WO2007055341A1

WO2007055341A1 - 示差的な糖尿病の予知・診断方法および糖尿病予知・診断用キット

Info

Publication number: WO2007055341A1
Application number: PCT/JP2006/322506
Authority: WO
Inventors: Toshikazu Yoshikawa; Yuji Naito; Hisashi Arikuni; Satomi Akagiri; Kenichi Mihara; Toshichika Ooki; Tsugihisa Yamaguchi; Shoichi Mafune; Yutaka Takahashi; Yumiko Nakashima
Original assignee: Biomarker Science Co., Ltd.
Priority date: 2005-11-11
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2007-05-18
Also published as: JPWO2007055341A1; JP5688829B2

Abstract

　本発明は、糖尿病の検出や予防に有用で、マルチマーカーシステムにも応用できる糖尿病の診断または事前診断の方法および糖尿病診断または事前診断のキットを提供する。糖尿病のマーカー物質として、血液中のトランスサイレチン、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、血清アルブミンおよびそれらの関連物質の群から選択される１または２以上のタンパク質を選択し、これらの濃度を健常値と比較して糖尿病の診断または事前診断を行う。マーカー物質の濃度を測定する方法としては、マーカー物質に特異的な抗体を用いることが好ましい。また、担体にマーカー物質を捕捉して測定することもできる。マーカー物質に特異的な抗体を含む糖尿病診断または事前診断のキットによれば、より簡便に糖尿病の診断または事前診断を行うことができる。

Description

明細書

示差的な糖尿病の予知 ·診断方法および糖尿病予知 ·診断用キット技術分野

[0001] 本発明は、疾病の事前診断および診断のための方法、物質の評価方法、および物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、被検者の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標として、糖尿病の有無または将来の発症リスクを判定 (事前診断）する疾病の診断方法、糖尿病を発症して、る動物または将来の発症リスクが高、動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標して、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する物質の評価方法、および、該評価方法を用いて糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法、に関する。

[0002] 本発明は、血液中のマーカー物質の濃度を測定し、その値を健常値と比較する糖尿病の診断方法、および糖尿病の診断に用いるためのキットに関する。

[0003] 本発明は、特に、健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマーカ一物質とを示差的に識別することができる手段に関する。

背景技術

[0004] 近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる肥満，糖尿病，動脈硬化等の生活習慣病が増カロしている。これらの発症増加は遺伝的なものではなぐ主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発症、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。これらの生活習慣病の中でも糖尿病は、知覚麻痺、失明、動脈硬化等との合併症を引き起こすことも多ぐ日常生活に多大な障害をもたらす病気として特に問題視されて、る。

[0005] 糖尿病はインスリンの作用不足による高血糖が引き起こす複合疾患である。糖尿病は 1型と 2型に分類される。 1型糖尿病は、脾臓のランゲルノヽンス島が炎症を起こした結果、インスリン分泌能が低下または枯渴してしまい、高血糖に至るものである。一方

、 2型糖尿病はそれ以外の原因によってインスリンの作用不足が起こり、高血糖に至るものである。この 2型糖尿病は日本人の糖尿病の大部分を占めるものであり、特に問題視されている。 2型糖尿病の発病メカニズムはまだ不明の点がある力主に環境因子が引き金になって発病するとされ、過食や肥満が大きな原因の一つである。例えば、肥満のために脾臓のインスリン分泌量が激増した結果、脾臓が疲労して逆にィンスリン分泌量が減少し、結局インスリンの作用不足となり高血糖となる。あるいは、脂肪の増加によってインスリン受容体が減少し、その結果、インスリンの作用不足となり高血糖となる。一方、逆に、インスリンの作用不足力生まれる余剰のグルコースが脂肪となって蓄えられて肥満が進むこともあり、糖尿病はその発症メカニズムにおいて肥満と密接に関係している。また、 2型糖尿病は発症初期に自覚症状がないことが多ぐ発見時には力なり進行していて治療が困難となることもある。すなわち、 2型糖尿病の予備軍は相当に多いと予想される。

[0006] 現在、糖尿病の診断に用いられて!/、る臨床検査項目としては、尿糖、空腹時血糖、ヘモグロビン Ale (HbAlc)、血中インスリン値、血中 '尿中 C—ペプチド値（CPR)などがある。その他、グルコースを経口摂取した後の血中グルコース濃度をモニターし、そのクリアランス能力をみる経口グルコース負荷試験（OGTT)も行われている。また、新たな臨床マーカーの例としては、血中レチノイン酸が提案されている（特許文献 1)。

[0007] しかし、インスリンの増減は、必ずしも糖尿病の明確な指標にならない。そこで、このほかに、遺伝子産物として有用な糖尿病のマーカー、特に、事前診断が可能なマーカーの報告はこれまでになされてヽな、。

[0008] また、ヒトは他因子の病態が絡み合っているが、因子が純粋なモデル動物で同様の診断指標となるかどうかは不明である。

[0009] また、健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマーカー物質とを示差的に識別することができる手段は、まだに提供されて!、な!、。

特許文献 1 :特開 2004— 163379号公報

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0010] 2型糖尿病のように発症初期に自覚症状が少ない疾患の場合は、予防をすることが特に大事である。そのためには、糖尿病の発症前の段階を検出する、いわゆる事前診断の技術が必要である。そうすれば、糖尿病が発症する前に食事制限や運動等の処置を行うことができ、糖尿病を予防することが可能になる。し力しながら、従来の臨床検査では糖尿病を発症前の段階で検出することは難しぐ予防という観点ではほとんど無力であるのが現状である。一方、マルチマーカーシステムと称し、複数のマーカー物質を指標にして臨床検査の診断精度を上げる方法がすでに提案されている。したがって、糖尿病の診断にもマルチマーカーシステムを適用して診断精度を上げることが考えられる。しかし、マルチマーカーシステムによって糖尿病の診断を行うには、複数の有用なマーカー物質が必要となる力現在のところそのような複数のマーカー物質は存在せず、マルチマーカーシステムによって糖尿病を検出した例は報告されていない。このように、糖尿病の予防や早期発見に有用で、マルチマーカーシステムにも適用可能な糖尿病の診断方法が求められて、る。

[0011] 2型糖尿病のように発症初期に自覚症状が少な!/、疾患の場合は、予防をすることが特に大事である。そのためには、糖尿病の発症の有無に加えて、糖尿病の将来の発症リスクを判定する診断技術が求められる。そうすれば、糖尿病が発症する前に、生活習慣の是正、食事制限、運動等の処置を行うことができ、当該疾病の発症を予防することが可能になる。さらに、当該疾病の発症リスクを低減させるような効果を有する食品素材等があれば、そのような食品素材を含む食品を日常的に摂取することで、糖尿病を容易に予防することができる。

[0012] しかし、糖尿病の将来の発症リスクを判定する診断技術は確立しておらず、物質が有する当該疾病の改善効果や発症リスクを低減させる効果を評価する方法、および、当該疾患の改善効果や発症リスクを低減させる効果を有する物質をスクリーニングする方法も開発されて!ヽなヽ。

[0013] 本発明の目的は、糖尿病の有無または将来の発症リスクを判定する診断方法を提供し、さらに、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する方法、および、該評価方法を用いて糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする方法を提供することにある

[0014] 本発明はまた、特に、健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマ一力一物質とを示差的に識別することができる手段を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0015] 本発明者らは、糖尿病の予防のための事前診断や早期発見に有用な糖尿病の新たなマーカー物質を検索すベぐ糖尿病患者と健常者の血液中のタンパク質を質量分析計スペクトルにより網羅的に比較し、糖尿病患者に特異的な、遺伝子産物であるタンパク質を検索した。その結果、糖尿病患者と健常者の間で統計的に有意差のある複数のタンパク質を見出した。さらに、それらのタンパク質を同定したところ、トランスサイレチン（transthyretin)、アポリポタンパク質 CII、アポリポタンパク質 CIII、および血清アルブミンならびにそれらの誘導体 (たとえば、酸化物、システィニル化物、グリコシルイ匕物等）と同定された。すなわち、本発明者らは、糖尿病の被験体および糖尿病予備群においては血液中のトランスサイレチンおよびアポリポタンパク質 cm は健常者より高ぐアポリポタンパク質 cnおよび血清アルブミンについては健常者より低い値を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。

[0016] 本発明者らはまた、上記課題を解決すベぐ糖尿病を発症する前の段階から、発症と未発症の境界、そして発症している段階、に至る種々の動物の体液サンプルを調製した。そして、当該体液サンプルを質量分析計によるプロテオーム解析により網羅的に解析した。その結果、糖尿病の有無に加え、将来の発症リスクと関連する（すなわち、事前診断を可能にする)タンパク質を複数見出した。そして、被検者の体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、糖尿病の有無または将来の発症リスクの判定 (すなわち、事前診断)する系を構築した。さらに、動物の体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する系を構築した。さらに、当該評価方法を用いて、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質のスクリーニングする系を構築した。本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。

(1) 被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステム。

(2) 上記マーカー物質が、上記被験体の体液中に存在する、項目 1に記載のシステム。

(3) 上記マーカー物質が、上記被験体の血液中に存在する、項目 1に記載のシステム。

(4) 上記マーカー物質が、遺伝子産物である、項目 1に記載のシステム。

(5) 上記マーカー物質が、トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質 cn、アポリポタンパク質 cn誘導体、アポリポタンパク質 cm、ァポリポタンパク質 cm誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質力なる群より選択される、 1またはそれより多い物質を含む、項目 1に記載のシステム。

(6)上記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目 1に記載のシステム。

(7)上記因子は、タンパク質または上記複合分子である、項目 1に記載のシステム。

(8)上記因子は、抗体である、項目 1に記載のシステム。

(9)上記因子は、標識されるか、または標識可能である、項目 1に記載のシステム。

(10)上記手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、 X線解析装置、 SPR、クロマトグラフィー、免疫学的手段、生化学的手段、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法、同位体標識法、タンデムァフィ-ティ精製法、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、項目 1に記載のシステム。

(11)さらに、上記マーカー物質の標準を含む、項目 1に記載のシステム。

(12)さらに、上記サンプルを精製する手段を備える、項目 1に記載のシステム。

(13)上記被験体は、哺乳動物を含む、項目 1に記載のシステム。

(14)上記被験体は、齧歯類を含む、項目 1に記載のシステム。

(15)上記被験体は、ヒトを含む、項目 1に記載のシステム。 (16)上記因子または上記手段は、上記マーカー物質の定量をする能力を有する、項目 1に記載のシステム。

(17)上記マーカー物質の定量を行うための定量手段をさらに備える、項目 1に記載のシステム。

(18)上記定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して上記マーカー物質が正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む、項目 17に記載のシステム。

(19)上記判定手段は、コンピュータである、項目 18に記載のシステム。

(20)上記システムは、上記マーカー物質または上記マーカー物質に特異的に相互作用する上記因子を含む組成物である、項目 1に記載のシステム。

(21) 上記マーカー物質が、トランスサイレチンおよびトランスサイレチン誘導体からなる群より選択される少なくとも 1つの物質を含み、上記トランスサイレチン誘導体は、 S—システィニルトランスサイレチン、 S—システィニルトランスサイレチン、グルタチォン化トランスサイレチン、 S— S結合形成トランスサイレチン、酸化トランスサイレチン、ホルミル化トランスサイレチン、ァセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付カ卟ランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチンおよびこれらの複合誘導体からなる群より選択される、項目 1に記載のシステム。

(22) 上記トランスサイレチンの減少および上記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目 21に記載のシステム。

(23) 上記トランスサイレチンの減少および上記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目 21に記載のシステム。

(24) 上記トランスサイレチンは、配列番号 1もしくは配列番号 3に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号 2もしくは配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有するか、先頭の 20アミノ酸が切除されている力、あるいは、これらの改変配列を有する、項目 21に記載のシステム。

(25) 上記トランスサイレチン誘導体は、配列番号 1もしくは配列番号 3に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号 2もしくは配列番号 4に示されるアミノ酸配列における、それぞれ、 30位のシスティンまたはそれに対応するシスティンのシスティンがシスティ-ル化されている誘導体である力、または、先頭の 2 0アミノ酸が切除されている、項目 21に記載のシステム。

(26) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンの単量体と四量体との区別をする能力を有する、項目 1に記載のシステム。

(27) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンと S—システィ-ルトランスサィレチンとの区別をする能力を有する、項目 1に記載のシステム。

(28) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンと S—システィ-ルトランスサィレチンとの区別をする能力を有する抗体を含む、項目 1に記載のシステム。

(29) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンと S—システィ-ルトランスサィレチンとを認識し、かつ、上記システムはトランスサイレチンと S—システィニルトランスサイレチンとを識另 Uする手段をさらに備える、項目 1に記載のシステム。

(30) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンと S—システィ-ルトランスサィレチンとを認識し、上記システムはトランスサイレチンの分子量と S—システィニルトランスサイレチンの分子量とを識別する手段、およびトランスサイレチンと S—システィ -ルトランスサイレチンとの相対比を測定する手段をさらに備える、項目 1に記載のシステム。

(31) 上記マーカー物質が、アポリポタンパク質 CIIまたはアポリポタンパク質 CII誘導体を含み、上記アポリポタンパク質 CII誘導体は、プロ体である、項目 1に記載のシステム。

(32) 上記アポリポタンパク質 CIIの減少および上記アポリポタンパク質 CII誘導体の変動力もなる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目 31に記載のシステム。

(33) 上記アポリポタンパク質 CIIの減少および上記アポリポタンパク質 CII誘導体の変動力なる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目 31に記載のシステム。

(34) 上記アポリポタンパク質 CIIは、配列番号 5もしくは配列番号 7に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号 6もしくは配列番号 8に示されるアミノ酸配列、あるいは、これらの改変配列を有する、項目 31に記載のシステム。

(35) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 CIIを選択的に識別する能力を有する、項目 31に記載のシステム。

(36) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 CIIを選択的に識別する能力を有する抗体を含む、項目 31に記載のシステム。

(37) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 CIIを選択的に識別する能力を有し、かつ、上記システムは上記アポリポタンパク質 CIIを定量する手段を備える、項目 31に記載のシステム。

(38) 上記マーカー物質が、アポリポタンパク質 cmまたはアポリポタンパク質 CIII 誘導体を含み、上記アポリポタンパク質 cmはアポリポタンパク質 cnioであり、上記アポリポタンパク質 cm誘導体は、アポリポタンパク質 cniiおよびアポリポタンパク質

CIII2からなる群より選択される、項目 1に記載のシステム。

(39) 上記アポリポタンパク質 cmの増カロ、アポリポタンパク質 cniiの増加およびァポリポタンパク質 CIII2の増カロからなる群より選択される少なくとも 1つの現象力糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目 38に記載のシステム。

(40) 上記アポリポタンパク質 cmの増カロ、アポリポタンパク質 cniiの増加およびァポリポタンパク質 CIII2の増カロからなる群より選択される少なくとも 1つの現象力糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目 38に記載のシステム。

(41) 上記アポリポタンパク質 cmは、配列番号 9もしくは配列番号 11に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号 10もしくは配列番号 12に示されるァミノ酸配列を有する、あるいは、これらの改変配列を有する、項目 38に記載のシステム。

(42) 上記アポリポタンパク質 cm誘導体は、配列番号 9もしくは配列番号 11に示される核酸配列によってコードされる力または配列番号 10もしくは配列番号 12に示されるアミノ酸配列において、それぞれ、 74位スレオニンに糖鎖を有する誘導体である、項目 38に記載のシステム。 (43) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 cmとアポリポタンパク質 CII I誘導体とを区別する能力を有する、項目 38に記載のシステム。

(44) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 cmo、アポリポタンパク質 CI

IIIおよびアポリポタンパク質 CIII2のうち少なくとも 2つを区別する能力を有する、項目 38に記載のシステム。

(45) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 CIIIOとアポリポタンパク質 CI IIIとアポリポタンパク質 CIII2とをすベて区別する能力を有する、項目 38に記載のシステム。

(46) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 cmとアポリポタンパク質 CII I誘導体とを区別する能力を有する抗体を含む、項目 38に記載のシステム。

(47) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 cmo、アポリポタンパク質 CI

II 1およびアポリポタンパク質 CIII2のうち少なくとも 2つを区別する能力を有する抗体を含む、項目 38に記載のシステム。

(48) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 CIIIOとアポリポタンパク質 CI II 1とアポリポタンパク質 CIII2とをすベて区別する能力を有する抗体の組み合わせを含む、項目 38に記載のシステム。

(49) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 cmとアポリポタンパク質 CII

I誘導体とを認識し、上記システムは、アポリポタンパク質 cmとアポリポタンパク質 cn

I誘導体とを識別する手段をさらに備える、項目 38に記載のシステム。

(50) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 cmとアポリポタンパク質 cn I誘導体とを認識し、上記システムは、アポリポタンパク質 cmo、アポリポタンパク質 c

ΠΙ1およびアポリポタンパク質 CIII2のうち少なくとも 2つを識別する手段をさらに備える、項目 38に記載のシステム。

(51) 上記因子または上記手段は、アポリポタンパク質 cmとアポリポタンパク質 cn I誘導体とを認識し、上記システムは、アポリポタンパク質 cmoとアポリポタンパク質 c

III1とアポリポタンパク質 CIII2とをすベて識別する手段をさらに備える、項目 38に記載のシステム。

(52) 上記マーカー物質が、血清アルブミンまたは血清アルブミン誘導体を含む、項目 1に記載のシステム。

(53) 上記血清アルブミンの減少および上記血清アルブミン誘導体の変動力なる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目 52に記載のシステム。

(54) 上記血清アルブミンの減少および上記血清アルブミン誘導体の変動力なる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目 52に記載のシステム。

(55) 上記血清アルブミンは、配列番号 13もしくは配列番号 15に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号 14もしくは配列番号 16に示されるアミノ酸配列、あるいは、これらの改変配列を有する、項目 52に記載のシステム。

(56) 上記因子または上記手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有する、項目 52に記載のシステム。

(57) 上記因子または上記手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有する抗体を含む、項目 52に記載のシステム。

(58) 上記因子または上記手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有し、かつ、上記システムは上記血清アルブミンを定量する手段を備える、項目 31に記載のシステム。

(59)診断薬である、項目 1に記載のシステム。

(60)被験体が糖尿病であるかどうか事前診断もしくは診断するため、または上記事前診断もしくは診断を支援するための方法であって、

A)上記被験体由来のサンプル中のマーカー物質を測定する工程；および

B)上記測定結果から、上記被験体が糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程、

を包含する、方法。

(61)項目 2〜59のいずれか 1項に記載の特徴を有する、項目 60に記載の方法。

(62) 被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための医薬の製造における、使用。 (63) 項目 2〜59のいずれか 1項に記載の特徴を有する、項目 62に記載の使用。

(64) 被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための使用。

(65) 項目 2〜59のいずれか 1項に記載の特徴を有する、項目 64に記載の使用。 (66)

項目 60に記載の方法であって、血液中のマーカー物質の濃度を測定し、その値を健常値と比較し、上記マーカー物質がトランスサイレチン、アポリポタンパク質 CIII、血清アルブミンの群力も選択される 1または 2以上のタンパク質であることを特徴とする、方法。

(67)

上記アポリポタンパク質 cniは、アポリポタンパク質 cmo、アポリポタンパク質 cnii

、アポリポタンパク質 CIII2の群力も選択される 1または 2以上のタンパク質であることを特徴とする項目 66に記載の糖尿病の診断方法。

(68)

下記工程 (1)〜(4)：

(1)被検者の血液から血清または血漿を調製する工程；

( 2)工程（ 1 )で得られた血清または血漿中のトランスサイレチンの濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程；

(3)工程（2)で糖尿病が検出されな力つた場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質 CIII2の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程;および

(4)工程（3)で糖尿病が検出されな力つた場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質 CIII1の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程、を含む、項目 67に記載の方法。

(69)

下記工程 (5)〜 (8) :

(5)被検者の血液から血清または血漿を調製する工程、

(6)工程 (5)で得られた血清または血漿中の血清アルブミンの濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程、

(7)工程 (6)で糖尿病が検出された場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質 CIII2の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程、

(8)工程（7)で糖尿病が検出されな力つた場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質 CIII1の濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出する工程；を含む、項目 67に記載の診断方法。

(70)

上記工程 (4)で糖尿病が検出された場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質 cmoの濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出することを特徴とする項目 68に記載の方法。

(71)

上記工程 (8)で糖尿病が検出された場合は、さらに、血清または血漿中のアポリポタンパク質 cmoの濃度値を健常値と比較して、糖尿病を検出することを特徴とする項目 69に記載の方法。

(72)

項目 60に記載の方法であって、血液中のマーカー物質の濃度を測定し、その値を健常値と比較し、上記マーカー物質が下記 (a)〜（e)：

(a) 7. 0以下の pHで陽イオン交換体に補足される、分子量が約 13800であるタンパク質；

(b) 7. 0以下の pHで金属イオン固定ィ匕担体に補足される、分子量が約 8700であるタンパク質；

(c) 7. 0以下の pHで陽イオン交換体に捕捉される、分子量が約 9400であるタンパク質または、 pH7. 0で金属イオン固定ィ匕担体に補足される、分子量が約 9400であるタンパク質；

(d) 7. 0以下の pHで陽イオン交換体に補足される、分子量が約 9700であるタンパク質、または、 pH7. 0で金属イオン固定ィ匕担体に補足される、分子量が約 9700であるタンパク質;および

(e) 7. 0以下の pHで陽イオン交換体に補足される、分子量が約 66000であるタンパク質、または、 pH7. 0で金属イオン固定ィ匕担体に補足される、分子量が約 66000であるタンパク質、

の群力も選択される 1または 2以上のタンパク質であることを特徴とする、方法。

(73)

項目 60に記載の方法であって、血液中のマーカー物質の濃度を測定し、その値を健常値と比較し、上記マーカー物質が下記：

(a)トリプシンで消ィ匕すると、分子量力 S約 1270、約 1370、約 1390、約 1520、約 245 0、約 2640、および約 3140のポリペプチドを生じる、分子量約 13800のタンパク質；および Zまたは

(b)卜リプシンで消ィ匕すると、分子量力 S約 900、約 1200、約 1390、約 1710、約 194 0、および約 2080のポジペプチドを生じる、分子量約 8700〜9700のタンパク質、のタンパク質であることを特徴とする、方法。

(74)

上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に血清または血漿を接触させて、マーカー物質を捕捉し、上記マーカー物質の濃度を測定することを特徴とする項目 66乃至 73の、ずれかに記載の方法。

(75)

上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記マーカー物質に特異的な抗体であることを特徴とする項目 74に記載の方法。

(76)

上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換基を有するものであることを特徴とする項目 74に記載の糖尿病の診断方法。

(77)

上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は上記平面部分の一部に固定ィ匕されていることを特徴とする項目 74〜76のいずれかに記載の方法。

(78)

上記抗体は、担体に固定ィ匕されていることを特徴とする項目 1に記載のシステム。 (79)

項目 60に記載の方法であって、上記被験体の体液中における下記マーカー物質 ( a)〜、n)：

(a) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 7040のイオンピークを生じるタンパク質、

(b) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量/電荷比が約 8330のイオンピークを生じるタンパク質、

(c) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 8530のイオンピークを生じるタンパク質。

(d) pH7. 0かつ 0. 5Mの NaCl濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 9060のイオンピークを生じるタンパク質、

(e) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 9260のイオンピークを生じるタンパク質、

(f) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量/電荷比が約 9450のイオンピークを生じるタンパク質、

(g) pH7. 0力つ 0. 5Mの NaCl濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 13700のイオンピークを生じるタンパク質、

(h) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 76400のイオンピークを生じるタンパク質、

(i) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 79100のイオンピークを生じるタンパク質、

(j) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 3500のイオンピークを生じるタンパク質、

(k) pH7. 0力つ 0. 5Mの NaCl濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 3560のイオンピークを生じるタンパク質、 (1) ρΗ7. 0かつ 0. 5Mの NaCl濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 4180のイオンピークを生じるタンパク質、 (m) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 12800のイオンピークを生じるタンパク質；

(n) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 65700のイオンピークを生じるタンパク質；および

(a)〜 (n)のタンパク質に対応するタンパク質または改変体

からなる群より選択される少なくとも 1つタンパク質の濃度を健常値と比較し、糖尿病の発症の有無または将来の糖尿病の発症リスクを判定することを特徴とする、方法。 (80)

上記体液は、血液であることを特徴とする項目 79に記載の方法。

(81)

上記体液または体液成分を、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の上記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された上記マーカー物質の量に基づいて体液中の上記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする項目 79または 80に記載の疾病の診断方法。

(82)

上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記平面部分の一部に固定ィ匕されていることを特徴とする項目 81に記載の方法。 (83)

上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする項目 81または 82に記載の方法。

(84)被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法であって、

a)糖尿病を発症して!/、る動物または将来の発症リスクが高、動物に被験物質を摂取させる工程；および

b)上記動物の体液中における上記マーカー物質の少なくとも 1つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する工程、

を包含する、方法。

(85) 項目 2〜59のいずれか 1項に記載の特徴を有する、項目 84に記載の方法。 (86)

項目 84に記載の方法であって、上記マーカー物質が、下記マーカー物質 (a)〜（n )：

(a)〜 (n)のタンパク質に対応するタンパク質または改変体

からなる群より選択される少なくとも 1つタンパク質である、方法。

(87)

上記基準値は、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、上記動物の体液中における上記マーカー物質の濃度であることを特徴とする項目 86に記載の方法。

(88)

上記体液は、血液であることを特徴とする項目 86または 87に記載の方法。

(89)

上記被検物質は、食品素材であることを特徴とする項目 86〜88のいずれか〖こ記載の方法。

(90)

上記体液または体液成分を、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定ィ匕した担体に接触させて、体液中の上記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された上記マーカー物質の量に基づいて体液中の上記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする項目 86〜89の、ずれかに記載の方法。

(91)

上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記平面部分の一部に固定ィ匕されていることを特徴とする項目 90に記載の方法。 (92)

上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする項目 90または 91に記載の方法。

(93)

項目 84〜92のいずれかに記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。

(94)項目 93に記載の方法によって得られた物質。

(101) 被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステムであって、上記認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、システム。

(102)上記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子力なる群より選択される、項目 101に記載のシステム。

(103)上記因子は、タンパク質または上記複合分子である、項目 101に記載のシステム。

(104)上記因子は、抗体である、項目 101に記載のシステム。

(105)上記因子は、標識されるか、または標識可能である、項目 101に記載のシステム。

(106)上記手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、 X線解析装置、 SPR、ク口マトグラフィー、免疫学的手段、生化学的手段、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法、同位体標識法、タンデムァフィ-ティ精製法、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、項目 101に記載のシステム。

(107)さらに、上記マーカー物質の標準を含む、項目 101に記載のシステム。

(108)さらに、上記サンプルを精製する手段を備える、項目 101に記載のシステム。

(109)上記被験体は、哺乳動物を含む、項目 101に記載のシステム。

(110)上記被験体は、齧歯類を含む、項目 101に記載のシステム。

(111)上記被験体は、ヒトを含む、項目 101に記載のシステム。

(112)上記因子または上記手段は、上記マーカー物質の定量をする能力を有する、項目 101に記載のシステム。

(113)上記マーカー物質の定量を行うための定量手段をさらに備える、項目 101に記載のシステム。

(114)上記定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して上記マーカー物質が正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む、項目 113に記載のシステム。

(115)上記判定手段は、コンピュータである、項目 114に記載のシステム。

(116)上記システムは、上記マーカー物質または上記マーカー物質に特異的に相互作用する上記因子を含む組成物である、項目 101に記載のシステム。

(117) 上記トランスサイレチン誘導体は、 S—システィ-ルトランスサイレチン、ダルタチオン化トランスサイレチン、 S— S結合形成トランスサイレチン、酸化トランスサイレチン、ホルミル化トランスサイレチン、ァセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付カ卟ランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチンおよびこれらの複合誘導体からなる群より選択される、項目 101に記載のシステム。

(118) 上記トランスサイレチン誘導体は、 S—システィ-ルトランスサイレチンである、項目 101に記載のシステム。

(119) 上記トランスサイレチン誘導体は、 S—システィ-ルトランスサイレチンであり、上記識別する手段は抗体である、項目 101に記載のシステム。

(120) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とに対して示差的に反応する、項目 101に記載のシステム。

(121) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンまたはトランスサイレチン誘導体のいずれか一方としか実質的に反応しない、項目 101に記載のシステム。

(122) 上記トランスサイレチンの減少および上記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症している力または将来の発症リスクが高いことの指標である、項目 101に記載のシステム。

(123) 上記トランスサイレチンの減少および上記トランスサイレチン誘導体の増加からなる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、項目 101に記載のシステム。

(124) 上記トランスサイレチンは、配列番号 1もしくは配列番号 3に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号 2もしくは配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有する力、先頭の 20アミノ酸が切除されている力、あるいは、これらの改変配列を有する、項目 101に記載のシステム。

(125) 上記トランスサイレチン誘導体は、配列番号 1もしくは配列番号 3に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号 2もしくは配列番号 4に示されるアミノ酸配列における、それぞれ、 30位のシスティンまたはそれに対応するシスティンのシスティンがシスティ-ル化されている誘導体である力、または、先頭の 20アミノ酸が切除されている、項目 101に記載のシステム。

(126) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンの単量体と四量体との区別をする會カを有する、項目 101に記載のシステム。

(127) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンと S—システィニルトランスサィレチンとの区別をする能力を有する、項目 101に記載のシステム。

(128) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンと S—システィニルトランスサィレチンとの区別をする能力を有する抗体を含む、項目 101に記載のシステム。

(129) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンと S—システィニルトランスサィレチンとを認識し、かつ、上記システムはトランスサイレチンと S—システィニルトランスサイレチンとを識另 Uする手段をさらに備える、項目 101に記載のシステム。

(130) 上記因子または上記手段は、トランスサイレチンと S—システィニルトランスサィレチンとを認識し、上記システムはトランスサイレチンの分子量と S—システィニルトランスサイレチンの分子量とを識別する手段、およびトランスサイレチンと S—システィ -ルトランスサイレチンとの相対比を測定する手段をさらに備える、項目 101に記載のシステム。

(131)診断薬である、項目 101に記載のシステム。

( 132)被験体が糖尿病であるかどうか事前診断もしくは診断するため、または上記事前診断もしくは診断を支援するための方法であって、

を包含する、方法。

(133)項目 102〜130のいずれか 1項に記載の特徴を有する、項目 32に記載の方法。

(134) 被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための医薬の製造における、使用であって、上記認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、使用。

(135) 項目 102〜130のいずれか 1項に記載の特徴を有する、項目 134に記載の使用。

(136) 被験体由来のサンプル中のマーカー物質、上記マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または上記マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための使用であって、上記認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、使用。

(137) 項目 102〜130のいずれか 1項に記載の特徴を有する、項目 134に記載の使用。

(138) 上記サンプルは、血液であることを特徴とする項目 132に記載の方法。

(139) 上記サンプルを、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定ィ匕した担体に接触させて、体液中の上記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された上記マーカー物質の量に基づいて体液中の上記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする項目 132に記載の疾病の診断方法。

(140) 上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記平面部分の一部に固定ィ匕されていることを特徴とする項目 139に記載の方法。

(141) 上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする項目 139または 140に記載の方法。

(142)被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法であって、

を包含する、方法。

(143) 項目 102〜130のいずれか 1項に記載の特徴を有する、項目 84に記載の方法。

(144) 上記基準値は、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、上記動物の体液中における上記マーカー物質の濃度であることを特徴とする項目 142に記載の方法。

(145) 上記体液は、血液であることを特徴とする項目 142〜144のいずれか 1項に記載の方法。

(146) 上記被検物質は、食品素材であることを特徴とする項目 142〜145のいずれか 1項に記載の方法。

(147) 上記体液または体液成分を、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定ィ匕した担体に接触させて、体液中の上記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された上記マーカー物質の量に基づいて体液中の上記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする項目 142〜 146の、ずれかに記載の方法。

(148) 上記担体は平面部分を有し、上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、上記平面部分の一部に固定ィ匕されていることを特徴とする項目 47に記載の方法。

(149) 上記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする項目 146または 147に記載の方法。

(150) 項目 142〜149のいずれかに記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリ一-ングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。

(151)項目 150に記載の方法によって得られた物質。 [0017] 従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白〖こなることが理解される。

発明の効果

[0018] トランスサイレチン、アポリポタンパク質 cm、および血清アルブミンは既知物質でかつある種の臨床的意義は知られている力糖尿病のマーカー物質となり得ることは本発明により初めて明ら力となった。

[0019] 本発明の糖尿病の診断および事前診断のための方法およびそのためのシステムもしくは組成物 (診断薬）によれば、糖尿病の診断および事前診断をより確実かつ精度よく行うことができる。また、複数のマーカー物質を組み合わせることによってマルチマーカーシステムによる糖尿病の診断および事前診断を行うことができる。

[0020] 本発明の糖尿病診断用キットによれば、より簡便かつ高精度で糖尿病の診断および事前診断をすることができる。

[0021] 本発明の疾病の診断および事前診断のための方法、組成物 (診断薬)およびシステムによれば、糖尿病の有無に加え、糖尿病の将来の発症リスクを判定 (すなわち事前診断)することができる。

[0022] 本発明の物質の評価方法によれば、被検物質が有する糖尿病の改善効果に加え、糖尿病の将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。

[0023] 本発明の物質のスクリーニング方法によれば、糖尿病の改善効果を有する物質に加え、糖尿病の将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることができる。

[0024] 本発明は、特に、健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマーカ一物質とを示差的に識別することができ、効率よい診断を可能とした。

図面の簡単な説明

[0025] [図 1]本発明の糖尿病の診断方法をマルチマーカーシステムに応用した例の手順を表すフローチャートである。

[図 2]本発明の糖尿病の診断方法をマルチマーカーシステムに応用した別の例の手順を表すフローチャートである。

[図 3]mZzが 13867のピークについての測定結果を表し、図 3 (a)は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図 3 (b)は図 3 (a)の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図 3 (c)は ROC 曲線を示すグラフである。

[図 4]mZzが 8690のピークについての測定結果を表し、図 4 (a)は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図 4(b)は図 4 (a)の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図 4 (c)は ROC曲線を示すグラフである

[図 5]糖尿病患者の血清を 2次元電気泳動に供した結果を表す写真である。

[図 6]mZzが 66216のピークについての測定結果を表し、図 6 (a)は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図 6 (b)は図 6 (a)の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図 6 (c)は ROC 曲線を示すグラフである。

[図 7]質量 Z電荷比が 7043 (平均値）のイオンピークにっヽての箱髭図である。

[図 8]質量 Z電荷比が 8325 (平均値）のイオンピークにっヽての箱髭図である。

[図 9]質量 Z電荷比が 8532 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 10]質量 Z電荷比が 9062 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 11]質量 Z電荷比が 9255 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 12]質量 Z電荷比が 9445 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 13]質量 Z電荷比が 13720 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 14]質量 Z電荷比が 76404 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 15]質量 Z電荷比が 79085 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 16]質量 Z電荷比が 3497 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 17]質量 Z電荷比が 3559 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 18]質量 Z電荷比が 4184 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 19]質量 Z電荷比が 12786 (平均値）のイオンピークについての箱髭図である。

[図 20]質量 Z電荷比が 65700 (平均値）のイオンピークにつ!、ての箱髭図である。

[図 21]図 21には、健常人由来 S- cysteinylated TTRを示す。測定値： M/Z= 13874.74 80。 [図 22]図 22には、還元処理後の健常人由来 S-cysteinylated TTRを示す。測定値: M /Z= 13759.7393。

[図 23]図 23には、糖尿病患者由来 S- cysteinylated TTRを示す。測定値: M/Z= 1387 1.3320。

[図 24]図 24には、還元処理後の糖尿病患者由来 S-cysteinylated TTRを示す。測定値： M/Z= 13755.6494₀

[図 25]図 25には、 TTRの 4量体構造とモノマーのアミノ酸配列を示す。このように、トランスサイレチンは、通常 4量体構造をとつており、これが崩れていくと糖尿病になると仮定される。

[図 26]図 26には、ヒト TTR a -ドメインの 3次元構造 (上）と 2次構造配列（下）が示される。

[図 27]図 27は、ラットアポリポタンパク質 CIIIと同定したバンドのゲル写真と、そのバンドの SELDI—TOFによる分析を示す。

[図 28]図 28は、ラットアポリポタンパク質 CIIIと同定したバンドのゲル写真と、そのバンドの SELDI—TOFによる分析を示す。

[図 29]図 29には、ヒトァポリポタンパク質 CIII (0〜2)のスポットであると考えられる二次元電気泳動上のスポットを示す。

[図 30]図 30には、図 29の各スポットの質量分析の結果を示す。

[図 31]図 31には、各スポットの SELDI— MSの結果を示す。

[図 32]図 32には、 CM10の検討結果を示す。

[図 33]図 33には、 Q10の検討結果を示す。

[図 34]図 34は、至適条件検討結果を示す。これらの結果から、得られたスポットが、ヒトァポリポタンパク質 CIII (0〜2)のスポットであることが明らかになる。

[図 35]図 35には、糖尿病患者における S—システィ-ル化トランスサイレチン (測定値： MZZ= 13, 863,理論値： MZZ= 13880. 53)のイオン強度と HbAlc値の関係を示す。

[図 36]図 36には、糖尿病患者における S—システィ-ル化トランスサイレチン (測定値： MZZ= 13, 874,理論値： MZZ= 13880. 53)のイオン強度と HbAlc値の関係が示される。

[図 37]図 37には、糖尿病患者における S システィ-ル化トランスサイレチン (測定値： MZZ= 13, 884,理論値： MZZ= 13880. 53)のイオン強度と HbAlc値の関係が示される。

[図 38]図 38は、糖尿病患者における MZZ : 13, 863の実測データを示す。

[図 39]図 39には、糖尿病ラット血清 8.3K ( Apo CII)箱髭図を示す。

[図 40]図 40には、上記の時系列データを示す。

[図 41]図 41は、ゲル上のバンドの SELDI— MSの結果を示す。

[図 42]図 42には、得られたバンドのウェスタンブロットによる確認を示す。

[図 43]図 43には、クロマトグラフィーによる分画において抗 ApoC2抗体により増強される様子を示す。

[図 44]図 44は、ヒトにおけるアポリポタンパク質 CIIもまた事前診断マーカーであることを示す。ここでは、健常人のアポリポタンパク質 CIIの質量分析結果を示す。

[図 45]図 45は、ヒトにおけるアポリポタンパク質 CIIもまた事前診断マーカーであることを示す。ここでは、糖尿病患者のアポリポタンパク質 CIIの質量分析結果を示す。

[図 46]図 46は、別の画分を用いた場合でのヒトにおけるアポリポタンパク質 CIIもまた事前診断マーカーであることを示す。ここでは、健常人のアポリポタンパク質 CIIの質量分析結果を示す。

[図 47]図 47は、別の画分を用いた場合でのヒトにおけるアポリポタンパク質 CIIもまた事前診断マーカーであることを示す。ここでは、糖尿病患者のアポリポタンパク質 CII の質量分析結果を示す。

配列表の簡単な説明

配列番号 1 2 トランスサイレチンヒト（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）配列番号 3— 4 トランスサイレチンラット (それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）配列番号 5— 6 アポリポタンパク質 CII ヒト (それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列)、

配列番号 7— 8 アポリポタンパク質 CII ラット (それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）配列番号 9 10 アポリポタンパク質 cm ヒト（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）

配列番号 11 12 アポリポタンパク質 cm ラット (それぞれ、核酸配列およびァミノ酸配列）

配列番号 13— 14 血清アルブミンヒト（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）配列番号 15— 16 血清アルブミンラット（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）配列番号 17— 18 血清アルブミンマウス（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列 )

配列番号 19 20 血清アルブミンィヌ（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）配列番号 21— 22 血清アルブミンゥサギ（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列 )

配列番号 23— 24 血清アルブミンサル (それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列）配列番号 25：ヒトのトランスサイレチンのシスティン残基のアミノ酸配列

配列番号 26：マウスのトランスサイレチンのシスティン残基のアミノ酸配列

配列番号 27：ラットのトランスサイレチンのシスティン残基のアミノ酸配列

配列番号 28： Gallus Gallusのトランスサイレチンのシスティン残基のアミノ酸配列発明を実施するための最良の形態

[0027] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞 (例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。

[0028] (一般技術）

本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Maniatis, T. e t al. (,1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubel, F. M. (1987) . Current Pro tocols in Molecular Biology, Greene Pub. AssociatESand Wiley— Inte rscience ; Ausubel, F. M. (1989) . Short Protocols in Molecular Biolog y : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecul ar Biology, Greene Pub. Associates ana

； Sambroo k, J. et al. (1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor ; Innis, M. A. (1990) . PCR Protocols： A Guide to Me thods and Applications, Academic Press ; Ausubel, F. M. (1992) . Shor t Protocols in Molecular Biology： A Compendium of Methods fro m Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates ; Ausubel, F. M. (1995) . Short Protocols in Molecular Biology: A Co mpendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biolog y, Greene Pub. Associates ; Innis, M. A. et al. (1995) . PCR Strategies , Academic Press ; Ausubel, F. M. (1999) . Short Protocols in Molecul ar Biology： A じ ompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates ; Sninsky, J. J. et al. (1 999) . PCR Applications： Protocols for Functional Genomics, Acade mic Press、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分 (全部であり得る）が参考として援用される。

[0029] プロテインチップに関連する技術としては、例えば、サイファージェン社から入手可能な技術などを挙げることができる。

[0030] (用語の説明）

以下に本明細書において使用される用語を説明する。

[0031] (マーカー物質として同定された代表的な遺伝子産物）

本明細書において「マーカー物質」とは、ある状態 (例えば、糖尿病などの疾患）に罹患して!/、る力またはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質を!、う。このようなマーカー物質としては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。

[0032] 本明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質または mRNAをいう。本明細書では、糖代謝に直接関連しない遺伝子産物（すなわち、インスリンなどの糖代謝に関連しないタンパク質など)が糖尿病の指標として使用可能であることが見出された。

[0033] 本明細書において「トランスサイレチン (TTR)」とは、別名プレアルブミンともいい、同質のサブユニットからなる四量体を形成するタンパク質として知られており、血中ビタミン A輸送タンパク質であるレチノール結合タンパク質 (RBP)とタンパク質複合体を形成し、チロキシン (T4)と結合することが知られている。ラットでは、主な T4輸送タンパク質として知られている。

[0034] トランスサイレチンは、 Raz, A.らにより単離精製され、神田らにより一次構造が同定された（Raz, A. & Goodman D. S. , (1969) , J. Biol. Chem. 224, 3230 - 3237 ;Kanda, Y. et al. , (1974) , J. Biol. Chem. , 247, 6796— 6805)。これまで、その異常がアルツハイマー性痴呆および家族性アミロイド一シスポリ-ユーロバチ一と関連して、ることが知られて、る。

[0035]

トランスサイレチンの代表的なヌクレオチド配列は、

(a)配列番号 1または配列番号 3に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；

(b)配列番号 2または配列番号 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；

(c)配列番号 2または配列番号 4に記載のアミノ酸配列にぉ、て、 1以上のアミノ酸力置換、付加および欠失力なる群より選択される 1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

(d)配列番号 1または配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；

(e)配列番号 2または配列番号 4に記載のアミノ酸配列力なるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；

(f) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または

(g) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド

であり得る。

[0036] トランスサイレチンのアミノ酸配列としては、

(a)配列番号 2または配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

(b)配列番号 2または配列番号 4に記載のアミノ酸配列にぉ、て、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；

(c)配列番号 1または配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；

(d)配列番号 2または配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリべプチド;または

(e) (a)〜（d)のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、

であり得る。

[0037] トランスサイレチンの代表的な配列は、配列番号 1または配列番号 3 (核酸配列）および配列番号 2または配列番号 4 (アミノ酸配列）にお、て示される。

[0038] ここで、トランスサイレチンの生物学的活性としては、例えば、四量体を形成するタンパク質として知られており、血中ビタミン A輸送タンパク質であるレチノール結合タンノク質 (RBP)とタンパク質複合体を形成し、チロキシン (T4)と結合する能力を挙げることがでさる。

[0039] トランスサイレチンは分子量約 14000のサブユニット 4個からなる複合タンパク質であり、肝臓で合成される。血液中のトランスサイレチンの臨床的意義としては、栄養状態および肝臓のタンパク質合成能を反映してヽるとされ、ネフローゼ症候群や急性肝炎の回復期等で高値を示すことが知られている。なお、本明細書では、トランスサィレチンというときは、 4量体の複合タンパク質とサブユニット単体とを特に区別せず、両方を指すものとする。

[0040] トランスサイレチンおよびその誘導体は、ヒト、ラットのほ力他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ (本明細書にお!/、て、「対応する」遺伝子またはタンパク質などという）が知られている。従って、本明細書においてトランスサイレチンおよびその誘導体は、通常、特に言及しない場合は、ヒト、ラットのほか、生物一般において存在するトランスサイレチンおよびその誘導体を指す。

[0041] 本明細書において「トランスサイレチン誘導体」とは、トランスサイレチンの任意の誘導体を指し、特に、翻訳後修飾などの生体内での代謝産物をいう。代表的なトランスサイレチン誘導体の改変を、以下に質量変動値とともに示す：

[0042] [表 1]

タンパク質やペプチドにおける

的な翻訳後修飾とての質変匕 odificalions ^onoiso o ic Mass Modifications iVionoisotopic M s メチ才ニンのホモ j'ノ化 -29.99 へキソサミン (GaiN, GicN) 161.08 グルタミンか口グルタミン化 Ai へキソース (Man, Gal, Glc) 182.05 ジ；イド (S-S)結合の形威 -2.01 リポン酸（リジンとアミ i¾合） 188.03

Glyの C雄アミ ΚΙ成 - 0.98 N-ァゼチルへキソサミン (GalNAc, GlcNAc) 203.07

Asnや Ginのデアミデーシヨン -0^8 ファルネシル化 204.18 メチル化 14.01 ミリストイル化 210.19 ヒドロキシル化 15.99 ビ才チン化（1級ァミンとアミ K 合） 226.07 メチ才二:麵匕 1S.99 ピリドキサールり 231.02 ベブチト合 1 纏 1謹 (1緩アミンとシ基を繊》

フ才ルミル化 27.99 ステァロイル化 266.26 ァセチル化 42.01 ケラニル 7ラニ匕 272.25

As や G(uのカルポキシル化 43.98 シァル酸 (NeuAc, NANA, SA) 29爆

79.96 グルチ才ン化 305.06 79.95 N-グリコリルニュラミン酸 (NeuGc) 307.09 システ^ V化 119.00 5，-アデル化 329.05 ベントース（Ara， Rib, X≠) 132.04 フォスフォントテ^ 339,07 テ才ヤシへキノ一ス (Fuc, Rha) 146.05 ADP-りポシル化 (from DNA) 541.06

[0043]

[0044] 本明細書では、代表的な、トランスサイレチン誘導体としては、システィンィ匕 (システィニル）、ダルタチオン化、 s— s結合形成、酸化 (例えば、メチォニン側鎖の酸化）、ホルミル化、ァセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などを挙げることができるがそれらに限定されない。

[0045] 本発明では、糖尿病の患者またはその危険が高い被験体において、トランスサイレチンの量が減少し、代わって、トランスサイレチンの特定の誘導体 (例えば、システィ

-ルトランスサイレチン、ダルタチオン化トランスサイレチン、 S— S結合形成したトランスサイレチン、酸化トランスサイレチン (例えば、メチォニン側鎖が酸ィ匕したトランスサィレチン）、ホルミル化トランスサイレチン、ァセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付カ卟ランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチン）が増加していることが明らかになった。従って、これらのトランスサイレチンの減少またはトランスサイレチン誘導体の増加を指標として、糖尿病またはその危険が高ヽ被験体を診断または事前診断することが可能である。

[0046] 本明細書にぉ、て「ァポリポタンパク質」または「アポ脂質タンパク質」とは、脂質と結合して脂質タンパク質を形成するタンパク質をいい、 A、 B、 C、 Dおよび Eに大別される。ヒトの血漿乳び脂粒 (カイロミクロン）， HDL, LDL,および VLDLなどの典型的な成分であるリポタンパク質複合体のタンパク質成分である。アポリポタンパク質 C — II (APOC2と略することがある）は、 VLDL, HDLやカイロミクロン中に存在するァポリポタンパク質である。リポタンパク質リパーゼの活性ィ匕因子である。このタンパク質の欠損により高カイロミクロン血症や高トリグリセリド血症が生じる。アポリポタンパク質 C— III (APOC3と略することがある）は、 VLDL, HDLやカイロミクロン中に存在するアポリポタンパク質であり、多数のリパーゼを抑制することが知られている。アポリポタンパク質 Cなどについての概説は、 Bondarenko, P. V. et al. J. Lipid Res. 1999;40:5 43-555を参照のこと。

[0047] アポリポタンパク質 CIIの代表的なヌクレオチド配列は、

(a)配列番号 5または配列番号 7に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；

(b)配列番号 6または配列番号 8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；

(c)配列番号 6または配列番号 8に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸 1S 置換、付加および欠失力なる群より選択される 1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

(d)配列番号 5または配列番号 7に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；

(e)配列番号 6または配列番号 8に記載のアミノ酸配列力なるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；

であり得る。

[0048] アポリポタンパク質 CIIのアミノ酸配列としては、

(a)配列番号 6または配列番号 8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

(b)配列番号 6または配列番号 8に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；

(c)配列番号 5または配列番号 7に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；

(d)配列番号 6または配列番号 8に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリべプチド;または

であり得る。

[0049] アポリポタンパク質 CIIの代表的な配列は、配列番号 5または配列番号 7 (核酸配列 )および配列番号 6または配列番号 8 (アミノ酸配列）にお、て示される。 [0050] アポリポタンパク質 CIIの生物学的活性としては、例えば、 VLDL, HDLやカイロミクロンを構成する能力などを挙げることができる。

[0051] アポリポタンパク質 CIIは、ヒト、ラットのほか、他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ (本明細書にぉ、て、「対応する」遺伝子またはタンパク質などと!/、う）が知られている。従って、本明細書においてアポリポタンパク質 CIIは、通常、特に言及しない場合は、ヒト、ラットのほか、生物一般において存在するアポリポタンパク質 CIIを指す。

[0052] アポリポタンパク質は、プロ体として生成される。より詳細な判定をする場合には、プ口体と成熟体とを区別してみることが好まし、。

[0053] アポリポタンパク質 cmの代表的なヌクレオチド配列は、

(a)配列番号 9または配列番号 11に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；

(b)配列番号 10または配列番号 12に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；

(c)配列番号 10または配列番号 12に記載のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が、置換、付加および欠失力なる群より選択される 1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリべプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

(d)配列番号 9または配列番号 11に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；

(e)配列番号 10または配列番号 12に記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；

(g) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。

[0054] アポリポタンパク質 cmのアミノ酸配列としては、

(a)配列番号 10または配列番号 12に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

(b)配列番号 10または配列番号 12に記載のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；

(c)配列番号 9または配列番号 11に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；

(d)配列番号 10または配列番号 12に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または

であり得る。

[0055] アポリポタンパク質 cmの代表的な配列は、配列番号 9または配列番号 11 (核酸配列）および配列番号 10または配列番号 12 (アミノ酸配列）にお、て示される。

[0056] アポリポタンパク質 CIIIの生物学的活性としては、例えば、 VLDL, HDLやカイロミクロンを構成する能力などを挙げることができる。

[0057] アポリポタンパク質 cmは、ヒト、ラットのほ力、他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ (本明細書にぉ、て、「対応する」遺伝子またはタンパク質などと!/、う）が知られている。従って、本明細書においてアポリポタンパク質 cmは、通常、特に言及しない場合は、ヒト、ラットのほ力、生物一般において存在するアポリポタンパク質 CIII を指す。

[0058] アポリポタンパク質 CIIIは、糖鎖の結合度合いにより、 CIIIO、 CIII1、 CIII2の少なくとも 3種類が存在することが知られている。

[0059] このように、アポリポタンパク質 CIIIは 3種のタンパク質の総称であり、アポリポタンパク質 cnio、アポリポタンパク質 cmi、アポリポタンパク質 cni2に分類される。そして、本発明の糖尿病の診断方法においては、これら 3種のアポリポタンパク質 cmの少なくとも 1種の濃度を測定する。本発明の糖尿病の診断方法によれば、アポリポタンパク質 cmの濃度を細分ィ匕して測定するので、精度が高!、。

[0060] アポリポタンパク質 cmは血液中に存在する 10種類以上のアポリポタンパク質の 1 種であり、肝臓で合成される。血液中のアポリポタンパク質 cmの臨床的意義としては、閉塞性黄疽ゃ抗脂血症で高値を示すことが知られている。また、アポリポタンパク質 cmは糖鎖の有無および構造の違いにより、アポリポタンパク質 cmo、アポリポタンパク質 Cini、アポリポタンパク質 CIII2の 3種にさらに分類される。アポリポタンパク質 cnioは糖鎖を持たないものであり、アポリポタンパク質 cniiはァポリポタンパク質 CniOに糖鎖が付加されたものであり、アポリポタンパク質 CIII2はァポリポタンパク質 CIII1にさらに複合的に糖鎖が付加されたものである。

[0061] Bondarenko, P. V. et al. J. Lipid Res. 1999;40:543-555によれば、アポリポタンパク質 cnio、アポリポタンパク質 cmi、アポリポタンパク質 cni2は以下のような構造をしている。

[0062] [化 1]

：

，

… Ί

[0063] これらを識別するには、識別可能な抗体などの特異的因子を用いる力またはこれら特定の糖鎖を選択的に切断する酵素を用いて処理し、分子量が減少するかどうかを判定することなどによって確認することができる。

[0064] 本明細書において「血清アルブミン」とは、血清中に含まれるアルブミンをいい、漿蛋白質中にもっとも多量に含まれ (100mlあたり約 4g)で，全蛋白質の 60%を占めるである。ヒトでは、分子量 64000-68000,等電点 pH4.7-4.9である。その役割はいくつかあり、血液の浸透圧の維持，様々な物質 (イオン，色素，一部の水溶性ビタミン，薬剤など)を結合し運搬すること，組織へのアミノ酸の供給源となることなどである。血清ァルブミンはアルブミンの 1種であり、血清中で最も多量に存在するタンパク質である。血清アルブミンは、分子量約 69000 (アミノ酸 1次構造力もの計算値は 66439)の糖鎖を持たないタンパク質であり、肝臓で合成される。血液中の血清アルブミンの臨床的意義としては、栄養状態の悪化や肝障害の程度を反映して低値を示すことが知られている。血清アルブミンの代表的なヌクレオチド配列は、

(a)配列番号 13または配列番号 15に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；

(b)配列番号 14または配列番号 16に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；

(c)配列番号 14または配列番号 16に記載のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が、置換、付加および欠失力なる群より選択される 1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリべプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

(d)配列番号 13または配列番号 15に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；

(e)配列番号 14または配列番号 16に記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；

であり得る。

[0066] 血清アルブミンのアミノ酸配列としては、

(a)配列番号 14または配列番号 16に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

(b)配列番号 14または配列番号 16に記載のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；

(c)配列番号 13または配列番号 15に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；

(d)配列番号 14または配列番号 16に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または

であり得る。

[0067] 血清アルブミンの代表的な配列は、配列番号 13または配列番号 15 (核酸配列）および配列番号 14または配列番号 16 (アミノ酸配列）において示される。

[0068] 血清アルブミンの生物学的活性としては、例えば、血液の浸透圧の維持，様々な物質 (イオン，色素，一部の水溶性ビタミン，薬剤など)を結合し運搬すること，組織へのアミノ酸の供給源となる能力などを挙げることができる。

[0069] 血清アルブミンは、ヒト、ラットのほ力他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモ口グ (本明細書にぉ、て、「対応する」遺伝子またはタンパク質などと、う）が知られて!/、る。従って、本明細書において血清アルブミンは、通常、特に言及しない場合は、ヒト、ラットのほか、生物一般において存在する血清アルブミンを指す。血清アルブミンの他の動物の配列は、マウス（配列番号 17— 18)、ィヌ（配列番号 19— 20)、ゥサギ（配列番号 21— 22)、サル（配列番号 23— 24)を挙げることができる。

[0070] (診断'事前診断 (予防)因子）本発明において、診断、または事前診断は、マーカー物質に特異的な因子または手段を用いて実現することができる。

[0071] 本明細書において「因子」（agent)としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素 (例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー )でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸 (例えば、 cDNA、ゲノム DNAのような DNA、 mRNAのような RNAを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子 (例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子 (例えば、低分子リガンドなど)など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を (例えば、 70%以上の配列同一性)もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物 (例えば、単鎖抗体)、そのポリぺプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。

[0072] したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が 3 0%未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に (例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダィゼーシヨンアツセィ、結合アツセィなどによって測定することができる。

[0073] 本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子 (特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダィゼーシヨン、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド―レセプタ一反応、酵素一基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質—脂質相互作用、核酸— 脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプタ一一リガンド反応による相互作用、酵素一基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。 2種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。

[0074] 本明細書にお!、て「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディォタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えば F (ab ' ) 2および Fab断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ヮサビペルォキシダーゼ、 αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい

[0075] 本明細書にぉ、て「手段」とは、ある目的を達成する任意の道具となり得るものを、い、特に、本明細書では、「選択的に認識する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識することができる手段をいう。このような能力については、ある対象 (たとえば、トランスサイレチン）を他のもの（たとえば、システィ-ルトランスサイレチンのようなトランスサイレンチン誘導体)力も本明細書にぉ、て「識別する能力」と、うこともある。本明細書において用いる場合は、選択的に認識する手段としては、両方を認識する力示差的に認識することができさえすればよぐ片方のみを認識しもう片方は認識しないような手段である必要はない。ただし、好ましくは、片方のみを認識しもう片方は認識しな、ような手段であることが有利である。結果の解釈が効率よく行えるからである。

[0076] 本明細書において「抗原」（antigen)とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（immunogen)とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性ィ匕を開始し得る抗原をいう。

[0077] 本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよぐモノクローナル抗体であってもよい。

[0078] 本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。

[0079] 本明細書にぉ、て「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約 1000以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子 (例えば、低分子リガンドなど)などが挙げられるがそれらに限定されな、。

[0080] 本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。

例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。

[0081] 本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ぺプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよぐ環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよぐ改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされた複合体をさし得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、グリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸ィ匕または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化)などが挙げられる。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上のアナログを含むポリペプチド (例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野にお!、て公知の他の改変が包含される。特に言及する場合、本発明の「ポリペプチド」は、マーカー物質を指すことがある。

[0082] 本明細書にぉ、て「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよ、。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸ァナログは、当該分野において周知である。

[0083] 本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L 異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、ァラニン、ノリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォニン、トレオニン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、 γ カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オル-チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書で、う全てのアミノ酸は L体である。

[0084] 本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、上述の D型アミノ酸、ノルロイシン、ノラーニトロフエ二ルァラニン、ホモフエ二ルァラニン、パラーフルオロフェニルァラニン、 3 アミノー 2 ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンの D体または L体および D フエ-ルァラニンが挙げられる。

[0085] 本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および Ζまたは機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォニン、カナバニン、 2—メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、ァミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物を、う。

[0086] アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号力、または IUPAC— IUB Biochemica 1 Nomenclature Commissionにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた 1文字コードにより言及され得る。

[0087] 本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「ォリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、 2，一O—メチルーリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3，—P5，ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5プロピ-ルゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ォリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5チアゾールゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンが C— 5プロピ-ルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン（phenoxazine— modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 DNA中のリボースが 2，一O—プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，ーメトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではな、と示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体 (例えば、縮重コドン置換体)および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1またはそれ以上の選択された (または、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基および Zまたはデォキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、 Nucleic Acid Res. 19 : 5081 (1991) ; Ohtsukaら、 J. Biol. Chem. 260 : 2605— 2608 (1985) ;Rossoliniら、 Mol. Cell. Probes 8 : 91— 98 (1994) )。

[0088] 本明細書にぉ、て「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよ、。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチォエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、 2，一 O—メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸 (PNA)が含まれる力これらに限定されない。

[0089] 本明細書にぉ、て「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を、う。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号 2のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、診断に関与する生物学的な活性性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。

[0090] 本明細書にぉ、て「核酸」はまた、遺伝子、 cDNA、 mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の)核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、ェキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物 (組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。

[0091] 本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列してヽる。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子

」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに zあるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。

[0092] 本明細書において遺伝子の「相同性」とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子が相同性を有する力否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダィゼーシヨン法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間で DNA配列力代表的には少なくとも 50%同一である場合、好ましくは少なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少なくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98 %または 99%同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。

[0093] 本明細書ではアミノ酸および塩基配列の類似性、相同性および同一性の比較は、配列分析用ツールである BLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、 NCBIの BLAST 2. 2. 9 (2004. 5. 12 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記 BLASTを用い、デフォルトの条件でァラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。

[0094] 本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有する力、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸を！ヽぅ。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するォルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システィンィ匕、、ダルタチオン化、 S— S結合形成、酸化 (例えば、メチォニン側鎖の酸化）、ホルミル化、ァセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチルイ匕などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体ィ匕を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。

[0095] 本明細書にぉ、て「対応する」遺伝子 (例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレォチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子 (例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、マウス、ラットのアポリポタンパク質 cn,アポリポタンパク質 cm,トランスサイレチン、血清アルブミンは、それぞれ、ヒトにおいて、対応するアポリポタンパク質 cn,アポリポタンパク質 cm,トランスサイレチン、血清アルブミンを見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、アポリポタンパク質 cn,アポリポタンパク質 cm, トランスサイレチン、血清アルブミン）は、の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。

[0096] 本明細書にぉ、て「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さが n)に対して、 l〜n— 1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 2 0、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ (例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100 およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙して!/、な!/、整数で表される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーとして機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーとしての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。

[0097] 本明細書中で使用される「接触 (させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリぺプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ (例えば、遺伝子チップ)などに化合物を置くことが挙げられる。

[0098] 本明細書にぉ、て「ストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニ一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. OMの Na C1存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC (salin e- sodium citrate)溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムである）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecu lar Cloning 2ηα ed. , Current Protocols m Molecular Biology, ¾uppl ement 1〜38、 DNA Cloning 1： Core Techniques, A PRacltical Appr oach, Second Edition, Oxford University Press (1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列からは、好ましくは、 A配列のみまたは T配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド (例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする核酸分子によってコードされるポリぺプチドも包含される。

[0099] 本明細書にぉ、て「ノヽイブリダィズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダィズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号 2、 4、 6などで表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは 80%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。

[0100] DNA二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダィゼーシヨン条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性の DNAがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致した DNA二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。

Tm (°C) =81. 5 + 16. 6 (log[Na + ]) +0. 41 (%G + C) -600/N-O. 72 (% ホノレムアミド）

ここで、 Nは、形成される二重鎖の長さであり、 [Na + ]は、ハイブリダィゼーシヨン溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％G + Cは、ノ、イブリツド中の（グァニン +シトシン)塩基のパーセンテージである。不完全に一致したノヽイブリッドに関して、融解温度は、各 1%不一致 (ミスマッチ）に対して約 1°Cずつ減少する。

[0101] 本明細書において「精製された」生物学的因子 (例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い (すなわち濃縮されている)。

[0102] 本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも 75重量％、より好ましくは少なくとも 85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも 95重量％、そして最も好ましくは少なくとも 98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。

[0103] 本明細書にぉ、て遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子など力 Sインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなど力転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されて mRNAが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書に、う誘導体)であり得る。

[0104] 本明細書においてポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、 mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンプロット法、ドットプロット法または PCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタ一プレートを用いる ELISA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、 ELISA法または RIA法などが例示される。

[0105] 本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたは m RNAが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いて ELI SA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、 PCR法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドの mRNAレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたは mRNAレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。

[0106] 本明細書中で使用される用語「結合」は、 2つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介する力または起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。 [0107] 本明細書中で使用される用語「調節する（modulate)」または「改変する（modify) 」は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。

[0108] 本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物 (RNAなど)）の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。

[0109] 本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物 (RNAなど)）の「増カロ」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性を、う。

[oiio] 本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび Zまたはインビボなどのスクリ一ユングなどの生物学的実験にお!、て用いられる、検索の手段となる物質を!、、、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。

[0111] 通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも 11の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 12の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 13の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 14の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 20の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 30の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 50の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも 70%相同な、より好ましくは、少なくとも 80%相同な、さらに好ましくは、少なくとも 90%相同な、少なくとも 95%相同な核酸配列が含まれる。

[0112] 本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および Zまたは性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、 BLAST (Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215 :403— 410 (1990) )、 FASTA (Pearson & Lipman, Proc . Natl. Acad. Sci. , USA 85 : 2444- 2448 (1988) ) , Smith and Waterma n法（Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147 : 195— 197 (1981) )、および Needleman and Wunsch法 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 443— 453 (1970) )などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダィゼーシヨン、ゲノム DNAをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ (マイクロアレイアツセィ）、 PCRおよび in situハイブリダィゼーシヨンなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。

[0113] 本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子 (例えば、 DNAまたは RNAなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。

[0114] 通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも 11 の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 12の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 1 3の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 14の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 16の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 17の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 18の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 19の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 20の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 30の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも 50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも 70%相同な、より好ましくは、少なくとも 80%相同な、さらに好ましくは、少なくとも 90%相同な、少なくとも 95%相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成 (増幅)が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなブライマ一の設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、 LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar)を用いて行ってもよい。

[0115] 本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子 (例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）力生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がリガンドである場合、その生物学的活性は、そのリガンドが対応するレセプターに結合する活性を包含する。

[0116] (トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質 CII、アポリポタンパク質 cn誘導体、アポリポタンパク質 cm、アポリポタンパク質 cm誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質の検出）

体液などに含まれるトランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、ァポリポタンパク質 cn、アポリポタンパク質 cn誘導体、アポリポタンパク質 cm、アポリポタンパク質 c in誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質を検出する際には、これらトランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質 cn、アポリポタンパク質 cn誘導体、アポリポタンパク質 cm、アポリポタンパク質 cm誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質を特異的に認識する抗体 (以下、トランスサイレチン抗体、トランスサイレチン誘導体抗体、ァポリポタンパク質 cn抗体、アポリポタンパク質 cn誘導体抗体、アポリポタンパク質 cm抗体、ァポリポタンパク質 cm誘導体抗体および血清アルブミン抗体ならびにこれらに対応するタンパク質の抗体などと呼ぶ)を作製する。このような抗体は、従来公知の手法を用いて作製することができる。なお、抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良い。他のマーカー物質 (例えば、トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質 cn、アポリポタンパク質 cn誘導体、ァポリポタンノク質 cni、アポリポタンパク質 cm誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質など）についても、同様に抗体を作製することができる。

[0117] 一例として、トランスサイレチンモノクローナル抗体の調製方法を以下に記載する。

トランスサイレチンモノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物カゝら得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイプリドーマを調製し、得られるハイプリドーマからトランスサイレチンの活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。

[0118] 動物の免疫に抗原として用いるトランスサイレチンタンパク質としては、組換え DNA 法または化学合成により調製したトランスサイレチンタンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部のペプチドが挙げられる。例えば、配列番号 2に示したトランスサイレチンタンパク質のアミノ酸配列における、 21〜147番目のアミノ酸配列からなるぺプチド (すなわち、成熟型)を抗原として使用することができる。また、細胞表面に存在するトランスサイレチンタンパク質を特異的に検出するためのトランスサイレチンモノクロ一ナル抗体としては、配列番号 2に示したトランスサイレチンタンパク質のアミノ酸配列における任意の 10以上力もなるペプチドを抗原として使用することが好ましい。他のトランスサイレチンの分子経路における任意の因子 (例えば、トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質 CII、アポリポタンパク質 CII誘導体、ァポリポタンパク質 cm、アポリポタンパク質 cm誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質など）についても同様に抗原を設計することができる。

[0119] 得られた抗原用トランスサイレチンをキャリアータンパク質 (例えばサイログロブリン）に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。

[0120] 上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ゥマ、サル、ゥサギ、ャギ、ヒッジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは 4〜2 1日間隔で免疫する。

[0121] 最終の免疫日から 2〜3日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は 1回にマウス 1匹当たり、例えば 100 g用いられる。

[0122] 免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、または抗体産生細胞の培養上清中の抗体価を測定する。抗体検出の方法としては、公知技術、例えば EIA (ェンザィムィムノアツセィ）、 RIA (ラジオィムノアツセィ）、 ELISA (酵素連結ィムノソルベントアツセィ)等が挙げられる。

[0123] 抗体産生細胞と融合させるミエローマ (骨髄腫)細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地 (例えば HAT培地 )で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に 8—ァザグァニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチングァ- ンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン ·アミノプテリン ·チミジン（HAT)培地に生育できな!/、ものである。

[0124] ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、 P3 (P3x63Ag8. 653) (J . Immunol. (1979) 123 : 1548— 1550)、 P3x63Ag8U. 1 (Current Topics i n Microbiology and Immunology (1978) 81 : 1— 7)、 NS— l (Kohler, G. and Milstein, C. , Eur. J. Immunol. (1976) 6 : 511— 519)、 MPC— 11 (M argulies, D. H. et al. , Cell (1976) 8 :405-415) , SP2/0 (Shulman, M . et al. , Nature (1978) 276 : 269— 270)、 FO (de St. Groth, S. F. et al . , J. Immunol. Methods (1980) 35 : 1— 21)、 S194 (Trowbridge, I. S. , J . Exp. Med. (1978) 148 : 313— 323)、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature ( 1979) 277 : 131— 133)等が好適に使用される。

[0125] 抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞など力得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出または採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物を PBS 、 DMEM、 RPMI1640等の培地または緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。

[0126] 次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、 ME M 、 DMEM、 RPME— 1640培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比 1： 1〜1： 10で融合促進剤の存在下、 30〜37°Cで 1 〜15分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量 1, 000〜6, 000のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはセンダイウィルスなどの融合促進剤や融合ウィルスを使用することができる。また、電気刺激 (例えばエレクト口ポレーシヨン)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。

[0127] 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ゥエルに選択培地 (HAT培地など)を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。

[0128] ノ、イブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを取得する。取得したノ、イブリドーマ力もモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイプリドーマを 10〜20%ゥシ胎児血清含有 RPMI— 1640培地、 MEM培地、または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件 (例えば 37°C, 5%C02濃度)で 2〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイプリドーマを投与し、ハイプリドーマを大量に増殖させる。そして、 1〜4週間後に腹水または血清を採取する。

[0129] 上記抗体の採取方法にお!、て、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製する。

[0130] 従って、抗原は、抗体と結合し、または Bリンパ球、 Tリンパ球などの特異的レセプタ一に結合して、抗体産生および Zまたは細胞障害などの免疫反応をひきおこす物質 (例えば、タンパク質、脂質、糖などが挙げられるがそれらに限定されない)である。ここで、抗体またはリンパ球レセプターとの結合性を、「抗原性」（antigecity)という。抗体産生などの免疫応答を誘導する特性を「免疫原性」（immunogenicity)という。抗原として使用される物質は、例えば、その目的とする物質 (例えば、タンパク質)を少なくとも 1つ含む。含まれる物質は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るェピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において「ェピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。ェピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなェピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。

ェピトープは、必ずしもその正確な位置および構造が判明して、な、としても使用することができる。従って、ェピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、 T細胞の場合は、 T細胞レセプタータンパク質および Zもしくは主要組織適合性複合体 (MHC)レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、ェピトープは、分子の特徴 (例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷)であり、免疫グロブリン、 T細胞レセプターまたは HL A分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むェピトープは、ェピトープに独特な空間的コンフオメーシヨン中に 3つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、ェピトープは、少なくとも 5つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも 6つ、 7つ、 8つ、 9つ、または 10のこのようなアミノ酸からなる。ェピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフオメーシヨンを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフオメーシヨンを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、 X線結晶学、および 2次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるェピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、 Geysenら（1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3998 (所定の抗原における免疫原性ェピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第 4, 708 , 871号 (抗原のェピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；および Geysenら（1986) Molecular Immunology 23 : 709 (所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術)を参照されたい。同じェピトープを認識する抗体は、単純な免疫アツセィにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むェピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなェピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。

[0132] 従って、ペプチドを含むェピトープとして使用するためには、少なくとも 3アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも 4アミノ酸、より好ましくは少なくとも 5アミノ酸、少なくとも 6アミノ酸、少なくとも 7アミノ酸、少なくとも 8アミノ酸、少なくとも 9アミノ酸、少なくとも 10アミノ酸、少なくとも 15アミノ酸、少なくとも 20ァミノ酸、少なくとも 25アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。ェピトープは線状であってもコンフオメーシヨン形態であってもよ、。

[0133] 近年より迅速に所望の抗体を獲得するための方法が知られている。例えば、特開 2 006— 149383号に記載される方法を用いることができる。この方法は、免疫グロブリン遺伝子座において体細胞組換えを誘発させ、種々のィムノグロブリン分子を産生して!、る DT40細胞集団（WO2004Z011644を参照）の中から、ストレプトアビジンに特異的に結合する抗体分子を選別することによって行う。

[0134] その手順は、多様ィ匕ライブラリー (例えば、細胞表面上に多様な抗体分子を提示することができる-ヮトリ由来の DT40細胞によって構成されるライブラリー）から、目的リガンドに特異的に結合する少なくとも一種のタンパク質を選択する方法である。この方法は、以下の工程を含む：（1)該ライブラリ一中に存在する種々のタンパク質と目的リガンド (タンパク質と結合するものであれば如何なるものであってもよぐ限定はしないが、例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖質、低分子化合物など)を接触させ、該タンパク質群と目的リガンドの混合物をインキュベートし、少なくとも一種のタンパク質と目的リガンドの複合体を回収する工程 (2)工程（1)で選別された少なくとも数種のタンパク質と目的リガンドと接触させ、該タンパク質と目的リガンドの混合物をインキュペートし、該タンパク質と目的リガンドの結合性を確認する工程、（3)工程（1)で選別された少なくとも数種のタンパク質を 1種類又は 2種類の特定の対照リガンドと接触させ、該タンパク質と対照リガンドの混合物をインキュベートし、該タンパク質と対照リガンドが結合した力どうかを判別する工程、および、（4)工程（1)において目的リガンドとの結合性が確認され、かつ、工程 (c)において対照リガンドと結合しな力つたタンパク質を選択する工程。目的リガンドと結合するタンパク質の選択は当該技術分野における通常の知識に基づいて行なうことができる。例えば、適当な担体に目的リガンドを結合させ、結合した目的リガンドを多様ィ匕ライブラリーに存在するタンパク質と接触させ、適切な条件下でインキュベートした後、生じた担体一目的リガンドータンパク質の複合体を遠心分離などにより回収し、目的リガンドと結合するタンパク質を選択することがでさる。

[0135] (改変体）

あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、糖鎖結合領域、システィニル化領域、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造にぉ、て他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはその DNAコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従つて、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応する DNAにおいて行われ得る。

[0136] 上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Kyte. Jおよび Doolittle, R. F. J. Mol. Bi ol. 157 (1) : 105- 132, 1982)。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子 (例えば、酵素、基質、レセプター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは:イソロイシン（ +4. 5)；バリン（+4. 2)；ロイシン（ + 3. 8)；フエ-ルァラニン（ + 2. 8)；システィン Zシスチン（ + 2. 5)；メチォニン（ + 1. 9)；ァラニン（ + 1. 8)；グリシン（一0. 4)；スレォニン（一 0. 7) ;セリン（一0. 8)；トリプトファン（一0. 9) ;チロシン（一1. 3) ;プロリン (— 1. 6) ;ヒスチジン（一3. 2)；グノレタミン酸（一 3. 5)；グノレタミン（一3. 5) ;ァスパラギン酸（一3. 5)；ァスパラギン（一3. 5) ;リジン（一3. 9)；およびアルギニン（一4. 5) )である。

[0137] あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 (例えば、酵素活性において等価なタンパク質)を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましぐおよび ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなァミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。

[0138] 親水性指数もまた、本発明のアミノ酸配列を改変するのに有用である。米国特許第 4, 554, 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（ + 3. 0)；リジン（ + 3. 0)；ァスパラギン酸（ + 3. 0± 1)；グルタミン酸（ + 3. 0± 1)；セリン（ + 0. 3)；ァスパラギン（ + 0. 2)；グルタミン（ + 0. 2)；グリシン（0)；スレオニン（一0. 4)；プロリン（一0. 5± 1)；ァラニン（一0. 5)；ヒスチジン（ —0. 5)；システィン（一1. 0)；メチォニン（一1. 3)；バリン（一 1. 5)；ロイシン（一1. 8 ) ;イソロイシン（一 1. 8) ;チロシン（一2. 3)；フエ-ルァラニン（一2. 5) ;およびトリプトフアン（一 3. 4)。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましく、および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。

[0139] 本発明にお、て、「保存的置換」とは、アミノ酸置換にぉ、て、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または Zおよび疎水性指数が上記のように類似して、る置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにパリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

[0140] 本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 (truncated)改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子 (allele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ (homolog)」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、 60%以上の相同性、より好ましくは、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上の相同性)を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ortholog)」とは、オルソロガス遺伝子 (orthologous gene)ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスの αヘモグロビン遺伝子はオルソログである力ヒトの αへモグロビン遺伝子と /3ヘモグロビン遺伝子はパラログ (遺伝子重複で生じた遺伝子)である。

[0141] 本明細書において「保存的（に改変された)改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がァミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドン GCA、 GCC、 GCG、および GCUはすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。したがって、ァラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなぐ記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチォニンのための唯一のコドンである AUG、および通常トリプトフアンのための唯一のコドンである TGGを除く） 1S 機能的に同一な分子を産生するため〖こ改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。

[0142] 本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを 1つ以上、例えば、 1〜： LO個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に 1つ以上、例えば、 1〜10個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから 1つ以上、例えば、 1〜 10個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を欠失させることをいう。ァミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、ァシル化 (例えば、ァセチル化)などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよぐ非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

[0143] 本明細書にぉ、て、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物力置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよぐそのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能 (例えば、マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの 20%以内、 10%以内、または 10 0個以下、 50個以下、 25個以下などであり得る。

[0144] 本明細書にぉヽて「誘導体」は、上記のような「改変体」に対しても存在し得る。

[0145] (診断方法）本明細書において「診断」とは、被検体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調ベることができ、そのような情報を用いて、被検体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「事前診断

を含む。

[0146] 本明細書において特に、「事前診断」とは、糖尿病について言及する場合、糖尿病の発症前の段階を検出することをいい、将来の発症リスクを判定すること、糖尿病の予防を目的として糖尿病に罹患するおそれの有無を判定することを含む。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を事前に調べることができ、そのような情報を用いて、被検体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。

[0147] 本発明の診断方法は、原則として、身体力出たものを利用することができることから、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「事前診断もしくは診断を支援」すると称することがある。

[0148] 本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になつた場合に、そのような疾患または障害の悪ィ匕を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいう。

[0149] 本発明の糖尿病の診断方法においては、糖尿病のマーカー物質として、血液中のこれら 3種のタンパク質のうちの少なくとも 1種の濃度を測定する。そして、その測定値を健常値と比較することにより、糖尿病の診断を行う。ここで、「糖尿病の診断」とは、糖尿病に罹患している力否かを判定することのみではなぐ糖尿病の予防を目的として糖尿病に罹患するおそれの有無を判定することや、糖尿病の改善状態や再発のモニタリングを行うことも含む。本発明の糖尿病の診断方法においては、 3種のマーカー物質の一部だけの濃度を測定してもよ!/、し、 3種全部の濃度を測定してもよ、。特に、全部のマーカー物質の濃度を測定する場合は、マルチマーカーシステムを組んで多方面力も糖尿病の診断を行うことができ、診断の精度が高い。また、これら 3種のタンパク質は、ずれも健常者の血液中にも存在して、るので、その濃度の変動をモニタリングすることにより、健常者が糖尿病を発病する兆候を検出することもできる。

[0150] 本発明の疾病の診断方法は、被検者の体液中における上記マーカー物質 (例えば、（a)〜(n) )の少なくとも 1つの濃度を健常値と比較し、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定するものである。本発明の疾病の診断方法では、血糖を直接指標とするのではなぐ別のマーカー物質を指標とするので、血糖値が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、糖尿病の有無に加え、糖尿病の将来の発症リスクを判定することができる。なお、「糖尿病の事前診断」および「糖尿病の将来の発症リスクを判定する」とは、交換可能に使用され、糖尿病を発症していない時点において、将来、糖尿病に罹患する可能性 (危険性)の有無またはその可能性 ( 危険性)の程度を判定することを、う。

[0151] ここで、各マーカー物質における質量 Z電荷比（以下、「MZZ」と略記することもある。）の「約 7040」、「約 8330」、「約 8530」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね ±0. 2%の幅を有する。すなわち、約 7040は概ね 7040±0. 2%、約 8330は概ね 8330±0. 2%、約 8530は概ね 8530±0. 2%を表す。他の質量 Z電荷比についても全く同様に、概ね ±0. 2%の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、被検者が糖尿病を発症して、る場合または糖尿病の将来の発症リスクが高、場合、体液中のマーカー物質 (a)、（b)、（c)、（d)、（e)、（f)、（g)、（h)および (i)の濃度はより高値を示し、マーカー物質、（k)、（1)、（m)および (n)の濃度はより低値を示す。

[0152] 本発明の疾病の診断方法の好ましい実施形態においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液または体液成分を接触させて、体液または体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の疾病の診断方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清または血漿が挙げられる。

[0153] 本発明の疾病の診断方法の好ましい実施形態では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。力かる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定ィ匕することができる。その結果、 1個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、 1個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料力もでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。

[0154] 本発明の疾病の診断方法の好ましい実施形態においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体、金属キレート体または抗体を用い、ィォン交換体、金属キレート体または抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質力イオン交換体または金属キレート体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、ィムノアッセィ (抗体の場合)が挙げられる。

[0155] (システム）

本明細書において、「システム」とは、診断するための任意の系をいい、一般に、 1 または複数の構成要素力なり、複数の構成要素がある場合それらの要素は互いに作用 '関連し合っており、全体として調和のとれた挙動'機能を示すという 3条件を満足する系をいう。システムは、装置、組成物、診断薬など任意の形態であり得る。従つて、システムは、例えば、測定装置を備える大掛力りなシステムから、クロマトグラフィ一を備えるシステム、免疫反応を利用したキット、抗体を含む組成物（すなわち、マーカー物質のモノクロナール抗体を含む、体外医薬品である診断薬)などを包含することが理解される。

[0156] (スクリーニング）

本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることち企図される。

[0157] 本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作 Z評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子 (例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよぐインシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーユングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることち企図される。

[0158] 1実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質または本発明のポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合する力、またはこれらの活性を調節する、候補ィ匕合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアツセィを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリ一法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー;逆重畳を要する合成ライブラリ一法；「1ビーズ 1ィヒ合物」ライブラリ一法;およびァフィユティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ一法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の 4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12 : 145)。

[0159] 分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る： DeWittら（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 6909 ;Erbら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 11422 ; Zuckermann¾ ( 1994) J. M ed. Chem 37: 2678 ;Cho¾ (1993) Science 261:1303; Carrell¾ ( 1994) An gew Chem. Int. Ed. Engl.33:2059;Carrell (1994)Angew Chem. Int. Ed. Engl.33 :2061;および Gallopら（1994) Med. Chem 37:1233。

[0160] 化合物のライブラリ一は、溶液中で（例えば、 Houghten(1992)BioTechniques

13:412〜421)、あるいはビーズ上（Lam(1991)Nature 354:82〜84)、チップ上（Fodor( 1993) Nature 364: 555〜556)、細菌（Ladner 米国特許第 5, 2 23, 409号）、胞子（Ladner、上記）、プラスミド（Cullら（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865〜1869)またはファージ上（3。01 ぉょび3111辻11(1990)3₍^ nce 249 :386〜390; Devlin (1990) Science 249:404〜406;Cwirlaら（199 0) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.87:6378〜6382;Felici(1991)J Mol B iol 222 : 301〜310 ; Ladner上記）にお!/、て示され得る。

[0161] 本発明は、他の実施形態において、本発明の活性成分 (例えば、ポリペプチドまたは核酸）と同等に有効な因子をスクリーニングするための道具として、コンピュータによる疋直的構造活'性ネ目関 (quantitative structure activity relationship = Q SAR)モデルィ匕技術を使用して得られる化合物もまた、本発明に包含される。ここで、コンピュータ技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質铸型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、 CATALYSTTM ファーマコフォア法（Ekins et al. , Pharmacogenetics, 9:477〜489, 1999;Ekins et al. , J. Pharm acol. & Exp. Ther. , 288:21〜29, 1999;Ekins et al.、 Pharmacol. &

Exp. Ther. , 290:429〜438, 1999;Ekins et al.、 Pharmacol. & Exp . Ther. , 291:424〜433, 1999)および比較分子電界分析（comparative mol ecular field analysis;し oMFAノ (Jones et al.、 Drug Metabolism & Dis position, 24:1〜6, 1996)などを使用して示されている。本発明において、コンビユータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、 CATALYSTTMバージョン 4 (Molecular Simulations, Inc. , San Diego, CA)など）を使用して行われ得る。 [0162] 活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンビユータモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、 QUANTA (Molecular Simul ations, Burlington, MA, 1992) , SYBYL (Molecular Modeling Software , Tripos Associates, Inc. , St. Louis, MO, 1992)、 AMBER (Weiner et a 1. , J. Am. Chem. Soc. , 106 : 765— 784, 1984)、 CHARMM (Brooks et a 1. 、J. Comp. Chem. , 4 : 187〜217, 1983)などのようなプログラムを使用して行うことができる。これにカロえ、 CHARMM, AMBERなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊ィ匕されたコンピュータモデリングは、 GRID (Goodford et al. 、J. Med. Chem. , 28 : 849〜857, 198 5) , MCSS (Miranker and Karplus, Function and Genetics, 11 : 29〜34 , 1991)、 AUTODOCK(Goodsell and Olsen, Proteins : S tructure, Func tion and Genetics, 8 : 195〜202, 1990)、 DOCK (Kuntz et al. , J. Mol. Biol. , 161 : 269-288, (1982) )などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、 LUDKBohm, J. Comp. Aid. Molec. Design, 6 : 61〜78, 1992)、 LEGEND (Nishibata and Itai, T etrahedron, 47 : 8985, 1991)、 Leap Frog (Tripos Associates, St. Louis, MO)などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物を設計することができる。

[0163] (投与 '注入'医薬）

本発明のスクリーニング方法によって得られた物質を含む組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直接投与などが挙げられる。

[0164] 本明細書において「キット」とは、通常 2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分 (例えば、抗体、標識など)が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなぐ使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分 (例えば、試薬をどのように処理すべき力を記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、抗体の使い方などを記載した指示書などが含まれる。

[0165] 本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法を医師、患者など投与を行う人に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、骨格筋に投与 (例えば、注射などによる)することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁 (例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局 (FDA)など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書 (package insert)であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体 (例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール)のような形態でも提供され得る。

[0166] 本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。

[0167] 本明細書において「生体内」または「インビボ」（in vivo)とは、生体の内部をいう。

特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。

[0168] 本明細書にぉ、て「インビトロ」とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に)摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。

[0169] 本明細書にぉ、て「ェキソビボ」とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子または因子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をェキソビボという。

[0170] 本発明において使用されるポリペプチド、核酸、医薬ならびにそのようなポリべプチドまたは核酸によって調製された組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与方法は、経口投与、非経口投与 (例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など)、患部への直接投与などが挙げられる。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。本発明の組成物および医薬は、全身投与されるとき、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、 pH、等張性、安定性などに相当な注意を払うことを条件として、当業者の技術範囲内である。

[0171] 本発明において医薬の処方のために使用される溶媒は、水性または非水性のいずれかの性質を有し得る。さらに、そのビヒクルは、処方物の、 pH、容量ォスモル濃度、粘性、明澄性、色、滅菌性、安定性、等張性、崩壊速度、または臭いを改変または維持するための他の処方物材料を含み得る。同様に、本発明の組成物は、有効成分の放出速度を改変または維持するため、または有効成分の吸収もしくは透過を促進するための他の処方物材料を含み得る。

[0172] 本発明の製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなぐ投与すべき量を決定することができる

[0173] (好ましい実施形態）

以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。

[0174] (診断システム）

1つの局面において、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マ一力一物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステムを提供する。

[0175] ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断するためのシステムまたは組成物を提供する。

[0176] ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質に特異的に相互作用する因子を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断するためのシステムまたは組成物を提供する。

[0177] ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断するためのシステムを提供する。

[0178] ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質を含む、被験体が糖尿病であるかどうか診断するためのシステムまたは組成物を提供する。

[0179] ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質に特異的に相互作用する因子を含む、被験体が糖尿病であるかどうか診断するためのシステムまたは組成物を提供する。

[0180] ある具体的な局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか診断するためのシステムを提供する。

[0181] これらの糸且成物またはシステムは、上記マーカー物質を同定することができる限り、任意の被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いること力できることが理解される。

[0182] 1つの実施形態において、使用されるマーカー物質は、前記被験体の体液、好ましくは血液中に存在するものであることが特徴である。理論に束縛されることを望まなヽ力体液であれば、取り出した後処理が簡便であり、大量の診断または診断支援が可能であるからである。理論に束縛されることを望まないが、血液が好ましいのは、本発明のマーカー物質の挙動が顕著に反映されるからである。 [0183] 1つの実施形態では、本発明において使用されるマーカー物質は、遺伝子産物であることが特徴である。特に、この遺伝子産物は、糖代謝に直接関連することがこれまで知られていな力つたものであることが好ましい。なぜなら、糖代謝に直接関連することが知られてヽな、マーカーでも、糖尿病のマーカー物質として診断または事前診断が可能になることは、これまで知られておらず、簡便、早期に糖尿病の診断を行うことが可能になるからである。また、本発明において同定されたマーカー物質は、モデル動物においてもマーカーとなることが示されており、ヒトにおいて経験的に見出されてきたマーカーのように、多数の病因によって変動し得、従って、糖尿病であればその疾患のみに起因するかどうかが不明であったものが多いところ、本発明のマーカ一物質では、そのような不明確性は無い。なぜなら、本発明のマーカー物質は、プロティンチップによる網羅解析の結果見出されたものであり、かつ、モデル動物における確認も行って、る力である。

[0184] 具体的な実施形態では、本発明において用いられるマーカー物質は、トランスサイレチン、トランスサイレチン誘導体、アポリポタンパク質 CII、アポリポタンパク質 CII誘導体、アポリポタンパク質 cm、アポリポタンパク質 cm誘導体および血清アルブミンならびにこれらに対応するタンパク質力もなる群より選択される、 1またはそれより多い物質を含む。好ましくは、 2以上、 3以上、あるいはそれより多い数のマーカー物質（特に、各々、誘導体と対を成しているものを 1群とみなしたとき、異なる群から選択される複数のマーカー物質）を含むことが有利である。マルチマーカーシステムとして、より精確な診断を行うことが可能であり、確定診断をも可能にするからである。

[0185] 1つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子 (例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など )である。好ましくは、因子は、抗体 (例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体)である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。

[0186] 本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他力も識別するための存在 (たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、 RI (ラジオアイソトープ)法、蛍光法、ピオチン法、化学発光法等を挙げることができる。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によつて標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、 lOnm以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができる力シァニン色素（例えば、 CyDyeTMシリーズの Cy3、 Cy5等）、ローダミン 6G試薬、 N ァセトキシ N2—ァセチルァミノフルオレン (AAF)、 AAIF (AAFのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が lOnm以上である蛍光物質としては、例えば、 Cy5とローダミン 6G試薬との組み合わせ、 Cy3とフルォレセインとの組み合わせ、ローダミン 6G試薬とフルォレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。

[0187] 本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、 X線解析装置、 SPR、クロマトグラフィー（例えば、 HPLC、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、免疫学的手段 (例えば、ウェスタンプロッティング、 ELISA、 RIA)、生化学的手段（例えば、 pi電気泳動、サザンブロッテイング、二次元電気泳動）、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法（2DE— DIGE)、同位体標識法 (ICAT)、タンデムァフィ-ティ精製法 (TAP法）、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせ力なる群より選択される。

[0188] 本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムは、さらに、マーカー物質の標準を含む。このような標準は、マーカー物質の検出手段 (該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段など)が正常に機能して、るかどうかを確認するために用いることが好ま、。

[0189] 好ましい実施形態では、本発明では、対象となるサンプルを精製する手段をさら〖こ備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態にぉ、て使用され得る力これは必須ではな、。

[0190] 本発明にお、て、被験体は、哺乳動物を含み、 1つの実施形態では、被験体は、齧歯類を含む。このような齧歯類 (例えば、ラット、マウスなど）は、モデル動物、特に、糖尿病のモデル動物が作製されていることから好ましい。好ましい実施形態では、被験体は、ヒトを含む。

[0191] 1つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、本発明のマ一力一物質の定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカー物質の定量を行うための定量手段をさらに備える。

[0192] 1つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカ一物質が正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。

[0193] 1つの実施形態では、本発明のシステムは、マーカー物質またはマーカー物質に特異的に相互作用する前記因子を含む組成物である。

[0194] (トランスサイレチン関連）

1つの局面では、本発明のシステムにおいて対象となるマーカー物質は、トランスサィレチンおよびトランスサイレチン誘導体力なる群より選択される少なくとも 1つの物質を含み、該トランスサイレチン誘導体は、 S—システィ-ルトランスサイレチン、ダルタチオン化トランスサイレチン、 S— S結合形成トランスサイレチン、酸化 (例えば、メチォニン側鎖の酸化）トランスサイレチン、ホルミル化トランスサイレチン、ァセチル化トランスサイレチン、リン酸ィ匕トランスサイレチン、糖鎖付カ卩トランスサイレチン、ミリスチノレィ匕トランスサイレチンなどを挙げることができる。特に、 S—システィニルトランスサイレチンであることが好ましい。また、本発明は、トランスサイレチンと、トランスサイレチン誘導体 (特に、酸ィ匕還元経路において登場する代謝産物）との量比を検討することによって、糖尿病の悪ィ匕度または危険度を決定することができることを見出した点に顕著性があると!/、うべきである。

[0195] 従って、 1つの実施形態では、トランスサイレチンの減少およびトランスサイレチン誘導体の増カロからなる群より選択される少なくとも 1つの現象は、糖尿病を発症している力または将来の発症リスクが高、ことの指標である。

[0196] 好ましくは、トランスサイレチンの減少およびトランスサイレチン誘導体の増カロからなる群より選択される少なくとも 1つの現象は、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標であり得る。このような指標は、本明細書の記載に基づいて当業者が決定することができることが理解される。

[0197] 具体的な実施形態では、本発明において対象となるトランスサイレチンは、配列番号 1もしくは配列番号 3に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号

2もしくは配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有する、あるいは、これらの改変配列を有する。

[0198] 別の実施形態では、本発明において対象となるトランスサイレチン誘導体は、配列番号 1もしくは配列番号 3に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号 2もしくは配列番号 4に示されるアミノ酸配列における、それぞれ、 30 位 (成熟形態では 10位)のシスティンまたはそれに対応するシスティンがシスティ- ル化されている誘導体であるか、あるいは、これらの改変配列を有し得る。

[0199] 1つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、トランスサイレチンの単量体と四量体との区別をする能力を有する。

[0200] 別の実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、トランスサイレチンと S—システィ-ルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する（例えば、抗体 )。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、トランスサイレチンまたは S—システィ-ルトランスサイレチンの、ずれか一方に特異的に (好ましくは、選択的に)反応するものを選択することによって作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野にお!、て周知技術を用いて達成することができる。

[0201] 好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、トランスサイレチンと S システィニルトランスサイレチンとを認識し、かつ、本発明のシステムはトランスサイレチンと S システィニルトランスサイレチンとを識別する手段をさらに備える。例えば

、抗体 +電気泳動などの分子量等での識別手段の組み合わせを提供することによつて、トランスサイレチン類は同定するが、誘導体とそれ以外とを識別するために電気泳動または質量分析などを利用することで識別を達成することができることが理解される。このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる

[0202] 好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、トランスサイレチンと S システィニルトランスサイレチンとを認識し、本発明のシステムはトランスサイレチンの分子量と S システィニルトランスサイレチンの分子量とを識別する手段、およびトランスサイレチンと S システィ-ルトランスサイレチンとの相対比を測定する手段をさらに備える。このようなシステムを提供することによって、本発明は、糖尿病の悪化度、発症確率の判定することができる。

[0203] (アポリポタンパク質 CII)

好ましい局面では、本発明のシステムにおいて用いられるマーカー物質は、ァポリポタンパク質 CIIまたはアポリポタンパク質 CII誘導体を含み、該ァポリポタンパク質 C II誘導体は、プロアポリポタンパク質 CIIなどを挙げることができる。

[0204] 1つの実施形態では、アポリポタンパク質 CIIの減少およびアポリポタンパク質 CII誘導体の変動力なる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症している力または将来の発症リスクが高、ことの指標であり得る。

[0205] 1つの実施形態では、アポリポタンパク質 CIIの減少およびアポリポタンパク質 CII誘導体の変動力なる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標であり得る。

[0206] 具体的な実施形態では、本発明にお、て対象となるアポリポタンパク質 CIIは、配列番号 5もしくは配列番号 7に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号 6もしくは配列番号 8に示されるアミノ酸配列、あるいは、これらの改変配列を有する。

[0207] 別の実施形態では、本発明にお、て対象となるブロアポリポタンパク質 CIIは、上記配列においてリード配列が結合したものであり得る。

[0208] 1つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、ァポリポタンパク質 CIIを選択的に識別する能力を有する (例えば、抗体)。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、アポリポタンパク質 CIIを特異的に (好ましくは、選択的に）反応するものを選択することによって作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野にお、て周知技術を用いて達成することができる。

[0209] 好ま、実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質 CI Iを選択的に識別する能力を有し、かつ、システムは該ァポリポタンパク質 CIIを定量する手段を備える。このようなシステムを提供することによって、本発明は、糖尿病の悪化度、発症確率の判定することができる。

[0210] 特に好ましい局面では、本発明は被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マ一力一物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステムであって、該認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、システムを提供する。ここで、マーカー物質、相互作用する因子、選択的に認識する手段等の実施形態としては、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有することが担保される限り、上記 (診断システム）におヽて例示されてヽる任意の形態を採り得ることが理解される。

[0211] 好ましい実施形態では、本発明のシステムにおいて使用されるトランスサイレチンは、 S—システィニルトランスサイレチンである。

[0212] 好まヽ実施形態では、本発明のシステムにおヽて使用される選択的に認識する手段は、抗体である。この抗体は、トランスサイレチンと S—システィ-ルトランスサイレチンとを示差的に認識することができる限り、どのような性質を有していてもよい。好ましくは、トランスサイレチンまたは S—システィ-ルトランスサイレチンの、ずれか一方のみを反応し、他方とは実質的に反応しない抗体であることが有利であり、より好ましくは、前者のみと反応する抗体と後者のみと反応する抗体の両方のセットを備えて、てもよい。

[0213] 本明細書において「実質的に反応しない」とは、通常使用するアツセィシステム (例えば、 ELISA等）において、検出限界以下であることをいう。したがって、そのような「実質的に反応しない」状態は、使用するアツセィシステムにより異なる力標準的には、ピオチンストレプトアビジンを用いた ELISAアツセィ系における検出限界を想定する。当業者は、実際のアツセィにおいて、検出を阻止しない濃度'限界値を設定することができ、これらは、実質的に反応しないということができる。

[0214] (アポリポタンパク質 cm)

好ましい局面では、本発明のシステムにおいて用いられるマーカー物質は、ァポリポタンパク質 cmまたはアポリポタンパク質 cm誘導体を含み、該ァポリポタンパク質 cinはアポリポタンパク質 cnioであり、該ァポリポタンパク質 cm誘導体は、アポリポタンパク質 cm 1およびアポリポタンパク質 cni2からなる群より選択される。また、本発明は、アポリポタンパク質 cmo、アポリポタンパク質 cniiおよびァポリポタンパク質 CIII2の量比を検討することによって、糖尿病の悪ィ匕度または危険度を精確に決定することができることを見出した点に顕著性があるというべきである。

[0215] 従って、 1つの実施形態では、アポリポタンパク質 cmの増カロ、アポリポタンパク質 C

III1の増加およびアポリポタンパク質 CIII2の増加からなる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症している力、または将来の発症リスクが高いことの指標である。

[0216] 好ましくは、アポリポタンパク質 cmの増カロ、アポリポタンパク質 CIII1の増加およびアポリポタンパク質 CIII2の増カロからなる群より選択される少なくとも 1つの現象力糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標であり得る。このような指標は、本明細書の記載に基づいて当業者が決定することができることが理解される。

[0217] 具体的な実施形態では、本発明にお、て対象となるアポリポタンパク質 cmは、配列番号 9もしくは配列番号 11に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号 10もしくは配列番号 12に示されるアミノ酸配列を有する、あるいは、これらの改変配列を有する。

[0218] 別の実施形態では、本発明にお、て対象となるアポリポタンパク質 cm誘導体は、配列番号 9もしくは配列番号 11に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号 10もしくは配列番号 12に示されるアミノ酸配列において、それぞれ、配列番号 10および 12のそれぞれ 73位および 74位またはそれに対応するスレオニンに糖鎖を有する誘導体である。

[0219] 1つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、ァポリポタンパク質 cmとアポリポタンパク質 CIII誘導体とを区別する能力を有する。

[0220] 別の実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、アポリポタンパク質 CIIIO、アポリポタンパク質 CIII1およびアポリポタンパク質 CIII2のうち少なくとも 2つを区別する能力を有する。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、アポリポタンパク質 cmo、アポリポタンパク質 cniiおよびアポリポタンパク質 cni2のうち少なくとも 2つを特異的に (好ましくは、選択的に)反応するものを選択することによつて作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。

[0221] 好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質 CI ΠΟとアポリポタンパク質 CIII1とアポリポタンパク質 CIII2とをすベて区別する能力を有する（例えば、抗体)。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、ァポリポタンパク質 CIIIOとアポリポタンパク質 CIII1とアポリポタンパク質 CIII2とをすベて区別するように特異的に (好ましくは、選択的に)反応するものを選択することによって作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。

[0222] 従って、 1つの実施形態では、因子または前記手段は、アポリポタンパク質 cmとァポリポタンパク質 cm誘導体とを区別する能力を有する抗体を含み、好ましくは、アポリポタンパク質 cmo、アポリポタンパク質 cniiおよびアポリポタンパク質 cni2のうち少なくとも 2つを区別する能力を有する抗体を含み、アポリポタンパク質 CIIIOとァポリポタンパク質 cm lとアポリポタンパク質 cni2とをすベて区別する能力を有する抗体の組み合わせを含む。

[0223] 好ま、実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質 CI

Πとアポリポタンパク質 cm誘導体とを認識し、前記システムは、アポリポタンパク質 ci Πとアポリポタンパク質 cm誘導体とを識別する手段をさらに備える。例えば、抗体 + 電気泳動などの分子量等での識別手段の組み合わせを提供することによって、アポリポタンパク質 cm類は、同定するが、誘導体とそれ以外とを識別するために電気泳動または質量分析などを利用することで識別を達成することができることが理解される。このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。

[0224] 好ま、実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質 CI

Πとアポリポタンパク質 cm誘導体とを認識し、本発明のシステムは、ァポリポタンパク質 CIIIO、アポリポタンパク質 CHI 1およびアポリポタンパク質 CIII2のうち少なくとも 2 つを識別する手段をさらに備える。例えば、抗体 +電気泳動などの分子量等での識別手段の組み合わせを提供することによって、アポリポタンパク質 cm類は、同定するが、誘導体とそれ以外とを識別するために電気泳動または質量分析などを利用することで識別を達成することができることが理解される。このような技術は、当該分野にお!、て周知技術を用いて達成することができる。

[0225] 好ま、実施形態では、本発明における因子または手段は、アポリポタンパク質 CI

Πとアポリポタンパク質 cm誘導体とを認識し、前記システムは、アポリポタンパク質 ci

ΠΟとアポリポタンパク質 CIII1とアポリポタンパク質 CIII2とをすベて識別する手段をさらに備える。このようなシステムを提供することによって、本発明は、糖尿病の悪化度、発症確率の判定することができる。

[0226] (血清アルブミン）

別の局面において、本発明のシステムにおいて用いられるマーカー物質は、血清アルブミンまたは血清アルブミン誘導体を含み、該血清アルブミン誘導体は、酸ィ匕された血清アルブミン、フラクション化された血清アルブミンなどが挙げられる。

[0227] 従って、 1つの実施形態では、血清アルブミンの減少および血清アルブミン誘導体の変動力もなる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高いことの指標である。アルブミンは、種々の疾患の指標として測定されている力糖尿病の指標であることはこれまで知られていな力つた。特に、トランスサイレチン、アポリポタンパク質 cn、アポリポタンパク質 ΠΙなどと組み合わせたときに、診断の精度を上昇させることは初めて見出されたことは特筆に価する。

[0228] 好ましくは、血清アルブミンの減少および血清アルブミン誘導体の変動力なる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である。このような指標は、本明細書の記載に基づいて当業者が決定することができることが理解される。

[0229] 具体的な実施形態では、本発明にお、て対象となる血清アルブミンは、配列番号 1 3もしくは配列番号 15に示される核酸配列によってコードされる力、または配列番号 1 4もしくは配列番号 16に示されるアミノ酸配列、あるいは、これらの改変配列を有する。あるいは、本明細書において記載される力他に公知の血清アルブミン配列を有していても良い。

[0230] 1つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有する（例えば、抗体)。このような能力を有する因子または手段は、例えば、抗体であれば、抗体のライブラリーを作製し、さらに、そのライブラリーの中から、血清アルブミンに特異的に (好ましくは、選択的に)反応するものを選択することによって作製することができ、このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。抗体以外でも同様に、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。

[0231] 好ましい実施形態では、本発明における因子または手段は、血清アルブミンを選択的に識別する能力を有し、かつ、前記システムは該血清アルブミンを定量する手段を備える。例えば、抗体 +電気泳動などの分子量等での識別手段の組み合わせを提供することによって、血清アルブミン類は同定する力血清アルブミン自体とそれ以外とを識別するために電気泳動または質量分析などを利用することで識別を達成することができることが理解される。このような技術は、当該分野において周知技術を用いて達成することができる。

[0232] 1つの局面において、本発明のシステムは、好ましくは、診断薬として使用され得る [0233] (診断方法）

1つの局面において、本発明は、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断もしくは診断するため、または該事前診断もしくは診断を支援するための方法であって、 A) 該被験体由来のサンプル中のマーカー物質を測定する工程;および B)該測定結果から、該被験体が糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程、を包含する、方法を提供する。ここで、サンプルの取得は、どのような手段であっても良い。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定するェ程は、正常値と比べて、各々のマーカー物質に比較して異常であるかどうかを判定すること〖こよって実施することができる。

[0234] 本発明の方法において、使用されるマーカー物質などは、上記 (システム）、（トランスサイレチン）、（アポリポタンパク質 CIII)、（アポリポタンパク質 CII)および (血清アルブミン)の項にお!、て記載される任意の 1または複数の特徴を矛盾することがない限り有して、ても良!、ことが理解される。

[0235] (使用）

1つの局面において、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マ一力一物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための医薬の製造における、使用を提供する。ここで、サンプルの取得は、どのような手段であっても良い。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程は、正常値と比べて、各々のマーカー物質に比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。

[0236] 本発明の方法において、使用されるマーカー物質などは、上記 (システム）、（トランスサイレチン）、（アポリポタンパク質 CIII)、（アポリポタンパク質 CII)および (血清アルブミン)の項にお!、て記載される任意の 1または複数の特徴を矛盾することがない限り有して、ても良!、ことが理解される。 [0237] 別の局面では、本発明は、被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための使用を提供する。ここで、サンプルの取得は、どのような手段であっても良い。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程は、正常値と比べて、各々のマーカー物質に比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。

[0238] 本発明の方法において、使用されるマーカー物質などは、上記 (システム）、（トランスサイレチン）、（アポリポタンパク質 CIII)、（アポリポタンパク質 CII)および (血清アルブミン)の項にお!、て記載される任意の 1または複数の特徴を矛盾することがない限り有して、ても良!、ことが理解される。

[0239] (さらなる説明）

本発明の糖尿病の診断方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のィムノアツセィ、質量分析 (MS)、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。

[0240] ィムノアッセィによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することが出来る。ィムノアツセィの例としては、抗原抗体結合物を直接的または間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたェンザィムィムノアッセィ (EIA)、ラジオィムノアツセィ (RIA)、蛍光ィムノアッセィ (FIA)等の方法が挙げられる。なお、これらのィムノアツセィに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。

[0241] 質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオンィ匕の方法としては、マトリクス支援レーサーイオンィ匕 (matrix— assisted laser desorption/ lonizat ion、 MALDI)、エレクトロスプレーイオンィ匕（electrospray ionization, ESI)のいずれも適用可能である力多価イオンの生成が少ない MALDIが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time— of— flight mass spectromer、 TOF)と組み合わせた MALDI—TOF— MSによれば、より正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。さらに、 2台の質量分析計を用いた MSZMSによれば、より正確にマーカ一物質の濃度を測定することができる。

[0242] 電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料を SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE)に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。 SDS— PAGEだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動 (IEF)と組み合わせた 2次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなぐウェスタンプロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。

[0243] クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー (HPLC)による方法を用いることができる。すなわち、試料を HP LCに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。

[0244] 本発明の糖尿病の診断方法は、 (a) 7. 0以下の pHで陽イオン交換体に補足される、分子量が約 13800であるタンパク質、（b) 7. 0以下の pHで金属イオン固定化担体に補足される、分子量が約 8700であるタンパク質、（c) 7. 0以下の pHで陽イオン交換体に捕捉される、分子量が約 9400であるタンパク質、または、 pH7. 0で金属ィオン固定ィ匕担体に補足される、分子量が約 9400であるタンパク質、（d) 7. 0以下の pHで陽イオン交換体に補足される、分子量が約 9700であるタンパク質、または、 p H7. 0で金属イオン固定ィ匕担体に補足される、分子量が約 9700であるタンパク質、 (e) 7. 0以下の pHで陽イオン交換体に補足される、分子量が約 66000であるタンパク質、または、 pH7. 0で金属イオン固定ィ匕担体に補足される、分子量が約 66000であるタンパク質、をマーカー物質とし、その血液中の量を健常値と比較する方法も含む。なお、上記 (a)、（b)、（c)、（d)、（e)の物性は、それぞれ、トランスサイレチンサブユニット、アポリポタンパク質 CIII0、アポリポタンパク質 cmi、アポリポタンパク質 C 1112、血清アルブミンと一致する。 [0245] 本発明の糖尿病の診断方法は、 (a)トリプシンで消化すると、分子量が約 1270、約 1370、約 1390、約 1520、約 2450、約 2640、および約 3140のポリペプチドを生じる、分子量約 13800のタンパク質、および Zまたは、（b)トリプシンで消化すると、分子量力 S約 900、約 1200、約 1390、約 1710、約 1940、および約 2080のポリべプチドを生じる、分子量約 8700〜9700のタンパク質をマーカー物質とし、その血液中の量を健常値と比較する方法も含む。なお、 ProFoundデータベースを用いてぺプチドマスフインガープリンティングを行うと、（a)はトランスサイレチンと同定される。また、 MS— Fitデータベースを用いてペプチドマスフィンガープリンティングを行うと、 (b) はアポリポタンパク質 cmと同定される。

[0246] 本発明の糖尿病の診断方法における好ましい実施形態の一つは、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質の濃度を測定することである。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお「親和性」の例としては、抗原と抗体、酵素と基質、ホルモンとレセプターのようなノィオアフィ-ティの他、イオン結合、疎水性相互作用等の化学的な作用が挙げられる。

[0247] 本実施形態においてマーカー物質の測定方法にィムノアツセィを用いる場合は、抗体を固定ィ匕した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定ィ匕された抗体を 1次抗体としたィムノアツセィの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でェピトープの異なる 2種類の抗体を用意し、一方を 1次抗体として担体に固定ィ匕し、他方を 2次抗体として酵素標識し、サンドイッチ EIAの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるィムノアツセィの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるィムノアッセィが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。

[0248] 一方、本実施形態においてマーカー物質の測定方法に質量分析を用いる場合は、抗体の他、イオン結合や疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉することもできる。イオン結合や疎水性相互作用は抗原と抗体等のバイオアフィ-ティほどの特異性がなぐマーカー物質以外の物質も捕捉されるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を使用したプロテインチップを用い、表面ェンハンス型レーザー脱離ィオンィ匕 (surf ace— enhanced laser desorption/ionization 一飛？ T時間貧量分析 (time— of— flight mass spectrometrv)

「&) ELDI— Tu — M 」と称する）を行えば、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、金属イオン基板が好ましく用いられる。

[0249] イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定ィ匕する。この場合、イオン交換体には陰イオン交換体、陽イオン交換体のいずれも用いることができ、さら〖こ、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体のいずれも用いることができる。例えば、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（DE)、ジェチルアミノエチル（DEAE)等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陰イオン交換体の例としては、 4 級アンモ-ゥム（トリメチルアミノメチル）（QA)、 4級アミノエチル（ジェチル，モノ · 2— ヒドロキシブチルアミノエチル）（QAE)、 4級アンモ-ゥム（トリメチルアンモ-ゥム）（Q MA)等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル (CM)等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル (SP)等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。一方、疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、 C4〜C20のアルキル基、フエ-ル基等が挙げられる。さらに、 Cu2+、 Zn2+、 Ni2+ 、 Ca2+、 Co2+、 Mg2+等の金属イオンを固定ィ匕した担体にマーカー物質を捕捉することちでさる。

[0250] 本実施形態において用いる担体の例としては、ビーズ、マイクロタイタープレート、榭脂等の公知のものを使用することができる。特に、ビーズとマイクロタイタープレートは、ィムノアッセィにおいて従来力も用いられており、測定系の構築が容易である。一方、

基板のような、平面部分を有する担体を用いることもできる。この場合は、平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定ィ匕することが好ましい。例としては、基盤としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に特異的な抗体を固定ィヒした担体が挙げられる。

[0251] 本発明の糖尿病の診断方法においては、被験者力採取した血液を検体とし、その血液力調製した血清または血漿を検査材料とすることが好ま、。血清または血漿は遠心分離等の公知の方法で血液力調製することができる。

[0252] 本発明の糖尿病の診断方法における好ましい実施形態の一つとして、マルチマーカーシステムによる糖尿病の診断が挙げられる。本発明の糖尿病の診断方法をマルチマ一力一システムに応用する例を、図 1および図 2を参照しながら説明する。図 1は、マルチマーカーシステムによる本発明の糖尿病の診断方法の手順を示すフローチヤートである。図 1のフローチャートの方法によれば、まず、血液中のトランスサイレチンの濃度を指標として 1次判定をする。そして、トランスサイレチンの濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、トランスサイレチンの濃度が健常値以下である場合は、血液中のアポリポタンパク質 CIII2の濃度を指標として 2次判定をする。そして、アポリポタンパク質 CIII2の濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、アポリポタンパク質 CIII2の濃度が健常値以下である場合は、血液中のアポリポタンパク質 CIII1の濃度を指標として 3次判定をする。そして、アポリポタンパク質 cmiの濃度が健常値以下である場合は、正常 (糖尿病ではない）と判定する。一方、アポリポタンパク質 cmiの濃度が健常値よりも高い場合は、血液中のアポリポタンパク質 cmoの濃度を指標として 4次判定をする。そして、アポリポタンパク質 cm 0の濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、アポリポタンパク質 CI noの濃度が健常値以下である場合は、正常 (糖尿病ではない）と判定する。

[0253] 図 2は、別のマルチマーカーシステムによる本発明の糖尿病の診断方法の手順を示すフローチャートである。図 2のフローチャートの方法によれば、まず、血液中の血清アルブミンの濃度を指標として 1次判定をする。そして、血清アルブミンの濃度が健常値以上である場合は、正常 (糖尿病ではない）と判定する。一方、血清アルブミンの濃度が健常値よりも低い場合は、血液中のアポリポタンパク質 CIII2の濃度を指標として 2次判定をする。そして、アポリポタンパク質 CIII2の濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、アポリポタンパク質 CIII2の濃度が健常値以下である場合は、血液中のアポリポタンパク質 cmiの濃度を指標として 3次判定をする。そして、アポリポタンパク質 cmiの濃度が健常値以下である場合は、正常 (糖尿病ではない）と判定する。一方、アポリポタンパク質 cmiの濃度が健常値よりも高い場合は、血液中のアポリポタンパク質 cmoの濃度を指標として 4次判定をする。そして、ァポリポタンパク質 cmoの濃度が健常値よりも高い場合は、糖尿病と判定する。一方、アポリポタンパク質 cmoの濃度が健常値以下である場合は、正常 (糖尿病ではない）と判定する。

[0254] なお、本発明で糖尿病マーカーとして使用するトランスサイレチン、ァポリポタンパク質 CIII、および血清アルブミンと、従来から知られている HbAlcや CPR等の臨床マ一力一を組み合わせることによつてもマルチマーカーシステムを構築することは可能である。

[0255] 上記のようなマルチマーカーシステムによる糖尿病の診断方法によれば、多方面から判定できるので、力なりの高精度で糖尿病の診断をすることができる。さらに、従来の糖尿病の診断方法では困難であった、糖尿病の発病前の段階の検出、すなわち糖尿病予備軍の診断にも好適である。また、マルチマーカーシステムによれば、糖尿病の検出のみでなぐ糖尿病予備軍の検出、糖尿病の改善状態のモニターも高精度に行うことができる。

[0256] 本発明の糖尿病診断用キットは、トランスサイレチン等のマーカー物質に特異的な抗体を含むものである。キットに含まれる抗体は単独の試薬としてもよいし、担体にあらかじめ固定化された状態でもよい。単独の試薬の場合は、その形状は溶液でもよいし凍結乾燥物でもよい。また、複数の抗体を含めてもよぐ例えば、ィムノアツセィで使用する標識抗体を 2次抗体として含めてもよい。また、本発明の糖尿病診断用キットには他の試薬類を含めてもよぐ例えば EIAを行うためのキットであれば、ビーズ等の担体、ブロッキング液、 PBS等の緩衝液、発色基質等を含むものでもよい。本発明の疾病の診断方法は、被検者の体液中における下記マーカー物質 (a)〜（ n)の少なくとも 1つの濃度を健常値と比較し、糖尿病の有無または将来の発症リスクを判定するものである。

(i) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量/電荷比が約 79100のイオンピークを生じるタンパク質、

(j) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量/電荷比が約 3500のイオンピークを生じるタンパク質、

(k) pH7. 0力つ 0. 5Mの NaCl濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 3560のイオンピークを生じるタンパク質、 (1) ρΗ7. 0かつ 0. 5Mの NaCl濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 4180のイオンピークを生じるタンパク質、 (m) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 12800のイオンピークを生じるタンパク質、

(n) pH4. 0で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量 Z電荷比が約 65700のイオンピークを生じるタンパク質。

[0258] これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、被検者が糖尿病を発症して、る場合または糖尿病の将来の発症リスクが高、場合、体液中のマーカー物質 (a)、（b)、（c)、（d)、（e)、（f)、（g)、（h)および (i)の濃度はより高値を示し、マーカー物質、（k)、（1)、（m)および (n)の濃度はより低値を示す。以下、マーカー物質 (a)、（b)、（c)、（d)、（e)、（f)、（g)、（h)および (i)からなるグループを「グループ 1」、マーカー物質 (j)、（k)、（1)、（m)および (n)からなるダループを「グループ 2」と称することがある。

[0259] 本発明の疾病の診断方法で使用する健常値は、例えば、糖尿病を発症して!/ヽな、と確定診断された健常人における上記マーカー物質 (a)〜 (n)の体液中の濃度データを収集し、その濃度値を元に設定することができる。糖尿病の将来の発症リスクを判定する場合も、当該健常人における濃度値を元に健常値を設定することができる。なお、健常値を段階的に複数設定し、糖尿病の有無または将来の発症リスクを定量的に判定することもできる。

[0260] 本発明の疾病の診断方法において使用する体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、被検者から採取した血液から調製した血清または血漿 (体液成分)を測定試料とすることが好ま、。血清または血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することがでさる。

[0261] (評価方法）

1つの局面において、本発明は物質の評価方法を提供し、この方法は、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中におけるマーカー物質 (例えば、（a)〜（n)の 14種）の少なくとも 1つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。本発明の物質の評価方法では、血糖を直接指標とするのではなぐ別のマーカー物質を指標とするので、動物における血糖値が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、被検物質が有する糖尿病の改善効果に加え、糖尿病の将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。なお、「動物」には、ラット等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。

[0262] 力かる構成により、より正確に、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。

[0263] 力かる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することがでさる。

[0264] 力かる構成により、機能性食品の開発を目的として、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。

[0265] 上記した本発明の疾病の診断方法と同様に、本発明の物質の評価方法においても、前記体液または体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定ィ匕した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する構成 (請求項 10)、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定ィ匕されている構成、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体である構成が推奨される。

[0266] 本発明の物質の評価方法では、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物における上記マーカー物質 (a)〜(！ 1) の少なくとも 1つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。なお、被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する場合、体液中におけるグループ 1に属するマーカー物質の濃度はより低値を示し、グループ 2に属するマーカー物質の濃度はより高値を示す。

[0267] 好まヽ実施形態では、上記基準値として、糖尿病を発症して!/ヽる動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被検物質を摂取させた上記動物における値 (測定値)と当該基準値 (異常値 )とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合 (正常側に維持された場合）に、当該被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ 1に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、グループ 2に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

[0268] さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、糖尿病を発症して、な、動物または糖尿病の発症リスクが低、動物における値 (正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（1)糖尿病を発症していない動物または糖尿病の発症リスクが低い動物に、普通食または被検物質を摂取させる群 (正常値を示す群）、 (2)糖尿病を発症して!/ヽる動物または糖尿病の発症リスクが高！、動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させる群 (異常値を示す群）、および、（3)糖尿病を発症している動物または糖尿病の発症リスクが高い動物に被検物質を摂取させる群、の 3群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（1)と (2)とで有意差があり、（3)と (2)とで有意差があり、かつ（3)が（2) に比べて正常側（（1)に近い側)である場合 (正常側に維持された場合）に、当該被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、被検物質に糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果があれば、（3)において血糖値が正常値に維持され、マーカー物質の濃度が正常値である（1)に近い値をとる。

[0269] さらに、基準値として、（4)糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質を摂取させる群、の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（1)〜（3)に加えて、上記 (4)の群を設定し、動物^!司育する。このとき、（1)と（ 2)とで有意差があり、（3)と (2)とで有意差があり、かつ（3)が（2)に比べて正常側（（ 1)および (4)に近い側）である場合に、当該被検物質が糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被検物質は、（4)で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。

[0270] 上記した「糖尿病を発症して!/、る動物、または糖尿病の発症リスクが高、動物」は、例えば、遺伝的に必ず糖尿病を発症する動物を用いることで、実現できる。より具体的には、例えば、大塚製薬 (株)徳島研究所カゝら供給されている OLETF (Otsuka Lo ng-Evans Tokushima Fatty)ラットを用いることができる。 OLETFラットは肥満を伴う 2 型糖尿病を自然発症するモデルラットであり、雄では 25週齢における OGTTでほぼ全例が糖尿病と診断される。同様に、「糖尿病を発症していない動物、または糖尿病の発症リスクが低い動物」は、例えば、遺伝的に全く糖尿病を発症しないモデル動物を用いることで、実現できる。より具体的には、例えば、大塚製薬 (株)徳島研究所から供給されてヽる LETO (Long- EvansTokushima Otsuka)ラットを用いることができる。 LETOラットは、糖尿病を全く発症しないコントロールラットであり、遺伝的に OLET Fラッドと近縁である。

[0271] 本発明の物質の評価方法に使用する動物としては、特に限定はなぐ例えばマウス、ラット、ゥサギ、ブタ等を使用することができる。特に、ラットとマウスはその飼育が容易であるので、本発明の評価方法に好ましくに用いられる。動物の飼育方法としては特に限定はなぐ例えば、飼料を自由摂取させて、 3〜20日程度飼育すればよい。さらに、動物としてヒトを用いることもできる。ヒトを用いる場合は、臨床試験の結果によつて物質を評価することになる。

[0272] 本様相の物質の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清または血漿 (体液成分)を測定試料とすることが好ま、。血清または血漿は遠心分離等の公知の方法で血液力調製することがでさる。

[0273] 本発明の物質の評価方法における被検物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることがでさる。

[0274] 本発明の物質の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、 CM等の弱陽イオン交換体、銅イオン等の金属キレート体、あるいはマーカー物質に対する抗体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、 SELDI-TO F— MSや抗体チップによるィムノアツセィを簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。

[0275] 本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の物質の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。さらに、上記した評価用キットと同様の構成力もなるスクリーニング用キットを構築することちでさる。

[0276] 本発明はまた、本発明に記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。

[0277] 本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中におけるマーカー物質 (例えば、（a)〜(n)の 14種)の少なくとも 1つの濃度を基準値と比較し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法では、血糖を直接指標とするのではなく、別のマーカー物質を指標とするので、動物における血糖値が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、糖尿病の改善効果を有する物質に加え、糖尿病の将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることができる。特に、被検物質が食品素材の場合は、糖尿病の改善効果を有する機能性食品または将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリー二ングすることができる。 [0278] 本発明は、このようなスクリーニング方法によって得られた物質も提供する。

[0279] 本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

[0280] 以上、本発明を、理解の容易のために好まし!/ヽ実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従つて、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

実施例

[0281] 以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明する力本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[実施例 1]

[0282] 1.プロテインチップを用いた糖尿病マーカー候補タンパク質の検索

糖尿病患者 10名分、健常者 10名分、計 20名分の血清サンプルを収集した。各血清サンプルについて、変性緩衝液（9M 尿素、 2% CHAPS、 50mM Tris—HC 1 (ρΗ9. 0) )をカ卩えて前処理を行い、一部の夾雑タンパク質を除去した。次に、前処理した各血清サンプルを強陰イオン交換樹脂に吸着させた後、 pHの異なる溶出液で順に溶出させ、画分 1 (素通り）、画分 2 (pH7. 0で溶出）、画分 3 (pH5. 0で溶出）、画分 4 (pH4. 0で溶出）、画分 5 (pH3. 0で溶出）、画分 6 (有機溶媒で溶出）の 6つの画分を得た。それぞれの画分に対して、プロテインチップを用いて SELDI— TOF MSを行い、糖尿病患者の血清に特異的なタンパク質を網羅的に検索した。プロティンチップは、金属イオン (Cu2+)、弱陽イオン交換体 (CM)、強陰イオン交換体（ Q)、逆相（C 16アルキル鎖）の 4種 ( 、ずれもサイファージヱン社製）につ、て検討した。エネルギー吸収物質 (EAM)は、 a—シァノ— 4—ヒドロキシケィ皮酸（CHCA) とシナピン酸（SPA)の 2種を検討した。その結果、プロテインチップの種類、画分の種類、チップの洗浄条件（pH)、 EAMの種類等の組み合わせによって多数のピークが検出された。これらのピークから、糖尿病患者と健常者との間で有意に強度が異なるピークを検索した。

2.候補ピークの検索（1)

弱陽イオン交換体を固定ィ匕したプロテインチップを用い、画分 4につ、て洗浄 pHを 7. 0とした場合に、質量/電荷 it (m/z)力 S 13867, 14049, 13885, 14087,および 13761の 5個のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定化したプロティンチップを用い、画分 5について洗浄 pHを 4. 0とした場合に、 mZz力 3885のピークが検出された。これら 6個のピークから、分子量 13800〜14100の範囲付近に候補となるタンパク質 (以下、「候補タンパク質（1)」と称する。）が存在することが示唆された。

[0283] 各ピークについて、糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットし、 ROC曲線を作成し、さらに、カットオフ値を設定した。一例として、図 3 (a)〜（c)に mZzが 13 867のピークについての例を示す。図 3 (a)は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、水平線はカットオフ値である。図 3 (b)は図 3 (a)の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフである。図 3 (c)は R OC曲線であり、 ROC面積が 1に近、ほど（曲線が左上に寄るほど)その測定系の精度が高!、ことを示す。他の 5個のピークにっヽても同様のグラフ（図示せず)を作成した。各ピークについて、 P値、 ROC面積、使用チップ、チップの洗浄条件、画分、および使用 EAMをまとめた表を以下の表 2に示す。

[0284] [表 2]

[0285] 3.候補タンパク質 (1)の精製

糖尿病患者の血清から、以下の手順により候補タンパク質（1)を精製した。まず、糖尿病患者の血清 50 /z Lに変性緩衝液（9M 尿素、 2% CHAPS、50mM Tris — HCl (pH9. 0) ) 75 をカ卩え、 4°Cで 20分間処理した。さらに、洗浄/結合緩衝液（lOOmM NaClを含む、 50mM リン酸緩衝液（pH7. 0) ) 1. 5mLをカ卩えて希釈した後、洗浄 Z結合緩衝液で平衡化した Q Ceramic HyperD F Spin Colu mn (バイオセプラ社）にアプライした。そのまま 4°Cで 30分間攪拌した後、 500 μ の洗浄 Ζ結合緩衝液で 2回洗浄した。次に、 125mM、 150mM、 175mM、 200mM 、または 250mMの NaClを含む 5種類の 50mM リン酸緩衝液（pH7. O OO /z L で順に溶出して分画した。各画分について SELDI— TOF— MSにて分析したところ、 175mM、 200mM、および 250mMの NaClを含む緩衝液で溶出した画分に、候補タンパク質（1)と同様の分子量約 13800〜14100のピークが検出された。なお、アルブミンは溶出前の洗浄工程で全て溶出されており、この条件で候補タンパク質（ 1)とアルブミンは完全に分離された。

4.候補タンパク質 (1)の同定

NaCl濃度が 175mM、 200mM、および 250mMの画分を混合した（90 /z L X 3) 。混合した画分を VivaSpin 5000 Cut Off (ザルトリウス社）にて遠心濃縮し、さらに 10倍量の 50mM リン酸緩衝液 (pH7. 0)をカ卩えて最終液量 50 μ Lまで濃縮し、緩衝液交換した。次に、濃縮したサンプルをゲル濃度 16%の SDS— PAGEに供し、クマシ一ブリリアントブルー（CBB)にてゲルを染色した。その結果、分子量約 13800 の位置に目的のバンドが検出された。次に、目的のバンドに 0. 02 _u g u Lのトリプシン溶液（25mM 炭酸水素アンモ-ゥム (pH8. 0)に溶解)を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプルについて MALDI— MSZMS分析をしたところ、少なくとも 7個のピーク力 S検出され、それらの分子量は、「1266. 960」、「1366. 300」、「1 394. 270」、「1522. 140」、「2451. 790」、「2646. 030」、および「3141. 310」と算出された。これらのデータを元に ProFoundデータベースによって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、目的のタンパク質は 99%以上の確率でトランスサイレチンのサブユニットと同定された。従来知られているトランスサイレチンのサブユニットの分子量は 13890、等電点は 5. 3であるのに対し、今回単離したタンパク質の分子量は約 13800、予想される等電点は 5. 3であり、両者の物理ィ匕学的性質はほぼ一致した。

[0286] なお、トランスサイレチンは同一のサブユニット 4個からなる 4量体であることが知られているが、本実施例の結果によれば、トランスサイレチンは 4量体の形ではなくサブユニット単体で検出された。

[実施例 2]

[0287] 1.候補ピークの検索（2)

実施例 1と同様にして別の候補ピークを検索した。その結果、弱陽イオン交換体を固定ィ匕したプロテインチップを用い、画分 6について洗浄 pHを 4. 0とした場合に、 m /zが 9279, 9705の 2個のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定ィ匕したプロテインチップを用い、画分 5について洗浄 pHを 4. 0とした場合に、 mZzが 9 285, 9415の 2個のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定化したプロティンチップを用い、画分 6について洗浄 pHを 7. 0とした場合に、 mZz力 9289, 9 638, 9712の 3個のピークが検出された。また、金属イオン（Cu2+)を固定化したプ口ティンチップを用い、画分 6について洗浄 pHを 7. 0とした場合に、 mZz力 690, 9289, 9638、 9712の 4偶のピーク力 S検出された。これら 11偶のピーク力ら、分子量 8600〜9800の範囲付近に候補となるタンパク質 (以下、「候補タンパク質（2)」と称する。）が存在することが示唆された。

[0288] 実施例 1と同様にして、各ピークについて、糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットし、 ROC曲線を作成し、さらに、カットオフ値を設定した。一例として、図 4 (a)〜（c)に mZzが 8690のピークにつ!、ての例を示す。図 4 (a)は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図 4 (b)は図 4 (a)の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図 4 (c)は ROC曲線である。他の 10個のピークについても同様のグラフ（図示せず)を作成した。各ピークについて、 P値、 ROC面積、使用チップ、チップの洗浄条件、画分、および使用 EAMをまとめた表を以下の表 3に示す。

[0289] [表 3] m/z P値 ROC面積使用チップ洗浄 pH 画分 EAM

8690 0.041 0.74 金属イオン 7.0 6 CHCA

9279 0.041 0.72 弱陽イオン交換 4.0 6 SPA

0.016 0.76 弱陽イオン交換 4.0 5 CHCA

9285

0.041 0.70 弱陽イオン交換 7.0 6 SPA

9289 0.034 0.72 金属イオン 7.0 6 SPA

9415 0.002 0.90 弱陽イオン交換 4.0 5 SPA

0.049 0.76 弱陽イオン交換 7.0 6 SPA

9638

0.028 0.76 金属イオン 7.0 6 SPA

9705 0.049 0.72 弱陽イオン交換 4.0 6 SPA

0.034 0.78 弱陽イオン交換 7.0 6 SPA

9712

0.028 0.78 金属イオン 7.0 6 SPA 2.候補タンパク質 (2)の精製

糖尿病患者の血清から、以下の手順により候補タンパク質 (2)を精製した。まず、糖尿病患者の血清 50 μ Lに変性緩衝液 75 μ Lを加え、 4°Cで 20分間処理した。さらに、洗浄/結合緩衝液（50mM リン酸緩衝液 (pH6. 0) ) 1. 5mLを加えて希釈した後、洗浄 Z結合緩衝液で平衡化した Q Ceramic HyperD F Spin Column にアプライした。そのまま 4°Cで 30分間攪拌した後、 500 Lの洗浄/結合緩衝液で 2回洗浄した。次に、 50mM、 150mM、または 250mMの NaClを含む 3種類の 50 mM リン酸緩衝液 (pH6. 0) 100 Lで順に溶出して分画した。各画分について S ELDI -TOF - MSにて分析したところ、候補タンパク質（2)と同様の分子量約 869 0、 9415、 9712のピークが検出された。なお、アルブミンは溶出前の洗浄工程で全て溶出されており、この条件で候補タンパク質（2)とアルブミンは完全に分離された。 3.候補タンパク質 (2)の同定

SDS— PAGEにて精製した目的のバンドに 0. 02 μ _&/ μ Lのトリプシン溶液（25 mM 炭酸水素アンモ-ゥム (pH8. 0)に溶解)を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプルにつ、て MALDI— MSZMS分析をしたところ、少なくとも 5個のピ一タカ S検出され、それらの分子量は、「898」、「1197」、「1717」、「1939」、「2076」と算出された。これらのデータを元に MS— Fitデータベースによって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、目的のタンパク質は

3種のアポリポタンパク質 cni、すなわち、アポリポタンパク質 cmo、ァポリポタンパク質 CIII1、アポリポタンパク質 CIII2と同定された。従来知られているアポリポタンパク質 CIII0、アポリポタンパク質 Cini、アポリポタンパク質 CIII2の分子量はそれぞれ 87 65、 9421、 9713、等電点はそれぞれ 4. 95、 4. 80、 4. 65であるのに対し、今回単離した 3種のタンパク質の分子量はそれぞれ 8690、 9415、 9712、予想される等電点はいずれも 4. 5〜5. 0であり、両者の物理ィ匕学的性質はほぼ一致した。

4. 2次元電気泳動による糖尿病患者血清の分析

糖尿病患者の血清を、 1次元目（水平方向）が IEF、 2次元目（垂直方向）が SDS— PAGEの 2次元電気泳動に供したところ、分子量 6. 5〜14. 4kDa、等電点（pi) 5付近に 3個のバンド A、 B、 Cが検出された（図 5)。これらのバンドは健常者の血清からは検出されなかった。これらのバンド A、 B、 Cについて、 SELDI— TOF— MSによつて分析したところ、 A、 B、 Cの分子量は、それぞれアポリポタンパク質 CIII2、アポリポタンパク質 cmi、アポリポタンパク質 cnioの分子量と一致した。この結果は、上記のプロテインチップを用いた候補タンパク質（2)の検索結果と一致した。

[実施例 3]

候補ピークの検索（3)

実施例 1と同様にしてさらに別の候補ピークを検索した。その結果、弱陽イオン交換体を固定ィ匕したプロテインチップを用い、画分 3について洗浄 pHを 7. 0とした場合に、 mZz力 66418, 66449の 2個のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定ィ匕したプロテインチップを用い、画分 5について洗浄 pHを 4. 0とした場合に、 m Zzが 66449のピークが検出された。また、弱陽イオン交換体を固定ィ匕したプロティンチップを用い、画分 6について洗浄 pHを 7. 0とした場合に、 mZz力 S66572のピークが検出された。また、金属イオン (Cu2+)を固定ィ匕したプロテインチップを用い、画分 4について洗浄 pHを 7. 0とした場合に、 m/zが 66216のピークが検出された。また、金属イオン (Cu2+)を固定ィ匕したプロテインチップを用い、画分 6について洗浄 p Hを 7. 0とした場合に、 mZz力 66572, 66582の 2個のピークが検出された。また、金属イオン（Cu2+)を固定ィ匕したプロテインチップを用い、画分 5について洗浄 pHを 7. 0とした場合に、 m/zが 66596のピークが検出された。なお、これらのピークは候補タンパク質（1)や候補タンパク質 (2)とは異なり、糖尿病患者にお!ヽて低値を示した。これら 8個のピークから、分子量 66000〜67000の範囲付近に候補となるタンパク質 (以下、「候補タンパク質 (3)」と称する。）が存在することが示唆された。この分子量の値は、公知のヒト血清アルブミンの分子量（66439)の値に極めて近ぐかつ m Zzが 66449というヒト血清アルブミンの分子量とほとんど同じ値のピークも検出されたことから、候補タンパク質（3)は血清アルブミンであると同定した。

[0292] 実施例 1および 2と同様にして、各ピークについて、糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットし、 ROC曲線を作成し、さらに、カットオフ値を設定した。一例として、図 6 (a)〜（c)に mZzが 66216のピークについての例を示す。図 6 (a)は糖尿病患者と健常者に分けてピーク強度をプロットしたグラフであり、図 6 (b)は図 6 (a)の結果を、最大値、最小値、中央値、およびカットオフ値で示したグラフであり、図 6 (c) は ROC曲線である。なお、本ピークは糖尿病患者の方が低値を示すので、図 6 (c) の ROC曲線は右下に傾き、かつ右下に寄るほど精度が高いことを示す。他の 7個のピークについても同様のグラフ（図示せず）を作成した。各ピークについて、 P値、 RO C面積、使用チップ、チップの洗浄条件、画分、および使用 EAMをまとめた表を以下の表 4に示す。

[0293] [表 4]

[実施例 4] [0294] 以下の構成の糖尿病検出用キット（1)を構築した。本キットは抗体を固定ィ匕した基板を含むものであり、基板上にマーカー物質を捕捉し、サンドイッチ EIAの系でトランスサイレチン、アポリポタンパク質 cm、および血清アルブミンを測定するためのものである。検出は蛍光標識ストレプトアビジンで行う。

[0295] [表 5] 抗トランスサイレチンモノクローナル抗体固定化カラス基板

ビォチン標識抗トランスサイレチンモノクローナル抗体（溶液）

トランスサイレチン標準品（凍結乾燥品）抗ァポリポタンパク質 cmモノクローナル抗体固定化ガラス基板

ビォチン標識抗ァポリポタンパク質 cmモノクローナル抗体 (溶液）

アポリポタンパク質 cm標準品（凍結乾燥品）抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体固定化ガラス基板

ビォチン標識抗ヒト血清アルブミン質 cniモノクローナル抗体（溶液)

ヒト血清アルブミン標準品（凍結乾燥品）ブロッキング液

洗浄用緩衝液（X 1 0)

蛍光標識ストレプトアビジン

[実施例 5] 適適適適適適適適適 ^ ^

量量X量量文量量量量量 .

[0296] 以下の構成の糖尿病検出用キット (2)を構築した。本キットは、マイクロタイタープレートを用いたサンドイッチ EIAによって、トランスサイレチン、アポリポタンパク質 cm、および血清アルブミンを測定するためのものである。

[0297] [表 6]

抗トランスサイレチンモノクローナル抗体プレート（96穴）

ペルォキシダ一ゼ標識抗トランスサイレチンモノクロ一ナル抗体（凍結乾燥品) トランスサイレチン標準品（凍結乾燥品）抗ァポリポタンパク質 CIIIモノクローナル抗体プレート（96穴）

ペルォキシダ一ゼ標識抗ァポリポタンパク質 CIIIモノクロ一ナル抗体

(凍結乾燥品）

アポリポタンパク質 cm標準品（凍結乾燥品）抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体プレート（96穴）

ペルォキシダ一ゼ標識抗ヒト血清アルブミンモノクローナル抗体 (凍結乾燥品) ヒト血清アルブミン標準品（凍結乾燥品）ブロッキング液

洗浄用緩衝液（X 10)

基質液（3, 3' , 5, 5'—テトラメチルベンジジン、 TMBZ)

反応停止液（I N 硫酸）

[実施例 6]

1.ラットを用いた動物実験

2型糖尿病自然発症モデルラットとして OLETFラットを、該モデルラットと同じ系統 ( 遺伝的に近縁)の 2型糖尿病を発症しないラットとして LETOラットを準備した。 OLE TFラットと LETOラットはヽずれも大塚製薬 (株)徳島研究所より提供された。 L適適適適適 u; I I產產 SI ί：E- -TO 量量量量夂量量量量量量 4 ラットの群 (第 1群）と OLETFラットの群 (第 2群）とを設定し、各ラットを飼育した。飼料には CRF— 1 (オリエンタルバイオサイエンス社)を用い、各群とも自由摂取とした。各群とも 5週齢力も試験を開始し、 50週または 62週まで飼育した。 5 (飼育開始時）， 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45,および 49の各週齢時【こ OGTTを行な!/ヽ、血液をサンプリングした。これらの各血液サンプル力血清を調製した。飼育終了後、特に異常が見られな力つたラットから、第 1群力も 4匹、第 2群力も 7匹を選択した。それらのラットにおける OGTTの評価を、常法に従い、正常（〇）、境界（△)、糖尿病 (參）の 3段階で評価した。 OGTTの結果を第 1表に示す。表中、 1—1から 1—4はそれぞれ第 1群のラット (計 4匹）、 2— 1から 2— 7は第 2群の各ラット (計 7匹)の結果であり、 5〜49の整数はラットの週齢である。すなわち、第 1群のラットでは糖尿病を発病しな力つた力第 2群のラットでは、 21週齢あたりから徐々に糖尿病を発症していた。次に、第 1表で特に示した 21サンプルを、以下の解析に供した

[0299] [表 7] 第 1表

[ I解析に供したサンプル

[0300] 各血清サンプル 20 Lに、変性緩衝液（9Μ 尿素、 2% CHAPS、 50mM Tris — HCl(pH9.0) )30 /zLを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各血清サンプルを強陰イオン交換樹脂カラム（Q Ceramic Hyper D、バイオセプラ社）にアプライした。次に、 pH9.0の緩衝液（50mM Tris—HCl(pH 9.0)、0. l%(w/v)l— o— N—ォクチル一 ;3— D—ダルコビラノシド（以下、「OG P」と称する。））、 ρΗ7.0の緩衝液（50mM HEPES— NaOH(pH7.0)、 0.1%( wZv)OGP)、pH5.0の緩衝液（lOOmM 酢酸ナトリウム（pH5.0)、0. l%(w/ v)OGP)、pH4.0の緩衝液（lOOmM 酢酸ナトリウム (pH4.0)、0. l%(w/v)0 GP)ゝ pH3.0の緩衝液（50mM クェン酸ナトリウム（pH3.0)、0. l%(w/v)OG P)、および有機溶媒（33.3%イソプロピルアルコール、 16.7%ァセトニトリル、 0.1 %トリフルォロ酢酸力もなる混合液)各 200 /zLで順に溶出させ、画分 1(ρΗ9.0で溶出、素通り）、画分 2(pH7.0で溶出）、画分 3(pH5.0で溶出）、画分 4(pH4.0で溶出）、画分 5(pH3.0で溶出）、画分 6 (有機溶媒)の 6つの粗分画画分を得た。

[0301] 得られた各画分 10/zLを pH4.0のプロテインチップ結合緩衝液（lOOmM 酢酸ナトリウム)で 10倍希釈した後、陽イオン交換チップ CM10 (サイファージェン社）に添カロした。同様に、得られた各画分 10 Lを pH7. 0のプロテインチップ結合緩衝液（1 OOmM リン酸、 0. 5M NaCl)で 10倍希釈した後、銅修飾チップ IMAC30 (サイファージェン社）に添加した。各プロテインチップを各結合緩衝液で 3回洗浄した後に脱イオン水で 1回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ SPA)または α シァノ 4—ヒドロキシケィ皮酸（CHCA)を添加し、プロテインチップリーダー Model PBS lie (サイファージェン社）を用いて、 SELDI— TOF— MS を行なった。なお、測定分子量範囲（MZZ)は、 3000〜200000の範囲で行なった。また、測定は 2連で行い、 MZZの平均値を算出した。データ解析は、 Protein C hip ;5oftware、し iphergenExpress Data Magnager、および Biomarker Pat terns Software ( 、ずれもサイファージェン社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規ィ匕処理を行なった後、シングルマーカー解析および数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。これらのピークの中から、第 1群と第 2群のサンプル間で有意差があったピークを 14個選抜した。

2.マーカー物質 (a)の特定

画分 5において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 70 43 (平均値)のイオンピークが検出された。図 7に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第 3四分位（75パーセンタイル）と第 1四分位（25パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（以下の図も同じ )。すなわち、本ピークは、第 1群で低値を示し、第 2群で高値を示した。以上より、 SE LDI—TOF MSに供すると質量 Z電荷比が約 7040のピークを生じるタンパク質（マーカー物質 (a) )が、糖尿病を発症して!/、るラットまたは将来の発症リスクが高!、ラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわ力つた。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質 (a)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (a) の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (a)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI— TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 7040のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することがでさる。

3.マーカー物質 (b)の特定

画分 6において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 83 25 (平均値）のイオンピークが検出された。図 8に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1群で低値を示し、第 2群で高値を示した。以上より、 SELDI— TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 8330のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (b) )力糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質 (b)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (b)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (b)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI— TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 8330のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

4.マーカー物質（c)の特定

画分 6において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 85 32 (平均値）のイオンピークが検出された。図 9に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1群で低値を示し、第 2群で高値を示した。以上より、 SELDI— TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 8530のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (c) )力糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質 (c)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (c)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (c)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI— TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 8530のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

5.マーカー物質（d)の特定

画分 1において、銅修飾チップ IMAC30を用いた場合に、質量/電荷比が 9062 ( 平均値)のイオンピークが検出された。図 10に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1 群で低値を示し、第 2群で高値を示した。以上より、 SELDI— TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 9060ピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (d) )が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（d) が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (d)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (d)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI—TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 9060のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

6.マーカー物質（e)の特定

画分 6において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 92 55 (平均値）のイオンピークが検出された。図 5に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1群で低値を示し、第 2群で高値を示した。以上より、 SELDI—TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 9260のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (e) )が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質 (e)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (e)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (e)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI—TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 9260のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

7.マーカー物質 (f)の特定

画分 6において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 94 45 (平均値）のイオンピークが検出された。図 12に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1群で低値を示し、第 2群で高値を示した。 2以上より、 SELDI—TOF— MSに供すると質量/電荷比が約 9450のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (f) )が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカ一物質 (f)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (f)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (f)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI—TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 9450のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

8.マーカー物質 (g)の特定

画分 4において、銅修飾チップ IMAC30を用いた場合に、質量/電荷比が 13720 (平均値)のイオンピークが検出された。図 13に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1 群で低値を示し、第 2群で高値を示した。 2以上より、 SELDI—TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 13700ピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (g) )が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質 (g)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (g)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (g)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI—TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 13700のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

9.マーカー物質 (h)の特定

画分 3において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 76 404 (平均値）のイオンピークが検出された。図 14に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1群で低値を示し、第 2群で高値を示した。 2以上より、 SELDI— TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 76400のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (h) ) が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわ力つた。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質 (h)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (h)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (h)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI— TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 76400 のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

10.マーカー物質 (i)の特定

画分 4において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 79 085 (平均値）のイオンピークが検出された。図 15に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1群で低値を示し、第 2群で高値を示した。以上より、 SELDI— TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 79100のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (i) )が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカ一物質 (i)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (i)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (i)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI—TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 79100のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

[0303] 11.マーカー物質 (j)の特定

画分 6において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 34 97 (平均値）のイオンピークが検出された。図 16に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1群で高値を示し、第 2群で低値を示した。 2以上より、 SELDI—TOF— MSに供すると質量/電荷比が約 3500のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (j) )が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカ一物質 G)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (j)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (i)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI—TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 3500のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

[0304] 12.マーカー物質（k)の特定

画分 1において、銅修飾チップ IMAC30を用いた場合に、質量/電荷比が 3559 ( 平均値)のイオンピークが検出された。図 17に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1 群で高値を示し、第 2群で低値を示した。以上より、 SELDI—TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 3560のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (k) )が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ k)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (k)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに

、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (k)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI— TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 3560のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

[0305] 13.マーカー物質（1)の特定

画分 4において、銅修飾チップ IMAC30を用いた場合に、質量 Z電荷比が 4184 ( 平均値)のイオンピークが検出された。図 18に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1 群で高値を示し、第 2群で低値を示した。以上より、 SELDI— TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 4180のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (1) )が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質 (1 )が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (1)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (1)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI— TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 4180のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

[0306] 14.マーカー物質（m)の特定画分 5において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 12 786 (平均値）のイオンピークが検出された。図 19に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1群で高値を示し、第 2群で低値を示した。以上より、 SELDI— TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 12800のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (m) )が、糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカ一物質 (m)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (m)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (m)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI— TOF— MSを行なった場合に、質量 Z電荷比が約 12800 のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

15.マーカー物質 (n)の特定

画分 4において、陽イオン交換チップ CM10を用いた場合に、質量/電荷比が 65 700 (平均値）のイオンピークが検出された。図 80に、 21週齢時における本ピークのピーク強度を各群に分けてプロットした場合の箱髭図を示す。すなわち、本ピークは、第 1群で高値を示し、第 2群で低値を示した。以上より、 SELDI— TOF— MSに供すると質量 Z電荷比が約 65700のピークを生じるタンパク質 (マーカー物質 (n) )力糖尿病を発症しているラットまたは将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカ一物質 (n)が存在する場合に、血中におけるマーカー物質 (n)の濃度を指標として、糖尿病の発症の有無または将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質を摂取させた動物の血中におけるマーカー物質 (n)の濃度を指標として、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果の評価、および、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順で SELDI— TOF MSを行なつた場合に、質量 Z電荷比力約 65700のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。

[実施例 7]

[0308] 上記実施例において、分子量から、 S システィ-ルトランスサイレチンであると予測されたマーカー物質について以下に同定するスキームを記載する。

[0309] 糖尿病患者および、対照である健常人の血清由来 S-cysteinylatedTTRの精製同定スキームを記す。

[0310] (A.イオン交換による精製法）

糖尿病患者および、健常人の血清 500 Lを 50mM Tris—HCl (pH7. 0)にて 5倍希釈を行い、 20kG, 4°C, lOmin遠心分離処理後、強陰イオン交換カラムである Amersham HiTrapQ HP lmLを用いて分画を行った。はじめに 50mM Tri s-HCl (pH7. 0)にて 5CV洗浄を行い、次いで、 50mM Tris—HCl (pH7. 0 ) , 160mM NaClにて 5CV洗浄を行った。溶出は 50mM Na -Acetate (pH4. 0)を用いて 2CV行った。溶出サンプルは 5倍量のアセトンにてアセトン沈殿を行い、得られた沈殿物を 62. 5mM Tris—HCl (pH6. 8) , 1% SDS, 20%グリセロール， 0. 005% BPB混合溶液 200 Lに溶解し SDS— PAGE用のサンプルとした。

[0311] (B. SDS— PAGEによる精製法）

A.の要領で作成した上記サンプルを 20 L使用し、 DRC Perfect NT Gelポリペプチド分析用を用い、定電圧 (100V, 2. 5hr)にて分画を行った。泳動緩衝液は lOOmM Tris, lOOmM Tricine, 0. 1% SDSを用いた。泳動終了後、 10%

AcOH in 40% MeOHにて固定化を行い、超純水にて洗浄後、 CBBにて染色を行った。

[0312] (C.ウェスタンブロッテイングによる同定法）

B.の要領で SDS— PAGEを行った後、 CBBで染色を行わず、下記の要領で PV DF膜にブロッテイングを行い、 BIO— RAD Amplified Alkaline Phosphatase Goat Anti- Rabbit Immun— Blot Assay Kitにより検出を行った。

[0313] (1)試薬の調製

'陽極緩衝液

60mM Tris, 40mMCAPS, 0.1% SDS, pH9.6

'陰極緩衝液

60mM Tris, 40mM CAPS, 15% MeOH, pH9.6

•Tris - bufferedsaline (TBS)

20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH7.5

•洗浄溶液 (TTBS)

20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 0.05% Tween— 20, pH 7.5

•ブロッキング緩衝液

TBS中 5%脱脂乾燥ミルク

•1次抗体溶液

抗 human Transthyretin抗体 (rabbit IgG 200 μ g/mL)を TTBSで 1000倍希釈（終濃度 0. 2 μ g/mL)

•2次抗体溶液

Biotinylated Goat Anti Rabbit IgG(H+L)を TTBSで 3000倍希釈

'ストレプトアビジン—ピオチン化アルカリホスファターゼ複合体

Streptavidin 10 Lを 30mLの TTBSに溶解し、更にピオチン化アルカリホスファターゼ

10 Lを加え、 2時間、室温でインキュベートする。

•AP発色溶液

25xストックを超純水にて 25倍希釈し、 AP発色緩衝液を作成する。 AP発色緩衝液 20 mLに対し 200 μ Lの AP発色試薬 A, 200 μ Lの AP発色試薬 Βを添加し AP発色溶液とする。

[0314] (2)陽極板に陽極緩衝液を湿潤させたろ紙を重ね、その上にメタノールを 5分間湿潤させた PVDF膜（7 X 6cm)を重ね、更にゲルを乗せ、陰極緩衝液を湿潤させたろ紙を重ね、陰極板を乗せ、定電流 105mAで 30分通電した。 (3)通電後、 PVDF膜は超純水に浸し、 5分振とうした。

(4) PVDF膜は風乾後、ブロッキング緩衝液にてブロッキングを行った。ブロッキングは室温、にて 1時間振とうの条件で行った。

(5)ブロッキング後、 TTBSに浸し室温にて 5分 X 3回、振とうを行いブロッキング緩衝液の洗浄を行った。

(6) 1次抗体溶液に浸し、室温で 2時間、振とうを行った。

(7) 1次抗体反応後、 TTBSに浸し室温にて 5分 X 3回、振とうし洗浄を行った。

(8) 2次抗体溶液に浸し、室温で 2時間、振とうを行った。

(9) (8)の作業中、ストレプトアビジン一ピオチン化アルカリホスファターゼ複合体を作製した。

( 10) 2次抗体反応後、 TTBSに浸し室温にて 5分 X 3回、振とうし洗浄を行った。

( 11)ストレプトアビジン一ピオチンィ匕アルカリホスファターゼ複合体溶液に浸し、室温で 2時間、振とうを行った。

( 12)ストレプトアビジンピオチン化アルカリホスファターゼ複合体反応後、 TTBS に浸し室温にて 5分 X 3回、振とうし洗浄を行った。

( 13) AP発色溶液に浸し、ヒト TTRであることを確認した。

[0315] (D.ゲルからの抽出および MALDI— TOF— MS分析）

ゲルからの抽出は、メタノールと lOOmM 重炭酸アンモ-ゥムの等量混合溶液を用いて脱色を行、、超純水： lOOmM 重炭酸アンモ-ゥム： MeCN= 2： 5： 3の比で混合した混合溶液（15 L)を用いて行った。

[0316] 得られた抽出液 2 μ Lを金属プレートに乗せ、マトリックスには飽和 CHCA 0. 4 μ Lを用いて Applied Bio systems 4700 Proteomics Analyzerにて測定を行つた。

[0317] (結果）

結果を図 21〜図 24に示す。

[0318] (ウェスタンブロッテイングによる TTRモノマーの確認）

上記方法にて、 13. 8K付近のタンパク質力TTR抗体を用いて、 TTRモノマーであることを確認した。各誘導体は、モノマー分画に含まれたことも見出した。 [0319] 上記モノマー分画の MSスペクトルは以下の通りである。

[0320] 理論値： S- cysteinylatedTTR M/Z=13880.53

還元後 TTR M/Z=13761.41

図 21には、健常人由来 S- cysteinylated TTRを示す。測定値： M/Z= 13874.7480。

[0321] 図 22には、還元処理後の健常人由来 S-cysteinylated TTRを示す。測定値： M/Z= 13759.7393。

[0322] 図 23には、糖尿病患者由来 S- cysteinylated TTRを示す。測定値： M/Z= 13871.33 20。

[0323] 図 24には、還元処理後の糖尿病患者由来 S-cysteinylated TTRを示す。測定値: M /Z= 13755.6494₀

[0324] 図 25には、 TTRの 4量体構造とモノマーのアミノ酸配列を示す。このように、トランスサイレチンは、通常 4量体構造をとつており、これが崩れていくと糖尿病になると仮定される。

[0325] 図 26には、ヒト TTR a -ドメインの 3次元構造と 2次構造配列が示される。表 1に示されるタンパク質やペプチドにおける代表的な翻訳後修飾とその質量変化を用いて、質量分析により、誘導体を分析することができる。

[実施例 8]

[0326] 上記実施例において、分子量から、アポリポタンパク質 cmであると予測されたマーカー物質にっ、て以下に同定するスキームを記載する。

[0327] 以下に Rat Apolipoprotein CIIIの精製同定スキームを記載する。

[0328] (A.イオン交換による精製法）

Rat Serum 750 /z Lを 50mM Tris— HC1 (pH6. 0)にて 5倍希釈を行い、 M illipore Millex— HV (0. 45 m)フィルターユニットを用いてろ過したものをサンプルとした。得られたサンプルを強陰イオン交換カラムである Amersham HiTrapQ HP lmLを用いて分画を行った。はじめに 50mM Tris— HCl (pH6. 0)にて 5C V洗浄を行い、次いで 50mM Tris— HCl (pH6. 0) , 200mM NaClにて 12CV 洗浄を行い、その後 50mM Tris— HCl (pH6. 0)にて 5CV洗浄を行った。溶出は 50mM Na -Acetate (pH3. 0)を用いて 2CV行った。溶出サンプルは 10倍量のアセトンにてアセトン沈殿を行い、得られた沈殿物を 62. 5mM Tris-HCl (pH 6. 8) , 1% SDS, 20%グリセロール， 0. 005% BPB混合溶液 100 Uこ溶解し SDS - PAGE用のサンプルとした。

[0329] (B. SDS— PAGEによる精製法）

A.の要領で作成した上記サンプルを 20 L使用し、 DRC Perfect NT Gelポリペプチド分析用を用い、定電圧（100V, 2. 5hr)にて分画を行った。泳動緩衝液は lOOmM Tris, lOOmM Tricine, 0. 1% SDSを用いた。泳動終了後、 10%

[0330] (C.ゲルからの抽出および SELDI— TOF— MS分析）

ゲルからの抽出は、メタノールと lOOmM重炭酸アンモ-ゥムの等量混合溶液を用

V、て脱色を行!、、超純水： lOOmM 重炭酸アンモ-ゥム： MeCN = 2： 5： 3の比で混合した混合溶液（15 L)を用いて行った。

[0331] 得られた抽出液を CIPHERGEN H50 ProteinChipArrayに乗せ、 0.

1% TFA にて 2回洗净を行!/、、マトリックスに ίま 25⁰/₀ SPA 0. 5 Lを 2回乗せて測定を行った。

[0332] (D.ゲル内消化による同定法）

SELDI— TOF— MSを用いて分子量を測定したサンプルについてゲル内消化を行い、同定を行った。（下記プロトコールを参照）

(1)反応溶液の調整

還元溶液の調整 <用事調整 >

•DTT (1. 5mg)を lOOmM 重炭酸アンモ-ゥム（lmL)に溶解する。

アルキル化溶液の調整 <用事調整 >

'ョ一ドアセトアミド（lOmg)を lOOmM 重炭酸アンモ-ゥム（lmL)に溶解する。トリプシン溶液の調整 <用事調整 >

•トリプシン（20 μ g)を 50mM 酢酸 (0. lmL)に溶解し、トリプシン保存液とする。トリプシン保存液（25 L)に超純水（200 L) , lOOmM 重炭酸アンモ-ゥム（ 500 L) , MeCN ^OO /z L)を加え、トリプシン溶液とする。 (2)バンドを切り出し、 500 Lのチューブに入れる。

(3)メタノールと lOOmM 重炭酸アンモ-ゥムの等量混合溶液を 100 Lカ卩ぇ脱色する。

(4)還元溶液を 100 L加え、 30分インキュベートする。

(5)アルキル化溶液を 100 L加え、 30分インキュベートする。

(6)トリプシン溶液を 15 Lカロえ、 37°Cでー晚インキュベートする。

(7) 1Z10倍量の 1 % TFAをカ卩え、反応を停止する。

[0333]

消化サンプル 1 μ Lを金属プレートに乗せ、マトリックスには飽和 CHCA 0. 4 Lを用いて Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzerにて測定を行った。

[0334] (得られたデータにつヽて）

Mascot (http://www.matrixscience.com/search— form— select. ntml) CDy ~~グへ¹ ~~スサーチを行い、ラットアポリポタンパク質 cmであると同定した。その結果を図 27および図 28に示す。

[0335] 図 27は、同定したバンドのゲル写真と、そのバンドの SELDI— TOFによる分析を示す。

[0336] 図 28は、同定したバンドのゲル写真と、そのバンドの SELDI— TOFによる分析を示す。

[0337] 同様のマーカーがヒトにおいて存在することを以下のようにして確認した。

[0338] 精製レジンの選択およびレジンへの至適吸着条件の検討を行った。

[0339] 使用 ProteinChips Q10及び CM 10

検討 pH pH 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 7.0

使用 Buffer

pH3.0 ： 50mM Na— Citrate Buffer

pH3.5〜5.5 ： 50mM Na— Acetate Buffer

pH7.0 ： 50mM HEPES Buffer

図 29には、ヒトァポリポタンパク質 CIII (0〜2)のスポットであると考えられる二次元電気泳動上のスポットを示す。 [0340] 図 30には、各スポットの質量分析の結果を示す。

[0341] 図 31には、各スポットの SELDI— MSの結果を示す。

[0342] 図 32から図 34には、上記至適吸着条件検討の結果を示す。図 32には、 CM10の検討結果を示し、図 33には、 Q10の検討結果を示す。図 34は、至適条件検討結果を示す。これらの結果から、得られたスポットが、ヒトァポリポタンパク質 cm(o〜2)のスポットであることが明らかになる。

[実施例 9]

[0343] (S—システィ-ル化トランスサイレチンは糖ィ匕ヘモグロビン（Saccharic Hemoglo bin； HbAlc)値による重症度評価にお、ても相関する）

上記のようにして同定した S—システィ-ル化トランスサイレチンが糖ィ匕へモグロビン (HbAlc)値による重症度評価にぉ、ても相関性を示すことを本実施例にぉ、て示した。 HbAlcは、現在最も信頼性のある糖尿病マーカーとして用いられている。

[0344] まず、上記実施例に記載されるプロトコールを用いて、糖尿病患者における S—システィ-ル化トランスサイレチン（測定値： MZZ= 13, 863,理論値： MZZ= 138 80. 53)のイオン強度と HbAlc値の関係を確認した。

[0345] 測定条件および統計値

IMAC30：キレート金属（Cu)固定化チップ、

Fr4 ：図血清の発現解析プロトコール参照。

[0346] CHCA: MS測定マトリックス

測定値： M/Z : 13, 863,

P- Value : 0. 0004, ROC area: 0. 86。

[0347] 結果を図 35に示す。図 35には、糖尿病患者における S—システィニル化トランスサィレチン（測定値： MZZ= 13, 863,理論値： MZZ= 13880. 53)のイオン強度と HbAlc値の関係を示す。縦軸： SELDI—TOF—MSで測定したS— cysteinyl ated TTRのイオン強度;横軸： C :コントロール (健常者）、 P :糖尿病患者。

[0348] 次に、糖尿病患者における S—システィニル化トランスサイレチン (測定値: MZZ

= 13, 874,理論値： MZZ= 13880. 53)のイオン強度と HbAlc値の関係を測し 7こ。 [0349] 測定条件および統計値

IMAC30：キレート金属（Cu)固定化チップ、

Fr4 ：図血清の発現解析プロトコール参照。

[0350] MS測定マトリックス： SPA— H

測定値： M/Z : 13, 874,

P- Value : 0. 007, ROC area: 0. 82。

[0351] 図 36に、その結果を示す。図 36には、糖尿病患者における S—システィ-ル化トランスサイレチン（測定値： M/Z= 13, 874,理論値： MZZ= 13880. 53)のィォン強度と HbAlc値の関係が示されており、縦軸： SELDI— TOF— MSで測定した S -cysteinylated TTRのイオン強度;横軸： C :コントロール (健常者）、 P :糖尿病患者が記載されている。

[0352] 次に、糖尿病患者における S—システィニル化トランスサイレチン (測定値: MZZ

= 13, 884,理論値： MZZ= 13880. 53)のイオン強度と HbAlc値の関係を調ベた。

[0353] 測定条件および統計値

CM10 (pH7)：弱陽イオン交換チップ (洗浄条件）

Fr4：図血清の発現解析プロトコール参照。

[0354] SPA— H ：： MS測定マトリックス

測定値： M/Z : 13884,

P- Value : 0. 0005, ROC area : 0. 90

その結果を図 37に示す。図 37には、糖尿病患者における S—システィ-ル化トランスサイレチン（測定値： M/Z= 13, 884,理論値： MZZ= 13880. 53)のイオン強度と HbAlc値の関係が示される。縦軸： SELDI— TOF— MSで測定した S— cy steinylated TTRのイオン強度;横軸： C :コントロール (健常者）、 P :糖尿病患者

[0355] 次に、糖尿病患者における MZZ : 13, 863の実測データを示す（図 38)。

[0356] このように、 S—システィ-ル化トランスサイレチンの挙動は、糖尿病の指標であることが判明し、し力もその重症度に相関していることも明らかになった。 [実施例 10]

[0357] (アポリポタンパク質は良好な事前診断マーカーである。 )

本実施例において、上記実施例において、予防 (事前)マーカーと予測した 8.3Kは、 Apo CIIと同定した。

[0358] (ラットァポリポタンパク質 C2の精製同定スキーム）

(A.イオン交換による精製法）

ラッ卜血清 750 Lを 50mM Tris-HCl (pH6. 0)【こて 5倍希釈を行!ヽ、 Millip ore Millex— HV(0. 45 m)フィルターユニットを用いてろ過したものをサンプルとした。得られたサンプルを強陰イオン交換カラムである Amersham HiTrapQ HP lmLを用いて分画を行った。はじめに 50mM Tris— HCl (pH6. 0)にて 5CV洗浄を行い、次いで 50mM Tris— HCl(pH6. 0) , 200mM NaClにて 12CV洗浄を行い、その後 50mM Tris— HCl (pH6. 0)にて 5CV洗浄を行った。溶出は 50m M Na- Acetate (pH3. 0)を用いて 2CV行った。溶出サンプルは 10倍量のァセトンにてアセトン沈殿を行い、得られた沈殿物を 62. 5mM Tris-HCl (pH6. 8) , 1 % SDS, 20%グリセロール， 0. 005% BPB混合溶液 100 /z Uこ溶解し SDS— P AGE用のサンプルとした。

[0359] (B. SDS— PAGEによる精製法）

A.の要領で作成した上記サンプルを 20· L使用し、 DRC Perfect NT Gelポリペプチド分析用を用い、定電圧（100V, 2. 5hr)にて分画を行った。泳動緩衝液は lOOmM Tris, lOOmM Tricine, 0. 1% SDSを用いた。泳動終了後、 10% A cOH in 40% MeOHにて固定化を行い、超純水にて洗浄後、 CBBにて染色を行った

(C.ゲルからの抽出および SELDI— TOF— MS分析）

[0360] 得られた抽出液を CIPHERGEN H50 ProteinChipArrayに乗せ、 0.

1% TFA にて 2回洗净を行!/、、マトリックス ίま 25⁰/₀ SPA 0. を 2回乗せて測定を行った。

[0361] (D.ゲル内消化による同定法）

(1)反応溶液の調整

還元溶液の調整 <用事調整 >

•DTT (1. 5mg)を lOOmM 重炭酸アンモ-ゥム（ImL)に溶解する。

アルキル化溶液の調整 <用事調整 >

'ョ一ドアセトアミド（lOmg)を lOOmM 重炭酸アンモ-ゥム（ImL)に溶解する。トリプシン溶液の調整 <用事調整 >

•トリプシン（20 μ g)を 50mM 酢酸 (0. ImL)に溶解し、トリプシン保存液とする。トリプシン保存液（25 L)に超純水（200 L) , lOOmM 重炭酸アンモ-ゥム（ 500 L) , MeCN ^OO /z L)を加え、トリプシン溶液とする。

(2)バンドを切り出し、 500 Lのチューブに入れる。

(4)還元溶液を 100 L加え、 30分インキュベートする。

(5)アルキル化溶液を 100 L加え、 30分インキュベートする。

(7) 1Z10倍量の 1% TFAをカ卩え、反応を停止する。

[0362] 消化サンプル 1 μ Lを金属プレートに乗せ、マトリックスには飽和 CHCA 0. 4 _U L を用いて Applied Bio systems 4700 Proteomics Analyzerにて柳 J疋を行つた。

[0363] 得られたデータについて

Mascot (http://www.matrixscience.com/search— form— select. ntml) (Dy ~~グへ¹ ~~スサーチを行い、 Rat Similer to Apolipoprotein C2であると同定した。

[0364] (E.ウェスタンブロッテイングによる同定法）

B.の要領で SDS— PAGEを行った後、 CBBで染色を行わず、下記の要領で PV DF膜にブロッテイングを行い、 BIO— RAD Amplified Alkaline Phosphatase Goat Anti- Rabbit Immun—Blot Assay Kit, 170— 6412, Lot 30000 2087により検出を行った。

(1)試薬の調製

'陽極緩衝液

60mM Tris, 40mM CAPS, 0. 1% SDS, pH9. 6

'陰極緩衝液

60mM Tris, 40mM CAPS, 15% MeOH, pH9. 6

•Tris - buffer saline (TBS)

20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH7. 5

'洗浄溶液 (TTBS)

20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 0. 05% Tween— 20, pH 7. 5 •ブロッキング緩衝液

TBS中 5% 脱脂乾燥ミルク

•1次抗体溶液

Santa Cruz Biotechnology, anti Apo C2 (Q— 20) Goat polyclonal I gG, sc- 19014, Lot C1904を TTBSで 1000倍希釈（終濃度 0. 2 μ g/mL) •2次抗体溶液

Zymed Laboratories, Rabbit Anti— oat IgG (H + L) Biotm― Conjugat e, 81 - 1640, Lot 50494328を TTBSで 3000倍希釈

Streptavidin 10 Lを 30mLの TTBSに溶解し、更にビォチン化アルカリホスファターゼ 10 Lをカ卩え、 2時間、室温でインキュベートする。

•AP発色溶液

25 トツクを超純水にて 25倍希釈し、 AP発色緩衝液を作成する。 AP発色緩衝液 20mL〖こ対し 200 μ Lの AP発色試薬 A, 200 μ Lの AP発色試薬 Βを添カ卩し AP発色溶液とする。

(2)陽極板に陽極緩衝液を湿潤させたろ紙を重ね、その上にメタノールを 5分間湿潤させた PVDF膜（7 X 6cm)を重ね、更にゲルを乗せ、陰極緩衝液を湿潤させたろ紙を重ね、陰極板を乗せ、定電流 105mAで 30分通電した。

(3)通電後、 PVDF膜は超純水に浸し、 5分振とうした。

(6) 1次抗体溶液に浸し、室温で 2時間、振とうを行った。

(8) 2次抗体溶液に浸し、室温で 2時間、振とうを行った。

(9) (8)の作業中、ストレプトアビジン一ピオチン化アルカリホスファターゼ complex 作成した。

(10) 2次抗体反応後、 TTBSに浸し室温にて 5分 X 3回、振とうし洗浄を行った。

(11)ストレプトアビジン一ピオチン化アルカリホスファターゼ complex溶液に浸し、室温で 2時間、振とうを行った。

(12)ストレプトアビジン一ピオチン化アルカリホスファターゼ complex反応後、 TT BSに浸し室温にて 5分 X 3回、振とうし洗浄を行った。

( 13) AP発色溶液に浸し確認した。

(F.抗体チップ（CIPHERGENPS10/PS20 ProteinChipArray)を用いた同定法）

Cの要領により抽出したサンプルについて、抗体チップを用いて同定を行った。（下記プロトコールを参照）

(1)試薬の調整

ブロッキング緩衝液： 1M Tris-HCl pH 8. 0 + 140mM NaCl 洗浄緩衝液 1 : 0. 1% TritonX- 100 / PBS

洗浄緩衝液 2 : 1% TritonX— 100 / PBS + 150mM NaCl

(2) 50% MeCN 200 Lを各スポットに applyし、 lmin, RT,静置する（PS10のみ)。

(3) MeCNを除去し PBS 200 Lを各スポットに applyし、 lmin, RT,静置する（P S10のみ）。

(4) PBSを除去し 125 μ g/mL 100 μ Lのプロテイン Α溶液を各スポットに applyし、 4°Cにてー晚静置する。

(5)プロテイン A溶液く SIGMA Aldrich, Protein A from Staphylococcus aureus, P7837- 5MG, Lot 074K10321 >を除去し、ブロッキング緩衝液 20 を applyし、 30min, RT (室温），静置する。

(6)ブロッキング緩衝液を除去し洗浄緩衝液 1 200 Lを applyし、 5min, RT,静置する（2times)。

(7)洗浄緩衝液 1を除去し、抗体溶液 < Santa Cruz Biotechnology, anti Apo C2 (Q- 20) Goat polyclonal IgG, sc— 19014, Lot C1904>を PBSにて終濃度 30 μ gZmLになるように希釈し、抗体溶液 100 μ Lを applyし 2hr, RT, 振とうを行う。

(8)抗体溶液を除去し、洗浄緩衝液 1 200 Lを applyし、 5min, RT,振とうを行う (2times) ₀

(9)洗浄緩衝液 1を除去し、 PBS 200 Lを applyし、 5min, RT,振とうを行う。

(10) PBSを除去し、 10mM HEPES (pH 7. 5) 200 Lを applyし、 30sec, R T,振とうを行う。

(11) HEPESを除去し、抗原溶液 20 /z Lを applyし、 2hr, RT,振とうを行う。

(12)抗原溶液を除去し、洗浄緩衝液 2 200 /z Lを applyし、 3min, RT,振とうを行う (2timesリ。

(13)洗浄緩衝液 2を除去し、 PBS 200 Lを applyし、 3min, RT,振とうを行う。

(14) PBSを除去し、 10mM HEPES (pH 7. 4) 200 Lを apply、 30sec, RT (室温)，振とうを行う。

(15) HEPESを除去し、風乾後、 EAM (50% SPA 0. 5 L X 2times)を appl yし、測定を行う。

[0366] また、その結果を図 39および図 40に示す。

[0367] 図 39には、糖尿病ラット血清 8.3K (Apo CII)箱髭図を示す。

[0368] 図 40には、上記の時系列データを示す。アポ CIIが良好な事前診断マーカーであることが明らかになった。

[0369] 図 41〜43には、得られた血清力ラットのアポリポタンパク質 CIIであることを示す結果が示されている。図 41は、ゲル上のバンドの SELDI— MSの結果を示す。図 42 には、得られたバンドのウェスタンブロットによる確認を示す。図 43には、クロマトダラフィ一による分画において抗 ApoC2抗体により増強される様子を示す。

[0370] 図 44力図 47は、ヒトにおけるアポリポタンパク質 CIIもまた事前診断マーカーであることを実証する。

[実施例 11 :スクリーニング]

[0371] まず、本発明において見出されたマーカー物質に変動 (好ましくは、正常化)させる可能性のある物質を、スクリーニングする。

[0372] 本実施例では、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における該マーカー物質の少なくとも 1つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する。

[実施例 12：ヒトでのスクリ一ユング]

[0373] 実施例 11で動物モデルで糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果が見られた物質について、実際にヒト被験体においても効果があるかを評価する。これは、通常の治験と同様の手続に則って行う。

[0374] このようなスクリーニングにより、動物において実際に糖尿病を診断することができることが理解される。

[実施例 13 : 健常者に見出されるマーカー物質と罹患者に見出されるマーカー物質とを示差的に識別することができる抗体の作製]

上述の実施例において、糖尿病のマーカー物質であることが明らかになったトランスサイレチンには、非修飾のものと、アミノ酸配列中に唯一存在するシスティン残基において修飾されたものがある。その修飾には、システィ-ル化の他に、スルホ-ル化やダルタチオン化、ホモシスティ二ルイ匕等が知られている力上記実施例において糖尿病のマーカーとして、システィニル化トランスサイレチンが見出された。

[0375] 本実施例では、このシスティニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しないような系を作ることを目的とした。

[0376] 抗原として!/、るペプチド (特に Cys残基近傍)の配列はヒトと代表的な免疫動物との間でよく保存されており、トランスサイレチンは血清に多く含まれることから、普通に免役しても抗体はできにく、と考えられることから、 Chiome社の ADLib (登録商標）の技術を用いることにした。システィン残基付近のアミノ酸配列のァライメントを以下に示す。

[Homo sapiens] GPTGTGESKCPLMVK (配列番号 25)

[Musmusculus] GPAGAGESKCPLMVK (配列番号 26)

[Rattusnorvegicus] GPGGAGESKCPLMVK (配列番号 27)

[GallusGallus] APLVSHGSVDSKCPLMVK (配列番号 28)

(材料および方法）

使用した抗原は以下のとおりである。抗体作製は、 Chiome社 (東京、文京）に依頼して行った。

[0377] (抗原）

ペプチドの元となるタンパクの名前と由来：トランスサイレチン（transthyretin, huma n)

長さ： 15残基

ペプチド配列： GPTGTGESKCPLMVK (トランスサイレチンの N末端の最初のァミノ酸残基から 15残基；配列番号 25)

修飾:ペプチド中の Cys残基がジスルフイド結合によりフリーのシスティンと結合して V、る（システィ-ル化修飾されて、る）。

[0378] (抗原調製方法）

抗原は、常法に基づいて調製した。

[0379] 以上の手法を行った結果、各ペプチド (Cysィヒペプチド、非修飾ペプチド両方とも）力約 20mg生成された。これを、ミリ Q (蒸留水）中に溶解し、この溶液を— 80°Cで保存し、各 4mg程度に分注した。

[0380] (抗体調製方法）抗体セレクションプロセスの概略を以下に示す。

[0381] (磁気ビーズ作製）

まず、磁気ビーズへの抗原固定を行った。磁気ビーズにシスティ-ル化トランスサイレチン部分ペプチドを固定しセレクションを行った後、 1週間後に培養上清を用いてシスティニル化トランスサイレチン部分ペプチドと非システィニル化トランスサイレチン部分ペプチドに対して ELISAを行った。

[0382] (ライブラリ一力もの抗体セレクション）

(抗体選抜方法）

抗体選抜方法は、原理的には、特開 2006— 149383号に記載される方法に従つた。手短には、免疫グロブリン遺伝子座において体細胞組換えを誘発させ、種々のィムノグロブリン分子を産生している DT40細胞集団（WO2004Z011644を参照）の中から、ストレプトアビジンに特異的に結合する抗体分子を選別することによって行つた。以下に詳細に説明する。

[0383] (ストレプトアビジンに特異的に結合する抗体の選別）

(培養細胞）

DT40細胞は、 5%の C02恒温槽にて 5%の C02、 39. 5°Cで培養した。培地は、 I MDM培地（Invitrogen社）を用い、 10%FBS、 1%-ヮトリ血清、ペニシリン 100単位 Zml、ストレプトマイシン 100 μ g/ml, 2—メルカプトエタノール 55 μ Μを加えて使用した。また、トリコスタチン Α (和光純薬）は、メタノールに 5mg/mlに溶解したものをストックとし、最終濃度が 2. 5ngZmlとなるように適宜培地で希釈して用いた。細胞濃度は 105〜106個 Zmlに保ちながら培養を続けた。

[0384] (ストレプトアビジン磁気ビーズの作製）

磁気ビーズは DynabeadsM— 280Tosylactivated(Dynal社)を、また磁気スタンドは DynalMPC(Dynal社)を用いた。ビーズ 200 1を 500 1の緩衝液 A (0. 1Mリン酸ナトリウム、 ρΗ7. 4)で 3回洗った後、緩衝液 Α、 400 1中で 240 gのストレプトァビジン (ナカライテスタ社)と 37°Cで 24時間、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズを緩衝液 C (10mMリン酸ナトリウム、 pH7. 4, 150mMNaCl, 0. 1%BSA ) 500 1で 2回洗浄した。その後緩衝液 D (0. 2MTris— HC1、 pH8. 5, 0. 1%BS A) 500 1をカ卩え、 37°Cで 4時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後 500 1の緩衝液 Cで 2回洗浄した後、 0. 02%アジィ匕ナトリウムを含む緩衝液。、 400 μ 1に懸濁した。

[0385] (ゥサギ IgG磁気ビーズの作製）

磁気ビーズは Dynabeads M— 280Tosylactivated(Dynal社)を、また磁気スタンドは DynalMPC(Dynal社)を用いた。ビーズ 200 1を 500 1の緩衝液 A (0. 1Mリン酸ナトリウム、 pH7. 4)で 3回洗った後、緩衝液 A、 200 1中で 120 gのゥサギ IgG( SIGMA社)と 37°Cで一晩、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズを緩衝液 C ( 10mMリン酸ナトリウム、 pH7. 4, 150mMNaCl, 0. 1 %BSA) 200 1で 2回洗浄した。その後緩衝液 D (0. 2MTris— HC1、 pH8. 5, 0. 1 %BSA) 200 1を加え、 37°Cで 4時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後 50 0 1の緩衝液 Cで 2回洗浄した後、 0. 02%アジィ匕ナトリウムを含む緩衝液 C、 200 μ 1に懸濁した。

[0386] (ストレプトアビジン磁気ビーズおよびゥサギ IgG磁気ビーズによるセレクション）トリコスタチン A、 2. 5ngZmlで 7週間処理した野生型 DT40細胞約 5 X 107個を洗浄緩衝液（1 %BSAを含む PBS) 10mlで 1回、さらに lmlで一回洗浄したのち、 1 mlの洗浄緩衝液中でストレプトアビジン磁気ビーズ (ゥサギ IgG磁気ビーズによるセレクシヨンの場合はゥサギ IgG磁気ビーズ) 5 X 106個と混合し、 4°Cで 30分間、穏ゃかに回転させつつインキュベートした。その後 lmlの洗浄緩衝液で 5回洗浄した。最後に、磁気ビーズに結合した細胞を 500 1に懸濁し、これを 30mlの培地に加えたのち、 96穴プレートに 300 1ずつ分注し、 39. 5°Cで培養した。 1週間後、培養上清で ELISAを行った。

[0387] (2枚のプレートによる ELISA)

2枚の 96穴ィムノプレート 'マキシソープ（NalgeNunc社）を用意し、それぞれに 5 μ g Zmlのストレプトアビジン（ナカライテスタ）およびオボアルブミン（Sigma社） (V、ずれも PBSに溶解）を 200 1カ卩え、室温でー晚放置してプレートに固定した（ゥサギ IgG磁気ビーズによるセレクションの場合は、ゥサギ IgG (SIGMA社）および卵白リゾチーム（ SIGMA社）を用いた）。その後 0. 5%スキムルク 200 1により室温で 1時間ブロッキングし、 ELISA洗浄緩衝液（0. 05%Tween20をカ卩えた PBS) 200 /z lで 3回洗浄した。ここに細胞培養上清 100 1を加え、室温で 1時間反応させた。なお、ここで培養上清は、同じものをストレプトアビジン固定プレートとオボアルブミン固定プレートの両方に（ゥサギ IgG磁気ビーズセレクションの場合はゥサギ IgG固定プレートと卵白リゾチーム固定プレート） 100 1ずつ分注した。その後 ELIS A洗浄緩衝液 200 1で 5回洗浄し、ホースラディッシュペルォキシダーゼ共役ャギ抗-ヮトリ IgM抗体（Bethyl社) を PBS〖こより 2000倍〖こ希釈して 100 1ずつカロえた。室温で 45分間反応後、 ELIS A洗浄緩衝液で 5回洗浄し、その後 TMB+ (Dako社)を 100 1カ卩え、室温で 4分間反応させた後、 1N硫酸 100 1により反応を停止させた。定量は、 mQuantBiomole cularSpectrometer (Bio- Teklnstruments社）により 450nmの吸光を測定して行つた。

[0388] ELISAの結果は、ストレプトアビジンに反応する抗体の O. D.値で示すと共に、同じクローンのオボアルブミンとの反応性に関する ELISAの結果を同時に示すことによつて評価する。

[0389] ストレプトアビジンに対し高!、親和性を示して!/、るクローンは!、ずれもオボアルブミンに対しても強く反応しているため、ストレプトアビジンに対する親和性のみを指標に選別を行うと、どのようなリガンドにも非特異的に結合する抗体を選別する確率が極めて高いことが実験的に明らかになった。一方、この方法を用いれば、こうした非特異的な抗体を当初力も効率的に除外できることが確認された。実際、ストレブトァビジン単独でアツセィを行うと 28クローンが候補として選別される力そのほとんどがオボアルブミンに対しても強く結合する。そのようなクローンを除外することにより、即座に 1クローンに限定することが可能である。

[0390] (2.特異性の確認）

(ストレプトアビジン特異性検証のための ELISA用培養上清の作製）

さらなる特異性を ELISAにより解析するのに用いた培養上清は、血清由来の IgM 等を除去するため、以下のようにして調製した培地を用いた。 -ヮトリ血清 (Invitrogen 社)から 50%飽和硫安によりィムノグロブリンを沈殿として除去し、上清を PBSに透析した。透析により生じた体積増加を CentriPrep (Amicon社）による濃縮で補正し、抗体除去-ヮトリ血清とした。これを AIM—V無血清培地（Invitrogen社）に 6%の濃度で加えた。ここに約 106Zmlの濃度で細胞をカ卩え、 2日培養し、培養上清をとり ELIS Aを行った。

[0391] (ストレプトアビジン特異性検証のための ELISA)

96穴ィムノプレート 'マキシソープに 5 μ gZmlのストレプトアビジン、オボァノレブミン、ヒト IgG (Sigma社）、また 0. 5%スキムミルク（Difco社）（いずれも PBSに溶解）を 200 1加え、室温でー晚放置してプレートに固定した。その後 0. 5%スキムルク 200 1 により室温で 1時間ブロッキングし、 ELISA洗浄緩衝液 200 1で 3回洗浄した。ここに細胞培養上清を 1倍から 3, 125倍まで、 6段階に 5倍ずつ希釈したものを 100 1 加え、室温で 1時間反応させた。なお、ここで用いたクローンは、さきの SD10を一度限界希釈して得られたクローン SD10— 1を用いた。その後 ELISA洗浄緩衝液 200 μ 1で 5回洗浄し、ホースラディッシュペルォキシダーゼ共役ャギ抗-ヮトリ IgM抗体を PBS〖こより 2, 000倍〖こ希釈して 100 1ずつカロえた。室温で 45分間反応後、 ELISA 洗浄緩衝液で 5回洗浄し、その後 TMB +を 100 1加え、室温で 4分間反応させた後、 1N硫酸 100 /z lにより反応を停止させた。定量は、 mQuant Biomolecular S pectrometerにより 450nmの吸光を測定して行った。

[0392] (結果）

(ELISAによる特異性検討）

システィニル化トランスサイレチン部分ペプチドと非システィニル化トランスサイレチン部分ペプチドへの反応性比較を行った。

[0393] その結果、システィニル化トランスサイレチン部分ペプチドに対して反応するクローンの殆どは、非システィ-ル化トランスサイレチン部分ペプチドに対しても同様に反応したが、そのうち 2クローンに関して、両ペプチドに対する反応性が若干ことなるものが得られた。

[0394] さらに選抜を進めると、 Cysィ匕ペプチド特異的抗体を作製することができる。したがつて、システィニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しない抗体を作製することができる。そのためには、本実施例において用いた抗原ペプチド (Cysィ匕ペプチド）に反応し、非修飾の同じ配列のペプチドには反応しないようなものを選抜することによって得ることができることが見出された。

[実施例 14： Asp修飾 TTRペプチドを用 V、た抗体製造]

[0395] 実施例 13にお、て、抗原として Asp修飾 TTRペプチドを用いて同様の抗体製造を実施した。

[0396] 使用した、抗原は以下のとおりである。

[0397] [化 1]

[0398] これを、「ImjectImmunogen EDC Kit with BSA」（PIERCE社）を用いて BSAへコンジユゲーシヨンし、実施例 13に記載される手順に従って抗体を製造した。

[0399] 実施例 13に記載されるようにその結果を調査することにより、 Cys化ペプチド特異的抗体を作製することができる。したがって、システィニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しない抗体を作製することができる。

[実施例 15： HuCALを用 V、た抗体製造]

[0400] 上述の実施例において、糖尿病のマーカー物質であることが明らかになったトランスサイレチンには、非修飾のものと、アミノ酸配列中に唯一存在するシスティン残基において修飾されたものがある。その修飾には、システィ-ル化の他に、スルホ-ル化やダルタチオン化、ホモシスティ二ルイ匕等が知られている力上記実施例において糖尿病のマーカーとして、システィニル化トランスサイレチンが見出された。

[0401] 本実施例では、このシスティニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しないような別の系を作ることを目的とした。

[0402] 抗原として、るペプチド (特に Cys残基近傍)の配列はヒトと代表的な免疫動物との間でよく保存されており、トランスサイレチンは血清に多く含まれることから、普通に免役しても抗体はできにくいと考えられることから、 Morphosys社（ドイツ）の MorphoS ys (登録商標）、 HuCAL (登録商標）、 HuCAL GOLD (登録商標）、 AutoPan ( 登録商標）、および AutoScreen (登録商標）技術を用いることとした。

システィン残基付近のアミノ酸配列のァライメントを以下に示す。

[Homosapiens] GPTGTGESKCPLMVK (配列番号 25)

[Musmusculus] GPAGAGESKCPLMVK (配列番号 26)

[Rattusnorvegicus] GPGGAGESKCPLMVK (配列番号 27)

[GallusGallus] APLVSHGSVDSKCPLMVK (配列番号 28)

(材料および方法）

使用した抗原は以下のとおりである。抗体作製は、 GeneFrontier社 (東京、中央）に依頼して行った。

[0403] (抗原）

長さ： 15残基

ペプチド配列： TGESKCPLMVK (トランスサイレチンの N末端の最初のアミノ酸残基から 15残基;配列番号 25のうち 5位〜 15位）

修飾:ペプチド中の Cys残基がジスルフイド結合によりフリーのシスティンと結合して V、る（システィ-ル化修飾されて!、る）かある!/、はピオチン化されて!/、る。

[0404] 従って、以下の 4種類の配列を作製した。

[0405] 1) Biotin-TGESK[C(Cys)]PLMVK-COOH

2) NH2-TGESK [C(Cys)]PLMVK (biotin)— COOH

3) Biotin— TGESKCPLMVK- COOH

4) TGESKCPLMVK- COOH

1)および 2)は抗原ペプチドであり、 3)および 4)はコントロールペプチドである。 1) および 2)は、純度は 95%以上とし、各々 5mg使用した。コントロールは、純度 90% で、 lmgを使用した。

[0406]

(抗原調製方法）抗原は、常法に基づいて調製した。

[0407] 以上の手法を行った結果、各ペプチド (Cysィヒペプチド、非修飾ペプチド両方とも）力約 20mg生成された。これを、ミリ Q (蒸留水）中に溶解し、この溶液を— 80°Cで保存し、各 4mg程度に分注した。

[0408] (抗体調製方法）

(一次スクリーニング）

原理的には、 AutoPan (登録商標）を用いて一時スクリーニングを行った。

[0409] 使用したファージライブラリ一は、 HuCAL GOLD (登録商標）であり、これは、ヒト型 Fab抗体を表面に発現させたファージライブラリーである。 150億種類を超える多様な Fabを持つファージが含まれている。ヒトのコンビナトリアル抗体ライブラリー（Hu CAL ;WO97Z〇8320 ;Knappikら、 J. Mol. Biol. 296 : 55、 2000)力も得られる。この手法は、（ポリ）ペプチドライブラリーの作製に適当な 1つまたは複数の（ポリ）ぺプチド配列をコードする 1つまたは複数の核酸配列を組み立てる方法であって、（ポリ )ペプチド配列がアミノ酸コンセンサス配列を含むものであり、以下の段階を含む方法：（a)少なくとも 3つの相同蛋白質のコレクションから、少なくとも 1つのアミノ酸コンセンサス配列を含む 1つまたは複数の (ポリ）ペプチド配列を導き出す段階；（b)選択的に、該 (ポリ）ペプチド配列内、または該 (ポリ）ペプチドもしくは他の（ポリ）ペプチド配列の間においてアミノ酸の間の好ましくない相互作用を除去するため修飾される、該 (ポリ）ペプチド配列内のアミノ酸を同定する段階 (c)各々の該 (ポリ）ペプチド配列の中で、少なくとも 1つの構造的サブ要素を同定する段階；（d)各々の該 (ポリ）ぺプチド配列を、対応する核酸コード配列に逆翻訳する段階；（e)該サブ要素をコードするサブ配列の末端に隣接する領域または末端の間にある領域に切断部位を組み立てる段階で、該切断部位の各々が、（ea)各々の該核酸コード配列内では唯一であり； (eb)すべての該核酸コード配列の対応するサブ配列に共通であると!/、う特徴を有する。

[0410] このように得たライブラリーについて、抗原を固相化し、 HuCAL (登録商標)ライブラリーと反応させる。結合したファージの回収 (溶出）は、独自の CysDisplayを利用して行う。一次スクリーニングによって候補抗体を発現して、るファージを数百〜数千種類にまで絞り込む。ここでは、特表 2003— 505025に記載される手法に基づいた手法である CycDisplayTMを用いた。この技術では、ファージに発現される抗体 (F ab)をジスルフイド結合を解して発現させ、ファージ部分を還元剤により溶出する。そのため、親和性のみに依存した溶出方法に比べて、多くの特異的抗体の選択が可能となる。

[0411] あるいは、ファージミドのレスキュー、ファージの増幅および精製は以下のようにして行う。 HuCAL (登録商標） Fabを、 34 gZmlクロラムフエ-コールおよび 1%ダルコースを含む 2 XTY培地（2 XTY—CG)において増幅させた。ヘルパーファージ (V CSM13)を 37。C、 OD600約 0. 5で感染させた後、 2 XTYZ34 /Z gZmlクロラムフェ-コール Z50 μ gZmlカナマイシンにおいて遠心および再懸濁した後、細胞を 30 °Cでー晚増殖させた。ファージを上清から PEG沈殿させた後（Ausubelら、 1998)、 PBSZ20%グリセロールに再浮遊させて、 80°Cで保存した。 2回の選別ラウンドのぁ、だのファージ増殖は以下のように行った：溶出したファージを対数中期 TG1細胞に感染させて、 1%グルコースおよび 34 μ g/mlクロラムフエ-コールを添カ卩した LB 寒天に播種した。 30°Cでー晚インキュベートした後、コロニーを搔き取って OD60 00. 5に調節した。ヘルパーファージを上記のように添カ卩した。

[0412] MaxiSorpTMマイクロタイタープレート（Nunc社）のゥエルを、 PBSに溶解して 50 μ gZmlに希釈した（2 gZゥエル）ラットまたはヒト ΤΙΜΡ蛋白質によってコーティングした。 5%脱脂粉乳の PBS溶液によってブロッキングした後、上記のように精製した HuCAL (登録商標） Fabファージ 1〜5 X 1012個を 20°Cで 1時間加えた。数回の洗浄段階の後、結合したファージを 100 mMトリェチルァミンによる pH溶出によつて放出した後、 1M Tris 'HCl、pH 7. 0によって中和した。 Krebsら、 J. Immu nol. Meth. 254 : 67、 2001を参照のこと。 2〜3ラウンドの選別を行い、上記のように各ラウンドのぁ、だにファージの増殖を行った。

[0413] (二次スクリーニング）

次に、 ELISAによる二次スクリーニングを行う。これは、 AutoScreen (登録商標）を用いて行う。一次スクリーニングで絞り込まれたファージをクローニングし、各々 Fab 抗体を発現させ、抗原特異的な ELISA陽性クローンを選定する。 [0414] 選択した HuCAL (登録商標） Fabl断片の Fabコードインサートを、可溶性 Fabの迅速な発現を促進するために、発現ベクター pMORPH (登録商標） X 7FS (Knapp ikら、 J. Mol. Biol. 296 : 55、 2000)にサブクローユングした。選択した HuCAL (登録商標) Fab 1クローンの DNA調製物を適切な制限酵素によって消化した後、 Fabコードインサートを切り出した。精製したインサートを、 scFv—インサートを既に有する上記制限酵素切断ベクター pMORPH (登録商標） X 7にサブクローユングすると、 F ab発現ベクターが作製される。このベクターにおいて発現された Fabは、検出および精製のために二つの C—末端タグ (FLAG (商標）および Strep— tagll)を有する。

[0415] これを ELISAにて選別する。

[0416] (候補抗体の生産および精製）

次に、配列決定により ELISA陽性クローンが単一クローンであることを確認した後、多量の抗体を生産する。えられた Fab抗体をァフィユティークロマトグラフィーにより精製する。

[0417] 生産した抗体は、 pMORPH (登録商標） X 9FSによってコードされる Fab断片の T G— 1細胞における発現は、 34 μ gZmlクロラムフエ-コールを添カ卩した 2 ΧΤΥ培地 1Lと共に振とうフラスコ培養において行った。 0. 5mM IPTGによって誘導した後、細胞を 22°Cで 16時間増殖させた。細胞沈降物のペリプラスム抽出物を調製して、 F ab断片を Strep— tactin (登録商標）クロマトグラフィー（IBA社、ゲッティンゲン、ドィッ）によって単離した。見かけの分子量は、較正標準物質を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（SEC)によって決定した。濃度は、 UV分光光度法によって決定した。

[0418] (2.特異性の確認）

[0419] (ストレプトアビジン特異性検証のための ELISA)

[0420] 評価基準としては、規定の ELISA陽性 (コントロールペプチド）に対して 5倍以上の ELISA比活性が得られるものを 5つ選択し (各々 25— 50 g)、これらから選択された適切な抗体を生産する。 Fab抗体の形式ィ匕または二価 Fabミニ抗体 (Myc— Hisタグ付)の形式を選択してもよ、。

[0421] (結果）

(ELISAによる特異性検討）

システィニル化トランスサイレチン部分ペプチドと非システィニル化トランスサイレチン部分ペプチドへの反応性比較を行う。

[0422] その結果、システィニル化トランスサイレチン部分ペプチドに対して反応するクローンの殆どは、非システィ-ル化トランスサイレチン部分ペプチドに対しても同様に反応するものと示差的に反応するものが得られる。

[0423] さらに選抜を進めると、 Cysィ匕ペプチド特異的抗体を作製することができる。したがつて、システィニル化トランスサイレチンを特異的に検出し、非修飾のトランスサイレチンは検出しない抗体を作製することができる。そのためには、本実施例において用いた抗原ペプチド (Cysィ匕ペプチド）に反応し、非修飾の同じ配列のペプチドには反応しないようなものを選抜することによって得ることができる。

[0424] 以上のように、本発明の好ま U、実施形態を用いて本発明を例示してきた力本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

産業上の利用可能性

[0425] 本発明は、医薬品産業等において利用性を有する。特に、診断薬の製造において産業上の利用可能性を有する。

Claims

請求の範囲

[I] 被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段を含む、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するためのシステムであって、該認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、システム。

[2] 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 1に記載のシステム。

[3] 前記因子は、タンパク質または前記複合分子である、請求項 1に記載のシステム。

[4] 前記因子は、抗体である、請求項 1に記載のシステム。

[5] 前記因子は、標識されるか、または標識可能である、請求項 1に記載のシステム。

[6] 前記手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、 X線解析装置、 SPR、クロマトグラフィー、免疫学的手段、生化学的手段、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法、同位体標識法、タンデムァフィ-ティ精製法、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせ力もなる群より選択される、請求項 1に記載のシステム。

[7] さらに、前記マーカー物質の標準を含む、請求項 1に記載のシステム。

[8] さらに、前記サンプルを精製する手段を備える、請求項 1に記載のシステム。

[9] 前記被験体は、哺乳動物を含む、請求項 1に記載のシステム。

[10] 前記被験体は、齧歯類を含む、請求項 1に記載のシステム。

[II] 前記被験体は、ヒトを含む、請求項 1に記載のシステム。

[12] 前記因子または前記手段は、前記マーカー物質の定量をする能力を有する、請求項 1に記載のシステム。

[13] 前記マーカー物質の定量を行うための定量手段をさらに備える、請求項 1に記載のシステム。

[14] 前記定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカー物質が正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む、請求項 13に記載のシステム。

[15] 前記判定手段は、コンピュータである、請求項 14に記載のシステム。

[16] 前記システムは、前記マーカー物質または該マーカー物質に特異的に相互作用する前記因子を含む組成物である、請求項 1に記載のシステム。

[17] 前記トランスサイレチン誘導体は、 S—システィ-ルトランスサイレチン、ダルタチォン化トランスサイレチン、 S— S結合形成トランスサイレチン、酸化トランスサイレチン、ホルミル化トランスサイレチン、ァセチル化トランスサイレチン、リン酸化トランスサイレチン、糖鎖付カ卟ランスサイレチン、ミリスチル化トランスサイレチンおよびこれらの複合誘導体からなる群より選択される、請求項 1に記載のシステム。

[18] 前記トランスサイレチン誘導体は、 S—システィ-ルトランスサイレチンである、請求項 1に記載のシステム。

[19] 前記トランスサイレチン誘導体は、 S—システィ-ルトランスサイレチンであり、前記識別する手段は抗体である、請求項 1に記載のシステム。

[20] 前記因子または前記手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とに対して示差的に反応する、請求項 1に記載のシステム。

[21] 前記因子または前記手段は、トランスサイレチンまたはトランスサイレチン誘導体の

Vヽずれか一方としか実質的に反応しな、、請求項 1に記載のシステム。

[22] 前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増力!]からなる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症しているか、または将来の発症リスクが高、ことの指標である、請求項 1に記載のシステム。

[23] 前記トランスサイレチンの減少および前記トランスサイレチン誘導体の増力!]からなる群より選択される少なくとも 1つの現象が、糖尿病を発症の程度、または将来の発症リスクが高さの指標である、請求項 1に記載のシステム。

[24] 前記トランスサイレチンは、配列番号 1もしくは配列番号 3に示される核酸配列によつてコードされるカゝ、または配列番号 2もしくは配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有するか、先頭の 20アミノ酸が切除されている力、あるいは、これらの改変配列を有する、請求項 1に記載のシステム。

[25] 前記トランスサイレチン誘導体は、配列番号 1もしくは配列番号 3に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号 2もしくは配列番号 4に示されるアミノ酸配列における、それぞれ、 30位のシスティンまたはそれに対応するシスティンのシスティンがシスティ-ル化されている誘導体である力、または、先頭の 20ァミノ酸が切除されている、請求項 1に記載のシステム。

[26] 前記因子または前記手段は、トランスサイレチンの単量体と四量体との区別をする能力を有する、請求項 1に記載のシステム。

[27] 前記因子または前記手段は、トランスサイレチンと S—システィニルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する、請求項 1に記載のシステム。

[28] 前記因子または前記手段は、トランスサイレチンと S—システィニルトランスサイレチンとの区別をする能力を有する抗体を含む、請求項 1に記載のシステム。

[29] 前記因子または前記手段は、トランスサイレチンと S—システィニルトランスサイレチンとを認識し、かつ、前記システムはトランスサイレチンと S—システィニルトランスサイレチンとを識另 IJする手段をさらに備える、請求項 1に記載のシステム。

[30] 前記因子または前記手段は、トランスサイレチンと S—システィニルトランスサイレチンとを認識し、前記システムはトランスサイレチンの分子量と S—システィ-ルトランスサイレチンの分子量とを識別する手段、およびトランスサイレチンと S—システィニルトランスサイレチンとの相対比を測定する手段をさらに備える、請求項 1に記載のシステム。

[31] 診断薬である、請求項 1に記載のシステム。

[32] 被験体が糖尿病であるかどうか事前診断もしくは診断するため、または該事前診断もしくは診断を支援するための方法であって、

A)該被験体由来のサンプル中のマーカー物質を測定する工程；および

B)該測定結果から、該被験体が糖尿病またはその可能性があるかどうかを決定する工程、

を包含する、方法。

[33] 請求項 2〜30のいずれか 1項に記載の特徴を有する、請求項 32に記載の方法。

[34] 被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための医薬の製造における、使用であって、該認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、使用。

[35] 請求項 2〜30のいずれか 1項に記載の特徴を有する、請求項 34に記載の使用。

[36] 被験体由来のサンプル中のマーカー物質、該マーカー物質に特異的に相互作用する因子、または該マーカー物質を選択的に認識する手段の、被験体が糖尿病であるかどうか事前診断または診断するための使用であって、該認識する手段は、トランスサイレチンとトランスサイレチン誘導体とを識別する能力を有する、使用。

[37] 請求項 2〜30のいずれか 1項に記載の特徴を有する、請求項 36に記載の使用。

[38] 前記サンプルは、血液であることを特徴とする請求項 32に記載の方法。

[39] 前記サンプルを、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定ィ匕した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項 32に記載の疾病の診断方法。

[40] 前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定ィ匕されていることを特徴とする請求項 39に記載の方法。

[41] 前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする請求項 39または 40に記載の方法。

[42] 被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法であって、

b)該動物の体液中における該マーカー物質の少なくとも 1つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を評価する工程、

を包含する、方法。

[43] 請求項 2〜30のいずれか 1項に記載の特徴を有する、請求項 84に記載の方法。

[44] 前記基準値は、糖尿病を発症している動物または将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項 42に記載の方法。

[45] 前記体液は、血液であることを特徴とする請求項 42〜44のいずれか 1項に記載の方法。

[46] 前記被検物質は、食品素材であることを特徴とする請求項 42〜45のいずれか 1項に記載の方法。

[47] 前記体液または体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定ィ匕した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項 42〜46のいずれかに記載の方法。

[48] 前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定ィ匕されていることを特徴とする請求項 47に記載の方法。

[49] 前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体または抗体であることを特徴とする請求項 46または 47に記載の方法。

[50] 請求項 42〜49の、ずれかに記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、糖尿病の改善効果または将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。

[51] 請求項 50に記載の方法によって得られた物質。