WO2007045432A9 - Srf als diagnostisches und/oder therapeutisches target für erkrankungen, die mit neuronalen abnormalitäten assoziiert sind - Google Patents

Srf als diagnostisches und/oder therapeutisches target für erkrankungen, die mit neuronalen abnormalitäten assoziiert sind

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WO2007045432A9
WO2007045432A9 PCT/EP2006/009993 EP2006009993W WO2007045432A9 WO 2007045432 A9 WO2007045432 A9 WO 2007045432A9 EP 2006009993 W EP2006009993 W EP 2006009993W WO 2007045432 A9 WO2007045432 A9 WO 2007045432A9
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transcription products
neuronal
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Alfred Nordheim
Bernd Knoell
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Univ Tuebingen
Alfred Nordheim
Bernd Knoell
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Publication of WO2007045432A3 publication Critical patent/WO2007045432A3/de

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • SRF as a diagnostic and / or therapeutic target for diseases associated with neuronal abnormalities
  • the present invention relates to the use of at least one substance for detecting and / or influencing the expression and / or activity of SRF (serum response factor) and / or SRF-regulated transcription products in neuronal cells for the diagnosis and / or therapy of diseases associated with neuronal abnormalities are associated.
  • SRF serum response factor
  • Neurodegenerative diseases are now among the most common civilization diseases. Their causes can be very diverse.
  • Parkinson's disease in particular is the apoptosis (physiological cell death) of certain nerve cells (neurons) with consecutive neurotransmitter deficiency, in particular dopamine deficiency, in some brainstem regions also serotonin and norepinephrine deficiency based.
  • the progressive cell death of neurons leads to a disruption of normal cerebral functions.
  • the increasing degeneration of the neurons in Alzheimer's dementia also leads to a consecutive neurotransmitter deficiency, in particular a lack of acetylcholine.
  • the inventors surprisingly observed a change in motility in post-mitotic SRF-deficient neurons; in particular, a motility inhibition was observed in cell bodies of post-mitotic SRF-deficient neurons compared to control cells (see FIG 9).
  • the motility of the cell bodies of differentiated neurons is fundamentally different from the cellular migration of neural progenitor cells.
  • cellular migration is strongly chemotactically influenced.
  • the formation of synapses is essentially subject to regulation by SRF; in particular, the formation and dynamics of cytoskeletal structures in pre- and post-synaptic cell compartments is essentially subject to regulation by SRF.
  • a modulation of the expression and / or the activity of the SRF can therefore be used for the therapeutic modulation of the synapse formation and synaptic connections of neurons.
  • synaptic connections in neurons can be stimulated and transmission activities in neurons can be induced.
  • WO 02/20092 A1 shows that SRF (serum response factor) is a modulator for various cellular activities.
  • SRF is a nuclear protein which occurs in almost all eukaryotic cells and which, in particular as a transcription factor, influences the expression of a large number of genes.
  • SRF in particular human SRF, reference is made to WO 02/20092 A1, the disclosure content of which should be included in the scope of the present invention so far.
  • At least one substance is used to detect and / or influence the expression and / or activity of SRF (serum response factor) and / or SRF-regulated transcription production in neuronal cells for the diagnosis and / or therapy of diseases associated with neuronal abnormalities (Anomalies) are used.
  • SRF serum response factor
  • SRF serum response factor
  • SRF-regulated transcription products is understood to mean gene products, ie mRNAs, microRNAs and proteins, which are regulated, in particular stimulated or inhibited, by SRF at the transcriptional level.
  • “therapy” is to be understood as meaning the treatment of disorders associated with neuronal abnormalities, the treatment of associated disorders of well-being as well as the prophylaxis and prevention of such diseases, in particular on the basis of neuroregenerative processes.
  • wild-type is meant the naturally occurring protein in the cell, including possible isoforms thereof.
  • constitutively active SRF variant is to be understood as meaning a protein or polypeptide which has the activity of wild-type SRF in constitutively active form.
  • a protein or polypeptide in particular a genetically modified variant of SRF is suitable.
  • the substance used according to the invention already influences the expression and / or activity of SRF and / or SRF-regulated transcription products at the transcriptional level.
  • the gene sequences coding for SRF and / or SRF-regulated transcription products, in particular promoters serve as targets for influencing the expression and / or activity of SRF and / or SRF-regulated transcription products.
  • the substance used according to the invention influences the expression and / or activity of SRF and / or SRF-regulated transcription products on a translational level.
  • the mRNA required for translation into a protein preferably serves as a suitable target for influencing the expression and / or activity of SRF and / or SRF-regulated transcription products. Further details will be explained below.
  • the substance used according to the invention can have an effect on the expression and / or activity of SRF and / or SRF-regulated transcription products at the post-translational level, the substance preferably influencing the phosphorylation status of expressed SRF protein and / or of expressed SRF-regulated transcription products , in particular stimulated or inhibited.
  • the present invention further relates to the use of at least one substance for detecting the expression and / or activity of SRF (serum response factor) and / or SRF regulated transcription products in neuronal cells for the production of a diagnostic agent for diseases associated with neuronal abnormalities.
  • SRF serum response factor
  • At least one substance will also be used to influence the expression and / or activity of SRF (serum response factor) and / or SRF-regulated transcription products in neuronal cells for the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for the therapy of disorders associated with neuronal abnormalities , used.
  • SRF serum response factor
  • the expression and / or activity of SRF (serum response factor) and / or SRF-regulated transcription products in neuronal cells is stimulated and / or inhibited, preferably stimulated.
  • the substance is constitutively active SRF variants.
  • it may be particularly preferred to increase the intracellular (endogenous) activity of SRF by introducing constitutively active SRF variants into neuronal cells. In this way it is possible to treat a therapy of diseases associated with neurological anomalies on the basis of a protein therapy.
  • SRF activity can be induced in neuronal cells by intracellular introduction of constitutively active SRF variants which are themselves resistant to the inhibitor specific for the wild type SRF protein.
  • targeted inhibition of the wild-type SRF protein in neuronal cells may be desirable in some cases.
  • the constitutively active SRF variants are, in particular, proteins or polypeptides which have a stronger activity than the wild-type SRF protein.
  • the inhibition of the wild-type protein results in the intracellular (endogenous) binding sites for SRF, in particular DNA segments and / or binding domains of potential SRF binding partners, being available for binding of the more active constitutively active SRF variants , In this way, in particular a stronger stimulation and promotion of neurite outgrowth, neurite orientation and / or the formation of synapses in neuronal cells.
  • constitutively-active SRF variants in particular SRF variants which are more active compared to the wild-type SRF protein, are used together with the wild-type inhibitor in a so-called combination therapy for generating endogenous SRF activity in neuronal cells.
  • the constitutively active SRF variants used in the context of protein therapy are fusion proteins.
  • the use of SRF fusion proteins, in particular for increasing the endogenous SRF activity has the advantage that, depending on the choice of the fusion partner, different transmembrane transporter proteins of the neuronal cells, in particular Tat proteins, specific for the respective fusion partner can be used, to effect the translocation of the SRF fusion protein into the cells.
  • it may be preferable for the introduction of SRF to use vectors, in particular expression vectors, preferably viral expression vectors. Applications thereof are known in the art.
  • the substance may in particular be a protein or polypeptide, antibodies directed against SRF and / or SRF-regulated transcription products being particularly preferred.
  • Such antibodies can be used in the context of methods familiar to the person skilled in the art, in particular immunological detection methods, for example ELIS A methods, in particular for the diagnosis of diseases associated with neuronal abnormalities.
  • the substance is polynucleic acids, in particular DNA or RNA.
  • the RNA is oligonucleotides, in particular ribozymes, antisense molecules or so-called siRNA (short interfering RNA).
  • antisense oligonucleotides is particularly preferred.
  • This is an RNA complementary to mRNA (messenger RNA), so that a double strand is formed by mating antisense RNA and mRNA, which can not be translated (translated) into a protein at the ribosomes and thus the expression inhibited by SRF.
  • mRNA messenger RNA
  • antisense technology therefore, the endogenous activity of wild-type SRF protein can be regulated, preferably inhibited.
  • the substance is in particular synthetically produced siRNA (small or short interfering RNA).
  • siRNA small or short interfering RNA
  • Dicer double-stranded RNA
  • Dicer produces short oligonucleotides, in particular with a length of 15 to 25 nucleotides, preferably approximately 22 nucleotides, and in the so-called zymkomplex RISC (RNA-Induced Silencing Complex).
  • RISC RNA-Induced Silencing Complex
  • RISC binds complementary to DNA or mRNA and thus leads to an inhibition of the expression of the corresponding gene product.
  • this RNA interference technology can also be used for regulation, in particular inhibition, of the activity of wild-type SRF protein.
  • the substance is DNA, preferably the DNA of constitutively active SRF variants (gene sequences encoding constitutively active SRF variants).
  • constitutively active SRF variants gene sequences encoding constitutively active SRF variants.
  • the DNA can be present in particular in the form of vector constructs.
  • the DNA vector constructs used according to the invention preferably have a sequence which codes for SRF and / or constitutively active SRF variants and / or SRF-regulated transcription products.
  • the vector constructs are plasmids, in particular the plasmid SRF-VP16 or SRF ⁇ MADS-VP16.
  • the preparation of such vector con structed and their introduction into the cells are known in the art, so that further details are not discussed here, wherein the introduction of vector constructs in the neuronal cells, preferably by means of electroporation.
  • the vector constructs can preferably be introduced as expression vectors, preferably as viral expression vectors.
  • the substance is an active ingredient, preferably a synthetically producible active ingredient.
  • the substance is preferably "small molecular compounds", preferably "small molecular compounds” having a molecular weight (MW) ⁇ 1000.
  • the SRF-regulated transcription products may in particular be cytoskeletal proteins, preferably at least one member of the group comprising actin, vinculin, zyxin, ⁇ -1 integrin, cofilin and / or gelsolin.
  • cytoskeletal proteins preferably at least one member of the group comprising actin, vinculin, zyxin, ⁇ -1 integrin, cofilin and / or gelsolin.
  • the integrin receptors are activated by ligand binding, in particular by additional binding of actin, vinculin, zyxin, ß-1 integrin and / or gelsolin, and form so-called focal adhesion complexes, which connect the extracellular matrix with the integrin, so that the neuronal Anchoring cells to the extracellular matrix and triggering signal transduction cascades, essentially integrating growth factors and hormonal effects.
  • the response of the neuronal cells to these stimuli can be modulated, in particular stimulated or inhibited.
  • the neuronal cells anchored in this way in particular can begin with processes which enable interneuronal communication and in particular are based on neurite outgrowth, neurite orientation and / or on the formation of synapses.
  • the transcription products are Rho-GEF5 ("Rho-Guanine Exchange Factor 5"), PI-3Kinase (phosphatidylinositol-3-kinase) (gamma subunit), PAK3 ("p21 actinase”). vated kinase3 "), c-fos, Egr-1 (early growth response protein-1) and Egr-2 (early growth response protein-2).
  • the results of the inventors show that a lack of SRF activity can cause an increased sensitivity to an intensity of epileptic seizures. In this case, induction of potentially neuroprotective genes in SRF-deficient animal models can be omitted. Suitable neuroprotective genes are in particular c-fos and Egr-1 in question.
  • the substance regulators in particular activators and / or inhibitors, and / or biological precursors of SRF and / or SRF-regulated transcription products.
  • the regulators are cofactors of SRF and / or SRF-regulated transcription products, with cofactors of SRF being particularly preferred.
  • the cofactor is a so-called TCF (Ets type tenary complex factor) and / or proteins of the myocardial family.
  • the substance is particularly preferred for the substance to be at least one member of the myocardium family, comprising myocardium, MAL (megakaryocytic acute leukemia), MKL (myocardine like) and MRTF (myocardinal-related transcription factor), in particular MAL or MRTF.
  • MAL megakaryocytic acute leukemia
  • MKL myocardine like
  • MRTF myocardinal-related transcription factor
  • the inventors were able to demonstrate for the first time that the MAL protein in cooperation with SRF stimulates neurite outgrowth, whereas the stimulating influence of MAL could only be observed in neuronal cells with endogenous SRF activity.
  • the abnormalities may be morphological abnormalities of the neuronal cells.
  • the inventors were able to demonstrate that nerve cells (neurons or neuronal cells) which do not express SRF have a rounded cell body as well as altered growth cones with missing filopodial structures (filopodia of the growth cones serve as sensors for axonal steering molecules).
  • annular structures of actin and / or micro tubules were found instead of growth cones in cells with wild-type SRF after induction with Ephrin A5 or members of the semaphorin molecule family.
  • the number of neuritic side branches was reduced in SRF-deficient nerve cells.
  • incorporation of constitutively active SRF variants results in increased branching (see Figure 10), since side branches represent precursor structures for later synaptic linkage formation , this observation is of particular relevance to neuro-regenerative therapeutic approaches.
  • the abnormalities relate to disorders of neurite outgrowth and / or neurite orientation and / or synapse formation.
  • neurite outgrowth should be understood as meaning both the outgrowth of the neurites from the neuronal cell bodies (so-called neurite outgrowth) and the growth, ie the extension of already formed neurites and their final differentiation.
  • the inventors were able to demonstrate for the first time that SRF causes both stimulation of neurite outgrowth and stimulation of neurite length growth in neuronal cells, particularly hippocampal and / or cortical neuronal cells of the system.
  • Decisive for the correct neurite orientation in vivo is the formation of so-called growth cones at the ends of neurites.
  • These growth cones are polymerized actin (F-actin) and / or microtubule sensors. These sensors interact with specific mediators, thereby regulating the neurite orientation in vivo, thus enabling the desired interconnection of the neurons with each other.
  • An unfavorable orientation of the neurites can be corrected in particular by repulsive mediators, for example, by the mediators inducing a collapse of the abovementioned growth cones, in particular by depolymerization of F-actin.
  • the repulsive mediators are ephrins, in particular ephrin A5 or other axonal steering molecules (eg semaphorin). It was found for the first time that SRF-deficient neurons have a significantly lower sensitivity especially to ephrins, preferably to Ephrin A5, so that erroneous orientations of the neurites between the neurons can not be corrected.
  • the diseases which can be diagnosed and / or treated by means of the use according to the invention are preferably neurodegenerative diseases, preferably Parkinson's disease, Alzheimer's disease, C. Huntington's disease, epilepsy, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), cataract, Hydrocephalus, schizophrenia, addictions and / or behavioral disorders, especially abnormal eating habits. Furthermore, such diseases count also damage to nerve fibers, in particular nerve fiber cuts in the central nervous system (CNS) and / or the peripheral nervous system (PNS), such as in cases of injury-related paralysis, in particular injury-induced "paraplegia", as well as deficits in learning and memory.
  • CNS central nervous system
  • PNS peripheral nervous system
  • the use according to the invention particularly makes possible a therapy which allows the neuroregeneration of at least partially dead and / or otherwise damaged neuronal tissue.
  • the use according to the invention can also be used, in particular, for trauma and injuries to the peripheral nervous system, in particular for paraplegia.
  • the neuronal cells are cells of the limbic system, in particular neuronal cells of the hippocampus.
  • the hippocampus is a part of the limbic system and is one of the oldest euputionary structures of the brain.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of at least one substance which influences, in particular stimulates and / or inhibits the expression and / or activity of SRF (serum response factor) and / or SRF-regulated transcription products in neuronal cells , and optionally a pharmaceutical carrier material.
  • SRF serum response factor
  • the present invention relates to a diagnostic kit comprising at least one substance for detecting the expression and / or activity of SRF (serum response factor) and / or SRF-regulated transcription products in neuronal cells.
  • SRF serum response factor
  • the invention also relates to a method for the diagnosis and / or therapy of diseases associated with neuronal abnormalities, wherein an effective amount of at least one substance for detecting and / or influencing the expression and / or
  • the plasmids SRF-VP16 and SRF- ⁇ MADS-VP16 were prepared as described in the literature (Schratt, G. et al., Serum Response Factor Is Crucial for Actin Cytoskeletal Organization and Focal Adhesion Assembly in Embryonic Stem Cells J Cell Biol 156 , 737-50, 2002).
  • mice anti-neurofilament associated protein (1:50, Developmental Studies Hybridoma Bank
  • murine anti-calbindin (1: 10000, Swant, Bellinzona, Switzerland
  • rabbit anti- ProxD1 (1: 1000, Chemicon
  • rabbit anti-tau (1: 200, Chemicon
  • mouse anti-Map 2 (1: 500, Chemicon
  • mouse anti- ⁇ -tubulin (1: 500, Sigma).
  • Texas Red phalloidin moleukin
  • Cryostat-cooled segments were hybridized with SRF riboprobes labeled with digoxygenin according to standard protocols.
  • the Srf riboprobes were obtained by PCR amplification comprising nucleotides 1550 to 2002 of the mouse SRF sequence (Accession NM_020493).
  • the PCR fragment was cloned into the pBluescript vector and the sequence identity verified.
  • the following primers were used: fwd (5'-AAT GGA TCC CCT AGT CCC CAT GCA GTG AT-3 1 ), rev (5'-AAT GAA TTC GCT GGA GTG AGA GGG CAT AG-3 ').
  • P14-P16 mice were anesthetized with sodium pentobarbital and perfused transcardially with 4% PFA and 0.1% glutaraldehyde in PBS.
  • Brains were removed and fixed in 4% PFA / 5% sucrose PBS. After post fixation, the tissue blocks were washed with PBS, and Horizontal sections (50 ⁇ m) were cut on a vibratome. After treatment with osmium tetroxide, the sections were stained with uranyl acetate, dehydrated and flattened in an epoxy resin (Durcupan ACM, Fluka, Sigma-Aldrich, Gillingham, UK). Ultra-thin sections were produced, which were then analyzed using a Philips CM 100 electron microscope.
  • the P1-P3 hippocampi or cerebella were trypsinized for 10 minutes in a trypsin-EDTA solution at 37% C (Gibco) and then washed in HBSS (Gibco) and resuspended in prewarmed DMEM / 10% horse serum (HS; Gibco).
  • the tissue was mixed by means of Pasteur pipettes heated under a flame, centrifuged (5 minutes, 600 rpm), and the resulting pellet reconstituted in DMEM / HS. After detecting the number of cells, the suspensions were again pelleted and resuspended in the Amaxa mouse Neuron Nuclefactor solution as recommended by the manufacturer (Amaxa, Cologne, Germany).
  • the cell cultures were plated in a NMEM medium which was supplemented as described in the literature (Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S. & Kiebler, M. Chemically Controller formation of a DNA / calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons, J Neurobiol 60, 517-25, 2004).
  • Acid-treated glass coverslips (13 mm diameter) were coated with 100 ug / ml poly-L-lysine (Sigma) in a borate buffer for one hour at 37 0 C, then washed and incubated with 20 ug / ml mouse laminin (Gibco), 20 ⁇ g / ml fibronectin (Becton Dickinson) or 50 ⁇ g / ml collagen (Becton Dickinson) in HBSS during 3 to 4 Hours at 37 0 C. After an additional wax steps, the coverslips in DMEM / 10% HS at 37 0 C until were kept on their use. The neurons were plated at a density of 5 x 10 3 - 2 x 10 4 cells per coverslip. After a 2 hour incubation, the cell cultures were fixed and stained for tubulin as mentioned above.
  • Strip assays comprising recombinant Ephrin A5-Fc (R & D Systems) and Fc (Calbiochem) were performed as described in the literature (Rashid, T. et al., Opposing Gradients of Ephrin-As and EphA7 in the Superior Colliculus Are Essential for Topography Mapping in the Mammalian Visual System, Neuron 47, 57-69, 2005).
  • the neurite length was determined using Axiovision V4.1 and LSM image browser V3.2 (Zeiss, Germany) and ImagingProPlus4.5 software (Media Cybernetics). For this purpose, the cell line profiles were drawn, which include the maximum possible neurite length of a particular neuron. For the experiments only individually growing neurons were considered.
  • FIG. 1 A first figure.
  • the SRF-deficient neurons have a reduced number of neurons with neurite outgrowth (see also g) and others.
  • the growth of neurites in SRF mutant neurons is reduced (quantified in i).
  • the control neurites expressing SFR-VP16 ⁇ MADS have twice the neurite length as the neurites of SRF-deficient neurons (61 + 8.5 ⁇ m vs. 31, 3 + 3.7 ⁇ m).
  • the vector SRF-VP16 significantly increases the neurite length of neurons deficient in endogenous SRF protein (96.1 + 29 ⁇ m).
  • control neurites On strips containing a control protein (c), control neurites still grow almost twice as long as neurons deficient in SRF (82 + 17 ⁇ m in controls vs. 48 + 5 ⁇ m in the mutants). In the experiments with EphrinA ⁇ strips, the control neurites grow slightly shorter (probably due to the repulsive effect of EphrinA ⁇ ) 57 + 12 ⁇ m). The neurons deficient in SRF show a subtle increase in neurite length (16 + 17 ⁇ m).
  • FIG. 7 The hippocampal neurons were electroporated with the control vector, the constitutively active RhoA (RhoA-V14) or Rad (Rac1-V12), and the neurite length (a, b) and Ephrin A5-mediated breakdown of the growth cones (c, d) quantified.
  • RhoA-V14 constitutively active RhoA
  • Rad Rad
  • ac1-V12 the neurite length
  • c, d Ephrin A5-mediated breakdown of the growth cones quantified.
  • electroporation with the vector RhoA-V14 resulted in a reduction in neurite length in the control neurons of approximately 30% (32.7 + 1.1%).
  • the complete cofactor MAL and various truncated versions thereof were introduced into control neurons and SRF-deficient neurons by electroporation, followed by neurite outgrowth (a, b) and EphrinA ⁇ -induced growth cone collapse (c).
  • FIG. 10 Hippocampal neurons were electroporated as control with SRF-VP16 ⁇ MADS (left) or constitutively active SRF (SRF-VP16) (right). In controls, the primary neurites have few side branches (left). Overexpression of the constitutively active SRF, on the other hand, induces the formation of side branches (arrows in the figure on the right) that emerge from the primary neurites.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.

Description

Beschreibung
SRF als diagnostisches und/oder therapeutisches Target für Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF- regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.
Neurodegenerative Erkrankungen zählen inzwischen zu den am häufigsten vorkommenden Zivilisationserkrankungen. Ihre Ursachen können sehr vielfältig sein. So liegt insbesondere der Parkinsonschen Erkrankung die Apoptose (physiologischer Zelltod) bestimmter Nervenzellen (Neuronen) mit konsekutivem Neurotransmittermangel, insbesondere Dopaminmangel, in manchen Hirnstammregionen auch Serotonin- und Noradrenalinmangel, zugrunde. Im Falle der Alzheimer Erkran- kung führt der fortschreitende Zelltod von Neuronen zu einer Störung der normalen cerebralen Funktionen. Die zunehmende Degeneration der Neuronen führt bei der Alzheimer Demenz ebenso zu einem konsekutiven Neurotransmittermangel, insbesondere einem Mangel an Acetyl- cholin. In vielen Fällen findet daher eine Behandlung von neurodegene- rativen Erkrankungen durch Zugabe von Neurotransmittern statt, wobei es sich allerdings lediglich um palliative sowie den weiteren Krankheitsverlauf verzögernde Therapieansätze handelt. Meistens machen die infolge der Erkrankung bei den Betroffenen gewöhnlich auftretenden Befindlichkeitsstörungen, insbesondere Unruhe, depressive Verstimmung sowie Erregung und Aggressivität, zudem eine Behandlung mit Psychopharmaka erforderlich. Alternative Behandlungsmöglichkeiten, insbesondere die Implantation von fötalem Hirngewebe, sind häufig insbe- sondere ethisch sehr umstritten und liefern außerdem in vielen Fällen widersprüchliche Therapieergebnisse.
Es stellt sich somit die Aufgabe alternative Therapiemöglichkeiten, die insbesondere auf neuroregenerativen Prozessen beruhen und die die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile vermeiden, sowie entsprechende Diagnosemöglichkeiten für neurodegenerative Erkrankungen bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendungen, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 3 beschrieben sind. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Verwendungen sind in den abhängigen Ansprüchen 3 bis 19 ausgeführt. Eine pharmazeutische Zusammensetzung und ein Diagnosekit sind in den Ansprüchen 20 bis 22 dargestellt. Die Ansprüche 23 und 24 beziehen sich auf ein geeignetes Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Überraschenderweise wurde von den Erfindern festgestellt, dass das Neuritenwachstum, die Orientierung der Neuriten (insbesondere Axone) sowie die Synapsenausbildung von Neuronen, insbesondere auch des Cortex und/oder des Hippocampus, durch SRF (Serum Response Fac- tor) beeinflußt, insbesondere stimuliert, wird. So konnten die Erfinder bei sogenannten SRF-defizienten Neuronen, d.h. Neuronen, die kein oder lediglich in geringen Mengen wildtypisches SRF exprimieren, deutliche Störungen des Neuritenwachstums, der Neuritenlenkung sowie der Ausbildung von Synapsen beobachten. Weiterhin wurde von den Erfindern überraschenderweise bei post-mitotischen SRF-defizienten Neuro- nen eine Motilitätsveränderung beobachtet, insbesondere wurde im Vergleich zu Kontrollzellen bei Zellkörpern von post-mitotischen SRF- defizienten Neuronen eine Motilitätsinhibierung beobachtet (siehe Figur 9). Anzumerken ist, dass die Motilität der Zellkörper von ausdifferenzierten Neuronen sich grundlegend von zellulärer Migration neuronaler Vorläuferzellen unterscheidet. Insbesondere ist eine zelluläre Migration stark chemotaktisch beeinflusst. Eine Bildung von Synapsen unterliegt im wesentlichen einer Regulation durch SRF, insbesondere unterliegt eine Ausbildung und Dynamik zytoskelettaler Strukturen in prä- und post-synaptischen Zellkompartimenten im wesentlichen einer Regulation durch SRF. Eine Modulation der Expression und/oder der Aktivität des SRF kann daher zur therapeutischen Modulation der Synapsenbildung sowie synaptischer Verschaltungen von Neuronen eingesetzt werden. Dadurch können synaptische Verschaltungen in Neuronen stimuliert werden und Transmissionsaktivitäten in Neuronen induziert werden.
Aus der WO 02/20092 A1 geht hervor, dass SRF (Serum Response Factor) ein Modulator für diverse zelluläre Aktivitäten darstellt. SRF ist ein in nahezu allen eukaryotischen Zellen vorkommendes Zellkern- Protein, welches insbesondere als Transkriptionsfaktor die Expression einer Vielzahl von Genen beeinflußt. Bezüglich weiterer Einzelheiten zu SRF, insbesondere humanem SRF, wird auf die WO 02/20092 A1 ver- wiesen, deren Offenbarungsgehalt insoweit vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt sein soll.
Erfindungsgemäß wird mindestens eine Substanz zum Nachweis und/ oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Se- rum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsproduktion in neuronalen Zellen zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten (Anomalien) assoziiert sind, verwendet.
Unter der Bezeichnung SRF (Serum Response Factor) im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen auch mögliche Isoformen von SRF verstanden werden. Unter der Bezeichnung „SRF-regulierte Transkriptionsprodukte" im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen Genprodukte, d. h. mRNAs, mikroRNAs und Proteine verstanden werden, die von SRF auf transkrip- tioneller Ebene reguliert, insbesondere stimuliert oder inhibiert, werden.
Unter „Therapie" im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen die Behandlung von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, die Behandlung von damit einhergehenden Befindlich- keitsstörungen sowie die Prophylaxe und Prävention derartiger Erkrankungen, insbesondere auf der Basis neuroregenerativer Prozesse, verstanden werden.
Unter dem Begriff „Wildtyp" soll das in der Zelle natürlich vorkommende Protein, einschließlich möglicher Isoformen davon, verstanden werden.
Unter dem Begriff der „konstitutiv-aktiven SRF-Variante" soll ein Protein oder Polypeptid verstanden werden, das die Aktivität von wildtypischem SRF in konstitutiv aktiver Form aufweist. Als ein derartiges Protein oder Polypeptid kommt insbesondere eine gentechnisch modifizierte Variante von SRF in Frage.
Es kann insbesondere vorgesehen sein, dass die erfindungsgemäß verwendete Substanz die Expression und/oder Aktivität von SRF und/ oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten bereits auf transkrip- tioneller Ebene beeinflußt. In einem solchen Fall dienen die für SRF und/ oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukte kodierenden Gensequenzen, insbesondere Promotoren, als Targets zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Trans- kriptionsprodukten. Weiterhin ist es insbesondere bevorzugt, dass die erfindungsgemäß verwendete Substanz die Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten auf translationaler Ebene beeinflußt. Bei diesem Ansatz dient vorzugsweise die für die Translation in ein Protein erforderliche mRNA (Messenger-RNA) als geeignetes Target zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten. Weitere Einzelheiten werden im Folgenden noch erläutert.
Außerdem kann die erfindungsgemäß verwendete Substanz eine Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF- regulierten Transkriptionsprodukten auf posttranslationaler Ebene bewirken, wobei die Substanz vorzugsweise den Phosphorylierungsstatus von exprimiertem SRF Protein und/oder von exprimierten SRF-regu- lierten Transkriptionsprodukten beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Herstellung eines Diagnostikmittels für Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.
Erfindungsgemäß wird außerdem mindestens eine Substanz zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, verwendet. Vorzugsweise wird die Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen stimuliert und/oder inhibiert, vorzugsweise stimuliert.
Vorzugsweise handelt es sich bei der Substanz um konstitutiv-aktive SRF- Varianten. So kann es insbesondere bevorzugt sein, die intrazelluläre (endogene) Aktivität von SRF durch Einschleusung von konsti- tutiv-aktiven SRF-Varianten in neuronale Zellen zu erhöhen. Auf diese Weise ist es möglich eine Therapie von Erkrankungen, die mit neurolo- gischen Anomalien assoziiert sind, auf der Basis einer Proteintherapie zu behandeln.
In Fällen, in denen das endogene wildtypische SRF Protein blockiert vorliegt, beispielsweise wegen eines exogenen spezifischen Inhibitors, ist die Erzeugung einer zusätzlichen exogenen SRF-Aktivität besonders erwünscht. In diesen Fällen kann durch intrazelluläre Einschleusung von konstitutiv-aktiven SRF-Varianten, die selbst gegen den für das wildtypische SRF Protein spezifischen Inhibitor resistent sind, eine SRF- Aktivität in neuronalen Zellen induziert werden.
In manchen Fällen kann jedoch eine gezielte Inhibierung des wildtypischen SRF Proteins in neuronalen Zellen erwünscht sein. Dies ist vorzugsweise dann der Fall, wenn es sich bei den konstitutiv-aktiven SRF- Varianten insbesondere um Proteine oder Polypeptide handelt, die eine stärkere Aktivität als das wildtypische SRF-Protein aufweisen. Durch die Inhibierung des Wildyp-Proteins wird erreicht, dass die intrazellulären (endogenen) Bindungsstellen für SRF, insbesondere DNA-Abschnitte und/oder Bindungsdomänen von potentiellen SRF-Bindungspartnern, für eine Bindung der aktiveren konstitutiv-aktiven SRF-Varianten zur Verfü- gung stehen. Auf diese Weise kann insbesondere eine stärkere Stimulierung und Förderung des Neuritenwachstums, der Neuritenorientierung und/oder der Ausbildung von Synapsen in neuronalen Zellen erzielt werden.
Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, wenn konstitutiv-aktive SRF-Varianten, insbesondere im Vergleich zum wildtypischen SRF Protein aktivere SRF-Varianten, zusammen mit dem Wildtyp-Inhibitor im Rahmen einer sogenannten Kombinationstherapie zur Erzeugung endogener SRF-Aktivität in neuronalen Zellen verwendet werden.
Vorzugsweise handelt es sich bei den im Rahmen einer Proteintherapie verwendeten konstitutiv-aktiven SRF-Varianten um Fusionsproteine. Die Verwendung von SRF-Fusionsproteinen, insbesondere zur Erhöhung der endogenen SRF-Aktivität, besitzt den Vorteil, dass abhängig von der Wahl des Fusionspartners unterschiedliche für den jeweiligen Fusions- partner spezifische transmembrane Transporterproteine der neuronalen Zellen, insbesondere Tat-Proteine, benutzt werden können, um die Translokation des SRF-Fusionsproteins in die Zellen zu bewirken. Weiterhin kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, SRF, insbesondere konstitutiv-aktive SRF-Varianten, vorzugsweise gentechnisch hergestell- te Varianten von SRF, durch Elektroporation in die neuronalen Zellen einzuschleusen. Ferner kann es für das Einschleusen von SRF erfindungsgemäß bevorzugt sein, Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, vorzugsweise virale Expressionsvektoren, zu verwenden. Applikationen davon sind dem Fachmann bekannt.
In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, die endogene SRF- Aktivität zu reduzieren. Das kann insbesondere auf translationaler Ebene beispielsweise durch RNA-I nterferenz-Technologien, insbesondere Antisense-Technologie, erreicht werden, deren Wirkungsprinzipien im Folgenden noch beschrieben werden. Erfindungsgemäß kann es sich bei der Substanz insbesondere um ein Protein oder Polypeptid handeln, wobei gegen SRF und/oder SRF-regu- lierte Transkriptionsprodukte gerichtete Antikörper besonders bevorzugt sind. Derartige Antikörper können im Rahmen von dem Fachmann ge- läufigen Verfahren, insbesondere immunologischen Nachweisverfahren, beispielsweise ELIS A- Verfahren, insbesondere zur Diagnose von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich bei der Substanz um Polynukleinsäuren, insbesondere um DNA oder RNA.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass es sich bei der RNA um Oligo- nukleotide, insbesondere Ribozyme, Antisensmoleküle oder um sogenannte siRNA (short interfering RNA) handelt. Die Verwendung von An- tisens-Oligonukleotiden ist besonders bevorzugt. Hierbei handelt es sich um eine zur mRNA (Messenger RNA) komplementäre RNA, so dass durch Paarung von Antisense-RNA und mRNA ein Doppelstrang gebil- det wird, welcher an den Ribosomen nicht in ein Protein übersetzt (translatiert) werden kann und somit die Expression von SRF inhibiert. Mit Hilfe dieser sogenannten Antisense-Technologie kann daher die endogene Aktivität des wildtypischen SRF Proteins reguliert, vorzugsweise inhibiert, werden.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich bei der Substanz um insbesondere synthetisch hergestellte siRNA (small oder short interfering RNA). Bei dieser Form der RNA-I nterferenz werden ausgehend von doppelsträngiger RNA (dsRNA) durch das Enzym Dicer kurze Oligonu- kleotide, insbesondere mit einer Länge von 15 bis 25 Nukleotiden, vorzugsweise ca. 22 Nukleotide, hergestellt und in den sogenannten En- zymkomplex RISC (RNA-Induced Silencing Complex) eingebaut. Mit Hilfe dieser inkorporierten RNA-Oligonukleotide bindet RISC komplementär an DNA oder mRNA und führt auf diese Weise zu einer Inhibierung der Expression des entsprechenden Genprodukts. Somit kann auch diese RNA-Interferenz-Technologie für eine Regulation, insbesondere Inhibierung, der Aktivität von wildtypischem SRF Protein verwendet werden.
Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, dass es sich bei der Substanz um DNA handelt, vorzugsweise um die DNA von konstitutiv-akti- ven SRF-Varianten (konstitutiv-aktive SRF- Varianten codierende Gensequenzen). Bezüglich weiterer Einzelheiten zur erfindungsgemäßen Verwendungsmöglichkeit der DNA von konstitutiv-aktiven SRF-Varianten, insbesondere im Zusammenhang einer möglichen Kombinationstherapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, wird auf die vorherige Beschreibung der konstitutiv-aktiven SRF-Varianten verwiesen. Die DNA kann insbesondere in Form von Vektorkon- strukten vorliegen. Bevorzugt weisen die erfindungsgemäß verwendeten DNA-Vektorkonstrukte eine für SRF und/oder konstitutiv-aktive SRF-Varianten und/oder SRF-regulierte Transkriptionsprodukte kodierende Se- quenz auf. Vorzugsweise handelt es sich bei den Vektorkonstrukten um Plasmide, insbesondere um das Plasmid SRF-VP16 oder SRFΔMADS- VP16. Die Herstellung derartiger Vektorkon strukte sowie ihre Einführung in die Zellen sind dem Fachmann bekannt, so dass auf weitere Einzelheiten an dieser Stelle nicht eingegangen wird, wobei die Einführung von Vektorkonstrukten in die neuronalen Zellen vorzugsweise mittels Elektroporation erfolgt. Ferner können die Vektorkonstrukte erfindungsgemäß bevorzugt als Expressionsvektoren, vorzugsweise als virale Expressionsvektoren, eingeführt werden. Somit ist es folglich erfindungsgemäß möglich, Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten as- soziiert sind, auf der Basis einer Gentherapie zu behandeln. In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung handelt sich bei der Substanz um Wirkstoffe, vorzugsweise um synthetisch herstellbare Wirkstoffe. Bevorzugt handelt es sich bei der Substanz um „small molecular Compounds", vorzugsweise um „small molecular Compounds" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1000.
Bei den SRF-regulierten Transkriptionsprodukten kann es sich insbesondere um zytoskelettale Proteine handeln, vorzugsweise um mindestens einen Vertreter aus der Gruppe, umfassend Aktin, Vinculin, Zyxin, ß-1 Integrin, Cofilin und/oder Gelsolin. Dies ist erfindungsgemäß besonders vorteilhaft, da extrazellulär wirkende zytoskelettale Proteine, insbesondere die soeben bevorzugt genannten Proteine, an der Verankerung der extrazellulären Matrix mit den Oberflächen von Zellen, insbesondere von neuronalen Zellen, beteiligt sind, wobei die Verankerung vorzugs- weise über entsprechende Rezeptorproteine, insbesondere Integrine, ermöglicht wird. Die Integrinrezeptoren werden durch Ligandenbindung, insbesondere durch zusätzliche Bindung von Aktin, Vinculin, Zyxin, ß-1 Integrin und/oder Gelsolin, aktiviert und bilden sogenannte fokale Adhäsionskomplexe aus, die zum einen die extrazelluläre Matrix mit den In- tegrinen verbinden, damit die neuronalen Zellen mit der extrazellulären Matrix verankern, und zum anderen Signaltransduktionskaskaden auslösen, wobei im wesentlichen Wachstumsfaktoren und Hormonwirkungen integriert werden. Auf diese Weise kann die Reaktion der neuronalen Zellen auf diese Stimuli moduliert, insbesondere stimuliert oder inhi- biert, werden. In einem zweiten Schritt können die insbesondere auf diese Weise verankerten neuronalen Zellen mit Prozessen beginnen, die eine interneuronale Kommunikation ermöglichen und insbesondere auf Neuritenwachstum, Neuritenorientierung und/oder auf der Ausbildung von Synapsen beruhen. Als Transkriptionsprodukte kommen insbeson- dere Rho-GEF5 („Rho-Guanine Exchange Factor 5"), PI-3Kinase (Phosphatidylinositol-3Kinase) (gamma Untereinheit), PAK3 („p21 Acti- vated Kinase3"), c-fos, Egr-1 (Early Growth Response Protein- 1) und Egr-2 (Early Growth Response Protein-2) in Frage.
Die Ergebnisse der Erfinder zeigen, dass ein Fehlen der SRF Aktivität eine erhöhte Sensitivität bezüglich einer Intensität epileptischer Anfälle bewirken kann. Dabei kann eine Induktion potentiell neuroprotektiv wirkender Gene in SRF-defizienten Tiermodellen ausbleiben. Als neuroprotektiv wirkende Gene kommen insbesondere c-fos und Egr-1 in Frage.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung beeinflusst, insbesondere stimuliert und/oder inhibiert, die Substanz Regulatoren, insbesondere Aktivatoren und/oder Inhibitoren, und/oder biologische Vorläufer von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Regulatoren um Cofaktoren von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten, wobei Cofaktoren von SRF besonders bevorzugt sind. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Cofaktor um ein so- genanntes TCF (Ets-Type tenary complex factor) und/oder um Proteine der Myocardinfamilie.
Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, dass es sich bei der Substanz um mindestens einen Vertreter aus der Myocardinfamilie, umfas- send Myocardin, MAL (Megakaryocytic acute leukemia), MKL (Myocar- din Like) und MRTF (Myocardin Related Transcription Factor), insbesondere um MAL oder MRTF, handelt.
So konnte von den Erfindern erstmals nachgewiesen werden, dass das Protein MAL in Kooperation mit SRF das Neuritenwachstum stimuliert, wobei der stimulierende Einfluß von MAL nur in neuronalen Zellen mit endogener SRF-Aktivität beobachtet werden konnte. Entsprechend der erfindungsgemäßen Verwendung kann es sich bei den Abnormalitäten um morphologische Abnormalitäten der neuronalen Zellen handeln. So konnte von den Erfindern nachgewiesen werden, dass Nervenzellen (Neuronen bzw. neuronale Zellen), welche kein SRF exprimieren, einen rundlichen Zellkörper sowie veränderte Wachstumskegel mit fehlenden filopodialen Strukturen aufweisen (Filopodien der Wachstumskegel dienen als Sensoren für axonale Lenkungsmoleküle). Als weitere morphologische Abnormalität wurden im Falle der SRF- defizienten Neuronen ringförmige Strukturen aus Aktin und/oder Mikro- tubuli anstelle von Wachstumskegeln in Zellen mit wildtypischem SRF festgestellt nach Induktion mit Ephrin A5 oder Mitgliedern der Semapho- rin-Molekülfamilie. Darüberhinaus wurde festgestellt, dass in SRF- defizienten Nervenzellen die Anzahl von neuritischen Seitenverzweigun- gen reduziert war. Komplementär zu dieser Beobachtung wurde festgestellt, dass eine Einbringung konstitutiv aktiver SRF Varianten (SRF- VP 16) zu einer erhöhten Ausbildung von Seitenverzweigungen („Bran- ching") führt (siehe Figur 10). Da Seitenverzweigungen Vorläuferstrukturen für die spätere Ausbildung synaptischer Verknüpfungen darstellen, ist diese Beobachtung von besonderer Relevanz für neuro-regenerative Therapieansätze.
In einer weitergehenden Ausführungsform betreffen die Abnormalitäten Störungen des Neuritenwachstum und/oder der Neuritenorientierung und/oder der Synapsenausbildung.
Unter dem Begriff des „Neuritenwachstums" im Sinne der vorliegenden Erfindung soll sowohl das Auswachsen der Neuriten aus den Neuronen- zellkörpern (sogenanntes Neuritenauswachsen) als auch das Wachstum d. h. die Verlängerung bereits gebildeter Neuriten und deren abschließende Differenzierung verstanden werden. Von den Erfindern konnte erstmals nachgewiesen werden, dass SRF sowohl eine Stimulierung des Neuritenauswachsens als auch eine Stimulierung des Neuritenlängenwachstums bei neuronalen Zellen, insbesondere bei hippocampalen und/oder cortikalen neuronalen Zellen des Systems, bewirkt.
Entscheidend für die richtige Neuritenorientierung in vivo ist die Ausbildung sogenannter Wachstumskegel an den Enden von Neuriten. Im Falle dieser Wachstumskegel handelt es sich um aus polymerisiertem Aktin (F-Aktin) und/oder Mikrotubuli bestehenden Sensoren. Diese Sensoren wechselwirken mit bestimmten Mediatoren, wodurch die Neuritenorientierung in vivo reguliert und somit die gewünschte Vernetzung der Neuronen untereinander ermöglicht wird. Eine ungünstige Orientierung der Neuriten kann insbesondere durch repulsive Mediatoren bei- spielsweise dadurch korrigiert werden, dass die Mediatoren einen Kollaps der obengenannten Wachstumskegel, insbesondere durch Depo- lymerisation von F-Aktin, induzieren. Vorzugsweise handelt es sich bei den repulsiven Mediatoren um Ephrine, insbesondere um Ephrin A5 o- der andere axonale Lenkungsmoleküle (z. B. Semaphorin). Von den Er- findern konnte erstmals festgestellt werden, dass SRF-defiziente Neuronen eine deutlich geringere Sensitivität insbesondere gegenüber Ephri- nen, vorzugsweise gegenüber Ephrin A5, aufweisen, so dass fehlerhafte Orientierungen der Neuriten zwischen den Neuronen nicht korrigiert werden können.
Bei den Erkrankungen, welche mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verwendung diagnostiziert und/oder therapiert werden können, handelt es sich bevorzugt um neurodegenerative Erkrankungen, vorzugsweise um Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, C. Huntington, Epilepsie, Amy- othrophe Lateralsklerose (ALS), Katarakt, Hydrozephalus, Schizophrenie, Suchterkrankungen und/oder Verhaltensstörungen, insbesondere anomale Eßgewohnheiten. Weiterhin zählen zu solchen Erkrankungen auch Schädigungen von Nervenfasern, insbesondere Durchtrennungen von Nervenfasern im Zentralen Nervensystem (ZNS) und/oder im Pe- riphären Nervensystem (PNS), wie im Falle von verletzungsbedingten Lähmungserscheinungen, insbesondere von verletzungsbedingten „Querschnittslähmungen", sowie Defizienzen des Lern- und Erinnerungsvermögens.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung wird insbesondere eine Therapie ermöglicht, die die Neuroregeneration von mindestens teilweise abgestorbenem und/oder in anderer Weise beschädigtem neuronalen Gewebe erlaubt. So kann die erfindungsgemäße Verwendung insbesondere auch bei Trauma und Verletzungen des peripheren Nervensystems, insbesondere bei Querschnittslähmungen, eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich bei den neuronalen Zellen um Zellen des limbischen Systems, insbesondere um neuronale Zellen des Hippocampus. Der Hippocampus ist ein Teil des limbischen Systems und gehört zu den e- volutionär ältesten Strukturen des Gehirns.
Die Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge mindestens einer Substanz umfaßt, die die Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen beeinflußt, insbesondere stimuliert und/oder inhibiert, und gegebenenfalls ein pharmazeutisches Trägermaterial. Bezüglich weiterer Einzelheiten wird auf die bisherige Beschreibung verwiesen
Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Diagnosekit, welcher mindestens eine Substanz zum Nachweis der Expression und/ oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen umfaßt. Bezüglich weitere Einzelheiten wird ebenso auf die bisherige Beschreibung verwiesen.
Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose und/ oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, wobei eine wirksame Menge mindestens einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/ oder
Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten
Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen verabreicht wird. Bezüg- lieh weiterer Einzelheiten wird ebenfalls auf die bisherige Beschreibung verwiesen.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Beispielen in Verbindung mit den Unter- ansprüchen, den Figuren sowie den Figurenbeschreibungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich alleine oder zu mehreren bei einer Ausführungsform der Erfindung verwirklicht sein. Die Beispiele und die Figurenbeschreibungen dienen lediglich zur Erläuterung und sind in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen.
Materialien
Die Plasmide SRF- VP16 und SRF-ΔMADS-VP16 wurden, wie in der Literatur beschrieben, hergestellt (Schratt, G. et al. Serum response factor is crucial for actin cytoskeletal organization and focal adhesion assembly in embryonic stem cells. J Cell Biol 156, 737-50, 2002). Die Antikörper und Verdünnungen wurden wie folgt hergestellt: das Anti-Neurofilament assoziierte Protein der Maus (1 :50, Developmental Studies Hybridoma Bank), anti-Calbindin der Maus (1 :10000, Swant, Bellinzona, Switzer- land), Kaninchen anti-ProxD1 (1 :1000, Chemicon), Kaninchen anti-Tau (1 :200, Chemicon), Maus anti-Map 2 (1 :500, Chemicon), Maus anti-ß- Tubulin (1 :500, Sigma). Texas Red Phalloidin (Molekularproben) wurden bei einer Verdünnung 1 :100 verwendet. In situ Hybridisierung
Cryostat-gekühlte Segmente wurden mit SRF-Riboproben, welche mit Digoxygenin markiert sind, gemäß den Standard Protokollen hybridisiert. Die Srf-Riboproben wurden durch PCR-Amplifikation erhalten, welche die Nukleotide 1550 bis 2002 der Maus SRF-Sequenz umfassen (Accession NM_020493). Das PCR-Fragment wurde in den pBluescriptvek- tor kloniert und die Sequenzidentität verfiziert. Die folgenden Primer wurden verwendet: fwd (5'-AAT GGA TCC CCT AGT CCC CAT GCA GTG AT-31), rev (5'-AAT GAA TTC GCT GGA GTG AGA GGG CAT AG— 3').
Immunhistochemie
5 μm Wachssegmente wurden gemäß den Standard Protokollen ange- färbt, indem HRP-konguierte Sekundärantikörper (Vector) und DAB (Sigma) als Substrate verwendet wurden. Die Zellkulturen wurden mit 4 %-igem PFA-5 % Sucrose/PBS während 15 Minuten fixiert und anschließend in 0,1 % Triton/PBS gewaschen und permeabilisiert. Nach weiterem Waschen mit PBS, Blockieren mit 2 % BSA/PBS wurden die Zellkulturen mit primären Antikörpern während einer Stunde inkubiert. Sekundär-Antikörper, konjugiert mit Alexa488 oder 546 (1 :1000; Molekularproben) wurden während einer Stunde appliziert. Anschließend wurde für Map2/Tau ein Anfärbeprotokoll verwendet, wie in der Literatur beschrieben (Schwamborn, J. C. & Puschel, A. W. The sequential acitivity of the GTPases Rap1 B and Cdc42 determines neuronal polarity. Nat Neurosci 7, 923-9, 2004).
Elektronenmikroskopie
P14-P16 Mäuse wurden mit Natriumpentobarbital anästhesiert und mit 4 % PFA und 0,1 % Glutaraldehyd in PBS transkardial perfusioniert. Die
Gehirne wurden entfernt und in 4 % PFA/5 % Sucrose-PBS fixiert. Nach der Postfixierung wurden die Gewebeblöcke mit PBS gewaschen, und Horizontalschnitte (50 μm) wurden auf einem Vibratom geschnitten. Nach Behandlung mit Osmiumtetroxid wurden die Schnitte mit Uranyl- acetat angefärbt, dehydradisiert und in ein Epoxyharz (Durcupan ACM, Fluka, Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) flach ausgelegt. Es wurden ultra- dünne Schnitte hergestellt, die anschließend mit Hilfe eines Philipps CM 100 Elektronenmikroskop analysiert wurden.
Neuronale Zellkulturen
Die P1-P3 Hippocampi oder Kleinhirne wurden während 10 Minuten in einer Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 % C (Gibco) trypsiniert und anschließend in HBSS (Gibco) gewaschen sowie in vorgewärmtem DMEM/10 % Pferdeserum (HS; Gibco) resuspendiert. Das Gewebe wurde mit Hilfe von unter einer Flamme erhitzten Pasteurpipetten vermengt, zentrifugiert (5 Minuten, 600 rpm), und das erhaltene Pellet wurde in DMEM/HS rekonstituiert. Nach Erfassung der Zellanzahl wurden die Suspensionen erneut pelletiert und in der Amaxa-Maus Neuronen Nuclefactor-Lösung, wie vom Hersteller empfohlen (Amaxa, Cologne, Germany) resuspendiert. Eine Gesamt-DNA-Menge von 3 μg (2,25 μg gewünschtes Konstrukt + 0,75 μg eGFP Vektor) wurde verwendet und die Zellkulturen einer Elektroporation unterworfen. Die Zellkulturen wurden in einem NMEM-Medium ausplattiert, das, wie in der Literatur, ergänzt wurde (Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S. & Kiebler, M. Chemically Controller formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J Neurobiol 60, 517-25, 2004).
Neunten wachstum-Assay
Säurebehandelte Deckgläser (Durchmesser 13 mm) wurden mit 100 μg/ml Poly-L-Lysin (Sigma) in einem Boratpuffer während einer Stunde bei 37 0C beschichtet, anschließend gewaschen und inkubiert mit 20 μg/ml Maus-Laminin (Gibco), 20 μg/ml Fibronectin (Becton Dickinson) oder 50 μg/ml Collagen (Becton Dickinson) in HBSS während 3 bis 4 Stunden bei 37 0C. Nach weiteren Wachschritten wurden die Deckgläser in DMEM/10 % HS bei 37 0C bis zu ihrer Benutzung gehalten. Die Neuronen wurden mit einer Dichte von 5 x 103 - 2 x 104 Zellen pro Deckglas ausplattiert. Nach einer 2-stündigen Inkubation wurden die Zellkulturen fixiert und auf Tubulin, wie oben erwähnt, angefärbt.
Axon-Orientierungs-Essay
Es wurden Streifenassays, welche rekombinantes EphrinA5-Fc (R&D Systems) und Fc (Calbiochem) aufweisen, wie in der Literatur beschrie- ben, durchgeführt (Rashid, T. et al. Opposing Gradients of Ephrin-As and EphA7 in the Superior Colliculus Are Essential for Topographie Mapping in the Mammalian Visual System. Neuron 47, 57-69, 2005). Für den Kollaps-Assay wurden die Zellen während 30 Minuten bis 37 0C mit einem μg/ml vorgebündeltem (10 μg/ml anti-human IgG Fc spezifisch während 30 Minuten; Sigma) ephrinA5-Fc oder Fc alleine inkubiert. Anschließend wurden die Zellkulturen fixiert und auf Tubulin/F-Actin, wie oben erwähnt, angefärbt.
Quantifizierung und statistische Analysen Die Neuritenlänge wurde mit AxiovisionV4.1 und LSM image brow- serV3.2 (Zeiss, Deutschland) und lmageProPlus4.5 Software (Media Cybernetics) bestimmt. Zu diesem Zweck wurden die Zeillinienprofile gezeichnet, die die maximal mögliche Neuritenlänge eines bestimmten Neurons umfassen. Für die Experimente wurden lediglich individuell wachsende Neuronen berücksichtigt.
In den Streifen-Assays wurde die Quantifizierung vor Kenntnis des Genotyps durchgeführt. Die Neuriten, welche den EphrinAδ enthaltenden Streifen an irgendeiner Stelle berührten, wurden als nicht abgestoßene Neuriten bewertet. Für die Pixel-Quantifizierung mit Hilfe der Image Pro Software wurden vier zufällige Bilder von jedem Testtier aufgenommen und bewertet. Bei der Quantifizierung des Kollapsessays wurden lediglich die Wachstumsspitzen von Neuriten bewertet, die vollständig kollabierten. Wachstumsspitzen, die ringförmige Strukturen aus Actin/Microtubuli aufwiesen, wie sie beispielsweise in SRF-Mutanten nach EphrinA5 Stimulierung festgestellt wurden, wurden als nicht kollabiert bewertet.
In den Elektroporation-Experimenten wurden lediglich GFP-positive Neuronen quantifiziert, welche in Kontrollexperimenten auch nahezu 100 % das Protein exprimierten, welches vom zweiten elektroporierten Vektor stammt. Für jedes erhaltene Ergebnis wurden mindestens drei unabhängige Experimente durchgeführt. Die Anzahl der Neuronen, die für jedes Tier a- nalysiert wurden, betragen im folgenden: Neuritenwachstum (50-100), Streifen-Assay (50-100), Kollaps-Assay (>20) und neuronale Polarisierung (10-15).
Figurenbeschreibung:
Figur 1
(a-d): Kontroll-Hippocampi und SRF-Mutanten-Hippocampi wurden mit anti-Neurofilament assoziiertem Protein Antikörpern markiert, um die Trajektorien aller Nervenfasern hervorzuheben. In den Kontrolltieren trennen sich die Moosfasern, welche aus dem Gyrus dentatus (DG) stammen, in einen supra- und einen infra-pyramidalen Zweig (Pfeile). Die SRF-defizienten Neuriten (b, d) verlassen den Gyrus dentatus in einer dispergierten Weise (Pfeile) ohne die typische Gabelung, wie sie in den Kontrollproben festgestellt wurde (a, c). Zusätzlich war die Länge der Nervenfasern in den Mutanten verkürzt. (e, f): Die Tl MM-Färbung färbt ausschließlich die Trajektorien der Moosfasern. Die Moosfasern der Kontrollschnitte (Pfeile in e) gabeln sich und navigieren genau entlang der Grenze der CA-Region (gestrichelte Li- nien). Im Gegensatz dazu, teilen sich Fasern, die einen Mangel an SRF aufweisen (Pfeile in f) nicht gabelförmig auf und wachsen stattdessen vorzugsweise an der Spitze von CA3-pyramidalen Neuronen, (g-j): Die Calbindinfärbung markiert neuronale Zellkörper und ihre Aus- maße, die im Gyrus dentatus lokalisiert sind. Die Enden von SRF- defizienten Nerven zeigen eine im Vergleich zu den Kontrollen deutlich abweichende Orientierung gegenüber praktisch allen Nervenfasern, die innerhalb der CA-Region wachsen (Pfeile).
Figur 2
(a, c, e): In P14-Kontrollmäusen sind die CA3-pyramidalen Zellen (PC) dicht angeordnet mit lediglich kleinen interzellulären Räumen zwischen den pyramidalen Zellkörpern (a). In den Kontrollproben enden die Moos- fasern an den dendritischen Ausläufern der CA3-pyramidalen Zellen im Stratum lucidum (Pfeile in b).
(b, d, T): Vergrößerte Interzelluläre Räume, welche Moosfasern-Axone zwischen den CA3-pyramidalen Zellen enthalten, häufig beobachtet in SRF-defizienten Neuronen (b). SRF-defiziente Moosfasern bilden kaum Synapsen mit CA3-basalen Dendriten im stratum lucidum (d). Allerdings zeigten die wenigen verbleibenden Synapsen eine unveränderten Morphologie (d). Die Mehrzahl der Moosfasern-Synapsen innerhalb der pyramidalen Schicht der SRF-defizienten Neuronen (f) sind eher unregelmäßig mit den CA3 Somata (Nervenzellkörper) verknüpft als mit den ba- salen Dendriten (vgl. auch Kontrollen a und c).
Figur 3
(a-f): Die Neuronen des Hippocampus, welche von den Kontrollen (a-c) und den SRF-defizienten (d-f) stammen, wurden auf Laminin gezüchtet.
Die SRF-defizienten Neuronen weisen einerseits eine reduzierte Neuro- nenanzahl mit einem Neuritenauswachsen auf (vgl. auch g) und ande- rerseits ist das Wachstum von Neuriten in SRF mutierten Neuronen vermindert (quantifiziert in i).
(h): Der längste Neurit in den Kontrollneuronen ist nahezu fünf mal länger (4,74 + 0,78) als die Durchschnittslänge der verbleibenden Neuriten. Im Gegensatz dazu ist dieses Verhältnis um einen Faktor von ca. 2 in SRF-defizienten Neuronen verringert (2,2 + 0,3).
(j): die Neuritenanzahl, die von einem bestimmten Neuron entspringt, ist in SRF-defizienten Neuronen nicht signifikant verändert.
Figur 4
(a, b): SRF-defiziente Neuronen (a) und Kontrollneurone (b) wurden einer Elektroporation unterworfen, indem ein verkürztes SRF-Konstrukt (S RF-VP 16ΔM ADS), dem die Sequenz für die DNA-Bindungsdomäne fehlt, verwendet wurde. Erwartungsgemäß weisen die Neuronen in den Kontrollen immer noch eine doppelt so große Neuritenlänge auf als in den SRF-defizienten Neuronen (vgl. auch e und Fig. 3). (c, d): Die Zuführung von konstitutiv aktivem SRF (SRF-VP16) in SRF- defiziente Neuronen (c) induziert einen dramatischen Zuwachs in der Neuritenlänge (vgl. auch e und f). In Kontrollneuronen wurde ebenfalls ein zusätzliches Wachstum der Neuritenlänge erreicht, wenn auch in einem geringeren Umfang als in den SRF-defizienten Neuronen (siehe auch f). (e): Die Kontrollneuriten, die SFR-VP16ΔMADS exprimieren, weisen ei- ne doppelte Neuritenlänge auf als die Neuriten von SRF-defizienten Neuronen (61 + 8,5 μm vs. 31 ,3 + 3,7 μm). Der Vektor SRF- VP16 erhöht beträchtlich die Neuritenlänge von Neuronen, welche einen Mangel an endogenem SRF-Protein aufweisen (96,1 + 29 μm). (f): Die Zunahme der Neuritenlänge, stimuliert durch die Zugabe des Vektorkonstrukts SRF-VP16 (bzw. SRF-VP 16ΔM ADS) ist für beide Genotypen dargestellt. In den Kontrollneuronen führte die Aufnahme des Vektorkonstrukts SRF-VP16 zu einer Zunahme der Neuritenlänge um ca. 42,3 % (+ 25,1 %). Durch eine Überexpression von SRF-VP16 in SRF-defizienten Neuronen konnte ein mehr als dreimal so großer Zuwachs der Neuritenlänge erreicht werden (169 + 13 %).
Figur 5
(a): Die Neuronen des Hippocampus, welche von den Kontrollen stammen, wurden auf einem alternativen Streifen mit ephrinA5-Fc (rote Streifen) und einem Kontrollprotein (Fc alleine, schwarze Streifen) gezüchtet. Typischerweise wurden Neuriten, die den EphA-Rezeptor exprimieren, durch die Wechselwirkung mit EphrinAδ stark abgestoßen, so dass auf diese Weise ein Wachstum auf den EphrinA enthaltenden Streifen verhindert wurde, (b): Die SRF-defizienten Neuronen sind weniger sensitiv gegenüber der abstoßenden Wirkung von EphrinAδ, daher überqueren mehr Neuriten die EphrinAδ enthaltenden Streifen.
(c): Die Kontrollexperimente mit Streifen, welche ein Kontroll protein (Fc vs. Fc) enthalten, zeigen ein unregelmäßiges Auswachsen der Neuriten auf diesen Streifen. (d): Der Prozentsatz der individuellen Neuriten, die durch EphrinAδ abgestoßen wurden, ist dargestellt. In den Experimenten mit den Ephri- nA5-Streifen wurden 80,6 % (+ 12,7 %) der Kontrollneuriten abgestoßen. Im Gegensatz dazu konnten die Erfinder eine nahezu zweifache Abnahme bei den SRF-defizienten Neuronen feststellen, was die Sensi- tivität der Neuriten gegenüber EphrinAδ anbelangt (44 % + 17 %). In den Kontrollstreifen-Essays wurde erwartungsgemäß lediglich eine geringe Anzahl an Neuriten abgestoßen (19 + 13,6 % in den Kontrollen und 19,3 + 8,5 % bei den Mutanten), (e): Die Anzahl der grünen Pixel (die die Neuronen reflektieren, die auf Tubulin angefärbt sind), lokalisiert auf den roten Streifen, wurden von der Gesamtanzahl der grünen Pixel in einem gegebenen Rahmen abgezogen. Nur 12 % (+ 6 %) der Pixel aus Kontrollneuronen wurden nicht durch EphrinAδ abgestoßen, während eine dreifache Zunahme (36 + 12 %) bei SRF-defizienten Neuronen beobachtet wurde. Theoretische Ll- berlegungen sagen eine 50 % Wahrscheinlichkeit für die Lokalisierung eines bestimmten Pixels auf einem der Streifen voraus. Dies wird in der Tat in den Kontrollstreifen mit einem unregelmäßigen Neuritenauswach- sen beobachtet (45 + 6 % bei den Kontrollen und 41 + 9 % bei den Mutanten).
(f): Auf Streifen, die ein Kontroll protein enthalten (c), wachsen die Kon- trollneuriten immer noch nahezu zweimal so lang als bei den Neuronen, die einen Mangel an SRF aufweisen (82 + 17 μm bei den Kontrollen vs. 48 + 5 μm bei den Mutanten). In den Experimenten mit EphrinAδ- Streifen wachsen die Kontrollneuriten (wahrscheinlich aufgrund der abstoßenden Wirkung von EphrinAδ) geringfügig kürzer 57 + 12 μm). Die Neuronen, die einen Mangel an SRF aufweisen, zeigen einen subtilen Zuwachs der Neuritenlänge (16 + 17 μm).
Figur 6
(a, b): In der Gegenwart von Kontroll proteinen (a) zeigen die Kontroll- neuronen vollständig ausgebildete Wachstumsspitzen (a) mit filo- und lamellipodialen Strukturen, wie durch Anfärben auf F-Actin (rot) gezeigt werden konnte. Die Anwendung von EphrinAδ (b) löst einen Zusammenbruch des Aktin Zytoskeletts aus, welcher in einem vollständigen Kollaps der Wachstumsspitzen resultiert (b). (c, d): In SRF-defizienten Neuronen sind die Wachstumskegel vor der Induzierung des Zusammenbruchs (c) ähnlich gut ausgebildet wie in den Kontrollen (a). Auffallend ist die Induktion ringförmiger Strukturen durch Inkubation mit EphrinAδ an den Wachstumskegeln. Diese ringförmigen Strukturen bestehen sowohl aus polymerisiertem Actin (F-Actin, rot) als auch aus Microtubuli (grün; vgl. auch e-g).
(e-g): Es werden vergrößerte Darstellungen der in (d) beschriebenen Ergebnisse gezeigt. (h): Es ist die Quantifizierung von Neuronen, die einen oder mehrere Ac- tin/Microtubuli-Ringe aufweisen, nach einer EphrinAδ-lnduktion dar- gestelt. Der Prozentsatz an SRF-defizienten Neuronen, welche diese ringförmigen Strukturen aufweisen, nimmt entsprechend der EphrinAδ- Dosierung zu. Diese Ringe fehlen fast vollständig in SRF-defizienten Neuronen, die mit einem Kontrollprotein (Fc) inkubiert sind oder in Wildtyp-Neuronen, behandelt entweder mit EphrinA5 oder einem Kontrollprotein. Die Überexpression des Vektors SRF-VP16 in SRF-defizienten Neuronen verhindert grundlegend das Wachstum von Actin-Microtubuli- Ringen und ermöglicht einen vollständigen Zusammenbruch der Wachstumskegel (vgl. auch Fig. 4).
Figur 7 Die Neuronen des Hippocampus wurden einer Elektroporation mit dem Kontrollvektor, dem konstitutiv aktiven RhoA (RhoA-V14) oder Rad (Rac1-V12) unterworfen und die Neuritenlänge (a, b) sowie der durch Ephrin A5 vermittelte Zusammenbruch der Wachstumskegel (c, d) quantifiziert. (a, b): Im Verhältnis zu der Durchschnitts-Neuritenlänge, die bei Kontroll- Wildtyp-Neuronen nach einer Elektroporation erhalten wurden, stimulierte Rac1-V12 eine ungefähr 40 % Zunahme der Neuritenlänge (39,3 + 4 %). Im Gegensatz dazu führte eine Elektroporation mit dem Vektor RhoA-V14 zu einer Reduktion der Neuritenlänge in den Kontrollneuro- nen um ca. 30 % (32,7 + 1 ,1 %). Neuronen, welche kein SRF exprimie- ren, zeigten erwartungsgemäß nach Elektroporation mit dem Kontrollvektor ein kleineres Neuritenwachstum. Weder Rac1-V12 noch RhoA- V14 konnten ohne SRF-Aktivität im Zellkern das Wachstum bzw. die Inhibierung der Neuriten stimulieren. (c, d): Der Anteil an kollabierten Wachstumskegeln in Gegenwart eines Kontrollproteins (Fc alleine) oder EphrinAδ ist in (c) zusammengefaßt. Die Überexpression beider Rho-GTPasen führte zu einer kleinen aber reproduzierbaren Zunahme des Prozentsatzes der kollabierten Wachstumskegel sogar in Gegenwart eines Kontrollproteins. EphrinAδ induzierte eine klare Antwort auf den Zusammenbruch in Kontrollen und in RhoA-V14 exprimierenden Kontrollneuronen. Dieser RhoA-abhängige Zuwachs in der Kollapsrate wurde in SRF-defizienten Neuronen nicht beobachtet. Konstitutiv aktives Rad scheint in Kontrollneuronen der Zusammenbruch der Wachstumskegel eher zu inhibieren als zu fördern, (d): Es ist die Prozentzunahme des Zusammenbruchs der Wachstumskegel nach Abzug der von Fc induzierten Zusammenbruchrate von der durch EphrinAδ induzierten Zusammenbruchrate dargestellt.
Figur 8
Der vollständige Cofaktor MAL sowie verschiedene gekürzte Versionen davon wurden durch Elektroporation in Kontrollneuronen sowie SRF- defizienten Neuronen eingebracht und anschließend das Neuritenaus- wachsen (a, b) und der durch EphrinAδ induzierte Zusammenbruch der Wachstumskegel bestimmt (c). (a, b): Die Überexpression des vollständigen Cofaktors MAL veränderte in den Kontrollneuronen nicht wesentlich das Neuritenauswachsen. Im Gegensatz dazu führte die Expression von multiplen dominant negativen (MAL C471 , ML ΔNΔB1 , MAL ΔNC471 ) zu einer Beeinträchtigung der MAL-Funktion und damit zu einer Reduzierung der Neuritenlänge in den Kontrollneuronen. Der vollständige Cofaktor MAL konnte in SRF- defizienten Neuronen kein Neuritenwachstum induzieren, was eine fehlende Aktivität des Cofaktors ohne die Anwesenheit des SRF als Partnerprotein belegt.
(b): Die Prozent-Zunahme/-Abnahme der Neuritenlänge wird für verschiedene MAL-Konstrukte abgebildet, wobei die Kontrollneuronen mit einem Kontroll-M AL- Vektor (MAL ΔNΔB1 , ΔLZ) transfiziert werden.
(c): Die Zunahme des Zusammenbruchs der Wachstumskegel gegenüber Fc-Kontrollen wird in Prozent angegeben. In Gegenwart des Kon- trollvektors (MAL ΔNΔB1 , ΔLZ) sowie des vollstängien MAL-Vektors zeigen die Kontrollneuronen eine robuste Antwort auf den Zusammenbruch der Wachstumskegel. Allerdings kann diese Reaktion in signifikanter Weise unter Verwendung von MAL als Target mit Hilfe von verschiede- nen dominant-negativen Vektorkonstrukten, wie angezeigt, blockiert werden. Ähnlich wie beim Neuritenauswachsen (a, b) beeinflußt ein vollständiger MAL-Vektor in SRF-defizienten Neuronen die Zusammenbruchrate nicht.
Figur 9
Zeitraffermikroskopieaufnahmen lebender Kontroll- (a, b) und SRF- defizienter Neurone (c, d) über einen Zeitraum von dreieinhalb Stunden, (a, b) Bei postmitotischen Kontrollneuronen ist das Neuritenwachstum von einer Zellkörperbewegung begleitet (siehe Veränderung der farbigen Asteriske zwischen 0 und 210 min). Diese räumliche Koordination zwischen Neuritenwachstum und Motilität des Zellkörpers ist in SRF- defizienten hippocampalen Neuronen gestört. Hier senden SRF- defiziente Neuronen zwar (kürzere) Neuriten aus, gleichzeitig bleibt die Position des Zellkörpers unverändert (vgl. farbige Asteriske nach 0 und 210 min).
Figur 10 Hippocampale Neurone wurden als Kontrolle mit SRF-VP16ΔMADS (links) oder konstitutiv-akiven SRF (SRF- VP16) elektroporiert (rechts). In Kontrollen haben die primären Neuriten kaum Seitenverzweigungen (links). Die Überexpression des konstitutiv-aktiven SRF hingegen induziert die Bildung von Seitenästen (Pfeile in der rechten Abbildung), die den primären Neuriten entspriessen.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.
2. Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/ oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Herstellung eines Diagnostikmittels für Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.
3. Verwendung mindestens einer Substanz zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/ oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.
4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Beeinflussung eine Stimulierung und/oder Inhibierung, vorzugsweise eine Stimulierung, der Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen betrifft.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um ein Protein oder Polypeptid, insbesondere um einen Antikörper, handelt.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um eine Po- lynukleinsäure, insbesondere DNA oder RNA, handelt.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der RNA um Oligonukleotide, insbesondere Ribozyme, An- tisensemoleküle oder um siRNA (short interfering RNA) handelt, wobei siRNA bevorzugt ist.
8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der DNA um Vektorkonstrukte handelt, die mindestens eine für SRF und/oder SRF-regulierte Transkriptionsprodukte codierende Sequenz aufweisen.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um einen Wirkstoff handelt, insbesondere aus der Gruppe der „small molecu- lar Compounds", vorzugsweise mit einem Molekulargewicht (MG) < 1000.
10. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den SRF-regulierten Transkriptionsprodukten um mindestens einen Vertreter aus der Gruppe, umfassend Aktin, Vinculin, Zyxin, ß-1 lntegrin und Gelsolin, handelt.
11. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz Regulatoren, insbesondere Aktivatoren und/oder Inhibitoren, und/oder biologische Vorläufer von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten beeinflußt, insbesondere stimuliert und/oder inhibiert.
12. Verwendung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Regulatoren um Cofaktoren von SRF und/oder SRF- regulierten Transkriptionsprodukten handelt, insbesondere von SRF.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Cofaktoren um TCF (Ets-type ternary complex factor) und/oder um Proteine der Myocardinfamilie handelt.
14. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um mindestens einen Vertreter aus der Gruppe, umfassend Myocardin, MAL, MKL und MRTF (Myocardin Related Transcription Factor), insbesondere um MAL oder MRTF, handelt.
15. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Abnormalitäten um morphologische Abnormalitäten der neuronalen Zellen handelt.
16. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abnormalitäten Störungen des Neuritenwachstums und/oder der Neuritenorientierung und/oder der Synapsenausbildung betreffen.
17. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Erkrankungen um neu- rodegenerative Erkrankungen handelt.
18. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Erkrankungen um Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, Querschnittslähmung, Epilepsie, Suchterkrankungen und/oder Verhaltensstörungen handelt.
19. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den neuronalen Zellen um Zellen des limbischen Systems handelt.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge mindestens einer Substanz, die die Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen beeinflußt, und gegebenenfalls ein pharmazeutisches Trägermaterial.
21. Diagnosekit, umfassend mindestens eine Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung oder Diagnosekit nach Anspruch 20 oder 21 , weiter gekennzeichnet durch mindestens eines der Merkmale des kennzeichnenden Teils der Ansprüche 4 bis 19.
23. Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass eine wirksame Menge einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen verabreicht wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, weiter gekennzeichnet durch mindestens eines der Merkmale des kennzeichnenden Teils der Ansprüche 4 bis 19.
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