DE102005050557A1

DE102005050557A1 - SRF als diagnostisches und/oder therapeutisches Target für Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind

Info

Publication number: DE102005050557A1
Application number: DE102005050557A
Authority: DE
Inventors: Alfred Prof. Dr. Nordheim; Bernd Dr. Knöll
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2005-10-17
Publication date: 2007-04-19
Also published as: WO2007045432A2; WO2007045432A3; WO2007045432A9

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.

Neurodegenerative Erkrankungen zählen inzwischen zu den am häufigsten vorkommenden Zivilisationserkrankungen. Ihre Ursachen können sehr vielfältig sein. So liegt insbesondere der Parkinsonschen Erkrankung die Apoptose (physiologischer Zelltod) bestimmter Nervenzellen (Neuronen) mit konsekutivem Neurotransmittermangel, insbesondere Dopaminmangel, in manchen Hirnstammregionen auch Serotonin- und Noradrenalinmangel, zugrunde. Im Falle der Alzheimer Erkrankung führt der fortschreitende Zelltod von Neuronen zu einer Störung der normalen cerebralen Funktionen. Die zunehmende Degeneration der Neuronen führt bei der Alzheimer Demenz ebenso zu einem konsekutiven Neurotransmittermangel, insbesondere einem Mangel an Acetylcholin. In vielen Fällen findet daher eine Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen durch Zugabe von Neurotransmittern statt, wobei es sich allerdings lediglich um palliative sowie den weiteren Krankheitsverlauf verzögernde Therapieansätze handelt. Meistens machen die infolge der Erkrankung bei den Betroffenen gewöhnlich auftretenden Befindlichkeitsstörungen, insbesondere Unruhe, depressive Verstimmung sowie Erregung und Aggressivität, zudem eine Behandlung mit Psychopharmaka erforderlich. Alternative Behandlungsmöglichkeiten, insbesondere die Implantation von fötalem Hirngewebe, sind häufig insbesondere ethisch sehr umstritten und liefern außerdem in vielen Fällen widersprüchliche Therapieergebnisse.

Es stellt sich somit die Aufgabe alternative Therapiemöglichkeiten, die insbesondere auf neuroregenerativen Prozessen beruhen und die die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile vermeiden, sowie entsprechende Diagnosemöglichkeiten für neurodegenerative Erkrankungen bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendungen, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 3 beschrieben sind. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Verwendungen sind in den abhängigen Ansprüchen 3 bis 19 ausgeführt. Eine pharmazeutische Zusammensetzung und ein Diagnosekit sind in den Ansprüchen 20 bis 22 dargestellt. Die Ansprüche 23 und 24 beziehen sich auf ein geeignetes Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.

Überraschenderweise wurde von den Erfindern festgestellt, daß das Neuritenwachstum, die Orientierung der Neuriten (Axone) sowie die Synapsenausbildung von Neuronen, insbesondere auch des Hippocampus, durch SRF (Serum Response Factor) beeinflußt, insbesondere stimuliert, wird. So konnten die Erfinder bei sogenannten SRF-defizitären Neuronen, d.h. Neuronen, die kein oder lediglich in geringen Mengen wildtypisches SRF exprimieren, deutliche Störungen des Neuritenwachstums, der Neuritenlenkung sowie der Ausbildung von Synapsen beobachten.

Aus der WO 02/20092 A1 geht hervor, daß SRF (Serum Response Factor) ein Modulator für diverse zelluläre Aktivitäten darstellt. SRF ist ein in nahezu allen eukaryotischen Zellen vorkommendes Zellkern-Protein, welches insbesondere als Transkriptionsfaktor die Expression einer Vielzahl von Genen beeinflußt. Bezüglich weiterer Einzelheiten zu SRF, insbesondere humanem SRF, wird auf die WO 02/20092 A1 verwiesen, deren Offenbarungsgehalt insoweit vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt sein soll.

Erfindungsgemäß wird mindestens eine Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsproduktion in neuronalen Zellen zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten (Anomalien) assoziiert sind, verwendet.

Unter der Bezeichnung SRF (Serum Response Factor) im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen auch mögliche Isoformen von SRF verstanden werden.

Unter der Bezeichnung „SRF-regulierte Transkriptionsprodukte" im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen Genprodukte, d. h. mRNAs und Proteine verstanden werden, die von SRF auf transkriptioneller Ebene reguliert, insbesondere stimuliert oder inhibiert, werden.

Unter „Therapie" im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen die Behandlung von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, die Behandlung von damit einhergehenden Befindlichkeitsstörungen sowie die Prophylaxe und Prävention derartiger Erkrankungen, insbesondere auf der Basis neuroregenerativer Prozesse, verstanden werden.

Unter dem Begriff „Wildtyp" soll das in der Zelle natürlich vorkommende Protein, einschließlich möglicher Isoformen davon, verstanden werden.

Unter dem Begriff der „konstitutiv-aktiven SRF-Variante" soll ein Protein oder Polypeptid verstanden werden, das die Aktivität von wildtypischem SRF in konstitutiv aktiver Form aufweist.

Es kann insbesondere vorgesehen sein, daß die erfindungsgemäß verwendete Substanz die Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten bereits auf transkriptioneller Ebene beeinflußt. In einem solchen Fall dienen die für SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukte kodierenden Gensequenzen, insbesondere Promotoren, als Targets zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten.

Weiterhin ist es insbesondere bevorzugt, daß die erfindungsgemäß verwendete Substanz die Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten auf translationaler Ebene beeinflußt. Bei diesem Ansatz dient vorzugsweise die für die Translation in ein Protein erforderliche mRNA (Messenger-RNA) als geeignetes Target zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten. Weitere Einzelheiten werden im Folgenden noch erläutert.

Außerdem kann die erfindungsgemäß verwendete Substanz eine Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten auf posttranslationaler Ebene bewirken, wobei die Substanz vorzugsweise den Phosphorylierungsstatus von exprimiertem SRF Protein und/oder von exprimierten SRF-regulierten Transkriptionsprodukten beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Herstellung eines Diagnostikmittels für Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.

Erfindungsgemäß wird außerdem mindestens eine Substanz zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, verwendet.

Vorzugsweise wird die Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen stimuliert und/oder inhibiert, vorzugsweise stimuliert.

Vorzugsweise handelt es sich bei der Substanz um konstitutiv-aktive SRF-Varianten. So kann es insbesondere bevorzugt sein, die intrazelluläre (endogene) Aktivität von SRF durch Einschleusung von konstitutiv-aktiven SRF-Varianten in neuronale Zellen zu erhöhen. Auf diese Weise ist es möglich eine Therapie von Erkrankungen, die mit neurologischen Anomalien assoziiert sind, auf der Basis einer Proteintherapie zu behandeln.

In Fällen, in denen das endogene wildtypische SRF Protein blockiert vorliegt, beispielsweise wegen eines exogenen spezifischen Inhibitors, ist die Erzeugung einer zusätzlichen exogenen SRF-Aktivität besonders erwünscht. In diesen Fällen kann durch intrazelluläre Einschleusung von konstitutiv-aktiven SRF-Varianten, die selbst gegen den für das wildtypische SRF Protein spezifischen Inhibitor resistent sind, eine SRF-Aktivität in neuronalen Zellen induziert werden.

In manchen Fällen kann jedoch eine gezielte Inhibierung des wildtypischen SRF Proteins in neuronalen Zellen erwünscht sein. Dies ist vorzugsweise dann der Fall, wenn es sich bei den konstitutiv-aktiven SRF-Varianten insbesondere um Proteine oder Polypeptide handelt, die eine stärkere Aktivität als das wildtypische SRF-Protein aufweisen. Durch die Inhibierung des Wildyp-Proteins wird erreicht, daß die intrazellulären (endogenen) Bindungsstellen für SRF, insbesondere DNA-Abschnitte und/oder Bindungsdomänen von potentiellen SRF-Bindungspartnern, für eine Bindung der aktiveren konstitutiv-aktiven SRF-Varianten zur Verfügung stehen. Auf diese Weise kann insbesondere eine stärkere Stimulierung und Förderung des Neuritenwachstums, der Neuritenorientierung und/oder der Ausbildung von Synapsen in neuronalen Zellen erzielt werden.

Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, wenn konstitutiv-aktive SRF-Varianten, insbesondere im Vergleich zum wildtypischen SRF Protein aktivere SRF-Varianten, zusammen mit dem Wildtyp-Inhibitor im Rahmen einer sogenannten Kombinationstherapie zur Erzeugung endogener SRF-Aktivität in neuronalen Zellen verwendet werden.

Vorzugsweise handelt es sich bei den im Rahmen einer Proteintherapie verwendeten konstitutiv-aktiven SRF-Varianten um Fusionsproteine. Die Verwendung von SRF-Fusionsproteinen, insbesondere zur Erhöhung der endogenen SRF-Aktivität, besitzt den Vorteil, daß abhängig von der Wahl des Fusionspartners unterschiedliche für den jeweiligen Fusionspartner spezifische transmembrane Transporterproteine der neuronalen Zellen, insbesondere Tat-Proteine, benutzt werden können, um die Translokation des SRF-Fusionsproteins in die Zellen zu bewirken. Weiterhin kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, SRF, insbesondere konstitutiv-aktive SRF-Varianten, durch Elektroporation in die neuronalen Zellen einzuschleusen.

In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, die endogene SRF-Aktivität zu reduzieren. Das kann insbesondere auf translationaler Ebene beispielsweise durch RNA-Interferenz-Technologien, insbesondere Antisense-Technologie, erreicht werden, deren Wirkungsprinzipien im Folgenden noch beschrieben werden.

Erfindungsgemäß kann es sich bei der Substanz insbesondere um ein Protein oder Polypeptid handeln, wobei gegen SRF und/oder SRF-regulierte Transkriptionsprodukte gerichtete Antikörper besonders bevorzugt sind. Derartige Antikörper können im Rahmen von dem Fachmann geläufigen Verfahren, insbesondere immunologischen Nachweisverfahren, beispielsweise ELISA-Verfahren, insbesondere zur Diagnose von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, verwendet werden.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich bei der Substanz um Polynukleinsäuren, insbesondere um DNA oder RNA.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß es sich bei der RNA um Oligonukleotide, insbesondere ein Ribozyme, Antisensmoleküle oder um sogenannte siRNA (short interfering RNA) handelt. Die Verwendung von Antisens-Oligonukleotiden ist besonders bevorzugt. Hierbei handelt es sich um eine zur mRNA (Messenger RNA) komplementäre RNA, so daß durch Paarung von Antisense-RNA und mRNA ein Doppelstrang gebildet wird, welcher an den Ribosomen nicht in ein Protein übersetzt (translatiert) werden kann und somit die Expression von SRF inhibiert. Mit Hilfe dieser sogenannten Antisense-Technologie kann daher die endogene Aktivität des wildtypischen SRF Proteins reguliert, vorzugsweise inhibiert, werden.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich bei der Substanz um insbesondere synthetisch hergestellte siRNA (small oder short interfering RNA). Bei dieser Form der RNA-Interferenz werden ausgehend von doppelsträngiger RNA (dsRNA) durch das Enzym Dicer kurze Oligonukleotide, insbesondere mit einer Länge von 15 bis 25 Nukleotiden, vorzugsweise ca. 22 Nukleotide, hergestellt und in den sogenannten Enzymkomplex RISC (RNA-Induced Silencing Complex) eingebaut. Mit Hilfe dieser inkorporierten RNA-Oligonukleotide bindet RISC komplementär an DNA oder mRNA und führt auf diese Weise zu einer Inhibierung der Expression des entsprechenden Genprodukts. Somit kann auch diese RNA-Interferenz-Technologie für eine Regulation, insbesondere Inhibierung, der Aktivität von wildtypischem SRF Protein verwendet werden.

Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, daß es sich bei der Substanz um DNA handelt, vorzugsweise um die DNA von konstitutiv-aktiven SRF-Varianten (konstitutiv-aktive SRF-Varianten codierende Gensequenzen). Bezüglich weiterer Einzelheiten zur erfindungsgemäßen Verwendungsmöglichkeit der DNA von konstitutiv-aktiven SRF-Varianten, insbesondere im Zusammenhang einer möglichen Kombinationstherapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, wird auf die vorherige Beschreibung der konstitutiv-aktiven SRF-Varianten verwiesen. Die DNA kann insbesondere in Form von Vektorkonstrukten vorliegen. Bevorzugt weisen die erfindungsgemäß verwendeten DNA-Vektorkonstrukte eine für SRF und/oder konstitutiv-aktive SRF-Varianten und/oder SRF-regulierte Transkriptionsprodukte kodierende Sequenz auf. Vorzugsweise handelt es sich bei den Vektorkonstrukten um Plasmide, insbesondere um das Plasmid SRF-VP16 oder SRFΔMADS-VP16. Die Herstellung derartiger Vektorkonstrukte sowie ihre Einführung in die Zellen sind dem Fachmann bekannt, so daß auf weitere Einzelheiten an dieser Stelle nicht eingegangen wird, wobei die Einführung von Vektorkonstrukten in die neuronalen Zellen vorzugsweise mittels Elektroporation erfolgt. Somit ist es folglich erfindungsgemäß möglich, Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, auf der Basis einer Gentherapie zu behandeln.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung handelt sich bei der Substanz um Wirkstoffe, vorzugsweise um synthetisch herstellbare Wirkstoffe. Bevorzugt handelt es sich bei der Substanz um „small molecular compounds", vorzugsweise um „small molecular compounds" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1000.

Bei den SRF-regulierten Transkriptionsprodukten kann es sich insbesondere um cytoskeletale Proteine handeln, vorzugsweise um mindestens einen Vertreter aus der Gruppe, umfassend Aktin, Vinculin, Zyxin, β-1 Integrin und/oder Gelsolin. Dies ist erfindungsgemäß besonders vorteilhaft, da extrazellulär wirkende cytoskeletale Proteine, insbesondere die soeben bevorzugt genannten Proteine, an der Verankerung der extrazellulären Matrix mit den Oberflächen von Zellen, insbesondere von neuronalen Zellen, beteiligt sind, wobei die Verankerung vorzugsweise über entsprechende Rezeptorproteine, insbesondere Integrine, ermöglicht wird. Die Integrinrezeptoren werden durch Ligandenbindung, insbe sondere durch zusätzliche Bindung von Aktin, Vinculin, Zyxin, β-1 Integrin und/oder Gelsolin, aktiviert und bilden sogenannte fokale Adhäsionskomplexe aus, die zum einen die extrazelluläre Matrix mit den Integrinen verbinden damit die neuronalen Zellen mit der extrazellulären Matrix verankern und zum anderen Signaltransduktionskaskaden auslösen, wobei im wesentlichen Wachstumsfaktoren und Hormonwirkungen integriert werden. Auf diese Weise kann die Reaktion der neuronalen Zellen auf diese Stimuli moduliert, insbesondere stimuliert oder inhibiert, werden. In einem zweiten Schritt können die insbesondere auf diese Weise verankerten neuronalen Zellen mit Prozessen beginnen, die eine interneuronale Kommunikation ermöglichen und insbesondere auf Neuritenwachstum, Neuritenorientierung und/oder auf der Ausbildung von Synapsen beruhen.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung beeinflusst, insbesondere stimuliert und/oder inhibiert, die Substanz Regulatoren, insbesondere Aktivatoren und/oder Inhibitoren, und/oder biologische Vorläufer von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Regulatoren um Cofaktoren von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten, wobei Cofaktoren von SRF besonders bevorzugt sind. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Cofaktor um ein sogenanntes TCF (Ets-Type tenary complex factor) und/oder um Proteine der Myocardinfamilie.

Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, daß es sich bei der Substanz um mindestens einen Vertreter aus der Myocardinfamilie, umfassend Myocardin, MAL (Myelin and Lymphocyte), MKL (Myocardin Like) und MRTF (Myocardin Related Transcription Factor), insbesondere umfassend MAL und MRTF, handelt.

So konnte von den Erfindern erstmals nachgewiesen werden, daß das Protein MAL in Kooperation mit SRF das Neuritenwachstum stimuliert, wobei der stimulierende Einfluß von MAL nur in neuronalen Zellen mit endogener SRF-Aktivität beobachtet werden konnte.

Entsprechend der erfindungsgemäßen Verwendung kann es sich bei den Abnormalitäten um morphologische Abnormalitäten der neuronalen Zellen handeln. So konnte von den Erfindern nachgewiesen werden, daß Nervenzellen (Neuronen bzw. neuronale Zellen), welche kein SRF exprimieren, einen rundlichen Zellkörper aufweisen. Als weitere morphologische Abnormalität wurden im Falle der SRF-defizitären Neuronen ringförmige Strukturen aus Aktin und/oder Mikrotubuli anstelle von Wachstumskegeln in Zellen mit wildtypischem SRF festgestellt nach Induktion mit Ephrin A5.

In einer weitergehenden Ausführungsform betreffen die Abnormalitäten Störungen des Neuritenwachstum und/oder der Neuritenorientierung und/oder der Synapsenausbildung.

Unter dem Begriff des „Neuritenwachstums" im Sinne der vorliegenden Erfindung soll sowohl das Auswachsen der Neuriten aus den Neuronenzellkörpern (sogenanntes Neuritenauswachsen) als auch das Wachstum d. h. die Verlängerung bereits gebildeter Neuriten und deren abschließende Differenzierung verstanden werden.

Von den Erfindern konnte erstmals nachgewiesen werden, daß SRF sowohl eine Stimulierung des Neuritenauswachsens als auch eine Stimulierung des Neuritenlängenwachstums bei neuronalen Zellen, insbesondere bei hippocampalen neuronalen Zellen des Systems, bewirkt.

Entscheidend für die richtige Neuritenorientierung in vivo ist die Ausbildung sogenannter Wachstumskegel an den Enden von Neuriten. Im Falle dieser Wachstumskegel handelt es sich um aus polymerisiertem Aktin (F-Aktin) und/oder Mikrotubuli bestehenden Sensoren. Diese Sensoren wechselwirken mit bestimmten Mediatoren, wodurch die Neuritenorientierung in vivo reguliert und somit die gewünschte Vernetzung der Neuronen untereinander ermöglicht wird. Eine ungünstige Orientierung der Neuriten kann insbesondere durch repulsive Mediatoren beispielsweise dadurch korrigiert werden, daß die Mediatoren einen Kollaps der obengenannten Wachstumskegel, insbesondere durch Depolymerisation von F-Aktin, induzieren. Vorzugsweise handelt es sich bei den repulsiven Mediatoren um Ephrine, insbesondere um Ephrin A5 oder andere axonale Lenkungsmoleküle (z. B. Semaphorin). Von den Erfindern konnte erstmals festgestellt werden, daß SRF-defizitäre Neuronen eine deutlich geringere Sensitivität insbesondere gegenüber Ephrinen, vorzugsweise gegenüber Ephrin A5, aufweisen, so daß fehlerhafte Orientierungen der Neuriten zwischen den Neuronen nicht korrigiert werden können.

Bei den Erkrankungen, welche mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verwendung diagnostiziert und/oder therapiert werden können, handelt es sich bevorzugt um neuodegenerative Erkrankungen, vorzugsweise um Morbus Parkinson, Alzheimer, Epilepsie, Suchterkrankungen und/oder um Verhaltensstörungen, insbesondere um anomale Eßgewohnheiten.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung wird insbesondere eine Therapie ermöglicht, die die Neuroregeneration von mindestens teilweise abgestorbenem und/oder in anderer Weise beschädigtem neuronalen Gewebe erlaubt. So kann die erfindungsgemäße Verwendung insbesondere auch bei Trauma und Verletzungen des peripheren Nervensystems, insbesondere bei Querschnittslähmungen, eingesetzt werden.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich bei den neuronalen Zellen um Zellen des limbischen Systems, insbesondere um neuronale Zellen des Hippocampus. Der Hip pocampus ist ein Teil des limbischen Systems und gehört zu den evolutionär ältesten Strukturen des Gehirns.

Die Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge mindestens einer Substanz umfaßt, die die Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen beeinflußt, insbesondere stimuliert und/oder inhibiert, und gegebenenfalls ein pharmazeutisches Trägermaterial. Bezüglich weiterer Einzelheiten wird auf die bisherige Beschreibung verwiesen

Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Diagnosekit, welcher mindestens eine Substanz zum Nachweis des Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen umfaßt. Bezüglich weitere Einzelheiten wird ebenso auf die bisherige Beschreibung verwiesen.

Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, wobei eine wirksame Menge mindestens einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen verabreicht wird. Bezüglich weiterer Einzelheiten wird ebenfalls auf die bisherige Beschreibung verwiesen.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Beispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, den Figuren sowie den Figurenbeschreibungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich alleine oder zu mehreren bei einer Ausführungsform der Erfindung verwirklicht sein. Die Bei spiele und die Figurenbeschreibungen dienen lediglich zur Erläuterung und sind in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen.

Materialien
Die Plasmide SRF-VP16 und SRF-ΔMADS-VP16 wurden, wie in der Literatur beschrieben, hergestellt (Schratt, G. et al. Serum response factor is crucial for actin cytoskeletal organization and focal adhesion assembly in embryonic stem cells. J Cell Biol 156, 737–50, 2002). Die Antikörper und Verdünnungen wurden wie folgt hergestellt: das Anti-Neurofilament assoziierte Protein der Maus (1:50, Developmental Studies Hybridoma Bank), anti-Calbindin der Maus (1:10000, Swant, Bellinzona, Switzerland), Kaninchen anti-ProxD1 (1:1000, Chemicon), Kaninchen anti-Tau (1:200, Chemicon), Maus anti-Map 2 (1:500, Chemicon), Maus anti-β-Tubulin (1:500, Sigma). Texas Red Phalloidin (Molekularproben) wurden bei einer Verdünnung 1:100 verwendet.
In situ Hybridisierung
Cryostat-gekühlte Segmente wurden mit SRF-Riboproben, welche mit Digoxygenin markiert sind, gemäß den Standardprotokollen hybridisiert. Die Srf-Riboproben wurden durch PCR-Amplifikation erhalten, welche die Nukleotide 1550 bis 2002 der Maus SRF-Sequenz umfassen (Accession NM_020493). Das PCR-Fragment wurde in den pBluescriptvektor kloniert und die Sequenzidentität verfiziert. Die folgenden Primer wurden verwendet: fwd (5'-AAT GGA TCC CCT AGT CCC CAT GCA GTG AT-3'), rev (5'-AAT GAA TTC GCT GGA GTG AGA GGG CAT AG-3').
Immunhistochemie
5 μm Wachssegmente wurden gemäß den Standardprotokollen angefärbt, indem HRP-konguierte Sekundärantikörper (Vector) und DAB (Sigma) als Substrate verwendet wurden. Die Zellkulturen wurden mit 4 %-igem PFA-5 % Sucrose/PBS während 15 Minuten fixiert und an schließend in 0,1 % Triton/PBS gewaschen und permeabilisiert. Nach weiterem Waschen mit PBS, Blockieren mit 2 % BSA/PBS wurden die Zellkulturen mit primären Antikörpern während einer Stunde inkubiert. Sekundär-Antikörper, konjugiert mit Alexa488 oder 546 (1:1000; Molekularproben) wurden während einer Stunde appliziert. Anschließend wurde für Map2/Tau ein Anfärbeprotokoll verwendet, wie in der Literatur beschrieben (Schwamborn, J. C. & Puschel, A. W. The sequential acitivity of the GTPases Rap1B and Cdc42 determines neuronal polarity. Nat Neurosci 7, 923–9, 2004).
Elektronenmikroskopie
P14–P16 Mäuse wurden mit Natriumpentobarbital anästhesiert und mit 4 % PFA und 0,1 % Glutaraldehyd in PBS transkardial perfusioniert. Die Gehirne wurden entfernt und in 4 % PFA/5 % Sucrose-PBS fixiert. Nach der Postfixierung wurden die Gewebeblöcke mit PBS gewaschen, und Horizontalschnitte (50 μm) wurden auf einem Vibratom geschnitten. Nach Behandlung mit Osmiumtetroxid wurden die Schnitte mit Uranylacetat angefärbt, dehydradisiert und in ein Epoxyharz (Durcupan ACM, Fluka, Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) flach ausgelegt. Es wurden ultradünne Schnitte hergestellt, die anschließend mit Hilfe eines Philipps CM 100 Elektronenmikroskop analysiert wurden.
Neuronale Zellkulturen
Die P1–P3 Hippocampi oder Kleinhirne wurden während 10 Minuten in einer Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 % C (Gibco) trypsiniert und anschließend in HBSS (Gibco) gewaschen sowie in vorgewärmtem DMEM/10 % Pferdeserum (HS; Gibco) resuspendiert. Das Gewebe wurde mit Hilfe von unter einer Flamme erhitzten Pasteurpipetten vermengt, zentrifugiert (5 Minuten, 600 rpm), und das erhaltene Pellet wurde in DMEM/HS rekonstituiert. Nach Erfassung der Zellanzahl wurden die Suspensionen erneut pelletiert und in der Amaxa-Maus Neuronen Nuclefactor-Lösung, wie vom Hersteller empfohlen (Amaxa, Cologne, Ger many) resuspendiert. Eine Gesamt-DNA-Menge von 3 μg (2,25 μg gewünschtes Konstrukt + 0,75 μg eGFP Vektor) wurde verwendet und die Zellkulturen einer Elektroporation unterworfen. Die Zellkulturen wurden in einem NMEM-Medium ausplattiert, das, wie in der Literatur, ergänzt wurde (Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S. & Kiebler, M. Chemically controller formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J Neurobiol 60, 517–25, 2004).
Neuritenwachstum-Assay
Säurebehandelte Deckgläser (Durchmesser 13 mm) wurden mit 100 μg/ml Poly-L-Lysin (Sigma) in einem Boratpuffer während einer Stunde bei 37 °C beschichtet, anschließend gewaschen und inkubiert mit 20 μg/ml Maus-Laminin (Gibco), 20 μg/ml Fibronectin (Becton Dickinson) oder 50 μg/ml Collagen (Becton Dickinson) in HBSS während 3 bis 4 Stunden bei 37 °C. Nach weiteren Wachschritten wurden die Deckgläser in DMEM/10 % HS bei 37 °C bis zu ihrer Benutzung gehalten. Die Neuronen wurden mit einer Dichte von 5 × 10³ – 2 × 10⁴ Zellen pro Deckglas ausplattiert. Nach einer 2-stündigen Inkubation wurden die Zellkulturen fixiert und auf Tubulin, wie oben erwähnt, angefärbt.
Axon-Orientierungs-Essay
Es wurden Streifenassays, welche rekombinantes EphrinA5-Fc (R&D systems) und Fc (Calbiochem) aufweisen, wie in der Literatur beschrieben, durchgeführt (Rashid, T. et al. Opposing Gradients of Ephrin-As and EphA7 in the Superior Colliculus Are Essential for Topographic Mapping in the Mammalian Visual System. Neuron 47, 57–69, 2005). Für den Kollaps-Assay wurden die Zellen während 30 Minuten bis 37 °C mit einem μg/ml vorgebündeltem (10 μg/ml anti-human IgG Fc spezifisch während 30 Minuten; Sigma) ephrinA5-Fc oder Fc alleine inkubiert. Anschließend wurden die Zellkulturen fixiert und auf Tubulin/F-Actin, wie oben erwähnt, angefärbt.
Quantifizierung und statistische Analysen
Die Neuritenlänge wurde mit AxiovisionV4.1 und LSM image browserV3.2 (Zeiss, Deutschland) und ImageProPlus4.5 software (Media Cybernetics) bestimmt. Zu diesem Zweck wurden die Zelllinienprofile gezeichnet, die die maximal mögliche Neuritenlänge eines bestimmten Neurons umfassen. Für die Experimente wurden lediglich individuell wachsende Neuronen berücksichtigt.
In den Streifen-Assays wurde die Quantifizierung vor Kenntnis des Genotyps durchgeführt. Die Neuriten, welche den EphrinA5 enthaltenden Streifen an irgendeiner Stelle berührten, wurden als nicht abgestoßene Neuriten bewertet. Für die Pixel-Quantifizierung mit Hilfe der Image Pro software wurden vier zufällige Bilder von jedem Testtier aufgenommen und bewertet.
Bei der Quantifizierung des Kollapsessays wurden lediglich die Wachstumsspitzen von Neuriten bewertet, die vollständig kollabierten. Wachstumsspitzen, die ringförmige Strukturen aus Actin/Microtubuli aufwiesen, wie sie beispielsweise in SRF-Mutanten nach EphrinA5 Stimulierung festgestellt wurden, wurden als nicht kollabiert bewertet.
In den Elektroporation-Experimenten wurden lediglich GFP-positive Neuronen quantifiziert, welche in Kontrollexperimenten auch nahezu 100 % das Protein exprimierten, welches vom zweiten elektroporierten Vektor stammt.
Für jedes erhaltene Ergebnis wurden mindestens drei unabhängige Experimente durchgeführt. Die Anzahl der Neuronen, die für jedes Tier analysiert wurden, betragen im folgenden: Neuritenwachstum (50–100), Streifen-Assay (50–100), Kollaps-Assay (> 20) und neuronale Polarisierung (10–15).
Figurenbeschreibung:
1

(a–d): Kontroll-Hippocampi und SRF-Mutanten-Hippocampi wurden mit anti-Neurofilament assoziiertem Protein Antikörpern markiert, um die Trajektorien aller Nervenfasern hervorzuheben. In den Kontrolltieren trennen sich die Moosfasern, welche aus dem Gyrus dentatus (DG) stammen, in einen supra- und einen infra-pyramidalen Zweig (Pfeile). Die SRF-defizitären Neuriten (b, d) verlassen den Gyrus dentatus in einer dispergierten Weise (Pfeile) ohne die typische Gabelung, wie sie in den Kontrollproben festgestellt wurde (a, c). Zusätzlich war die Länge der Nervenfasern in den Mutanten verkürzt.
(e, f): Die TIMM-Färbung färbt ausschließlich die Trajektorien der Moosfasern. Die Moosfasern der Kontrollschnitte (Pfeile in e) gabeln sich und navigieren genau entlang der Grenze der CA-Region (gestrichelte Linien). Im Gegensatz dazu, teilen sich Fasern, die einen Mangel an SRF aufweisen (Pfeile in f) nicht gabelförmig auf und wachsen stattdessen vorzugsweise an der Spitze von CA3-pyramidalen Neuronen.
(g–j): Die Calbindinfärbung markiert neuronale Zellkörper und ihre Ausmaße, die im Gyrus dentatus lokalisiert sind. Die Enden von SRF-defizitären Nerven zeigen eine im Vergleich zu den Kontrollen deutlich abweichende Orientierung gegenüber praktisch allen Nervenfasern, die innerhalb der CA-Region wachsen (Pfeile).

2

(a, c, e): In P14-Kontrollmäusen sind die CA3-pyramidalen Zellen (PC) dicht angeordnet mit lediglich kleinen interzellulären Räumen zwischen den pyramidalen Zellkörpern (a). In den Kontrollproben enden die Moosfasern an den dendritischen Ausläufern der CA3-pyramidalen Zellen im Stratum lucidum (Pfeile in b).
(b, d, f): Vergrößerte Interzelluläre Räume, welche Moosfasern-Axone zwischen den CA3-pyramidalen Zellen enthalten, häufig beobachtet in SRF-defizitären Neuronen (b). SRF-defizitäre Moosfasern bilden kaum Synapsen mit CA3-basalen Dendriten im stratum lucidum (d). Allerdings zeigten die wenigen verbleibenden Synapsen eine unveränderten Morphologie (d). Die Mehrzahl der Moosfasern-Synapsen innerhalb der pyramidalen Schicht der SRF-defizitären Neuronen (f) sind eher unregelmäßig mit den CA3 Somata (Nervenzellkörper) verknüpft als mit den basalen Dendriten (vgl. auch Kontrollen a und c).

3

(a–f): Die Neuronen des Hippocampus, welche von den Kontrollen (a–c) und den SRF-defizitären (d–f) stammen, wurden auf Laminin gezüchtet. Die SRF-defizitären Neuronen weisen einerseits eine reduzierte Neuronenanzahl mit einem Neuritenauswachsen auf (vgl. auch g) und andererseits ist das Wachstum von Neuriten in SRF mutierten Neuronen vermindert (quantifiziert in i).
(h): Der längste Neurit in den Kontrollneuronen ist nahezu fünf mal länger (4,74 ± 0,78) als die Durchschnittslänge der verbleibenden Neuriten. Im Gegensatz dazu ist dieses Verhältnis um einen Faktor von ca. 2 in SRF-defizitären Neuronen verringert (2,2 ± 0,3).
(j): die Neuritenanzahl, die von einem bestimmten Neuron entspringt, ist in SRF-defizitären Neuronen nicht signifikant verändert.

4

(a, b): SRF-defizitäre Neuronen (a) und Kontrollneurone (b) wurden einer Elektroporation unterworfen, indem ein verkürztes SRF-Konstrukt (SRF-VP16ΔMADS), dem die Sequenz für die DNA-Bindungsdomäne fehlt, verwendet wurde. Erwartungsgemäß weisen die Neuronen in den Kontrollen immer noch eine doppelt so große Neuritenlänge auf als in den SRF-defizitäre Neuronen (vgl. auch e und 3).
(c, d): Die Zuführung von konstitutiv aktivem SRF (SRF-VP16) in SRF defizitären Neuronen (c) induziert einen dramatischen Zuwachs in der Neuritenlänge (vgl. auch e und f). In Kontrollneuronen wurde ebenfalls ein zusätzliches Wachstum der Neuritenlänge erreicht, wenn auch in einem geringeren Umfang als in den SRF-defizitären Neuronen (siehe auch f).
(e): Die Kontrollneuriten, die SFR-VP16ΔMADS exprimieren, weisen eine doppelte Neuritenlänge auf als die Neuriten von SRF-defizitären Neuronen (61 ± 8,5 μm vs. 31,3 ± 3,7 μm). Der Vektor SRF-VP16 erhöht beträchtlich die Neuritenlänge von Neuronen, welche einen Mangel an endogenem SRF-Protein aufweisen (96,1 ± 29 μm).
(f): Die Zunahme der Neuritenlänge, stimuliert durch die Zugabe des Vektorkonstrukts SRF-VP16 (bzw. SRF-VP16ΔMADS) ist für beide Genotypen dargestellt. In den Kontrollneuronen führte die Aufnahme des Vektorkonstrukts SRF-VP16 zu einer Zunahme der Neuritenlänge um ca. 42,3 % (± 25,1%). Durch eine Überexpression von SRF-VP16 in SRF-defizitären Neuronen konnte ein mehr als dreimal so großer Zuwachs der Neuritenlänge erreicht werden (169 ± 13 %).

5

(a): Die Neuronen des Hippocampus, welche von den Kontrollen stammen, wurden auf einem alternativen Streifen mit ephrinA5-Fc (rote Streifen) und einem Kontrollprotein (Fc alleine, schwarze Streifen) gezüchtet. Typischerweise wurden Neuriten, die den EphA-Rezeptor exprimieren, durch die Wechselwirkung mit EphrinA5 stark abgestoßen, so daß auf diese Weise ein Wachstum auf den EphrinA enthaltenden Streifen verhindert wurde.
(b): Die SRF-defizitären Neuronen sind weniger sensitiv gegenüber der abstoßenden Wirkung von EphrinA5, daher überqueren mehr Neuriten die EphrinA5 enthaltenden Streifen.
(c): Die Kontrollexperimente mit Streifen, welche ein Kontrollprotein (Fc vs. Fc) enthalten, zeigen ein unregelmäßiges Auswachsen der Neuriten auf diesen Streifen.
(d): Der Prozentsatz der individuellen Neuriten, die durch EphrinA5 abgestoßen wurden, ist dargestellt. In den Experimenten mit den EphrinA5-Streifen wurden 80,6 % (± 12,7 %) der Kontrollneuriten abgestoßen. Im Gegensatz dazu konnten die Erfinder eine nahezu zweifache Abnahme bei den SRF-defizitären Neuronen feststellen, was die Sensitivität der Neuriten gegenüber EphrinA5 anbelangt (44 % ± 17 %). In den Kontrollstreifen-Essays wurde erwartungsgemäß lediglich eine geringe Anzahl an Neuriten abgestoßen (19 ± 13,6 % in den Kontrollen und 19,3 ± 8,5 % bei den Mutanten).
(e): Die Anzahl der grünen Pixel (die die Neuronen reflektieren, die auf Tubulin angefärbt sind), lokalisiert auf den roten Streifen, wurden von der Gesamtanzahl der grünen Pixel in einem gegebenen Rahmen abgezogen. Nur 12 % (± 6 %) der Pixel aus Kontrollneuronen wurden nicht durch EphrinA5 abgestoßen, während eine dreifache Zunahme (36 ± 12 %) bei SRF-defizitären Neuronen beobachtet wurde. Theoretische Überlegungen sagen eine 50 % Wahrscheinlichkeit für die Lokalisierung eines bestimmten Pixels auf einem der Streifen voraus. Dies wird in der Tat in den Kontrollstreifen mit einem unregelmäßigen Neuritenauswachsen beobachtet (45 ± 6 % bei den Kontrollen und 41 + 9 % bei den Mutanten).
(f): Auf Streifen, die ein Kontrollprotein enthalten (c), wachsen die Kontrollneuriten immer noch nahezu zweimal so lang als bei den Neuronen, die einen Mangel an SRF aufweisen (82 ± 17 μm bei den Kontrollen vs. 48 ± 5 μm bei den Mutanten). In den Experimenten mit EphrinA5-Streifen wachsen die Kontrollneuriten (wahrscheinlich aufgrund der abstoßenden Wirkung von EphrinA5) geringfügig kürzer 57 ± 12 μm). Die Neuronen, die einen Mangel an SRF aufweisen, zeigen einen subtilen Zuwachs der Neuritenlänge (16 ± 17 μm).

6

(a, b): In der Gegenwart von Kontrollproteinen (a) zeigen die Kontrollneuronen vollständig ausgebildete Wachstumsspitzen (a) mit filo- und lamellipodialen Strukturen, wie durch Anfärben auf F-Actin (rot) gezeigt werden konnte. Die Anwendung von EphrinA5 (b) löst einen Zusammenbruch des Aktin Cytoskeletts aus, welcher in einem vollständigen Kollaps der Wachstumsspitzen resultiert (b).
(c, d): In SRF-defizitären Neuronen sind die Wachstumskegel vor der Induzierung des Zusammenbruchs (c) ähnlich gut ausgebildet wie in den Kontrollen (a). Auffallend ist die Induktion ringförmiger Strukturen durch Inkubation mit EphrinA5 an den Wachstumskegeln. Diese ringförmigen Strukturen bestehen sowohl aus polymerisiertem Actin (F-Actin, rot) als auch aus Microtubuli (grün; vgl. auch e–g).
(e–g): Es werden vergrößerte Darstellungen der in (d) beschriebenen Ergebnisse gezeigt.
(h): Es ist die Quantifizierung von Neuronen, die einen oder mehrere Actin/Microtubuli-Ringe aufweisen, nach einer EphrinA5-Induktion dargestelt. Der Prozentsatz an SRF-defizitären Neuronen, welche diese ringförmigen Strukturen aufweisen, nimmt entsprechend der EphrinA5-Dosierung zu. Diese Ringe fehlen fast vollständig in SRF-defizitären Neuronen, die mit einem Kontrollprotein (Fc) inkubiert sind oder in Wildtyp-Neuronen, behandelt entweder mit EphrinA5 oder einem Kontrollprotein. Die Überexpression des Vektors SRF-VP16 in SRF-defizitären Neuronen verhindert grundlegend das Wachstum von Actin-Microtubuli-Ringen und ermöglicht einen vollständigen Zusammenbruch der Wachstumskegel (vgl. auch 4).

7
Die Neuronen des Hippocampus wurden einer Elektroporation mit dem Kontrollvektor, dem konstitutiv aktiven RhoA (RhoA-V14) oder Rac1 (Rac1-V12) unterworfen und die Neuritenlänge (a, b) sowie der durch Ephrin A5 vermittelte Zusammenbruch der Wachstumskegel (c, d) quantifiziert.

(a, b): Im Verhältnis zu der Durchschnitts-Neuritenlänge, die bei Kontroll-Wildtyp-Neuronen nach einer Elektroporation erhalten wurden, stimulierte Rac1-V12 eine ungefähr 40 % Zunahme der Neuritenlänge (39,3 ± 4 %). Im Gegensatz dazu führte eine Elektroporation mit dem Vektor RhoA-V14 zu einer Reduktion der Neuritenlänge in den Kontrollneuronen um ca. 30 % (32,7 ± 1,1 %). Neuronen, welche kein SRF exprimieren, zeigten erwartungsgemäß nach Elektroporation mit dem Kontrollvektor ein kleineres Neuritenwachstum. Weder Rac1-V12 noch RhoA-V14 konnten ohne SRF-Aktivität im Zellkern das Wachstum bzw. die Inhibierung der Neuriten stimulieren.
(c, d): Der Anteil an kollabierten Wachstumskegeln in Gegenwart eines Kontrollproteins (Fc alleine) oder EphrinA5 ist in (c) zusammengefaßt. Die Überexpression beider Rho-GTPasen führte zu einer kleinen aber reproduzierbaren Zunahme des Prozentsatzes der kollabierten Wachstumskegel sogar in Gegenwart eines Kontrollproteins. EphrinA5 induzierte eine klare Antwort auf den Zusammenbruch in Kontrollen und in RhoA-V14 exprimierenden Kontrollneuronen. Dieser RhoA-abhängige Zuwachs in der Kollapsrate wurde in SRF-defizitären Neuronen nicht beobachtet. Konstitutiv aktives Rac1 scheint in Kontrollneuronen der Zusammenbruch der Wachstumskegel eher zu inhibieren als zu fördern.
(d): Es ist die Prozentzunahme des Zusammenbruchs der Wachstumskegel nach Abzug der von Fc induzierten Zusammenbruchrate von der durch EphrinA5 induzierten Zusammenbruchrate dargestellt.

8
Der vollständige Cofaktor MAL sowie verschiedene gekürzte Versionen davon wurden durch Elektroporation in Kontrollneuronen sowie SRF-defizitären Neuronen eingebracht und anschließend das Neuritenauswachsen (a, b) und der durch EphrinA5 induzierte Zusammenbruch der Wachstumskegel bestimmt (c).

(a, b): Die Überexpression des vollständigen Cofaktors MAL veränderte in den Kontrollneuronen nicht wesentlich das Neuritenauswachsen. Im Gegensatz dazu führte die Expression von multiplen dominant negativen (MAL C471, ML ΔNΔB1, MAL ΔNC471) zu einer Beeinträchtigung der MAL-Funktion und damit zu einer Reduzierung der Neuritenlänge in den Kontrollneuronen. Der vollständige Cofaktor MAL konnte in SRF-defizitären Neuronen kein Neuritenwachstum induzieren, was eine fehlende Aktivität des Cofaktors ohne die Anwesenheit des SRF als Partnerprotein belegt.
(b): Die Prozent-Zunahme/-Abnahme der Neuritenlänge wird für verschiedene MAL-Konstrukte abgebildet, wobei die Kontrollneuronen mit einem Kontroll-MAL-Vektor (MAL ΔNΔB1, ΔLZ) transfiziert werden.
(c): Die Zunahme des Zusammenbruchs der Wachstumskegel gegenüber Fc-Kontrollen wird in Prozent angegeben. In Gegenwart des Kontrollvektors (MAL ΔNΔB1, ΔLZ) sowie des vollstängien MAL-Vektors zeigen die Kontrollneuronen eine robuste Antwort auf den Zusammenbruch der Wachstumskegel. Allerdings kann diese Reaktion in signifikanter Weise unter Verwendung von MAL als Target mit Hilfe von verschiedenen dominant-negativen Vektorkonstrukten, wie angezeigt, blockiert werden. Ähnlich wie beim Neuritenauswachsen (a, b) beeinflußt ein vollständiger MAL-Vektor in SRF-defizitären Neuronen die Zusammenbruchrate nicht.

Claims

Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.
Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Herstellung eines Diagnostikmittels für Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.
Verwendung mindestens einer Substanz zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Beeinflussung eine Stimulierung und/oder Inhibierung, vorzugsweise eine Stimulierung, der Expression und/oder Aktivität von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen betrifft.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Substanz um Proteine oder Polypeptide, insbesondere um Antikörper, handelt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Substanz um Polynukleinsäuren, insbesondere DNA oder RNA, handelt.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der RNA um Oligonukleotide, insbesondere Ribozyme, Antisensemoleküle oder um siRNA (short interfering RNA) handelt, wobei siRNA bevorzugt ist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA um Vektorkonstrukte handelt, die mindestens eine für SRF und/oder SRF-regulierte Transkriptionsprodukte codierende Sequenz aufweisen.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Substanz um Wirkstoffe handelt, insbesondere um „small molecular compounds", vorzugsweise um „small molecular compounds" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1000.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den SRF-regulierten Transkriptionsprodukten um mindestens einen Vertreter aus der Gruppe, umfassend Aktin, Vinculin, Zyxin, β-1Integrin und Gelsolin, handelt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Regulatoren, insbesondere Aktivatoren und/oder Inhibitoren, und/oder biologische Vorläufer von SRF und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten beeinflußt, insbesondere stimuliert und/oder inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Regulatoren um Cofaktoren von SRF und/oder SRF- regulierten Transkriptionsprodukten handelt, insbesondere von SRF.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Cofaktoren um TCF (Ets-type ternary complex factor) und/oder um Proteine der Myocardinfamilie handelt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Substanz um mindestens einen Vertreter aus der Gruppe, umfassend Myocardin, MAL, MKL und MRTF (Myocardin Related Transcription Factor), insbesondere umfassend MAL und MRTF, handelt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Abnormalitäten um morphologische Abnormalitäten der neuronalen Zellen handelt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abnormalitäten Störungen des Neuritenwachstums und/oder der Neuritenorientierung und/oder der Synapsenausbildung betreffen.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkrankungen um neurodegenerative Erkrankungen handelt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkrankungen um Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, Querschnittslähmung, Epilepsie, Suchterkrankungen und/oder Verhaltensstörungen handelt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den neuronalen Zellen um Zellen des limbischen Systems handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge mindestens einer Substanz, die die Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen beeinflußt, und gegebenenfalls ein pharmazeutisches Trägermaterial.
Diagnosekit, umfassend mindestens eine Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder Diagnosekit nach Anspruch 20 oder 21, weiter gekennzeichnet durch mindestens eines der Merkmale des kennzeichnenden Teils der Ansprüche 4 bis 19.
Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit neuronalen Abnormalitäten assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß eine wirksame Menge einer Substanz zum Nachweis und/oder zur Beeinflussung der Expression und/oder Aktivität von SRF (Serum Response Factor) und/oder SRF-regulierten Transkriptionsprodukten in neuronalen Zellen verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 23, weiter gekennzeichnet durch mindestens eines der Merkmale des kennzeichnenden Teils der Ansprüche 4 bis 19.