WO2007036291A2 - Verbessertes zellkulturmedium - Google Patents

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WO2007036291A2
WO2007036291A2 PCT/EP2006/008761 EP2006008761W WO2007036291A2 WO 2007036291 A2 WO2007036291 A2 WO 2007036291A2 EP 2006008761 W EP2006008761 W EP 2006008761W WO 2007036291 A2 WO2007036291 A2 WO 2007036291A2
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Aziz Cayli
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Cellca Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to a nutrient medium, in particular a cell culture medium, for cultivating at least one cell and / or for obtaining a polypeptide, protein and / or a vaccine from organisms, in particular from cells or from cell cultures, wherein the organisms are cultivated in the nutrient medium according to the invention, and the desired polypeptide, protein or vaccine is recovered from the organisms and / or the culture supernatant.
  • a nutrient medium in particular a cell culture medium, for cultivating at least one cell and / or for obtaining a polypeptide, protein and / or a vaccine from organisms, in particular from cells or from cell cultures, wherein the organisms are cultivated in the nutrient medium according to the invention, and the desired polypeptide, protein or vaccine is recovered from the organisms and / or the culture supernatant.
  • the increase in productivity and / or the reduction of byproduct formation caused according to this aspect of the invention can be achieved if the substances according to the invention are added to a nutrient medium, in particular a cell culture medium, or combined with one another, or combined with other carbohydrates, in particular if the Substances are added to a medium which is glutamine-poor, or does not contain glutamine, or used with a medium containing glutamine substitutes.
  • the substances according to the invention are used as modulators of cell metabolism. They act as additional energy and / or carbohydrate source.
  • the substances can be used in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, with a correspondingly higher concentration, which contains carbohydrates and / or glutamine.
  • the substances according to the invention can also be used in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, which contains no carbohydrates and / or glutamine.
  • animal cells in particular mammalian cells
  • host cells are increasingly used as host cells.
  • cell lines which are either immortalized cells or tumor cells.
  • primary cells are used, for example taken directly from humans or animals.
  • the primary cells can divide only a few times, while cell lines can divide almost infinitely.
  • the cell metabolism between primary cells and continuous cell lines may also be different, for example the glucose consumption rate, the lactate formation rate and the glutamine consumption rate.
  • One goal of process optimization in the use of cells, particularly mammalian cells, is to try to increase the integral of the living cell concentration in the culture system, ie the integral of the live-cell concentration and the time-curve. Because the integral of the living cell concentration correlates positively with the product concentration, for example with the polypeptide concentration. (Renard, JM, et al, Biotechnology Letters, 1988, 10 (2): 91-96).
  • the integral of the living cell concentration can be increased either by increasing the living cell concentration or by prolonging the process time.
  • the process time can be extended if the cells live long in the bioreactor, that is, if the vitality of the cells remains high for a long time, or if the stationary growth phase is prolonged. If vitality is low, there are many dead cells in the culture that lyse during fermentation and release cell-derived proteins. A higher total protein content in the culture, in turn, complicates the purification of the desired polypeptide.
  • a substrate can have a limiting effect, the cells can enter into apoptosis due to the physical fermentation conditions or metabolic by-products can accumulate in the medium the cells are toxic.
  • Desirable would be a nutrient medium or a method in which the cell vitality remains high for a long time, that is, in which the stationary growth phase is prolonged, since in the stationary growth phase, the highest living cell concentration has already been reached.
  • the extension of the stationary growth phase leads to an increase in the integral of the living cell concentration and to higher product formation.
  • Another parameter to increase the integral of the living cell concentration is to increase the highest cell concentration reached (peak cell density).
  • Better nutrient media and better cultivation techniques can further increase the highest cell concentration achieved.
  • the highest cell concentration or cell vitality achieved is a function of cell metabolism. When the cells have an inefficient metabolism, they secrete high-energy intermediate metabolites, such as lactate, into the medium. Cells can also secrete toxic intermediate metabolites into the medium, such as ammonium.
  • Ammonium in turn can negatively affect cell growth, productivity and product quality, for example glycosylation.
  • productivity and product quality for example glycosylation.
  • the intracellular concentration of the glycolytic intermediates is shifted. This may affect the expression profile of various genes necessary for stress stability, productivity and growth (Verstrepen, KJ, et al., Trends Biotechnol., 2004, 22 (10): 531-537). Under such conditions, the integral of the live cell concentration is low, which in turn means less product formation.
  • Continuous cell lines are known to have degenerate cell metabolism compared to primary cells. A number of enzymes of primary metabolism between cell lines and primary cells were compared in this context. In the tested cell lines, no activity of enzymes connecting the glycylysis with the citrate cycle could be detected while they exist in primary cells (Neermann, J. and Wagner, R., J. Cell. Physiol., 1996, 166 (1): 152-169). In many mammalian continuous cells, the flow of glucose to lactate is high while the flow of pyruvate to the citrate cycle is low. Glucose is converted by the cells to a large extent to lactate and then the high-energy lactate is excreted into the nutrient medium, in particular in a cell culture medium.
  • EP 0435911 B1 teaches that inter alia glutamine must be increased in standard cell culture media in order to achieve improved cell growth and increased product formation. Similarly, feeding the animal cells with glutamine in fed-batch or perfusion is necessary for biopharmaceutical production (Duvar, S. et al., Transcript, 2004, 5 (1): 34-36). In this respect, there are statements in the literature about the role of glutamine in cell metabolism.
  • No. 4,049,494 describes a serum-free, chemically defined and autoclavable nutrient medium.
  • the medium has the property that it is glutamine-free and at the same time contains glucose and pyruvate.
  • the medium was specially designed for virus production with Hamster kid ney cells developed.
  • WO 03/106661 A2 describes a substrate combination for the cultivation of mammalian cells.
  • the combination comprises a glutamine-free and at the same time pyruvate-containing nutrient medium. This substrate combination is intended to reduce the formation of lactate and / or ammonium.
  • the cells in this approach grew on microcarriem and were either in the later exponential growth phase or in the stationary growth phase. In these growth phases, the cells have an altered metabolism profile. In addition, a pre-adaptation of the cells to glutamine-free medium was necessary.
  • Glutamine was removed from the nutrient medium in a special nutrient medium. Without cell adaptation, the examined clone simply grew in the special nutrient medium. This reduced the ammonium reformation and increased product formation (Deer, F., andingham, M., Genetic Eng., News, 2000, 20 (7): 42). Kurano, N., et al, 1990 (Journal of Biotechnology, 15 (1-2): 113-28) substituted glutamine with asparagine. A CHO culture was used under fed-batch conditions and under glutamine-free conditions Asparagine supplemented while reducing the formation of ammonium.
  • Glutamine was also replaced in nutrient media with dipeptides, alanylglutamine (Ala-GIn) or glycyl-glutamine (Gly-GIn). It has been shown that by this strategy, the cells have formed less ammonium (Roth, E. et al., In vitro Cellular & Develop- mental Biology, 1988, 24 (7): 696-698; Christie, A., and Butler, M., J. Biotechnology, 1994, 37 (3): 277-90). Glutamine has been replaced with the stable glutamine alternative L-alanyl-glutamine (Glutamax) to study the effect of glutamine limitation with this substance (Sanfeliu, A. and Stephanopoulus, G., Biotechnol., And Bioeng., 1999, 64 (1): 46 -53).
  • EP 1 342 780 A1 has published another combination of substances intended to reduce glucose consumption and lactate formation. Accordingly, free unbound citrate should be added to the nutrient medium in combination with iron citrate bound in a complexing agent.
  • lactate In a nutrient medium (perfusate), lactate and pyruvate were offered in a ratio of 10: 1 as a substrate to the rat cardiac cells. Lactate has been used because lactate is a preferred cardiac cell substrate. It has been shown that the glycolytic flux has been inhibited by the addition of lactate (Depre, C. et al., Acta Cardiologica, 1993, 48 (1): 147-64; Ovchinnikov, IV and Kim, NP, Ukrainskii Biovicheskii Zhurnal, 1985, 57 (4): 72-5). In a chemically defined protein-free medium, the effect of succinate, malate, lactate and pyruvate on hamster embrion was investigated.
  • CHO (Chinese hamster ovary) cells are unable to utilize ribose, lactose, sucrose, glycerol, lactate, pyruvate, citrate, succinate, fumarate or malate as an energy source (Faik, P. and Morgan, MJ , Cell Biol. Int. Reports, 1977, 1 (6): 555-62). It has surprisingly been found that precisely these substances can be used by cells, in particular by CHO cells, as a substrate, if, according to the invention, the correct concentration is chosen here, and the correct amino acid concentration (glutamine, glutamate, aspartame) and Carbohydrate source is selected.
  • Acetate was added to the nutrient medium on the grounds that it increases the productivity of the cells in a manner comparable to butyrate (WO 03/064630).
  • Glucose was combined with another C2 carbon source in order to be able to select a genetically modified yeast strain (WO 2004/099425). In this publication, however, the focus is on a method for selecting a new yeast strain, not for cultivating an organism.
  • the technical problem underlying the invention is to provide a yield-enhanced culture medium, in particular a cell culture medium, a cell culture and a method for culturing cells or cell cultures, in particular for the production of biological products from the cells or cell cultures, in which the integral of the live cell concentration of a cell culture is increased, and accordingly, over the total process time, a larger amount of desired biological product can be recovered.
  • the nutrient medium in particular the cell culture medium, can be used for cells which have one or more possibly not precisely located metabolic blocks in the glycosylation pathway or in the energy pathway, in particular in the citric acid cycle or glycolysis, or a blockade when transporting metabolites of medium into the cell, and / or in the cell between the organelles.
  • the invention is therefore also based on the technical problem of a nutrient medium for culturing cells or cell cultures, even of cells with metabolic blockade in Glykosyltechniksstoffwech- or in energy pathway, eg in Citratey or glycolysis, or of cells that blockade in transport of metabolites of Medium in the cell, and / or in the cell between the organelles to provide, in which the cell growth is improved, or the formation of metabolic byproducts is reduced, and accordingly over the entire process time a larger amount of desired biological product can be obtained.
  • the invention is also based on the technical problem of providing methods for the selection of specific cells, in particular genetically modified and / or metabolically modified, in particular optimized, cells.
  • organic acids or salts, derivatives or complexes of the organic acids selected from the group of citric acid, succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, tartaric acid, Adipic acid, lactic acid in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, which has increased the growth and / or productivity of the cells and / or has reduced the toxic metabolite formation.
  • Organic acids or salts or complexes of the organic acids selected from the group of succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutaric acid, fumaric acid, oxacetic acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, tartaric acid, adipic acid, lactic acid are preferred according to the invention.
  • the increase in productivity and / or reduction of by-product formation produced according to this aspect of the invention can be achieved if the substances according to the invention are added to a nutrient medium, in particular a cell culture medium, or are combined with one another, or combined with carbohydrates, or without carbohydrates added to the medium especially when the substances are added to a medium containing glutamine, or containing no glutamine, or used in a medium containing glutamine substitutes, or containing no glutamine substitutes, or having a high asparagine concentration, or asparagine contains or has a high glutamate concentration, or contains glutamate substitutes.
  • the invention solves the underlying technical problem in particular by providing a nutrient medium, in particular a cell culture medium, a cell culture and a method according to the claims.
  • the invention solves the underlying technical problem by providing a nutrient medium, in particular a cell culture medium, for culturing a cell culture, comprising at least one cell, wherein the nutrient medium, in particular the cell culture medium, at least one substance selected from the group consisting of citronenic acid, Succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, tartaric acid, adipic acid, lactic acid and mixtures thereof and salts, derivatives or complexes of these acids.
  • the nutrient medium in particular the cell culture medium, contains at least one substance selected from the group consisting of succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, tartaric acid, adipic acid, lactic acid and mixtures thereof, as well as salts or complexes of these acids.
  • Salts of the acids used according to the invention are in particular succinate, malate, ⁇ -keto-glutarate, fumarate, oxalacetate, isocitrate, oxalsuccinate, tartrate, adipate or lactate.
  • citric acid By the salt of citric acid is meant citrate.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium, preferably contains at least two substances selected from the group consisting of succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, isocitric acid, oxalic acid, tartaric acid, adipic acid, lactic acid and mixtures thereof and salts or complexes of these acids, so that one or more of the aforementioned acids may also be present as salt or complex.
  • the group is extended to citric acid.
  • the nutrient medium preferably contains lactic acid.
  • the nutrient medium preferably contains lactate.
  • the nutrient medium preferably contains at least one lactic acid complex.
  • the nutrient medium contains a lactic acid derivative.
  • the nutrient medium preferably contains alanine as the lactic acid derivative and / or at least one alanine-containing peptide.
  • the nutrient medium contains alanine and / or at least one alanine-containing peptide in a concentration of 0.1 g / l or greater, more preferably of 1 g / l or greater, more preferably of 5 g / l or greater, most preferred of 25 g / l or larger.
  • the nutrient medium preferably contains pyruvate as the lactic acid derivative and / or at least one pyruvate derivative.
  • the nutrient medium preferably contains pyruvate and / or at least one pyruvate derivative in a concentration of 0.1 g / l or greater, more preferably of 1 g / l or greater, most preferably of 5 g / l or greater, most preferably of 25 g / l or larger.
  • the concentrations listed in the description are final concentrations. In a karten embodiment, the concentrations listed in the description are total concentrations of the respective substances.
  • the nutrient medium preferably contains lactic acid, lactate, at least one lactic acid complex and / or at least one lactic acid derivative in a concentration of 0.1 g / l or greater, preferably 1 g / l or greater, more preferably 5 g / l or greater, more preferably 25 g / L or greater.
  • the nutrient medium contains succinic acid.
  • the nutrient medium preferably contains succinate.
  • the nutrient medium contains a succinic acid derivative.
  • the nutrient medium preferably contains a succinate derivative.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium, all of the acids or substances mentioned, wherein instead of the acids and the corresponding salts or complexes can be used.
  • metabolism-blocked cells can be cultured in such a composition, in particular if the location of the block, for example in the glycosylation pathway or in the energy pathway, for example in the citric acid cycle or glycolysis, can not be exactly localized or if cells block the transport of metabolites from medium into the cell Cell, and / or in the cell between the organelles.
  • the nutrient medium in particular the cell culture medium, ie succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, tartaric acid, adipic acid and lactic acid, may preferably contain one or more of the abovementioned acids as salt or complex , The group is particularly preferably extended by citric acid.
  • the substances according to the invention are suitable for the permanent cultivation of the organisms, in particular for the cultivation of animal cells, in particular for the cultivation of mammalian cells.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, preferably contains at least one substance according to the invention in a concentration of at least 15 mg / l, more preferably at least 30 mg / l, particularly preferably at least 100 mg / l, in particular at least 300 mg / l preferably at least 1000 mg / l.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, preferably contains at least one substance according to the invention in a concentration of 0.03 g / l or greater, more preferably 0.1 g / l or greater, particularly preferably 1 g / l or greater, in particular of 5 g / l or greater, most preferred of 25 g / l or greater.
  • the nutrient medium according to the invention is a feeding medium.
  • the nutrient medium according to the invention, in particular feeding medium preferably contains at least one substance according to the invention in a concentration of 0.2 g / l or greater, more preferably 1 g / l or greater, more preferably 5 g / l or greater, very preferably 25 g / L or greater, most preferably at least 100 g / L.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, contains at least one carbohydrate, more preferably a monosaccharide or a disaccharide.
  • the nutrient medium preferably contains a carbohydrate.
  • the carbohydrate is selected from the group consisting of glucose, galactose, fructose, mannose, ribose, glucosamine, sucrose, lactose and mixtures thereof.
  • the nutrient medium preferably contains the at least one carbohydrate in a concentration of 0.1 g / l or greater, more preferably 1 g / l or greater, particularly preferably 5 g / l or greater, particularly preferably 25 g / l or greater, most preferably 100 g / L or greater.
  • the nutrient medium preferably contains galactose.
  • the nutrient medium contains galactose and a second carbohydrate.
  • the nutrient medium contains galactose in a concentration of 0.1 g / l or greater, more preferably 1 g / l or greater, more preferably 5 g / l or greater, particularly preferably 25 g / l or greater, on most preferably 100 g / L or greater.
  • the nutrient medium preferably contains glucose in a concentration of 100 g / l or less, more preferably 25 g / l or less, more preferably 5 g / l or less, particularly preferably 1 g / l or less, especially preferably 0.1 g / l or smaller.
  • the nutrient medium is free of glucose.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, is free of carbohydrates.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, preferably contains glutamine in a concentration of less than 8 mmol / l, preferably of less than 5 mmol / l, particularly preferably of less than 3 mmol / l, more preferably test less than 2 mmol / l.
  • the nutrient medium, in particular the cell culture medium but may also be preferably free of glutamine.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, contains at least one glutamine derivative, ie at least one glutamine-containing glutamine substitute, particularly preferably a glutamine-containing dipeptide.
  • the at least one glutamine derivative is a glutamine-containing peptide.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, preferably contains glutamine derivatives in a total concentration of greater than 30 mg / l, preferably greater than 150 mg / l, more preferably greater than 750 mg / l, most preferably greater than 2000 mg / l.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, preferably contains glutamine derivatives in a concentration of 0.05 g / l or greater, preferably of 0.2 g / l or greater, more preferably of 0.8 g / l or greater, most preferably 3.2 g / L or greater.
  • the nutrient medium, in particular the cell culture medium can also be free of glutamine derivatives in a preferred alternative.
  • the nutrient medium preferably contains asparagine.
  • the nutrient medium preferably contains at least one asparagine substitute, in particular at least one asparagine derivative.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, preferably contains asparagine or at least one aspartic acid, more preferably at least one asparagine derivative, in a high concentration, ie in a concentration, in particular particular total concentration of greater than 0.05 g / l, more preferably greater than 0.15 g / l, more preferably greater than 0.3 g / l, in particular greater than 0.6 g / l
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, preferably contains glutamate or at least one glutamate substitute, preferably at least one glutamate derivative, in a high concentration, that is to say in a concentration of 0.05 g / l or more, more preferably 0.15 g / L or greater, more preferably 0.3 g / L or greater, more preferably 0.6 g / L or greater.
  • the present invention relates to a cell culture medium containing lactic acid and galactose and the aforementioned high asparagine concentration, but at the same time is free of glutamine.
  • the present invention relates to a cell culture medium which contains lactic acid, galactose and asparagine in the aforementioned high concentration and at the same time is free of glutamine but has at least one glutamine-containing peptide.
  • the present invention relates to a cell culture medium which comprises lactic acid and galactose, moreover has a high glutamate concentration in the aforementioned concentration, but at the same time is free of glutamine.
  • the present invention relates to a cell culture medium containing succinic acid and has a high asparagine or asparagine substitute concentration of the aforementioned concentrations, but at the same time is free of glutamine.
  • the nutrient medium is free of glucose and glutamine-free and contains asparagine in a concentration of 0.05 g / l or greater, more preferably 0.15 g / l or greater, more preferably 0.3 g / l or greater , most preferably 0.6 g / L or greater, as well as lactic acid and galactose.
  • the nutrient medium is free of glucose and glutamine and contains glutamate in a concentration of 0.05 g / l or greater, more preferably 0.15 g / l or greater, even more preferably 0.3 g / l or greater more preferably 0.6 g / L or greater, as well as lactic acid and galactose.
  • the nutrient medium is preferably free of glucose and contains glutamine-containing peptides, lactic acid and galactose.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, is a feeding medium.
  • the feed medium preferably comprises lactic acid, lactate, at least one lactic acid complex and / or at least one lactic acid derivative in a concentration of 1 g / l or greater, preferably 5 g / l or greater, more preferably 25 g / l or greater, more preferably 100 g / L or greater.
  • the feeding medium contains galactose in a concentration of 1 g / l or greater, more preferably 5 g / l or greater, more preferably 25 g / l or greater, most preferably 100 g / l or greater.
  • the nutrient medium according to the invention more preferably feed medium, preferably contains glutamine derivatives in a concentration of 0.2 g / l or greater, more preferably 1 g / l or greater, particularly preferably 5 g / l or greater, more preferably 10 g / l or greater.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the feeding medium, preferably contains asparagine or at least one aspartic substitute, more preferably at least one aspartic derivative, in a concentration of 0.2 g / l or greater, more preferably of 1 g / l or greater , more preferably 2 g / L or greater, more preferably 5 g / L or greater, most preferably 10 g / L or greater.
  • the feeding medium according to the invention preferably contains glutamate or at least one glutamate substitute, more preferably at least one glutamate derivative, in a concentration of 0.2 g / l or greater, preferably 1 g / l or greater, more preferably 2 g / l or greater, more preferably 5 g / L or greater, most preferably 10 g / L or greater.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, is a basal medium, preferably a basal medium having an osmolality of 240 to 360 mmol / kg H 2 O.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, a basal medium, more preferably a basal medium having an osmolality of 280 to 350 mOsmol / kg H 2 O, most preferably a basal medium having an osmolality of 280 to 320 mOsmol / kg H 2 O.
  • the nutrient medium according to the invention in particular the cell culture medium according to the invention, is a feed medium (also called feed medium), preferably a feed medium with an osmolality of 150 to 1500 m ⁇ smol / kg hfeO.
  • the nutrient medium is preferably serum-free. According to the invention, the nutrient medium preferably contains serum.
  • a nutrient medium is in particular a cell culture medium.
  • the nutrient medium is preferably a liquid nutrient medium, in particular a liquid cell culture medium.
  • the concentration limits of the ingredients to be selected ie also the maximum concentrations of the ingredients to be selected, are to be determined without particular effort by the preferred minimum data specified for the concentration of the stated ingredients in the nutrient medium.
  • the concentration of an organic acid used according to the invention is at most 200 g / l, more preferably 100 g / l, more preferably 50 g / l, most preferably 25 g / l.
  • the concentration of lactate used according to the invention and / or of a lactic acid derivative, in particular alanine and / or pyruvate is at most 200 g / l, particularly preferably 100 g / l, in particular 50 g / l, most preferably 25 g / l.
  • the concentration of a glutamine derivative used according to the invention is at most 60 g / l, particularly preferably 30 g / l, more preferably 10 g / l, very preferably 5 g / l, in particular 1.2 g / l, most preferably 1, 1 g / l.
  • the concentration of glutamate or a glutamate derivative used according to the invention is at most 60 g / l, more preferably 30 g / l, more preferably 5 g / l, in particular 1.2 g / l, most preferably 1.1 g / l.
  • the concentration of galactose used according to the invention is preferably at most 200 g / l, particularly preferably 100 g / l, in particular 50 g / l, most preferably 25 g / l.
  • the invention also relates to the use of a nutrient medium according to the invention, in particular of a cell culture medium according to the invention, for culturing a cell culture comprising at least one cell.
  • the invention also solves the underlying technical problem by providing a cell or cell culture.
  • the cell or cell culture according to the invention is preferably metabolically optimized so far that it can be cultured in culture media and methods according to the invention.
  • the cell or cell culture is preferably characterized in that the cell culture can survive or divide in a medium with substances according to the invention, or the highest cell concentration reached is higher, or the stationary growth phase is prolonged or the dying phase is slowed, or the formation of cell-metabolic by-products, for example, ammonium or lactate is reduced.
  • Preferred according to the invention is a cell or cell culture which can metabolize lactic acid, as well as salts (lactate) or complexes of lactic acid salts, or salts of lactic acid substitutes.
  • a cell or cell culture which can survive in a glucose-free medium preferably can divide, more preferably achieves higher integral of viable cells (IVC), most preferably produces low metabolic by-products, in particular lactate or ammonium.
  • Preferred according to the invention is a cell or cell culture which can survive in a glucose-free and glutamine-free medium and can metabolise, preferably divide, particularly preferably achieve higher integral of viable cells (IVC), most preferably low metabolic by-products , in particular lactate or ammonium produced.
  • Preferred according to the invention is a cell or cell culture which can survive in a glucose-free and glutamine-free medium and can metabolise lactate and has a high asparagine consumption, can preferably divide in such a medium, more preferably higher integral of viable cells (IVC ), most preferably produces minor metabolic by-products, especially lactate or ammonium.
  • Preferred according to the invention is a cell or cell culture which can survive in a glucose-free and glutamine-free medium and can metabolize lactate and has a high glutamate consumption, can preferably share in such a medium, in particular which preferentially achieves higher integral of viable cells (IVC), most preferably produces minor metabolic byproducts, particularly lactate or ammonium.
  • Preferred according to the invention is a cell or cell culture which can survive in a glucose-free and glutamine-free medium and can metabolize lactate and can metabolise galactose, preferably divide in such a medium, more preferably higher integral of viable cells (IVC). most preferably produces minor metabolic byproducts, especially lactate or ammonium.
  • Preferred in accordance with the present invention is a cell or cell culture which can survive in a glucose-free and glutamine-free medium and can metabolize lactate and metabolize galactose, and have a high asparagine consumption or high glutamate consumption, preferably sharing in such medium; more preferably achieves higher integral of viable cells (IVC), most preferably produces minor metabolic by-products, especially lactate or ammonium.
  • IVC integral of viable cells
  • the invention solves the underlying technical problem also by providing a method for cultivating a cell culture comprising at least one cell, wherein the cell culture is introduced and cultured in a nutrient medium and wherein the pH of the nutrient medium during at least one fifth of the cultivation period pH 7.2 or more basic.
  • the invention also solves the technical problem on which it is based by providing a method for cultivating a cell culture comprising at least one cell, the cell culture being introduced and cultivated in a nutrient medium according to the invention, in particular in a cell culture medium according to the invention.
  • the cell culture introduced into the nutrient medium according to the invention, in particular into the cell culture medium according to the invention, comprising at least one cell, is preferably used for the production of a biological product.
  • the biological product is selected from at least one polypeptide, at least one protein, at least one viral component, at least one virus or a mixture of these. Most preferably, the biological product is at least one vaccine.
  • the biological product is preferably obtained from the cell culture and / or from the nutrient medium, in particular from the cell culture medium according to the invention.
  • the at least one cell contains at least one gene encoding the biological product.
  • cell culture is understood as meaning at least one cell which is kept alive in a medium, preferably a nutrient medium, in particular a cell culture medium, preferably also dividing or exciting for cell division in the medium.
  • the at least one cell is preferably a eukaryotic cell, more preferably a fungal cell, in particular a yeast cell, a plant cell or an animal cell, for example an insect or mammalian cell, in particular a human or rodent cell, a hamster cell or a myeloma cell, for example a CHO, NSO, PERC6, HEK-293 or BHK21 cell.
  • the at least one cell is a prokaryotic cell.
  • the at least one cell is a derivative of one of the cells mentioned above.
  • the at least one cell preferably originates from a cell line, in particular an immortalized cell line and / or a tumor cell line.
  • the at least one cell is a primary cell. Examples of cells according to the invention are listed in the further course of the text.
  • the cell culture according to the invention is preferably a cell population.
  • the cell culture according to the invention is preferably alternatively a cell clone.
  • the cell culture may also comprise a plurality of cell types or cell types; the cell culture may preferably consist of or comprise a plurality of cell types or cell types.
  • the cell culture may preferably consist of cell aggregates or comprise cell aggregates.
  • the process according to the invention is preferably a batch process, a split-batch process, a fed-batch process, a continuous process or a perfusion process.
  • the pH of the nutrient medium at the end of culturing is preferably 7.2 or more basic, more preferably 7.3 or more basic, more preferably 7.4 or more basic, particularly preferably 7.5 or more basic, most preferably 7.6 or basic, most preferably 7.7 or more basic.
  • the pH of the nutrient medium is preferably at least one fifth, more preferably at least two-fifths, particularly preferably at least three-fifths, especially during at least four-fifths of the culture period pH 7.2 or more basic, more preferably 7.3 or more basic, more preferably 7.4 or basic, particularly preferably 7.5 or more basic, most preferably 7.6 or basic, most preferably 7.7 or more basic.
  • the pH of the nutrient medium during the cultivation process is preferably pH 7.2 or more basic, more preferably 7.3 or more basic, particularly preferably 7.4 or basic, particularly preferably 7.5 or basic, very particularly preferably 7.6 or basic, most preferably 7.7 or more basic.
  • the pH of the nutrient medium during the cultivation process is preferably at least pH 6.6 and at most pH 7.9, more preferably at least pH 6.7 and at most pH 7.9, most preferably at least pH 6.8 and at most pH7
  • the ninth According to the invention the pH of the nutrient medium during the cultivation process is at least pH 6.6 and at most 7.5, more preferably at least pH 6.7 and at most pH 7.5, most preferably at least pH 6.8 and at most pH 7, 5th According to the invention is preferred.
  • the pH of the nutrient medium during the cultivation process is at least pH 6.6 and at most 7.2, more preferably at least pH 6.7 and at most pH 7.2, most preferably at least pH 6.8 and at most pH 7.2.
  • the pH value of the nutrient medium during the cultivation process is never higher than pH 9.0, very preferably never higher than pH 8.5, more preferably never higher than pH 8.0, in particular particular preferably never higher than pH 7.8, most preferably never higher than pH 7.7.
  • the pH during the culturing process of the process according to the invention is more basic than pH 7.2, more preferably less than pH 7.3, more preferably less than pH 7.4, more preferably less than pH 7.5, especially preferably less than pH 7.6, most preferably more basic than pH 7.7.
  • the pH during the culturing process of the process according to the invention is at least in four fifths (4/5) of the total cultivation time of the process according to the invention more basic than pH 7.2, preferably more basic than pH 7.3, more preferably more basic than pH 7.4 more preferably more basic than pH 7.5, more preferably more basic than pH 7.6, most preferably more basic than pH 7.7.
  • the total cultivation time of the method according to the invention starts when a culture vessel is inoculated with cells in the production stage. So the intermediate stages of a cell cultivation to expand cells for the production stage does not count towards the total cultivation time.
  • the pH at the end of the culture process of the process according to the invention is more basic than pH 7.2, preferably more basic than pH 7.3, more preferably more basic than pH 7.4, more preferably basic than pH 7.5, particularly preferably more basic as pH 7.6, most preferably more basic than pH 7.7.
  • the pH of the process according to the invention is preferably at most 7.8, more preferably at most 8.0.
  • the invention also relates to a method for producing a nutrient medium according to the invention, in particular a cell culture medium according to the invention, wherein at least one substance selected from the group consisting of citric acid, succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, Tartaric acid, adipic acid, lactic acid and mixtures thereof and salts, derivatives or complexes of these acids, in water or a cell culture solvent or Nährmediumlierestoff, in particular a cell culture medium solvent, or a conventional nutrient medium, in particular cell culture medium, is dissolved or become.
  • the invention also relates to a method for producing a nutrient medium according to the invention, in particular a cell culture medium according to the invention, wherein at least one substance selected from the group consisting of citric acid, succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, Tartaric acid, adipic acid, lactic acid and mixtures thereof and salts or complexes of these acids, in water or a cell culture solvent or Nährmediumlierestoff, in particular a cell culture medium solvent, or a conventional nutrient medium, in particular cell culture medium is dissolved or become.
  • the invention also relates to a method, in particular a method according to the invention for cultivating a cell culture, for the selection of a genetically modified, in particular metabolically optimized, cell from a cell population, wherein a) a cell culture is cultivated as cell population in a nutrient medium according to the invention for at least one week , more preferably from min. cultivated for at least four weeks; and then b) isolating the cell.
  • the isolated cell is a living cell.
  • the cultivation preferably takes place according to a cultivation method according to the invention.
  • the at least one cell isolated in step b) is transferred in a further step c) into a new culture medium.
  • the new nutrient medium is particularly preferably a fresh nutrient medium.
  • the new nutrient medium is particularly preferably a nutrient medium according to the invention.
  • the new nutrient medium is particularly preferably a nutrient medium not according to the invention, ie a nutrient medium from the prior art.
  • the at least one cell isolated in step b) is preferably expanded in step c).
  • the nutrient medium when carrying out the process according to the invention, preferably has a pH of more basic than 7.2, preferably more basic than pH 7.3, even more preferably less than pH 7.4, more preferably less than pH 7.5, in particular preferably more basic than pH 7.6, most preferably more basic than pH 7.7.
  • the nutrient medium in carrying out the process according to the invention, has a pH of more basic than pH 7.2, preferably more basic than pH 7.3, more preferably more basic than pH 7.4, at least in four fifths (4/5) of the total cultivation time more basic than pH 7.5, more preferably more basic than pH 7.6, most preferably more basic than pH 7.7.
  • the total cultivation time of the process according to the invention starts when a culture vessel is inoculated with cells in the production stage. So the intermediate stages of a cell cultivation to expand cells for the production stage does not count towards the total cultivation time.
  • the nutrient medium at the end of the cultivation process has a pH of more basic than 7.2, preferably more basic than pH 7.3, even more preferably less than pH 7.4, more preferably less than pH 7.5, especially preferably more basic than pH 7.6, most preferably more basic than pH 7.7.
  • the pH is preferably at most 7.8, more preferably at most 8.0.
  • the at least one cell is preferably subcultured for at least one passage, more preferably at least 2 passages, most preferably for at least 5 passages. According to the invention, the at least one cell is preferably subcultured until a split ratio of greater than 1 to 4 is reached.
  • the invention also relates to a selected cell obtainable from a process according to the invention.
  • the cell can metabolize lactate as a carbon source.
  • the cell preferably has a split ratio of at least 1 to 4 with galactose as sole carbon source.
  • the cell preferably has a split ratio of at least 1 to 4 in a glucose- and glutamine-free medium.
  • the growth rate ( ⁇ ) of the cell is less than 24 hours, particularly preferably less than 20 hours, more preferably less than 18 hours.
  • the invention also relates to a cell culture which contains at least one cell according to the invention.
  • the cell culture can metabolize lactate as a carbon source.
  • the cell culture preferably has a split ratio of at least 1 to 4 with galactose as sole carbon source.
  • the cell culture in a glucose- and glutamine-free medium preferably has a split ratio of at least 1 to 4.
  • the growth rate ( ⁇ ) of the cell culture thus isolated is less than 24 hours, more preferably less than 20 hours, particularly preferably less than 18 hours.
  • the invention also provides a process for obtaining a biological product from at least one cell, wherein the at least one cell is cultured according to a method according to the invention and the biological product is obtained therefrom.
  • the substances found according to this aspect of the invention are especially succinic, malic, ⁇ -keto-glutaric, fumaric, oxaloacetic, isocitric, succinic, tartaric, adipic and lactic acids.
  • citric acid may also belong to these substances.
  • the substances required according to this aspect of the invention can in particular be added individually in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, preferably they are combined, that is some or all of them. But also preferred is the combination with other carbohydrates.
  • the suitable carbohydrates are preferably selected from mono- and disaccharides such as glucose, galactose, glucosamine, fructose, ribose, mannose, sucrose, lactose. One can choose one or more of these carbohydrates as a source of carbohydrate.
  • the substances required according to this aspect of the invention can be used in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium which contains glutamine or which is glutamine-free or contains low glutamine concentration, for example less than 8 mM, or the nutrient medium, especially cell culture medium, may include glutamine substitutes, for example alanyl glutamine or glycyl glutamine or the nutrient medium, in particular cell culture medium, may include a mixture of several glutamine-containing peptides.
  • the substances required according to this aspect of the invention can preferably be used in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, which contains asparagine or asparagin substitutes.
  • concentration of asparagine or the asparagine substitute may preferably be, for example, higher than 0.05 g / l, more preferably higher than 0.15 g / l, even more preferably higher than 0.3 g / l, most preferably higher than 0.6 g / l.
  • Asparagine substitutes may preferably be, for example, asparagine-containing peptides, for example but not limited to leu-asn (Sigma, catalog number: L0641), or ile-asn (Sigma, catalog number: I3635), or glu-asn-gly (Sigma, catalog number: P5148).
  • the peptides may preferably contain in principle 2 amino acids or more than 2 amino acids, in particular 3 or 4 amino acids.
  • the substances required according to this aspect of the invention can preferably be used in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, which contains glutamate or glutamate substitutes.
  • concentration of glutamate or glutamate substitutes may preferably be, for example, higher than 0.05 g / l, more preferably higher than 0.15 g / l, even more preferably higher than 0.3 g / l, most preferably higher than 0.6 g / l.
  • Glutamate substitutes may be preferred, e.g.
  • Glutamate-containing peptides for example but not limited to Asp-Glu (Sigma, catalog number: A1916-250MG), Glu-Glu (Sigma, catalog number: G3640-25MG), Glu-His (Sigma, catalog number: G6882-100MG), Glu Leu (Sigma, catalog number G7007-10MG), Glu-Lys (Sigma, catalog number: G5136-25MG).
  • the peptides may preferably contain in principle 2 amino acids or more than 2 amino acids, in particular 3 or 4 amino acids.
  • the invention also solves the problem on which it is based by providing a nutrient medium, a cell culture or a method for improving or prolonging the process duration of the cell growth of a cell culture comprising at least one cell an aqueous system, preferably according to the invention in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, whereby cell growth is improved by adding the abovementioned substances, preferably in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium.
  • the invention provides a nutrient medium, a cell culture and a method for achieving higher cell growth or for prolonging the cell vitality or for reducing the metabolic by-product formation of a cell culture comprising at least one cell in an aqueous system, preferably in a nutrient medium according to the invention in a cell culture medium, cell growth being improved by the addition of the organic acids in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium.
  • the nutrient medium is characterized in that the nutrient medium preferably contains an organic acid or salts thereof.
  • the addition of the substances according to the invention increases cell growth and / or product formation, or prolongs the culture time and / or reduces the formation of metabolic by-products.
  • the cell culture is characterized in that the cell culture can survive or divide in a medium with substances according to the invention or the highest cell concentration reached is increased, or the stationary growth phase is prolonged or the dying phase is slowed down, or the formation of cell metabolic by-products, for example, ammonium or lactate is reduced, which medium may preferably include low glutamine concentration or no glutamine, and may include high asparagine concentration, May contain glucose or other carbohydrates, in particular glucose-free or contains galactose. Instead of the high aspartic concentration, a high concentration of glutamate may preferably also be included.
  • Cell growth according to the invention is the growth of the cell culture, primarily but not exclusively caused by at least one cell division of at least one cell. If the cell growth is increased, this is primarily caused by an increase in the cell division frequency (cell growth rate, also called ⁇ ).
  • cell growth rate also called ⁇
  • the stationary growth phase of a cell culture is a typical growth phase of a growth curve of a cell culture known to those skilled in the art.
  • This growth curve includes a start-up phase, an exponential growth phase, a stationary growth phase and a dying-off phase.
  • the course of these phases can vary. Also, the course and duration of these phases can be influenced, for example by adding the substances according to the invention in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium.
  • the integral of the living cell concentration is meant the living cell concentration over a certain period of time (Renard, JM, et al., Biotechnology Letters, 1988, 10 (2): 91-96).
  • the integral of the living cell concentration is thus in particular the number of all living cells over a process period, in particular over the period of cell cultivation.
  • the integral of the live cell concentration can be changed either by the number of cells or by the duration of the process.
  • Preferably according to the invention by a nutrient medium according to the invention or Method an enlargement of the integral of the living cell concentration.
  • cell growth is enhanced or the peak cell density achieved is increased, or the steady state growth phase is prolonged or the staging phase is slowed, or the formation of cell metabolic by-products, for example ammonium or lactate, is reduced.
  • cell metabolic by-products for example ammonium or lactate
  • the process according to the invention is preferably a batch process, a split-batch process (repeated batch operation), a fed-batch process, a continuous process or a perfusion process.
  • the cell culture comprising at least one cell is preferably used for producing a biological product.
  • the biological product is preferably selected from at least one polypeptide, at least one protein, at least one virus constituent, at least one virus or from a mixture of these.
  • the biological product is preferably at least one vaccine.
  • prokaryotic cells for example bacteria
  • eukaryotic cells for example yeast cells or plant cells
  • animal cells preferably mammalian cells
  • the gene of the product to be produced may occur naturally or recombinantly in the host cells.
  • the product spectrum may vary from peptides with niger amino acids to whole viruses.
  • animal cells are preferably used.
  • the biological product is preferably obtained from cell culture and / or from the cell culture supernatant, or from the cells (intracellularly) themselves.
  • the biological product may also be the cell itself, for example it may be a primary cell, a stem cell, a primary cell aggregate, a tissue constituent, or a complete tissue.
  • the at least one cell preferably contains at least one gene which codes for the biological product.
  • the gene can be a foreign gene, ie a gene that is naturally occurring
  • the gene can be a cell-derived gene naturally occurring in the cell
  • Production cell occurs.
  • a cell-specific gene can, for example, be active or inactive in the production cell. If the cell's own gene was inactive, the gene may have been activated by external access.
  • the invention also provides a method for cultivating at least one cell as cell culture, wherein the at least one cell is cultivated in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, and according to the invention is preferably stimulated in its cell growth according to a method according to the invention.
  • the invention also provides a method for obtaining a biological product from at least one cell, wherein the at least one cell is cultured according to a method according to the invention and the biological product is obtained therefrom.
  • the present invention differs from the teachings of EP 0 435 911 B1.
  • higher glutamine concentration greater than 8 mM
  • the present invention preferably claims a reduced glutamine concentration, in particular a glutamine-free nutrient medium.
  • EP 0 435 911 B1 these substances are expressly used in a medium having a glutamine concentration of greater than 8 mM, because this is the invention of this publication.
  • the substances according to the invention are used as modulators of the metabolism.
  • the substances may be preferably used in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, which contains carbohydrates and / or glutamine.
  • the organic acids can also preferably be used in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, which contains no carbohydrates and / or glutamine.
  • the main energy and carbon sources of the cells are glucose and glutamine, so that the substances in the low concentration have no significance as a metabolic modulator.
  • lactate just one of the most well-known metabolic by-products of cells, namely lactate, promotes cell growth and the integral of the living cell concentration.
  • lactate is a metabolite byproduct and is even toxic to the cells.
  • lactate has a positive effect on cell growth when the nutrient medium, in particular the cell culture medium, containing no glutamine or containing low concentration of glutamine, for example containing a glutamine concentration of less than 8 mM, or if glutamine has been replaced with glutamine-containing glutamine substitutes, or if the medium contains asparagine, especially if asparagine in higher concentration
  • the asparagine concentration is greater than 0.3 g / l, or if asparagine has been replaced with asparagine-containing substitutes, or if the medium contains glutamate, especially if the glutamate concentration is greater than 0.3 g / l, or if glutamate with glutamate-containing substitutes, or the medium has been formulated with or without glucose, especially if the medium is glucose-free, especially if the medium contains galactose.
  • the positive effect of lactate is particularly evident when the medium does not contain glutamine and contains carbon hydride carbohydrates other than glucose, especially when the medium
  • a preferred aspect of the invention thus relates to a nutrient medium, in particular a cell culture medium, for culturing a cell, or for obtaining a polypeptide, a protein or a vaccine (for example a virus) from organisms, in particular from cells or cell cultures, preferably from eukaryotic cells or Cell cultures, wherein the organisms are cultured in a suitable medium and the desired polypeptide or protein or the vaccine from the organisms and / or the culture supernatant is obtained, characterized in that the cell growth by the addition of citric acid, succinic acid, malic acid, ⁇ -keto Glutaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, tartaric acid, adipic acid, lactic acid and Mixtures thereof and salts or complexes of these acids in a nutrient medium, in particular in a cell culture medium, is stimulated.
  • a nutrient medium in particular a cell culture medium, for
  • a second preferred aspect of the invention relates to a method for cultivating a cell, or for obtaining a polypeptide, protein or vaccine (for example a virus) from organisms, especially from cells or cell cultures, preferably from eukaryotic cells or cell cultures, said organisms are cultured in a suitable medium and the desired polypeptide or protein or vaccine is recovered from the organisms and / or the culture supernatant, the process being characterized in that the organisms are contacted with a nutrient medium containing at least one of the following substances: Citric acid, succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, tartaric acid, adipic acid, lactic acid and mixtures thereof and salts or complexes of these acids.
  • a nutrient medium containing at least one of the following substances: Citric acid, succinic acid, malic acid, ⁇ -keto-glutari
  • the growth stimulation particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium is achieved by the nutrient medium being glutamine-poor, for example a glutamine concentration of less than 8 mM, preferably less than 5 mM, particularly preferably less than 3 mM , most preferably less than 2 mM.
  • the growth stimulation particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium, in particular into the cell culture medium, becomes achieved in that the nutrient medium and / or feed medium is free of glutamine.
  • the growth stimulation which is particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium is achieved by including the nutrient medium glutamine-containing glutamine substitutes.
  • the glutamine-containing glutamine replacement substance concentration in nutrient medium is preferably at least 50 mg / l, more preferably at least 250 mg / l, particularly preferably at least 500 mg / l, most preferably at least 1000 mg / l.
  • the glutamine-containing glutamine substitute concentration in nutrient medium is preferably also at least 0.05 g / l, more preferably at least 0.2 g / l, more preferably at least 0.8 g / l, most preferably at least 3.2 g / l.
  • the particularly preferred growth stimulation according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium is achieved by including the nutrient medium asparagine or asparagine substitutes.
  • the asparagine or asparagine replacement concentration in the nutrient medium is preferably at least 0.05 g / L, more preferably at least 0.15 g / L, more preferably at least 0.3 g / L, most preferably at least 0.6 g / L .
  • the growth stimulation particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium is achieved by including the nutrient medium glutamate or glutamate substitutes.
  • the glutamate or glutamate substitution concentration in the nutrient medium is preferably at least 0.05 g / l, more preferably at least 0.15 g / l, more preferably at least 0.3 g / l, most preferably at least 0.6 g / l.
  • the growth stimulation particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium is achieved by the nutrient medium being glucose-free.
  • the growth stimulation particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium is achieved by the nutrient medium containing galactose.
  • the galactose concentration is at least 0.1 g / l, preferably at least 1 g / l, more preferably at least 5 g / l, most preferably at least 25 g / l.
  • the growth stimulation which is particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium is achieved by the fact that the nutrient medium contains lactate.
  • the lactate concentration is at least 0.1 g / l, preferably at least 1 g / l, more preferably at least 5 g / l, most preferably at least 25 g / l.
  • the growth stimulation particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium is achieved by the nutrient medium and / or feed medium being free from glutamine or glutamine-containing substitutes.
  • the growth stimulation particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium, in particular into the cell culture medium, is achieved by the fact that the feed medium contains glutamine-containing glutamine Substitutes included.
  • the glutamine-containing glutamine replacement substance concentration in the feed medium is preferably at least 0.2 g / l, more preferably at least 1 g / l, more preferably at least 5 g / l, most preferably at least 10 g / l.
  • the growth stimulation particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium, in particular into the cell culture medium, is achieved by the fact that the feed medium contains asparagine or asparagine substitutes.
  • the asparagine or asparagine substitute concentration in the feed medium is preferably at least 0.2 g / l, preferably at least 1 g / l, more preferably at least 5 g / l, most preferably at least 10 g / l.
  • the particularly preferred growth stimulation in accordance with this aspect of the invention by adding the abovementioned substances into the nutrient medium, in particular into the cell culture medium, is achieved by the fact that the feed medium contains glutamate or glutamate substitutes.
  • the glutamate or glutamate substitution concentration in the feed medium is preferably at least 0.2 g / l, more preferably at least 1 g / l, more preferably at least 5 g / l, most preferably at least 10 g / l.
  • the growth stimulation particularly preferred according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium, in particular into the cell culture medium, is achieved by the fact that the feed medium contains lactate or lactate derivatives.
  • the lactate. or lactate derivative concentration in the feed medium is preferably at least 1 g / l, more preferably at least 5 g / l, more preferably at least 25 g / l, most preferably at least 100 g / l.
  • the particularly preferred growth stimulation according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium, in particular into the cell culture medium, is achieved by the fact that the feed medium is glucose-free.
  • the glucose concentration in the feed medium is preferably not more than 100 g / l, preferably not more than 25 g / l, more preferably not more than 5 g / l, most preferably not more than 1 g / l.
  • the particularly preferred growth stimulation according to this aspect of the invention by adding the above-mentioned substances into the nutrient medium, in particular into the cell culture medium, is achieved by the fact that the feed medium contains galactose.
  • the galactose concentration in the feed medium is preferably at least 1 g / l, preferably at least 5 g / l, more preferably at least 25 g / l, most preferably at least 100 g / l.
  • a third aspect of the invention relates to a cell or a cell culture, which is characterized in that the cell culture in a medium with substances according to the invention can survive or share or whose peak cell density is increased, or their stationary growth phase is prolonged or their Absterbephase is slowed down or their formation of cell-metabolic by-products, for example ammonium or lactate is reduced.
  • the substances according to the invention Due to the stimulation of growth by the addition of the substances according to the invention into the nutrient medium, in particular into the cell culture medium, it can be preferred according to the invention in the case of a Cell density fermentation (highest achieved total cell concentration during fermentation, for example, in particular> 1x10 5 cells / ml, preferably> 1x10 6 cells / ml on a large scale (working volume> 1 I, for example 30 - 20 000 I) the highest cell concentration reached (peak cell density ), or prolonging the stationary growth phase, whereby the cell vitality remains high for a longer time, ie, the integral of the living cell concentration is increased and thereby the product yield is increased.
  • a Cell density fermentation highest achieved total cell concentration during fermentation, for example, in particular> 1x10 5 cells / ml, preferably> 1x10 6 cells / ml on a large scale (working volume> 1 I, for example 30 - 20 000 I) the highest cell concentration reached (peak cell density ), or prolonging the stationary growth
  • the method according to the invention is in principle suitable for the preparation of any desired polypeptides, proteins or vaccines, for example for virus production.
  • polypeptides which may be glycosylated or unglycosylated.
  • the polypeptides may be, for example, natural, human polypeptides or recombinant variants of human polypeptides.
  • the nutrient medium according to the invention is preferably suitable for the preparation of the polypeptides with post-translational modifications, in particular for the production of glycoproteins.
  • the addition of the substances according to the invention into a nutrient medium, in particular into a cell culture medium can promote or inhibit certain glycosylation pathways and thus be conducive to the formation of a desired glycostructure of the desired polypeptide or vaccine.
  • the substances according to the invention can promote or inhibit specific post-translational modification in the cell individually or in combination with one another, with the result that the desired polypeptide variants or vaccine variants are expressed during production.
  • the substances according to the invention can increase the protein dialysis or the protein salicylation.
  • the pH of the cell culturing process runs very atypically at the upper end of the nominal value. It is common in cell culturing processes that the pH of the process starts at pH 7.0 to pH 7.1, and that the cells secrete acids, in particular lactate, into the culture through their metabolic activities. As a result, the pH of the culture normally shifts towards the acidic region. It has surprisingly been found that the pH value shifts towards basic pH values when using the cell culturing process according to the invention because of the altered metabolism of the cells. This may be related to the theory that the cells have a better metabolism and no longer excrete acids into the culture. Conversely, they metabolize acids.
  • the pH of the culture is at pH values above 7.2 (higher than pH 7.2 or in other words more basic than pH 7.2).
  • This is useful for protein glycosylation, for example, but not limited to protein alkali lactation or protein dialysis.
  • Some intracellular glycosylation enzymes are more basic at pH values more basic than 7.2, so that they glycosylate the proteins to be produced higher. This is an important process property, which is caused by the metabolism of the substances according to the invention.
  • a fourth aspect of the invention is a culturing method using the aforementioned culture media, wherein the pH of the cell culturing process is preferably more basic than pH 7.2, especially more basic than pH 7.3, more preferably less than pH 7.4, more preferably more basic than pH 7.5, more preferably more basic than pH 7.6, most preferably more basic than pH 7.7.
  • the method according to the invention is basically suitable for culturing prokaryotic cells, for example bacteria, or eukaryotic cells, for example yeasts or animal cells.
  • prokaryotic cells for example bacteria, or eukaryotic cells, for example yeasts or animal cells.
  • non-mammalian cells are cells of Spodoptera frugiperda, Aedes aegypti, Aedes albopictus
  • preferred organisms for this invention are mammalian cells
  • the mammalian cells may be primary cells, but continuous cell lines are preferred
  • suitable continuous cell lines may be of human origin, for example, PER-C6, human liver cells (Hep G2, HB 8065), human lung cells (W138, ATCC CCL 75), human cervical carcinoma cells (HeLa, ATCC CCL 2
  • the continuous cell lines may also have an animal origin, for example derived from mouse or hamster, for example SV-40 immortalized monkey kidney cells (COS-7, ATCC CRL 1651), canine kidney cells (MD
  • CHO-DUKX or CHO-K1 with ATCC number of ATCC CCL 61), lymphocytic cells (Jurkat T-cell line), buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442 ), mouse mammary tumor cells (MMT 060562, ATCC CCL 51), SP2 / 0 cells, myeloma cells (for example NS0), hybridoma cells and trioma cells.
  • the hybrid cell lines may be from any species, including human and mouse.
  • the derivatives of the above-mentioned cells are also suitable in Cultivation in nutrient media according to the invention and methods according to the invention.
  • the preferred cells according to this invention are from a mammalian cell line and are not hybridoma cells.
  • the cell lines particularly preferred according to the invention are all variants of the CHO, NSO, PERC-6 and BHK-21 cell lines, wherein the cell line is transformed with an exogenous nucleic acid, wherein the exogenous nucleic acid encodes the polypeptide of interest.
  • Exogenous nucleic acid means a nucleic acid sequence that does not occur in the host cell
  • the exogenous nucleic acid may also be homologous to a nucleic acid of the host cell, but is not normally found in the host cell in that position.
  • the cells preferred according to this invention are capable of being able to rub or divide in the media with substances and methods of the invention, or whose highest cell concentration is increased, or their stationary growth phase is prolonged or their dying phase is slowed down or their formation of cell-metabolic by-products, for example, ammonium or lactate is reduced.
  • the metabolism of the cells can be adapted in media with substances according to the invention or in methods according to the invention. This adaptation can be done by targeted molecular biological modification of the cells or by the adaptation of the cells in the media and methods of the invention.
  • clone means a derivative of a parent cell, for example, one of the cell lines counted above
  • a clone can arise when a cell has other cellular properties and is different from a cell different from the original mother cell.
  • clones can arise after a gene transfer of the parent cell, for example by transfection.
  • metabolic optimization means adapting or altering cellular metabolism to the desired conditions Adapting or altering cellular metabolism can be achieved by targeted genetic intervention into the host cell by cloning certain genes into the cell or by shutting down certain genes. Or, adaptation or alteration of cell metabolism can be achieved by cultivating the cells under the desired process conditions and / or in nutrient media so that the cell itself adapts to the altered conditions. "" Culturing under the new conditions allows novel cells The genetic modification is manifested, for example, by a change, in particular an improvement in cell metabolism, in particular those cells with such an altered cell metabolism growing in comparison to conventional ones cells under the desired conditions, since their metabolism has been optimized.
  • a product according to the invention is a polypeptide, a protein or a virus which is expressed in the cells and harvested from the cultivation system, ie the cells and / or the cell medium. It can be any protein of interest. They may be, for example, diagnostic or therapeutic proteins, such as interleukins, enzymes, multimeric proteins or subunits of the multimeric proteins, as well as antibodies or antibody fragments.
  • the recombinant gene for the protein of interest may include a signal sequence responsible for the secretion of the protein of interest from the host cell.
  • the protein can be expressed from a transgenic promoter or its naturally active gene locus, as well as an immunoglobulin gene locus in hybridoma cells.
  • the protein may also be expressed from a host promoter, for example, if a CHO cell is used for protein production, the foreign gene may be expressed from a CHO promoter.
  • the product may also be a vaccine, for example a virus or virus-like particle capable of replicating with the aid of a host cell.
  • the cells to be cultured can grow adherently or on microcarriem, but cells growing in suspension are preferred. Furthermore, the cells can grow in serum-containing culture media (for example in fetal bovine serum, FBS, also called FCS serum), but a medium which contains no serum and is called "serum-free" is preferred.Cells in serum-free media can be insulin Transferrin may be at least partially replaced by alternatives, for example by iron citrate Most cell lines require one or more growth factors comprising the recombinant polypeptides or proteins as growth factor
  • the medium may include but is preferably polypeptides When the medium comprises a polypeptide, a recombinantly produced polypeptide is preferred
  • the medium may include peptones which may be of animal origin, but preferably peptones having yeast as the origin are more preferred are the Peptones derived from plants. Preferably, culture media are used which are peptone-free and fully chemically defined.
  • nutrient medium which is also known to the person skilled in the art as “culture medium” or “cell culture medium”, is understood as meaning a medium which serves to store and / or cultivate cell cultures or at least one cell As an umbrella term for all media, the term “nutrient medium” is introduced here.
  • Nursing medium includes, for example, but not limited to, the terms “basal medium” (culture medium), “feeding medium” (feed medium), and “perfusion medium.”
  • nutrient medium is a liquid containing nutrients for cells
  • the substances according to the invention do not occur in a nutrient medium, instead they are added externally into the culture from another solution, for example from a stock solution into a nutrient medium with or without cells.
  • the substances according to the invention do not come into direct contact with the cells via a nutrient medium, in particular via a cell culture medium, but in a process for contacting the cells with substances according to the invention "or" basal medium "is a medicine m, in particular a culture fluid, which promotes cell growth and / or cell vitality and / or product formation.
  • the culture medium is liquid.
  • a high cell density cell culture medium is preferably used, by means of which, a population of animal Cells can be achieved in a given period of cultivation with a living cell concentration of at least 1x10 5 / ml, preferably at least 1x10 6 / ml, to provide necessary nutrients.
  • Culture media that provide such high cell densities with nutrients are supplemented with the following exemplary substances: At least one amino acid, more usually several amino acids to all amino acids including cystine.
  • At least one energy source usually a carbohydrate source, for example glucose, inorganic salts, vitamins, for example vitamin C and / or vitamin E.
  • Trace elements also defined as inorganic components, which occur in micromolar concentrations.
  • Buffers up to four nucleosides or nucleotides, antioxidants and glutathione.
  • Lipids for example cholesterol, phosphatidylcholine or lipid precursors, for example choline or inositol.
  • a high cell density medium is preferably added with at least one of the above-enumerated components and may include the above enumerated components in high concentrations.
  • the nutrient medium in particular the cell culture medium, may optionally be supplemented with one or more or all components of the following categories: a) hormones and other growth factors, for example IGF-1, insulin, transferrin, epidermal growth factor b) salts and buffers, for example calcium , Magnesium, and phosphates c) nucleosides and bases, for example adenosine, thymidine, hypoxanthine d) protein and tissue hydrolysates.
  • the formulation of the culture media to which substances according to the invention can be added may preferably correspond to one of the published formulations.
  • the media formulations can preferably be used in the published manner, but often they are modified and adapted to the requirements of the cell used.
  • Suitable published culture media formulations are Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, L-15 Medium, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Eagle's Minimal Essentail Medium (MEM) 1 Ham's F12 Medium, or Iscove's Modified DMEM. These published media formulations may be used alone or in admixture in any mixing ratio as the basal media powder.
  • the formulation of the culture media to which the substances according to the invention can be added can particularly preferably be a commercial nutrient medium whose formulation has not been published, for example but not limited, CD-CHO medium from GIBCO, Ex-CeII 325 PF CHO medium from Sigma (Cat No .: 14340C).
  • Feed Medium or “Feed Medium” is a medium that is added to the culture system during cell culture, ie, feed media are added to culture systems after the cells have come into contact with another medium, for example a culture medium (basal medium).
  • Feed media include substances that promote cell growth and / or cell vitality and / or product formation. By adding the feed media, the process time can be extended because cell vitality can stay high for longer.
  • the feed media may include one or more sources of energy, for example, carbohydrates, for example, glucose. Glucose can be contained in the feed medium or separated from another stock solution into the cultivar. be fed.
  • the feed medium may include one or more amino acids.
  • Feed media may include only essential amino acids or only non-essential amino acids, or even a mixture of the two amino acid groups.
  • the feed medium may include glutamine, or be glutamine-free, or contain glutamine substitutes, or include glutamine-containing glutamine ingredients, or may include a mixture of glutamine and glutamine-containing glutamine substitutes. Glutamine can thus be combined in the feed medium with other substances, or fed separately from a stock solution as a single substance in the cultivation system.
  • Feed media may only be simple concentrates of the basal medium, but preferred are feed media that are more than simply concentrated, for example, twice or more concentrated forms of the basal medium.
  • Feed media formulas are similar to basal media formulations, meaning that the feed media typically contains the same or some of the substances found in basal media.
  • Feed media may differ from basal media in their inorganic components. They may be, for example, a basal medium without salts, or a low-salt variant of the basal medium. Feed media may also include substances that are not found in basal media formulations.
  • glutamine-containing substances substances which contain D- or L-glutamine, in particular L-glutamine in one molecule. This molecule can carry D- or L-glutamine in a wide variety of ways For example, but not limited to, glutamine may be covalently bound to another substance, particularly as “glutamine-containing substances", “glutamine derivatives”. or “glutamine-containing glutamine substitutes” are meant peptides or oligopeptides from D- or L-glutamine (Roth, E.
  • glutamine-based dipeptides for example, alanyl-glutamine (Ala-GIn) or glycyl-glutamine (Gly-GIn) (Christie, A. and Butler, M., Journal of Biotechnology, 1994, 37 (3): 277-90; Sanfeliu , A. and Stephanopoulus, G., Biotechnol., And Bioeng., 1999, 64 (1): 46-53; (Kurano, N., et al, J. Biotechnology, 1990, 15: 113-128).
  • the term "glutamine-containing substances” is also described in WO 03/106661 (page 7, line 1).
  • asparagine substitutes substances which contain D- or L-asparagine, especially L-asparagine in a molecule .
  • This molecule may contain the D- or L-asparagine Asparagine substitutes, "asparagine derivatives” or “asparagine-containing asparagine substitutes” can be peptides or oligopeptides from D or L.
  • asparagine substitutes "covalently bound" with another substance Asparagine meant.
  • the peptides may in principle contain 2 or more than 2 amino acids.
  • glutamate substitutes substances which contain D- or L-glutamate, in particular L-glutamate in one molecule Glutamate in a variety of ways, for example but not limited to GIu tamate be covalently bound with another substance.
  • glutamate substitutes mean peptides or oligopeptides from D- or L-glutamate, for example, but not limited to Asp-Glu (Sigma, catalog number: A1916- 250MG) 1 Glu-Glu (Sigma, catalog number: G3640-25MG), Glu-His (Sigma, catalog number: G6882-100MG), Glu-Leu (Sigma, catalog number: G7007-10MG), Glu-Lys (Sigma, catalog number: G5136-25MG)
  • the peptides may in principle contain 2 or more than 2 amino acids.
  • lactate substitutes or "lactate-containing lactate substitutes” or “lactate derivatives” is meant substances containing D- or L-lactate in one molecule, for example but not limited to iron (II) lactate hydrates (Sigma , Catalog number: 44953), or manganase (II) lactate trihydrate (Sigma, catalog number: 13227) or lactose.
  • the molecule may contain the D- or L-lactate in a variety of ways, but for example but not limited to lactate with another substance Bound, but not limited, for example (+) ethyl D-lactate (Sigma, catalog number: 69796) .
  • Lactate derivatives are also molecules that can easily be converted intracellularly into lactate, for example but not limited to pyruvate or the like Alanine, in which case pyruvate can be added to the nutrient medium Extracellular pyruvate is easily transported into the cell and converted into lactate by pyruvate dehydrogenase In the case
  • alanine-containing peptides are also defined as "lactate derivatives".
  • the term “split ratio” also called “dilution factor” is a measure to express the split ratio of two liquids. When two liquids are to be mixed together to achieve a target concentration, the solutions are mixed in proportion to each other with a split ratio. Split ratio is explained by the following example: A cell culture was inoculated in a culture vessel with a cell concentration of 2 ⁇ 10 5 / ml and allowed to grow for 3 days. On the third day, the cell concentration of 20 ⁇ 10 5 / ml was measured.
  • This culture is diluted with fresh medium so that the Zielanimpfkonzentration of 2 x 10 5 / ml is reached again. In this case, dilute the mature culture (inoculum) 1:10 with fresh medium. If you have a working volume of 1 I in the new culture, you have to take 100 ml of inoculum and 900 ml of fresh medicine. In this case you would have a split ratio of 1:10.
  • a preferred method according to the invention is a high cell density method.
  • the high cell density cell culture method is defined as a method in which a living cell concentration of at least 1 ⁇ 10 5 / ml, preferably at least 1 ⁇ 10 6 / ml is achieved in a certain period of cultivation, wherein the culture is from a single cell or from another cell culture or can be expanded from an inoculum.
  • Preferred methods according to the invention are continuous culture, fed-batch, batch, perfusion or split-batch processes.
  • the cultivation is preferably carried out in batch process, wherein all components for cell cultivation are presented at the beginning of the process in the culture vessel.
  • the cells are inoculated in a suitable medium and harvested after a certain culture time. Subsequently, the desired product, for example a polypeptide, is isolated from the culture.
  • a method which is particularly preferred according to the invention is a fed-batch method in which the cells are contacted with another nutrient medium, for example a feed medium, between the inoculation and the end of the process.
  • the fed-batch process does not start with a limited basal medium.
  • basal medium the cells are inoculated.
  • this nutrient medium may be a feed medium (feed medium).
  • the feed medium may be added to the cell culture batchwise, at intervals or continuously over a set dose. Thus, the volume of culture during cultivation increases.
  • Another culture method suitable according to the invention is perfusion, in which the cells are supplied, after a growth phase in a culture medium, with further fresh medium, for example with perfusion medium, while the spent medium, with or without cells, is withdrawn from the process.
  • Perfusion media can differ from culture media (basal media), or the same basal medium can also be used as a perfusion medium.
  • the cells are first inoculated into a basal medium.
  • the cells are separated from the cell culture (cell suspension) and, on the one hand, the spent medium is withdrawn from the process; on the other hand, new nutrients are made available to the cells by fresh medium.
  • perfusion If cells are retained in the culture system during the process, this is called “perfusion.” If cells from the system with the spent medium are also removed during the process, this is called a “continuous process.” In perfusion processes, the cells can also be removed from the culture system at certain intervals in order to be able to maintain a maximum cell concentration. This process is known to those skilled in the art as "bleeding.” Cell separation is by different technologies, with some technologies indirectly promoting cell separation Examples of some potential cell separation methods include filtration, cell capsulation, cell adherence to microcarriers, cell sedimentation, or centrifugation.
  • Another method suitable according to the invention is the split-batch method (repeated batchwise operation) with or without addition of the cells.
  • this procedure after a growth phase, part of the cell suspension is harvested and the remainder of the cell suspension is left in the fermentor as the inoculum of the next batch operation. The fermenter is then filled with this inoculum again to the desired working volume with fresh medium and thus starts the second batch mode operation.
  • the term “harvest” or "cell harvest” is an indication of the end of a production batch in upstream process.
  • the upstream process can end up with only one harvest, while in split-batch, perfusion, and continuous processes, there can be multiple harvests.
  • the cell culture process may include a lag phase, an exponential phase, a stationary phase, and a stalling phase.
  • the fermentation process can be stopped in one of these growth phases.
  • the fermentation process is preferably ended in the stationary phase or in the staging phase.
  • the cells are separated from the suspension. This cell separation process is called “harvesting” or “cell harvesting” here. After the cell harvest further purification steps are carried out in order to isolate the product.
  • the term "inoculation” means inoculating a new culture system (for example, a bioreactor and a suitable nutrient medium, especially a cell culture medium) with cells.
  • the inoculum ie the cells or cell suspension, are prepared in advance for this purpose the cells to be inoculated expand before the actual production process, so that one has enough cells to be able to animate the new cultivation system with the desired cell concentration.
  • cell growth is meant an increase in the live cell concentration at least in one of the cultivation phases.
  • cell vitality expresses the ratio of living cell concentration the total cell concentration, which also includes the dead cells. This ratio can be calculated in any way.
  • One method is to label the cells with a dye and thus differentiate the living and dead cells.
  • An example of distinguishing the dead and living cells is the use of tyrpan blue dye.
  • the labeled cells are then counted and the number of dead and living cells determined.
  • the cell vitality is calculated, in which the relationship between the jadzelliere and the total cell number is formed.
  • osmolality is a measure of the osmotic pressure of the dissolved particles in an aqueous solution.
  • the dissolved particles include both the ions and the non-ionized molecules.Osmolarity is expressed as the concentration of the osmotically active particles dissolved in 1 kg Water (1 mOsmol / kg H 2 O at 38 ° C is equivalent to an osmotic pressure of 19 mm Hg.)
  • osmolarity means the number of particles dissolved in 1 L of solution.
  • Substances that are found in culture media and that increase the osmolality of the solution are therefore, for example, proteins, peptides, amino acids, non-metabolizable polymers, vitamins, ions, salts, sugars, metabolites, organic acids, lipids, etc.
  • Solutions with a pH value below 7.0 react more acidically, with a pH of 7, They are neutral for solutions with a pH greater than 7.0, and when comparing the pH values of two solutions, the solution with a higher pH is defined as "more basic” compared to the solution with lower pH, eg solution 1 has a pH of 6.8, Solution 2 has a pH of 7.0. In this case the solution 2 is more basic compared to solution 1.
  • pH values of the preparation processes can be measured in different ways. For example, but not limited, the pH of a bioreactor can be measured on-line with a pH electrode. Another method of determining the pH of the culture is an off-line sampling and detection of the pH with an external pH electrode.
  • FIG. 1 Growth data of metabolically optimized CHO cells in a nutrient medium according to the invention without glucose and without glutamine under routine strain maintenance.
  • FIG. 2 Growth curve of cells in nutrient medium according to the invention in comparison to a control in fed-batch method.
  • FIG. 3 Course of the lactate concentration during fed-batch cultivation.
  • FIG. 4 Ammonium formation during fed-batch cultivation.
  • FIG. 5 Course of the pH of a cultivation process. The pH values were measured off-line and during the cultivation, the pH of the process was not controlled.
  • FIG. 6 Growth behavior of wild-type cells (metabolically not optimized) in a fed-batch culture with basal media according to the invention and feed media in different combinations.
  • FIG. 7 Growth behavior of metabolically optimized cells in a fed-batch culture in basal medium according to the invention and with 2 different feed media.
  • FIG. 8 Growth behavior of metabolically optimized cells in a fed-batch culture in nutrient media according to the invention with and without sodium succinate.
  • FIG. 9 Course of the lactate concentration in nutrient media according to the invention with and without sodium succinate in a fed-batch culture.
  • Cells were stored in the gas phase of liquid nitrogen. One to two ampoules were thawed in 37 ° C preheated nutrient medium and transferred to spinner flasks, shake flasks or T-Falschen. In the first days of cultivation was depending on the clone a medium change.
  • cells were split into new medium either every other day or every third day or alternately two and three days, ie, a portion of the cell suspension was removed from the culture and a small portion of the cell suspension was inoculated. lum of the next culture. This inoculum was supplemented with fresh preheated nutrient medium. Cells were incubated for 2 atmosphere at 37 0 C in an incubator at a C ⁇ . An alternative to incubate cells was culturing in a brood room at 37 ° C, cells were maintained in culture for several passages in this manner. By a passage is meant a cultivation period of two to three days. At different times cell suspension was taken from the stock and used as an inoculum for experiments. The experiments were carried out in various culture systems, for example in spinner flasks, T-bottles, shake flasks, culture tubes or in controlled bioreactors.
  • a CHO cell line expressing an antibody was used.
  • the product concentration (antibody concentration) in the cell supernatant was determined by ELISA.
  • a CHO medium from Sigma (CR 1020, Lot: 64K2403) was used as the nutrient medium (basal medium) for the experiments. This is a serum-free, protein-free nutrient medium. It is a ready-made and sterile-filtered nutrient medium.
  • All substances according to the invention were obtained from Sigma and prepared from it stock solutions. From the stock solutions, the substances were added to the desired final concentration in culture tubes. The thus prepared different culture tubes were finally inoculated with the antibody-producing CHO clone with a target inoculum cell concentration (1-3 x 10 5 / ml). For this purpose, the appropriate amount of inoculum cells was calculated and centrifuged the required amount of inoculum cell suspension. The cell pellet was finally taken up in the appropriate volume of fresh nutrient medium without substances according to the invention (Sigma, CR 1020, Lot: 64K2403). As a result, the desired seed cell concentration was set in the cell suspension to be investigated.
  • the prepared cell suspension was proportioned in the culture tubes that were previously provided with the substances according to the invention.
  • the culture tubes were incubated at 37 0 C, and 8% CO 2 atmosphere with shaking.
  • the culture tubes were cultivated for 8-11 days by batch or fed-batch method.
  • the culture vessels were sampled at regular intervals, for example daily or every third day, to measure offline parameters. From the samples, metabolic parameters and cell concentrations were measured.
  • the cell concentration and the cell vitality were measured with a CeDex device.
  • the metabolic parameters (glucose, lactate, glutamine and ammonium) were determined with an analyzer (BioProfile 100).
  • Example 1 Batch experiment with the substances according to the invention
  • the substances according to the invention were tested in a batch process.
  • the nutrient medium or basal medium serum-free, protein-free CHO medium from Sigma CR 1020, Lot: 64K2403 had a glucose concentration of 4.7 g / l and a glutamine concentration of 1.5 mM (Table 1).
  • the nutrient medium serum-free, protein-free CHO medium from Sigma, CR 1020, Lot: 64K2403 had a glucose concentration of 4.7 g / l and a glutamine concentration of 0.7 mM.
  • the feed medium used was from HyQ, (R05.2 Supplement, Cat. No: SH30584.04, Lot No: APF21457G).
  • the feed medium was without glutamine (Table 2).
  • Table 2 Results of the fed-batch experiment with the substances according to the invention
  • Table 3 Result of product determination of the selected substances. The absolute value of the control was set to 100%.
  • Example 3 Fed-batch experiment with the substances according to the invention and without glutamine in all culture media used
  • the nutrient medium serum-free, protein-free CHO medium from Sigma, CR 1020, Lot: 64K2403 had a glucose concentration of 4.7 g / L and it was glutamine-free.
  • the feed medium used was from HyQ, (R05.2 Supplement, Cat. No: SH30584.04, Lot No: APF21457G).
  • the feed medium was without glutamine (Table 4).
  • the substances according to the invention were tested under fed-batch conditions.
  • the nutrient medium serum-free, protein-free CHO medium from Sigma, CR 1020, Lot: 64K2403 had a glucose concentration of 4.7 g / l and a glutamine concentration of 4 mM.
  • the feed medium used was from HyQ, (R05.2 Supplement, Cat. No: SH30584.04, Lot No: APF21457G).
  • the feed medium was admixed with 3 g / l alanyl glutamine (AIa-GIn) and with 3 g / l with glycyl glutamine (Gly-GIn).
  • the feed medium was without glutamine (Table 5).
  • EXAMPLE 5 Routine Cultivation of the Metabolically Optimized Cells in the Stock Keeping with Substances According to the Invention in a Glucose-Free and Glutamine-Free Nutrient Medium (Basal Medium)
  • Basal Medium A glucose-free and glutamine-free commercial nutrient medium was obtained. This medium was increased according to Table 6 with substances of the invention and thus prepared the final nutrient medium. The concentration of the substances shown in Table 6 is the final concentration of the respective substances in the medium.
  • This nutrient medium corresponds to a serum-free, protein-free, peptone-free medium with substances according to the invention.
  • the ultimate culture medium for cell culture is glucose-free, glutamine-free, contains galactose and contains lactate.
  • Table 6 Composition of the nutrient medium (basal medium) for the routine cultivation of CHO cells with substances according to the invention in stock
  • the metabolically optimized CHO cells were cultured in shake flasks under batch conditions for strain maintenance. Cells were inoculated into the above nutrient medium with an inoculation cell concentration of 1-2 x 10 5 live cells per ml. The culture was incubated for 2 days at 37 0 C and at 7.5% pCO 2 atmosphere and on day 2, the culture was subcultured. For this purpose, the cell concentration was counted on day 2 and a culture vessel with the same seed cell concentration was inoculated in the same fresh medium. A cultivation period of two days was defined as a passage. The culture was cultivated in this way for several days and the live cell concentration at each passage, shortly before subculture. determined. The determined values were plotted in a diagram (FIG. 1).
  • the cells can grow well in the medium according to the invention.
  • Cells have a doubling time of 17.9 hours in the medium according to the invention.
  • Cells have a high split ratio of 1: 6.3 in a 2 day culture mode. If cells are groomed every 3 days, they have a split ratio greater than 1:10. This high split ratio or low doubling time is achieved in a serum-free, protein-free, pep tone-free, glucose-free, and glutamine-free medium.
  • the first nutrient medium that has been used is a commercial nutrient medium (basal medium).
  • This baiting medium is a glucose-free and glutamine-free basal medium whose formulation is unknown.
  • This basal medium was increased in respective examples with substances according to the invention.
  • the specified concentration of the substances in the examples is the final concentration of the respective substance in basal medium. Therefore, if appropriate, the nutrient media with substances according to the invention were increased to reach the final, indicated concentration.
  • the pH of the basal medium was adjusted to 7.1 ⁇ 0.1.
  • the osmolality of the basal medium was adjusted to 310 ⁇ 20 m ⁇ smol / kg H 2 O.
  • the basal medium thus prepared corresponds to a serum-free, protein-free, and peptone-free basal medium.
  • the second nutrient medium used is a feed medium (feed medium). It is a serum-free, protein-free feed medium.
  • the feed medium is a self-formulation consisting of, inter alia, amino acids, salts and vitamins. This feed medium was increased in respective examples with substances according to the invention.
  • the final feed medium had a pH of 6.0 to 7.8 and an osmolality of 460-750 m ⁇ smol / kg H 2 O.
  • MEL First abbreviation
  • Example 6 Fed-batch experiment with the substances according to the invention, without glucose and without glutamine in nutrient media
  • St-St-St standard cell (wild-type cell), standard basal medium, standard feed medium
  • MEL-MEL-MEL metabolically optimized cell, basal medium according to the invention, feed medium according to the invention
  • the standard cell wild-type cell that is not genetically modified was tested under fed-batch conditions with the following media combination:
  • St-St-MEL standard cell (wild-type cell), standard basal medium, feed medium according to the invention
  • the feed medium according to the invention can be combined better with basal medium according to the invention (FIG. 6, comparisons S6: St-St-MEL versus S6: St-MEL-MEL).
  • the basal medium according to the invention can also be combined well with a standard feed medium in which the feed medium contains a carbohydrate other than galactose, e.g. Glucose.
  • the basal medium contains the substances according to the invention and feed medium contains glucose, the cells even grow to an even higher cell concentration (FIG. 6, compare S6: St-MEL-MEL to S6: St-MEL-St).
  • lactate and succinate were combined in a fed-batch experiment.
  • the following nutrient media combination was used for these fed-batch experiments:
  • MEL-MEL-MEL metabolically optimized cell, basal medium according to the invention with lactates, feed medium according to the invention with lactates
  • MEL-MEL-MEL-S metabolically optimized cell, basal medium according to the invention with lactates and succinate, feed medium according to the invention with lactates and succinate
  • FIG. 8 shows the growth behavior of the metabolically optimized cells in nutrient media according to the invention with and without sodium succinate.
  • FIG. 9 shows the course of the lactate concentration in the nutrient media according to the invention with and without sodium succinate.

Abstract

Die Erfindung betrifft Nährmedien, insbesondere Zellkulturmedien, wobei diese mindestens eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Milchsäure, Adipinsäure und Mischungen davon sowie Salze, Derivate oder Komplexe dieser Säuren, enthalten. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung und Verfahren zur Herstellung solcher Zellkulturmedien, Verfahren zum Kultivieren einer Zellkultur in einem erfindungsgemäßen Zellkulturmedium sowie Zellen, die durch solche Verfahren gewonnen werden können.

Description

Verbessertes Zellkulturmedium
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nährmedium, insbesondere ein Zellkulturmedium, zur Kultivierung mindestens einer Zelle und/oder zur Gewinnung eines Polypeptids, Proteins und/oder eines Impfstoffes aus Organismen, insbesondere aus Zellen oder aus Zellkulturen, wobei die Organismen in dem erfindungsgemäßen Nährmedium kultiviert werden, und das gewünschte Polypeptid, Protein oder der Impfstoff aus den Organismen und/oder dem Kulturüber- stand gewonnen wird.
Es wurde überraschender Weise gefunden, dass die Zugabe von organischen Säuren oder Salzen, Derivaten oder Komplexen der organischen Säuren, ausgewählt aus der Gruppe Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxal- essigsaure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adi- pinsäure, Milchsäure in ein Nährmedium das Wachstum und/oder die Produktivität der Zellen erhöht und/oder die toxischen Metabolit- bildung reduziert hat. Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung hervorgerufene Produktivitätssteigerung und/oder Reduzierung der Ne- benproduktbildung kann erzielt werden, wenn die erfindungsgemäßen Substanzen allein einem Nährmedium, insbesondere einem Zellkulturmedium, zugegeben werden, oder miteinander kombiniert werden, oder mit anderen Kohlenhydraten kombiniert werden, insbesondere wenn die Substanzen in ein Medium zugegeben werden, welches Glutaminarm ist, oder kein Glutamin enthält, oder mit einem Medium benutzt werden, welches Glutaminersatzstoffe enthält.
Die erfindungsgemäßen Substanzen werden als Modulatoren des Zellstoffwechsels eingesetzt. Sie agieren als zusätzliche Energie- und/oder Kohlenhydratquelle. In diesem Zusammenhang können die Substanzen in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, mit entsprechend höherer Konzentration verwendet werden, welches Kohlenhydrate und/oder Glutamin enthält. Die erfin- dungsgemäßen Substanzen können aber auch in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, verwendet werden, welches keine Kohlenhydrate und/oder kein Glutamin enthält.
Stand der Technik
Bei der Produktion von Impfstoffen, zum Beispiel Viren oder PoIy- peptiden, werden tierische Zellen, insbesondere Säugerzellen, zunehmend als Wirtszellen eingesetzt. Hier verwendet man meist kontinuierlich wachsende Zellen, also Zelllinien, welche entweder immor- talisierte Zellen oder Tumorzellen sind. Für einige Anwendungen werden Primärzellen eingesetzt, die beispielsweise direkt aus Men- sehen oder Tieren entnommen werden. Es gibt große Unterschiede zwischen Primärzellen und Zelllinien, wenn sie in vitro kultiviert werden. Die Primärzellen können sich nur wenige Male teilen, während sich Zelllinien praktisch unendlich oft teilen können. Auch der Zellmetabolismus zwischen Primärzellen und kontinuierlichen Zelllinien kann unterschiedlich sein, beispielsweise die Glucoseverbrauchsra- te, die Lactatbildungsrate und die Glutaminverbrauchsrate.
Ein Ziel der Prozessoptimierung bei der Verwendung von Zellen, insbesondere Säugerzellen ist, dass man versucht, das Integral der Lebendzellkonzentration im Kultivierungssystem zu erhöhen, also das Integral aus der Lebendzeilkonzentrations- und der Zeitkurve. Denn das Integral der Lebendzellkonzentration korreliert positiv mit der Produktkonzentration, zum Beispiel mit der Polypeptidkonzentra- tion (Renard, J. M., et.al., Biotechnology Letters, 1988, 10(2): 91-96). Das Integral der Lebendzellkonzentration kann entweder durch die Erhöhung der Lebendzellkonzentration oder durch die Verlängerung der Prozesszeit erhöht werden.
Die Prozesszeit kann verlängert werden, wenn die Zellen lange im Bioreaktor am Leben bleiben, das heißt, wenn die Vitalität der Zellen lange hoch bleibt, beziehungsweise, wenn die stationäre Wachstumsphase verlängert wird. Ist die Vitalität niedrig, gibt es viele tote Zellen in der Kultur, die während der Fermentation lysieren und zell- eigene Proteine freisetzen. Ein höherer Gesamt-Eigenproteingehalt in der Kultur erschwert wiederum die Aufreinigung des gewünschten Polypeptids. Für die Abnahme der Vitalität und somit kurze Prozesszeit gibt es mehrere Erklärungen: In einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, kann ein Substrat limitierend wirken, die Zellen können durch die physikalischen Fermentationsbedingungen in die Apoptose eintreten oder es können Stoffwechselnebenprodukte im Medium akkumulieren, die auf die Zellen toxisch wirken.
Wünschenswert wäre ein Nährmedium oder eine Methode, bei der die Zellvitalität lange hoch bleibt, das heißt bei der die stationäre Wachstumsphase verlängert wird, da in der stationären Wachstumsphase die höchste Lebendzellkonzentration schon erreicht ist. Die Verlängerung der stationären Wachstumsphase führt zu einer Erhöhung des Integrals der Lebendzellkonzentration und zu höherer Produktbildung. Ein anderer Parameter, um das Integral der Lebendzell- konzentration zu erhöhen, ist die Erhöhung der höchste erreichte Zellkonzentration (peak cell density). Durch bessere Nährmedien und durch bessere Kultivierungsverfahren kann die höchste erreichte Zellkonzentration weiter erhöht werden. Die höchste erreichte Zellkonzentration oder Zellvitalität ist eine Funktion des Zellmetabolismus. Wenn die Zellen einen ineffizienten Metabolismus haben, scheiden sie energiereiche Zwischenmetaboli- te, wie Lactat ins Medium aus. Zellen können auch toxische Zwi- schenmetabolite ins Medium ausscheiden, wie Ammonium. Ammonium wiederum kann das Zellwachstum, Produktivität und Produktqualität, zum Beispiel Glykosilierung negativ beeinflussen. Zum Beispiel, wenn Zellen mit hoher glykolytischen Aktivität Glucose metabo- lisieren, wird die intrazelluläre Konzentration der glykolytischen Zwi- schenprodukte verschoben. Dies kann das Expressionsprofil diverser Gene beeinflussen, die für Stressstabilität, Produktivität und Wachstum notwendig sind (Verstrepen, K. J., et.al., Trends Biotechnol., 2004, 22 (10): 531-537). Unter solchen Bedingungen ist das Integral der Lebendzellkonzentration niedrig, was wiederum geringere Pro- duktbildung bedeutet.
Bei kontinuierlichen Zelllinien ist bekannt, dass sie, im Vergleich zu Primärzellen, einen entarteten Zellmetabolismus haben. Eine Reihe von Enzymen des Primärmetabolismus zwischen Zelllinien und Primärzellen wurden in diesem Zusammenhang verglichen. In den ge- prüften Zelllinien konnte keine Aktivität von Enzymen, die die Glyko- lyse mit dem Citratzyklus verbinden, nachgewiesen werden, während sie in Primärzellen existieren (Neermann, J. und Wagner, R., J. Cell. Physiol., 1996, 166 (1 ): 152-169). In vielen kontinuierlichen Säugerzellen ist der Fluss von Glucose zu Lactat hoch, während der Fluss von Pyruvat zum Citratzyklus gering ist. Glucose wird durch die Zellen zu einem großen Teil zu Lactat umgewandelt und anschließend wird das energiereiche Lactat ins Nährmedium, insbesondere in ein Zellkulturmedium, ausgeschieden. Außer Glucose metabolisieren die Zelllinien mit hoher Rate Glutamin als Energiequelle. Somit gehören die beiden Substrate, Glucose und Glutamin zu den wichtigsten Substraten in Nährmedien für kontinuierliche Säugerzellen. Es gab mehrere Ansätze, um den Zellmetabolismus der kontinuierlichen Zelllinien zu verbessern. Es wurde versucht, die Glucose und Glutamin im Prozess zu limitieren, um den glykolytischen Fluss zu bremsen. Durch die Substratlimitierung sollte der Overflow- Metabolismus der Zellen unterdrückt werden, somit sollten die Zellen weniger Lactat und Ammonium bilden (US 2004/0048368 A1 ; Europa, A.F., et.al., Biotechnol. Bioeng., 2000, 67(1 ): 25-34). Die Wirkung der Glutaminlimitierung wurde auf das Wachstum und die Apoptose der CHO-Zellen genau untersucht. Es wurde gezeigt, dass bei Glutaminlimitierung die Zeilwachstumsrate abnimmt, aber der Anteil der Zellen, die in Apoptose eintreten geringer ist (Sanfeliu, A. und Ste- phanopoulus, G., Biotechnol. and Bioeng., 1999, 64(1 ): 46-53). In der WO 98/41611 wurde vorgeschlagen, die Glucose- und Glutamin- konzentration auf einen niedrigen Wert zu regeln. Dies soll durch die Kopplung der Glucose-, oder Glutaminkonzentration mit der Sauerstoffverbrauchsrate erfolgen. Diese Vorgehensweise setzt eine komplexe Regelung und Zufütterung der Substrate voraus, so dass der Prozess insbesondere unter Großmaßstabbedingungen schwer zu beherrschen ist. Das Risiko eines Absturzes des Fermenterlaufes und das damit verbundene finanzielle Risiko ist groß. Andererseits lehrt die EP 0435911 B1 , dass unter anderem Glutamin in Standardzellkulturmedien erhöht werden muss, um verbessertes Zellwachs- tum und gesteigerte Produktbildung zu erzielen. In ähnlicher Weise sei die Zufütterung der tierischen Zellen mit Glutamin in Fed-batch oder in Perfusion für die Biopharmazeutikaproduktion notwendig (Duvar, S. et.al, Transkript, 2004, 5(1 ): 34-36). Insofern gibt es wi- dersprüchliche Aussagen in der Literatur über die Rolle des Glutamins bezüglich des Zellstoffwechsels.
Chen, K., et.al. (Biotechnol. Bioeng., 2001 , 72: 55-62) haben versucht, die Lactatbildung durch homologe Rekombination zu unter- drücken. Eine Kopie des Lactatdehydrogenase-Gens wurde inaktiviert und dadurch die zellspezifische Lactatbildungsrate 50 % reduziert. Irani, N., et.al. (J. Biotechnol., 1999, 66: 238-246) haben das Pyruvat-Carboxylase-Gen in eine Zelllinie kloniert. Die Erwartung war, dass die Zellen dadurch mehr Pyruvat in den Citratzyklus för- dem und damit weniger Lactat produzieren. Gemäß der EP 0 338 841 A1 wurde das Glutaminsynthetase-Gen in Zellen als Selekti- onsmarker kloniert. Dies hatte den Vorteil, dass kein externes Glutamin ins Nährmediumzugegeben werden musste. Zellen haben selbst Glutamin produziert und wenig Ammonium ausgeschieden. Altamirano, C. et.al. (Biotechnol. Progress, 2000, 16(1 ): 69-75) haben in einem low-protein Medium unter Batch-Bedingungen Glucose und Glutamin durch schwer metabolisierbare Alternativen ersetzt, in diesem Falle mit Galactose und Glutamat. Dadurch haben die Zellen zwar weniger Stoffwechselnebenprodukte produziert, jedoch war sowohl das Zellwachstum als auch die Produktbildung niedriger als in der Kontrolle. Es wurde ferner vorgeschlagen einen Zweiphasen- prozess zu entwickeln: Zellen sollen zuerst in Glucose wachsen und danach in der Produktionsphase Galactose als Kohlenhydratquelle verwerten (Altamirano, C, et.al., Biotechnol. Bioeng., 2001 , 76(4): 351-60; Altamirano, C, et.al., J. Biotechnology, 2004, 110(2): 171-9). Die US 4,049,494 beschreibt ein serumfreies, chemisch definiertes und autoklavierbares Nährmedium. Das Medium besitzt die Eigenschaft, dass es glutaminfrei ist und gleichzeitig Glucose und Pyruvat enthält. Das Medium wurde speziell für die Virusproduktion mit Baby- Hamster-Kid ney Zellen entwickelt. Ähnlich beschreibt WO 03/106661 A2 eine Substratkombination für die Kultivierung von Säugerzellen. Die Kombination umfasst ein glutaminfreies und gleichzeitig pyru- vathaltiges Nährmedium. Diese Substratkombination soll die Bildung von Lactat und/oder Ammonium reduzieren. Es wurde gezeigt, dass eine Kombination von 1 mM Pyruvat mit 5,5 mM Glucose in einem Nährmedium die Ausreifung der Cumulus-cell-enclosed Maus Oocy- ten fördert. Interessanterweise konnte kein oder ein nur geringer Ein- fluss von Glutamin auf die Ausreifung der Zellen gezeigt werden (Downs, S. M. und Hudson, E. D., Zygote, 2000, 8(4): 339-51 ). Hassel, T. und Butler, M. (J. Cell Science, 1990, 96 (Pt3): 501-8) haben in einem Nährmedium Glutamin durch Glutamat oder 2- Oxoglutarat ersetzt und Zellen wurden in dieses Medium adaptiert. Nach der Adaptationsphase produzierten die verwendeten McCoy- Zellen weniger Lactat und Ammonium. Es ist zu betonen, dass die Zellen in diesem Ansatz auf Microcarriem wuchsen und sich entweder in der späteren exponentiellen Wachstumsphase oder in der stationären Wachstumsphase befanden. In diesen Wachstumsphasen haben die Zellen ein verändertes Metabolismusprofil. Außerdem war eine Voradaptierung der Zellen an glutaminfreies Medium notwendig.
In einem speziellen Nährmedium wurde Glutamin aus dem Nährmedium entfernt. Ohne Zelladaptation wuchs der untersuchte Klon einfach in dem speziellen Nährmedium. Dadurch wurde die Ammoni- Umbildung reduziert und Produktbildung erhöht (Deer, F., und Cun- ningham, M., Genetic Eng. News, 2000, 20(7): 42). Kurano, N., et.al., 1990 (Journal of Biotechnology, 15(1-2): 113-28) haben Glutamin durch Asparagin substituiert. Eine CHO-Kultur wurde unter fed-batch Bedingungen und unter glutaminfreien Bedingungen mit Asparagin supplementiert und dabei die Ammoniumbildung reduziert.
Glutamin wurde ferner in Nährmedien mit Dipeptiden, Alanyl- Glutamin (AIa-GIn) oder Glycyl-Glutamin (GIy-GIn) ersetzt. Es konnte gezeigt werden, dass durch diese Strategie die Zellen weniger Ammonium gebildet haben (Roth, E. et.al., In vitro cellular & develop- mental biology, 1988, 24(7): 696-698; Christie, A. und Butler, M., J. Biotechnology, 1994, 37(3):277-90). Glutamin wurde mit der stabilen Glutaminalternativen L-Alanyl-Glutamin (Glutamax) ersetzt um die Wirkung von Glutaminlimitierung mit dieser Substanz zu untersuchen (Sanfeliu, A. und Stephanopoulus, G., Biotechnol. und Bioeng., 1999, 64(1 ): 46-53).
In der EP 1 342 780 A1 wurde eine andere Stoffkombination veröffentlicht, welche den Glucoseverbrauch und die Lactatbildung reduzieren soll. Demnach soll dem Nährmedium freies ungebundens Cit- rat in Kombination mit in einem Komplexbildner gebundenem Eisen- citrat zugegeben werden.
In einem Nährmedium (Perfusate) wurde Lactat und Pyruvat in einem Verhältnis 10:1 als Substrat zu den Ratten Herzzellen angeboten. Es wurde Lactat eingesetzt, weil Lactat ein bevorzugtes Substrat der Herzzellen ist. Es konnte gezeigt werden, dass der glykolytische Fluss durch Zugabe von Lactat inhibiert worden ist (Depre, C. et.al., Acta Cardiologica, 1993, 48(1 ): 147-64; Ovchinnikov, IV und Kim, N. P., Ukrainskii Biokhimicheskii Zhurnal, 1985, 57(4): 72-5). In einem chemisch definierten proteinfreien Medium wurde die Wirkung von Succinat, Malat, Lactat und Pyruvat an Hamster- Embrionen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Succinat und Malat in Nährmedium die Entwicklung der Blastocyten unterstützen (Ain, R. und Seshagiri, P.B., Molecular Reproduction & Development, 1997, 47(4): 440-7). In dieser Publikation war der Fokus auf die Entwicklungsbiologie gerichtet, speziell auf die Entwicklung der Blastocyten (Primärzellen).
Es wurde berichtet, dass die CHO (Chinese hamster ovary) Zellen nicht in der Lage sind Ribose, Lactose, Sucrose, Glycerol, Lactat, Pyruvat, Citrat, Succinat, Fumarat oder Malat als Energiequelle zu verwerten (Faik, P. und Morgan, MJ. , Cell biol. Int. Reports, 1977, 1 (6): 555-62). Es wurde überraschender Weise herausgefunden, dass genau diese Substanzen durch Zellen, insbesondere durch CHO-Zellen, als Substrat verwendet werden können, wenn gemäß der Erfindung hier die richtige Konzentration gewählt wird und dabei die richtige Aminosäurekonzentration (Glutamin, Glutamat, Aspara- gin) und Kohlenhydratquelle gewählt wird.
Acetat wurde dem Nährmedium zugegeben, mit der Begründung, dass es die Produktivitätsleistung der Zellen in einer vergleichbaren Weise wie Butyrat erhöht (WO 03/064630). Glucose wurde mit einer anderen C2-Kohlenstoffquelle kombiniert um eine genetisch verän- derte Hefestamm selektieren zu können (WO 2004/099425). In dieser Publikation ist der Fokus aber ein Verfahren zur Selektion eines neuen Hefestammes, nicht zur Kultivierung eines Organismus.
Technisches Problem Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist die Bereitstellung eines Ausbeute-verbesserten Nährmediums, insbesondere eines Zellkulturmediums, einer Zellkultur und eines Verfahrens zur Kultivierung von Zellen beziehungsweise Zellkulturen, insbeson- dere zur Herstellung von biologischen Produkten aus den Zellen o- der Zellkulturen, bei dem das Integral der Lebendzellkonzentration einer Zellkultur erhöht wird, und wobei dementsprechend über die Gesamtprozessdauer eine größere Menge an erwünschtem biologischen Produkt gewonnen werden kann. Wünschenswert ist es dar- über hinaus auch, dass das Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, für Zellen eingesetzt werden kann, die einen oder mehr ggf. auch nicht genau lokalisierte Stoffwechselblockaden in Glykosy- lirungstoffwechselweg oder in Energiestoffwechselweg insbesondere im Citratzyklus oder Glykolyse aufweisen oder eine Blockade beim Transport von Metaboliten von Medium in die Zelle, und/oder in der Zelle zwischen den Organellen aufweisen.
Der Erfindung liegt daher auch das technische Problem zugrunde, ein Nährmedium zur Kultivierung von Zellen oder Zellkulturen, auch von Zellen mit Stoffwechselblockade in Glykosylierungsstoffwech- selweg oder in Energiestoffwechselweg, z.B. im Citratzyklus oder Glykolyse, oder von Zellen, die eine Blockade in Transport von Metaboliten von Medium in die Zelle, und/oder in der Zelle zwischen den Organellen aufweisen bereitzustellen, bei dem das Zellwachstum verbessert wird, oder die Bildung der Stoffwechselnebenproduk- te vermindert wird, wobei dementsprechend über die Gesamtprozessdauer eine größere Menge an erwünschtem biologischen Produkt gewonnen werden kann. Der Erfindung liegt auch das technische Problem zugrunde, Verfahren zur Selektion spezieller Zellen, insbesondere genetisch modifizierter und/oder metabolisch veränderter, insbesondere optimierter, Zellen bereitzustellen. Es wurde überraschender Weise gefunden, dass die Zugabe von organischen Säuren oder Salze, Derivate oder Komplexe der organischen Säuren, ausgewählt aus der Gruppe Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessig- säure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäu- re, Milchsäure in ein Nährmedium, insbesondere in ein Zellkulturmedium, das Wachstum und/oder die Produktivität der Zellen erhöht und/oder die toxischen Metabolitbildung reduziert hat. Erfindungsgemäß bevorzugt sind dabei organischen Säuren oder Salze oder Komplexe der organischen Säuren, ausgewählt aus der Gruppe Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxa- lessigsäure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adi- pinsäure, Milchsäure.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung hervorgerufene Produktivitätssteigerung und/oder Reduzierung der Nebenproduktbildung kann erzielt werden, wenn die erfindungsgemäßen Substanzen allein einem Nährmedium, insbesondere einem Zellkulturmedium, zugegeben werden, oder miteinander kombiniert werden, oder mit Kohlenhydraten kombiniert werden, oder ohne Kohlenhydrate ins Medium zugegeben werden, insbesondere wenn die Substanzen in ein Medi- um zugegeben werden, welches Glutamin enthält, oder kein Glutamin enthält, oder in einem Medium verwendet werden, welches GIu- taminersatzstoffe enthält, oder keine Glutaminersatzstoffe enthält, oder eine hohe Asparaginkonzentration hat, oder Asparaginer- satzstoffe enthält, oder eine hohe Glutamatkonzentration hat, oder Glutamatersatzstoffe enthält.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technisches Problem insbesondere durch die Bereitstellung eines Nährmediums, insbe- sondere eines Zellkulturmediums, einer Zellkultur und eines Verfahrens gemäß der Patentansprüche.
Insbesondere löst die Erfindung das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Nährmediums, insbesondere eines Zellkulturmediums, zur Kultivierung einer Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, wobei das Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, mindestens eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Citonensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Iso- citronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milch- säure und Mischungen davon sowie Salze, Derivate oder Komplexe dieser Säuren, enthält. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, mindestens eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milchsäure und Mischungen davon sowie Salze oder Komplexe dieser Säuren.
Unter Salzen der erfindungsgemäß eingesetzten Säuren werden insbesondere Succinat, Malat, α-Keto-Glutarat, Fumarat, Oxalacetat, Iso-Citrat, Oxalsuccinat, Tartrat, Adipat, beziehungsweise Lactat verstanden. Unter dem salz von Citronensäure wird Citrat verstanden. Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, mindestens zwei Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto- Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxal- bernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milchsäure und Mischungen davon sowie Salze oder Komplexe dieser Säuren, wobei also eine oder mehrere der vorgenannten Säuren auch als Salz oder Komplex vorliegen können. Besonders bevorzugt ist die Gruppe um Citronensäure erweitert.
Bevorzugt enthält das Nährmedium Milchsäure. Bevorzugt enthält das Nährmedium Lactat. Bevorzugt enthält das Nährmedium mindestens einen Milchsäure-Komplex. Bevorzugt enthält das Nährmedium ein Milchsäure-Derivat.
Bevorzugt enthält das Nährmedium als Milchsäure-Derivat Alanin und/oder mindestens ein Alanin-haltiges Peptid. Bevorzugt enthält das Nährmedium Alanin und/oder mindestens ein Alanin-haltiges Peptid in einer Konzentration von 0,1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 1 g/l oder größer, mehr bevorzugt von 5 g/l oder größer, am meisten bevorzugt von 25 g/l oder größer. Bevorzugt enthält das Nährmedium als Milchsäure-Derivat Pyruvat und/oder mindestens ein Pyruvat-Derivat. Bevorzugt enthält das Nährmedium Pyruvat und/oder mindestens ein Pyruvat-Derivat in einer Konzentration von 0,1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 1 g/l oder größer, am bevorzugtesten von 5 g/l oder größer, am meisten bevorzugt von 25 g/l oder größer.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in der Beschreibung aufgeführten Konzentrationen Endkonzentrationen. In einer bevor- zugten Ausführungsform sind die in der Beschreibung aufgeführten Konzentrationen Gesamtkonzentrationen der jeweiligen Substanzen.
Bevorzugt enthält das Nährmedium Milchsäure, Lactat, mindestens einen Milchsäure-Komplex und/oder mindestens ein Milchsäure- Derivat in einer Konzentration von 0,1 g/l oder größer, bevorzugt von 1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 5 g/l oder größer, insbesondere bevorzugt von 25 g/l oder größer.
Bevorzugt enthält das Nährmedium Bernsteinsäure. Bevorzugt enthält das Nährmedium Succinat. Bevorzugt enthält das Nährmedium ein Bernsteinsäure-Derivat. Bevorzugt enthält das Nährmedium ein Succinat-Derivat.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, sämtliche der genannten Säuren oder Stoffe auf, wo- bei anstelle der Säuren auch die entsprechenden Salze oder Komplexe verwendet werden können. Insbesondere können in einer solchen Zusammensetzung stoffwechselblockierte Zellen kultiviert werden, insbesondere wenn der Ort des Blocks, z.B. in Glykosylie- rungsstoffwechselweg oder in Energiestoffwechselweg, beispiels- weise im Citratzyklus oder Glykolyse nicht exakt lokalisierbar ist oder Zellen eine Blockade in Transport von Metaboliten von Medium in die Zelle, und/oder in der Zelle zwischen den Organellen aufweisen. Bevorzugt enthält das Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, also Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumar- säure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure und Milchsäure, wobei eine oder mehrere der vorgenannten Säuren auch als Salz oder Komplex vorliegen können. Besonders bevorzugt ist die Gruppe um Citronensäure erweitert.Die erfindungsgemäßen Substanzen sind zur dauerhaften Kultivierung der Organismen, besonders zur Kultivierung von tierischen Zellen, insbesondere zur Kultivierung von Säugerzellen, geeignet.
Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, die mindestens eine erfindungsgemäße Substanz in einer Konzentration von mindestens 15 mg/l, bevorzugter mindestens 30 mg/l, besonders bevorzugt mindestens 100 mg/l, insbesondere mindestens 300 mg/l, am meisten bevorzugt mindestens 1000 mg/l. Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, die mindestens eine erfindungsgemäße Substanz in einer Konzentration von 0,03 g/l oder größer, bevorzugter von 0,1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 1 g/l oder größer, insbeson- dere von 5 g/l oder größer, am meisten bevorzugt von 25 g/l oder größer.ln einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nährmedium ein Zufütterungsmedium. Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere Zufütterungsmedium, die mindestens eine erfindungsgemäße Substanz in einer Konzentration von 0,2 g/l oder größer, bevorzugter von 1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 5 g/l oder größer, sehr bevorzugt von 25 g/l oder größer, am meisten bevorzugt mindestens 100 g/l.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemä- ße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, mindestens ein Kohlenhydrat, besonders bevorzugt ein Monosaccharid oder ein Disaccharid. Bevorzugt enthält das Nährmedium ein Kohlenhydrat. Bevorzugt ist das Kohlenhydrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Galactose, Fructose, Mannose, Ribose, Glucosamin, Saccharose, Lactose und Mischungen davon.
Bevorzugt enthält das Nährmedium das mindestens eine Kohlenhydrat in einer Konzentration von 0,1 g/l oder größer, bevorzugter von 1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 5 g/l oder größer, insbesondere bevorzugt von 25 g/l oder größer, am meisten bevorzugt von 100 g/l oder größer.
Bevorzugt enthält das Nährmedium Galactose. Bevorzugt enthält das Nährmedium Galactose und ein zweites Kohlenhydrat. Bevor- zugt enthält das Nährmedium Galactose in einer Konzentration von 0,1 g/l oder größer, bevorzugter von 1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 5 g/l oder größer, insbesondere bevorzugt von 25 g/l oder größer, am meisten bevorzugt von 100 g/l oder größer.
Bevorzugt enthält das Nährmedium Glucose in einer Konzentration von 100 g/l oder kleiner, bevorzugter 25 g/l oder kleiner, mehr bevorzugt 5 g/l oder kleiner, besonders bevorzugt von 1 g/l oder kleiner, insbesondere bevorzugt von 0,1 g/l oder kleiner. Bevorzugt ist das Nährmedium frei von Glucose.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungs- gemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, frei von Kohlenhydraten.
Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, Glutamin in einer Konzentration von kleiner als 8 mmol/l, bevorzugt von kleiner als 5 mmol/l, besonders bevorzugt von kleiner als 3 mmol/l, am bevorzug- testen von kleiner als 2 mmol/l. Das Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, kann aber auch bevorzugt frei von Glutamin sein.
In einer weiteren bevorzugten Alternative enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkul- turmedium, mindestens ein Glutamin-Derivat, also mindestens einen Glutamin-haltigen Glutaminersatzstoff, besonders bevorzugt ein GIu- tamin-haltiges Dipeptid. Bevorzugt ist das mindestens eine Glutamin-Derivat ein Glutamin-haltiges Peptid.
Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesonde- re das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, Glutamin-Derivate in einer Gesamt-Konzentration von größer als 30 mg/l, bevorzugt größer als 150 mg/l, besonders bevorzugt größer als 750 mg/l, am bevorzugtesten größer als 2000 mg/l. Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, Glutamin-Derivate in einer Konzentration von 0,05 g/l oder größer, bevorzugt von 0,2 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 0,8 g/l oder größer, am bevorzugtesten von 3,2 g/l oder größer. Das Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, kann aber auch in einer bevorzugten Alternative frei von Glutamin- Derivaten sein.
Bevorzugt enthält das Nährmedium Asparagin. Bevorzugt enthält das Nährmedium mindestens ein Asparagin-Ersatzstoff, insbesondere mindestens ein Asparagin-Derivat. Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, Asparagin oder mindestens einen Asparaginer- satzstoff, besonders bevorzugt mindestens ein Asparagin-Derivat, in einer hohen Konzentration, das heißt in einer Konzentration, insbe- sondere Gesamtkonzentration, von größer als 0,05 g/l, stark bevorzugt von größer als 0,15 g/l, mehr bevorzugt von größer als 0,3 g/l, insbesondere von größer als 0,6 g/l
Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesonde- re das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, Glutamat oder mindestens einen Glutamatersatzstoff, bevorzugt mindestens eine Gluta- mat-Derivat, in einer hohen Konzentration, das heißt in einer Konzentration von 0,05 g/l oder größer, bevorzugter von 0,15 g/l oder größer, mehr bevorzugt von 0,3 g/l oder größer, insbesondere von 0,6 g/l oder größer.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellkulturmedium, das Milchsäure und Galacto- se sowie die vorgenannte hohe Aspargin-Konzentration enthält, gleichzeitig aber frei von Glutamin ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellkulturmedium, welches Milchsäure, Galac- tose und Aspargin in der vorgenannten hohen Konzentration enthält sowie gleichzeitig frei von Glutamin ist, aber zumindest ein Glutamin- haltiges Peptid aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellkulturmedium, welches Milchsäure und Ga- lactose aufweist, darüber hinaus eine hohe Glutamat-Konzentration in der vorgenannten Konzentration aufweist, gleichzeitig aber frei von Glutamin ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellkulturmedium, welches Bernsteinsäure und eine hohe Aspargin- oder Aspargin-Ersatzstoffkonzentration der vorgenannten Konzentrationen aufweist, gleichzeitig aber frei von Glutamin ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Nährmedium frei von Glucose und frei von Glutamin und enthält Asparagin in einer Konzentration von 0,05 g/l oder größer, bevorzugter von 0,15 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 0,3 g/l oder größer, am bevorzugtesten von 0,6 g/l oder größer, sowie Milchsäure und Galactose. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Nährmedium frei von Glucose und Glutamin ist und enthält Glutamat in einer Konzentration von 0,05 g/l oder größer, bevorzugter von 0,15 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 0,3 g/loder größer, noch mehr bevorzugt von 0,6 g/l oder größer, sowie Milchsäure und Galactose. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Nährmedium frei von Glucose ist und enthält Glutamin-haltige Peptide, Milchsäure und Galactose.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, ein Zufütterungsmedium.
Bevorzugt enthält das Zufütterungsmedium Milchsäure, Lactat, min- destens einen Milchsäure-Komplex und/oder mindestens ein Milchsäure-Derivat in einer Konzentration von 1 g/l oder größer, bevorzugt von 5 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 25 g/l oder größer, insbesondere bevorzugt von 100 g/l oder größer.
Bevorzugt enthält das Zufütterungsmedium Galactose in einer Kon- zentration von 1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 5 g/l oder größer, insbesondere bevorzugt von 25 g/l oder größer, am meisten bevorzugt von 100 g/l oder größer. Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, besonders bevorzugt Zufütterungsmedium, Glutamin-Derivate in einer Konzentration von von 0,2 g/l oder größer, mehr bevorzugt von 1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 5 g/l oder größer, am bevorzugtes- ten von 10 g/l oder größer.
Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das Zufütterungsmedium, Asparagin oder mindestens einen Aspa- raginersatzstoff, besonders bevorzugt mindestens ein Asparagin- Derivat, in einer Konzentration von 0,2 g/l oder größer, mehr bevor- zugt von 1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 2 g/l oder größer, insbesondere von 5 g/l oder größer, am bevorzugtesten von 10 g/l oder größer.
Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Zufütterungsmedium Glutamat oder mindestens einen Glutamatersatzstoff, besonders bevor- zugt mindestens ein Glutamat-Derivat, in einer Konzentration von 0,2 g/l oder größer, bevorzugt von 1 g/l oder größer, besonders bevorzugt von 2 g/l oder größer, insbesondere von 5 g/l oder größer, am bevorzugtesten von 10 g/l oder größer.
In einer bevorzugten Alternative ist das erfindungsgemäße Nährme- dium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, ein Basalmedium, bevorzugt ein Basalmedium mit einer Osmolalität von 240 bis 360 mθsmol/kg H2O. In einer bevorzugten Alternative ist das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, ein Basalmedium, bevorzugter ein Basal- medium mit einer Osmolalität von 280 bis 350 mOsmol/kg H2O, am meisten bevorzugt ein Basalmedium mit einer Osmolalität von 280 bis 320 mOsmol/kg H2O. In einer weiteren bevorzugten Alternative ist das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, ein Zufütterungsmedium (auch Feedmedium genannt), bevorzugt ein Zufütterungsmedium mit einer Osmolalität von 150 bis 1500 mθsmol/kg hfeO.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Nährmedium Serum-frei. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Nährmedium Serum.
Ein Nährmedium ist insbesondere ein Zellkulturmedium. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Nährmedium ein flüssiges Nährmedium, insbesondere ein flüssiges Zellkulturmedium.
Für einen Fachmann sind durch die angegebenen bevorzugten Mindestangaben für die Konzentration der genannten Inhaltsstoffe im Nährmedium die zu wählenden Konzentrationsbereiche der Inhaltsstoffe, also auch die zu wählenden Höchstkonzentrationen der In- haltsstoffe, ohne besonderen Aufwand zu ermitteln. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt die Konzentration einer erfindungsgemäß eingesetzten organischen Säure höchstens 200 g/l, besonders bevorzugt 100 g/l, mehr bevorzugt 50 g/l, am meisten bevorzugt 25 g/l. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt die Konzentration von erfin- dungsgemäß eingesetztem Lactat und/oder von einem Milchsäure- Derivat, insbesondere Alanin und/oder Pyruvat, höchstens 200 g/l, besonders bevorzugt 100 g/l, insbesondere 50 g/l, am meisten bevorzugt 25 g/l. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt die Konzentration eines erfindungsgemäß eingesetzten Glutamin-Derivats höchs- tens 60 g/l, besonders bevorzugt 30 g/l, mehr bevorzugt 10 g/l, sehr bevorzugt 5 g/l, insbesondere 1 ,2 g/l, am meisten bevorzugt 1 ,1 g/l. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt die Konzentration von erfin- dungsgemäß eingesetztem Asparagin oder eines Asparagin-Derivats höchstens 60 g/l, besonders bevorzugt 30 g/l, mehr bevorzugt 5 g/l, insbesondere 1 ,2 g/l, am meisten bevorzugt 1 ,1 g/l. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt die Konzentration von erfindungsgemäß ein- gesetztem Glutamat oder eines Glutamat-Derivats höchstens 60 g/l, besonders bevorzugt 30 g/l, mehr bevorzugt 5 g/l, insbesondere 1 ,2 g/l, am meisten bevorzugt 1 ,1 g/l. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt die Konzentration von erfindungsgemäß eingesetzter Galactose höchstens 200 g/l, besonders bevorzugt 100 g/l, insbesondere 50 g/l, am meisten bevorzugt 25 g/l.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nährmediums, insbesondere eines erfindungsgemäßen Zellkulturmediums, zum Kultivieren einer Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technisches Problem auch durch die Bereitstellung einer Zelle oder einer Zellkultur. Die Zelle oder Zellkultur ist erfindungsgemäß bevorzugt metabolisch soweit optimiert, dass sie in erfindungsgemäßen Kulturmedien und Verfahren kultiviert werden kann.
Gemäß der Erfindung ist die Zelle oder Zellkultur bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultur in einem Medium mit erfindungsgemäßen Substanzen überleben kann oder teilen kann oder die höchste erreichte Zellkonzentration (peak cell density) höher ist, oder die stationäre Wachstumsphase verlängert ist oder die Abster- bephase verlangsamt ist, oder die Bildung der Zell-metabolischen Nebenprodukte, zum Beispiel Ammonium oder Lactat reduziert ist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Zelle oder Zellkultur, welche Milchsäure, sowie Salze (Lactat) oder Komplexe der Milchsäure-, oder Salze von Milchsäure-Ersatzstoffen metabolisieren kann. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Zelle oder Zellkultur, welche in ei- nem glucosefreien und glutaminfreien Medium überleben kann, bevorzugt teilen kann, besonders bevorzugt höhere integral of viable cells (IVC) erreichen kann, am bevorzugtesten geringer Stoffwechselnebenprodukte, insbesondere Lactat oder Ammonium produziert. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Zelle oder Zellkultur, welche in einem Glucose-freien Medium überleben kann, bevorzugt teilen kann, besonders bevorzugt höhere integral of viable cells (IVC) erreichen kann, am bevorzugtesten geringer Stoffwechselnebenprodukte, insbesondere Lactat oder Ammonium produziert. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Zelle oder Zellkultur, welche in einem GIu- cose-freien und Glutamin-freien Medium überleben kann, und Lactat metabolisieren kann, bevorzugt teilen kann, besonders bevorzugt höhere integral of viable cells (IVC) erreichen kann, am bevorzugtesten geringer Stoffwechselnebenprodukte, insbesondere Lactat oder Ammonium produziert. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Zelle oder Zellkultur, welche in einem Glucose-freien und Glutamin-freien Medium überleben kann, und Lactat metabolisieren kann und einen hohen Asparaginverbrauch hat, sich in einem solchen Medium bevorzugt teilen kann, besonders bevorzugt höhere integral of viable cells (IVC) erreichen kann, am bevorzugtesten geringer Stoffwech- selnebenprodukte, insbesondere Lactat oder Ammonium produziert. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Zelle oder Zellkultur, welche in einem Glucose-freien und Glutamin-freien Medium überleben kann, und Lactat metabolisieren kann und einen hohen Glutamatverbrauch hat, sich in einem solchen Medium bevorzugt teilen kann, beson- ders bevorzugt höhere integral of viable cells (IVC) erreichen kann, am bevorzugtesten geringer Stoffwechselnebenprodukte, insbesondere Lactat oder Ammonium produziert. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Zelle oder Zellkultur, welche in einem Glucose-freien und Glutamin-freien Medium überleben kann, und Lactat metabolisieren kann und Galactose metabolisieren kann, sich in einem solchen Medium bevorzugt teilen kann, besonders bevorzugt höhere integral of viable cells (IVC) erreichen kann, am bevorzugtesten geringer Stoffwechselnebenprodukte, insbesondere Lactat oder Ammonium produziert. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Zelle oder Zellkultur, welche in einem Glucose-freien und Glutamin-freien Medium überleben kann, und Lactat metabolisieren kann und Galactose metabolisieren kann, und einen hohen Asparaginverbrauch oder einen hohen Glutamatverbrauch hat, sich in einem solchen Medium bevorzugt teilen kann, besonders bevorzugt höhere integral of viable cells (IVC) erreichen kann, am bevorzugtesten geringer Stoffwechselnebenprodukte, insbesondere Lactat oder Ammonium produziert.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem auch durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Kultivieren einer Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, wobei die Zellkultur in einem Nährmedium eingebracht und kultiviert wird und wobei der pH-Wert des Nährmediums während mindestens eines Fünftels der Kultivierungszeitdauer pH 7,2 oder basischer ist.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem auch durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Kultivieren einer Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, wobei die Zellkultur in einem erfindungsgemäßen Nährmedium, insbesondere in einem erfindungsgemäßen Zellkulturmedium, eingebracht und kultiviert wird. Bevorzugt wird die in das erfindungsgemäße Nährmedium, insbesondere in das erfindungsgemäße Zellkulturmedium, eingebrachte Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, zur Herstellung eines biologischen Produktes verwendet.
Bevorzugt ist das biologische Produkt ausgewählt aus mindestens einem Polypeptid, mindestens einem Protein, mindestens einem Virusbestandteil, mindestens einem Virus oder aus einer Mischung aus diesen. Besonders bevorzugt ist das biologische Produkt mindestens ein Impfstoff.
Bevorzugt wird das biologische Produkt aus der Zellkultur und/oder aus dem Nährmedium, insbesondere aus dem erfindungsgemäßen Zellkulturmedium, gewonnen.
Bevorzugt enthält die mindestens eine Zelle mindestens ein Gen, das das biologische Produkt codiert.
Erfindungsgemäß wird unter Zellkultur mindestens eine Zelle verstanden, die in einem Medium, bevorzugt einem Nährmedium, insbesondere einem Zellkulturmedium, am Leben erhalten wird, sich bevorzugt auch in dem Medium teilt beziehungsweise zur Zellteilung angeregt wird. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die mindestens eine Zelle eine eukaryontische Zelle, besonders bevorzugt eine Pilz-Zelle, insbesondere eine Hefe-Zelle, eine pflanzliche Zelle oder eine tierische Zelle, beispielsweise eine Insekten- oder Säugetier-Zelle, insbesondere eine humane oder Nagerzelle, eine Hamsterzelle oder eine Myelomazelle, zum Beispiel eine CHO-, NSO-, PERC6-, HEK- 293- oder BHK21 -Zelle. Erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt ist die mindestens eine Zelle eine prokaryotische Zelle. Erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt ist die mindestens eine Zelle ein Abkömmling der einer der obengenannten Zellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt stammt die mindestens eine Zelle aus einer Zelllinie, insbesondere einer immortalisierten Zelllinie und/oder einer Tumor-Zelllinie. Ebenfalls erfindungsgemäß bevorzugt ist die mindestens eine Zelle eine Primärzelle. Beispiele für erfindungsgemäße Zellen sind im weiteren Verlauf des Textes aufgeführt.
Die Zellkultur ist erfindungsgemäß bevorzugt eine Zellpopulation. Die Zellkultur ist erfindungsgemäß bevorzugt alternativ ein Zellklon. Die Zellkultur kann erfindungsgemäß auch mehrere Zelltypen oder Zellarten umfassen, bevorzugt kann die Zellkultur aus mehreren Zelltypen oder Zellarten bestehen beziehungsweise diese umfassen. Die Zellkultur kann erfindungsgemäß bevorzugt aus Zellverbänden bestehen oder Zellverbände umfassen.
Erfindungsgemäß bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein Batch-Verfahren, um ein Split-Batch- Verfahren, um ein Fed-Batch-Verfahren, um ein kontinuierliches Verfahren oder um ein Perfusionsverfahren.
Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH-Wert des Nährmediums bei Beendigung des Kultivierens 7,2 oder basischer, mehr bevorzugt 7,3 oder basischer, besonders bevorzugt 7,4 oder basischer, insbesondere bevorzugt 7,5 oder basischer, ganz besonders bevorzugt 7,6 oder basischer, am meisten bevorzugt 7,7 oder basischer.
Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH-Wert des Nährmediums während mindestens eines Fünftels, mehr bevorzugt während mindestens zwei Fünftel, insbesondere bevorzugt während mindestens drei Fünftel, insbesondere während mindestens vier Fünftel, der Kultivierungsdauer pH 7,2 oder basischer,, mehr bevorzugt 7,3 oder basischer, besonders bevorzugt 7,4 oder basischer, insbesondere bevorzugt 7,5 oder basischer, ganz besonders bevorzugt 7,6 oder basischer, am meisten bevorzugt 7,7 oder basischer.
Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH-Wert des Nährmediums während des Kultivierungsprozesses pH 7,2 oder basischer, mehr bevorzugt 7,3 oder basischer, besonders bevorzugt 7,4 oder basischer, insbesondere bevorzugt 7,5 oder basischer, ganz besonders bevorzugt 7,6 oder basischer, am meisten bevorzugt 7,7 oder basischer.
Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH-Wert des Nährmediums während des Kultivierungsprozesses mindestens pH 6,6 und höchstens pH 7,9 , mehr bevorzugt mindestens pH 6,7 und höchstens pH 7,9, am meisten bevorzugt mindestens pH 6,8 und höchstens pH 7,9. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH-Wert des Nährmediums während des Kultivierungsprozesses mindestens pH 6,6 und höchstens 7,5 , mehr bevorzugt mindestens pH 6,7 und höchstens pH 7,5, am meisten bevorzugt mindestens pH 6,8 und höchstens pH 7,5. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt. der pH-Wert des Nährmediums während des Kultivierungsprozesses mindestens pH 6,6 und höchstens 7,2 , mehr bevorzugt mindestens pH 6,7 und höchstens pH 7,2, am meisten bevorzugt mindestens pH 6,8 und höchstens pH 7,2.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der pH Wert des Nährmediums während des Kultivierungsprozesses nie höher als pH 9,0, sehr bevorzugt nie höher als pH 8,5, mehr bevorzugt nie höher als pH 8,0, ins- besondere bevorzugt nie höher als pH 7,8, am meisten bevorzugt nie höher als pH 7,7.
Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH-Wert während des Kultivierungsprozesses des erfindungsgemäßen Verfahrens basischer als pH 7,2, bevorzugter basischer als pH 7,3, mehr bevorzugt basischer als pH 7,4, bevorzugter basischer als pH 7,5, insbesondere bevorzugt basischer als pH 7,6, am bevorzugtesten basischer als pH 7,7. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH-Wert während des Kultivierungsprozesses des erfindungsgemäßen Verfahrens mindestens in vier fünftel (4/5) der Gesamtkultivierungszeit des erfindungsgemäßen Verfahrens basischer als pH 7,2, bevorzugt basischer als pH 7,3, mehr bevorzugt basischer als pH 7,4 bevorzugter basischer als pH 7,5, insbesondere bevorzugt basischer als pH 7,6, am bevorzugtesten basischer als pH 7,7. Wobei Gesamtkultivie- rungszeit des erfindungsgemäßen Verfahrens startet wenn ein Kulturgefäß mit Zellen in der Produktionsstufe angeimpft wird. Also die Zwischenstufen einer Zellkultivierung um Zellen für die Produktionsstufe zu expandieren zählt nicht zur Gesamtkultivierungszeit.
Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH-Wert am Ende des Kulti- vierungsprozesses des erfindungsgemäßen Verfahrens basischer als pH 7,2, bevorzugt basischer als pH 7,3, mehr bevorzugt basischer als pH 7,4 bevorzugter basischer als pH 7,5, insbesondere bevorzugt basischer als pH 7,6, am bevorzugtesten basischer als pH 7,7. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH Wert des erfin- dungsgemäßen Verfahrens höchsten 7,8 mehr bevorzugt höchstens 8,0. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Nährmediums, insbesondere eines erfindungsgemäße Zellkulturmediums, wobei mindestens eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Iso- citronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milchsäure und Mischungen davon sowie Salze, Derivate oder Komplexe dieser Säuren, in Wasser oder einem Zellkulturlösemittel beziehungsweise Nährmediumlösemittel, insbesondere einem Zellkultur- mediumlösemittel, oder einem herkömmlichen Nährmedium, insbesondere Zellkulturmedium, gelöst wird beziehungsweise werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Nährmediums, insbesondere eines erfindungsgemäßen Zellkulturmediums, wobei mindestens eine Substanz, aus- gewählt aus der Gruppe bestehend aus Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milchsäure und Mischungen davon sowie Salze oder Komplexe dieser Säuren, in Wasser oder einem Zellkulturlösemittel beziehungs- weise Nährmediumlösemittel, insbesondere einem Zellkulturmediumlösemittel, oder einem herkömmlichen Nährmedium, insbesondere Zellkulturmedium, gelöst wird beziehungsweise werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, insbesondere ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Kultivieren einer Zellkultur, zur Selek- tion einer genetisch modifizierten, insbesondere metabolisch optimierten, Zelle aus einer Zellpopulation, wobei a) eine Zellkultur als Zellpopulation in einem erfindungsgemäßen Nährmedium für mindestens eine Woche kultiviert wird, besonders bevorzugt von min- destens vier Wochen kultiviert wird; und anschließend b) die Zelle isoliert wird. Die isolierte Zelle ist eine lebende Zelle. Erfindungsgemäß bevorzugt findet die Kultivierung gemäß einer erfindungsgemäßen Kultivierungsmethode statt.
Es zeigte sich überraschender Weise, dass sich bei Kultivierung in einem erfindungsgemäßen Nährmedium neuartige Zellen selektieren und isolieren lassen, die genetisch modifiziert sind. Die genetische Modifikation zeigt sich beispielsweise durch eine Veränderung, insbesondere Verbesserung des Zellmetabolismus. Insbesondere sol- che Zellen mit einem solchen veränderten Zellmetabolismus wachsen im vergleich zu herkömmlichen Zellen besonders gut, beziehungsweise überhaupt, in einem erfindungsgemäßen Medium. Der veränderte Zellmetabolismus entsteht durch genetische Modifikationen. Somit lassen sich durch Kultivierung von Zellpopulationen in einem erfindungsgemäßen Nährmedium solche Zellen isolieren, die genetisch modifiziert sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die mindestens eine in Schritt b) isolierte Zelle in einem weiteren Schritt c) in ein neues Kulturmedium überführt. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist das neue Nährmedium ein frisches Nährmedium. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist das neue Nährmedium ein erfindungsgemäßes Nährmedium. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist das neue Nährmedium ein nicht erfindungsgemäßes Nährmedium, also ein Nährmedium aus dem Stand der Technik. Erfindungsgemäß bevorzugt wird die mindestens eine in Schritt b) isolierte Zelle in Schritt c) expandiert. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Nährmedium bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens einen pH Wert von basischer als 7,2, bevorzugt basischer als pH 7,3, noch mehr bevorzugt basischer als pH 7,4, bevorzugter basischer als pH 7,5, insbesonde- re bevorzugt basischer als pH 7,6, am bevorzugtesten basischer als pH 7,7.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Nährmedium bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mindestens in vier fünftel (4/5) der Gesamtkultivierungszeit einen pH-Wert basischer als pH 7,2, bevorzugt basischer als pH 7,3, mehr bevorzugt basischer als pH 7,4 bevorzugter basischer als pH 7,5, insbesondere bevorzugt basischer als pH 7,6, am bevorzugtesten basischer als pH 7,7. Die Gesamtkultivierungszeit des erfindungsgemäßen Verfahrens startet wenn ein Kulturgefäß mit Zellen in der Produktionsstufe angeimpft wird. Also die Zwischenstufen einer Zellkultivierung um Zellen für die Produktionsstufe zu expandieren zählt nicht zur Gesamtkultivierungszeit.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Nährmedium am Ende des Kultivierungsprozesses einen pH Wert von basischer als 7,2, bevorzugt basischer als pH 7,3, noch mehr bevorzugt basischer als pH 7,4, bevorzugter basischer als pH 7,5, insbesondere bevorzugt basischer als pH 7,6, am bevorzugtesten basischer als pH 7,7. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt der pH Wert höchstens 7,8 mehr bevorzugt höchstens 8,0.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die mindestens eine Zelle mindestens eine Passage, besonders bevorzugt mindestens 2 Passagen, am meisten bevorzugt mindestens 5 Passagen lang subkultiviert. Erfindungsgemäß bevorzugt wird die mindestens eine Zelle so lang subkultiviert wird, bis ein Splitverhältnis von größer 1 zu 4 erreicht wird.
Die Erfindung betrifft auch eine selektierte Zelle, erhältlich aus einem erfindungemäßen Verfahren. Erfindungsgemäß bevorzugt kann die Zelle Lactat als Kohlenstoffquelle metabolisieren. Erfindungsgemäß bevorzugt besitzt die Zelle ein Splitverhältnis von mindestens 1 zu 4 mit Galactose als einziger Kohlenstoffquelle. Erfindungsgemäß bevorzugt besitzt die Zelle in einem Glucose- und Glutamin-freien Me- dium ein Splitverhältnis von mindestens 1 zu 4. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt die Wachstumsrate (μ) der Zelle weniger als 24 Stunden, besonders bevorzugt weniger als 20 Stunden, besonders bevorzugt weniger als 18 Stunden. Die Erfindung betrifft auch eine Zellkultur, die mindestens eine erfindungsgemäße Zelle enthält.
Erfindungsgemäß bevorzugt kann die Zellkultur Lactat als Kohlenstoffquelle metabolisieren. Erfindungsgemäß bevorzugt besitzt die Zellkultur ein Splitverhältnis von mindestens 1 zu 4 mit Galactose als einziger Kohlenstoffquelle. Erfindungsgemäß bevorzugt besitzt die Zellkultur in einem Glucose- und Glutamin-freien Medium ein Split- Verhältnis von mindestens 1 zu 4. Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt die Wachstumsrate (μ) der so isolierten Zellkultur weniger als 24 Stunden, besonders bevorzugt weniger als 20 Stunden, besonders bevorzugt weniger als 18 Stunden.
Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Gewinnung eines biolo- gischen Produkts aus mindestens einer Zelle, wobei die mindestens eine Zelle gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert und daraus das biologische Produkt gewonnen wird. Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung gefundenen Substanzen sind insbesondere Bernsteinsäure, Apfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure und Milchsäure. Erfindungsgemäß sehr be- vorzugt kann zu diesen Substanzen auch Citronensäure gehören.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung notwendigen Substanzen können insbesondere einzeln in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, addiert werden, vorzugsweise werden sie, das heißt einige oder alle miteinander kombiniert. Bevorzugt ist aber auch die Kombination mit anderen Kohlenhydraten. Die geeigneten Kohlenhydrate sind vorzugsweise aus Mono- und Disacchari- den wie etwa Glucose, Galactose, Glucosamin, Fructose, Ribose, Mannose, Saccharose, Lactose ausgewählt. Man kann als Kohlen- hydratquelle eine oder mehrere dieser Kohlenhydrate wählen.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung notwendigen Substanzen können in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, verwendet werden, welches Glutamin beinhaltet, oder welches Glutamin-frei ist, oder geringe Glutaminkonzentration beinhal- tet, zum Beispiel weniger als 8 mM, oder das Nährmedium, insbesondere Zellkulturmedium, kann Glutaminersatzstoffe beinhalten, zum Beispiel Alanyl-Glutamin oder Glycyl-Glutamin oder das Nährmedium, insbesondere Zellkulturmedium, kann eine Mischung mehrerer glutaminhaltiger Peptide beinhalten.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung notwendigen Substanzen können bevorzugt in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, verwendet werden, welches Asparagin oder Aspa- raginersatzstoffe beinhaltet. Die Konzentration von Asparagin oder der Asparaginersatzstoffe kann bevorzugt zum Beispiel höher als 0,05 g/l, mehr bevorzugt höher als 0,15 g/l, besonders bevorzugt höher als 0,3 g/l, am bevorzugtesten höher als 0,6 g/l sein. Asparaginersatzstoffe können bevorzugt z.B. asparaginhaltige Peptide sein, zum Beispiel aber nicht limitiert Leu-Asn (Sigma, Katalognummer: L0641 ), oder Ile-Asn (Sigma, Katalognummer: I3635), oder Glu-Asn- GIy (Sigma, Katalognummer: P5148). Die Peptide können bevorzugt grundsätzlich 2 Aminosäuren oder mehr als 2 Aminosäuren, insbesondere 3 oder 4 Aminosäuren, beinhalten.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung notwendigen Substanzen können bevorzugt in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, verwendet werden, welches Glutamat oder Gluta- matersatzstoffe beinhaltet. Die Konzentration von Glutamat oder Glutamatersatzstoffe kann bevorzugt zum Beispiel höher als 0,05 g/l, mehr bevorzugt höher als 0,15 g/l, besonders bevorzugt höher als 0,3 g/l, am bevorzugtesten höher als 0,6 g/l sein. Glutamatersatz- satzstoffe können bevorzugt z.B. Glutamathaltige Peptide sein, zum Beispiel aber nicht limitiert Asp-Glu (Sigma, Katalognummer: A1916- 250MG), GIu-GIu (Sigma, Katalognummer: G3640-25MG), Glu-His (Sigma, Katalognummer: G6882-100MG), Glu-Leu (Sigma, Katalognummer. G7007-10MG), Glu-Lys (Sigma, Katalognummer: G5136- 25MG). Die Peptide können bevorzugt grundsätzlich 2 Aminosäuren oder mehr als 2 Aminosäuren, insbesondere 3 oder 4 Aminosäuren, beinhalten.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende Problem auch durch die Bereitstellung eines Nährmediums, einer Zellkultur oder eines Verfahrens zur Verbesserung oder Verlängerung der Prozessdauer, des Zellwachstums einer Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, in einem wässrigen System, erfindungsgemäß bevorzugt in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, wobei das Zellwachstum über die Zugabe der obengenannter Substanzen, bevorzugt in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturme- dium, verbessert wird. Insbesondere stellt die Erfindung ein Nährmedium, eine Zellkultur und ein Verfahren zur Erzielung höheres Zellwachstum oder zur Verlängerung der Zellvitalität oder zur Reduzierung der metabolischen Nebenproduktbildung einer Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, in einem wässrigen System be- reit, erfindungsgemäß bevorzugt in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, wobei das Zellwachstum über die Zugabe der organischen Säuren in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, verbessert wird.
Gemäß der Erfindung ist das Nährmedium dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium bevorzugt eine organische Säure oder Salze dieser beinhaltet. Durch die Zugabe der erfindungsgemäßen Substanzen wird das Zellwachstum und/oder die Produktbildung erhöht, oder die Kulturdauer verlängert und/oder die Bildung von metabolischen Nebenprodukten reduziert.
Gemäß der Erfindung ist die Zellkultur dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultur in einem Medium mit erfindungsgemäßen Substanzen überleben kann oder teilen kann oder die höchste erreichte Zellkonzentration (peak cell density) erhöht wird, oder die stationäre Wachstumsphase verlängert wird oder die Absterbephase verlang- samt wird, oder die Bildung der Zell-metabolischen Nebenprodukte, zum Beispiel Ammonium oder Lactat reduziert wird, wobei das Medium bevorzugt niedrige Glutaminkonzentration oder kein Glutamin beinhalten kann, und hohe Asparaginkonzentration beinhalten kann, Glukose oder andere Kohlenhydrate beinhalten kann, insbesondere Glukosefrei ist oder Galaktose beinhaltet. Anstelle der hohen Aspa- raginkonzentration kann bevorzugt auch eine hohe Glutamatkon- zentration beinhaltet sein.
Zellwachstum ist erfindungsgemäß das Wachstum der Zellkultur, primär, aber nicht ausschließlich hervorgerufen durch mindestens eine Zellteilung mindestens einer Zelle. Wird das Zellwachstum erhöht, so wird dies primär durch eine Erhöhung der Zellteilungsfrequenz (Zeilwachstumsrate, auch μ genannt) verursacht.
Die stationäre Wachstumsphase einer Zellkultur ist eine dem Fachmann bekannte typische Wachstumsphase einer Wachstumskurve einer Zellkultur. Diese Wachstumskurve beinhaltet eine Anlaufphase, eine exponentielle Wachstumshase, eine stationäre Wachstumsphase und eine Absterbephase. Der Verlauf dieser Phasen kann variieren. Auch können Verlauf und Dauer dieser Phasen beeinflusst werden, beispielsweise durch Zugabe der erfindungsgemäßen Substanzen in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium.
Unter dem Integral der Lebendzellkonzentration wird die Lebendzell- konzentration über einen bestimmten Zeitraum hinweg gemeint (Renard, J. M., et.al., Biotechnology Letters, 1988, 10(2): 91-96). Das Integral der Lebendzellkonzentration ist also insbesondere die Anzahl aller lebenden Zellen über einen Prozesszeitraum, insbesondere über den Zeitraum der Zellkultivierung. Das Integral der Lebend- zellkonzentration kann entweder durch die Anzahl der Zellen oder durch die Dauer des Prozesses verändert werden. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt durch ein erfindungsgemäßes Nährmedium oder Verfahren eine Vergrößerung des Integrals der Lebendzellkonzentration.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Zellwachstum verbessert oder die höchste erreichte Zellkonzentration (peak cell density) erhöht, oder die Stationäre Wachstumsphase verlängert oder die Absterbephase verlangsamt, oder die Bildung der Zell-metabolischen Nebenprodukte, zum Beispiel Ammonium oder Lactat reduziert.
Erfindungsgemäß bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein Batch-Verfahren, um ein Split-batch Ver- fahren (wiederholter Satzbetrieb), um ein Fed-batch-Verfahren, um ein kontinuierliches Verfahren oder um ein Perfusionsverfahren.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird in einem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, zur Herstellung eines biologischen Produktes verwendet. Erfindungsgemäß be- vorzugt ist das biologische Produkt ausgewählt aus mindestens einem Polypeptid, mindestens einem Protein, mindestens einem Virusbestandteil, mindestens einem Virus oder aus einer Mischung aus diesen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das biologische Produkt mindestens ein Impfstoff.
Für die Produktion eines gewünschten biotechnologischen Produkts, insbesondere eines Polypeptids, Proteins oder eines Impfstoffs, werden je nach Produkt entweder prokaryotische Zellen, zum Beispiel Bakterien, oder eukaryontische Zellen, zum Beispiel Hefezellen oder Pflanzenzellen, insbesondere aber tierische Zellen, bevorzugt Säu- gerzellen, eingesetzt. Das Gen des zu produzierenden Produkts kann in den Wirtszellen in natürlicher Weise oder rekombinant vorkommen. Das Produktspektrum kann variieren von Peptiden mit we- nigen Aminosäuren bis zu ganzen Viren. Besonders bei komplexen Proteinen, die nach der Translation in einem post-translationalen Prozess verändert, insbesondere glykosyliert werden, werden bevorzugt tierische Zellen eingesetzt. In einer weiteren Variante ist vorge- sehen, andere eukaryontische Zellen einzusetzen, beispielsweise Hefe.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das biologische Produkt aus Zellkultur und/oder aus dem Zellkulturüberstand, oder aus den Zellen (intrazellulär) selbst gewonnen.
Erfindungsgemäß bevorzugt kann das biologische Produkt auch die Zelle selbst sein, zum Beispiel es kann eine Primärzelle, eine Stammzelle, ein Primärzellverband, ein Gewebebestandteil, oder ein komplettes Gewebe sein.
Erfindungsgemäß bevorzugt enthält die mindestens eine Zelle min- destens ein Gen, das das biologische Produkt kodiert. Das Gen kann ein Fremdgen sein, also ein Gen, welches in natürlicher Art und
Weise in der Produktionszelle nicht vorkommt oder das Gen kann ein zelleigenes Gen sein, welches in natürlicher Art und Weise in der
Produktionszelle vorkommt. So ein zelleigenes Gen kann zum Bei- spiel in der Produktionszelle aktiv oder inaktiv vorkommen. Wenn das zelleigene Gen inaktiv war, kann das Gen durch externer Zugriff aktiviert worden sein.
Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Kultivierung mindestens einer Zelle als Zellkultur, wobei die mindestens eine Zelle in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, kultiviert und dabei erfindungsgemäß bevorzugt in ihrem Zellwachstum gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahrens stimuliert wird. Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Gewinnung eines biologischen Produkts aus mindestens einer Zelle, wobei die mindestens eine Zelle gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert und daraus das biologische Produkt gewonnen wird.
Es wurde überraschender Weise gefunden, dass gerade diese organische Säuren (Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto- Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxal- bernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milchsäure) Zellwachstum und/oder Polypeptidproduktion fördern und/oder Stoffwechsel- Nebenproduktbildung unterdrücken, besonders, wenn man höhere Konzentrationen einsetzt. Insbesondere, wenn man diese Komponenten in einem glutaminfreien oder glutaminarmen Nährmedium einsetzt, oder in einem Medium mit hoher Asparaginkonzentration, oder Asparaginersatzstoffkonzentration einsetzt, oder in einem Me- dium mit hoher Glutamatkonzentration, oder mit hoher Glutaminer- satzstoffkonzentration einsetzt, oder in einem Medium mit oder ohne Glukose einsetzt, oder mit Galaktose einsetzt. In dieser Hinsicht unterscheidet sich die vorliegende Erfindung von der Lehre nach der EP 0 435 911 B1. In der genannten Patentschrift wird vorgeschla- gen, höhere Glutaminkonzentration (größer als 8 mM) in Medien einzusetzen, während die vorliegende Erfindung bevorzugt eine reduzierte Glutaminkonzentration, insbesondere ein glutaminfreies Nährmedium, beansprucht.
In der EP 0 435 911 B1 , (Seite 8, Zeile 14, und Seite 14) wurden die Komponenten Succinat, Malat, α-Keto-Glutarat, Fumarat und Citrat als Chelatoren für Metalionen in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, getestet. Anhand der durchgeführten Experimente wurde herausgefunden, dass Citrat ein guter Chelator für die Metallionen ist (Seite 22, Anspruch 5). Außer Citrat scheinen die anderen getesteten organischen Säuren kein zufrieden stellendes Resultat geliefert zu haben. Da das Ziel war, in EP 0 435 911 B1 einen guten Metallchelator zu finden, hat man sehr geringe Konzent- rationen der getesteten organischen Säuren eingesetzt (Malat = 10,7 mg/l, α-Keto-Glutarat = 5,9 mg/l, Succinat = 0,96 mg/l, Fumarat = 0,88 mg/l). Außerdem werden in EP 0 435 911 B1 diese Substanzen ausdrücklich in einem Medium mit einer Glutaminkonzentration von größer als 8 mM eingesetzt, weil dies die Erfindung dieser Druck- schrift ist. Ein anderer Unterschied zwischen der Lehre der EP 0 435 911 B1 und der vorliegenden Erfindung ist, dass man die erfindungsgemäßen Substanzen als Modulatoren des Stoffwechsels einsetzt. In diesem Zusammenhang können die Substanzen in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, bevorzugt verwendet werden, welches Kohlenhydrate und/oder Glutamin beinhaltet. Die organischen Säuren können aber auch bevorzugt in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, verwendet werden, welches keine Kohlenhydrate und/oder kein Glutamin enthält. In EP 0 435 911 B1 sind die Hauptenergie- und Kohlen- stoffquellen der Zellen Glucose und Glutamin, sodass die Substanzen in der geringen Konzentration keine Bedeutung als Stoffwechsel-Modulator haben.
Es wurde überraschender Weise gefunden, dass gerade einer der bekanntesten Stoffwechsel-Nebenprodukte von Zellen, nämlich Lac- tat, das Zellwachstum und das Integral der Lebendzellkonzentration fördert. Es gibt zahlreiche Publikationen darüber, dass Lactat ein Stoffwechselnebenprodukt ist und sogar für die Zellen toxisch sei. Es wurde überraschender Weise herausgefunden, dass Lactat einen positiven Effekt auf das Zellwachstum hat, wenn das Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, kein Glutamin enthält oder geringe Konzentration von Glutamin enthält, zum Beispiel eine Gluta- minkonzentration von weniger als 8 mM enthält, oder wenn Glutamin mit glutaminhaltigen Glutaminersatzstoffen ersetzt worden ist, oder wenn das Medium Asparagin enthält, besonders wenn Asparagin in höherer Konzentration vorkommt, z.B. die Asparaginkonzentration höher als 0,3 g/l ist, oder wenn Asparagin mit asparaginhaltigen Ersatzstoffen ersetzt worden ist, oder wenn das Medium Glutamat enthält, besonders wenn die Glutamatkonzentration höher als 0,3 g/l ist, oder wenn Glutamat mit glutamathaltigen Ersatzstoffen ersetzt worden ist, oder das Medium mit oder ohne Glukose formuliert worden ist, besonders wenn das Medium glukosefrei ist, insbesondere wenn das Medium Galactose enthält. Der positive Effekt von Lactat ist besonders dann ersichtlich, wenn das Medium kein Glutamin beinhaltet und als Kohlenstoffquelle andere Kohlenhydrate beinhaltet als Glukose, besonders wenn das Medium Galactose beinhaltet.
Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft somit ein Nährmedium, insbesondere ein Zellkuturmedium, zur Kultivierung einer Zelle, oder zur Gewinnung eines Polypeptids, eines Proteins oder eines Impfstoffes (zum Beispiel eines Virus) aus Organismen, insbesondere aus Zellen oder Zellkulturen, bevorzugt aus eukaryontischen Zellen oder Zellkulturen, wobei die Organismen in einem geeigneten Medium kultiviert werden und das gewünschte Polypeptid oder Protein oder der Impfstoff aus den Organismen und/oder dem Kulturüberstand gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellwachstum durch die Zugabe von Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronen- säure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milchsäure und Mischungen davon sowie Salze oder Komplexe dieser Säuren in einem Nährmedium, insbesondere in einem Zellkulturmedium, stimuliert wird.
Ein zweiter bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung einer Zelle, oder zur Gewinnung eines Polypeptids, eines Proteins oder eines Impfstoffes (zum Beispiel eines Virus) aus Organismen, insbesondere aus Zellen oder Zellkulturen, bevorzugt aus eukaryontischen Zellen oder Zellkulturen, wobei die Organismen in einem geeigneten Medium kultiviert werden und das gewünschte Polypeptid oder Protein oder der Impfstoff aus den Organismen und/oder dem Kulturüberstand gewonnen wird, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die Organismen mit einem Nährmedium kontaktiert werden, welches mindestens eine der folgenden Substanzen enthält: Citronensäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, α- Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milchsäure und Mischungen davon sowie Salze oder Komplexe dieser Säuren.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium wird dadurch erzielt, dass das Nährmedium Glutamin-arm ist, zum Beispiel eine Glutaminkonzentration von kleiner als 8 mM, bevorzugt kleiner als 5 mM, besonders bevorzugt kleiner als 3 mM, am meisten bevorzugt kleiner als 2 mM aufweist.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium, insbesondere in das Zellkulturmedium, wird dadurch erzielt, dass das Nährmedium und/oder Feedmedium frei von Glutamin ist.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substan- zen ins Nährmedium wird dadurch erzielt, dass das Nährmedium glutaminhaltige Glutamin-Ersatzstoffe beinhaltet. Die Glutaminhaltige Glutaminersatzstoff-Konzentration in Nährmedium ist dabei bevorzugt mindestens 50 mg/1, bevorzugter mindestens 250 mg/1, besonders bevorzugt mindestens 500 mg/1, am meisten bevorzugt mindes- tens 1000 mg/l. Die Glutaminhaltige Glutaminersatzstoff- Konzentration in Nährmedium ist dabei bevorzugt auch mindestens 0,05 g/l, bevorzugter mindestens 0,2 g/l, besonders bevorzugt mindestens 0,8 g/l, am meisten bevorzugt mindestens 3,2 g/l.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium wird dadurch erzielt, dass das Nährmedium Asparagin oder Asparagin-Ersatzstoffe beinhaltet. Die Asparagin- oder Asparagin-Ersatzstoffkonzentration im Nährmedium ist bevor- zugt mindestens 0,05 g/l, bevorzugter mindestens 0,15 g/l, besonders bevorzugt mindestens 0,3 g/l, am meisten bevorzugt mindestens 0,6 g/l. Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium wird dadurch erzielt, dass das Nähr- medium Glutamat oder Glutamat-Ersatzstoffe beinhaltet. Die Glutamat- oder Glutamat-Ersatzstoffkonzentration im Nährmedium ist bevorzugt mindestens 0,05 g/l, bevorzugter mindestens 0,15 g/l, be- sonders bevorzugt mindestens 0,3 g/l, am meisten bevorzugt mindestens 0,6 g/l.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substan- zen ins Nährmedium wird dadurch erzielt, dass das Nährmedium Glucose-frei ist.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium wird dadurch erzielt, dass das Nährmedium Galactose enthält. Die Galactosekonzentration ist mindestens 0,1 g/l, bevorzugt mindestens 1 g/l, besonders bevorzugt mindestens 5 g/l, am meisten bevorzugt mindestens 25 g/l. Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium wird da- durch erzielt, dass das Nährmedium Lactat enthält. Die Lactatkon- zentration ist mindestens 0,1 g/l bevorzugt mindestens 1 g/l, besonders bevorzugt mindestens 5 g/l, am meisten bevorzugt mindestes 25 g/l.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium wird dadurch erzielt, dass das Nährmedium und/oder Feedmedium frei von Glutamin oder glutaminhaltigen Ersatzstoffen ist.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium, insbesondere ins Zellkulturmedium, wird dadurch erzielt, dass das Feedmedium glutaminhaltige Glutamin- Ersatzstoffe beinhaltet. Die glutaminhaltige Glutaminersatzstoff- Konzentration im Feedmedium ist bevorzugt mindestens 0,2 g/l, bevorzugter mindestens 1 g/l, besonders bevorzugt mindestens 5 g/l, am meisten bevorzugt mindestens 10 g/l.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium, insbesondere ins Zellkulturmedium, wird dadurch erzielt, dass das Feedmedium Asparagin oder Asparagin- Ersatzstoffe beinhaltet. Die Asparagin- oder Asparagin- Ersatzstoffkonzentration im Feedmedium ist bevorzugt mindestens 0,2 g/l, bevorzugt mindestens 1 g/l, besonders bevorzugt mindestens 5 g/l, am meisten bevorzugt mindestens 10 g/l.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenannten Substan- zen ins Nährmedium, insbesondere ins Zellkulturmedium, wird dadurch erzielt, dass das Feedmedium Glutamat oder Glutamat- Ersatzstoffe beinhaltet. Die Glutamat- oder Glutamat- Ersatzstoffkonzentration im Feedmedium ist bevorzugt mindestens 0,2 g/l, bevorzugter mindestens 1 g/l, besonders bevorzugt mindes- tens 5 g/l, am meisten bevorzugt mindestens 10 g/l.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium, insbesondere ins Zellkulturmedium, wird dadurch erzielt, dass das Feedmedium Lactat oder Lactat-Derivate be- inhaltet. Die Lactat. oder Lactat-Derivatkonzentration im Feedmedium ist bevorzugt mindestens 1 g/l, bevorzugter mindestens 5 g/l, be- sonders bevorzugt mindestens 25 g/l, am meisten bevorzugt mindestens 100 g/l.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substan- zen ins Nährmedium, insbesondere in das Zellkulturmedium, wird dadurch erzielt, dass das Feedmedium Glucose-frei ist. Die Gluco- sekonzentration im Feedmedium ist bevorzugt maximal 100 g/l, bevorzugt maximal 25 g/l, besonders bevorzugt maximal 5 g/l, am meisten bevorzugt maximal 1 g/l.
Die gemäß diesem Aspekt der Erfindung besonders bevorzugte Wachstumsstimulierung durch Zugabe der obengenanten Substanzen ins Nährmedium, insbesondere in das Zellkulturmedium, wird dadurch erzielt, dass das Feedmedium Galactose beinhaltet. Die Galactosekonzentration im Feedmedium ist bevorzugt mindestens 1 g/l, bevorzugt mindestens 5 g/l, besonders bevorzugt mindestens 25 g/l, am meisten bevorzugt mindestens 100 g/l.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft eine Zelle oder eine Zellkultur, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellkultur in einem Medium mit erfindungsgemäßen Substanzen überleben kann oder tei- len kann oder deren höchste erreichte Zellkonzentration (peak cell density) erhöht ist, oder deren stationäre Wachstumsphase verlängert ist oder deren Absterbephase verlangsamt ist, oder deren Bildung der Zell-metabolischen Nebenprodukte, zum Beispiel Ammonium oder Lactat reduziert ist.
Aufgrund der Wachstumsstimulierung durch die Zugabe der erfindungsgemäßen Substanzen ins Nährmedium, insbesondere in das Zellkulturmedium, kann erfindungsgemäß bevorzugt bei einer Hoch- zelldichtefermentation (höchste erreichte Gesamtzellkonzentration während der Fermentation beispielsweise insbesondere >1x105 Zellen/ml, vorzugsweise > 1x106 Zellen/ml im Großmaßstab (Arbeitsvolumen > 1 I, zum Beispiel 30 - 20 000 I) die höchste erreichte ZeII- konzentration (peak cell density) erhöht werden, oder die stationäre Wachstumsphase verlängert werden, wobei die Zellvitalität länger hoch bleibt, d.h. das Integral der Lebendzellkonzentration erhöht wird und dadurch die Produktausbeute erhöht wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich zur Herstellung beliebiger Polypeptide, Proteine oder Impfstoffe, wie zum Beispiel zur Virusproduktion, geeignet. Bevorzugt sind jedoch Polypeptide, die glykosyliert oder nicht glykosyliert sein können. Die Polypeptide können beispielsweise natürliche, humane Polypeptide oder rekom- binante Varianten humaner Polypeptide sein.
Das erfindungsgemäße Nährmedium ist bevorzugt zur Herstellung der Polypeptide mit post-translationalen Modifikationen, insbesondere zur Herstellung von Glykoproteinen geeignet. Die Zugabe der erfindungsgemäßen Substanzen in ein Nährmedium, insbesondere in ein Zellkulturmedium, kann bestimmte Glykosylierungspathways för- dem oder inhibieren und somit für die Bildung einer gewünschten Glykostruktur des gewünschten Polypeptides oder des Impfstoffes förderlich sein. Die erfindungsgemäßen Substanzen können einzeln oder in Kombination miteinander bestimmte post-translationale Modifikation in der Zelle fördern oder inhibieren, mit dem Resultat, dass in der Produktion die gewünschten Polypeptidvarianten oder Impfstoffvarianten exprimiert werden. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Substanzen die Proteinsialilierung oder die Proteingalac- tosilierung erhöhen. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen und Nährmedien läuft der pH-Wert des Zeilkultivierungsprozesses sehr atypisch am oberen Ende des Sollwertes. Es ist bei Zeilkultivierungsprozessen üblich, dass der pH-Wert des Prozesses mit pH 7,0 bis pH 7,1 startet, und dass die Zellen durch ihre Stoffwechselaktivitäten Säuren, insbesondere Lactat in die Kultur ausscheiden. Dadurch verschiebt sich der pH-Wert der Kultur normalerweise in Richtung saurer Bereich. Es wurde überraschender Weise festgestellt, dass sich der pH-Wert bei Anwendung des erfindungsgemäßen ZeII- kultivierungsprozesses wegen des veränderten Metabolismus der Zellen in Richtung basische pH-Werte verschiebt. Dies könnte damit zusammenhängen, ohne an die Theorie gebunden zu sein, dass die Zellen einen besseren Metabolismus haben und keine Säuren mehr in die Kultur ausscheiden. Umgekehrt, sie metabolisieren Säuren. Das ist ein anderer Beweis dafür, dass die Zellen durch die erfindungsgemäßen Substanzen und Verfahren einen anderen Metabolismus haben. Als Konsequenz liegt der pH-Wert der Kultur bei pH- Werten oberhalb von 7,2 (höher als pH 7,2 oder anders formuliert basischer als pH 7,2). Dies ist für die Proteinglykosylierung, zum Bei- spiel aber nicht limitiert für die Proteingalactosilierung oder für die Proteinsialilierung nützlich. Einige intrazelluläre Glykosylierungsen- zyme wiederum sind bei pH-Werten basischer als 7,2 aktiver, so dass sie die zu produzierenden Proteine höher glykosylieren. Das ist eine wichtige Prozesseigenschaft, die durch den Metabolismus der erfindungsgemäßen Substanzen hervorgerufen wird.
Daher ist ein vierter Aspekt der Erfindung ein Kultivierungsverfahren unter Nutzung vorgenannter Kulturmedien, bei dem der pH-Wert des Zellkultivierungsprozesses vorzugsweise basischer ist als pH 7,2, insbesondere basischer als pH 7,3, bevorzugter basischer als pH 7,4, noch bevorzugter basischer als pH 7,5 sehr bevorzugt basischer als pH 7,6, am meisten bevorzugt basischer als pH 7,7.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich zur Kultivierung prokaryontischer Zellen, zum Beispiel Bakterien, oder eukaryonti- scher Zellen, beispielsweise Hefen oder tierische Zellen, geeignet. Der Begriff „tierische Zelle" umfasst nicht-Säugerzellen und Säugerzellen. Beispiele für nicht-Säugerzellen sind Zellen von Spodoptera frugiperda, Aedes aegypti, Aedes albopictus. Bevorzugte Organismen für diese Erfindung sind jedoch Säugerzellen. Die Säugerzellen können Primärzellen sein, bevorzugt sind jedoch kontinuierliche Zelllinien. Die geeigneten kontinuierlichen Zelllinien können beispielsweise einen humanen Ursprung haben, zum Beispiel PER-C6, human liver cells (Hep G2, HB 8065), human lung cells (W138, ATCC CCL 75), human cervical Carcinoma cells (HeLa, ATCC CCL 2). Die kontinuierlichen Zelllinien können aber auch einen tierischen Ursprung haben, beispielsweise aus Maus oder Hamster abgeleitet sein, zum Beispiel SV-40 immortalisierte monkey kidney cells (COS- 7, ATCC CRL 1651), canine kidney cells (MDCK), monkey kidney cells (CV1 , ATCC CCL 70), afrikan green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587), baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10), Chinese hamster ovary cells (CHO-DG44, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1980, 77: 4216, oder CHO- DUKX, oder CHO-K1 mit ATCC-Nummer von ATCC CCL 61), lym- phocytic cells (Jurkat T-cell line), buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442), mouse mammary tumor cells (MMT 060562, ATCC CCL 51), SP2/0 Zellen, Myelomazellen (zum Beispiel NSO), Hybridomazellen und Triomazellen. Die Hybrid-Zelllinien können von irgendeiner Spezies, umfassend Mensch und Maus, stammen. Die Abkömmlinge der obengenannter Zellen sind ebenfalls geeignet in Kultivierung in erfindungsgemäßen Nährmedien und erfindungsgemäßen Verfahren.
Die gemäß dieser Erfindung bevorzugten Zellen sind allerdings aus einer Säugerzelllinie und sind keine Hybridomazellen. Die gemäß der Erfindung besonders bevorzugten Zelllinien sind alle Varianten der CHO, NSO, PERC-6 und BHK-21 -Zelllinien, wobei die Zelllinie mit einer exogenen Nukleinsäure transformiert sind, wobei die exogene Nukleinsäure für das interessierende Polypeptid kodiert. „Exogene Nukleinsäure" bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, welche in der Wirtszelle nicht vorkommt. Die exogene Nukleinsäure kann auch homolog zu einer Nukleinsäure der Wirtszelle sein, die aber in der Wirtszelle in dieser Position normaler Weise nicht zu finden ist.
Die gemäß dieser Erfindung bevorzugten Zellen sind in der Lage, in den Medien mit erfindungsgemäßen Substanzen und Verfahren ü- berieben zu können oder teilen zu können oder deren höchste erreichte Zellkonzentration (peak cell density) erhöht ist, oder deren stationäre Wachstumsphase verlängert ist oder deren Absterbephase verlangsamt ist, oder deren Bildung der zell-metabolischen Nebenprodukte, zum Beispiel Ammonium oder Lactat reduziert ist. Der Metabolismus der Zellen kann in Medien mit erfindungsgemäßen Substanzen oder in erfindungsgemäßen Verfahren angepasst sein. Diese Anpassung kann durch gezielte molekular biologische Veränderung der Zellen oder durch die Adaptation der Zellen in den erfindungsgemäßen Medien und Verfahren geschehen.
Der Begriff „Klon" bedeutet, eine Abkömmling einer Mutterzelle, zum Beispiel eine der oben gezählten Zelllinien. Ein Klon kann entstehen, wenn eine Zelle andere zelluläre Eigenschaften besitzt und sich von der ursprünglichen Mutterzelle dadurch unterscheidet. Üblicher Weise können Klone nach einem Gentransfer der Mutterzelle, zum Beispiel durch Transfektion entstehen.
Der Begriff „metabolische Optimierung" bedeutet, Anpassung oder Veränderung des Zellmetabolismus an die gewünschten Bedingungen. Die Anpassung oder Veränderung des Zellmetabolismus kann erzielt werden durch gezielte genetischer Eingriff in die Wirtszelle, in dem man bestimmte Gene in die Zelle kloniert, oder bestimmte Gene ausschaltet. Oder die Anpassung oder Veränderung des Zellme- tabolismus kann erreicht werden, wenn die Zellen unter den gewünschten Verfahrensbedingungen und/oder in Nährmedien kultiviert werden, so dass die Zelle selbst sich auf die veränderten Bedingungen anpasst. Durch die Kultivierung unter den neuen Bedingungen können neuartige Zellen entstehen, dich sich selektieren und isolieren lassen, die genetisch modifiziert sind. Die genetische Modifikation zeigt sich beispielsweise durch eine Veränderung, insbesondere Verbesserung des Zellmetabolismus. Insbesondere solche Zellen mit einem solchen veränderten Zellmetabolismus wachsen im vergleich zu herkömmlichen Zellen besonders gut unter den ge- wünschten Bedingungen, da deren Metabolismus optimiert worden ist.
Ein Produkt gemäß der Erfindung ist ein Polypeptid ein Protein oder ein Virus, welches in den Zellen exprimiert und aus dem Kultivierungssystem, also den Zellen und/oder dem Zellmedium, geerntet wird. Es kann ein jegliches interessierendes Protein sein. Es können zum Beispiel diagnostische oder therapeutische Proteine sein, wie Interleukine, Enzyme, multimere Proteine oder Subeinheiten der multimeren Proteine, sowie Antikörper oder Antikörperfragmente. Das rekombinante Gen für das interessierende Protein kann ein Signalsequenz beinhalten, welche für die Ausscheidung des interessierenden Proteins aus der Wirtszelle verantwortlich ist. Das Protein kann aus einem transgenen Promoter oder dessen natürlich aktiven Gen-Lokus, sowie einem Immunglobolin-Genlokus in Hybridomazellen exprimiert werden. Das Protein kann auch aus einem Wirtseigenen Promoter exprimiert werden, zum Beispiel wenn eine CHO-ZeIIe für Proteinproduktion benutzt wird, kann das Fremdgen aus einem CHO-Promoter exprimiert werden. Das Produkt kann aber auch ein Impfstoff sein, zum Beispiel ein Virus oder virusähnliches Partikel, welches in der Lage ist mit Hilfe einer Wirtszelle sich zu replizieren.
Die zu kultivierenden Zellen können adhärent oder auf Microcarriem wachsen, bevorzugt sind jedoch in Suspension wachsende Zellen. Weiterhin können die Zellen in serumhaltigen Kulturmedien (zum Beispiel in fetal bovine Serum, FBS, auch FCS genannten Serum) wachsen, bevorzugt ist aber ein Medium, welches kein Serum beinhaltet und „serum frei" genannt wird. Zellen in Serum-freien Medien können Insulin und Transferrin für optimales Wachstum benötigen. Transferrin kann zumindest partial durch Alternativen ersetzt werden, zum Beispiel durch Eisencitrat. Die meisten Zelllinien benötigen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren, umfassend die rekombinan- ten Polypetide oder Proteine als Wachstumsfaktor. Das Medium kann Polypeptide beinhalten, bevorzugt ist aber ein polypeptidarmes oder ein polypeptidfreies oder ein Proteinfreies Medium. Wenn das Medium ein Polypeptid beinhaltet, ist ein rekombinant hergestelltes Polypeptid bevorzugt. Das Medium kann Peptone beinhalten, die aus tierischem Ursprung stammen können, bevorzugt sind aber Peptone, die Hefe als Ursprung haben, besonders bevorzugt sind die Peptone, die aus Pflanzen stammen. Vorzugsweise werden Kulturmedien verwendet, die peptonfrei und voll chemisch definiert sind.
Unter „Nährmedium", dem Fachmann auch als „Kulturmedium" oder „Zellkulturmedium" bekannt, wird ein Medium verstanden, das der Aufbewahrung und/oder Kultivierung von Zellkulturen beziehungsweise von mindestens einer Zelle dient. Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Nährmedium ein flüssiges Nährmedium, auch Kulturflüssigkeit genannt. Als Überbegriff aller Medien wird hier der Begriff „Nährmedium" eingeführt. Nährmedium umfasst zum Beispiel, aber nicht limi- tiert die Begriffe „Basalmedium" (Kulturmedium), „Zufütterungsmedi- um" (Feedmedium) und „Perfusionsmedium". Nährmedium ist also eine Flüssigkeit, welche Nährstoffe für Zellen beinhaltet. Die erfindungsgemäßen Substanzen können in einem Nährmedium mit anderen zellulären Nährstoffen gemeinsam vorkommen. Es ist aber mög- lieh, dass die erfindungsgemäßen Substanzen in einem Nährmedium nicht vorkommen, stattdessen aus einer anderen Lösung, zum Beispiel aus einer Stammlösung in ein Nährmedium mit oder ohne Zellen extern in die Kultur zugegeben werden. Dadurch kommen die erfindungsgemäßen Substanzen nicht direkt über ein Nährmedium, insbesondere über ein Zellkulturmedium, sondern über einen Umweg mit den Zellen in Kontakt. Insofern ein Verfahren zur Kontaktie- rung der Zellen mit erfindungsgemäßen Substanzen ist ebenfalls Teil der Erfindung. Mit „Nährmedium", Kulturmedium" oder „Basalmedium" ist ein Medium, insbesondere eine Kulturflüssigkeit gemeint, welches Zellwachstum und/oder Zellvitalität und/oder Produktbildung fördert. Bevorzugt ist das Kulturmedium flüssig.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird ein Hochzelldichte-Zellkultur- Medium eingesetzt, durch welches, eine Population von tierischen Zellen in einer bestimmten Periode der Kultivierung mit einer Lebendzellkonzentration von mindestens 1x105/ml, bevorzugt mindestens 1x106/ml erreicht werden kann, mit notwendigen Nährstoffen zu versorgen. Kulturmedien, die solche Hochzelldichten mit Nährstoffen versorgen, werden mit folgenden beispielhaften Substanzen aufgestockt: Mindestens eine Aminosäure, üblicher Weise mehrere Aminosäuren bis zu alle Aminosäuren inklusive Cystin. Mindestens eine Energiequelle, üblicherweise eine Kohlenhydratquelle, beispielsweise Glucose, anorganische Salze, Vitamine, beispielsweise Vitamin C und/oder Vitamin E. Spurenelemente, auch definiert als anorganische Komponente, die in mikromolaren Konzentrationen vorkommen. Puffer, bis zu vier Nukleoside oder Nukleotide, Antioxidanzien sowie Gluthation. Lipide, beispielsweise Cholesterol, Phosphatidyl- cholin oder Lipidvorstufen beispielsweise Cholin oder Inositol. Ein Hochzelldichte-Medium wird bevorzugt mit mindestens einem der oben aufgezählten Komponenten versetzt und kann die oben aufgezählten Komponenten in hohen Konzentrationen beinhalten.
Das Nährmedium, insbesondere das Zellkulturmedium, kann optional mit einem oder mehreren oder allen Komponenten der folgenden Kategorien supplementiert werden: a) Hormone und andere Wachstumsfaktoren, zum Beispiel IGF-1 , Insulin, Transferrin, epidermaler Wachstumsfaktor b) Salze und Puffer, zum Beispiel Kalzium, Magnesium, und Phosphate c) Nukleoside und Basen, zum Beispiel Adenosin, Thymidin, Hypo- xanthin d) Protein- und Gewebehydrolysate. Die Formulierung der Kulturmedien, denen erfindungsgemäße Substanzen zugesetzt werden können, kann bevorzugt einer der publizierten Formulierungen entsprechen. Die Medienformulierungen können bevorzugt in der publizierten Art und Weise eingesetzt wer- den, oft werden sie aber modifiziert und an die Ansprüche der verwendeten Zelle angepasst. Beispiele für geeignete publizierte Kulturmedienformulierungen sind, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, L-15-Medium, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Eagle's Minimal Essentail Medium (MEM)1 Ham's F12 Medium, oder Iscoves' Modified DMEM. Diese publizierten Medienformulierungen können allein oder in Mischung in einem beliebigen Mischungsverhältnis als Basalmedienpulver verwendet werden. Die Formulierung der Kulturmedien, denen die erfindungsgemäße Substanzen zugesetzt werden können, kann besonders bevorzugt ein kommerzielles Nährmedium sein, dessen Rezeptur nicht publiziert sind, beispielsweise aber nicht limitiert, CD-CHO Medium von GIBCO, Ex-CeII 325 PF CHO Medium von Sigma (Cat. Nr.: 14340C).
„Feedmedium" oder „Zufütterungsmedium" ist ein Medium, welches während der Zellkultivierung in das Kultivierungssystem zugegeben wird, d.h. Feedmedien werden in Kultivierungssystemen gegeben, nach dem die Zellen mit einem anderen Medium, zum Beispiel einem Kulturmedium (Basalmedium) in Kontakt gekommen sind. Feedmedien beinhalten Substanzen, die das Zellwachstum und/oder die Zellvitalität und/oder die Produktbildung fördern. Durch Zugabe der Feedmedien kann die Prozesszeit verlängert werden, weil die Zellvitalität länger hoch bleiben kann. Die Feedmedien können eine oder mehrere Energiequellen beinhalten, beispielsweise Kohlenhydrate, zum Beispiel Glucose. Glucose kann im Feedmedium enthalten sein oder getrennt aus einer anderen Stammlösung in das Kultivie- rungssystem zugefüttert werden. Das Feedmedium kann eine oder mehrere Aminosäuren beinhalten. Feedmedien können nur essentielle Aminosäuren oder nur nicht-essentielle Aminosäuren, oder auch eine Mischung der beiden Aminosäuregruppen beinhalten. Das Feedmedium kann Glutamin beinhalten, oder Glutaminfrei sein oder Glutaminersatzstoffe beinhalten .oder glutaminhaltige Glutaminer- satzstoffe beinhalten oder eine Mischung aus Glutamin und gluta- minhaltigen Glutaminersatzstoffe beinhalten. Glutamin kann also in dem Feedmedium mit anderen Substanzen kombiniert sein, oder getrennt aus einer Stammlösung als Einzelsubstanz in das Kultivierungssystem zugefüttert werden. Feedmedien können nur einfache Konzentrate des Basalmediums sein, bevorzugt sind aber Feedmedien, die mehr als einfach konzentriert sind, zum Beispiel zweifach oder höher konzentrierte Formen des Basalmediums. Feedmedien- rezepturen ähneln Basalmedienrezepturen, d.h. in der Regel beinhalten die Feedmedien dieselben oder ein Teil der Substanzen, die in Basalmedien vorkommen. Feedmedien können sich von Basal- medien in ihren anorganischen Komponenten unterscheiden. Sie können zum Beispiel ein Basalmedium ohne Salze, oder eine salz- arme Variante des Basalmediums sein. Feedmedien können aber auch Substanzen umfassen, die in Basalmedienrezepturen nicht vorkommen.
Als „glutaminhaltige Substanzen", „Glutamin-Derivate" oder „glutaminhaltige Glutaminersatzstoffe" werden Substanzen gemeint, die D- oder L-Glutamin, insbesondere L-Glutamin in einem Molekül beinhalten. Dieses Molekül kann das D- oder L-Glutamin in verschiedenster Art und Weise beinhalten, beispielsweise aber nicht limitiert kann Glutamin mit einem anderen Substanz kovalent gebunden sein. Insbesondere als „glutaminhaltige Substanzen", „Glutamin-Derivate" oder „glutaminhaltige Glutaminersatzstoffe" werden Peptide oder Oligopeptide aus D- oder L-Glutamin gemeint (Roth, E. et.al., In vitro cellular & developmental biology, 1988, 24(7): 696-698). Beispielsweise kann Glutamin mit glutaminbasierten Dipeptiden zum Beispiel Alanyl-Glutamin (AIa-GIn) oder Glycyl-Glutamin (GIy-GIn) ersetzt sein (Christie, A. und Butler, M., Journal of Biotechnology, 1994, 37(3):277-90; Sanfeliu, A. und Stephanopoulus, G., Biotechnol. und Bioeng., 1999, 64(1 ): 46-53; (Kurano, N., et.al., J. Biotechnology, 1990, 15: 113-128). Der Begriff „glutaminhaltige Substanzen" ist auch in der WO 03/106661 (Seite 7, Zeile 1 ) beschrieben.
Als „Asparagin-Ersatzstoffe", „Asparagin-Derivate" oder „asparagin- haltige Asparaginersatzstoffe" werden Substanzen gemeint, die D- oder L-Asparagin, insbesondere L-Asparagin in einem Molekül beinhalten. Dieses Molekül kann das D- oder L-Asparagin in verschie- denster Art und Weise beinhalten, beispielsweise aber nicht limitiert kann Asparagin mit einem anderen Substanz kovalent gebunden sein. Insbesondere als .Asparagin-Ersatzstoffe", .Asparagin- Derivate" oder „asparaginhaltige Asparaginersatzstoffe" werden Peptide oder Oligopeptide aus D- oder L-Asparagin gemeint. Zum Bei- spiel aber nicht limitiert Leu-Asn (Sigma, Katalognummer: L0641), oder Ile-Asn (Sigma Katalognummer: I3635), oder Glu-Asn-Gly (Sigma, Katalognummer: P5148). Die Peptide können grundsätzlich 2 oder mehr als 2 Aminosäuren beinhalten.
Als „Glutamat-Ersatzstoffe", „Glutamate-Derivate" oder „glutamathal- tige Glutamat-Ersatzstoffe" werden Substanzen gemeint, die D- oder L-Glutamat, insbesondere L-Glutamat in einem Molekül beinhalten. Dieses Molekül kann das D- oder L-Glutamat in verschiedenster Art und Weise beinhalten, beispielsweise aber nicht limitiert kann GIu- tamat mit einem anderen Substanz kovalent gebunden sein. Insbesondere als „Glutamat-Ersatzstoffe", „Glutamat-Derivate" oder „glu- tamathaltige Glutamat-Ersatzstoffe" werden Peptide oder Oligopeptide aus D- oder L-Glutamat gemeint. Zum Beispiel aber nicht limitiert Asp-Glu (Sigma, Katalognummer: A1916-250MG)1 GIu-GIu (Sigma, Katalognummer: G3640-25MG), Glu-His (Sigma, Katalognummer: G6882-100MG), Glu-Leu (Sigma, Katalognummer: G7007-10MG), Glu-Lys (Sigma, Katalognummer: G5136-25MG). Die Peptide können grundsätzlich 2 oder mehr als 2 Aminosäuren beinhalten.
Als „Lactat-Ersatzstoffe", oder „lactathaltige Lactat-Ersatzstoffe" oder „Lactat-Derivate" werden Substanzen gemeint, die D- oder L-Lactat, in einem Molekül beinhalten, zum Beispiel aber nicht limitiert Iron (II) lactate hydrate (Sigma, Katalognummer: 44953), oder Manganase (II) lactate trihydrate (Sigma, Katalognummer: 13227) oder Lactose. Das Molekül kann das D- oder L-Lactat in verschiedenster Art und Weise beinhalten, beispielsweise aber nicht limitiert kann Lactat mit einem anderen Substanz gebunden sein, zum Beispiel aber nicht limitiert (+) Ethyl D-Lactate (Sigma, Katalognummer: 69796). Lactat- Derivate sind auch Moleküle, die leicht intrazellulär in Lactat umge- wandelt werden können, zum Beispiel aber nicht limitiert Pyruvat o- der Alanin. In diesem Falle kann Pyruvat ins Nährmedium zugegeben werden. Extrazelluläre Pyruvat wird leicht in die Zelle transportiert und durch Pyruvat-Dehydrogenase in Lactat umgewandelt. Im Falle Alanin, kann exrazelluläres Alanin in die Zelle transportiert wer- den und durch Alanintransaminase über Pyruvat-Zwischenstufe in Lactat umgewandelt werden. Dies gilt auch für alaninhaltige Peptide, daher werden alaninhaltige Peptide ebenfalls als „Lactat-Derivate" definiert. Der Begriff „Splitverhältnis" auch „Verdünnungsfaktor" genannt, ist ein Maßstab um das Splitverhältnis zweier Flüssigkeiten auszudrücken. Wenn zwei Flüssigkeiten miteinander gemischt werden sollen, damit eine Zielkonzentration erreicht wird, werden die Lösungen im Verhältnis zueinander mit einem Splitverhältnis gemischt. Splitverhältnis wird Anhand folgendes Beispiel erläutert: Eine Zellkultur wurde in einem Kulturgefäß mit einer Zellkonzentration von 2 x 105/ml angeimpft und 3 Tage lang wachsen lassen. Am dritten Tag wurde die Zellkonzentration von 20 x 105/ml gemessen. Diese Kultur wird mit frischem Medium so verdünnt, damit die Zielanimpfkonzentration von 2 x 105/ml wieder erreicht wird. Man muss in diesem Falle die ausgewachsene Kultur (Inokulum) um 1:10 mit frischem Medium verdünnen. Wenn man in der neuen Kultur ein Arbeitsvolumen von 1 I haben soll, muss man 100 ml Inokulum und 900 ml frisches Medi- um nehmen. In diesem Falle hätte man ein Splitverhältnis von 1 :10.
Alle Prozessvarianten, in denen Zellen kultiviert werden, um ein gewünschtes Polypeptid, Protein oder einen gewünschten Impfstoff zu produzieren, sind grundsätzlich für die Applikation der Erfindung geeignet. Ein gemäß der Erfindung bevorzugtes Verfahren ist aber ein Hochzelldichteverfahren. Das Hochzelldichte-Zellkultur-Verfahren ist definiert als ein Verfahren, in dem in einer bestimmten Periode der Kultivierung eine Lebendzellkonzentration von mindestens 1x105/ml, bevorzugt mindestens 1x106/ml erreicht wird, wobei die Kultur von einer einzigen Zelle oder von einer anderen Zellkultur oder von ei- nem Inokulum expandiert werden kann. Gemäß der Erfindung bevorzugte Verfahrensweisen sind kontinuierliche Kultur-, Fed-batch-, Batch-, Perfusion, oder Split-batch-Verfahren. Die Kultivierung wird vorzugsweise in Batch-Verfahren durchgeführt, wobei alle Komponenten für Zellkultivierung am Beginn des Prozesses im Kulturgefäß vorgelegt werden. In Batch-Verfahren werden die Zellen in einem geeigneten Medium angeimpft und nach einer ge- wissen Kultivierungszeit geerntet. Anschließend wird das gewünschte Produkt, zum Beispiel ein Polypeptid, aus der Kultur isoliert.
Ein gemäß der Erfindung besonders bevorzugtes Verfahren ist ein Fed-batch-Verfahren, in dem die Zellen zwischen dem Animpfen und dem Ende des Prozesses mit einem weiteren Nährmedium, bei- spielsweise mit einem Feedmedium kontaktiert werden. Fed-batch Prozess startet beispielsweise aber nicht limitiert mit einem Basal- medium. In Basalmedium werden die Zellen angeimpft. Nach einer gewissen Zeit, beispielsweise aber nicht limitiert 1-4 Tage nach Animpfen wird die Kultur mit einem weiteren Nährmedium kontaktiert, beispielsweise kann dieses Nährmedium ein Feedmedium (Zufütte- rungsmedium) sein. Das Zufütterungsmedium kann batchweise, in Intervallen oder kontinuierlich über eine eingestellte Dosis in die Zellkultur zugegeben werden. Somit steigt das Volumen der Kultur während der Kultivierung an.
Eine weitere, gemäß der Erfindung geeignete Kultivierungsmethode ist die Perfusion, in dem die Zellen nach einer Wachstumsphase in einem Kulturmedium mit weiterem frischen Medium zum Beispiel mit Perfusionsmedium versorgt werden, während das verbrauchte Medium mit oder ohne Zellen aus dem Prozess abgezogen wird. Perfusi- onsmedien können sich von Kulturmedien (Basalmedien) unterscheiden, oder das gleiche Basalmedium kann auch als Perfusionsmedium eingesetzt werden. In Perfusionsverfahren werden die Zellen zuerst in ein Basalmedium inokuliert. Im Laufe der Zellkultivie- rung werden die Zellen (Biomasse) von der Zellkultur (Zellsuspension) getrennt und einerseits das verbrauchte Medium aus dem Pro- zess abgezogen, andererseits werden den Zellen neue Nährstoffe durch frisches Medium zur Verfügung gestellt. Wenn während des Prozesses Zellen im Kultursystem zurückgehalten werden, wird dies „Perfusion" genannt. Wenn während des Prozess Zellen aus dem System mit dem verbrauchten Medium mit entfernt werden, wird dies „kontinuierliches Verfahren" genannt. In Perfusionsprozessen können die Zellen auch in bestimmten Zeitabständen aus dem Kultivie- rungssystem entfernt werden um eine maximale Zellkonzentration einhalten zu können. Dieser Vorgang ist als „bleeding" dem Fachmann bekannt. Die Zelltrennung erfolgt mit unterschiedlichen Technologien, wobei einige Technologien die Zelltrennung indirekt fördern. Beispiele für einige mögliche Zeiltrennverfahren sind Filtration, Zellenkapsulierung, Zelladhärenz an Mikrocarriern, Zellsedimentation oder Zentrifugation.
Ein weiteres, gemäß der Erfindung geeignetes Verfahren ist das Split-batch-Verfahren (wiederholter Satzweise Betrieb) mit oder ohne Zufütterung der Zellen. In diesem Verfahren wird nach einer Wachs- tumsphase ein Teil der Zellsuspension geerntet und der Rest der Zellsuspension wird im Fermenter als Inokulum des nächsten Satzbetriebs gelassen. Der Fermenter wird mit diesem Inokulum anschließend wieder bis zum gewünschten Arbeitsvolumen mit frischem Medium befüllt und somit startet der zweite Satzweise- Betrieb.
Die Entfernung von Proben aus dem Kultivierungssystem für offline Messungen während oben genannter Verfahrensweisen hat mit den beschriebenen Kultivierungsverfahren nichts zu tun. Es dient lediglich dazu um den Prozess besser zu verstehen oder zu kontrollieren.
Der Begriff „Ernte" oder „Zellernte" ist ein Hinweis für das Ende eines Produktionsbatches in Upstream-Prozess. In Batch, und Fed-batch- Prozess kann der Upstreamprozess nur mit einer Ernte enden, während es in Split-batch, Perfusion- und in kontinuierlichen Verfahren mehrere Ernten geben kann. Je nach ausgewählter Verfahrensweise kann der Zellkultivierungsprozess (Upstreamprozess) eine Lag- Phase, eine Exponentiellephase, eine Stationärephase und eine Absterbephase beinhalten. Der Fermentationsprozess kann in einer dieser Wachstumsphasen beendet werden. Bevorzugt wird der Fermentationsprozess in der stationären Phase oder in Absterbephase beendet. Am Ende des Upstream-Prozesses werden die Zellen von der Suspension getrennt. Dieser Zelltrennungsprozess wird hier „Ernte" oder „Zellernte" genannt. Nach der Zellernte erfolgen weitere Aufreinigungsschritte um das Produkt isolieren zu können.
Der Begriff „Inokulation" bedeutet das Animpfen eines neuen Kultivierungssystems (zum Beispiel eines Bioreaktors und eines geeigneten Nährmediums, insbesondere eines Zellkulturmediums) mit ZeI- len. Das Inokulum, d.h. die Zellen oder die Zellsuspension werden im Voraus für diesen Zweck vorbereitet. Üblicher Weise werden die zu inokulierenden Zellen vor dem eigentlichen Produktionsprozess expandiert, sodass man genug Zellen hat, um das neue Kultivierungssystem mit gewünschter Zellkonzentration animpfen zu können.
Mit Zellwachstum ist eine Zunahme der Lebendzellkonzentration mindestens in einer der Kultivierungsphasen gemeint. Der Begriff „Zellvitalität" drückt das Verhältnis der Lebendzellkonzentration zu der Gesamtzellkonzentration aus, welches auch die toten Zellen um- fasst. Dieses Verhältnis kann auf eine beliebiger Art und Weise berechnet werden. Eine Methode ist die Markierung der Zellen mit einem Farbstoff und somit die Differenzierung der lebenden und toten Zellen. Ein Beispiel zur Unterscheidung der toten und lebenden Zellen ist der Einsatz von Tyrpanblau-Farbstoff. Die markierten Zellen werden anschließend gezählt und die Zahl der toten und lebenden Zellen bestimmt. Die Zellvitalität wird kalkuliert, in dem das Verhältnis zwischen der Lebendzellzahl und der Gesamtzellzahl gebildet wird.
Der Begriff „Osmolalität" ist ein Maßstab für den osmotischen Druck der gelösten Partikel in einer wässrigen Lösung. Die gelösten Partikel beinhalten sowohl die Ionen als auch die nicht-ionisierten Moleküle. Osmolalität ist ausgedrückt als die Konzentration der osmotisch aktiven Partikel, gelöst in 1 kg Wasser (1 mOsmol/kg H2O bei 38°C ist äquivalent zu einem osmotischen Druck von 19 mm Hg). Der Begriff „Osmolarität" bedeutet, die Anzahl der Partikel, die in 1 I Lösung gelöst sind. Substanzen, die in Kulturmedien vorkommen und die die Osmolalität der Lösung erhöhen, sind daher beispielsweise Proteine, Peptide, Animosäuren, nicht-metabolisierbare Polymere, Vitamine, Ionen, Salze, Zucker, Metabolite, organische Säuren, Lipide, etc.
Der Begriff „pH-Wert" ist der negative dekadische Logarithmus des Zahlenwertes der molaren Wasserstoffionenaktivität aH + (pH = -log aπ+). Lösungen mit einem pH-Wert kleiner 7,0 reagieren sauer, mit einem pH-Wert von 7,0 sind sie neutral. Bei Lösungen mit einem pH- Wert größer als 7,0 reagieren sie basisch. Wenn pH-Werte zweier Lösungen miteinander verglichen wird, ist die Lösung mit höherem pH-Wert definiert als „basischer" im Vergleich zu der Lösung mit niedrigerem pH-Wert, z.B. Lösung 1 hat einen pH-Wert von 6,8, Lö- sung 2 hat einen pH-Wert von 7,0. In diesem Falle ist die Lösung 2 basischer im Vergleich zu Lösung 1. pH-Werte der Herstellverfahren können in unterschiedlicher Art und Weise gemessen werden. Beispielsweise aber nicht limitiert, kann der pH-Wert eines Bioreaktors on-line mit einer pH-Elektrode gemessen werden. Eine andere Methode den pH-Wert der Kultur zu bestimmen ist eine off-line Probenahme und Detektion des pH-Wertes mit einer externen pH- Elektorde.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen sind den Unteransprüchen zu entnehmen.
Die Erfindung wird anhand folgender Beispiele näher erläutert.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Wachstumsdaten von metabolisch optimierten CHO-Zellen in einem erfindungsgemäßen Nährmedium ohne Glucose und ohne Glutamin unter Routine-Stammhaltung.
Figur 2: Wachstumskurve von Zellen in erfindungsgemäßem Nährmedium im Vergleich zu einer Kontrolle in Fed-batch Verfahren.
Figur 3: Verlauf der Lactat-Konzenration während einer Fed-batch- Kultivierung.
Figur 4: Ammonium-Bildung während einer Fed-batch-Kultivierung.
Figur 5: Verlauf des pH-Wertes eines Kultivierungs-Prozesses. Die pH-Werte wurden off-line gemessen und während der Kultivierung wurde der pH-Wert des Prozesses nicht geregelt. Figur 6: Wachstumsverhalten von Wildtypzellen (metabolisch nicht optimiert) in einer Fed-batch-Kultivierung mit erfindungsgemäßen Basalmedien und Feedmedien in unterschiedliche Kombination.
Figur 7: Wachstumsverhalten von metabolisch optimierten Zellen in einer Fed-batch-Kultivierung in erfindungsgemäßem Basalmedium und mit 2 unterschiedlichen Feedmedien.
Figur 8: Wachstumsverhalten von metabolisch optimierten Zellen in einer Fed-batch-Kultivierung in erfindungsgemäßen Nährmedien mit und ohne Natrium-Succinat.
Figur 9: Verlauf der Lactatkonzentration in erfindungsgemäßen Nährmedien mit und ohne Natrium-Succinat in einer Fed-batch- Kultivierung.
Beispiele:
Material und Methoden
Zellkulturbedingungen
Zellen wurden in der Gasphase von flüssigem Stickstoff gelagert. Ein bis zwei Ampullen wurden in 37°C vorgewärmten Nährmedium aufgetaut und in Spinnerflaschen, in Schüttelkolben oder in T-Falschen transferiert. In den ersten Kultivierungstagen erfolgte je nach Klon ein Mediumwechsel.
Zellen wurden je nach Klon entweder jeden zweiten Tag oder jeden dritten Tag oder nach abwechselnd zwei und drei Tagen in neues Medium gesplittet, d.h. ein Teil der Zellsuspension wurde der Kultur entnommen und ein kleiner Teil der Zellsuspension wurde als Inoku- lum der nächsten Kultur weiterverwendet. Dieses Inokulum wurde mit frischem vorgewärmten Nährmedium aufgestockt. Zellen wurden bei 370C in einem Brutschrank bei einer Cθ2-Atmosphäre inkubiert. Eine Alternative, um Zellen zu inkubieren war die Kultivierung in ei- nem Brutraum bei 37°C, Zellen wurden in dieser Art mehrere Passagen lang in Kultur gehalten. Mit einer Passage ist eine Kultivierungsdauer von zwei bis drei Tagen gemeint. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde aus der Stammhaltung Zellsuspension genommen und als Inokulum für Experimente verwendet. Die Experimente wur- den in diversen Kultivierungssystemen durchgeführt, zum Beispiel in Spinnerflaschen, T-Flaschen, Schüttelkolben, Kulturröhrchen oder in geregelten Bioreaktoren.
Für die Experimente wurde eine CHO Zelllinie benutzt, welche einen Antikörper exprimiert. Die Produktkonzentration (Antikörperkonzent- ration) im Zellüberstand wurde durch ELISA bestimmt.
Ein CHO-Medium von der Firma Sigma (CR 1020, Lot: 64K2403) wurde für die Experimente als Nährmedium (Basalmedium) verwendet. Das ist ein serumfreies, proteinfreies Nährmedium. Es handelt sich um ein fertig hergestelltes und steril filtriertes Nährmedium.
Die Experimente wurden entweder in Batch-Verfahren oder in Fed- batch-Verfahren durchgeführt. Wenn der Prozess im Fed-batch- Verfahren durchgeführt wurde, wurde der Prozess zuerst in der Batch-Verfahrensweise in oben genanntem Basalmedium gestartet und Zellen wurden 1-4 Tage in dieser Weise kultiviert. Nach 1-4 Ta- gen wurden die Zellen mit einem Feedmedium zugefüttert, d.h. der Prozess wurde auf Fed-batch umgestellt. Die Zufütterung erfolgte in regulären Abständen. Bei Fed-batch Experimenten wurde ein prote- infreies und serumfreies Feedmedium von der Firma HyQ (R05.2 Supplement, Cat. Nr: SH30584.04, Lot Nr: APF21457G) verwendet.
Alle verwendeten erfindungsgemäßen Substanzen (Chemikalien) wurden von der Firma Sigma erhalten und daraus Stammlösungen vorbereitet. Aus den Stammlösungen wurden die Substanzen zu der gewünschten Endkonzentration in Kulturröhrchen gegeben. Die so vorbereiteten unterschiedlichen Kulturröhrchen wurden zum Schluss mit dem Antikörper produzierenden CHO-Klon mit einer Ziel- Animpfzellkonzentration (1-3 x 105/ml) angeimpft. Dazu wurde die entsprechende Menge an Inokulumszellen kalkuliert und die benötigte Menge an Inokulums-Zellsuspension zentrifugiert. Das Zellpellet wurde zum Schluss in dem entsprechenden Volumen von frischem Nährmedium ohne erfindungsgemäßen Substanzen (Sigma, CR 1020, Lot: 64K2403) aufgenommen. Dadurch wurde in der zu unter- suchenden Zellsuspension das gewünschte Animpfzellkonzentration eingestellt. Die so vorbereitete Zellsuspension wurde in die Kulturröhrchen proportioniert, die zuvor mit den erfindungsgemäßen Substanzen versehen waren. Die Kulturröhrchen wurden bei 370C, und 8 %iger CO2 Atmosphäre unter Schütteln inkubiert. Die Kulturröhrchen wurden 8-11 Tage lang im Batch-Verfahren oder im Fed-batch- Verfahren kultiviert. Aus den Kulturgefäßen wurden in regulären Abständen, zum Beispiel täglich oder bis jeden dritten Tag, Proben genommen um Offline-Parameter zu messen. Aus den Proben wurden die metabolischen Parameter und Zellkonzentrationen gemessen. Die Zellkonzentration und die Zellvitalität wurden mit einem CeDex- Gerät gemessen. Die metabolischen Parameter (Glucose, Lactat, Glutamin und Ammonium) wurden mit einem Analyser (BioProfile 100) bestimmt. Beispiel 1 : Batch-Experiment mit den erfindungsgemäßen Substanzen
Folgende Endkonzentration der erfindungsgemäßen Substanzen wurden in einem Nährmedium nach der Inokulation eingestellt:
Natrium-Succinat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Äpfelsäure mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium α-Keto-Glutarat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Natrium-Fumarat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Weinsäure mit 0,5 g/l Endkonzentration in Nährmedium Adipinsäure mit 0,5 g/l Endkonzentration in Nährmedium Natrium-Lactat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Ornithin mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Citrullin mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium
Natrium-Pyruvat mit 0,5 g/l Endkonzentration in Nährmedium
Die erfindungsgemäßen Substanzen wurden im Batch-Verfahren getestet. Das Nährmedium oder Basalmedium (Serum freies, Protein freies CHO Medium von der Firma Sigma CR 1020, Lot: 64K2403) hatte eine Glucosekonzentration von 4,7 g/l und eine Glutaminkon- zentration von 1 ,5 mM (Tabelle 1 ).
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Tabelle 1 : Ergebnisse des Batch-Experimentes mit den erfindungsgemäßen Substanzen
Beispiel 2: Fed-batch-Experiment mit den erfindungsgemäßen
Substanzen
Folgende Endkonzentration der erfindungsgemäßen Substanzen wurden in einem Nährmedium nach der Inokulation eingestellt:
Natrium-Succinat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Äpfelsäure mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium α-Keto-Glutarat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Natrium-Fumarat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Weinsäure mit 0,5 g/l Endkonzentration in Nährmedium Adipinsäure mit 0,5 g/l Endkonzentration in Nährmedium Natrium-Lactat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Ornithin mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Natrium-Pyruvat mit 0,5 g/l Endkonzentration in Nährmedium
Als Unterschied zu Beispiel 1 wurden die erfindungsgemäßen Sub- stanzen im Fed-batch Verfahren getestet und aus jeder zu testendem Substanz wurden zwei unabhängige Kulturröhrchen inokuliert (n=2).
Das Nährmedium (Serum freies, Protein freies CHO Medium von der Firma Sigma, CR 1020, Lot: 64K2403) hatte eine Glucosekonzent- ration von 4,7 g/l und eine Glutaminkonzentration von 0,7 mM. Das verwendete Feedmedium war von der Firma HyQ, (R05.2 Supplement, Cat. Nr: SH30584.04, Lot Nr: APF21457G). Das Feedmedium war ohne Glutamin (Tabelle 2).
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Tabelle 2: Ergebnisse des Fed-batch-Experimentes mit den erfindungsgemäßen Substanzen
Aus ausgewählten Proben wurde die Produktkonzentration (Antikörperkonzentration) im Überstand durch ELISA bestimmt (Tabelle 3)
Figure imgf000073_0001
Tabelle 3: Ergebnis der Produktbestimmung der ausgewählten Substanzen. Der absolute Wert der Kontrolle wurde auf 100 % gesetzt.
Beispiel 3: Fed-batch Experiment mit den erfindungsgemäßen Substanzen und ohne Glutamin in allen eingesetzten Kulturmedien
Folgende Endkonzentration der erfindungsgemäßen Substanzen wurden in einem Nährmedium nach der Inokulation eingestellt:
Kontrolle, ohne Zugaben
Natrium-Succinat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium α-Keto-Glutarat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Natrium Lactat mit 0,5 g/l Endkonzentration in Nährmedium
Die erfindungsgemäßen Substanzen wurden unter Fed-batch-
Bedingungen getestet. Das Nährmedium (Serum freies, Protein frei- es CHO Medium von der Firma Sigma, CR 1020, Lot: 64K2403) hatte eine Glucosekonzentration von 4,7 g/l und es war glutaminfrei. Das verwendete Feedmedium war von der Firma HyQ, (R05.2 Supplement, Cat. Nr: SH30584.04, Lot Nr: APF21457G). Das Feedmedium war ohne Glutamin (Tabelle 4).
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Tabelle 4: Ergebnisse des Fed-batch-Experimentes mit den erfindungsgemäßen Substanzen in glutaminfreien Kulturmedien Beispiel 4: Fed-batch Experiment mit den erfindungsgemäßen Substanzen und mit glutaminhaltigen Glutaminersatz- stoffen
Folgende Endkonzentration der erfindungsgemäßen Substanzen wurden in einem Nährmedium nach der Inokulation eingestellt:
Kontrolle, ohne Zugaben
Natrium-Succinat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium α-Keto-Glutarat mit 1 g/l Endkonzentration in Nährmedium Natrium Lactat mit 0,5 g/l Endkonzentration in Nährmedium
Die erfindungsgemäßen Substanzen wurden unter Fed-batch- Bedingungen getestet. Das Nährmedium (Serum freies, Protein frei- es CHO Medium von der Firma Sigma, CR 1020, Lot: 64K2403) hatte eine Glucosekonzentration von 4,7 g/l und eine Glutaminkon- zentration von 4 mM. Das verwendete Feedmedium war von der Firma HyQ, (R05.2 Supplement, Cat. Nr: SH30584.04, Lot Nr: APF21457G). Das Feedmedium war mit 3 g/l Alanyl-Glutamin (AIa- GIn) und mit 3 g/l mit Glycyl-Glutamin (GIy-GIn) versetzt. Das Feedmedium war ohne Glutamin (Tabelle 5).
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Tabelle 5: Ergebnisse des Fed-batch-Experimentes mit den erfindungsgemäßen Substanzen und mit Glutamin-Derivaten
Beispiel 5: Routinekultivierung der metabolisch optimierten Zellen in Stammhaltung mit erfindungsgemäßen Substanzen in einem Gluco- sefreien und Glutaminfreien Nährmedium (Basalmedium) Ein glukosefreies und glutaminfreies kommerzielles Nährmedium wurde besorgt. Dieses Medium wurde gemäß Tabelle 6 mit erfindungsgemäßen Substanzen aufgestockt und somit das endgültige Nährmedium vorbereitet. Die in der Tabelle 6 dargestellte Konzentration der Substanzen ist die Endkonzentration der jeweiligen Substanzen in Medium. Dieses Nährmedium entspricht einem serumfreien, proteinfreien, peptonfreien Medium mit erfindungsgemäßen Substanzen. Das endgültige Nährmedium für Zellkultivierung ist also, glucosefrei, glutaminfrei, beinhaltet Galactose und beinhaltet Lactat.
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Tabelle 6: Zusammensetzung des Nährmediums (Basalmedium) für die Routinekultivierung der CHO-Zellen mit erfindungsgemäßen Substanzen in Stammhaltung
Die metabolisch optimierten CHO-Zellen wurden in Schüttelkolben unter Batchbedingungen für Stammhaltung kultiviert. Zellen wurden in obengenantem Nährmedium mit einer Animpfzellkonzentration von 1-2 x 105 Lebendzellen pro ml angeimpft. Die Kultur wurde bei 37 0C und bei 7,5 % pCO2 Atmosphäre 2 Tage lang inkubiert und am Tag 2 wurde die Kultur subkultiviert. Dazu wurde die Zellkonzentration am Tag 2 gezählt und ein Kultivierungsgefäß mit gleicher Animpf- zellkonzentration in gleiches frisches Medium angeimpft. Eine Kultivierungsperiode von zwei Tagen wurde als eine Passage definiert. Die Kultur wurde in dieser Weise mehrere Passage lang kultiviert und die Lebendzellkonzentration bei jeder Passage, kurz vor Subkul- tivierung bestimmt. Die ermittelten Werte wurden in einem Diagramm aufgetragen (Figur 1 ). Aus Figur 1 ist ersichtlich, dass die Zellen in dem erfindungsgemäßen Medium gut wachsen können. Zellen haben in dem erfindungsgemäßen Medium eine Verdopplungszeit von 17,9 Stunden. Zellen verfügen ein hohes Splitverhältnis von 1 :6,3 in einem Kultivierungsmodus von 2 Tagen. Wenn Zellen in Stammhaltung jeden dritten Tag gespurtet werden, haben sie ein Splitverhältnis von größer als 1 :10. Dieses hohe Splitverhältnis, bzw. niedrige Verdopplungszeit ist erreicht in einem serumfreien, proteinfreien, pep- tonfreien, glucosefreien, und glutaminfreien Medium.
Ab hier wurde die zweite Gruppe von Fed-batch Experimenten durchgeführt. In allen Experimenten ab hier (Beispiele 6 bis 9) wurden folgende gemeinsame Materialen und Methoden verwendet: Das erste Nährmedium, das verwendet worden ist, ist ein kommerzielles Nährmedium (Basalmedium). Es handelt sich bei diesem Ba- salmedium um ein glukosefreies und glutaminfreies Basalmedium, dessen Rezeptur nicht bekannt ist. Dieses Basalmedium wurde in jeweiligen Beispielen mit erfindungsgemäßen Substanzen aufge- stockt. Die angegebene Konzentration der Substanzen in den Beispielen ist die Endkonzentration der jeweiligen Substanz in Basalmedium. Daher wurden gegebenenfalls die Nährmedien mit erfindungsgemäßen Substanzen soweit aufgestockt um die finale, angegebene Konzentration zu erreichen. Nach der Aufstockung wurde der pH-Wert des Basalmediums auf 7,1 ±0,1 eingestellt. Die Osmo- lalität des Basalmediums wurde auf 310 ±20 mθsmol/kg H2O eingestellt. Somit wurde das endgültige Basalmedium vorbereitet und sterilfiltriert. Das so vorbereitete Basalmedium entspricht einem serumfreien, proteinfreien, und peptonfreien Basalmedium. Das zweite verwendete Nährmedium ist ein Feedmedium (Zufütte- rungsmedium). Es ist ein Serum freies, proteinfreies Feedmedium.
Das Feedmedium ist eine Eigenformulierung, bestehend aus unter anderem Aminosäuren, Salzen und Vitaminen. Dieses Feedmedium wurde in jeweiligen Beispielen mit erfindungsgemäßen Substanzen aufgestockt. Die angegebene Konzentration der Substanzen in den
Beispielen ist die Endkonzentration der jeweiligen Substanz in
Feedmedien. Das finale Feedmedium hatte einen pH-Wert von 6,0 bis 7,8 und eine Osmolalität von 460-750 mθsmol/kg H2O.
Alle Experimente wurden unter fed-batch Bedingungen durchgeführt. Die Experimente wurden gestartet, in dem die Basalmedien mit CHO-Zellen inokuliert worden sind. Die Inokulationszellkonzentration betrug 1-3 105/ml. Die Kulturen wurden bis zu 7 Tage laufen gelassen und während der Kultivierung mit dem korrespondierenden Feedmedium in regulären Abständen zugefüttert.
Die verwendete Terminologie in Experimenten wird Anhand folgen- der Beispiele erläutert. Name des Experiments ist beispielsweise S4:MEL-St-MEL.
S4: Nummer des Experiments. Es variiert von S1 bis S6 Erste Abkürzung (MEL): Spezifikation der eingesetzten Zellen. Dies kann entweder MEL (metabolically engineered), oder St (Standard, Wildtyp) heißen.
Zweite Abkürzung (St): Spezifikation des eingesetzten Basalmedi- ums. Dies kann entweder MEL (erfindungsgemäße Basalmedium), oder St (Standard Basalmedium) heißen. Dritte Abkürzung (MEL): Spezifikation des eingesetzten Feedmedi- ums. Dies kann entweder MEL (erfindungsgemäße Feedmedium), oder St (Standard Feedmedium) heißen.
In den erfindungsgemäßen Verfahren war es notwendig Zellen mit Lactat zu zufüttern, da sie Lactat als Kohlenhydratquelle benötigen. Solche Feedmedien, bzw. die Kulturen, die extra mit Lactat zugefüttert worden sind, wurden in Medientabellen mit dem Vermerk „Extra feed" gekennzeichnet. Dies liegt darin, dass Lactat zu den angege- benen Feedmedien dazu gehört. Dennoch wurde Lactat in die Feedmedien nicht dazugegeben, da man Löslichkeitsprobleme vermeiden wollte. Stattdessen wurde die Lactatkonzentration täglich bestimmt und bei Bedarf, (bevor Lactat limitiert) aus einer getrennten Stammlösung der Kultur dazu gegeben.
Beispiel 6: Fed-batch Experiment mit den erfindungsgemäßen Substanzen, ohne Glukose und ohne Glutamin in Nährmedien
Für dieses Fed-batch Experiment wurde folgende Medienkombination eingesetzt:
Figure imgf000080_0001
Tabelle 7: Die Endkonzentration der Substanzen in eingesetzten Nährmedien
S1 :St-St-St = Standardzelle (Wildtypzelle), Standard Basalmedium, Standard Feedmedium
S1 :MEL-MEL-MEL = Metabolisch optimierte Zelle, erfindungsgemäße Basalmedium, erfindungsgemäße Feedmedium
Die Ergebnisse zeigen, dass die metabolisch optimierten Zellen in erfindungsgemäßen Nährmedien vergleichbares Zellwachstum zeigen wie die Kontrolle (Figur 2). Im Unterschied zu Kontrolle produzieren sie weniger Ammonium (Figur 4) und metabolisieren Lactat, während die Kontrolle Lactat produziert (Figur 3). Der pH-Wert der Kultur mit erfindungsgemäßen Substanzen wandert zu basischen pH- Werten (zu höheren pH-Werten) oder bleibt konstant. Der pH-Wert der Kontrolle (herkömmliches Verfahren) wandert nach saueren pH- Werten (niedriger pH-Wert) (Figur 5).
Beispiel 7:
Die Standardzelle (Wildtypzelle, die genetisch nicht modifiziert ist) wurde unter Fed-batch-Bedingungen mit folgenden Medienkombination gestestet:
Figure imgf000082_0001
Tabelle 8: Die Endkonzenration der Substanzen in Nährmedien, die in diesem Experiment eingesetzt worden sind
S6:St-St-MEL = Standardzelle (Wildtypzelle), Standard Basalmedium, erfindungsgemäße Feedmedium
S6:St-MEL-MEL = Standardzelle (Wildtypzelle), erfindungsgemäße Basalmedium, erfindungsgemäße Feedmedium S6:St-MEL-St = Standardzelle (Wildtypzelle), erfindungsgemäße Basalmedium, Standard Feedmedium
Im Stand der Technik wurde bisher mehrere Kombinationen von Kohlenhydrate in Basalmedien und Feedmedien getestet. Alle Kom- binationen sahen vor, dass die Zellen in einem Basalmedium inokuliert werden welches Glukose beinhaltet. Anschließend wurde mit fed-batch Prozess gestartet, in dem das Feedmedium z.B. Galactose beinhaltet. Der Grund für diese Art von Vorgehensweise ist, dass die Zellen in Galaktosehaltigen Basalmedium niedrige Wachstumsrate haben, oder gar nicht wachsen, daher musste man mit glucosehalti- gern Basalmedium starten (Altamirano, C, et.al., Biotechnol. Bioeng., 2001 , 76(4): 351-60; Altamirano, C1 et.al., J. Biotechnology, 2004, 110(2): 171-9; Altamirano, C. et.al., Biotechnol. Progress, 2000, 16(1 ): 69-75). Gemäß der Erfindung hier aber, haben die ZeI- len in Galactosehaltigem Medium vergleichbare Wachstumsrate wie in Glucosehaltigem Medium, sodass ein Basalmedium mit erfindungsgemäßen Substanzen völlig neue Möglichkeiten für Zellkultivierung eröffnet. Daher wurde hier ein erfindungsgemäßes Basalmedium mit verschiedenen Feedmedien kombiniert.
Aus den Daten es ist ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Feed- medium besser mit erfindungsgemäße Basalmedium kombiniert werden kann (Figur 6, Vergleiche S6:St-St-MEL gegen S6:St-MEL- MEL). Das erfindungsgemäße Basalmedium kann man aber auch gut mit einem Standard-Feedmedium kombinieren, in dem das Feedmedium ein anderes Kohlenhydrat beinhaltet als Galaktose, z.B. Glucose. Insbesondere wenn das Basalmedium die erfindungsgemäßen Substanzen beinhaltet und Feedmedium Glucose beinhaltet wachsen die Zellen sogar auf noch höhere Zellkonzentration (Fi- gur 6, vergleiche S6:St-MEL-MEL gegen S6:St-MEL-St).
Ein ähnliches Experiment wurde auch mit metabolisch optimierten Zellen durchgeführt (Figur 7). Die Nährmedien des Fed-batch- Experimentes mit metabolisch optimierten Zellen sahen folgender maßen aus:
Figure imgf000084_0001
Tabelle 9: Die Endkonzentration der Substanzen in Nährmedien, die in diesem Experiment eingesetzt worden sind
S1 :MEL-MEL-MEL = Metabolisch optimierte Zelle, erfindungsgemäße Basalmedium, erfindungsgemäße Feedmedium S2: M EL-M EL-St = Metabolisch optimierte Zelle, erfindungsgemäße Basalmedium, Standard Feedmedium
Beispiel 9: Fed-batch Experiment mit zwei erfindungsgemäßen Substanzen in Nährmedien
In diesem Experiment wurden 2 erfindungsgemäße Substanzen (Lactat und Succinat) in einem Fed-batch Experiment miteinander kombiniert. Für diese Fed-batch Experimente wurde folgende Nährmedienkombination eingesetzt:
Figure imgf000085_0001
Tabelle 10: Endkonzentration der eingesetzten Substanzen in Nährmedien dieses Experimentes
S5:MEL-MEL-MEL = Metabolisch optimierte Zelle, erfindungsgemäße Basalmedium mit Lactate, erfindungsgemäße Feedmedium mit Lactate
S5:MEL-MEL-MEL-S = Metabolisch optimierte Zelle, erfindungsgemäße Basalmedium mit Lactate und Succinat, erfindungsgemäße Feedmedium mit Lactate und Succinat
Figur 8 zeigt das Wachstumsverhalten der metabolisch optimierten Zellen in erfindungsgemäßen Nährmedien mit und ohne Natrium- Succinat. Figur 9 zeigt den Verlauf der Lactatkonzentration in den erfindungsgemäßen Nährmedien mit und ohne Natrium-Succinat.

Claims

Patentansprüche
1. Nährmedium zur Kultivierung einer Zellkultur, wobei das Nährmedium mindestens eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto- Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxal- bernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milchsäure und Mischungen davon sowie Salze, Derivate oder Komplexe dieser Säuren, enthält.
2. Nährmedium zur Kultivierung einer Zellkultur, wobei das Nährmedium mindestens eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bernsteinsäure, Äpfelsäure, α-Keto-Glutarsäure, Fumarsäure, Oxalessigsäure, Isocitronensäure, Oxalbernsteinsäure, Weinsäure, Adipinsäure, Milchsäure und Mischungen davon sowie Salze oder Komplexe dieser Säuren, enthält.
3. Nährmedium nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Nährmedium die mindestens eine Substanz in einer Konzentration von 0,03 g/l oder größer enthält.
4. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium Milchsäure und/oder ein Milchsäure-Derivat enthält.
5. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium als Milchsäure-Derivat Alanin und/oder Alanin-haltige Peptide enthält.
6. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium als Milchsäure-Derivat Pyruvat und/oder Py- ruvat-Derivate enthält.
7. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium mindestens ein Kohlenhydrat enthält.
8. Nährmedium nach einem der Anspruch 7, wobei das mindestens eine Kohlenhydrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Galactose, Fructose, Mannose, Ribose, Glucosamin, Saccharose, Lactose und Mischungen davon.
9. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium Galactose enthält.
10. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium das Kohlenhydrat in einer Konzentration von 0,1 g/l oder größer enthält.
11. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium Glucose in einer Konzentration von 25 g/l oder kleiner enthält.
12. Nährmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Nährmedium frei von Glucose ist.
13. Nährmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Nährmedium frei von Glucose ist, und wobei das Nährmedium GIu- tamin-haltige Peptide, Milchsäure und Galactose enthält.
14. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium Glutamin in einer Konzentration von kleiner als 8 mmol/l enthält.
15. Nährmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Nährmedium frei von Glutamin ist.
16. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium mindestens ein Glutamin-Derivat enthält.
17. Nährmedium nach Anspruch 16, wobei das Nährmedium GIu- tamin-Derivate in einer Gesamt-Konzentration von 0,05 g/l oder grö- ßer enthält.
18. Nährmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Nährmedium frei von Glutamin-Derivaten ist.
19. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium Asparagin enthält.
20. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium mindestens ein Asparagin-Derivat enthält.
21. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium Glutamat enthält.
22. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium mindestens ein Glutamat-Derivat enthält.
23. Nährmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Nährmedium frei von Glucose und frei von Glutamin ist, und wobei das Nährmedium Asparagin in einer Konzentration von mindestens 0,05 g/l sowie Milchsäure und Galactose enthält.
24. Nährmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Nährmedium frei von Glucose und frei von Glutamin ist und, wobei das Nährmedium Glutamat in einer Konzentration von mindestens 0,05 g/l sowie Milchsäure und Galactose enthält.
25. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium ein flüssiges Nährmedium ist.
26. Nährmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nährmedium ein Basalmedium mit einer Osmolalität von
240 bis 360 mθsmol/kg H2O ist.
27. Nährmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei das Nährmedium ein Zufütterungsmedium mit einer Osmolalität von 150 bis 1500 mOsmol/kg H2O ist.
28. Verwendung des Nährmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zum Kultivieren einer Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle.
29. Verfahren zum Kultivieren einer Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, wobei die Zellkultur in einem Nährmedium einge- bracht und kultiviert wird und wobei der pH-Wert des Nährmediums während mindestens eines Fünftels der Kultivierungszeitdauer pH 7,2 oder basischer ist.
30. Verfahren zum Kultivieren einer Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, wobei die Zellkultur in ein Nährmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 27 eingebracht und kultiviert wird.
31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei die Zelle eine eukaryontische Zelle ist.
32. Verfahren nach Anspruch 29 bis 31 , wobei die Zelle eine Säugetier-Zelle ist.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 oder 30, wobei die Zelle eine prokaryotische Zelle ist.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 33, wobei der pH-Wert des Nährmediums bei Beendigung des Kultivierens 7,2 oder basischer ist.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wobei der pH-Wert während mindestens eines Fünftels der Kultivierungszeit- dauer pH 7,2 oder basischer ist.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 35, wobei der pH-Wert des Nährmediums während des Kultivierungsprozesses pH 7,2 oder basischer ist.
37. Verfahren zur Herstellung eines biologischen Produktes, wo- bei die Zellkultur, umfassend mindestens eine Zelle, wobei die Zelle nach einem der Ansprüche 29 bis 36 kultiviert wird und das biologische Produkt aus der Zellkultur und/oder aus dem Nährmedium gewonnen wird.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das biologische Produkt ausgewählt ist aus mindestens einem Polypeptid, mindestens einem Protein, mindestens einem Virusbestandteil, mindestens einem Virus oder aus einer Mischung aus diesen.
39. Verfahren zur Selektion einer genetisch modifizierten, insbesondere metabolisch optimierten Zelle aus einer Zellpopulation, wobei
a) eine Zellkultur als Zellpopulation in dem Nährmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 26 für mindestens einer Woche nach ei- nem der Ansprüche 29 bis 36 kultiviert wird; und anschließend
b) die Zelle daraus isoliert wird.
40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei die in Schritt b) isolierte Zelle in einem weiteren Schritt c) in ein frisches Nährmedium überführt wird.
41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die isolierte Zelle in Schritt c) expandiert wird.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41 , wobei die isolierte Zelle eine Passage oder mehr subkultiviert wird.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41 , wobei die isolierte Zelle so lang subkultiviert wird, bis ein Splitverhältnis von größer 1 : 4 erreicht wird.
44. Selektierte Zelle, erhältlich aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 43.
45. Zelle nach Anspruch 44, wobei die Wachstumsrate (μ) der Zelle weniger als 24 Stunden beträgt.
46. Zellkultur oder Zellpopulation, enthaltend die Zelle nach einem der Ansprüche 44 oder 45.
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