WO2007009446A2 - Verfahren zur extraktion von pflanzen der pflanzengattung pelargonium, danach hergestellter extrakt und verwendung desselben - Google Patents
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Classifications
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- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
Definitions
- the present invention relates to a method for the extraction of plants, preferably roots, the plant genus Pelargonium, as well as an extract produced in particular by the method and its use.
- Pelargonium reniforme / sidoides is a plant that is traditionally used in folk medicine in southern Africa for gastrointestinal disorders and respiratory diseases. The plant was brought to England in 1897, and in the twenties the plant and extracts were brought to Switzerland by Sechehaye. Extracts were mainly used in homeopathic preparations in tuberculosis therapy (Kolodziej, H., Kayser, O., Z. Phytotherap., 19, 141-151, 1998).
- Pelargonium sidoides-Wurzoln The main ingredients of Pelargonium sidoides-Wurzoln are proanthocyanidins, oligomeric hydrolyzable tannins, coumarins, flavonoids and caffeic acid derivatives (Kayser, O., Dissertation, Free University Berlin, 1997). Characteristic is the occurrence of the sometimes highly oxidized coumarins, which are partly responsible for the biological effect (Kayser, O., Kolodziej, H., Phytochemistry, 39, 1181-1185, 1995).
- Extracts of the root material of Pelargonium sidoides and also Pelargonium reniforme and other plants of the genus Pelargonium have in the past been obtained by maceration and / or percolation using pure water, mixtures of water and an organic solvent such as acetone (Kayser, O., Kolodziej, H , Phytochemistry, 39, 1181-1185, 1995), methanol (Bladt, S., Wagner, H., Dtsch. Apoth.-Ztg., 128, 292-296, 1988) or ethanol (WO 03/028746 A1). produced.
- Pelargonium Pelargonium lobatum and Pelargonium triste are known from the plant genus Pelargonium.
- the desire for ethanol-free herbal liquida in other pharmaceutical fields has led in the past to the development of forms of preparation without ethanol, in which unlike fresh plant juices, tea preparations and aqueous tonic now lipophilic plant ingredients are now included.
- the solvents and extraction medium used were, for example, polyethylene glycol, glycerol, sorbitol or propylene glycol, individually or in combination with water.
- Chamomile belongs to a plant genus other than pelargonium. In chamomile extraction, however, it was found that predominantly only lipophilic constituents were extracted with the polyhydric alcohol propylene glycol, but hydrophilic constituents were scarcely obtained (Vogel, K., Dissertation, University of Tübingen, 1992).
- Ethanol-water mixtures have certain technological and microbiocidal advantages over ethanol-free extracts, in particular a higher extract yield can be expected.
- a propylene glycol-glycerol-water mixture is used to dissolve the ethanolic spissum or acetone extract in some finished medicines (eg Tebonin forte solution).
- Sorbitol-water mixtures are used to offer the drug Prospan used in paediatrics (Rote Liste 2006).
- the present invention has for its object to further develop the generic method such that the disadvantages of the prior art are overcome.
- a method is to be provided which allows an ethanol-free extraction of plants, especially roots, the plant genus Pelargonium to allow administration to patients who should not take ethanol for health reasons or may (for example, children, alcoholics, epileptics, Parkinson's patients).
- the process according to the invention should furthermore lead to an extract which is essentially equivalent to the extract obtained from a water-ethanol extraction.
- the extractants used should be toxicologically safe.
- the method should provide an extract which is qualitatively and quantitatively similar to the aqueous-ethanolic extracts.
- the first object is achieved by extracting the plants with an ethanol-free solvent or an ethanol-free solvent mixture selected from water and at least one monohydric alcohol having at least three carbon atoms, water and at least one polyhydric alcohol, water and at least one inorganic, organic, mono- or polybasic acid or derivative thereof, at least one vegetable oil and carbon dioxide.
- an ethanol-free solvent or an ethanol-free solvent mixture selected from water and at least one monohydric alcohol having at least three carbon atoms, water and at least one polyhydric alcohol, water and at least one inorganic, organic, mono- or polybasic acid or derivative thereof, at least one vegetable oil and carbon dioxide.
- polyhydric alcohols preference is also given to sugars and sugar alcohols.
- the extraction comprises a percolation and / or a one-stage or multi-stage, preferably two-stage maceration.
- the polyhydric alcohol is selected from the group consisting of polyethylene glycol, glycerol, propylene glycol, sorbitol, xylitol or mixtures thereof.
- the polyethylene glycol has a molecular weight of about 40 to about 40,000, preferably from about 200 to about 2000, more preferably from about 200 to about 800.
- the plants are comminuted, ground and / or dried and / or used fresh.
- the weight ratio of water-grade polyhydric alcohol ranges from 95: 5 to about 5:95.
- the weight ratio of water: organic mono- or polyvalent acid is in a range from 99.9: 0.1 to about 80:20.
- At least one vegetable oil or carbon dioxide is used as extractant.
- the weight ratio Wasse ⁇ anorganische acid is in a range of 99.9: 0.1 to about 80:20.
- the inorganic acid is preferably phosphoric acid or its alkali metal or alkaline earth metal salts.
- the weight ratio of water of polyhydric alcohol ranges from about 80:20 to about 60:40, preferably about 70:30, with a maceration, and that the weight ratio of water to polyhydric alcohol is from about 90:10 to about 70 at a percolation : 30, preferably about 80:20 is enough.
- the plants are mashed before percolation.
- the second object is achieved by an extract of the plant genus Pelargonium, dissolved in an ethanol-free solvent or an ethanol-free solvent mixture selected from the group consisting of water and at least one monohydric alcohol having at least three carbon atoms, water and at least one polyhydric alcohol, water and at least one inorganic, organic, mono- or polybasic acid or a derivative thereof, at least one vegetable oil and carbon dioxide.
- the extract of roots of the plant is Pelargonium sidoides, Pelargonium reniforme, Pelargonium lobatum and / or Pelargonium triste.
- the extract additionally contains a thickening agent and is present in solid, solidified form.
- the extract may be in the form of a lozenge, a lozenge, a buccal or lingual form or a lollipop.
- root extract be administered orally.
- the extract may also be used preferably for the treatment or prophylaxis of HIV infections or HIV-associated infections.
- Corresponding HIV-associated infections can be bacterial, other viral, fungal and / or parasitic infections. More concrete examples are given in DE 10 2004 032 439 A1.
- an extract preferably root extract, of the plant genus Pelargonium can be obtained in the same yield and quality as for extraction based on water-ethanol by the inventive method.
- the known antimicrobial and immunostimulatory effects were obtained when using the method according to the invention.
- high proportions of lipophilic and hydrophilic components can be extracted. Since the erfmdungswashe method is operated ethanol-free, the extract obtained can be safely used for the treatment of children, alcoholics, epileptics and Parkinson's patients.
- the extraction is carried out in the form of a percolation and / or a two-stage maceration.
- the percolation is preferably carried out with different mixtures of water and polyhydric alcohol.
- a preferred polyhydric alcohol is sorbitol, for example in a mixture of water-glycerol sorbitol 70:15:15 (wt.%), Or polyethylene glycol, for example in a mixture of water-polyethylene glycol-glycerol 70:20:10 (wt. -%).
- the percolation can also be done by Anmaischen, the mashing and subsequent percolation with the same or different concentrated water-alcohol mixtures can be done.
- the final concentration of the polyhydric alcohol (s) is about 22%.
- the extracts according to the invention contain a coumarin content, based on scopolaltin, which is in the same size range as that of the ethanolic extracts.
- a particularly preferred embodiment of the root extract according to the invention is to add to the extract a thickening agent, for example glucose syrup, in such an amount that the extract solidifies or solidifies. Then it is possible to administer the solidified extract, for example in the form of a lollipop, lozenge, buccal or lingual medicine or a lollipop, which in particular can greatly facilitate the treatment of children.
- the extract according to the invention can also be formulated and administered in a customary liquid preparation, such as in the form of drops, juice, syrup, etc.
- Polyhydric alcohols including sugars and sugar alcohols, polyethylene glycol (PEG) 100-4000, propylene glycol, polypropylene glycol 100-4000, butanediol in possible substitution
- aliphatic phenyl alcohols for example isobutyl, propyl or ethyl phenyl alcohol, methyl benzyl acetate, butyrate and other acid derivatives, liquid, saturated and unsaturated fatty acids and fatty alcohols having chain lengths of C 6 to C 16 , benzyl alcohol and its derivatives, isoamyl alcohol and its derivatives, Isobutyl alcohol and its derivatives.
- IFN interferon-gamma, indication in EC5 Q ( ⁇ g / ml)
- TNF tumor necrosis factor-alpha, expressed in U / mL
- E. coli Escherichia coli
- in diameter of the inhibitory chamber in mm Sa Staphylococcus aureus
- Sp Streptococcus pneumonaiae
- Pm Proteus mirabilis
- indication in diameter of the zone of inhibition in mm Hi Haemophilus influenzae
- a modified maceration was carried out according to the DAB 10 regulation (Devril's Pharmacopoeia). 20 g of the ground and dried root of P. sidoides were suspended with 140 ml of a water sorbitol mixture (70 g sorbitol in 100 ml distilled water) and allowed to stand for 5 days with occasional shaking. It was then filtered and the crude extract collected. The moist drug material was now macerated a second time in the same manner. The extract solution was also collected and combined with the first crude extract. 4 t
- the total phenol content is determined according to the method for tanning agents specified in the German Pharmacopoeia (DAB 2002). The determination is carried out photometrically after reaction with molybdate tungstate reagent. For this purpose, the crude extract is taken directly, alkalized with sodium carbonate solution and then mixed with molybdate tungstate reagent. After centrifugation, the absorbance of the supernatant solution is measured at 720 nm against water. The determination against extraction medium El or E2 showed no difference compared to water. The calculation is based on the epicatechin. 42
- Total coumarins are determined by HPLC on an RP-18 column.
- As the mobile phase an acetonitrile-water-phosphoric acid gradient (10: 990: 4 to 205: 795: 4) is used. The detection is at 330 nm. The calculation of the individual coumarin peaks is carried out as scopoletin.
- each of the extracts according to the invention are diluted to 200 ⁇ l in 150 ml of Muellr-Hinton medium and the antimicrobial effect according to DIN 58 940, 1995, and the method according to Van den Berghe DA, Vlietnick, AJ, In: Methods in Plant Biochemistry , Assays for Bioactivity, VoI 6, Dey, PM, Harborne, JB (ed.), Academic Press, London, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto, 47-99 (1991). The determination was made by measuring the Hemmhofes on agar plates in which punctures were punched before inoculation.
- the reference strains were obtained from the German strain collection for microorganisms and cell cultures (DSMZ) in Braunschweig: Escherichia coli ATCC 25922, Haemophilus influenzae ATCC 33379. All further strains were obtained as an in-house strain from patient material at the University Medical Center UMCG, Groningen, NL.
- the supernatants are aspirated from the cells adhering to the soil and adjusted with different dilute actinomycin D solutions and test solutions.
- the activated microtiter plates were incubated at 37 ° C, 6% CO 2 , 18
- each microtiter plate is washed four times in distilled water, tapped dry on nonwoven and after-dried at 50 ° C for 30 minutes. 100 ⁇ L of 33% acetic acid are then added to each well, the microtiter plates are shaken for 10 minutes and the absorbance at 592 nm is measured in the ELISA device.
- L929 (IFN) cells (lot # 5577) were grown in 100 mL culture dishes, trypsinized, washed and counted. The suspension was adjusted to 2x10 "cells / mL and seeded into microtiter plates with 2x10 4 cells / well, which were incubated overnight at 37 0 C, 5% CO 2. Subsequently, the supernatant was in each case by 100 .mu.l medium control, cell control , Virus control with r-mu-IFN- ⁇ control, r-mu-IFN- ⁇ standard (100 LVmL) and test solution, all diluted linearly. 44
- the samples were incubated for exactly 8 hours at 37 ° C, 5% CO2. After the incubation period, 100 ⁇ L of the virus-use suspension were pipetted into the virus, interferon control and into the test solutions and incubated again overnight at 37 ° C., 5% CO 2 .
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Pflanzen, insbesondere Wurzeln, der Pflanzengattung Pelargonium, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen mit einem ethanolfreien Lösungsmittel oder einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung extrahiert werden, das bzw. die ausgewählt wird bzw. werden aus Wasser und zumindest einem einwertigen Alkohol mit mindestens drei Kohlenstoffatomen, Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol, Wasser und zumindest einer anorganischen, organischen, ein- oder mehrwertigen Säure oder einem Derivat derselben, zumindest einem pflanzlichen Öl und Kohlendioxid.
Description
Verfahren zur Extraktion von Pflanzen der Pflanzengattung Velargonium, danach hergestellter
Extrakt und Verwendung desselben
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Pflanzen, bevorzugt Wurzeln, der Pflanzengattung Pelargonium, sowie einen insbesondere nach dem Verfahren hergestellten Extrakt sowie dessen Verwendung.
Pelargonium reniforme/sidoides ist eine Pflanze, die im südlichen Afrika in der Volksmedizin tradtionell bei gastrointestinalen Beschwerden und Atemwegserkrankungen gebraucht wird. Die Pflanze wurde im Jahre 1897 nach England gebracht, und in den zwanziger Jahren wurde die Pflanze und Extrakte durch Sechehaye in die Schweiz gebracht. Extrakte wurden vor allem in homöopathischen Zubereitungen in der Tuberkulosetherapie eingesetzt (Kolodziej, H., Kayser, O., Z. Phytotherap. 19, 141-151, 1998).
In wissenschaftlichen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß ethanolische Extrakte eine antimikiObielle Wirkung gegen einige grampositive und gramnegative Bakterien haben (Kayser, O., Kolodziej, H., Planta Med. 63, 508-510, 1997) und über immunmodulatorische Wirkungen verfügen (Kayser, O., Kolodziej, H., Kiderlen, A.F., Radtke, O., Phytomedicine 2003; 10 Suppl. 4:18-24.
Hauptinhaltsstoffe von Pelargonium sidoides-Wurzoln sind Proanthocyanidine, oligomere hy- drolysierbare Gerbstoffe, Cumarine, Flavonoide und Kaffeesäurederivate (Kayser, O., Dissertation, Freie Universität Berlin, 1997). Charakteristisch ist das Vorkommen der zum Teil hocho- xygenierten Cumarine, die für die biologische Wirkung zum Teil mit verantwortlich gemacht werden (Kayser, O., Kolodziej, H., Phytochemistry, 39, 1181-1185, 1995).
Extrakte des Wurzelmaterials von Pelargonium sidoides und auch Pelargonium reniforme sowie anderer Pflanzen der Gattung Pelargonium wurden in der Vergangenheit durch Mazeration und/oder Perkolation unter Verwendung von reinem Wasser, Gemischen aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel wie Aceton (Kayser, O., Kolodziej, H., Phytochemistry, 39, 1181- 1185, 1995), Methanol (Bladt, S., Wagner, H., Dtsch. Apoth.-Ztg., 128, 292-296, 1988) oder Ethanol (WO 03/028746 Al) hergestellt. Zwischenzeitlich sind aus der Pflanzengattung Pelargonium auch Pelargonium lobatum und Pelargonium triste bekannt. In der therapeutischen An-
wendung und im Handel befindet sich ein mit Glycerol stabilisierter ethanolischer Auszug aus Pelargonium reniforme/sidoides (Rote Liste 2006). Gegenüber Extraktionen mit Wasser, Methanol oder Aceton zeigt sich bei der ethanolischen Extraktion die verbesserte Gewinnung von Extraktivstoffen und die Extraktion bei Raumtemperatur. Allerdings wird der Gebrauch ethanolischer Extrakte aus P. reniforme/sidoides in Fachkreisen als problematisch angesehen, da insbesondere Kinder als bevorzugte Patientengruppe arzneilich genutzte Extrakte einnehmen. Diese Problematik gilt auch für Patienten, die Ethanol aus gesundheitlichen Gründen nicht einnehmen sollen oder dürfen, zum Beispiel alkoholkranke Personen, Epileptiker oder Parkinson-Patienten.
Der Wunsch nach ethanolfreien pflanzlichen Liquida auf anderen pharmazeutischen Gebieten hat in der Vergangenheit zur Entwicklung von Zubereitungsformen ohne Ethanol geführt, bei denen im Gegensatz zu Frischpflanzensäften, Teezubereitungen und wäßrigen Tonika nunmehr auch lipophile Pflanzeninhaltsstoffe enthalten sind. Als Lösungs- und Extraktionsmedium dienten beispielsweise Polyethylenglykol, Glycerol, Sorbitol oder Propylenglykol, einzeln oder in Kombination mit Wasser. In einer Dissertation von Vogel, K., Disseratation, Universität Tübingen, 1992, konnte gezeigt werden, daß die lipophilen Inhaltsstoffe von Kamille, nämlich Chama- zulen und Bisabolol, nicht nur gut löslich sind in Propylenglykol, sondern auch chemisch und physikalisch stabilisiert werden können. Kamille gehört einer anderen Pflanzengattung als Pe- largonium an. Bei der Kamillenextraktion zeigte sich jedoch, daß mit dem mehrwertigen Alkohol Propylenglycol im überwiegenden Maße lediglich lipophile Bestandteile extrahiert wurden, hydrophile Bestandteile jedoch kaum erhalten wurden (Vogel, K., Dissertation, Universität Tübingen, 1992). Ethanol- Wasser-Gemische besitzen gegenüber ethanolfreien Extrakten gewisse technologische und mikrobiozide Vorteile, insbesondere kann eine höhere Extraktausbeute erwartet werden. Gegenwärtig wird ein Propylenglykol-Glycerol- Wasser-Gemisch genutzt, um in einigen Fertigarzneimitteln den ethanolischen Spissum oder acetonischen Extrakt zu lösen (bspw. Tebonin forte Lösung). Sorbitol-Wasser-Gemische werden eingesetzt, um das in der Pädiatrie gebrauchte Arzneimittel Prospan anzubieten (Rote Liste 2006).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das gattungsgemäße Verfahren derart weiter zu entwickeln, daß die Nachteile des Stands der Technik überwunden werden. Insbesondere soll ein Verfahren bereit gestellt werden, das eine ethanolfreie Extraktion von Pflanzen, insbesondere Wurzeln, der Pflanzengattung Pelargonium ermöglicht, um eine Verabreichung an Patienten zu ermöglichen, die Ethanol aus gesundheitlichen Gründen nicht einnehmen sollen
oder dürfen (beispielsweise Kinder, alkoholkranke Personen, Epileptiker, Parkinson-Patienten). Das erfindungsgemäße Verfahren soll ferner zu einem Extrakt führen, der dem aus einer Wasser- Ethanol-Extraktion gewonnenen Extrakt im wesentlichen äquivalent ist. Die eingesetzten Extraktionsmittel sollen toxikologisch unbedenklich sein. Insbesondere soll das Verfahren einen Extrakt bereitstellen, der qualitativ und quantitativ den wäßrig-ethanolischen Extrakten gleicht.
Desweiteren ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen insbesondere nach dem Verfahren hergestellten Extrakt bereitzustellen und dessen Verwendung zu ermöglichen.
Die erste Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Pflanzen mit einem ethanolfreien Lösungsmittel oder einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung extrahiert werden, das bzw. die ausgewählt wird bzw. werden aus Wasser und zumindest einem einwertigen Alkohol mit mindestens drei Kohlenstoffatomen, Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol, Wasser und zumindest einer anorganischen, organischen, ein- oder mehrwertigen Säure oder einem Derivat derselben, zumindest einem pflanzlichen Öl und Kohlendioxid. Als mehrwertige Alkohole sollen bevorzugt auch Zucker und Zuckeralkohole verstanden werden.
Bevorzugt ist dabei, daß die Extraktion eine Perkolation und/oder eine einstufige oder mehrstufige, vorzugsweise zweistufige Mazeration umfaßt.
Besonders bevorzugt ist, daß der mehrwertige Alkohol ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol, Glycerol, Propylenglycol, Sorbitol, Xylitol oder Mischungen derselben.
Dabei wird vorgeschlagen, daß das Polyethylenglycol ein Molekulargewicht von etwa 40 bis etwa 40000, bevorzugt von etwa 200 bis etwa 2000, besonders bevorzugt von etwa 200 bis etwa 800 aufweist.
In einer Ausführungsform werden die Pflanzen zerkleinert, gemahlen und/oder getrocknet und/oder frisch eingesetzt.
Besonders bevorzugt ist, daß das Gewichtsverhältnis Wasseπmehrwertiger Alkohol in einem Bereich von 95:5 bis etwa 5:95 liegt.
-A-
Auch wird vorgeschlagen, daß das Gewichtsverhältnis Wasser:organische ein- oder mehrwertige Säure in einem Bereich von 99,9:0,1 bis etwa 80:20 liegt.
Alternativ wird vorgeschlagen, daß zumindest ein pflanzliches Öl oder Kohlendioxid als Extraktionsmittel eingesetzt wird.
Ebenfalls wird alternativ vorgeschlagen, daß das Gewichtsverhältnis Wasseπanorganische Säure in einem Bereich von 99,9:0,1 bis etwa 80:20 liegt. Bevorzugt ist die anorganische Säure Phosphorsäure oder ihre Alkali- oder Erdalkalisalze.
Bevorzugt ist, daß das Gewichtsverhältnis von Wasseπmehrwertigem Alkohol bei einer Mazeration von etwa 80:20 bis etwa 60:40, bevorzugt etwa 70:30 reicht, und daß das Gewichtsverhältnis von Wasser:mehrwertigem Alkohol bei einer Perkolation von etwa 90:10 bis etwa 70:30, bevorzugt etwa 80:20 reicht.
Auch kann vorgesehen sein, daß vor der Perkolation ein Anmaischen der Pflanzen erfolgt.
Die zweite Aufgabe wird gelöst durch einen Extrakt der Pflanzengattung Pelargonium, gelöst in einem ethanolfreiem Lösungsmittel oder einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasser und zumindest einem einwertigen Alkohol mit mindestens drei Kohlenstoffatomen, Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol, Wasser und zumindest einer anorganischen, organischen, ein- oder mehrwertigen Säure oder einem Derivat derselben, zumindest einem pflanzlichen Öl und Kohlendioxid.
Am bevorzugtesten ist, daß der Extrakt von Wurzeln der Pflanze Pelargonium sidoides, Pelargonium reniforme, Pelargonium lobatum und/oder Pelargonium triste ist.
Auch wird in einer Ausführungsform vorgeschlagen, daß der Extrakt zusätzlich ein Eindik- kungsmittel enthält und in fester, erstarrter Form vorliegt.
Dabei kann der Extrakt in Form eines Lutschbonbons, einer Lutschtablette, einer Bukal- oder Lingualarzneiform oder eines Lutschers vorliegen.
Schließlich wird die Verwendung des erfindungsgemäßen Extrakts zur Behandlung von akuten und/oder chronischen Entzündungserkrankungen und/oder Infektionen bei Säugetieren vorgeschlagen.
Bevorzugt ist die Verwendung beim Menschen, Haus- und Nutztieren, bevorzugt Pferd, Hund, Katze, Schwein oder Huhn.
Auch wird vorgeschlagen, daß der Wurzelextrakt oral verabreicht wird.
Der Extrakt kann auch bevorzugt zur Behandlung oder Prophylaxe von HIV-Infektionen oder HlV-assoziierten Infektionen eingesetzt werden. Entsprechende HIV-assoziierte Infektionen können Bakterien-, andere Virus-, Pilz- und/oder Parasiteninfektionen sein. Konkretere Beispiele werden in der DE 10 2004 032 439 Al gegeben.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren ein Extrakt, vorzugsweise Wurzelextrakt, der Pflanzengattung Pelargonium in einer gleichen Ausbeute und Qualität wie für eine Extraktion auf Basis Wasser-Ethanol erhalten werden kann. Gleichzeitig wurde gefunden, daß die bekannten antimikrobiellen und immunstimulierenden Wirkungen bei Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können hohe Anteile an lipophilen und hydrophilen Bestandteilen extrahiert werden. Da das erfmdungsgemäße Verfahren ethanolfrei betrieben wird, kann der gewonnene Extrakt unbedenklich für die Behandlung von Kindern, alkoholkranken Personen, Epileptikern und Parkinson-Patienten eingesetzt werden.
Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Extraktion in Form einer Perkolation und/oder einer zweistufigen Mazeration durchgeführt.
Die Perkolation wird bevorzugt mit unterschiedlichen Gemischen aus Wasser und mehrwertigem Alkohol durchgeführt. Ein bevorzugter mehrwertiger Alkohol ist Sorbitol, beispielsweise in einer Mischung aus Wasser-Glycerol-Sorbitol 70:15:15 (Gew.-%), oder Polyethylenglykol, beispielsweise in einer Mischung aus Wasser-Polyethylenglykol-Glycerol 70:20:10 (Gew.-%). Die Perkolation kann aber auch durch Anmaischen erfolgen, wobei das Anmaischen und anschließende Perkolieren mit gleich oder unterschiedlich konzentrierten Wasser-Alkohol-Gemischen
erfolgen kann. Es zeigte sich als Vorteil, daß ein Anmaischen mit einem Wasser-Alkohol-Anteil von 70:30 (Gew.-%) und die Perkolation mit einem Wasser-Alkohol-Anteil von 80:20 (Gew.-%) zu besten Ausbeuten führt. Bei einem Verhältnis von Wurzelmaische zu Extraktionsmedium von 20:80 (Gew.-%) ergibt sich eine Endkonzentration des bzw. der mehrwertige Alkohol(e) bei circa 22 %. Die erfindungsgemäßen Extrakte enthalten einen Cumarinanteil, bezogen auf Scopole- tin, der im gleichen Größenbereich wie derjenige der ethanolischen Extrakte liegt.
Bei Extraktionsversuchen mit der gemahlenen und getrockneten Wurzel von Pelargonium sidoi- des mit Gemischen aus Wasser und mehrwertigem Alkohol wurde überraschenderweise festgestellt, daß in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Extraktionsmediums lipophile Stoffe wie Cumarine auf der einen Seite, aber auch wasserlösliche Phenole auf der anderen Seite sich im gleichen Extraktionsschritt extrahieren lassen. Vor dem Hintergrund des bestehenden Kenntnisstandes zu Pelargonium sidoides und Pelargonium reniforme ist dieses nicht zu erwarten gewesen. Sowohl bei der Perkolation als auch bei der zweistufigen Mazeration, die unten in den Beispielen näher beschrieben werden, konnten Extraktivmengen gewonnen werden, die qualitativ und quantitativ denen ethanolischer Extrakte gleichen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäß erhaltenen Wurzelextrakts liegt darin, dem Extrakt ein Eindickungsmittel, beispielsweise Glukosesirup, in einer solchen Menge zuzugeben, daß sich der Extrakt verfestigt bzw. erstarrt. Dann ist es möglich, den erstarrten Extrakt beispielsweise in Form eines Lutschbonbons, Lutschtablette, Bukal- oder Lingual- arzneiform oder eines Lutschers zu verabreichen, was insbesondere die Behandlung von Kindern stark erleichtern kann. Daneben kann der erfindungsgemäße Extrakt auch in einer üblichen flüssigen Zubereitung, wie in Form von Tropfen, Saft, Sirup, usw. formuliert und verabreicht werden.
Bei Prüfung der erfindungsgemäßen Extrakte auf ihre antimikrobielle und immunstimulierende Wirkung konnte eine deutliche Wirkung gegen grampositive Keime wie Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae und gramnegative Keime wie E. coli, Proteus mirabilis und Hämophilus influenzae gezeigt werden. Bei Prüfung auf Immunstimulierung zeigte sich eine Induktion von IFN-Gamma und TNF-alpha in Leishmania donovani infizierten murinen Makrophagen.
AIs Extraktionsmittel können bestimmte ein- oder mehrwertige Alkohole und Derivate, wie aliphatische und aromatische ein- oder mehrwertige Alkohole, anorganische oder organische, ein- oder mehrwertige Säuren und Derivate, pflanzliches Öl und Kohlendioxid eingesetzt werden. Bevorzugte Mischungsverhältnisse sind oben angegeben.
Beispiele konkreter besonders bevorzugter Extraktionsmittel sind:
Mehrwertige Alkohole, einschließlich Zucker und Zuckeralkohole, Polyethylenglycol (PEG) 100-4000, Propylenglycol, Polypropylenglycol 100-4000, Butandiol in möglichen Substituti¬
onsformen und seine Derivate, Butylalkohol, 1,3-Butylenglycol, Carboxymethylcellulose und ihre Derivate, beispielsweise Carboxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose, Dextran, Dextrin, Dextrose, Ethylcellulose, Ethylenglycolderivate, beispielsweise Ethylenglycoldistearat, Ethylen- glycolmonobutylether, Ethylenglycolmonoethylether, Glucose, Glycerin und seine veretherten und veresterten Derivate, insbesondere Glycerin verestert mit langkettigen Fettsäuren oder ve- rethert mit langkettigen Fettalkoholen, Lactose, Mono- und Diglyceride mit ihren Estern und Alkali- und Erdalkalisalzen, Octanol, Polysorbat 20-80, Polyvinylacetat, Polyvinylalkohol, Pro- pylenglycolalginat, Sorbitan und seine ein- und mehrfach veresterten Derivate, Sorbitol, Xylose, Xylit, organische ein- und mehrwertige Säuren und ihre Alkali- und Erdalkalisalze, beispielsweise Ascorbinsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Heteropolysaccharide, Monosaccharide, Disaccharide, Trisaccharide, Tetrasaccharide, Kohlendioxid, pflanzliche Öle, Lecithin und seine Derivate, Phosphorsäure und ihre Alkali- und Erdalkalisalze und Polyoxyethylen, vorzugsweise verestert mit gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren, zum Beispiel Polysorbat 20-80.
Bevorzugt sind ebenfalls aliphatische Phenylalkohole, beispielsweise Isobutyl-, Propyl- oder Ethylphenylalkohol, Methylbenzylacetat, -butyrat und weitere Säurederivate, flüssige, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren und Fettalkohole mit Kettenlängen von C6 bis C16, Benzylalkohol und seine Derivate, Isoamylalkohol und seine Derivate, Isobutylalkohol und seine Derivate.
Die Erfindung wird anhand folgender, nicht einschränkender Beispiele erläutert. Um vergleichbare analytische und pharmakologische Daten zu erhalten, wurde der Scopoletingehalt aller Extrakte bestimmt.
Beispiel 1
100 g getrocknete und gemahlene Wurzel von Pelargonium sidoides wurden 24 h mit 200 g einer Wasser-Sorbitol-Mischung (70g Sorbitol in 100 ml Wasser) vorgequellt und anschließend mit 800 ml des gleichen Wasser-Sorbitol-Gemisches über 8 Stunden perkoliert. Der Rohextrakt wurde über Seitz Supra 1500 filtriert und abgefüllt.
Tabelle 1 : Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung
GP: Gesamtphenol, Angabe in Prozent
GC: Gesamtcumarin, Angabe in Prozent
IFN: Interferon-Gamma, Angabe in EC5Q (μg/ml)
TNF: Tumornekrosefaktor-alpha, Angabe in U/mL E. coli: Escherichia coli, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm S.a: Staphylococcus aureus, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm S.p.: Streptococcus pneumonaiae, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm P.m.: Proteus mirabilis, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm H.i.: Haemophilus influenzae, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm
Beispiel 2
100 g getrocknete und gemahlene Wurzel von Pelargonium sidoides wurden 24 h mit 200 g einer Wasser-PEG400-Mischung (Wasser:PEG400 = 10:90 (Gew.-%)) vorgequellt und anschließend mit 800 ml des gleichen Wasser-PEG400-Gemisches über 8 Stunden perkoliert. Der Rohextrakt wurde über Seitz Supra 1500 filtriert und abgefüllt.
Tabelle 2: Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung
Beispiel 3
Je 20 g getrocknete und gemahlene Wurzeldroge von P, sidoides wurde in unterschiedlichen Ansatzmedien (A1-A15) über 16 h vorgequellt (siehe Tabelle 3) und danach mit je 160 g zweier unterschiedlicher Extraktionsmedien (El, E2) perkoliert. Das Extraktionsmedium E 1 bestand aus Wasser-Glycerol-Sorbitol 80:10:10 (Gew.-%). und Extraktionsmedium E2 aus Wasser- Glycerol-PEG400 85:12,5:2,5 (Gew.-%). Die Perkolation erfolgte über 8 h und der Rohextrakt wurde über Glasfritten Größe G4 filtriert. Neben den ethanolfreien Extrakten wurde zu Vergleichszwecken ein ethanolhaltiger Extrakt (Al 6) erstellt, der nach den Vorgaben in Beispiel 1 der WO 03/028746 Al erstellt wurde.
Tabelle 3: Ansatzgemische und Extraktionsmedien (alle Angaben in Gew.-%)
Tabelle 4: Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung
Beispiel 4
Im Vergleich zur Perkolation wurde eine modifizierte Mazeration entsprechend der DAB 10 Vorschrift (Devrtsches Arzneibuch) durchgeführt. 20 g der gemahlenen und getrockneten Wurzel von P. sidoides wurden mit 140 ml einer Wasser-Sorbitol-Mischung (70g Sorbitol in 100 ml Aqua dest.) suspendiert und über 5 Tage mit gelegentlichem Umschütteln stehen gelassen. Anschließend wurde filtriert und der Rohextrakt aufgefangen. Das feuchte Drogenmaterial wurde nun ein zweites Mal in der gleichen Art und Weise mazeriert. Die Extraktlösung wurde ebenfalls aufgefangen und mit dem ersten Rohextrakt vereinigt.
4 t
Tabelle 5: Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung
Beispiel 5
Im Vergleich zur Perkolation wurde eine modifizierte Mazeration entsprechend der DAB 10 Vorschrift durchgeführt. 20 g der gemahlenen und getrockneten Wurzel wurden mit 140 ml einer Wasser-PEG400-Mischung (Wasser:PEG400 = 10:90 (Gew.-%)) suspendiert und über 5 Tage mit gelegentlichem Umschütteln stehen gelassen. Anschließend wurde filtriert und der Rohextrakt aufgefangen. Das feuchte Drogenmaterial wurde nun ein zweites Mal in der gleichen Art und Weise mazeriert. Die Extraktlösung wurde ebenfalls aufgefangen und mit dem ersten Rohextrakt vereinigt.
Tabelle 6: Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung
Analytische und pharmakologische Methoden
A. Bestimmung der Gesamtphenole
Die Bestimmung des Gesamtphenolanteils erfolgt nach der im Deutschen Arzneibuch angegebenen Methode für Gerbstoffe (DAB 2002). Die Bestimmung erfolgt photometrisch nach Umsetzung mit Molybdat-Wolframat-Reagenz. Dazu wird der Rohextrakt direkt genommen, mit Natri- umcarbonat-Lösung alkalisiert und anschließend mit Molybdat-Wolframat-Reagenz versetzt. Nach Zentrifugation wird die Extinktion der überstehenden Lösung bei 720 nm gegen Wasser gemessen. Die Bestimmung gegen Extraktionsmedium El oder E2 zeigte keinen Unterschied im Vergleich zu Wasser. Die Berechnung erfolgt auf Basis des Epicatechins.
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B. Bestimmung der Gesamtcumarine
Die Bestimmung der Gesamtcumarine erfolgt mit Hilfe der HPLC über eine RP- 18 Säule. Als mobile Phase wird ein Acetonitril-Wasser-Phosphorsäure-Gradient (10:990:4 zu 205:795:4) verwendet. Detektiert wird bei 330 nm. Die Berechnung der einzelnen Cumarin-Peaks erfolgt als Scopoletin.
C. Bestimmung der antimikrobiellen Wirkung
Je 50 μl der erfindungsgemässen Extrakte werden in 150 ml Muellr-Hinton-Medium zu 200 μl verdünnt, und der antimikrobielle Effekt nach DIN 58 940, 1995, und der Methodik nach Van den Berghe D. A., Vlietnick, A. J., In: Methods in Plant Biochemistry, Assays for Bioactivity, VoI 6, Dey, P.M., Harborne, J. B. (Hrsg.), Academic Press, London, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto, 47-99 (1991) bestimmt. Die Bestimmung erfolgte durch Ausmessen des Hemmhofes auf Agarplatten, in die vor Beimpfen Vertiefungen gestanzt wurden. Die Referenzstämme wurden von der deutschen Stammsammlung für Mikrooroganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig bezogen: Escherichia coli ATCC 25922, Hämophilus influenzae ATCC 33379. Alle weiteren Stämme wurden als in-house Stamm aus Patientenmaterial am Universitätsmedizinischen Zentrum UMCG, Groningen, NL, gewonnen.
D. Bestimmung der immunmodulierenden Wirkung
Prüfung auf TNF-Synthese und Freisetzung aus murinen L-929 (TNF) und humanen WEHI-Fibroblasten
Zellen der Maus-Fibroblastenzellinie L-929 (TNF) #5707 und WEHI 164/E clone 13 #5676 wurden in R5-Medium vorkultiviert bei 370C, 6% CC^. Das Kulturmedium in der Nährflasche wurde verworfen, und die adhärenten Zellen in der Flasche wurden mit 10 mL HBSS (Henk ba- lanced salt Solution) (ohne FCS (Fetal calf serum)) gespült. Die HBSS-Lösung wurde ebenfalls verworfen, in die Flasche 5 mL Trypsin/EDTA-Lösung gegeben und 15 Minuten bei 37°C, 6% CO2 inkubiert. Die enzymatische Ablösung der Zellen wurde durch Zugabe von 5 mL R5-
Medium gestoppt und die Zellsuspension in Falconröhrchen gesammelt. Zur Zellgewinnung wurde die Suspension zwei Mal bei 1100 U/min 12 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert
43-
und drei Mal mit 10 mL HBSS-Lösung gewaschen. Nach Neubauer erfolgte die Zellzahlbestimmung (3,97xlO7 für L-929 (TNF) und l,3xlθ7 für WEHI 164/E), die jeweils auf 3xlO4 Zellen/Vertiefung in 100 μL (entspricht 3x1 O^ Zellen/mL) mit R5-Lösung eingestellt werden. Die normierte Zellsuspension wurde auf Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen) ausplattiert. Als Kontollen wurden in zwei Vertiefungen Mediumkontrollen (zellfrei), in weiteren zwei Vertiefungen Negativkontrollen (Zellen mit R5-Medium) und eine Vertiefung eine Positivkontrolle (Zellen in R5-Lösung mit 5 μL einer auf 10U/mL eingestellten TNF-Lösung) pipettiert. Die ausplattierten Mikrotiterplatten wurden über Nacht bei 37°C, 6% CO2 inkubiert.
Aus den über Nacht inkubierten Zellsuspensionen werden die Überstände von den am Boden adhärierenden Zellen abgesaugt und mit unterschiedlich verdünnten Actinomycin D-Lösungen sowie Testlösungen eingestellt. Die aktivierten Mikrotiterplatten wurden bei 37°C, 6% CO2, 18
Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Positivkontrolle mikroskopisch auf hinreichende Zellyse kontrolliert. Das Medium der Mikrotiterplatte wurde verworfen und die Platte auf Vlies trocken geklopft. In jede Vertiefung wurden 100 μL einer 0,5%ige Kristallviolettlösung gefüllt und 3 Minuten angefärbt. Anschließend wurde die Färbelösung verworfen, jede Mikroti- terplatte wird vier Mal in destillierten Wasser gewaschen, auf Vlies trocken geklopft und 30 Minuten lang bei 50°C nachgetrocknet. In jede Vertiefung werden anschließend 100 μL 33%ige Essigsäure gefüllt, die Mikrotiterplatten 10 Minuten geschüttelt und die Absorption bei 592 nm im ELISA Gerät gemessen.
Bestimmung des zytoprotektiven Effekts durch Wertbestimmung von IFN im EMC-Virus/L929 (IFN) -Testmodell
In 100 mL Kulturschalen wurden L929 (IFN)-Zellen (Charge Nr. 5577) angezüchtet, trypsiniert, gewaschen und gezählt. Die Suspension wurde auf 2x10-" Zellen/mL eingestellt und in Mikrotiterplatten mit 2x104 Zellen/Vertiefung eingesät, die über Nacht bei 370C, 5% CO2, inkubiert wurden. Anschließend wurde der Überstand jeweils durch je 100 μL Mediumkontrolle, Zellkontrolle, Viruskontrolle mit r-mu-IFN-γ-Kontrolle, r-mu-IFN-γ-Standard (100 LVmL) und Testlösung ersetzt, die alle linear verdünnt wurden.
44
Die Proben wurden genau acht Stunden lang bei 370C, 5% CO2, inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden in die Virus-, Interferonkontrolle und in die Testlösungen je 100 μL der Virus-Gebrauchssuspension pipettiert und über Nacht bei 370C, 5% CO2, erneut inkubiert.
Nach 22 Stunden zeigte sich vollausgeprägte Virusaktivität (Zellysis muß in der Viruskontrolle deutlich ausgeprägt sein), so daß die Lysis abgebrochen wurde. Die Überstände wurden über dem Waschbecken verworfen. In jede Vertiefung wurde 100 μL 0,5%ige Kristallviolett-Lösung pipettiert. Nach drei Minuten Färbezeit wurde die überschüssige Lösung entfernt und die Mikro- titerplatten mit destillierten Wasser nachgewaschen und bei 50°C 10 Minuten nachgetrocknet. In die vollständig trockenen Vertiefungen wurden 100 μL Essigsäure (33%) pipettiert und 10 Minuten geschüttelt. Die Bestimmung der Absorption der Kristallviolettfärbung erfolgt am ELISA- Reader bei 550 nm. Die mittlere Absorption der r-mu-IFN-γ-Kontrolle wurde gleich 100% und die der Viruskontrolle gleich 0% Zellprotektion gesetzt. Der EDgQ- Wert des r-mu-IFN-γ-
Standards lag bei 1,076 LVmL (bestimmt aus 8 Standardkurven).
Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln aus auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.
Claims
1. Verfahren zur Extraktion von Pflanzen, insbesondere Wurzeln, der Pflanzengattung Pe- largonium, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen mit einem ethanolfreien Lösungsmittel oder einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung extrahiert werden, das bzw. die ausgewählt wird bzw. werden aus Wasser und zumindest einem einwertigen Alkohol mit mindestens drei Kohlenstoffatomen, Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol, Wasser und zumindest einer anorganischen, organischen, ein- oder mehrwertigen Säure oder einem Derivat derselben, zumindest einem pflanzlichen Öl und Kohlendioxid.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion eine Perkolation und/oder eine einstufige oder mehrstufige, vorzugsweise zweistufige Mazeration umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der mehrwertige Alkohol ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol, Glycerol, Propy- lenglycol, Sorbitol, Xylitol oder Mischungen derselben.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyethylenglycol ein Molekulargewicht von etwa 40 bis etwa 40000, bevorzugt von etwa 200 bis etwa 2000, besonders bevorzugt von etwa 200 bis etwa 800 aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen zerkleinert, gemahlen und/oder getrocknet und/oder frisch eingesetzt werden.
6. Verfaliren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis Wasseπmehrwertiger Alkohol in einem Bereich von 95:5 bis etwa 5:95 liegt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis Wasser: organische ein- oder mehrwertige Säure in einem Bereich von 99,9:0,1 bis etwa 80:20 liegt. 46
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein pflanzliches Öl oder Kohlendioxid als Extraktionsmittel eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis Wasseπanorganische Säure in einem Bereich von 99,9:0,1 bis etwa 80:20 liegt.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von Wasseπmehrwertigem Alkohol bei einer Mazeration von etwa 80:20 bis etwa 60:40, bevorzugt etwa 70:30 reicht.
11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichts Verhältnis von Wasseπmehrwertigem Alkohol bei einer Perkolation von etwa 90:10 bis etwa 70:30, bevorzugt etwa 80:20 reicht.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Perkolation ein Anmaischen der Pflanzen erfolgt.
13. Extrakt der Pflanzengattung Pelargonium, gelöst in einem ethanolfreiem Lösungsmittel oder einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasser und zumindest einem einwertigen Alkohol mit mindestens drei Kohlenstoffatomen, Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol, Wasser und zumindest einer anorganischen, organischen, ein- oder mehrwertigen Säure oder einem Derivat derselben, zumindest einem pflanzlichen Öl und Kohlendioxid, insbesondere hergestellt nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 12.
14. Extrakt nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt von Wurzeln der Pflanze Pelargonium sidoides, Pelargonium reniforme, Pelargonium lobatum und/oder Pelargonium triste ist.
15. Extrakt nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt zusätzlich ein Eindickungsmittel enthält und in fester, erstarrter Form vorliegt. 47
16. Extrakt nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt in Form eines Lutschbonbons, einer Lutschtablette, einer Bukal- oder Lingualarzneiform oder eines Lutschers vorliegt.
17. Verwendung des Extrakts nach einem der Ansprüche 13 bis 16 zur Behandlung von akuten und/oder chronischen Entzündungserkrankungen und/oder Infektionen bei Säugetieren.
18. Verwendung nach Anspruch 17 beim Menschen, Haus- und Nutztieren, bevorzugt Pferd, Hund, Katze, Schwein oder Huhn.
19. Verwendung nach Ansprach 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt oral verabreicht wird.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19 zur Behandlung oder Prophylaxe von HIV-Infektionen oder HIV-assoziierten Infektionen.
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