DE102005034227A1

DE102005034227A1 - Verfahren zur Extraktion von Wurzeln der Pflanzengattung Pelargonium, danach hergestelltes Extrakt und Verwendung desselben

Info

Publication number: DE102005034227A1
Application number: DE102005034227A
Authority: DE
Inventors: Wilfried Kohnen
Original assignee: EMSPHARM GmbH
Current assignee: EMSPHARM GmbH
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2005-07-19
Publication date: 2007-02-01
Also published as: JP2009501736A; WO2007009446A2; CN101252944A; US20100047373A9; WO2007009446A3; EP1924271A2; US20090035402A1; ZA200800402B

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Wurzeln der Pflanzengattung Pelargonium, wobei die Wurzeln mit einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung aus Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol extrahiert werden, sowie einen daraus erhaltenen Wurzelextrakt sowie dessen Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Wurzeln der Pflanzengattung Pelargonium, sowie einen insbesondere nach dem Verfahren hergestellten Wurzelextrakt sowie dessen Verwendung.

Pelargonium reniforme/sidoides ist eine Pflanze, die im südlichen Afrika in der Volksmedizin tradtionell bei gastrointestinalen Beschwerden und Atemwegserkrankungen gebraucht wird, Die Pflanze wurde im Jahre 1897 nach England gebracht, und in den zwanziger Jahren wurde die Pflanze und Extrakte durch Sechehaye in die Schweiz gebracht. Extrakte wurden vor al lem in homöopathischen Zubereitungen in der Tuberkulosetherapie eingesetzt (Kolodziej, H., Kayser, O., Z. Phytotherap. 19, 141-151, 1998).

In wissenschaftlichen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß ethanolische Extrakte eine antimikrobielle Wirkung gegen einige grampositive und gramnegative Bakterien haben (Kayser, O., Kolodziej, H., Planta Med. 63, 508-510, 1997) und über immunmodulatorische Wirkungen verfügen (Kayser, O., Kolodziej, H., Kiderlen, A.F., Radtke, O., Phytomedicine 2003; 10 Suppl. 4:18-24.

Hauptinhaltsstoffe von Pelargonium sidoides Wurzeln sind Proanthocyanidine, oligomere hydrolysierbare Gerbstoffe, Cumarine, Flavonoide und Kaffeesäurederivate (Kayser, O., Dissertation, Freie Universität Berlin, 1997). Charakteristisch ist das Vorkommen der zum Teil hochoxygenierten Cumarine, die für die biologische Wirkung zum Teil mit verantwortlich gemacht werden (Kayser, O., Kolodziej, H., Phytochemistry, 39, 1181-1185, 1995).

Extrakte des Wurzelmaterials von Pelargonium sidoides und auch Pelargonium reniforme sowie anderer Pflanzen der Gattung Pelargonium wurden in der Vergangenheit durch Mazeration und/oder Perkolation unter Verwendung von reinem Wasser, Gemischen aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel wie Aceton (Kayser, O., Kolodziej, H., Phytochemistry, 39, 1181-1185, 1995), Methanol (Bladt, S., Wagner, H., Dtsch. Apoth.-Ztg., 128, 292-296, 1988) oder Ethanol (WO 03/028746 A1) hergestellt. In der therapeutischen Anwendung und im Handel befindet sich ein mit Glycerol stabilisierter ethanolischer Auszug aus Pelargonium reniforme/sidoides (Rote Liste 2005). Gegenüber Extraktionen mit Wasser, Methanol oder Aceton zeigt sich bei der ethanolischen Extraktion die verbesserte Gewinnung von Extraktivstoffen und die Extraktion bei Raumtemperatur. Allerdings wird der Gebrauch ethanolischer Extrakte aus P. reniforme/sidoides in Fachkreisen als problematisch angesehen, da insbesondere Kinder als bevorzugte Patientengruppe arzneilich genutzte Extrakte einnehmen. Diese Problematik gilt auch für Patienten, die Ethanol aus gesundheitlichen Gründen nicht einnehmen sollen oder dürfen, zum Beispiel alkoholkranke Personen, Epileptiker oder Parkinson-Patienten.

Der Wunsch nach ethanolfreien pflanzlichen Liquida auf anderen pharmazeutischen Gebieten hat in der Vergangenheit zur Entwicklung von Zubereitungsformen ohne Ethanol geführt, bei denen im Gegensatz zu Frischpflanzensäften, Teezubereitungen und wäßrigen Tonika nunmehr auch lipophile Pflanzeninhaltsstoffe enthalten sind. Als Lösungs- und Extraktionsmedium dienten beispielsweise Polyethylenglykol, Glycerol, Sorbitol oder Propylenglykol, einzeln oder in Kombination, mit Wasser. In einer Dissertation von Vogel, K., Disseratation, Universität Tübingen, 1992, konnte gezeigt werden, daß die lipophilen Inhaltsstoffe von Kamille, nämlich Chamazulen und Bisabolol, nicht nur gut löslich sind in Propylenglykol, sondern auch chemisch und physikalisch stabilisiert werden können. Kamille gehört einer anderen Pflanzengattung als Pelargonium an. Bei der Kamillenextraktion zeigte sich jedoch, daß mit dem mehrwertigen Alkohol Propylenglycol im überwiegenden Maße lediglich lipophile Bestandteile extrahiert wurden, hydrophile Bestandteile jedoch kaum erhalten wurden (Vogel, K., Dissertation, Universität Tübingen, 1992). Ethanol-Wasser-Gemische besitzen gegenüber ethanolfreien Extrakten gewisse technologische und mikrobiozide Vorteile, insbesondere kann eine höhere Extraktausbeute erwartet werden. Gegenwärtig wird ein Propylenglykol-Glycerol-Wasser-Gemisch genutzt, um in einigen Fertigarzneimitteln den ethanolischen Spissum oder acetonischen Extrakt zu lösen (bspw. Tebonin forte Lösung). Sorbitol-Wasser-Gemische werden eingesetzt, um das in der Pädiatrie gebrauchte Arzneimittel Prospan anzubieten (Rote Liste 2005).

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das gattungsgemäße Verfahren derart weiter zu entwickeln, daß die Nachteile des Stands der Technik überwunden werden. Insbesondere soll ein Verfahren bereit gestellt werden, das eine ethanolfreie Extraktion von Wurzeln der Pflanzengattung Pelargonium ermöglicht, um eine Verabreichung an Patienten zu ermöglichen, die Ethanol aus gesundheitlichen Gründen nicht einnehmen sollen oder dürfen (beispielsweise Kinder, alkoholkranke Personen, Epileptiker, Parkinson-Patienten). Das erfindungsgemäße Verfahren soll ferner zu einem Extrakt führen, der dem aus einer Wasser-Ethanol-Extraktion gewonnenen Extrakt im wesentlichen äquivalent ist. Die eingesetzten Extraktionsmittel sollen toxikologisch unbedenklich sein. Insbesondere soll das Verfahren einen Extrakt bereitstellen, der qualitativ und quantitativ den wäßrig-ethanolischen Extrakten gleicht.

Desweiteren ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen insbesondere nach dem Verfahren hergestellten Extrakt bereitzustellen und dessen Verwendung zu ermöglichen.

Die erste Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Wurzeln mit einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung aus Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol extrahiert werden.

Bevorzugt ist dabei, daß die Extraktion eine Perkolation und/oder eine einstufige oder zweistufige Mazeration umfaßt.

Besonders bevorzugt ist, daß der mehrwertige Alkohol ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol, Glycerol, Polypropylenglycol, Sorbitol, Xylitol oder Mischungen derselben.

Dabei wird vorgeschlagen, daß das Polyethylenglycol ein Molekulargewicht von etwa 40 bis etwa 40000, bevorzugt von etwa 200 bis etwa 2000, besonders bevorzugt von etwa 200 bis etwa 800 aufweist.

In einer Ausführungsform werden die Wurzeln gemahlen und/oder getrocknet und/oder frisch eingesetzt.

Besonders bevorzugt ist, daß das Gewichtsverhältnis Wasser:mehrwertiger Alkohol in einem Bereich von 90:10 bis etwa 10:90 reicht.

Dabei wird vorgeschlagen, daß das Gewichtsverhältnis von Wasser:mehrwertigem Alkohol bei einer Mazeration von etwa 80:20 bis etwa 60:40, bevorzugt etwa 70:30 reicht, und daß das Gewichtsverhältnis von Wasser:mehrwertigem Alkohol bei einer Perkolation von etwa 90:10 bis etwa 70:30, bevorzugt etwa 80:20 reicht.

Auch kann vorgesehen sein, daß vor der Perkolation ein Anmaischen der Wurzeln erfolgt.

Die zweite Aufgabe wird gelöst durch einen Wurzelextrakt der Pflanzengattung Pelargonium, gelöst in einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung aus Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol, insbesondere hergestellt nach einem erfindungsgemäßen Verfahren.

Am bevorzugtesten ist, daß die Wurzeln Wurzeln der Pflanze Pelargonium sidoides DC und/oder Pelargonium reniforme CURT sind.

Auch wird in einer Ausführungsform vorgeschlagen, daß der Extrakt zusätzlich ein Eindickungsmittel enthält und in fester, erstarrter Form vorliegt.

Dabei kann der Extrakt in Form eines Lutschbonbons, einer Lutschtablette, einer Bukal- oder Lingualarzneiform oder eines Lutschers vorliegen.

Schließlich wird die Verwendung des erfindungsgemäßen Wurzelextrakts zur Behandlung von akuten und/oder chronischen Entzündungserkrankungen und/oder Infektionen bei Säugetieren vorgeschlagen.

Bevorzugt ist die Verwendung beim Menschen, Pferd, Hund oder Katze. Jedoch ist die Verwendung bei Haus- und Nutztieren im allgemeinen möglich.

Schließlich wird vorgeschlagen, daß der Wurzelextrakt oral verabreicht wird.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren ein Wurzelextrakt der Pflanzengattung Pelargonium in einer gleichen Ausbeute und Qualität wie für eine Extraktion auf Basis Wasser-Ethanol erhalten werden kann. Gleichzeitig wurde gefunden, daß die bekannten antimikrobiellen und immunstimulierenden Wirkungen bei Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können hohe Anteile an lipophilen und hydrophilen Bestandteilen extrahiert werden. Da das erfindungsgemäße Verfahren ethanolfrei betrieben wird, kann der gewonnene Extrakt unbe denklich für die Behandlung von Kindern, alkoholkranken Personen, Epileptikern und Parkinson-Patienten eingesetzt werden.

Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Extraktion in Form einer Perkolation und/oder einer zweistufigen Mazeration durchgeführt.

Die Perkolation wird mit unterschiedlichen Gemischen aus Wasser und mehrwertigem Alkohol durchgeführt. Ein bevorzugter mehrwertiger Alkohol ist Sorbitol, beispielsweise in einer Mischung aus Wasser-Glycerol-Sorbitol 70:15:15 (Gew.-%), oder Polyethylenglykol, beispielsweise in einer Mischung aus Wasser-Polyethylenglykol-Glycerol 70:20:10 (Gew.-%). Die Perkolation kann aber auch durch Anmaischen erfolgen, wobei das Anmaischen und anschließende Perkolieren mit gleich oder unterschiedlich konzentrierten Wasser-Alkoholgemischen erfolgen kann. Es zeigte sich als Vorteil, daß ein Anmaischen mit einem Wasser-Alkohol-Anteil von 70:30 (Gew.-%) und die Perkolation mit einem Wasser-Alkohol-Anteil von 80:20 (Gew.-%) zu besten Ausbeuten führt. Bei einem Verhältnis von Wurzelmaische zu Extraktionsmedium von 20:80 ergibt sich eine Endkonzentration des bzw. der mehrwertige Alkohol(e) bei circa 22 %. Die erfindungsgemäßen Extrakte enthalten einen Cumarinanteil, bezogen auf Scopoletin, der im gleichen Größenbereich wie derjenige der ethanolischen Extrakte liegt.

Bei Extraktionsversuchen mit der gemahlenen und getrockneten Wurzel von Pelargonium sidoides mit Gemischen aus Wasser und mehrwertigem Alkohol wurde überraschenderweise festgestellt, daß in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Extraktionsmediums lipophile Stoffe wie Cumarine auf der einen Seite, aber auch wasserlösliche Phenole auf der anderen Seite sich im gleichen Extraktionsschritt extrahieren lassen. Vor dem Hintergrund des bestehenden Kenntnisstandes zu Pelargonium sidoides und Pelargonium reniforme ist dieses nicht zu erwarten gewesen. Sowohl bei der Perkolation als auch bei der zweistufigen Mazeration, die unten in den Beispielen näher beschrieben werden, konnten Extraktivmengen gewonnen werden, die qualitativ und quantitativ denen ethanolischer Extrakte gleichen.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäß erhaltenen Wurzelextrakts liegt darin, dem Extrakt ein Eindickungsmittel, beispielsweise Glukosesirup, in einer solchen Menge zuzugeben, daß sich der Extrakt verfestigt bzw. erstarrt. Dann ist es möglich, den erstarrten Wurzelextrakt beispielsweise in Form eines Lutschbonbons, Lutschtablette, Bukal- oder Lingualarzneiform oder eines Lutschers zu verabreichen, was insbesondere die Behandlung von Kindern stark erleichtern kann. Daneben kann der erfindungsgemäße Wurzelextrakt auch in einer üblichen flüssigen Zubereitung, wie in Form von Tropfen, Saft, Sirup, usw. formuliert und verabreicht werden.

Bei Prüfung der erfindungsgemäßen Extrakte auf ihre antimikrobielle und immunstimulierende Wirkung konnte eine deutliche Wirkung gegen grampositive Keime wie Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae und gramnegative Keime wie E. coli, Proteus mirabilis und Hämophilus influenzae gezeigt werden. Bei Prüfung auf Immunstimulierung zeigte sich eine Induktion von IFN-Gamma und TNF-alpha in Leishmania donovani infizierten murinen Makrophagen.

Die Erfindung wird anhand folgender nicht einschränkender Beispiele erläutert. Um vergleichbare analytische und pharmakologische Daten zu erhalten, wurden die Extrakte auf den Gehalt von Scopoletin standardisiert.

Beispiel 1
100 g getrocknete und gemahlene Wurzel von Pelargonium sidoides wurden 24 h mit 200 g einer Wasser-Sorbitol-Mischung (70g Sorbitol in 100 ml Wasser) vorgequellt und anschließend mit 800 ml des gleichen Wasser-Sorbitol-Gemisches über 8 Stunden perkoliert. Der Rohextrakt wurde über Seitz Supra 1500 filtriert und abgefüllt.
Tabelle 1: Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung

¹GP: Gesamtphenol, Angabe in Prozent
²GC: Gesamtcumarin, Angabe in Prozent
³IFN: Interferon-Gamma, Angabe in EC₅₀ (μg/ml)
⁴TNF: Tumornekrosefaktor-alpha, Angabe in U/mL
⁵E. coli: Escherichia coli, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm
⁶S.a: Staphylococcus aureus, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm
⁷S.p.: Streptococcus pneumonaiae, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm
⁸P.m.: Proteus mirabilis, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm
⁹H.i.: Haemophilus influenzae, Angabe in Durchmesser des Hemmhofes in mm

Beispiel 2
100 g getrocknete und gemahlene Wurzel von Pelargonium sidoides wurden 24 h mit 200 g einer Wasser-PEG400-Mischung (Wasser:PEG400 = 10:90 (Gew.-%)) vorgequellt und anschließend mit 800 ml des gleichen Wasser-PEG400-Gemisches über 8 Stunden perkoliert. Der Rohextrakt wurde über Seitz Supra 1500 filtriert und abgefüllt.
Tabelle 2: Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung
Beispiel 3
Je 20 g getrocknete und gemahlene Wurzeldroge von P. sidoides wurde in unterschiedlichen Ansatzmedien (A1-A15) über 16 h vorgequellt (siehe Tabelle 3) und danach mit je 160 g zweier unterschiedlicher Extraktionsmedien (E1, E2) perkoliert. Das Extraktionsmedium E1 bestand aus Wasser-Glycerol-Sorbitol 80:10:10 (Gew.-%). und Extraktionsmedium E2 aus Wasser-Glycerol-PEG400 85:12,5:2,5 (Gew.-%). Die Perkolation erfolgte über 8 h und der Rohextrakt wurde über Glasfritten Größe G4 filtriert. Neben den ethanolfreien Extrakten wurde zu Vergleichszwecken ein ethanolhaltiger Extrakt (A16) erstellt, der nach den Vorgaben in Beispiel 1 der WO 03/028746 A1 erstellt wurde.
Tabelle 3: Ansatzgemische und Extraktionsmedien (alle Angaben in Gew.-%)
Tabelle 4: Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung
Beispiel 4
Im Vergleich zur Perkolation wurde eine modifizierte Mazeration entsprechend der DAB 10 Vorschrift (Deutsches Arzneibuch) durchgeführt. 20 g der gemahlenen und getrockneten Wurzel von P. sidoides wurden mit 140 ml einer Wasser-Sorbitol-Mischung (70g Sorbitol in 100 ml Aqua dest.) suspendiert und über 5 Tage mit gelegentlichem Umschütteln stehen gelassen. Anschließend wurde filtriert und der Rohextrakt aufgefangen. Das feuchte Drogenmaterial wurde nun ein zweites Mal in der gleichen Art und Weise mazeriert. Die Extraktlösung wurde ebenfalls aufgefangen und mit dem ersten Rohextrakt vereinigt.
Tabelle 5: Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung
Beispiel 5
Im Vergleich zur Perkolation wurde eine modifizierte Mazeration entsprechend der DAB 10 Vorschrift durchgeführt. 20 g der gemahlenen und getrockneten Wurzel wurden mit 140 ml einer Wasser-PEG400-Mischung (Wasser:PEG400 = 10:90 (Gew.-%)) suspendiert und über 5 Tage mit gelegentlichem Umschütteln stehen gelassen. Anschließend wurde filtriert und der Rohextrakt aufgefangen. Das feuchte Drogenmaterial wurde nun ein zweites Mal in der gleichen Art und Weise mazeriert. Die Extraktlösung wurde ebenfalls aufgefangen und mit dem ersten Rohextrakt vereinigt.
Tabelle 6: Gewonnene Menge an Extraktivstoffen und korrelierte biologische Wirkung
Analytische und pharmakologische Methoden
A. Bestimmung der Gesamtphenole
Die Bestimmung des Gesamtphenolanteils erfolgt nach der im Deutschen Arzneibuch angegebenen Methode für Gerbstoffe (DAB 2002). Die Bestimmung erfolgt photometrisch nach Umsetzung mit Molybdat-Wolframat-Reagenz. Dazu wird der Rohextrakt direkt genommen, mit Natriumcarbonat-Lösung alkalisiert und anschließend mit Molybdat-Wolframat-Reagenz versetzt. Nach Zentrifugation wird die Extinktion der überstehenden Lösung bei 720 nm ge gen Wasser gemessen. Die Bestimmung gegen Extraktionsmedium E1 oder E2 zeigte keinen Unterschied im Vergleich zu Wasser. Die Berechnung erfolgt auf Basis des Epicatechins.
B. Bestimmung der Gesamtcumarine
Die Bestimmung der Gesamtcumarine erfolgt mit Hilfe der HPLC über eine RP-18 Säule. Als mobile Phase wird ein Acetonitril-Wasser-Phosphorsäure-Gradient (10:990:4 zu 205:795:4) verwendet. Detektiert wird bei 330 nm. Die Berechnung der einzelnen Cumarin-Peaks erfolgt als Scopoletin.
C. Bestimmung der antimikrobiellen Wirkung
Je 50 μl der erfindungsgemässen Extrakte werden in 150 ml Muellr-Hinton-Medium zu 200 μl verdünnt, und der antimikrobielle Effekt nach DIN 58 940, 1995, und der Methodik nach Van den Berghe D. A., Vlietnick, A. J., In: Methods in Plant Biochemistry, Assays for Bioactivity, Vol 6, Dey, P.M., Harborne, J. B. (Hrsg.), Academic Press, London, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto, 47-99 (1991) bestimmt. Die Bestimmung erfolgte durch Ausmessen des Hemmhofes auf Agarplatten, in die vor Beimpfen Vertiefungen gestanzt wurden. Die Referenzstämme wurden von der deutschen Stammsammlung für Mikrooroganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig bezogen: Escherichia coli ATCC 25922, Hämophilus influenzae ATCC 33379. Alle weiteren Stämme wurden als in-house Stamm aus Patientenmaterial am Universitätsmedizinischen Zentrum UMCG, Groningen, NL, gewonnen.
D. Bestimmung der immunmodulierenden Wirkung
Prüfung auf TNF-Synthese und Freisetzung aus murinen L-929 (TNF) und humanen WEHI-Fibroblasten
Zellen der Maus-Fibroblastenzellinie L-929 (TNF) #5707 und WEHI 164/E clone 13 #5676 wurden in RS-Medium vorkultiviert bei 37°C, 6% CO₂. Das Kulturmedium in der Nährflasche wurde verworfen, und die adhärenten Zellen in der Flasche wurden mit 10 mL HBSS (Henk balanced salt solution) (ohne FCS (Fetal calf serum)) gespült. Die HBSS-Lösung wurde ebenfalls verworfen, in die Flasche 5 mL Trypsin/EDTA-Lösung gegeben und 15 Minuten bei 37°C, 6% CO₂ inkubiert. Die enzymatische Ablösung der Zellen wurde durch Zugabe von 5 mL RS-Medium gestoppt und die Zellsuspension in Falconröhrchen gesammelt. Zur Zellgewinnung wurde die Suspension zwei Mal bei 1100 U/min 12 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und drei Mal mit 10 mL HBSS-Lösung gewaschen. Nach Neubauer erfolgte die Zellzahlbestimmung (3,97 × 10⁷ für L-929 (TNF) und 1,3 × 10⁷ für WEHI 164/E), die jeweils auf 3 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in 100 μL (entspricht 3 × 10⁵ Zellen/mL) mit RS-Lösung eingestellt werden. Die normierte Zellsuspension wurde auf Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen) ausplattiert. Als Kontollen wurden in zwei Vertiefungen Mediumkontrollen (zellfrei), in weiteren zwei Vertiefungen Negativkontrollen (Zellen mit RS-Medium) und eine Vertiefung eine Positivkontrolle (Zellen in RS-Lösung mit 5 μL einer auf 10U/mL eingestellten TNF-Lösung) pipettiert. Die ausplattierten Mikrotiterplatten wurden über Nacht bei 37°C, 6% CO₂ inkubiert.
Aus den über Nacht inkubierten Zellsuspensionen werden die Überstände von den am Boden adhärierenden Zellen abgesaugt und mit unterschiedlich verdünnten Actinomycin D-Lösungen sowie Testlösungen eingestellt. Die aktivierten Mikrotiterplatten wurden bei 37°C, 6% CO₂, 18 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Positivkontrolle mikroskopisch auf hinreichende Zellyse kontrolliert. Das Medium der Mikrotiterplatte wurde verworfen und die Platte auf Vlies trocken geklopft. In jede Vertiefung wurden 100 μL einer 0,5%ige Kristallviolettlösung gefüllt und 3 Minuten angefärbt. Anschließend wurde die Färbelösung verworfen, jede Mikrotiterplatte wird vier Mal in destillierten Wasser gewaschen, auf Vlies trocken geklopft und 30 Minuten lang bei 50°C nachgetrocknet. In jede Vertiefung werden anschließend 100 μL 33%ige Essigsäure gefüllt, die Mikrotiterplatten 10 Minuten geschüttelt und die Absorption bei 592 nm im ELISA Gerät gemessen.
Bestimmung des zytoprotektiven Effekts durch Wertbestimmung von IFN im EMC-Virus/L929 (IFN)-Testmodell
In 100 mL Kulturschalen wurden L929 (IFN)-Zellen (Charge Nr. 5577) angezüchtet, trypsiniert, gewaschen und gezählt. Die Suspension wurde auf 2 × 10⁵ Zellen/mL eingestellt und in Mikrotiterplatten mit 2 × 10⁴ Zellen/Vertiefung eingesät, die über Nacht bei 37°C, 5% CO₂, inkubiert wurden. Anschließend wurde der Überstand jeweils durch je 100 μL Mediumkontrolle, Zellkontrolle, Viruskontrolle mit r-mu-IFN-γ-Kontrolle, r-mu-IFN-γ-Standard (100 U/mL) und Testlösung ersetzt, die alle linear verdünnt wurden.
Die Proben wurden genau acht Stunden lang bei 37°C, 5% CO₂, inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden in die Virus-, Interferonkontrolle und in die Testlösungen je 100 μL der Virus-Gebrauchssuspension pipettiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO₂, erneut inkubiert.
Nach 22 Stunden zeigte sich vollausgeprägte Virusaktivität (Zellysis muß in der Viruskontrolle deutlich ausgeprägt sein), so daß die Lysis abgebrochen wurde. Die Überstände wurden über dem Waschbecken verworfen. In jede Vertiefung wurde 100 μL 0,5%ige Kristallviolett-Lösung pipettiert. Nach drei Minuten Färbezeit wurde die überschüssige Lösung entfernt und die Mikrotiterplatten mit destillierten Wasser nachgewaschen und bei 50°C 10 Minuten nachgetrocknet. In die vollständig trockenen Vertiefungen wurden 100 μL Essigsäure (33%) pipettiert und 10 Minuten geschüttelt. Die Bestimmung der Absorption der Kristallviolettfärbung erfolgt am ELISA-Reader bei 550 nm. Die mittlere Absorption der r-mu-IFN-γ-Kontrolle wurde gleich 100% und die der Viruskontrolle gleich 0% Zellprotektion gesetzt. Der ED₅₀-Wert des r-mu-IFN-γ-Standards lag bei 1,076 U/mL (bestimmt aus 8 Standardkurven).
Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln aus auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

Verfahren zur Extraktion von Wurzeln der Pflanzengattung Pelargonium, dadurch gekennzeichnet, daß die Wurzeln mit einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung aus Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol extrahiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion eine Perkolation und/oder eine einstufige oder zweistufige Mazeration umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der mehrwertige Alkohol ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol, Glycerol, Polypropylenglycol, Sorbitol, Xylitol oder Mischungen derselben.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyethylenglycol ein Molekulargewicht von etwa 40 bis etwa 40000, bevorzugt von etwa 200 bis etwa 2000, besonders bevorzugt von etwa 200 bis etwa 800 aufweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wurzeln gemahlen und/oder getrocknet und/oder frisch eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis Wasser:mehrwertiger Alkohol in einem Bereich von 90:10 bis etwa 10:90 reicht.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von Wasser:mehrwertigem Alkohol bei einer Mazeration von etwa 80:20 bis etwa 60:40, bevorzugt etwa 70:30 reicht.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von Wasser:mehrwertigem Alkohol bei einer Perkolation von etwa 90:10 bis etwa 70:30, bevorzugt etwa 80:20 reicht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Perkolation ein Anmaischen der Wurzeln erfolgt.
Wurzelextrakt der Pflanzengattung Pelargonium, gelöst in einer ethanolfreien Lösungsmittelmischung aus Wasser und zumindest einem mehrwertigen Alkohol, insbesondere hergestellt nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 9.
Wurzelextrakt nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Wurzeln Wurzeln der Pflanze Pelargonium sidoides DC und/oder Pelargonium reniforme CURT sind.
Wurzelextrakt nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt zusätzlich ein Eindickungsmittel enthält und in fester, erstarrter Form vorliegt.
Wurzelextrakt nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt in Form eines Lutschbonbons, einer Lutschtablette, einer Bukal- oder Lingualarzneiform oder eines Lutschers vorliegt.
Verwendung des Wurzelextrakts nach einem der Ansprüche 10 bis 13 zur Behandlung von akuten und/oder chronischen Entzündungserkrankungen und/oder Infektionen bei Säugetieren.
Verwendung nach Anspruch 14 beim Menschen, Pferd, Hund oder Katze.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Wurzelextrakt oral verabreicht wird.