CN101703551A - 一种由十大功劳叶中提取总生物碱及总黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

一种由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，涉及一种中药成分的提取工艺：提取方法步骤如为；取十大功劳叶粉碎用乙醇回流提取3次，然后合并滤液并静置，滤过，滤液减压回收乙醇得浸膏；而后加入热水，搅拌；用稀酸调节pH5.0-6.0，水洗、乙醇洗脱、收集乙醇洗脱液、得粗提物，所述粗提物用90％乙醇1-3倍量溶解，用2-3倍量聚酰胺粉拌样，挥干溶剂；然后以聚酰胺为载体的层析柱，用水洗脱至碘化铋钾反应阴性，再用乙醇洗脱，分别收集水及洗脱液，分别于减压浓缩，真空干燥得十大功劳总生物碱及总黄酮；本发明提供的方法不仅可将十大功劳叶中两类主要成分最大化的提取出来，最终得到纯度较高的总生物碱及总黄酮。

Description

一种由十大功劳叶中提取总生物碱及总黄酮的方法

【技术领域】

本发明涉及一种中药成分的提取工艺，特别涉及一种由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法。

【背景技术】

自20世纪40年代青霉素发现以来，抗生素的发展突飞猛进，为控制和治疗细菌引起的感染提供了有力的工具。但是由于抗生素不合理使用，导致日趋严重的耐药性问题。耐药菌不仅使抗生素的疗效减弱，治疗费用增加，而且还会引起并发症，甚至使抗生素失去疗效导致病人、患畜死亡率升高。特别是近年来，临床上出现了多重、超强耐药菌株。使得抗菌药失去了原有的疗效，从而使得大肠杆菌耐药性问题的解决变得更加棘手。致病性大肠杆菌可引起禽败血性大肠杆菌病、肠炎、脐带炎、心包炎、全眼球炎，甚至还导致胚胎和幼畜的死亡。

由于上述原因，如何消除或降低细菌的耐药性，使其重新恢复对抗菌药物的敏感性，以及在开发特效的新药之前，延缓抗菌药物耐药性的产生速度，减少抗菌药物的用量和毒性，对于解决耐药性问题具有重要的意义。公知的中药作用靶点多，恰好针对多药耐药机制复杂的特点，以恢复细菌对抗生素的敏感性，现有研究亦提示开发中药多药耐药逆转剂有较好的前景。

小檗科(Berberidaceae)十大功劳属植物，多具有药用价值，分布于美洲中部和北部及亚洲。我国有50种，产于西南部和南部。该属植物根、茎、叶均可入药，以根、茎入药的称为功劳木，以叶入药的称为功劳叶，有清热燥湿、泻火解毒之功效，民间常用于清热、解毒、治感冒等。现已从该属植物中提取分离出几十种生物碱，如小檗碱、异汉防己碱、小檗胺、药根碱、巴马亭碱、非洲防己胺、尖刺碱等，这些生物碱多具有生理活性；除此之外还分离出一些黄酮类及木脂素类成分，如ampelopsin(dihydromyricetin)，丁香树脂醇(syringaresinol)等。盐酸小檗碱具有广谱抗菌作用，体外对多种革兰氏阳性菌及阴性菌均具有抑制作用，主要用于治疗肠道细菌感染性疾病、胃肠炎等。张立新(张立新、孙诺.小檗碱及其类似物在逆转多药耐药泵中的应用.专利申请号：200810112350.1)研究小檗碱及其结构类似物可作为多药耐药泵的逆转剂，与其他药物联合使用，可预防和治疗由于耐药菌所引起的浅部和深部微生物感染。黄酮类成分具有广泛的药理活性，可作为防治高血压及动脉血管硬化的辅助治疗剂，对降低血管脆性及异常通透性及保肝、利胆亦具有明显的作用。小檗属植物中的黄酮木脂素类化合物5′-甲氧基大风子品-D(5′-methoxyhydnocarpin-D，5′-MHC)有抑制金黄色葡萄球菌NorA外排泵的活性。

目前，十大功劳药材被用于提取黄连素，采用的加工工艺是酸水提取或乙醇回流提取，再用石灰水及盐酸调节pH得到黄连素，此工艺得到的黄连素成品含杂质较多，并且未能充分利用原料.有报道阔叶十大功劳叶及花中黄酮类成分的含量测定方法，就如何制备十大功劳叶黄酮类成分未见报道.大孔树脂是利用树脂的吸附和分子筛作用原理进行分离纯化，因而针对性不强，不能将生物碱类和黄酮类物质进行选择性的分离，但是能很好的除去叶绿素、糖类及粘液质类等杂质；聚酰胺可以选择性的分离黄酮类成分，如杨新波(杨新波、黄正明、曹文斌等.一种罗布麻提取物的制备方法及其药物制剂与应用.专利申请号：200610083712.X)利用聚酰胺分离罗布麻叶总黄酮；余丹妮(余丹妮、徐德生、冯怡，等.聚酰胺-大孔树脂联用富集益母草总黄酮[J]，中国中药杂志.2008，33(3)：264-268)利用聚酰胺大孔树脂联用分离益母草总黄酮；蔡鹰(蔡鹰、陆晓和、魏群.聚酰胺柱层析法分离回心草总黄酮的研究[J]，药学实践杂志.2009，27(1)：58-60)利用聚酰胺分离回心草总黄酮.

参考专利

1)、专利申请号、200810112350.1；小檗碱及其结构类似物在逆转多药耐药泵中的应用；

2)、专利申请号、200610083712.X；专利名称、一种罗布麻提取物的制备方法及其药物制剂与应用。

参考文献

1)、利用聚酰胺分离罗布麻叶总黄酮、余丹妮(余丹妮、徐德生、冯怡，等.聚酰胺-大孔树脂联用富集益母草总黄酮[J]，中国中药杂志.2008，33(3)：264-268)利用聚酰胺大孔树脂联用分离益母草总黄酮；

2)、蔡鹰(蔡鹰、陆晓和、魏群.聚酰胺柱层析法分离回心草总黄酮的研究[J]，药学实践杂志.2009，27(1)：58-60)利用聚酰胺分离回心草总黄酮。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，本发明所述提取方法通过大孔树脂除去其中的叶绿素及糖类、黏液质类杂质，再用聚酰胺分离，从而获取所述总生物碱及总黄酮。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，所述工艺步骤如下：

1)、取十大功劳叶，粉碎过10-60目筛；

2)、用十大功劳叶的6～10倍量乙醇“乙醇含量80-95％”回流提取3次，每次1.5-2小时，然后合并3次滤液；

3)、滤液合并后静置12小时以上，而后滤过，减压回收乙醇得浸膏；

4)、浸膏中加入4-6倍量热水，边加边搅拌；然后用稀酸调节pH5.0-6.0，静置2小时，上清液上于非极性或弱极性大孔吸附树脂。

5)、用水洗至Molisch反应阴性，再用2-8倍柱体积10-80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于70℃减压浓缩，得粗提物，此粗提物用90％乙醇1-3倍量溶解，用2-3倍量聚酰胺粉拌样，挥干溶剂。

6)、然后以聚酰胺为载体的层析柱，用水洗脱至碘化铋钾反应阴性，再用5-10倍量柱体积的80％乙醇洗脱，分别收集水及80％洗脱液，分别于70℃减压浓缩，真空干燥得十大功劳总生物碱及总黄酮。

本发明由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，其中大孔吸附树脂为弱极性，包括AB-8、HPD-100、HPD-300或D101型等。

本发明由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，所述大孔吸附树脂柱层析时，上样样品pH5.0-6.0。

本发明由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，所述聚酰胺柱层析，样品使用90％乙醇溶解，用2-3倍量聚酰胺粉拌样，挥干溶剂，并上于载体为聚酰胺的层析柱。

本发明由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，所述的聚酰胺规格包括80-120目、100-200目。

所述的由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，所述大孔树脂的处理方法；大孔吸附树脂用95％乙醇浸泡24小时后使其充分溶胀后，湿法装柱，并用5倍树脂体积95％乙醇动态清洗，水洗至无醇后，依次用5％NaOH“动态清洗3-5倍树脂体积，水洗至中性”和5％盐酸“动态清洗3-5倍树脂体积，水洗至中性”处理，最后用95％乙醇动态清洗至乙醇洗脱液与水混合(1：5)不呈白色混浊溶液止，用水洗去乙醇后即可装柱便可。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果；

本发明所述由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，获取的生物碱及黄酮类成分与现有的获取方法相比较，优点是：

1、本发明提供的综合提取工艺可将十大功劳叶中生物碱类及黄酮类成分提取出来，并能将二者同时分离；

2、本发明将大孔树脂与聚酰胺联用分离总生物碱及总黄酮。利用大孔吸附树脂可同时除去叶绿素、糖类及黏液质等杂质；聚酰胺柱层析能将生物碱类成分及黄酮类成分同时分离，减少了操作程序，大孔树脂及聚酰胺均可再生后使用，从而减少操作工序和有效的降低了工艺成本；

本发明所述工艺过中程用到的溶剂为乙醇，毒性相对较小，各环节所用溶剂可回收再利用，降低生产成本的同时也减少环境污染。

【具体实施方式】

通过下面的实施例可以更详细的解释本发明，本发明并不局限于下面的实施例，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切变化和改进；

实施例1

取十大功劳叶100g，粉碎过30目筛，用6倍量80％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并3次滤液，静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇，70℃减压回收乙醇得浸膏；加入4倍量热水，边加边搅拌，用稀酸调节pH6.0，静置2小时，上清液上于AB-8型大孔吸附树脂柱，用水洗脱至Molisch反应阴性，再依次用2倍柱体积的10％乙醇、4倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于70℃减压浓缩，得粗提物，此粗提物用2倍量90％乙醇溶解后用2倍量聚酰胺粉(80-120目)拌样，挥干溶剂，上于5倍量聚酰胺(80-120目)为载体的层析柱，用水洗脱至碘化铋钾反应阴性，再用8倍量柱体积的80％乙醇洗脱，收集水及80％洗脱液，分别于70℃减压浓缩，真空干燥得十大功劳总生物碱1.93g及总黄酮1.85g，总生物碱及总黄酮的含量分别为62％、76％。

实施例2

取十大功劳叶100g，粉碎过10目筛，用8倍量90％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，合并3次滤液，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，70℃减压回收乙醇得浸膏；加入6倍量热水，边加边搅拌，用稀酸调节pH5.0，静置2小时，上清液上于HPD-100型大孔吸附树脂，用水洗脱至Molisch反应阴性，再依次用2倍柱体积的10％乙醇、4倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于70℃减压浓缩，得粗提物，此粗提物用3倍量90％乙醇溶解，用2倍量聚酰胺粉(80-120目)拌样后挥干溶剂，上于8倍量聚酰胺(80-120目)为载体的层析柱，用水洗脱至碘化铋钾反应阴性，再用8倍量柱体积的80％乙醇洗脱，收集水及80％洗脱液，分别于70℃减压浓缩，真空干燥得十大功劳总生物碱2.27g及总黄酮2.04g，总生物碱及总黄酮的含量分别为54％、68％.

实施例3

取十大功劳叶100g，粉碎过60目筛，用10倍量95％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并3次滤液，静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇，70℃减压回收乙醇得浸膏；加入5倍量热水，边加边搅拌，用稀酸调节pH5.5，静置2小时，上清液上于HPD-300型大孔吸附树脂，用水洗脱至Molisch反应阴性，再依次用4倍柱体积的10％乙醇、8倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于70℃减压浓缩，得粗提物，此粗提物用3倍量90％乙醇溶解后用2倍量聚酰胺粉(80-120目)拌样，挥干溶剂，上于10倍量聚酰胺(80-120目)为载体的层析柱，用水洗脱至碘化铋钾反应阴性，再用10倍量柱体积的80％乙醇洗脱，收集水及80％洗脱液，分别于70℃减压浓缩，真空干燥得十大功劳总生物碱2.33g及总黄酮2.18g，总生物碱及总黄酮的含量分别为52％、66％。

实施例4

取十大功劳叶100g，粉碎过40目筛，用8倍量95％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，合并3次滤液，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，70℃减压回收乙醇得浸膏；加入4倍量热水，边加边搅拌，用稀酸调节pH6.0，静置2小时，上清液上于D101型大孔吸附树脂，用水洗脱至Molisch反应阴性，再依次用3倍柱体积的10％乙醇、5倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于70℃减压浓缩，得粗提物，此粗提物用1倍量90％乙醇溶解后用3倍量聚酰胺粉(100-200目)拌样，挥干溶剂，上于5倍量聚酰胺(100-200目)为载体的层析柱，用水洗脱至碘化铋钾反应阴性，再用8倍量柱体积的80％乙醇洗脱，收集水及80％洗脱液，分别于70℃减压浓缩，真空干燥得十大功劳总生物碱2.12g及总黄酮2.07g，总生物碱及总黄酮的含量分别为55％、67％。

Claims (6)

1.一种由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，其特征在于：所述提取方法步骤如下：

1)、取十大功劳叶，粉碎过10-60目筛；

2)、用十大功劳叶的6～10倍量乙醇“乙醇含量80-95％”回流提取3次，每次1.5-2小时，然后合并分3次滤液；

3)、滤液后静置12小时以上，而后滤过，滤液减压回收乙醇，70℃减压回收乙醇得浸膏；

4)、浸膏中加入4-6倍量热水，边加边搅拌；然后用稀酸调节pH5.0-6.0，静置2小时，上清液上于非极性或弱极性大孔吸附树脂；

5)、用水洗洗至Molisch反应阴性，再用2-8倍柱体积10-80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于70℃减压浓缩，得粗提物，此粗提物用90％乙醇1-3倍量溶解，用2-3倍量聚酰胺粉拌样，挥干溶剂；

6)、然后以聚酰胺为载体的层析柱，用水洗脱至碘化铋钾反应阴性，再用5-10倍量柱体积的80％乙醇洗脱，分别收集水及80％洗脱液，分别于70℃减压浓缩，真空干燥得十大功劳总生物碱及总黄酮。

2.根据权利要求1所述的由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，其特征在于：其中大孔吸附树脂为弱极性，包括AB-8、HPD-100、HPD-300或D101型。

3.根据权利要求1所述的由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂柱层析时，上样样品pH5.0-6.0。

4.根据权利要求1所述的由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，其特征在于：所述聚酰胺柱层析，样品使用90％乙醇溶解，用2-3倍量聚酰胺粉拌样，挥干溶剂，并上于载体为聚酰胺的层析柱。

5.根据权利要求1所述的由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，其特征在于：所述的聚酰胺规格为80-120目或100-200目。

6.根据权利要求1所述的由十大功劳叶中提取总生物碱及黄酮的方法，其特征在于：所述大孔树脂的处理方法为大孔吸附树脂用95％乙醇浸泡24小时后使其充分溶胀后，湿法装柱，并用5倍树脂体积95％乙醇动态清洗，水洗至无醇后，依次用5％NaOH“动态清洗3-5倍树脂体积，水洗至中性”和5％盐酸“动态清洗3-5倍树脂体积，水洗至中性”处理，最后用95％乙醇动态清洗至乙醇洗脱液与水混合“1∶5”不呈白色混浊溶液止，用水洗去乙醇后即可装柱便可。