WO2006123745A1 - Ｌ－セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素 - Google Patents

Ｌ－セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素 Download PDF

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WO2006123745A1
WO2006123745A1 PCT/JP2006/309949 JP2006309949W WO2006123745A1 WO 2006123745 A1 WO2006123745 A1 WO 2006123745A1 JP 2006309949 W JP2006309949 W JP 2006309949W WO 2006123745 A1 WO2006123745 A1 WO 2006123745A1
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group
amino acid
seq
protein
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PCT/JP2006/309949
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Shinji Kuroda
Hiroyuki Nozaki
Kunihiko Watanabe
Kenzo Yokozeki
Yuki Imabayashi
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/02—Hydroxymethyl-, formyl- and related transferases (2.1.2)
    • C12Y201/02001—Glycine hydroxymethyltransferase (2.1.2.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a ⁇ (beta) -hydroxy-a-L amino acid, and more particularly to a method for producing an L-serine derivative using a novel enzyme.
  • Amino acids such as serine derivatives and amino acids having optical activity at the ⁇ -position are substances that are expected to be used as pharmaceutical intermediates.
  • optically active a alkylserine derivatives which are optically active amino acid derivatives having two different substituents at the ⁇ -position, and salts thereof, for example, the following methods are known.
  • Non-patent Document 1 Method by asymmetric alkylation to optically active oxazolidinic compound obtained from optically active serine derivative and pivalaldehyde
  • Non-patent Document 2 Method by asymmetric aldol reaction of isocyanatocarboxylic acid ester and paraformaldehyde using optically active metal catalyst
  • Non-patent Document 4 Asymmetric ring-opening reaction of optically active aziridine compounds (Non-patent Document 4)
  • Non-patent Document 5 Method by asymmetric alkylation to optically active birazinone compounds obtained from optically active palin derivatives and optically active alanine derivatives (Non-patent Document 5)
  • Non-patent Document 6 A method in which sharpless asymmetric dihydroxylation is performed on 2-methyl-2-propenoic acid derivatives, and the resulting optically active diol compound is reduced to an optically active azide compound (Non-patent Document 6)
  • Non-Patent Document 7 Helvetica Chimica Acta, 1987, 70, 1194-1216
  • Non-Patent Document 2 Tetrahedron Letters, 1988, 29, 235-238
  • Non-patent literature 3 Journal of Organic Chemistry, 1993, 58, 5918-5924
  • Non-patent literature 4 Tetrahedron Letters, 1995, 36, 3639-3642
  • Non-Patent Document 5 European Journal of Organic Chemistry, 2000, 2809— 28 20
  • Non-Patent Document 6 Tetrahedron Asymmetry, 2001, 12, 949—957
  • Non-Patent Document 7 Wilson et al. J. Biol. Chem 237 3171-3179
  • An object of the present invention is to provide a new method for producing a serine derivative and an optically active substance thereof by a simple technique, an enzyme used in the method, and the like.
  • the inventors of the present invention diligently studied a new method for producing a serine derivative, and found a new protein that catalyzes the reaction in a system in which L-amino acid is reacted with a predetermined aldehyde. . Furthermore, it can be seen that by using this protein, a serine derivative can be easily produced, and when the product is an amino acid capable of producing optical activity, an L-serine derivative can be selectively produced. It was issued. In addition, as a specific form, an unprecedented reaction system is constructed in which an amino acid and formaldehyde are directly reacted without using 5, 10-methylenetetrahydrofolic acid. The present invention is based on such knowledge, and provides the following method for producing L-serine derivatives and enzymes used therefor.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms, or a carbon number.
  • R 2 represents hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms, carbon Selected from the group consisting of an alkoxyalkyl group having 2 to 11 carbon atoms, a group containing a heteroatom in these carbon skeletons, and a basic force containing a carbon-carbon unsaturated bond in these carbon skeletons.
  • the chain may be branched or branched, and may further have a substituent, and may be reacted with an aldehyde represented by formula ( ⁇ ):
  • R 1 in formula (III) is the same as R 1 in Formula (I), R 2 in formula (III) are the same as R 2 in the formula ([pi))
  • the enzyme is derived from a microorganism belonging to any genus selected from the group consisting of the genus Ralstonia, the genus Rariovorax, the genus Bosea, and the genus Silicibacter.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 has an amino acid sequence containing one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in (III)
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 has an amino acid sequence containing a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 has an amino acid sequence containing one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula ( A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in III)
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 has an amino acid sequence containing a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula ( A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in III)
  • C has the amino acid sequence comprising one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, and has the formula (III A protein having an activity of catalyzing the above reaction to produce an L-serine derivative represented by
  • a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30 (L) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 has an amino acid sequence containing a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula ( A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in III)
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms, or a carbon number.
  • R 2 represents hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms, carbon Selected from the group consisting of an alkoxyalkyl group having 2 to 11 carbon atoms, a group containing a heteroatom in these carbon skeletons, and a basic force containing a carbon-carbon unsaturated bond in these carbon skeletons.
  • the chain may be branched or branched, and may further have a substituent, from the aldehyde represented by the following formula ( ⁇ ):
  • R 1 in the formula ( ⁇ ) is the same as R 1 in Formula (I)
  • R 2 in formula (III) are the same as R 2 in the formula ([pi))
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms, or a carbon number.
  • R 2 represents hydrogen, an alkyl group having 16 carbon atoms, an aryl group having 614 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 10 carbon atoms, an aralkyl group having 719 carbon atoms, or 2 1 1 carbon atoms. Selected from the group consisting of a group containing a heteroatom in these carbon skeletons, and a group containing a carbon-carbon unsaturated bond in these carbon skeletons, and these groups may be linear
  • the aldehyde may be branched and further substituted, and from the aldehyde represented by the following formula ( ⁇ ):
  • R 1 in the formula ( ⁇ ) is the same as R 1 in Formula (I)
  • R 2 in formula (III) are the same as R 2 in the formula ([pi))
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 has an amino acid sequence containing one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion, and the formula A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in (III)
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 has an amino acid sequence containing a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula ( A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in III)
  • C has the amino acid sequence comprising one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, and has the formula (III A protein having an activity of catalyzing the above reaction to produce an L-serine derivative represented by
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 has an amino acid sequence containing a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula ( A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in III)
  • a polynucleotide wherein the group power is also selected from the following (a) to (1)
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms, or a carbon number.
  • L 1 Selected from the group consisting of alkoxyalkyl groups, groups containing heteroatoms in these carbon skeletons, and basic groups containing carbon-carbon unsaturated bonds in these carbon skeletons, and these groups may be straight chain It may be branched and may have further substituents!
  • R 2 represents hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms, carbon Selected from the group consisting of an alkoxyalkyl group having 2 to 11 carbon atoms, a group containing a heteroatom in these carbon skeletons, and a basic force containing a carbon-carbon unsaturated bond in these carbon skeletons.
  • the chain may be branched or it may have a substituent.
  • R 1 in formula (III) is the same as R 1 in Formula (I), R 2 in formula (III) are the same as R 2 in the formula ([pi))
  • an L-serine derivative can be produced by a simple technique.
  • the present invention is capable of selectively producing L-form amino acid when producing an optically active L-serine derivative, and is therefore efficient as a method for producing an L amino acid.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a reaction system in one embodiment of the present invention.
  • R 1 in formula (I) is more specifically shown as follows.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, for example, methyl group, ethyl group, npropyl group, isopropyl group, nbutyl group, isobutyl group, secbutyl group, tertbutyl Group, n-pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, n-hexyl group, isohexyl group and the like.
  • R 1 is an aryl group having 6 to 14 carbon atoms
  • specific examples include a phenyl group, a tolyl group, a xylyl group, a biphenyl-ryl group, a naphthyl group, an anthryl group, An example is a phenanthryl group.
  • R 1 is a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms
  • specific examples are cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group, cycloheptal group, cyclooctaneyl.
  • Group, cyclononanyl group, cyclodeoxy group and the like are exemplified.
  • R 1 is a aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms
  • specific examples include a benzyl group, a benzhydryl group, a phenethyl group, a trityl group and other phenylalkyl groups, a cinnamyl group, a styryl group, A naphthylalkyl group etc. are illustrated.
  • R 1 is an alkoxyalkyl group having 2 to 2 carbon atoms:
  • L 1 a specific example is as follows: an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms is substituted with a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group or an isopropoxy group. Group, butoxy group, pentyloxy group, phenoxy group, heptoxy group, oxy group, nonanoxy Examples are those in which a group selected from a group, a decanoxy group, and an undecoxy group is substituted.
  • R 1 may be a group containing a hetero atom in the carbon skeleton of the hydrocarbon! /.
  • Hetero atoms include oxygen, nitrogen, sulfur and the like.
  • R 1 is a group containing a hetero atom in the carbon skeleton includes a heterocyclic ring-containing hydrocarbon group.
  • the heterocyclic ring-containing hydrocarbon group is a cyclic hydrocarbon group containing a hetero atom in the ring of the cyclic compound.
  • the heterocycle-containing hydrocarbon group includes a heteroaryl group and is not limited to the presence or absence of aromaticity, and may be monocyclic or polycyclic.
  • heterocyclic ring-containing hydrocarbon group examples include a furyl group, a chael group, a pyridyl group, a piperidyl group, a piperidino group, a morpholino group, an indolyl group, an imidazolyl group, and further substituted by these heterocyclic groups. Illustrated are alkyl groups and the like.
  • R 1 may be a hydrocarbon group containing a carbon-carbon unsaturated bond in the carbon skeleton in the group shown above.
  • R 1 may be linear or branched.
  • One or two or more of 2 2 2 may be substituted and added.
  • the L-a-amino acid represented by the formula (I) includes, for example, each of the La-type, alanine, noline, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, Glutamine, ferrolanine, tyrosine, tryptophan, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine, 2-amino-n-butyric acid, and the like are preferred.
  • alanine is exemplified.
  • R 2 in the formula ( ⁇ ) is more specifically shown as follows.
  • R 2 may be hydrogen
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, for example, methyl group, ethyl group, npropyl group, isopropyl group, nbutyl group, isobutyl group, secbutyl group, tertbutyl Group, n-pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, n-hexyl group, isohexyl group And the like.
  • R 2 is an aryl group having 6 to 14 carbon atoms
  • specific examples include phenyl group, tolyl group, xylyl group, biphenyl group, naphthyl group, anthryl group, and phenanthryl group.
  • R 2 is a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms
  • specific examples include cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group, cycloheptyl group, cyclooctaneyl. Group, cyclononanyl group, cyclodeoxy group and the like.
  • R 2 is an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms
  • specific examples include a benzyl group, a benzhydryl group, a phenethyl group, a trityl group and other phenylalkyl groups, a cinnamyl group, a styryl group, And a naphthylalkyl group.
  • R 2 is an alkoxyalkyl group having 2 to 2 carbon atoms: L 1
  • L 1 a specific example is as follows: an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms is substituted with a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, or an isopropoxy group. Group, butoxy group, pentyloxy group, phenoxy group, heptoxy group, otatoxyl group, nonanoxyl group, decanoxy group, and undecoxy group.
  • R 2 may be a group containing a hetero atom in the carbon skeleton of the hydrocarbon! /.
  • Hetero atoms include oxygen, nitrogen, sulfur and the like.
  • R 2 is a group containing a hetero atom in the carbon skeleton includes a heterocycle-containing carbon hydrogen group.
  • the heterocyclic ring-containing hydrocarbon group is a cyclic hydrocarbon group containing a hetero atom in the ring of the cyclic compound.
  • the heterocycle-containing hydrocarbon group includes a heteroaryl group and is not limited to the presence or absence of aromaticity, and may be monocyclic or polycyclic.
  • heterocyclic ring-containing hydrocarbon group examples include a furyl group, a chael group, a pyridyl group, a piperidyl group, a piperidino group, a morpholino group, an indolyl group, an imidazolyl group, and further substituted by these heterocyclic groups. Alkyl groups and the like.
  • R 2 may be a hydrocarbon group containing a carbon-carbon unsaturated bond in the carbon skeleton in the group shown above.
  • R 2 may be linear or branched.
  • R 2 represents a part of the above hydrocarbon group, a halogen atom, an alkyl group having up to 3 carbon atoms, an alkyl group having up to 3 carbon atoms.
  • amino group one NH
  • amide group one CONH
  • imino group NH
  • hydrazino group one NHNHNH
  • One or two or more of them may be substituted and added.
  • Preferred examples of the compound represented by the formula ( ⁇ ) include formaldehyde and acetoaldehyde.
  • R 1 and R 2 in formula ( ⁇ ) are the same as those in formula (I) and formula ( ⁇ ), respectively.
  • the product may be an optically inactive stereoisomer (meso isomer), but the method of the present invention produces an optically active amino acid. It is related to the method and does not include the combination of R 1 and R 2 that produces a meso form.
  • a-hydroxymethyl-serine is not an L-serine derivative! Therefore, the compound of formula (I) is serine and the compound of formula ( ⁇ ) is formaldehyde! /, And the combination is not included in the method for producing L-serine derivatives of the present invention! /.
  • the method for producing an L-serine derivative of the present invention is a method for preferentially producing an L-form serine derivative by a reaction using an enzyme.
  • the L form is preferentially produced means that the ratio of the L form to the produced serine derivative is higher than that of the D form, and preferably the ratio of the L form is 70% or more, more preferably. Is 80% or more, more preferably 90% or more. In this case, the ratio of L-form to the serine derivative is calculated as [L-form] Z ([D-form] + [L-form]) * 100.
  • a system in which L a alanine and formaldehyde are reacted to form a- methyl-L-serine is included.
  • a reaction system in which formaldehyde is directly reacted with an L amino acid to form an L-serine derivative without using 5, 10-methylenetetrahydrofolic acid or the like has never been known before.
  • an L-serine derivative can be obtained with a simpler reaction system.
  • formaldehyde it is preferable to add a small amount of formaldehyde to the reaction system sequentially. By sequentially adding formaldehyde, the production of by-products can be suppressed.
  • Another preferred form of the present invention is, for example, a system in which L-2 amino-n-butyric acid is reacted with formaldehyde to produce ⁇ -ethyl-L-serine, and La A system that reacts alanine with acetaldehyde to produce ⁇ -methyl-L-threonine.
  • the reaction temperature is preferably 10 to 60 ° C, more preferably 20 to 40 ° C.
  • the pH of the reaction system is preferably 4 to 10, more preferably 6 to 8.
  • the L-serine derivative can be isolated as follows.
  • NF nanofiltration: nanofiltration
  • electrodialysis ion exchange resin
  • the reaction solution is concentrated after performing the above desalting treatment as necessary, crystals of the L-serine derivative precipitate, but the properties are fine and the solubility is high during crystal separation. In addition, a high recovery rate cannot be obtained, and the viscosity is large and the handling is often difficult. Therefore, it is preferable to perform crystallization with addition of a poor solvent after preliminarily concentrating the liquid to some extent as necessary. Preconcentration can be performed, for example, until crystals begin to precipitate. As the poor solvent added here, a water-soluble lower alcohol or acetone is preferable. It is possible to increase the crystallization rate by combining cooling crystallization after anti-solvent crystallization. By separating this slurry and drying the wet cake, crystals of L-serine derivative can be obtained.
  • the reaction between the aldehyde of formula ( ⁇ ) and the La amino acid is carried out in the presence of a predetermined enzyme.
  • Enzymes that can catalyze this reaction include, for example, obtaining microbial power belonging to any of the genus Ralstonia, Variovorax, Bosea, and Silicibacter. You can. More specific examples of microorganisms include Ralstonia s p., Norrioborax paradoxus, Bosea sp., Siriciactor pomeroyi, etc.
  • Ralstonia 'SP FERM ABP-10607 strain Norrioborax' Paradoxus FERM ABP-10608 strain Norriovolak 'Variovorax paradoxus NBRC 15149, Varioborax' Variovorax paradoxus NBRC15150, Bosea sp.
  • FERM ABP— 10609, Silicibacter p Examples include stocks.
  • the strains to which the FERM number or the NBRC number is assigned are the strains deposited as follows, and can be distributed by a predetermined procedure with reference to each number.
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • DOB Biotechnology Headquarters
  • NBRC Biological Genetic Resources Division
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • DOB Biotechnology Headquarters
  • NBRC Biological Genetic Resources Division
  • Tables 1-1 and 1-2 show the mycological properties of Ralstonia sp. All strain (or alias: AJ110405, deposit number: FERM ABP-10607).
  • Tables 2-1 and 2-2 show the mycological properties of Norrioborax 'Variovorax paradox us B2-B2 strain (also known as AJ110406 strain, deposit number: FERM ABP-10608).
  • Tables 3-1 and 3-2 show that Bosea sp. B2—R1 strain (also known as AJ11)
  • enzyme used in the reaction for producing the L-serine derivative in the present invention include the following proteins.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 has an amino acid sequence containing one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in (III)
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 has an amino acid sequence containing one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in (III)
  • E a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 has an amino acid sequence containing one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula ( A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in III)
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 has an amino acid sequence containing a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula ( A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in III)
  • C has the amino acid sequence comprising one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, and has the formula (III A protein having an activity of catalyzing the above reaction to produce an L-serine derivative represented by
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 has an amino acid sequence containing a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force, and the formula ( A protein having an activity to catalyze the above reaction to produce the L-serine derivative shown in III)
  • an L-serine derivative can be easily produced.
  • substantially only hymethyl-L-serine can be produced, and an optically active amino acid can be obtained efficiently.
  • the protein (A) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 can be isolated from Ralstonia sp. FER M ABP-10607 strain.
  • a protein (C) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 can be isolated from Norrioborax 'paradoxus FERM ABP-10608 strain.
  • a protein (E) having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 is Norrioborax 'paradoxus NBRC 15149 strain Rikigo et al.
  • a protein (G) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 can be isolated from Norioborax 'paradoxus NBRC15150 strain.
  • the protein (I) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 can be isolated from Bosea 'SP FERM ABP-10609 strain.
  • a protein (K) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 can be isolated from Sirishibacter i'Pomeroy strain DSM 15171.
  • SEQ ID NO: 30 is a registered sequence of serine hydroxymethyltransferase (AAV96754.1) with an upstream 9 amino acid residue added. As a result of introducing and expressing this sequence in Escherichia coli, the target protein was detected, and 2-methylserine hydroxymethyltransferase activity was confirmed.
  • proteins substantially the same as the proteins (A), (C), (E), (G), (I) and (K) are used. Can also be used.
  • the protein shown in (B) is provided as a protein substantially the same as the protein shown in (A) above.
  • the term “several” varies depending on the position and type of the three-dimensional structure of the amino acid residue protein, but is within a range that does not significantly impair the three-dimensional structure or activity of the amino acid residue protein. Specifically, 2 to 50, preferably 2 to 30, more preferably 2 to: L0.
  • amino acid sequence containing one or several amino acid mutations selected from the group consisting of one or several substitutions, deletions, insertions, additions and inversion forces in the amino acid sequence of the protein of (B) Under the conditions of 30 ° C and pH 7-8, it retains about half or more of the protein of (A), more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more.
  • the amino acid mutation as shown in (B) above is performed by, for example, site-directed mutagenesis. It can be obtained by modifying the nucleotide sequence so that the amino acid at a specific site of the gene encoding this protein is substituted, deleted, inserted, attached, etc. In addition, a polynucleotide having the modified base sequence as described above can be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • Mutation treatment includes a method in which DNA encoding (A) is treated in vitro with hydroxylamine or the like, and a bacterium belonging to the genus Escherichia having DNA encoding (A) is irradiated with ultraviolet rays or N-methyl-N′— -Tro-N- -Trosoguanidine (NTG) or a method of treatment with a mutation agent usually used for artificial mutation such as nitrous acid.
  • NTG N-methyl-N′— -Tro-N- -Trosoguanidine
  • mutations such as base substitution, deletion, insertion, addition, and inversion as described above include naturally occurring mutations such as differences between microorganism species and strains.
  • DNA having the mutation as described above in an appropriate cell and examining the enzyme activity of the expression product DNA encoding a protein substantially the same as the protein (A) can be obtained.
  • the protein of (D) is substantially the same as the protein of (E) as a protein that is substantially identical to the protein of (C)
  • protein (F) is substantially the same as protein (G) (H)
  • protein (I) is substantially identical to protein (J)
  • Examples of (L) are substantially the same proteins as the protein of K).
  • examples thereof include proteins having a sequence of 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 90% or more.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the protein. Due to codon degeneracy, there can be multiple base sequences that define one amino acid sequence. That is, as the polynucleotide of the present invention, the above (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (1), CO ⁇ ( A polynucleotide having a base sequence encoding the protein shown in (K) and (L) included.
  • polynucleotide of the present invention include the following polynucleotides (a), (c), (e), (g), (i), and (k).
  • the polynucleotide (a) above encodes the protein (A) and can be isolated from the Ralstonia sp. FERM ABP-10607 strain.
  • the polynucleotide (c) encodes the protein (C) and can be isolated from the Norrioborax 'paradoxus FERM ABP-10608 strain.
  • the polynucleotide of (e) encodes the protein of (E) and can be isolated from Norrio Borax 'paradoxus NBRC 15149 strain.
  • the polynucleotide (g) encodes the protein (G) and can be isolated from Norrioborax 'paradoxus NBRC15150 strain.
  • the polynucleotide (i) encodes the protein (I) and can be isolated from Bosea sp. FERM ABP-10609.
  • the polynucleotide of (k) encodes the protein of (K) and can be isolated from Siricipacter 'Pomeroy strain DSM15171.
  • DNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is Ralstonia sp. Chromosomal DNA or DNA library, PCR (polymerase chain reacion, White, TJ et al; T rends Genet., 5, 185 (1989 )) Or hybridisation. Primers used for PCR can be designed based on an internal amino acid sequence determined based on a purified protein having an activity of catalyzing the reaction in the method of the present invention, for example.
  • a probe for a primer or hybridization can be designed based on the base sequence described in SEQ ID NO: 4, and some probes can be isolated using a probe.
  • a primer for PCR a set of primers having sequences corresponding to the 5 'untranslated region and the 3' untranslated region so as to sandwich the coding region Using the combination, the entire coding region of the protein can be amplified.
  • Primers can be synthesized, for example, using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems using the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).
  • the PCR reaction can be performed, for example, using Gene Amp PCR System 9600 (PERKIN ELMER) and TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (Takara Bio) according to the method specified by the supplier such as each manufacturer. .
  • Polynucleotides substantially the same as the above (a), (c), (e), (g), (i) and (k) are also included in the polynucleotide of the present invention.
  • polynucleotide (f) is used as the same polynucleotide
  • polynucleotide (h) is used as the polynucleotide substantially the same as (g)
  • polynucleotide (i) is used as the polynucleotide (i)
  • the following polynucleotide (1) is exemplified as the polynucleotide substantially identical to the polynucleotide power (k) of j).
  • a probe can be used as a polynucleotide to be hybridized.
  • the probe can be prepared by a standard method based on each nucleotide sequence described in SEQ ID NOs: 4, 8, 14, 18, 22, and 29.
  • a method for isolating a target polynucleotide by picking up a polynucleotide that hybridizes thereto using a probe may be performed according to a conventional method.
  • a DNA probe can be prepared by amplifying a base sequence cloned into a plasmid or a phage vector, cutting out the base sequence using a restriction enzyme and extracting it. The part to be cut out can be adjusted according to the target DNA.
  • a substantially identical polynucleotide as described above it can be amplified by PCR or the like by a conventional method.
  • the normal washing conditions for Southern hybridization are 60 ° C, 1 X SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 X SSC, 0.1
  • Some of the genes that are noblyzed under these conditions include those in which a stop codon has occurred in the middle and those that have lost activity due to mutations in the active center, but these are linked to commercially available expression vectors. It can be easily removed by expressing in an appropriate host and measuring the enzyme activity of the expression product by the method described below.
  • the quality (A) In the case of the polynucleotide (d) above, this is the same as the protein (C).
  • the case of the polynucleotide (f) is the same as that of the protein (E).
  • the case of the polynucleotide (h) is the same as that of the protein (G).
  • the above-mentioned polynucleotide (j) is the same as the protein (I).
  • the case of the polynucleotide (1) is the same as the protein (K).
  • the form of the enzyme used in the present invention is not particularly limited as long as it exists in the reaction system in a state capable of catalyzing the above reaction.
  • Specific forms include cultures of microorganisms that produce enzymes, microbial cells isolated from the cultures, processed microbial cells, and the like.
  • a microorganism culture is a product obtained by culturing a microorganism. More specifically, a microorganism cell, a medium used for culturing the microorganism, and a substance produced by the cultured microorganism. It means a mixture. Further, the microbial cells may be washed and used as washed cells.
  • the processed bacterial cells include those obtained by crushing, lysing, and freeze-drying the bacterial cells, and further including crude purified proteins recovered by treating the bacterial cells, and further purified proteins.
  • the purified protein partially purified proteins obtained by various purification methods may be used, or immobilized proteins obtained by immobilizing them by a covalent bond method, an adsorption method, a comprehensive method, or the like. May be used. Also use Some microorganisms partially lyse during culturing, and in this case, the supernatant of the culture solution can also be used as the enzyme-containing material.
  • the transformant expressing the protein (A) can be produced by preparing a recombinant polynucleotide incorporating a polynucleotide having any one of the above-described base sequences, and using this recombinant polynucleotide. it can.
  • a transformant expressing the protein (A) can be obtained by preparing a recombinant DNA incorporating a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and introducing it into an appropriate host.
  • hosts for expressing the protein specified by the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 4 include Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria, and Bacillus.
  • prokaryotic cells including Bacillus subtilis, various eukaryotic cells including Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, Aspergillus oryzae Can be used.
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Pichia stipitis Aspergillus oryzae Can be used.
  • Recombinant DNA used to introduce DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 into a host is encoded by the DNA into a vector corresponding to the type of host to be expressed. It can be prepared by inserting in a form in which the protein can be expressed.
  • a promoter for protein expression if a promoter specific to the gene encoding the enzyme derived from Ralstonia 'SP, Varioborax' Paradoxus, Bosea sp, etc. functions in the host cell, the promoter is used. Can be used. Also, if necessary, another promoter that works in the host cell may be linked to DNA such as SEQ ID NO: 4 and expressed under the control of the promoter! /.
  • Transformation methods for introducing recombinant DNA into host cells include DM Morrison's method (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or recipient cells.
  • a method of increasing the permeability of DNA by treating with calcium chloride (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
  • a target protein When a target protein is mass-produced using recombinant DNA technology, a form in which the protein associates in a transformant producing the protein to form an inclusion body is also preferable.
  • Advantages of this expression production method include that the target protein is protected from digestion by proteases present in the microbial cells, and that the target protein can be easily purified by centrifugation following cell disruption.
  • an active protein such as protein inclusion body strength
  • a series of operations such as solubilization 'activity regeneration is necessary, and the operation becomes more complicated than when directly producing an active protein.
  • the effect can be suppressed by accumulating it in the microbial cell as an inactive protein inclusion body.
  • strains commonly used for the expression of heterologous genes can be used.
  • E. coli K12 subspecies E. coli strain JM109 strain, DH5a strain, HB101 strain, BL21 (DE3) strain, etc. Power can be selected. Methods for transformation and methods for selecting transformants are also described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press (200lZ0lZl5) and the like. Hereinafter, a method for producing transformed Escherichia coli and producing a predetermined enzyme using the same will be described more specifically as an example.
  • a promoter for expressing a DNA encoding a protein having a catalytic activity used in the present invention a promoter usually used for heterologous protein production in E. coli can be used, for example, T7 promoter, lac promoter, Strong promoters such as trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, T5 promoter and the like.
  • the vectors include pUC19, pUC 18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pA CYC 177, pACYC184, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pQE30 and derivatives thereof can be used.
  • phage DNA vectors can be used.
  • an expression vector that contains a promoter and is capable of expressing the inserted DNA sequence can be used.
  • a gene encoding another protein preferably a peptide that is hydrophilic, is linked upstream or downstream of the protein, Let it be a fusion protein gene. Any gene encoding such other proteins can be used as long as it increases the accumulation amount of the fusion protein and enhances the solubility of the fusion protein after the denaturation-regeneration step.
  • T7gene 10, ⁇ -galactosidase gene, dehydro Candidates include folate reductase gene, interferon ⁇ gene, interleukin 2 gene, prochymosin gene and the like.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, downstream of the fusion protein gene.
  • the terminator include 7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, E. coli trpA gene terminator, and the like.
  • a plasmid having a replication origin derived from ColEl which is preferably a so-called multicopy type, for example, Examples include pUC plasmids, pBR322 plasmids, and derivatives thereof.
  • the “derivative” means a plasmid modified by base substitution, deletion, insertion, addition and Z or inversion. The modification here includes modification by mutagen, UV irradiation, or natural mutation.
  • the vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene.
  • a marker such as an ampicillin resistance gene.
  • the current vectors are commercially available (puc (Takara Bio), pPROK (Clontech), pKK233-2 (Clontech).
  • a promoter, a target protein having a predetermined activity or a gene encoding a fusion protein of the target protein and another protein, or in some cases a DNA fragment linked in the order of a terminator, and a vector DNA are combined and assembled. Get replacement DNA.
  • the target protein When expressed as a fusion protein, the target protein may be excised using a restriction protease such as blood coagulation factor Xa, kallikrein, etc., which recognizes a sequence that does not exist in the target protein. .
  • a restriction protease such as blood coagulation factor Xa, kallikrein, etc.
  • a medium usually used for culturing Escherichia coli such as an M9-strong samino acid medium and an LB medium, may be used.
  • Culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the type of marker, promoter, host fungus, etc. used.
  • the target protein or a fusion protein containing the same There are the following methods for recovering the target protein or a fusion protein containing the same. If the target protein or its fusion protein is soluble in the microbial cells, the microbial cells can be recovered and then disrupted or lysed to be used as a crude enzyme solution. Furthermore, if necessary, the target protein or a fusion protein thereof can be purified and used by a conventional method such as precipitation, filtration or column chromatography. In this case, a purification method using an antibody of the target protein or fusion protein can also be used. When a protein inclusion body is formed, it can be dissolved with a denaturing agent, and the denaturing agent can be removed by dialysis or the like to obtain the target protein.
  • the microorganisms shown in Table 4 were cultured on Nutrient Broth agar medium (Difco) at 30 ° C. for 24 hours, respectively.
  • One platinum loop was inoculated into 3 ml of Nutrient Broth liquid medium and the cells of each microorganism obtained were cultured at 30 ° C. and 120 round-trip Z minutes for 24 hours.
  • 0.15 ml of the obtained culture broth Inoculated into 3 ml Nutrient Broth liquid medium containing 0.2% ⁇ -methyl-DL serine and cultured at 30 ° C. and 120 round-trip Z minutes for 24 hours.
  • the cells were centrifuged, and the cells were washed twice with a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing 0. ImM pyridoxal phosphate in an amount equal to that of the culture solution.
  • a 0.3 ml total cell suspension was prepared using 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing ImM pyridoxal phosphate, and sonicated at 4 ° C.
  • the supernatant obtained by centrifugation (16,000 g, 10 minutes) was dialyzed against 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing 0. ImM pyridoxal phosphate to obtain a cell-free extract.
  • reaction solution 1 having a composition of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), 10 mM a-methyl-DL serine, 0.1 lm M pyridoxal phosphate, ImM magnesium sulfate, 0.05 ml of cell-free extract was added and reacted at 30 ° C for 10 minutes in a total volume of 0.1 ml.
  • Formanolide kit test The reaction was stopped by mixing 0.1 ml of alkaline test solution (5N-hydroxyaluminum) in KOKO (Wako Pure Chemical Industries). Thereafter, according to the manual attached to the kit, formaldehyde was detected and the absorbance at 550 nm was measured (El l).
  • the absorbance (E10) of the reaction solution obtained by the reaction performed in the reaction solution 1 with water added in place of ⁇ -methyl-DL-serine was measured in the same manner, and a-methyl DL-serine specific was measured.
  • the obtained cells are collected by centrifugation (8,000 g, 10 minutes), washed twice with 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.02 mM pyridoxal phosphate, and 50 ml of cells are collected. A suspension was prepared. The cells are disrupted by ultrasonic disruption, the supernatant obtained by centrifugation (18,000 g, 10 minutes) is subjected to ultracentrifugation (200,000 g, 30 minutes), dialyzed using the same buffer, A cell-free extract was obtained.
  • the active fraction of the enzyme obtained in (2) above was dialyzed against 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) (hereinafter referred to as buffer I) containing 0.02 mM pyridoxal phosphate. Mix with buffer I containing 2M ammonium sulfate and apply to a Phenyl- Sepharose column (Amersham Biosciences) equilibrated with buffer I containing 1M ammonium sulfate in advance. The enzyme was eluted with a linear concentration gradient of -um.
  • the enzyme active fraction obtained in (3) above was dialyzed against 2.5 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.02 mM pyridoxal phosphate and equilibrated in advance with the same buffer. It applied to Cellul ofineHAp column (made by Seikagaku Corporation). 2. The enzyme was eluted with 5-500 mM potassium phosphate buffer (PH 7.0).
  • the enzyme active fraction thus obtained has a specific activity of 0.72 UZ mg, subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis, and the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue staining solution. As a result, a uniform band was detected at a molecular weight of about 47,000.
  • Example 3 Determination of amino acid sequence and encoding base sequence of 2-methylserine hydroxymethyltransferase derived from Ralstonia sp. All strain (AJ110405)
  • the purified enzyme lOOpmol equivalent prepared in Example 2 was subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis, transferred to a PVDF membrane, and subjected to a protein sequencer to determine 30 amino acids (SEQ ID NO: 1).
  • this PCR reaction solution is used as a bowl, and the second PCR (94 ° C: 30 seconds, 55 ° C: 2 minutes, 72 ° C: 1 minute, 30 cycles) is performed with cassette primer C2 and primer ALD— RV—S2 (SEQ ID NO: 3) was used.
  • a fragment of about 0.7 kb long confirmed to be amplified was ligated to pGEM-Teasy (Promega), and Escherichia coli JM109 was transformed. When the nucleotide sequence of the approximately 0.7 kb fragment was determined, a nucleotide sequence encoding the N-terminal amino acid sequence of the target protein was found.
  • Example 4 Expression of 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene derived from Ralstonia sp. All strain (AJ110405) by Escherichia coli
  • PSKA04098 is a vertical type, primer Ral Eco (SEQ ID NO: 6), and primer PUC18 with Ral-ter-Pst (SEQ ID NO: 7), amplified by PCR with the ORF region 1.3 kb of 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene, treated with EcoRl / Pstl, and then treated with EcoRlZPstl And Escherichia coli JM109 was transformed to obtain a transformant having a plasmid (pRal2) containing the target gene fragment. This transformant was named JM109ZpRal2.
  • JM109 / pRal2 was precultured at 37 ° C for 16 hours in LB medium containing lOOmg / 1 ampicillin. 0.15 ml of the preculture was inoculated into 3 ml of LB medium containing lOOmgZl of ampicillin and cultured at 37 ° C. After 1 hour of culture, IPTG was added to a final concentration of ImM, and the culture was further continued for 4 hours. The obtained cells are collected by centrifugation, washed with 0. 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing ImM pyridoxal phosphate, and then with 0.3 mL of the same buffer. A suspension was prepared.
  • the cells were disrupted by ultrasonic disruption, and the 2-methylserine hydroxymethyltransferase activity was measured using the supernatant obtained by centrifugation (18,000g, 10 minutes, 4 ° C) as the cell-free extract. 0.03 U / mg.
  • Example 5 Ralstonia sp Al l strain (AJ110405) derived with 2-methyl serine hydroxymethyl methylation transferase a-methyl-L Serin formation reaction
  • Example 6 Expression of 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene derived from Ralstonia sp. All strain (AJ110405) Production of ⁇ -methyl-L-serine by Escherichia coli
  • JM109ZpRal2 was pre-cultured in LB medium containing lOOmgZl of ampicillin at 30 ° C. for 24 hours, and then pre-cultured in 400 ml of LB medium containing ampicillin lOOmgZl and IPTGO. 5 mM at 34 ° C. for 16 hours.
  • the cells obtained from 400 ml of the culture broth were collected by centrifugation, and then washed with 0. lOOmM phosphate buffer (pH 7.4) containing ImM pyridoxal phosphate.
  • the obtained bacterial cells were suspended in 100 ml of a reaction solution (300 mM L-alanine, 0.
  • ImM pyridoxal phosphate, lOO mM phosphate buffer (pH 7.4) To this reaction liquid, 50.5 ml of a 60 OmM formaldehyde aqueous solution was added at 30 ° C. with stirring over 24 hours.
  • formaldehyde a special grade formaldehyde solution [code number: 16223-55] manufactured by Nacalai Testa Co., Ltd. was used.
  • Example 7 Obtaining 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene derived from Variovorax paradoxus B2-B2 strain (AJ110406)
  • the ORF region derived from Ralstonia sp. AJ110405 strain was amplified by PCR in the same manner as in Example 3. Using this PCR product as a probe, genomic DNA of Variovorax paradoxus B2-B2 strain was treated with Pstl and then subjected to Southern analysis. As a result, a positive signal was obtained with a length of about 2 kb.
  • JM109 / pTVVHMT01 was pre-cultured for 16 hours at 37 ° C in LB medium containing lOOmg / 1 ampicillin and 0. ImM IPTG.
  • the obtained cells are collected by centrifugation, washed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.1 mM pyridoxal phosphate, and suspended using the same buffer. A liquid was prepared.
  • the cells were disrupted by ultrasonic disruption, and 2-methylserine hydroxymethyltransferase activity was measured using the supernatant obtained by centrifugation (18, OOOg, 10 minutes, 4 ° C) as a cell-free extract.
  • Reaction solution composition 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), lOmM a-methyl-L-serine, 0. ImM pyridoxal phosphate was used to quantify formaldehyde liberated at a reaction temperature of 30 ° C. 9 mUZmg.
  • Example 8 Obtaining 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene derived from Variovorax paradoxus NBRC15149
  • the ORF region derived from Ralstonia sp. AJ110405 strain was amplified by PCR in the same manner as in Example 3. Using this PCR product as a probe, genomic DNA of Variovorax paradoxus NBRC 15149 was treated with Pstl and then subjected to Southern analysis. As a result, a positive signole was obtained with a length of 2 kb.
  • the 1.2 kb amplified fragment obtained by PCR reaction using pUC15149 as a saddle and primers 15149-Nde (SEQ ID NO: 16) and 15149-ter-Pst (SEQ ID NO: 17) was treated with NdelZPstl, and NdelZPstl of pTV118Nd It was inserted into the site and named pTV VHMT02. This plasmid allows Escherichia coli
  • JM109 / pTVVHMT02 was pre-cultured at 37 ° C for 16 hours in LB medium containing lOOmg / 1 ampicillin and 0. ImM IPTG.
  • the obtained cells are collected by centrifugation, washed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.1 mM pyridoxal phosphate, and suspended using the same buffer. A liquid was prepared.
  • the cells were disrupted by ultrasonic disruption and the 2-methylserine hydroxymethyltransferase activity was measured using the supernatant obtained by centrifugation (18,000g, 10 minutes, 4 ° C) as the cell-free extract. 13 mU / mg.
  • Example 9 Obtaining 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene derived from Variovorax paradoxus NBRC15150
  • the ORF region derived from Ralstonia sp. AJ110405 strain was amplified by PCR in the same manner as in Example 3. Using this PCR product as a probe, genomic DNA of Variovorax paradoxus NBRC 15150 was treated with PstI and then subjected to Southern analysis. As a result, a positive signole was obtained with a length of 2 kb.
  • primers 15150—Nde (SEQ ID NO: 20) and 15150—61: —? 5 SEQ ID NO: 21) were subjected to a 1 3 0 ⁇ reaction, and the resulting 1.2 kb amplified fragment was subjected to NdelZPstl This was processed and inserted into the NdelZPstl site of pTV118Nd to obtain pTV VHMT03.
  • This plasmid allows Escherichia coli
  • JM109 / pTVVHMT03 was pre-cultured at 37 ° C for 16 hours in LB medium containing lOOmg / 1 ampicillin and 0. ImM IPTG.
  • the obtained cells are collected by centrifugation, washed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.1 mM pyridoxal phosphate, and suspended using the same buffer. A liquid was prepared.
  • the cells were disrupted by ultrasonic disruption and the 2-methylserine hydroxymethyltransferase activity was measured using the supernatant obtained by centrifugation (18,000g, 10 minutes, 4 ° C) as the cell-free extract. 36 mUZmg.
  • Example 10 Obtaining 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene derived from Bosea sp. B2-R1 strain (AJ110407 strain)
  • the ORF region derived from Ralstonia sp. AJ110405 strain was amplified by PCR in the same manner as in Example 3. Using this PCR product as a probe, Bosea sp. B2-R1 strain genomic DNA was treated with Pstl and then subjected to Southern analysis. As a result, a positive signal was obtained with a length of 5 kb.
  • JM109 / pTVBHMT was pre-cultured at 37 ° C for 16 hours in an LB medium containing lOOmg / 1 ampicillin and 0. ImM IPTG. After collecting the cells by centrifugation, the cells were washed with 0. 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing ImM pyridoxal phosphate, and the cells were suspended using the same buffer. Was prepared. The cells were disrupted by ultrasonic disruption, and the 2-methylserine hydroxymethyltransferase activity was measured using the supernatant obtained by centrifugation (18,000g, 10 minutes, 4 ° C) as the cell-free extract. However, it was 95 mUZmg.
  • JM109 / pUCBHMT was precultured at 37 ° C for 16 hours in LB medium containing lOOmg / 1 ampicillin and 0. ImM IPTG. After collecting the cells by centrifugation, the cells were washed with 0. 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing ImM pyridoxal phosphate, and the cell suspension was washed with the same buffer. Was prepared. The cells were disrupted by ultrasonic disruption, and 2-methylserine hydroxymethyltransferase activity was measured using the supernatant obtained by centrifugation (18,000 g, 10 minutes, 4 ° C) as the cell-free extract. However, it was 318m UZmg.
  • the activity of the cell-free extract obtained from JM109ZpUC18 by the above method was below the detection limit.
  • Example l l Obtaining 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene derived from Silicibacter pomeroyi DSM15171
  • JM109ZpUCSHMT was pre-cultured at 37 ° C for 16 hours in an LB medium containing lOOmgZl ampicillin and 0. ImM IPTG. After collecting the cells by centrifugation, the cells were washed with 0. 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing ImM pyridoxal phosphate, and the cells were suspended using the same buffer. Was prepared. The cells were disrupted by ultrasonic disruption, and 2-methylserine hydroxymethyltransferase activity was measured using a cell-free extract obtained by centrifugation (18, OOOg, 10 minutes, 4 ° C). .
  • Reaction solution composition 50 mM Tris-HCl buffer (PH7.4), lOmM a-methyl-L-serine, 0. ImM pyridoxal phosphate was used to quantify formaldehyde released at a reaction temperature of 30 ° C. However, it was 190 mUZmg.
  • Silicibacter pomeroyi DSM15171 chromosomal DNA was used as a cocoon-type PCR with about 1.3 kb in length including primers SEQ.ID.
  • the product was obtained.
  • the DNA fragment obtained by digestion with BamHI-Pstl was inserted into the BamHI-Pstl site of pQE30 vector (QIAGEN).
  • pQE30SHMT a plasmid capable of producing 2-methylserine hydroxymethyltransferase having 6 X His fused to the 5 ′ end was obtained, which was named PQE30SHMT.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with this plasmid. This transformant was named JM109ZPQE30SHMT.
  • the obtained transformant was cultured in an LB medium (LB + amp) containing 100 mg / L ampicillin at 30 ° C for 14 hours, followed by addition of ImM IPTG, and further cultured for 3 hours.
  • the obtained cells are collected by centrifugation, washed with 0. 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing ImM pyridoxal phosphate, and suspended using the same buffer. A liquid was prepared.
  • the cells were disrupted by ultrasonic disruption, and the supernatant obtained by centrifugation (18,000 g, 10 minutes, 4 ° C) was purified using QIAexprssionist (QIAGEN) according to the attached protocol.
  • the obtained protein was named His fusion SHMT.
  • Example 12 Expression of 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene derived from Variovorax paradoxus Production of ⁇ -methyl-L-serine by Escherichia coli
  • Each bacterial cell obtained was suspended in 100 ml of a reaction solution (150 mM L-alanine, 0. ImM pyridoxal phosphate, lOO mM phosphate buffer (pH 7.4)).
  • a reaction solution 150 mM L-alanine, 0. ImM pyridoxal phosphate, lOO mM phosphate buffer (pH 7.4)
  • 50.5 ml of 300 mM aqueous formaldehyde solution was added at 30 ° C. with stirring for 24 hours.
  • the formaldehyde used was a special grade formaldehyde solution [code number: 16223-55] manufactured by Nacalai Testa Co., Ltd.
  • Example 13 2-Methylserine Hydroxide derived from Bosea sp. B2-Rl strain (AJ110407 strain) Creation of simethyltransferase expression strain
  • the promoter region of the trp operon on Escherichia coli W3110 chromosomal DNA was amplified by PCR using the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 as primers, and the resulting DNA fragment was pGEM-Teasy vector ( (Promega made). Transform E. coli JM109 with this ligation solution.
  • the strain having the target plasmid inserted in the opposite direction to the lac promoter of the trp promoter was selected.
  • this plasmid was ligated with a DNA fragment containing the trp promoter obtained by treating with EcoOl 091 / EcoRI and EcoUC109lZEcoRI treated product of pUC19 (manufactured by Takam).
  • Escherichia coli JM109 was transformed with this ligation solution, and a strain having the target plasmid was selected from ampicillin resistant strains.
  • the PCR product was digested with EcoO109lZNdeI digested with ptrp2 treated with EcoRO109lZNdeI, transformed into Escherichia coli JM109, and transformed into an ampicillin resistant strain. A strain having the desired plasmid was selected. This plasmid was designated as ptrp4. Furthermore, pTWV228 (manufactured by TaKaRa) was treated with Ndel, followed by a blunt end treatment, followed by Aatll to obtain a 1.9 kb fragment.
  • This fragment was ligated with a 0.4 kb fragment treated with ptrp4 with Aatll / Hindlll and a 0.7 kb fragment treated with pKK223-3 with PvuII ZHindlll.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the target plasmid was selected from ampicillin meta strains, and this plasmid was designated as ptrp13.
  • Bosea sp. B2 Obtained by PCR using the genomic DNA of strain R1 as a saddle and primers B2—Rl—Psh (SEQ ID NO: 24) and B2—Rl ter Pst (SEQ ID NO: 25). The amplified fragment of 1.2 kb was treated with PshBlZPstl and inserted into the NdelZPstl site of ptrpl3 to obtain ptrpl3BHMT. Escherichia coli JM109 was transformed with this plasmid. This transformant was named JM109Zptrpl3BHMT.
  • JM109Zptrpl3BHMT obtained above was cultured on LB agar medium (peptone 10gZl, yeast extract 5gZl, NaCllOgZD containing ampicillin (100 ⁇ g / ml) for 24 hours at 30 ° C. Next, for 1Z8 plate The cells were transferred to 50 mL of LB medium (peptone 10 gZl, yeast ex 5 gZl, NaCllOg / 1). Inoculated into 300 ml of medium and batch-cultured in a laboratory fermentor with a capacity of 1.01 with stirring and aeration (lZlvvm) at a rotation speed of 700 rpm.
  • the medium was inoculated into 300 ml of the composition, and a sugar feed culture was performed at 35 ° C. with agitating aeration (l / lwm) using the same fermenter, and the pH was automatically adjusted to 7.0 with gaseous ammonia.
  • Glucose and magnesium sulfate were sterilized separately.
  • the pH of the other components was adjusted to 5.0 with KOH.
  • Example 14 Bosea sp. B2-R2-strain (AJ110407) -derived 2-methylserine hydroxyl Production of ⁇ -methyl L-serine by cymethyltransferase
  • ⁇ -methyl L-serine production reaction was carried out using 30 ml of the culture solution of ⁇ JM109 / ptrp13BHMT prepared in Example 13 above.
  • the formaldehyde used was a special grade formaldehyde solution [code number: 16223-55] manufactured by Nacalai Testa Co., Ltd.
  • the reaction solution prepared in Example 14 was simply sterilized by centrifugation.
  • the obtained reaction solution (451 g, methyl L-serine: 9.08%) was charged with 3.3 g of sulfuric acid, pH was adjusted to 3, and dissolved protein was heated and aggregated at 50 ° C for 1 hour. This is 0.2 m MF, filtered, and the residue washing water is included, and 482 g of the solution is added.
  • Example 16 Expression of 2-methylserine hydroxymethyltransferase gene derived from Bosea sp. Production of ⁇ -ethylyl L-serine by Escherichia coli
  • JM 109ZpUCBHMT was suspended in a 100 ml reaction solution (150 mM L-2 amino n-butyric acid, 0. ImM pyridoxal phosphate, lOOmM phosphate buffer (pH 7.4)) using JM 109ZpUCBHMT as an enzyme cell.
  • reaction solution 150 mM L-2 amino n-butyric acid, 0. ImM pyridoxal phosphate, lOOmM phosphate buffer (pH 7.4)
  • 50.5 ml of 300 mM aqueous formaldehyde solution was added at 30 ° C over 24 hours with stirring.
  • formaldehyde a special grade formaldehyde solution [Code No .: 16223-55] manufactured by Nacalai Testa Co., Ltd. was used.
  • reaction solution 50 ml: containing 632 mg and 4.75 mmol as a-ethylylserine
  • 8, OOOg, lOmin was previously activated with 50 ml of methanol and equilibrated with 100 ml of HO.
  • silica gel was scraped from the plate, extracted with methanol (100 ml) and concentrated to dryness to give white crystals. A small amount of water was added and dissolved by adjusting the pH to around 8.0 with NaOH. Then, HC1 was added dropwise and recrystallized by adjusting the pH to around 2.0.
  • the main product of the enzymatic reaction was confirmed to be (one), ie, (S) isomer by comparing with the values described in the literature (Journal of Peptide Science, 2001, 7, 619-625).
  • Example 17 Production of ⁇ -methylthreonine by 2-methylserine hydroxymethyltransferase derived from Ralstonia sp. All strain (AJ110405)
  • Example 2 51 mM acetoaldehyde, 50 mM L-alanine, 0. ImM pyridoxal phosphate, 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) 50 1
  • the purified enzyme solution prepared in Example 2 was added to 50 1 and 30 ° Reacted at C for 17.5 hours. After the reaction was completed, ESI-MS analysis was performed on the supernatant obtained by centrifugation (18,000 g, 10 minutes, 4 ° C), and a molecular ion peak of ⁇ -methylthreon was observed.
  • the present invention is useful in the industry related to the process for producing amino acids.
  • the present invention contributes to the production of various serine derivatives and optically active amino acids, and is expected to be used, for example, as a method for producing pharmaceutical intermediates.
  • SEQ ID NO: 7 primer

Abstract

　簡便な手法によるセリン誘導体およびその光学活性体を生成する新たな方法を提供する。所定の酵素の存在下で、 （式（Ｉ）において、Ｒ1は、所定の炭化水素基） に示されるＬ－α－アミノ酸と、下記式（ＩＩ）： （式（ＩＩ）においてＲ2は所定の炭化水素基） に示されるアルデヒドとを反応させて、式（ＩＩＩ）： に示されるＬ－セリン誘導体を生成させる。

Description

明 細 書
Lーセリン誘導体の製造方法およびこれに用レ、る酵素
技術分野
[0001] 本発明は、 β (beta)—ヒドロキシ— a—L アミノ酸の製造方法に関し、より詳しく は、新規な酵素を用いた Lーセリン誘導体の製造方法に関する。
背景技術
[0002] セリン誘導体、 α位に光学活性を有するアミノ酸などのアミノ酸は、医薬品の中間 体などとしての利用が期待される物質である。 α位に異なる 2つの置換基を有する光 学活性アミノ酸誘導体である光学活性 a アルキルセリン誘導体およびその塩の製 造方法としては、例えば以下の方法が知られている。
1)光学活性セリン誘導体とピバルアルデヒドより得られる光学活性ォキサゾリジンィ匕 合物への不斉アルキル化による方法 (非特許文献 1)
2)光学活性金属触媒を用いるひ一イソシァノカルボン酸エステルとパラホルムアル デヒドの不斉アルドール反応による方法 (非特許文献 2)
3)光学活性ォキサゾリジンクロムカルべン錯体とォキサジン化合物力 得られる光 学活性 β ラタタム化合物への不斉アルキル化による方法 (非特許文献 3)
4)光学活性アジリジン化合物の不斉開環反応 (非特許文献 4)
5)光学活性パリン誘導体と光学活性ァラニン誘導体カゝら得られる光学活性ビラジノ ン化合物への不斉アルキル化による方法 (非特許文献 5)
6) 2—メチルー 2 プロペン酸誘導体にシャープレス不斉ジヒドロキシル化を行い、 得られる光学活性ジオール化合物を光学活性アジド化合物に導き還元する方法 (非 特許文献 6)
[0003] また、医薬品の中間体として有望視される物質の一つとして、例えば aーメチルー Lーセリンがある。 ocーメチルー Lーセリンを酵素反応を利用して製造する方法として は、例えば、 D ァラニンと 5, 10—メチレンテトラノ、イド口葉酸を原料とし、 2—メチル セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（EC2. 1. 2. 7)の利用する方法が知られて いる (非特許文献 7)。 [0004] 非特許文献 1 : Helvetica Chimica Acta, 1987, 70, 1194—1216 非特許文献 2 : Tetrahedron Letters, 1988, 29, 235- 238
非特許文献 3 Journal of Organic Chemistry, 1993, 58, 5918- 5924 非特許文献 4: Tetrahedron Letters, 1995, 36, 3639- 3642
非特許文献 5 : European Journal of Organic Chemistry, 2000, 2809— 28 20
非特許文献 6 : Tetrahedron Asymmetry, 2001, 12, 949— 957
非特許文献 7 : Wilsonら J. Biol. Chem 237 3171 - 3179
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 上記のように光学活性アミノ酸の製法にっ 、ては様々な手法が研究されて 、る。し かし、光学活性アミノ酸ゃセリン誘導体の種類は多ぐより簡便な手法、またはより効 率よぐ様々な光学活性アミノ酸ゃセリン誘導体を生成する方法が求められている。 本発明は、簡便な手法によるセリン誘導体およびその光学活性体を生成する新たな 方法およびこれに用いられる酵素等を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者等はセリン誘導体の新たな製法について鋭意研究したところ、 Lーァミノ 酸と所定のアルデヒドとを反応させる系にお 、て、その反応を触媒する新たなタンパ ク質を見出した。さらに、このタンパク質を用いることにより、簡便にセリン誘導体を生 成でき、し力も生成物が光学活性を生じ得るアミノ酸である場合には、 L—セリン誘導 体を選択的に生成し得ることが見出された。また、具体的な一形態として、アミノ酸と ホルムアルデヒドとを、 5, 10—メチレンテトラヒドロ葉酸を介さずに直接的に反応させ るという従来にない反応系を構築したものである。本発明は係る知見に基づくもので あり、下記 Lーセリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素などを提供するもの である。
[0007] 〔1〕酵素の存在下で、式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000005_0001
(式 (I)において、 R1は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭 素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜： L 1のァ ルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭 素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの基は直 鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ!/、）
に示される L— a アミノ酸と、下記式 (Π)：
[化 2]
Figure imgf000005_0002
(式 (Π)において R2は、水素、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール 基、炭素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜1 1のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれ らの炭素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの 基は直鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ 、） に示されるアルデヒドとを反応させる、式 (ΠΙ)：
[化 3]
"姻
Figure imgf000005_0003
(式 (III)における R1は、式 (I)中の R1と同じであり、式 (III)における R2は式 (Π)中の R 2と同じ）
に示される Lーセリン誘導体の製造方法。
〔2〕前記酵素が、ラルストニア（Ralstonia)属、ノ リオボラックス（Variovorax)属、ボセ ァ（Bosea)属およびシリシパクター（Silicibacter)属からなる群より選ばれる 、ずれか の属に属する微生物に由来する、上記〔1〕に記載の Lーセリン誘導体の製造方法。 〔3〕前記酵素が、下記 (A)〜 (L)力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上のタンパ ク質である、上記〔1〕に記載の Lーセリン誘導体の製造方法。
(A)配列番号 5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号 5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、力 つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(C)配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号 9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、力 つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(E)配列番号 15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号 15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(G)配列番号 19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号 19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(I)配列番号 23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
C 配列番号 23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、力 つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(Κ)配列番号 30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 (L)配列番号 30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
〔4〕式 (I)で示されるアミノ酸力 L- αーァラニンであり、式 (III)で示される Lーセリ ン誘導体が α—メチル—L セリンである、上記〔1〕から〔3〕のいずれか一項に記載 の Lーセリン誘導体の製造方法。
〔5〕式 (I)で示されるアミノ酸力 L— 2 アミノー η—酪酸 *1であり、式 (III)で示され る L セリン誘導体が α—ェチル—L セリンである、上記〔1〕から〔3〕のいずれか一 項に記載の Lーセリン誘導体の製造方法。
〔6〕式 (I)で示されるアミノ酸力 L- αーァラニンであり、式 (III)で示される Lーセリ ン誘導体が α—メチルー Lースレオニンである、上記〔1〕から〔3〕のいずれか一項に 記載の Lーセリン誘導体の製造方法。
〔7〕ラルストニア（Ralstonia)属、バリオボラックス (Variovorax)属、ボセァ（Bosea)属ぉ よびシリシパクター（Silic¾acter)属からなる群より選ばれるいずれかの属に属する微 生物に由来し、式 (I) :
[化 4]
Figure imgf000007_0001
(式 (I)において、 R1は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭 素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜： L 1のァ ルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭 素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの基は直 鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ!/、）
に示される L— a アミノ酸と、下記式 (Π)：
Figure imgf000008_0001
(式 (Π)において R2は、水素、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール 基、炭素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜1 1のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれ らの炭素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの 基は直鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ 、） に示されるアルデヒドとから、下記式 (ΠΙ)：
[化 6]
Figure imgf000008_0002
(式 (ΠΙ)における R1は、式 (I)中の R1と同じであり、式 (III)における R2は式 (Π)中の R 2と同じ）
に示される L セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。 〔8试 (I) :
[化 7]
Figure imgf000008_0003
(式 (I)において、 R1は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭 素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜： L 1のァ ルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭 素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの基は直 鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ!/、）
に示される L— a アミノ酸と、下記式 (Π)： 0
2人 ■■·(»)
R H
(式 (Π)において R2は、水素、炭素数 1 6のアルキル基、炭素数 6 14のァリール 基、炭素数 3 10のシクロアルキル基、炭素数 7 19のァラルキル基、炭素数 2 1 1のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれ らの炭素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの 基は直鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ 、） に示されるアルデヒドとから、下記式 (ΠΙ)：
[化 9]
Figure imgf000009_0001
(式 (ΠΙ)における R1は、式 (I)中の R1と同じであり、式 (III)における R2は式 (Π)中の R 2と同じ）
に示される Lーセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有する、下記 (A) （ L)の! ずれかのタンパク質。
(A)配列番号 5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号 5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 からなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、か つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(C)配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号 9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 からなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、か つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(E)配列番号 15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号 15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(G)配列番号 19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号 19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(I)配列番号 23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
C 配列番号 23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、力 つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(Κ)配列番号 30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(L)配列番号 30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
〔9〕上記〔8〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔10〕下記 (a)から (1)よりなる群力も選ばれるポリヌクレオチド
(a)配列番号 4に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号 4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号 8に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号 8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号 14に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(f)配列番号 14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(g)配列番号 18に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(h)配列番号 18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a—アミノ酸と 式 (Π)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反 応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(i)配列番号 22に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(j)配列番号 22に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(k)配列番号 29に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(I)配列番号 29に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式
(II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[化 10] . . '(1)
Figure imgf000011_0001
(式 (I)において、 R1は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭 素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜： L 1のァ ルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭 素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの基は直 鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ!/、）
[化 11]
Figure imgf000012_0001
(式 (Π)において R2は、水素、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール 基、炭素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜1 1のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれ らの炭素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの 基は直鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ 、）
[化 12]
Figure imgf000012_0002
(式 (III)における R1は、式 (I)中の R1と同じであり、式 (III)における R2は式 (Π)中の R 2と同じ）
〔11〕上記〔9〕または〔10〕に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレ ォチド。
〔12〕上記〔11〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
発明の効果
[0008] 本発明により、簡便な手法で Lーセリン誘導体を生成することができる。
また、本発明は、光学活性を有する Lーセリン誘導体を生成する場合、 L 型のアミ ノ酸を選択的に生成することができるため、 L アミノ酸の製法として効率がよ!、。 図面の簡単な説明
[0009] [図 1]図 1は、本発明の一実施形態における反応系を示す概略図である。
発明を実施するための最良の形態 [0010] 以下、本発明の実施の形態についてその最良の形態と共に説明する。 なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、 Molecular Clonin g : A Laooratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press ( 2001Z01Z15)、細胞工学ノ、ンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（1992)、新遺 伝子工学ノ、ンドブック改訂第 3版、村松ら編、羊土社 (1999)など、多くの標準的な 実験マ-ユアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可 能である。本明細書においては、特に断らない限り、配列番号は配列表中の配列番 号を示す。また、本明細書において、酵素とは化学反応を触媒する活性を有するタ ンパク質のことをいう。
[0011] 本発明の Lーセリン誘導体の製造方法においては、式 (I)の L a アミノ酸と、式
(II)で示されるアルデヒドとを反応させる。
[0012] 式 (I)における R1をより具体的に示すと以下の通りである。
R1が炭素数 1〜6のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、ェチル 基、 nプロピル基、イソプロピル基、 nブチル基、イソブチル基、 secブチル基、 tertブ チル基、 nペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、 nへキシル基、イソへキシ ル基などが例示される。
[0013] また、 R1が炭素数 6〜 14のァリール基である場合とは、具体例を示すと、フエ-ル 基、トリル基、キシリル基、ビフヱ-リル基、ナフチル基、アントリル基、フヱナントリル基 などが例示される。
[0014] R1が炭素数 3〜 10のシクロアルキル基である場合とは、具体例を示すと、シクロプロ ピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロヘプタ-ル基、 シクロォクタ二ル基、シクロノナニル基、シクロデ力-ル基などが例示される。
[0015] R1が炭素数 7〜 19のァラルキル基である場合とは、具体例を示すと、ベンジル基、 ベンズヒドリル基、フエネチル基、トリチル基などのフエニルアルキル基、シンナミル基 、スチリル基、ナフチルアルキル基などが例示される。
[0016] R1が炭素数 2〜： L 1のアルコキシアルキル基である場合とは、具体例を示すと、炭素 数 1〜10のアルキル基に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、 ブトキシ基、ペンチルォキシ基、フエノキシ基、ヘプトキシ基、オタトキシ基、ノナノキシ 基、デカノキシ基、およびゥンデコキシ基力 選ばれる基が置換されたものが例示さ れる。
[0017] R1は、上記炭化水素の炭素骨格中にヘテロ原子を含む基であってもよ!/、。ヘテロ 原子としては、酸素、窒素、硫黄などが挙げられる。
R1が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭化水素 基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む 環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはへテロァリール基などが含 まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい 。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チェ-ル基、ピリジル基、ピ ペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これ らの複素環基により置換されたアルキル基等が例示される。
[0018] また、 R1は、上記に示す基において炭素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む 炭化水素基であってもよい。
さらに、上記 R1は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、 R1は、上記の 炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数 3までのアルキル基、炭素数 3までのァ ルコキシル基、ケト基（ =〇）、水酸基（一 OH)、チオール基（一 SH)、ァミノ基（一 N H )、アミド基（一 CONH )、ィミノ基（ = NH)、ヒドラジノ基（一 NHNH )等力ら選ば
2 2 2 れる 1種または 2種以上が置換'付加されたものであってもよい。
[0019] 式 (I)に示される L— a—アミノ酸としては、例えば、それぞれ L a—型の、ァラ- ン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システィン、メチォニン、ァスパ ラギン、グルタミン、フエ-ルァラニン、チロシン、トリプトファン、ァスパラギン酸、グル タミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、 2—アミノー n—酪酸などが挙げられ、好ま しくは、了ラニン、 2—ァミノ一 n—酪酸、より好ましくはァラニンが例示される。
[0020] 式 (Π)における R2をより具体的に示すと次の通りである。
[0021] R2は水素であってもよい。
R2が炭素数 1〜6のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、ェチル 基、 nプロピル基、イソプロピル基、 nブチル基、イソブチル基、 secブチル基、 tertブ チル基、 nペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、 nへキシル基、イソへキシ ル基などが挙げられる。
[0022] また、 R2が炭素数 6〜 14のァリール基である場合とは、具体例を示すと、フエニル 基、トリル基、キシリル基、ビフヱ-リル基、ナフチル基、アントリル基、フヱナントリル基 などが挙げられる。
[0023] R2が炭素数 3〜 10のシクロアルキル基である場合とは、具体例を示すと、シクロプロ ピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロヘプタ-ル基、 シクロォクタ二ル基、シクロノナニル基、シクロデ力-ル基などが挙げられる。
[0024] R2が炭素数 7〜 19のァラルキル基である場合とは、具体例を示すと、ベンジル基、 ベンズヒドリル基、フエネチル基、トリチル基などのフエニルアルキル基、シンナミル基 、スチリル基、並びにナフチルアルキル基などが挙げられる。
[0025] R2が炭素数 2〜： L 1のアルコキシアルキル基である場合とは、具体例を示すと、炭素 数 1〜10のアルキル基に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、 ブトキシ基、ペンチルォキシ基、フエノキシ基、ヘプトキシ基、オタトキシ基、ノナノキシ 基、デカノキシ基、およびゥンデコキシ基力 選ばれる基が置換されたものなどが挙 げられる。
[0026] R2は、上記炭化水素の炭素骨格中にヘテロ原子を含む基であってもよ!/、。ヘテロ 原子としては、酸素、窒素、硫黄などが挙げられる。
R2が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭素水素 基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む 環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはへテロァリール基などが含 まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい 。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チェ-ル基、ピリジル基、ピ ペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これ らの複素環基により置換されたアルキル基等が含まれる。
[0027] また、 R2は、上記に示す基において炭素骨格中に炭素—炭素不飽和結合を含む 炭化水素基であってもよい。
さらに、上記 R2は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、 R2は、上記の 炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数 3までのアルキル基、炭素数 3までのァ ルコキシル基、ケト基（ = 0)、水酸基（一 OH)、チオール基（一 SH)、ァミノ基（一 N H )、アミド基（一 CONH )、ィミノ基（ = NH)、ヒドラジノ基（一 NHNH )等力ら選ば
2 2 2
れる 1種または 2種以上が置換'付加されたものであってもよい。
[0028] 式 (Π)で示される化合物としては、好ましくはホルムアルデヒド及びァセトアルデヒド が例示される。
[0029] 式 (ΠΙ)における R1および R2はそれぞれ式 (I)および式 (Π)におけるそれらと同じで ある。なお、 R1および R2との具体的な組み合わせによっては、生成物が光学不活性 な立体異性体 (メソ体)となる場合があり得るが、本発明の方法は光学活性を有する アミノ酸の製造方法に係るものであり、メソ体を生成するような R1および R2の組み合わ せは含まない。例えば、 a—ヒドロキシメチルーセリンは L—セリン誘導体には該当し な！、ので、式 (I)の化合物がセリンであって式 (Π)の化合物がホルムアルデヒドと!/、う 組み合わせは本発明の Lーセリン誘導体の製造方法には含まれな!/、。
[0030] 本発明の L セリン誘導体の製造方法は、酵素を用いた反応により L体のセリン誘 導体を優先的に生成させる方法である。ここで「L体を優先的に生成」とは、生成され るセリン誘導体に占める L体の比率が、 D体よりも高いことを意味し、好ましくは L体の 比率が 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上である。この 場合のセリン誘導体に占める L体の比率は [L体] Z( [D体] + [L体]) * 100で算出さ れる。
[0031] 本発明における好ましい一形態としては、例えば図 1に示すように、 L a ァラニ ンとホルムアルデヒドとを反応させて、 aーメチルー Lーセリンを生成する系が含まれ る。ホルムアルデヒドを、 5, 10—メチレンテトラヒドロ葉酸などを介さずに、直接的に L アミノ酸と反応させて Lーセリン誘導体を生成する反応系は従来にお!/、てまったく 知られていなかった。このように、本発明によって、よりシンプルな反応系で Lーセリン 誘導体を得ることができる。また、ホルムアルデヒドを用いる場合、少量のホルムアル デヒドを逐次的に反応系に添カ卩して 、くことが好まし 、。ホルムアルデヒドを逐次添カロ することにより、副産物等の生成を抑制し得る。
[0032] 本発明における好ましい別の形態としては、例えば、 L— 2 アミノー n—酪酸とホ ルムアルデヒドとを反応させて α—ェチルー Lーセリンを生成する系、及び L a ァラニンとァセトアルデヒドとを反応させて α—メチルー L—スレオニンを生成する系 が挙げられる。
[0033] 反応温度は、好ましくは 10〜60°C、より好ましくは 20〜40°Cである。また、反応系 の pHは、好ましくは 4〜 10であり、より好ましくは 6〜8である。
[0034] 上記反応終了後の酵素反応液からは、例えば、以下の様にして Lーセリン誘導体 の単離を行うことが出来る。
酵素反応液の pHを下げ、加熱殺菌と共に、溶存タンパクの凝集を行った後、遠心 分離、ろ過、 UF (ウルトラフィルトレーシヨン：限外ろ過）等の手段により、除菌 '除タン ノ クを行う。この液中には、無機塩類が含まれるため、晶析時に、これらの析出を回 避する為、脱塩を行う。方法は、 NF (ナノフィルトレーシヨン:ナノろ過）、電気透析、ィ オン交換榭脂等何れの方法を用いても構わな 、。
[0035] 必要に応じ上記の脱塩処理を行った後、反応液を濃縮していくと Lーセリン誘導体 の結晶が析出してくるが、性状は微細であり、結晶分離に際し、溶解度が高い故、高 回収率が得られない上に、粘性も大きく取り扱いが困難であることが多い。その為、 液を必要に応じてある程度予備的に濃縮した後に貧溶媒添加晶析を行うのが好まし い。予備的濃縮は、例えば結晶が析出し始めるまで行うことができる。ここで添加する 貧溶媒としては、水溶性である低級アルコールやアセトンが好適である。貧溶媒晶析 の後に、冷却晶析を組み合わせて、晶析率を上げることも可能である。このスラリーを 分離し、湿ケーキを乾燥することにより、 Lーセリン誘導体の結晶を得ることができる。
[0036] 本発明において、式 (Π)のアルデヒドと、 L a アミノ酸との反応は所定の酵素の 存在下において行われる。この反応を触媒し得る酵素としては、例えば、ラルストニア (Ralstonia)属、ノ リオボラックス (Variovorax)属、ボセァ (Bosea)属およびシリシ パクター（Silicibacter)属からなる群の 、ずれかに属する微生物力 得ることができ る。微生物についてのより具体的な例としては、ラルストニア'エスピー（Ralstonia s p.)、ノ リオボラックス 'パラドキサス（Variovorax paradoxus)、ボセァ 'エスピー（B osea sp. )、シリシパクター 'ポメロイ（Silicibacter pomeroyi)などが挙げられ、よ り好ましくは、ラルストニア'エスピー FERM ABP— 10607株、ノ リオボラックス' パラドキサス（Variovorax paradoxus) FERM ABP— 10608株、ノ リオボラック ス 'パラドキサス（Variovorax paradoxus) NBRC 15149株、バリオボラックス 'パラ ドキサス（Variovorax paradoxus) NBRC15150株、ボセァ·ェスピー（Bosea sp . ) FERM ABP— 10609株、シリシパクタ^ ~ ·ポメロイ（Silicibacter pomeroyi) D SMI 5171株などが例示される。
[0037] なお、 FERM番号または NBRC番号が付与された菌株は下記の通り寄託された菌 株であり、各番号を参照の上、所定の手続により分譲を受けることができる。
[0038] (1)名称：ラルストニア.エスピー（Ralstonia sp.) Al l株（または別名： AJ110405 株）
寄託番号： FERM ABP- 10607
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6
寄託された日： 2005年 3月 8日
[0039] (2)名称；バリオボラックス ·パラドキサス（Variovorax paradoxus) B2— B2株（別 名： AJ 110406株;）
寄託番号： FERM ABP- 10608
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6
寄託された日： 2005年 3月 8日
[0040] (3)バリオボラックス 'パラドキサス（Variovorax paradoxus) AJ 110408株
寄託番号： NBRC 15149
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 (NITE)バイオテクノロジー本部（ DOB)生物遺伝資源部門（NBRC)
寄託機関住所：日本国千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8
[0041] (4)バリオボラックス 'パラドキサス（Variovorax paradoxus) AJ110409株
寄託番号： NBRC15150
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 (NITE)バイオテクノロジー本部（ DOB)生物遺伝資源部門（NBRC)
寄託機関住所：日本国千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8 [0042] (5)名称：ボセァ 'エスピー（Bosea sp. ) B2— R1株（別名： AJ110407株） 寄託番号： FERM ABP- 10609
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6
寄託された日： 2005年 3月 8日
[0043] この他、シリシバクタ一'ポメロイ（Silicibacter pomeroyi) DSM15171tt«, De utscne ¾ammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (任 所： Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig、 GERMANY)力も、本 || 優先日当時から公衆が入手可能である他、 American Type Culture Collectio n (連絡先： P. O. Boxl549, Manassas, VA 20108、 U. S. A.；)力もも、 ATCC 700808株として本願優先日当時力も公衆が入手可能である。
[0044] 表 1— 1および表 1— 2に、ラルストニア'エスピー（Ralstonia sp.)Al l株（または 別名： AJ110405株、寄託番号： FERM ABP— 10607)の菌学的性質について示 す。
[0045] [表 1-1]
ラルストニア.エスピー All株
Figure imgf000020_0001
-2] 4. 糖類からの酸産生/ガス産生 2)
L—ァラビノース — /- D—キシロース 一!一
D—グノレコース -/- D—マンノ一ス -/一
D—フラク ト一ス 一/一 D—ガラクト一ス — /—
マルト一ス -/— サ—クロース — /—
ラク ト―ス トレノ、口一ス — /—
D—ンルビトール -/— D—マンニト—ノレ
イノシト—ル -/一 グリセリン — /-
5. その他の生理学的性質
ガラクトシダ一ゼ活性 - アルギニンジヒドロラ一ゼ活性 - リジンデカルボキシラーゼ活性 - トリブトファンデァミナーゼ活性 - ゼラチナ一ゼ活性 一
+: !¾性. -:陰性， 《:反応弱い
[0047] 表 2—1および表 2— 2に、ノ リオボラックス 'パラドキサス (Variovorax paradox us) B2— B2株 (別名： AJ110406株、寄託番号: FERM ABP— 10608)の菌学的 性質について示す。
[0048] [表 2-1]
バリオボラックス 'パラドキウス B2- B2株
Figure imgf000022_0001
- 2] 4. 糖類からの酸産生/ガス産生 2〕
L—ァラビノース D—キシロース
D—グルコース — /— D—マンノ一ス
D—フラク トース 一/— D—ガラクトース -/- マル卜ース サ―ク口一ス 一/一
ラク —/一 α— 一/一
D—ソルビ I ル 一/一 D—マンニトール —/一 イノシ I ル グリセリン 一/一
5. その他の生理学的性質 2)
0—ガラク トシダーゼ活性 ―
アルギ ンジヒ ドロラ一ゼ活性 ―
リジンデカルボキシラーゼ活性 - トリブトファンデァミナ一ゼ活性 ―
ゼラチナーゼ活性 一
+:賜性， -:陰性. 反応弱い
[0050] 表 3—1および表 3— 2に、ボセァ 'エスピー（Bosea sp. ) B2— R1株（別名： AJ11
0407株、寄託番号： FERM ABP— 10609)の菌学的性質について示す。
[0051] [表 3-1]
ポセァ 'エスピー B2- R1株
Figure imgf000024_0001
2] 4. 糖類からの酸産生/ガス産生 2)
L—ァラビノ一ス — /- D—キシ口—ス -/-
D—グ レコース -/— D—マンノース 一!一
D—フラク トース — /— D—ガラク ト一ス 一/— マルト一ス -/- サ―ク口一ス 一/— ラク ト―ス -/- トレ /、口一ス _/—
D—ソノレビトール -/- D—マンニトール -/- イノシトール 一/一 グリセリン 一/一
5. その他の生理学的性: 32)
—ガラク トシダーゼ活性 - アルギニンジヒドロラーゼ活性 - リジンデカルボキシラーゼ活性 ―
トリブトファンデァミナ一ゼ活姓 一
ゼラチナ一ゼ活性 -
+: 性， 性. 反応弱い
[0053] 参考文献および使用キット
1) BARROW, (G. I. ) and FELTHAM, (R. K. A)： Cowan and Steel' s Manual for the Identificaation of Medical Bacteria. 3 edition. 19 93, Cambridge University Press.
2)坂崎利一吉崎悦郎，三木寛二:新細菌培地学講座 '下〈第二版〉. 1988,近大出 版，東京.
3)細菌同定キット ΑΡΙ20, ΝΕ,
(bioMerieux, France： http： / / www. biomerieux. fr/home― en. htm) .
[0054] 本発明において Lーセリン誘導体を生成する反応に用いられる酵素としては、より 具体的には下記のタンパク質が例示される。
(A)配列番号 5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号 5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、か つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(C)配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号 9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、か つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質 (E)配列番号 15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号 15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(G)配列番号 19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号 19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(I)配列番号 23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
C 配列番号 23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、力 つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(Κ)配列番号 30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(L)配列番号 30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
[0055] 上記のタンパク質を用いることにより、 Lーセリン誘導体を簡便に生成することができ る。特に、 L- α—ァラニンとホルムアルデヒドとを反応させる系においては、実質的 にひーメチルー Lーセリンのみを生成可能であり、効率よく光学活性アミノ酸を得るこ とがでさる。
[0056] 配列番号 5に示すアミノ酸を有するタンパク質 (A)は、ラルストニア.エスピー FER M ABP— 10607株力ゝら単離し得る。配列番号 9に示すアミノ酸を有するタンパク質 (C)は、ノ リオボラックス 'パラドキサス FERM ABP— 10608株から単離し得る。 配列番号 15に示すアミノ酸を有するタンパク質 (E)は、ノ リオボラックス 'パラドキサス NBRC 15149株力ゝら単離し得る。配列番号 19に示すアミノ酸を有するタンパク質（ G)は、ノ リオボラックス 'パラドキサス NBRC15150株力ら単離し得る。配列番号 2 3に示すアミノ酸を有するタンパク質（I)は、ボセァ 'エスピー FERM ABP- 1060 9株から単離し得る。配列番号 30に示すアミノ酸を有するタンパク質 (K)は、シリシバ クタ一'ポメロイ DSM 15171株から単離し得る。
[0057] シリシバクタ一 ·ポメロイ DSM15171はゲノム配列が公開されており、配列番号 30 の一部はセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（AAV96754. 1)として登録され ていた。このセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ (AAV96754. 1)の登録配列 を Escherichia coliにて発現させた結果、 目的のタンパク質は検出されず 2—メチ ルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性も示さな力つた。し力しながら、発明者 らの検討の結果、登録配列にさらに上流の 9アミノ酸残基が 2—メチルセリンヒドロキ シメチルトランスフェラーゼの活性に必須であることを見出した。配列 30は、セリンヒド ロキシメチルトランスフェラーゼ (AAV96754. 1)の登録配列に上流の 9アミノ酸残 基が加わっているものである。この配列を Escherichia coliに導入し発現させた結 果、 目的のタンパク質が検出され 2—メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ 活性が確認された。
[0058] 上記のように、本発明にお ヽては、（A)、 (C)、 (E)、 (G)、 (I)および (K)のタンパ ク質と実質的に同一のタンパク質も用い得る。まず (A)のタンパク質を例とすると、上 記 (A)に示すタンパク質と実質的に同じタンパク質として (B)に示すタンパク質が提 供される。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や 種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損な わない範囲のものであり、具体的には、 2〜50個、好ましくは 2〜30個、さらに好まし くは 2〜： L0個である。ただし、（B)のタンパク質のアミノ酸配列において 1または数個 の置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸 の変異を含むアミノ酸配列の場合には、 30°C、 pH7— 8の条件下で、（A)のタンパク 質の半分程度以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ま しくは 95%以上の酵素活性を保持して 、ることが望ま 、。
[0059] 上記 (B)に示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、 本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付カロ などされるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変さ れた塩基配列を有するポリヌクレオチドは、従来知られて 、る突然変異処理によって も取得され得る。突然変異処理としては、（A)をコードする DNAをヒドロキシルァミン 等でインビトロ処理する方法、及び (A)をコードする DNAを保持するェシエリヒア属 細菌を、紫外線照射または N—メチル—N'—-トロ— N— -トロソグァ二ジン (NTG )もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する 方法が挙げられる。
[0060] また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および逆位等の変異には、微 生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異 を有する DNAを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより 、 (A)のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする DNAが得られる。
[0061] (A)のタンパク質と (B)のタンパク質の関係と同様に、（C)のタンパク質と実質的に 同一のタンパク質として (D)のタンパク質が、（E)のタンパク質と実質的に同一のタン パク質として (F)のタンパク質が、（G)のタンパク質と実質的に同一のタンパク質とし て（H)が、（I)のタンパク質と実質的に同一のタンパク質として (J)が、（K)のタンパク 質と実質的に同一のタンパク質として (L)が、それぞれ例示される。
[0062] また、（A)、（C)、（E)、（G)、（I)および (K)のタンパク質とそれぞれ実質的に同一 のタンパク質として、アミノ酸配列による相同性力 好ましくは 70%以上、より好ましく は 80%以上、さらに好ましくは 90%以上の配列を有するタンパク質が例示される。な お、本明細書において、アミノ酸配列の相同性の計算は、株式会社ゼネテイツタスの ソフトウェア GENETYX Ver7. 0. 9を使用し、 ORFにコードされるポリペプチド鎖 全長をもちいて、 Unit Size to Compare = 2の設定で Marching countを perc entage計算させた際の数値またはこれと同等の計算手法による数値である。
[0063] 本発明は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。コドンの縮重に より、 1つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本発明のポ リヌクレオチドとして、上記 (A)、（B)、（C)、（D)、（E)、（F)、（G)、（H)、（1)、 COゝ ( K)および (L)に示されるタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが 含まれる。
[0064] また、本発明のポリヌクレオチドとして具体的には、下記 (a)、（c)、 (e)、（g)、（i)、（ k)に示すポリヌクレオチドが例示される。
(a)配列番号 4に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(c)配列番号 8に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(e)配列番号 14に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(g)配列番号 18に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(i)配列番号 22に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(k)配列番号 29に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
[0065] 上記（a)のポリヌクレオチドは、（A)のタンパク質をコードしており、ラルストニア -ェ スピー FERM ABP— 10607株から単離し得る。（c)のポリヌクレオチドは、（C)の タンパク質をコードしており、ノ リオボラックス 'パラドキサス FERM ABP- 10608 株から単離し得る。（e)のポリヌクレオチドは (E)のタンパク質をコードしており、ノ リオ ボラックス 'パラドキサス NBRC 15149株力 単離し得る。（g)のポリヌクレオチドは（ G)のタンパク質をコードしており、ノ リオボラックス 'パラドキサス NBRC15150株か ら単離し得る。（i)のポリヌクレオチドは (I)のタンパク質をコードしており、ボセァ 'エス ピー FERM ABP— 10609株から単離し得る。（k)のポリヌクレオチドは（K)のタン パク質をコードしており、シリシパクター 'ポメロイ DSM15171株から単離し得る。
[0066] 単離の方法について (a)のポリヌクレオチドの場合を例に説明する。配列番号 4に 記載の塩基配列を有する DNAは、ラルストニア ·エスピーの染色体 DNA、もしくは D NAライブラリ一力ら、 PCR (polymerase chain reacion、 White, T. J. et al;T rends Genet. , 5, 185 (1989)参照）またはハイブリダィゼーシヨンによって取得 することができる。 PCRに用いるプライマーは、例えば本発明の方法における反応を 触媒する活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基 づいて設計することができる。また、配列番号 4に記載された塩基配列に基づいてプ ライマーまたはハイブリダィゼーシヨン用のプローブを設計することもでき、ある ヽはプ ローブを使って単離することもできる。 PCR用のプライマーとして、コード領域を挟む ように、 5 '非翻訳領域及び 3 '非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーの組 み合わせを用いると、本タンパク質のコード領域全長を増幅することができる。
[0067] プライマーの合成は、例えば、 Applied Bio systems社製 DN A合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters (1981) , 22, 1859参照）常法に従って合成できる。 PCR反応は、例えば Gene Amp PCR Sy stem 9600 (PERKIN ELMER社製）及び TaKaRa LA PCR in vitro Clo ning Kit (タカラバイオ社)などを用い、各メーカーなど供給者により指定された方法 に従って行うことができる。
[0068] また、上記 (a)、（c)、（e)、（g)、（i)および (k)と実質的に同一のポリヌクレオチドも 本発明のポリヌクレオチドに含まれる。（a)と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下 記 (b)のポリヌクレオチド力 また (c)と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記 (d )のポリヌクレオチド力 また (e)と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記 (f)のポ リヌクレオチドが、（g)と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記 (h)のポリヌクレオ チドが、（i)と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記 (j)のポリヌクレオチド力 （k )と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記 (1)のポリヌクレオチドがそれぞれ例示 される。
[0069] (b)配列番号 4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号 8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号 14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(h)配列番号 18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a—アミノ酸と 式 (Π)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反 応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(j)配列番号 22に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(I)配列番号 29に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式
(II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[0070] ノ、イブリダィズさせるポリヌクレオチドとしては、例えばプローブを用い得る。それぞ れの場合において、プローブは、配列番号 4、 8、 14、 18、 22および 29に記載の各 塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれと ハイブリダィズするポリヌクレオチドをつり上げ、 目的とするポリヌクレオチドを単離す る方法も、定法に従って行えばよい。例えば、 DNAプローブは、プラスミドやファージ ベクターにクロー-ングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いた 、塩基配列 を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、 目的と する DNAに応じて調節することができる。また、ー且、上記のような実質的に同一の ポリヌクレオチドが検出された後は、 PCR等によって増幅することも定法により可能で ある。
[0071] 「ストリンジェントな条件」とは、 V、わゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的 なノ、イブリツドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値ィ匕することは困難で あるが、一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 70%以上、より好ましくは 8 0%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同性を有する D NA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低い DNA同士がハイブリダィズしな い条件が挙げられる。なお、塩基配列についての相同性 (％)の計算は各遺伝子の ORF全体（終止コドンを含む）をもち 、て、株式会社ゼネテイツタスのソフトウェア GEN ETYX Ver7.0.9を使用し、 Unit Size to Compare = 6、 pick up location = 1の 設定で percentage計算させた数値として表示する。また、他の例として、通常のサザ ンハイブリダィゼーシヨンの洗いの条件である 60°C、 1 X SSC、0. 1%SDS、好まし くは、 0. 1 X SSC、 0. 1%SDSに相当する塩濃度でノ、イブリダィズする条件が挙げ られる。このような条件でノヽイブリダィズする遺伝子の中には途中にストップコドンが 発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらにつ いては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素 活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
[0072] なお、上記のように上記（b)のポリヌクレオチドの場合には、それぞれ 30°C、 pH8の 条件下で、上記配列番号 4の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタン ノ ク質 (A)の半分程度以上の活性、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90% 以上の触媒活性を保持して 、ることが望ま 、。上記 (d)のポリヌクレオチドの場合に つ!ヽては（C)のタンパク質と対比して同様である。上記 (f)のポリヌクレオチドの場合 につ ヽては (E)のタンパク質と対比して同様である。上記 (h)のポリヌクレオチドの場 合にっ ヽては (G)のタンパク質と対比して同様である。上記 (j)のポリヌクレオチドの 場合につ ヽては (I)のタンパク質と対比して同様である。上記 (1)のポリヌクレオチドの 場合については (K)のタンパク質と対比して同様である。
[0073] 本発明にお ヽて用いられる酵素は、上記のような反応を触媒し得る状態で反応系 内に存在すれば、その形態に特に限定はない。具体的形態としては、酵素を生産す る微生物の培養物、その培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含ま れる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的に は、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生 成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体とし て用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなど が含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗精製タンパク質、さらに精製した精 製タンパク質なども含まれる。精製処理されたタンパク質としては、各種精製法によつ て得られる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法 、包括法等によって固定ィ匕した固定ィ匕タンパク質を使用してもよい。また、使用する 微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上 清も酵素含有物として利用できる。
[0074] 次に本発明のタンパク質の製造方法、並びにこれに用いられる組換え体および形 質転換体の作製方法について、上記 (A)のタンパク質を一例として説明する。他の タンパク質につ ヽても同様に実施可能である。
[0075] 上記 (A)のタンパク質を発現する形質転換体は、上記の ヽずれかの塩基配列を有 するポリヌクレオチドを組み込んだ組換えポリヌクレオチドを作製し、これを用いて作 製することができる。例えば、配列番号 4に示される塩基配列を有する DNAを組み 込んだ組換え DNAを作製して適切な宿主に導入することにより、 (A)のタンパク質を 発現する形質転換体を得ることができる。配列番号 4の塩基配列を有する DNAによ り特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、例えばェシエリヒア'コリ（E scherichia coli)等のェシエリヒア属細菌、コリネバタテリゥム属細菌、及びバチルス •ズブチリス（Bacillus subtilis)をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス · セレヒ、、ンェ (Saccharomyces cerevisiae)、ピヒフ ·スアイヒアイス (Pichia stipitis )、ァスペルギルス ·ォリゼ（Aspergillus oryzae)をはじめとする種々の真核細胞を 用いることができる。培養等の取り扱いが簡便で、高価な成分を要せずとも培養でき る宿主を用いることにより、 L—セリン誘導体の大量生産をより簡便に、また安価に行 うことができる。
[0076] 配列番号 4の塩基配列を有する DNAを宿主に導入するために用いる組換え DNA は、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、これらの DNAを、 DNAがコ ードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。タンパク質 を発現させるためのプロモータとしては、ラルストニア'エスピー、バリオボラックス'パ ラドキサス、ボセァ ·エスピーなどに由来する上記酵素をコードする遺伝子固有のプロ モータが宿主細胞で機能する場合には、そのプロモータを使用することができる。ま た、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを、配列番号 4などの DNAに連結 し、そのプロモータ制御下で発現させるようにしてもよ!/、。
[0077] 組換え DNAを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、 D. M. Morrison の方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979) )あるいは受容菌細胞を 塩化カルシウムで処理して DNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A. , J. Mol. Biol. , 53, 159 (1970) )等力挙げられる。
[0078] 目的のタンパク質を組換え DNA技術を用いて大量生産する場合、そのタンパク質 を生産する形質転換体内でそのタンパク質が会合し、タンパク質の封入体 (inclusio n body)を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産 方法の利点は、 目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から 保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に 精製できる点等である。タンパク質封入体力ゝら活性型タンパク質を得るためには、可 溶化'活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場 合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌 体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積さ せることにより、その影響を抑えることができる。
[0079] 目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制 御下、 目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られて いるタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
[0080] 形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することが できる力 大腸菌 K12株亜種のェシエリヒア コリ JM109株、 DH5 a株、 HB101株 、 BL21 (DE3)株など力 選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質 転換体を選別する方法は Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press (200lZ0lZl5)などにも記載され ている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する 方法を、一例としてより具体的に説明する。
[0081] 本発明で用いられる触媒活性を有するタンパク質をコードする DNAを発現させる プロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモー タを使用することができ、例えば、 T7プロモータ、 lacプロモータ、 trpプロモータ、 trc プロモータ、 tacプロモータ、ラムダファージの PRプロモータ、 PLプロモータ、 T5プロ モータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、 pUC19、 pUC 18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG298、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010、 pA CYC 177, pACYC184、 pMW119、 pMW118、 pMW219、 pMW218、 pQE30 およびその誘導体等を用いることができる。他にもファージ DNAのベクターも利用で きる。さらに、プロモータを含み、挿入 DNA配列を発現させることができる発現べクタ 一を使用することもできる。
[0082] 本発明で用いられるタンパク質を融合タンパク質封入体として生産させるためには 、そのタンパク質の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるべ プチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他の タンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性- 再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよぐ例えば、 T7gene 10、 β ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロン γ遺伝子、インターロイキン 2遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げら れる。
[0083] これらの遺伝子とタンパク質をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み 取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適 当な配列の合成 DNAを利用すればょ ヽ。
[0084] また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配 列であるターミネータを連結することが好ま 、場合がある。このターミネータとしては 、 Τ7ターミネータ、 fdファージターミネータ、 T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺 伝子のターミネータ、大腸菌 trpA遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
[0085] 触媒活性を有するタンパク質またはその融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸 菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましぐ C olEl由来の複製開始点を有するプラスミド、例えば pUC系のプラスミドや pBR322 系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換 、欠失、挿入、付加および Zまたは逆位などによってプラスミドに改変を施したものを 意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤や UV照射などによる変異処理、あるい は自然変異などによる改変をも含む。
[0086] また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマー カーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発 現ベクターが市販されている（puc系（タカラバイオ社製）、 pPROK系（クローンテツ ク製）、 pKK233— 2 (クローンテック製）ほ力 。
[0087] プロモータ、所定の活性を有する目的タンパク質またはその目的タンパク質と他の タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順 に連結した DNA断片と、ベクター DNAとを連結して組換え DNAを得る。
[0088] 得られた組換え DNAを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、所 定のタンパク質またはその融合タンパク質が発現生産される。
[0089] 融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子 Xa、カリクレインなどの、 目的 タンパク質内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いて目的タ ンパク質を切り出せるようにしてもょ 、。
[0090] 生産培地としては、 M9—力ザミノ酸培地、 LB培地など、大腸菌を培養するために 通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクター のマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
[0091] 目的のタンパク質またはこれを含む融合タンパク質を回収するには、以下の方法な どがある。 目的タンパク質あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶ィ匕されていれ ば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。 さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により、 目的タンパク質あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この 場合、 目的タンパク質あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる 。タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶ィ匕し、変性剤を透析 等により除去して目的タンパク質を得ることができる。
実施例
[0092] 以下、本発明について実施例を示しより詳細に説明するが、本発明は下記実施例 に制限されるものではな 、。
[0093] 実施例 1： 2—メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性の検出
Nutrient Broth寒天培地（Difco社）で、表 4に示した微生物をそれぞれ 30°C、 2 4時間培養した。得られた各微生物の菌体を 3mlの Nutrient Broth液体培地に 1 白金耳接種し、 30°C、 120往復 Z分で 24時間培養した。得られた培養液 0. 15mlを 0. 2% α—メチルー DL セリンを含む 3mlの Nutrient Broth液体培地に接種し、 30°C、 120往復 Z分で 24時間培養した。
[0094] 培養後、菌体を遠心分離し、培養液と等量の 0. ImMピリドキサールリン酸を含む 50mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 4)で菌体を 2回洗浄した。 0. ImMピリドキサ一 ルリン酸を含む 50mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 4)を用いて、全量 0. 3mlの菌体 懸濁液を調製し、 4°Cにて超音波破砕処理をした。遠心分離（16, 000g、 10分)で 得られる上清を 0. ImMピリドキサールリン酸を含む 50mMリン酸カリウム緩衝液 (p H7. 4)に対して透析し、無細胞抽出液とした。
[0095] 50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7. 4)、 10mM aーメチルー DL セリン、 0. lm Mピリドキサールリン酸、 ImM硫酸マグネシウムの組成を有する反応液 1に、 0. 0 5mlの無細胞抽出液を添カ卩して、全量 0. 1mlで 30°C、 10分間反応させた。ホルム ァノレデヒドキット テスト ヮコー（和光純薬工業）内のアルカリ試液（5N—水酸ィ匕カリ ゥム）を 0. 1ml混和させることで反応を停止した。以降、キット付帯のマニュアルに従 い、ホルムアルデヒドの検出反応を行い、 550nmの吸光度を測定した (El l)。なお 、対照として前記反応液 1において α—メチルー DL セリンの代わりに水を添カロ したもので行った反応によって得られる反応液の吸光度 (E10)を同様に測定し、 a -メチル DL セリン特異的な吸光度変化 (E Δ 1 = E 11 E 10)を算出し、表 4に 示した。以上の結果より、 2—メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性が確 f*i¾ れ 。
[0096] [表 4] 表 4
Figure imgf000037_0001
実施例 2 :Ralstonia sp. Al l株（AJ110405)由来 2—メチルセリンヒドロキシメ チルトランスフェラーゼの精製
(1)無細胞抽出液の調製
Nutrient Broth寒天培地（Difco社）で 30°C、 25. 5時間培養したラルストニア' スピーシーズの菌体を 500ml容の坂口フラスコ内の 50mlの Nutrient Broth液体 培地に接種し、 30°C、 120往復 Z分で 21時間培養した。得られた培養液を 0. 2% α メテル一 DL セリン、 0. 17% Yeast Nitrogen Base w/ o amino aci d and ammonium sulfate (pH7. 0)液体培地 2Lに接種し、 500ml容の坂ロフ ラスコに 100mlずつ分注し、 30°C、 120往復 Z分で 24時間培養した。得られた菌体 を遠心分離（8, 000g、 10分）により集菌し、 0. 02mMピリドキサールリン酸を含む 2 5mMトリス塩酸緩衝液 (pH8. 0)で 2回洗浄し、 50mlの菌体懸濁液を調製した。超 音波破砕処理により菌体を破砕し、遠心分離（18, 000g、 10分)で得られる上清を 超遠心分離（200, 000g、 30分)を行い、同緩衝液を用いて透析し、無細胞抽出液 を得た。
[0098] (2)陰イオン交換クロマトグラフィー
上記（1)にて得られた無細胞抽出液を予め 0. 02mMピリドキサールリン酸を含む 2 5mMトリス塩酸緩衝液 (pH8. 0)で平衡化した ResourceQカラム（アマシャムバイオ サイエンス製）にアプライし、 0—1M塩ィ匕ナトリウムの直線的濃度勾配により酵素を溶 出した。なお、この操作は無細胞抽出液を 1Z3づっ 3回に分けて行った。
[0099] (3)疎水性相互作用クロマトグラフィー
上記（2)で得られた酵素の活性画分を 0. 02mMピリドキサールリン酸を含む 25m Mリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 4) (以下、緩衝液 Iとする）に透析し、等量の 2M硫酸 アンモ-ゥムを含む緩衝液 Iと混和し、予め 1M硫酸アンモ-ゥムを含む緩衝液 Iと平 衡化した Phenyl— Sepharoseカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし 1 0M硫酸アンモ-ゥムの直線的濃度勾配により、酵素を溶出した。
[0100] (4)ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
上記（3)で得られた酵素の活性画分を 0. 02mMピリドキサールリン酸を含む 2. 5 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0)に透析し、予め同緩衝液で平衡ィ匕された Cellul ofineHApカラム（生化学工業製）にアプライした。 2. 5— 500mMのリン酸カリウム 緩衝液 (PH7. 0)にて酵素を溶出させた。
このようにして得られた酵素の活性画分は、比活性 0. 72UZmgであり、 SDS ポ リアクリルアミド電気泳動に供し、クーマシーブリリアントブルー染色液でゲルを染色さ せたところ、分子量約 47, 000の位置に均一なバンドが検出された。
[0101] 実施例 3 :Ralstonia sp. Al l株（AJ110405)由来 2—メチルセリンヒドロキシメ チルトランスフェラーゼのアミノ酸配列およびコードする塩基配列の決定
実施例 2で調製した精製酵素 lOOpmol相当を SDS -ポリアクリルアミド電気泳動 後、 PVDF膜に転写し、プロテインシーケンサーに供し、 30アミノ酸を決定した (配列 番号 1)。
[0102] 次いで、 Ralstonia sp. AJ110405のゲノム DNA5 gを SalI (75U)にて切断し た後、 TaKaRaLA PCR in vitro Cloning Kitのマニュアル記載の方法に従つ て、 Sailカセットとライゲートした。ライゲートミックスを铸型として、カセットプライマー C 1とプライマー ALD— RV— S1 (配列番号 2)の組み合わせによって PCR (94°C： 30 秒、 47°C : 2分、 72°C : 1分、 30サイクル）を行った。次いでこの PCR反応液を铸型と して 2回目の PCR(94°C： 30秒、 55°C： 2分、 72°C： 1分、 30サイクル）をカセットプラ イマ一 C2とプライマー ALD— RV— S2 (配列番号 3)を用いて行った。増幅が確認さ れた約 0. 7kb長の断片を pGEM— Teasy (プロメガ社）にライゲートし、 Escherichi a coli JM109を形質転換した。約 0. 7kbの断片について塩基配列を決定したとこ ろ目的タンパク質の N末端アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。このプ ラスミドを EcoRlZSphl処理して得られる約 0. 3kb長の遺伝子断片をプローブとし て、染色体 DNAを各種制限酵素処理後、サザン解析したところ、 Sphl処理した場合 に約 2. 4kbにポジティブシグナノレを確認した。
[0103] 次いで、染色体 DN Aを Sphl処理後、ァガロース電気泳動し、約 2. 5kb断片を精 製し、 pUC18の Sphlサイトにライゲートした。この反応液をもちいて Escherichia c oli JM109を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニー ハイブリダィズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られた プラスミドを PSKA04098として、挿人酉己歹 IJにつ！/、て塩基酉己歹 IJを決定したところ、 438 アミノ酸をコードする ORFが存在した（配列番号 4)。
[0104] 実施例 4 : Ralstonia sp. Al l株（AJ110405)由来 2—メチルセリンヒドロキシメ チルトランスフェラーゼ遺伝子の Escherichia coliによる発現
PSKA04098を铸型として、プライマー Ral Eco (配列番号 6)、およびプライマー Ral— ter— Pst (配列番号 7)をもち、、て PCRにより 2—メチルセリンヒドロキシメチルト ランスフェラーゼ遺伝子の ORF領域 1. 3kbを増幅し、 EcoRl/Pstl処理した後、予 め EcoRlZPstl処理した pUC18とライゲートし、 Escherichia coli JM109を开質 転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミド (pRal2)を有する形質転換体を得た。こ の形質転換体を JM109ZpRal2と命名した。
[0105] JM109/pRal2を lOOmg/1のアンピシリンを含む LB培地で 37°C、 16時間前培 養した。 0. 15mlの前培養液を 3mlの lOOmgZlのアンピシリンを含む LB培地に接 種し、 37°Cで培養を行った。培養 1時間後、終濃度 ImMとなるように IPTGを添加し 、さらに 4時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、 0. ImMピ リドキサールリン酸を含む 50mM 燐酸緩衝液 (pH7. 4)を用いて洗菌し、同緩衝液 0. 3mLを用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、 遠心分離（18, 000g、 10分、 4°C)により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、 2 ーメチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、 0. 03U/m gであった。なお、 pUC18を JM109に導入した形質転換体; JM109ZPUC18を用 V、上記の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は検出限界以下であつ た。
[0106] 実施例 5 : Ralstonia sp. Al l株（AJ110405)由来 2—メチルセリンヒドロキシメ チルトランスフェラーゼによる aーメチルー Lーセリン生成反応
lOOmMホルムアルデヒド、 lOOmML—ァラニン、 0. ImMピリドキサールリン酸、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH7. 4)力もなる溶液に実施例 2で調製した精製酵素溶液 を 50 μ 1添加し、 30°Cで 20時間反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスタ株 式会社製の特級ホルムアルデヒド液 [コード番号： 16223— 55]を用いた。反応終了 後、反応混合物 50 1に ImM硫酸銅水溶液を 100 1、水 50 1加え、 Sumichiral OA— 6100 (住化分析センター）により HPLC分析を行った (移動相： 0. 5mM硫酸 銅水溶液、カラム温度： 30°C、流速： lmlZ分、検出： UV215nm)。その結果 27. 5 mMの (Xーメチルー Lーセリンの生成が確認され、 (Xーメチルー D—セリンは検出限 界以下であった。なお、標準品としては、 Acros Organics社製の α—メチルー L— セジン [η—、番号：29001— 2500] aーメチノレー D—セジン [=f一 番号： 29002— 2500]を用いた。
[0107] 実施例 6 : Ralstonia sp. Al l株（AJ110405)由来 2—メチルセリンヒドロキシメ チルトランスフェラーゼ遺伝子発現 Escherichia coliによる α—メチルー Lーセリン 生成
JM109ZpRal2を lOOmgZlのアンピシリンを含む LB培地で 30°C、 24時間前培 養した後、アンピシリン lOOmgZl及び IPTGO. 5mMを含む LB培地 400mlで 34°C 、 16時間前培養した。培養液 400mlカゝら得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、 0. ImMピリドキサールリン酸を含む lOOmM 燐酸緩衝液 (pH7. 4)を用いて洗菌 した。得られた菌体を 100mlの反応液（300mML—ァラニン、 0. ImMピリドキサ一 ルリン酸、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH7. 4) )に懸濁した。この反応液に 30°Cにて 60 OmMホルムアルデヒド水溶液 50. 5mlを撹拌しながら 24時間かけて添カ卩した。なお 、ホルムアルデヒドはナカライテスタ株式会社製の特級ホルムアルデヒド液 [コード番 号： 16223— 55]を用いた。添加終了後、反応混合物 50 1に ImM硫酸銅水溶液 を 50 μ 1、水 100 μ 1加え、 SumichiralOA— 6100 (住化分析センター）により HPLC 分析を行った (移動相： 0. 5mM硫酸銅水溶液、カラム温度： 30°C、流速： lmlZ分、 検出： UV215nm)。その結果 27. Ommolの α—メチルー Lーセリンの生成が確認さ れ、 aーメチルー D—セリンは検出限界以下であった。
[0108] 実施例 7 : Variovorax paradoxus B2— B2株（AJ110406)由来 2—メチルセリ ンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ralstonia sp. AJ110405株由来 ORF領域を実施例 3と同様の方法により、 PCR により増幅した。この PCR産物をプローブとして、 Variovorax paradoxus B2— B 2株のゲノム DNAを Pstlによって処理した後、サザン解析を行ったところ、約 2kb長 にポジティブシグナノレが得られた。
[0109] 次いで、 Variovorax paradoxus B2— B2株のゲノム DNAを Pstl処理後、ァガ ロース電気泳動し、約 2kb断片を精製し、 pUCl 18の Pstlサイトにライゲートした。こ の反応液をもちいて Escherichia coli JM109を形質転換し、ライブラリーを作製し た。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダィズを行い、ポジティブコロニーを取 得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドを PUCB2— B2として、挿入配列につ いて塩基配列を決定したところ、 441アミノ酸力もなる ORF (配列番号 8)が存在する のを確認した。
[0110] 次に、 PTV118N (タカラバイオ製）を铸型として、プライマー pTV118N— Nde (配 列番号 10)、及び pTVl 18N— Ndec (配列番号 11)を使用して Quikchange site direct mutagenesis kit (プロメガ製）を用いて、 pTV118Ndを得た。 pUCB2— B2を铸型として、プライマー B2— B2— Nde (配列番号 12)、及び B2— B2— ter— P st (配列番号 13)により PCR反応により、得られた 1. 2kbの増幅断片を NdelZPstl 処理し、 pTV 118Ndの NdelZPstlサイトに挿入し、 pTVVHMTOlとした。このプラ スミドにより Escherichia coli JM109を形質転換した。この形質転換体を JM109 /pTVVHMTO 1と命名した。
[0111] JM109/pTVVHMT01を lOOmg/1のアンピシリン、 0. ImMの IPTGを含む L B培地で 37°C、 16時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、 0. 1 mMピリドキサールリン酸を含む 50mM 燐酸緩衝液 (pH7. 4)を用いて洗菌し、同 緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、 遠心分離（18, OOOg、 10分、 4°C)により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、 2 —メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定した。反応液組成 50m Mトリス塩酸緩衝液（pH8. 5)、 lOmM a—メチル— L—セリン、 0. ImMピリドキサ ールリン酸にて、反応温度 30°Cの条件で遊離するホルムアルデヒドの定量を行った ところ、 9mUZmgであった。なお、 pTV118Ndを JM109に導入した形質転換体; J M 109/pTV 118Ndより上記の方法で得られる無細胞抽出液を用 、た場合の活性 は検出限界以下であった。
[0112] 実施例 8 :Variovorax paradoxus NBRC15149由来 2—メチルセリンヒドロキシ メチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ralstonia sp. AJ110405株由来 ORF領域を実施例 3と同様の方法により、 PCR により増幅した。この PCR産物をプローブとして、 Variovorax paradoxus NBRC 15149のゲノム DNAを Pstlによって処理した後、サザン解析を行ったところ、 2kb長 にポジティブシグナノレが得られた。
[0113] 次いで、 Variovorax paradoxus NBRC 15149のゲノム DNAを Pstl処理後、 ァガロース電気泳動し、約 2kb断片を精製し、 pUC118の Pstlサイトにライゲートした 。この反応液をもちいて Escherichia coli JM109を形質転換し、ライブラリーを作 製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダィズを行い、ポジティブコロニーを 取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドを PUC15149として、挿入配列に ついて塩基配列を決定したところ、 440アミノ酸力 なる ORF (配列番号 14)が存在 するのを確認した。 pUC15149を铸型として、プライマー 15149— Nde (配列番号 1 6)、及び 15149— ter— Pst (配列番号 17)により PCR反応により、得られた 1. 2kb の増幅断片を NdelZPstl処理し、 pTV118Ndの NdelZPstlサイトに挿入し、 pTV VHMT02とした。このプラスミドにより Escherichia coli
Figure imgf000043_0001
この形質転換体を JM109ZpTVVHMT02と命名した。
[0114] JM109/pTVVHMT02を lOOmg/1のアンピシリン、 0. ImMの IPTGを含む L B培地で 37°C、 16時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、 0. 1 mMピリドキサールリン酸を含む 50mM 燐酸緩衝液 (pH7. 4)を用いて洗菌し、同 緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、 遠心分離（18, 000g、 10分、 4°C)により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、 2 —メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、 13mU/mg であった。
[0115] 実施例 9 :Variovorax paradoxus NBRC15150由来 2—メチルセリンヒドロキシ メチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ralstonia sp. AJ110405株由来 ORF領域を実施例 3と同様の方法により、 PCR により増幅した。この PCR産物をプローブとして、 Variovorax paradoxus NBRC 15150のゲノムDNAをPstIにょって処理した後、サザン解析を行ったところ、 2kb長 にポジティブシグナノレが得られた。
[0116] 次いで、 Variovorax paradoxus NBRC 15150のゲノム DNAを Pstl処理後、 ァガロース電気泳動し、約 2kb断片を精製し、 pUCl 18の Pstlサイトにライゲートした 。この反応液をもちいて Escherichia coli JM109を形質転換し、ライブラリーを作 製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダィズを行い、ポジティブコロニーを 取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドを PUC15150として、挿入配列に ついて塩基配列を決定したところ、 440アミノ酸力もなる ORF (配列番号 18)が存在 するのを確認した。 pUC15150を铸型として、プライマー 15150— Nde (配列番号 2 0)、及び 15150— 61：—?5 配列番号21)にょり130^反応にょり、得られた 1. 2kb の増幅断片を NdelZPstl処理し、 pTV118Ndの NdelZPstlサイトに挿入し、 pTV VHMT03とした。このプラスミドにより Escherichia coli
Figure imgf000044_0001
この形質転換体を JM109ZpTVVHMT03と命名した。
[0117] JM109/pTVVHMT03を lOOmg/1のアンピシリン、 0. ImMの IPTGを含む L B培地で 37°C、 16時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、 0. 1 mMピリドキサールリン酸を含む 50mM 燐酸緩衝液 (pH7. 4)を用いて洗菌し、同 緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、 遠心分離（18, 000g、 10分、 4°C)により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、 2 —メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、 36mUZmg であった。
[0118] 実施例 10 : Bosea sp. B2— R1株（AJ110407株）由来 2—メチルセリンヒドロキ シメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ralstonia sp. AJ110405株由来 ORF領域を実施例 3と同様の方法により、 PCR により増幅した。この PCR産物をプローブとして、 Bosea sp. B2— R1株 ゲノム D NAを Pstlによって処理した後、サザン解析を行ったところ、 5kb長にポジティブシグ ナルが得られた。
[0119] 次いで、 Bosea sp. B2—R1株のゲノム DNAを Pstl処理後、ァガロース電気泳 動し、約 5kb断片を精製し、 pUCl 18の Pstlサイトにライゲートした。この反応液をも ちいて Escherichia coli JM109を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プロ ーブを用いてコロニーハイブリダィズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミド を抽出した。得られたプラスミドを PUCB2—R1として、挿入配列について塩基配列 を決定したところ、 440アミノ酸力もなる ORF (配列番号 22)が存在するのを確認した 。 pUCB2—Rlを铸型として、プライマー B2—R1— Psh (配列番号 24)、及び B2— Rl— ter— Pst (配列番号 25)により PCR反応により、得られた 1. 2kbの増幅断片を PshBl/Pstl処理し、 pTV118の Ndel/Pstlサイトに挿入し、 pTVBHMTとした。 このプラスミドにより Escherichia coli JM109を形質転換した。この形質転換体を J M109ZpTVBHMTと命名した。 pUCB2— R1を铸型として、プライマー B2— R1 — Eco (配列番号 26)、及び B2— Rl— ter— Pst (配列番号 25)により PCR反応によ り、得られた 1. 2kbの増幅断片を EcoRl/Pstl処理し、 pUC18の EcoRl/Pstlサ イトに挿入し、 pUCBHMTとした。このプラスミドにより Escherichia coli JM109を 形質転換した。この形質転換体を JM109ZPUCBHMTと命名した。
[0120] JM109/pTVBHMTを lOOmg/1のアンピシリン、 0. ImMの IPTGを含む LB培 地で 37°C、 16時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、 0. ImM ピリドキサールリン酸を含む 50mM 燐酸緩衝液 (pH7. 4)を用いて洗菌し、同緩衝 液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心 分離（18, 000g、 10分、 4°C)により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、 2—メ チルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、 95mUZmgで あった。 JM109/pUCBHMTを lOOmg/1のアンピシリン、 0. ImMの IPTGを含 む LB培地で 37°C、 16時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、 0. ImMピリドキサールリン酸を含む 50mM 燐酸緩衝液 (pH7. 4)を用いて洗菌し 、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕 し、遠心分離（18, 000g、 10分、 4°C)により得られる上澄み液を無細胞抽出液とし て、 2—メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、 318m UZmgであった。
なお、 JM109ZpUC18より上記の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活 性は検出限界以下であった。
[0121] 実施例 l l : Silicibacter pomeroyi DSM15171由来 2—メチルセリンヒドロキシ メチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Silicibacter pomeroyi DSM15171株のゲノム DNAを铸型としてプライマー Si lici ATG EcoRI (配列番号 27)、及び Silici— ter— Pst (配列番号 28)により PC R反応を行い 1. 3kbの配列番号 29を含む増幅断片を得た。この断片を EcoRl/Ps tl処理し、 pUC18の EcoRlZPstlサイトに挿入し、 pUC18SHMTとした。このプラ スミドにより Escherichia coli JM109を形質転換した。この形質転換体を JM109 ZpUCSHMTと命名した。
[0122] JM109ZpUCSHMTを lOOmgZlのアンピシリン、 0. ImMの IPTGを含む LB培 地で 37°C、 16時間前培養した。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、 0. ImM ピリドキサールリン酸を含む 50mM 燐酸緩衝液 (pH7. 4)を用いて洗菌し、同緩衝 液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心 分離（18, OOOg、 10分、 4°C)により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、 2—メ チルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定した。反応液組成 50mMトリ ス塩酸緩衝液（PH7. 4)、 lOmM a—メチル— L—セリン、 0. ImMピリドキサールリ ン酸にて、反応温度 30°Cの条件で遊離するホルムアルデヒドの定量を行ったところ、 190mUZmgであった。
[0123] 次いで、 Silicibacter pomeroyi DSM15171染色体DNAを铸型としてプラィ マー Silici ATG pQE30 BamHI (配列番号 34)、 Silici— ter— Pst (配列番号 28)により配列番号 29を含む約 1. 3 kb長の PCR産物を得た。次いで、 BamHI— Pstlにて消化することにより得られる DNA断片を pQE30ベクター（QIAGEN社）の BamHI - Pstlサイトに挿入した。これにより 5'末端に 6 X Hisが融合した 2—メチル セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを生成することのできるプラスミドが得られ、こ れを PQE30SHMTと命名した。このプラスミドにより Escherichia coli JM109を 形質転換した。この形質転換体を JM109ZPQE30SHMTと命名した。
[0124] 得られた形質転換体を 100mg/Lアンピシリンを含む LB培地（LB+amp)で 30°C にて 14hr培養し、 ImM IPTGを添カ卩しさらに 3hr培養した。得られた菌体を遠心分 離にて集菌した後、 0. ImMピリドキサールリン酸を含む 50mM 燐酸緩衝液 (pH7 . 4)を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理に よって、菌体を破砕し、遠心分離（18, 000g、 10分、 4°C)により得られる上澄み液を QIAexprssionist (QIAGEN社）を用い添付プロトコールに従って精製した。得られ たタンパク質を His融合 SHMTとした。
[0125] 得られた His融合 SHMTを用いて、 10mMホルムアルデヒド、 lOOmM L—ァラ- ン、 0. ImMピリドキサールリン酸、 lOOmMリン酸緩衝液（pH7. 4)力らなる 100 L の溶液にて、 30°Cで 10分間反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスタ株式 会社製の特級ホルムアルデヒド液 [コード番号： 16223— 55]を用いた。反応終了後 、反応混合物 100 μ 1に ImM硫酸銅水溶液を 200 μ 1加え、 SumichimlOA—610 0 (住化分析センター）により HPLC分析を行った (移動相： 0. 5mM硫酸銅水溶液、 カラム温度： 30°C、流速： lmlZ分、検出： UV215nm)。その結果、 0. 367mMの α—メチルー Lーセリンの生成が確認され、 α—メチルー D—セリンは検出限界以下 であった。
[0126] 実施例 12 :Variovorax paradoxus由来 2—メチルセリンヒドロキシメチルトランス フェラーゼ遺伝子発現 Escherichia coliによる α—メチルー Lーセリン生成
上記の実施例の方法で作製し: feJM109ZpTWHMT01、JM109ZpTWHM T02、JM109ZpTVVHMT03をそれぞれ、 lOOmgZlのアンピシリン、及び 0. lm Mを含む LB培地で 37°C、 16時間前培養した。培養液 100mlから得られた菌体を遠 心分離にて集菌した後、 0. ImMピリドキサールリン酸を含む lOOmM 燐酸緩衝液 (pH7. 4)を用いて洗菌した。
[0127] 得られた各菌体を 100mlの反応液（150mML—ァラニン、 0. ImMピリドキサール リン酸、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH7. 4) )に懸濁した。この反応液に 30°Cにて 300 mMホルムアルデヒド水溶液 50. 5mlを撹拌しながら 24時間かけて添カ卩した。なお、 ホルムアルデヒドはナカライテスタ株式会社製の特級ホルムアルデヒド液 [コード番号 : 16223— 55]を用いた。添加終了後、反応混合物 50 1に ImM硫酸銅水溶液を 5 0 1、水 100 1加え、 SumichiralOA— 6100 (住化分析センター）により HPLC分 析を行った (移動相： 0. 5mM硫酸銅水溶液、カラム温度： 30°C、流速： lmlZ分、検 出： UV215nm)。その結果、表 5に示す α—メチルー Lーセリンの生成が確認され、 α—メチルー D—セリンはいずれの場合も検出限界以下であった。
[0128] [表 5]
表 5
Figure imgf000047_0001
[0129] 実施例 13 : Bosea sp. B2— Rl株（AJ110407株）由来 2—メチルセリンヒドロキ シメチルトランスフェラーゼ発現株の作成
Escherichia coli W3110染色体 DNA上の trpオペロンのプロモータ領域を、 配列番号 31、配列番号 32に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCRにより 0 . 3kbの断片を増幅し、得られた DNA断片を pGEM— Teasyベクター（プロメガ製） にライゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液で E. coli JM109を形質
転換し、アンピシリン耐性株の中力も trpプロモータの方向力lacプロモータと反対向 きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドを EcoOl 091/EcoRIにて処理して得られる trpプロモータを含む DNA断片と、 pUC19 (Tak am製）の EcoO109lZEcoRI処理物とライゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液 で Escherichia coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプ ラスミドを有する株を選択した。このプラスミドを HindlllZPvuIIにて処理して得られ る DNA断片と、 pKK223 3 (Amersham Pharmacia製）を HindlllZHincIIに て処理し、得られた TrrnBターミネータを含む 0. 7kbの DNA断片とライゲーシヨンし た。このライゲーシヨン溶液で Escherichia coli JM109を形質転換し、アンピシリ ン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドを ptrp2とした 。この ptrp2を铸型として、プライマー（配列番号 31、配列番号 33)を用いて trpプロ モータ領域を含む 0. 3kbの断片を増幅した。この PCR産物と ptrp2のプロモータ領 域を置換することを目的に、 PCR産物を EcoO109lZNdeI消化によって得られる断 片を ptrp2の EcoRO109lZNdeI処理物とライゲーシヨンし Escherichia coli JM 109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し た。このプラスミドを ptrp4とした。さらに、 pTWV228 (TaKaRa製）を Ndelで処理し た後に末端の平滑ィ匕処理を行い、次いで Aatllで処理し 1. 9kbの断片を得た。この 断片に、 ptrp4を Aatll/Hindlllで処理した 0. 4kbの断片と pKK223— 3を PvuII ZHindlllで処理した 0. 7kbの断片とライゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液で Escherichia coli JM109を形質転換し、アンピシリン而性株の中から目的のプラ スミドを有する株を選択しこのプラスミドを ptrp 13とした。
Bosea sp. B2— R1株のゲノム DNAを铸型として、プライマー B2— Rl— Psh (配 列番号 24)、及び B2— Rl ter Pst (配列番号 25)により PCR反応により、得られ た 1. 2kbの増幅断片を PshBlZPstl処理し、 ptrpl3の NdelZPstlサイトに挿入し 、 ptrpl3BHMTとした。このプラスミドにより Escherichia coli JM109を开質転換 した。この形質転換体を JM109Zptrpl3BHMTと命名した。
[0131] 上記で得られ^ JM109Zptrpl3BHMTをアンピシリン（100 μ g/ml)を含む LB 寒天倍地（ペプトン 10gZl、酵母エキス 5gZl、 NaCllOgZD上で 30°C、 24時間培 養した。次に 1Z8プレート分の細胞を 50mLの LB培地（ペプトン 10gZl、酵母ェキ ス 5gZl、 NaCllOg/1)に移した。シェーカー（120rpm)を用いて 30°C、 16時間培 養した培養液 lml分を以下に示す組成の培地 300mlに植菌し、 1. 01の容量の実験 室用フアーメンター内で 700rpmの回転数で攪拌通気（lZlvvm)しながらバッチ培 養を行った。糖切れ後の培養液 15ml分を同じ組成の培地 300mlに植菌し、同様の フアーメンターによる攪拌通気（l/lwm)、 35°Cで糖フィード培養を行った。 pHは 気体アンモニアで自動的に 7. 0に調整した。
[0132] 培地の組成 (gZD
Glucose 25. 0
MgSO · 7Η Ο 1. 0
4 2
(ΝΗ ) SO 5. 0
4 2 4
Η ΡΟ 3. 5
3 4
FeSO 7aq 0. 05
4
MnSO 7aq 0. 05Thiamine HC1 0. 001
4
Pyridoxyne HC1 0. 01
GD113 0. 1
アンピシリン 0. 1
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。他の組成分の pHは KOHで 5. 0 に調整した。
フィード糖液の組成 (gZD
Glucose 500. 0
pH 無調
[0133] 実施例 14 : Bosea sp. B2— R1株（AJ110407株）由来 2—メチルセリンヒドロキ シメチルトランスフェラーゼによる α メチル Lーセリンの生成
上記の実施例 13で作製し^ JM 109/ptrp 13BHMTの培養液 30mlを用いて α メチル Lーセリン生成反応を行った。 300mlの反応液（ 1200mML ァラニン、 0. ImMピリドキサールリン酸、 lOOmMリン酸緩衝液（pH7. 4) , JM109/ptrpl3 BHMTの培養液 10%)に 30°Cにて 2400mMホルムアルデヒド水溶液 150mlを撹 拌しながら 48時間かけて添カ卩した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスタ株式会 社製の特級ホルムアルデヒド液 [コード番号： 16223— 55]を用いた。添加終了後、 反応混合物 50 μ 1に ImM硫酸銅水溶液を 950 μ 1加え、水で 5倍希釈して Sumichi ralOA—6100 (住化分析センター）により HPLC分析を行った（移動相： 0. 5mM硫 酸銅水溶液、カラム温度： 30°C、流速： lmlZ分、検出： UV215nm)。その結果、 32 7. 3mmolの α メチル L セリンの生成が確認され、 α メチル—D セリンは いずれの場合も検出限界以下であった。
[0134] 実施例 15 : α メチル L セリンの精製
実施例 14で作成した反応溶液から遠心分離により簡単に除菌を行った。得られた 反応溶液 451g メチル L セリン： 9. 08%)に硫酸 3. 3gをカ卩え、 pHを 3に調 整し、 50°Cにて 1時間、溶存タンパクの加熱凝集を行った。これを 0. 2 mの MF て、ろ過を行い、残渣洗浄水を含め、 482gの溶液 メチル L セリン： 8. 45 %、 D—ァラニン： 0. 13%、 L ァラニン： 0. 08%)を得た。この溶液の内 165gを採 り、 5%の α—メチルー Lーセリン濃度となる様、水で希釈した後、 Η型の強酸性カチ オン交換榭脂 (バイエル製 レバチット S— 1468) 120mlを充填した榭脂塔にフィー ドし、 α メチル—L セリンを吸着させた。榭脂量の 2倍量の水を貫流して洗浄した 後、 1Mのアンモニア水を用いて溶離を行い、 3528 ( 0；—メチルーしーセリン含量:約 3. 8%)の水溶液を得た。
[0135] この溶液を、減圧下、濃縮を行 、、アンモニアを概ね留去した。この時の溶液の ΡΗ は約 8. 2であり、残るカチオン類を除去する為、この溶液を Η型の弱酸性カチオン交 換榭脂 (IONAC A- 365) 20mlを充填した榭脂塔に貫流させ、洗浄液も含め、 p H5. 2の 204gの貫流液を得た。続けて、この貫流液を濃縮し、結晶が析出し始めた 段階で濃縮を止めた。この時の溶液重量は、 35. 55g ( Q; メチル L セリン： 37. 2%)であり、ここに室温下、 67gのメタノールを添加することにより、貧溶媒添加晶析 を行った。この後、撹拌下 10°Cにて 1時間熟成した後、結晶分離を行い、 75%メタノ ール水溶液 12gを用いて結晶を洗浄した。得られた湿結晶を、 40°Cで 2時間減圧乾 燥し、 12. 13gの乾燥結晶を得た。 ひ メチル—L—セリン含量は、市販試薬を標品 として 100. 7%であり、不純物としては、 D ァラニン： 0. 06%、 L ァラニン： 0. 05 %を含有していた。
実施例 16 : Bosea sp. 由来 2—メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺 伝子発現 Escherichia coliによる α—ェチルー Lーセリン生成
JM 109ZpUCBHMTを酵素菌体として 100mlの反応液（ 150mM L— 2 アミ ノー n—酪酸、 0. ImMピリドキサールリン酸、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH7. 4) )に懸 濁した。この反応液に 30°Cにて 300mMホルムアルデヒド水溶液 50. 5mlを撹拌し ながら 24時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスタ株式会社製 の特級ホルムアルデヒド液 [コード番号： 16223— 55]を用いた。菌体分離（8, OOOg 、 lOmin)を行った反応液（50ml ： a—ェチルーセリンとして 632mg、 4. 75mmol 含有）を、予め 50mlのメタノールでの活性化、及び 100mlの H Oでの平衡化を行つ
2
た Mega Bond Elut SCX (10G) (Varian, Inc)にアプライした。 100mlの 水で洗浄した後、 50mlの 0. 5N— HC1で溶出し、 2. 5mlずつ分取した。各分取画 分を HPLC分析によって a—ェチルーセリン Z (a—ェチルーセリン + L— 2—アミ ノー n 酪酸)の存在比を確認し、存在比 > 99%である画分を分離画分とした。非分 離画分については濃縮乾固した後、 10ml程度の水に溶解し、 NaOHで pH7. 0付 近に調整し、再び上記の条件で分離を行った。この操作を 2回繰り返し、分離画分を 集めて、濃縮乾固した。 100ml程度の水に溶解し、陰イオン交換榭脂 (DEAE— eel lulose, whatman)を添カ卩して、 pHを 6. 0付近に調整した。その後、榭脂をろ過に よって取り除き、ろ液に対してアセトンを滴下し、結晶を析出させ、乾燥し、白色の結 晶を得た（348mg、 2. 6mmol)。 NMR ^ベクトルと ESI— MS分析によって、構造を 確認後、 日本分光製旋光度計 (DIP— 370)により旋光度を測定した（[a] 20= S.
D
4±0. 4 (c = l, 5N— HC1)、 [a] 2。=一 4· 5±0· 04 (c = 10, 5Ν— HC1) )。
D
文献記載値と比較することにより、酵素反応の主生成物は（一）体、すなわち（S)体で あること力 S確認された（Journal of Peptide Science, 2001, 7, 619— 625 及び Tetrahedron Letters, 1988, 29, 235— 238)。
[0137] また菌体分離（8, 000g、 lOmin)を行った反応液（25ml ： a—ェチルーセリンと して 316mg、 2. 38mmol含有）に 5mmolの NaHCOを添加し、氷冷下で ρΗ9. 5
3
に調整した。 10mlのアセトンに溶解させた 2. 38mmolのべンゾイルク口リドを lhrか けて、 pHを 9— 10に保ちながら、滴下した。その後、室温で 3hr反応させた後、 HC1 をカロえることで pH2. 0に調整させた。 EtO Ac (10ml x 3)抽出、 MgSOによる脱
4 水処理後、濃縮乾固させた。 HPLC分析によって安息香酸が大量に含まれていたこ と力らメタノーノレに溶解させ、 TLC (PLC plate 20 x 20cm, Silica gel 60 F , 2mm (Merck)、展開溶媒： EtO Ac / AcOH = 20 / 1)によって
254
分離し、 uv照射による確認を行って、シリカゲルをプレートから搔き取り、メタノール（ 100ml)で抽出し、濃縮乾固し、白色の結晶を得た。少量の水をカ卩え、 NaOHで pH 8. 0付近に調整することで溶解させ、次いで HC1を滴下して、 pH2. 0付近に調整す ることで再結晶させた。結晶をろ過分離し、乾燥させた後、少量の 2—プロパノールに 溶解させ、へキサンを滴下することで再結晶させ、 l lOmgの標品を得た (0. 46mmo D o HPLC分析は 99% areaであり、 NMR ^ベクトルと ESI— MS分析によって構造 の確認を行い、旋光度測定を行った（[a] 20=— 11. 4 ±0. 2 (c = l, メタノール）
D
)。文献記載値と比較することにより酵素反応の主生成物は（一）体、すなわち（S)体 であることが確認された (Journal of Peptide Science, 2001, 7, 619— 6 25)。
[0138] 実施例 17 :Ralstonia sp. Al l株（AJ110405)由来 2—メチルセリンヒドロキシメ チルトランスフェラーゼによる α—メチルスレオニン生成
51mMァセトアルデヒド、 50mML—ァラニン、 0. ImMピリドキサールリン酸、 100 mMリン酸緩衝液 (pH7. 4)カゝらなる溶液に実施例 2で調製した精製酵素溶液を 50 1添加し、 30°Cで 17. 5時間反応した。反応終了後、遠心分離（18, 000g、 10分、 4°C)により得られる上澄み液の ESI— MS分析を行ったところ、 α—メチルスレオ- ンの分子イオンピークが観測された。
産業上の利用可能性 [0139] 本発明はアミノ酸の製法に係る産業において有用である。本発明は、各種のセリン 誘導体、光学活性アミノ酸の製造に寄与し、例えば医薬中間体などの製法として利 用されることが期待される。
配列表フリーテキスト
[0140] 配列番号 1 :プライマー
配列番号 2 :プライマ
配列番号 3 :プライマ
配列番号 6 :プライマ
配列番号 7 :プライマ
配列番号 10 プライマ
配列番号 11 プライマ
配列番号 12 プライマ
配列番号 13 プライマ
配列番号 16 プライマ
配列番号 17 プライマ
配列番号 20 プライマ
配列番号 21 プライマ
配列番号 24 プライマ
配列番号 25 プライマ
配列番号 26 プライマ
配列番号 27 プライマ
配列番号 28 プライマ
配列番号 31 プライマ
配列番号 32 プライマ
配列番号 33 プライマ
配列番号 34 プライマ

Claims

請求の範囲 酵素の存在下で、式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000054_0001
(式 (I)において、 R1は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭 素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜： L 1のァ ルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭 素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの基は直 鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ!/、）
に示される L— a アミノ酸と、下記式 (Π)：
[化 2]
Figure imgf000054_0002
(式 (Π)において R2は、水素、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール 基、炭素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜1 1のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれ らの炭素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの 基は直鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ 、） に示されるアルデヒドとを反応させる、式 (ΠΙ)：
[化 3]
Figure imgf000054_0003
(式 (ΠΙ)における R1は、式 (I)中の R1と同じであり、式 (III)における R2は式 (Π)中の R 2と同じ） に示される Lーセリン誘導体の製造方法。
[2] 前記酵素が、ラルストニア（Ralstonia)属、バリオボラックス (Variovorax)属、ボセァ（
Bosea)属およびシリシパクター（Silic¾acter)属からなる群より選ばれる 、ずれかの属 に属する微生物に由来する、請求項 1に記載の Lーセリン誘導体の製造方法。
[3] 前記酵素が、下記 (A)〜(L)からなる群より選ばれる 1種または 2種以上のタンパク 質である、請求項 1に記載の Lーセリン誘導体の製造方法。
(A)配列番号 5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号 5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、力 つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(C)配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号 9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、力 つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(E)配列番号 15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号 15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(G)配列番号 19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号 19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(I)配列番号 23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
C 配列番号 23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、か つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(K)配列番号 30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(L)配列番号 30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
[4] 式 (I)で示されるアミノ酸力 L- α—ァラニンであり、式 (ΠΙ)で示される L セリン 誘導体が aーメチルー Lーセリンである、請求項 1から 3のいずれか一項に記載の L ーセリン誘導体の製造方法。
[5] 式 (I)で示されるアミノ酸力 L— 2—ァミノ一 n—酪酸であり、式 (III)で示される L— セリン誘導体が α—ェチル—L セリンである、請求項 1から 3のいずれか一項に記 載の Lーセリン誘導体の製造方法。
[6] 式 (I)で示されるアミノ酸力 L- aーァラニンであり、式 (III)で示される Lーセリン 誘導体が a—メチル— L—スレオニンである、請求項 1から 3のいずれか一項に記載 の Lーセリン誘導体の製造方法。
[7] ラルストニア（Ralstonia)属、ノ リオボラックス（Variovorax)属、ボセァ（Bosea)属およ びシリシパクター（Silidbacter)属カもなる群より選ばれるいずれかの属に属する微生 物に由来し、式 (I) :
[化 4]
Figure imgf000056_0001
(式 (I)において、 R1は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭 素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜： L 1のァ ルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭 素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの基は直 鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ!/、)
に示される L— a アミノ酸と、下記式 (Π)：
[化 5]
Figure imgf000057_0001
(式 (Π)において R2は、水素、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール 基、炭素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜1 1のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれ らの炭素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの 基は直鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ 、） に示されるアルデヒドとから、下記式 (ΠΙ)：
[化 6]
Figure imgf000057_0002
(式 (ΠΙ)における R1は、式 (I)中の R1と同じであり、式 (III)における R2は式 (Π)中の R 2と同じ）
に示される L セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。 式 (I) :
[化 7]
Figure imgf000057_0003
(式 (I)において、 R1は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭 素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜： L 1のァ ルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭 素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの基は直 鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ!/、)
に示される L— a アミノ酸と、下記式 (Π)：
[化 8]
Figure imgf000058_0001
(式 (Π)において R2は、水素、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール 基、炭素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜1 1のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれ らの炭素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの 基は直鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ 、） に示されるアルデヒドとから、下記式 (ΠΙ)：
[化 9]
Figure imgf000058_0002
(式 (ΠΙ)における R1は、式 (I)中の R1と同じであり、式 (III)における R2は式 (Π)中の R 2と同じ）
に示される Lーセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有する、下記 (A)〜（ L)の! ずれかのタンパク質。
(A)配列番号 5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号 5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 からなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、か つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(C)配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号 9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 からなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、か つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(E)配列番号 15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号 15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(G)配列番号 19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号 19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
(I)配列番号 23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
C 配列番号 23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位 力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、力 つ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有す るタンパク質
(Κ)配列番号 30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(L)配列番号 30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有 するタンパク質
[9] 請求項 8に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[10] 下記 (a)から (1)よりなる群力も選ばれるポリヌクレオチド。
(a)配列番号 4に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号 4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号 8に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号 8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号 14に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(f)配列番号 14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(g)配列番号 18に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(h)配列番号 18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a—アミノ酸と 式 (Π)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反 応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(i)配列番号 22に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(j)配列番号 22に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式 (II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(k)配列番号 29に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(I)配列番号 29に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下においてハイブリダィズし、かつ、式（I)の L— a アミノ酸と式
(II)のアルデヒドと反応させて、式 (III)に示される Lーセリン誘導体を生成する反応 を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[化 10]
Figure imgf000061_0001
(式 (I)において、 R1は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭 素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜： L 1のァ ルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭 素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの基は直 鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ!/、）
[化 11]
Figure imgf000061_0002
(式 (Π)において R2は、水素、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 6〜14のァリール 基、炭素数 3〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜1 1のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれ らの炭素骨格中に炭素 炭素不飽和結合を含む基力 なる群より選ばれ、これらの 基は直鎖であっても分岐して 、てもよく、さらに置換基を有して 、てもよ 、）
[化 12]
Figure imgf000061_0003
(式 (III)における R1は、式 (I)中の R1と同じであり、式 (III)における R2は式 (Π)中の R 2と同じ）
請求項 9または 10に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド
[12] 請求項 11に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体,
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