WO2006123537A1

WO2006123537A1 - 新規なエンドリボヌクレア－ゼ

Info

Publication number: WO2006123537A1
Application number: PCT/JP2006/308981
Authority: WO
Inventors: Masamitsu Shimada; Masanori Takayama; Yoko Tatsumi; Kiyozo Asada; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2005-05-16
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2006-11-23
Also published as: JPWO2006123537A1

Abstract

　新規なエンドリボヌクレア－ゼ活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、当該核酸を含んでなる組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡにより形質転換されてなる形質転換体、当該形質転換体を培養する工程および培養物中より上記ポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする上記ポリペプチドの製造方法、一本鎖ＲＮＡに上記ポリペプチドを作用させる工程を包含することを特徴とする一本鎖ＲＮＡ分解物の製造方法および一本鎖ＲＮＡの分解方法。

Description

新規なエンドリボヌクレア一ゼ

技術分野

[0001] 本発明は、遺伝子工学分野において有用な、新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼに関する。

背景技術

[0002] V、くつかの原核生物のプラスミドは、宿主でのプラスミドを維持するためにプラスミドが脱落した宿主を殺す post— segregation killing (PSK)の機能を有することが報告されている。これらのプラスミドにはトキシンアンチトキシン遺伝子が存在している。アンチトキシンは細胞内でトキシンと結合しトキシンを不活性ィ匕している力アンチトキシンはプロテアーゼに対して分解されやすく、アンチトキシンがプロテアーゼにより分解されると安定なトキシンが活性化される (非特許文献 1)。このようなトキシンーァンチトキシン遺伝子はほとんどの原核生物のクロモソームにも存在し、さまざまなストレスに対応し、 Programmed Cell Deathの機能を担っている。これらのトキシンの機能はまだすべて明らかになっていないが、 CcdBおよび ParEは DNA gyraseをタ一ゲットとして複製を制御し、 RelEおよび Docは転写を制御して、る可能性が示唆されている (非特許文献 1、 2)。

[0003] 大腸菌においては、 RelE、 ChpAK (MazF)、 ChpBK、 YoeB、 YafQの少なくとも 5つのトキシンが存在する（非特許文献 2)。 Christensenらは、 RelEがリボソーム依存的に 3塩基の特定のコドンを認識して mRNAを切断するエンドリボヌクレアゼであることを報告している（非特許文献 3、 4)。また Christensenらは、 ChpA ：、 ChpB Kおよび YoeBも同様にリボソームおよびコドン依存的に mRNAを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを報告している（非特許文献 5、 6)。

[0004] 一方、井上らは、 MazF (ChpAK)は、リボソーム非依存的に ACAの特定の塩基を認識して mRNAを切断するエンドリボヌクレア一ゼであることを証明している（非特許文献 7、 8)。また、 Munoz— Gomezらは、 mazFの RNA切断の特異性は NACであると報告している（非特許文献 9)。さらに、井上らは、プラスミド R100に存在する Pe mKが UAH (Hは C, Aまたは U)の特定の塩基を認識して mRNAを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを証明している（特許文献 1、非特許文献 10)。以上のように、 RelEや PemKファミリーのトキシンは塩基特異的に mRNAを切断するエンドリボヌクレア一ゼである可能性が示唆されてきた。特に PemKファミリーのトキシンは、リボソーム非依存的に特定の塩基を認識して mRNAを切断するエンドリボヌクレアゼである可能性がある。 PemKファミリーのトキシンは、原核生物に多く存在し、その配列の比較はよく研究されて、る (非特許文献 1、 11)。

[0005] また、 Anantharamanらは、トキシンの遺伝子情報およびゲノム解析が終了した生物の遺伝子情報をもとに Gene neighborhood analysisを行い、トキシンを系統的に分類し、さらに未知の機能のタンパクについてもトキシン様プロテインを予測した（非特許文献 12)。さらに解析を通して、 RelEや PemKのみならず、 Docファミリーおよび PINドメインを有するタンパクがリボヌクレアーゼ活性を有する可能性を示唆している。

[0006] 核酸を配列特異的に切断する酵素は、二本鎖 DNAを切断する制限酵素は数多く見出されており、遺伝子工学分野で広く利用されている。一本鎖 RNAを配列特異的に切断する酵素は、 G塩基を特異的に切断するリボヌクレアーゼ T1が見出されており、遺伝子工学で利用されているが（非特許文献 13)、一本鎖 RNA内の複数の塩基を認識して特異的に切断する酵素は未だ数少なぐ遺伝子工学分野ではそのようなエンドリボヌクレアーゼの開発が望まれている。 MazFのような 3塩基配列あるいはそれ以上の塩基数を特異的に認識して切断するエンドリボヌクレアーゼが発見されれば、遺伝子工学分野で有用な酵素となると考えられる。

[0007] 特許文献 1：国際公開第 2004Z113498号パンフレット

非特許文献 1 :ジャーナル'ォブ 'バタテリォロジ一 (J. Bacteriol. )、第 182卷、 p5 61 - 572 (2000)

非特許文献 2 :サイエンス（Science)、第 301卷、 pl496— 1499 (2003) 非特許文献 3 :モレキュラ^ ~·マイクロバイオロジー（Molecular Microbiol. )、第 48 卷、 pl389— 1400 (2003)

非特許文献 4:セル（Cell)、第 122, 131— 140 (2003) 非特許文献 5:ジャーナル'ォブ 'モレキユラ一'バイオロジーお Mol. Biol. )、第 332卷、 p809-819(2003)

非特許文献 6:モレキユラ一'マイクロバイオロジー、第 51卷、 pl705— 1717(, 200 4)

非特許文献 7:モレキユラ一 ·セル（Molecular Cell)、第 12卷、 p913— 920, 200 3)

非特許文献 8:ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem. )、第 80卷、 p3143-4150(2005)

非特許文献 9:フエブス'レターズ (FEBS Letters)、第 567卷、 p316— 320(2004 )

非特許文献 10:ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー、第 279卷、 p20678 -20684(2004)

非特許文献 11:ジャーナル'ォブ'モレキユラ一'バイオテクノロジーお Mol. Biot enol. )、第 1卷、 p295— 302(1999)

非特許文献 12:ゲノム'バイオロジー（Genome Biology)、第 4卷、 R81(2003) 非特許文献 13:メソッズ'イン'ェンザィモロジ一（Method in Enzymology)、第 3 41卷、 p28-41(2001)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明の目的は、上記従来技術を鑑みて行われたものであり、新規な配列特異的エンドリボヌクレア一ゼを見出すことであり、その新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼの切断配列の特異性を同定し、遺伝子工学への利用を提供することにある。課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、配列特異的なエンドリボヌクレア—ゼをスクリーニングし、 Neisseria meningitides由来の NMB2038ホモログが新規な配列特異的エンドリボヌクレア

—ゼであることを見出した。さらに該酵素の切断配列の特異性を同定し、本発明を完成させた。

[0010] すなわち、本発明は、〔1〕配列表の配列番号 4記載のアミノ酸配列、または該配列において 1個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列で示され、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、〔2〕〔1〕のポリペプチドをコードする核酸、

〔3〕配列表の配列番号 3記載の塩基配列を有することを特徴とする〔2〕の核酸、〔4〕〔2〕または〔3〕の核酸にストリンジェントな条件でノ、イブリダィズ可能であり、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、〔5〕〔2〕〜〔4〕 V、ずれ力 1項に記載の核酸を含んでなる組換え DNA、

〔6〕 [5]の組換え DNAにより形質転換されてなる形質転換体、

〔7〕〔6〕の形質転換体を培養する工程、および該培養物中より配列特異的な RNA 切断活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする〔1〕のポリペプチドの製造方法、

〔8〕一本鎖 RNAに〔1〕のポリペプチドを作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖 RNA分解物の製造方法、および

〔9〕一本鎖 RNAに〔1〕のポリペプチドを作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖 RNAの分解方法、

に関する。

発明の効果

[0011] 本発明により、新規な配列特異的エンドリボヌクレア—ゼを見出し、その新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼの切断配列の特異性を同定し、遺伝子工学への利用を提供することが可能となる。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 1.本発明のポリペプチド

本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号 4記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において 1個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも 1 つを有するアミノ酸配列で示され、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことを特徴とする。

[0013] 本発明のポリペプチドが有している活性は、一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌタレァーゼ活性であり、構成塩基としてリボヌクレオチドを含有する一本鎖核酸中の、リボヌクレオチドの 3 '側のリン酸ジエステル結合を加水分解することができる。前記活性により加水分解された核酸は、水酸基を有する 3 '末端とリン酸基を有する 5'末端、リン酸基を有する 3'末端と水酸基を有する 5'末端、もしくは 2' , 3'サイクリックホスフエートと水酸基を有する 5'末端を生じる。

[0014] 本発明のポリペプチドの基質としては、少なくとも 1分子のリボヌクレオチドを有する核酸であればよぐ例えば RNA、デォキシリボヌクレオチドを含有する RNA、リボヌクレオチドを含有する DNA等が例示される力これらに限定されるものではない。前記の基質は、本発明のポリペプチドの作用を阻害しない範囲で通常の核酸中に含有されているものとは異なるヌクレオチド、例えばデォキシイノシン、デォキシゥリジン、ヒドロキシメチルデォキシゥリジン等を含有して、てもよ、。

[0015] また、本願発明のポリペプチドは一本鎖核酸に特異的に作用する。二本鎖核酸、例えば二本鎖 RNA、 RNA— DNAノヽイブリツド等は切断することができな!/、。

[0016] 本発明のポリペプチドは核酸をその塩基配列特異的に切断する活性を有することを特徴とする。本発明を特に限定するものではないが、例えば配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、一本鎖 RNA分子中に 5'— GAACU— 3'の配列が存在した場合、当該配列の 2つの A残基間のリン酸ジエステル結合を加水分解する。この活性は、一本鎖の RNAに本発明のポリペプチドを作用させた後、生成する RNA分解物を検出することにより確認することができる。例えば配列番号 14に示される塩基配列のオリゴリボヌクレオチドである MRI007を基質とした場合、配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記オリゴリボヌクレオチドの 12 番目と 13番目の塩基の間のリン酸ジエステル結合を優先的に加水分解する。さらに前記のポリペプチドは、一本鎖 RNAに 5'— GAZAUU— 3'、 5'— GAZACC (または A)—3'、 5，—AA/ACU—3'および 5，—GU/ACUの配列が存在した場合、前記配列に「Z」で示した位置も切断することがある。本発明のポリペプチドのェンドリボヌクレアーゼ活性はリボソームの共存なしに発現されることから、前記活性はリポソーム非依存性である。

[0017] 本発明のポリペプチドが有する一本鎖 RNA特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性は、例えば一本鎖 RNAを基質として測定することができる。具体的には、 RNAポリメラーゼにより DNAを铸型として転写された一本鎖 RNAやィ匕学的に合成した一本鎖 RNAに活性を測定しょうとするポリペプチドを作用させ、 RNAの切断が生じるかどうかを調べることで測定することができる。 RNAの分解は、例えば電気泳動（ァガロースゲル、アクリルアミドゲル等）により確認することができる。基質とする RNAに適当な標識 (例えば放射性同位体、蛍光物質等)を付しておけば電気泳動後の分解産物の検出が容易となる。

[0018] 本発明のポリペプチドは、配列特異的に一本鎖 RNAを加水分解するエンドリボヌクレアーゼ活性を示す限りにおいて、配列表の配列番号 4記載のアミノ酸配列に 1個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも 1つがなされたアミノ酸配列で示されるポリペプチドを包含する。このような変異を有するポリペプチドとしては、例えば配列番号 4記載のポリペプチドに 50%以上のホモロジ一を有するポリべプチド、好ましくは 70%以上のホモロジ一を有するポリペプチド、特に好ましくは 90 %以上のホモロジ一を有するポリペプチドが例示される。これらの変異を有するポリペプチドは、配列番号 4記載のアミノ酸配列のポリペプチドとは異なる配列を認識、切断するものであっても、本発明に包含される。

[0019] さらに、前記のポリペプチドはその活性には必須でな、ペプチド領域を有して!/、てもよい、例えば翻訳の効率を向上させるためのペプチドや、前期ポリペプチドの精製を容易とするためのペプチド (例えばヒスチジンタグ、ダルタチオン S トランスフエラーゼ、マルトース結合タンパク質等）、シャペロンなど発現効率を向上させるタンノクが付加されたものであっても、一本鎖 RNA特異的な RNA切断活性を示す限り本発明のポリペプチドに包含される。

[0020] 2.本発明のポリペプチドをコードする核酸

本発明は、配列特異的なエンドリボヌクレア—ゼ活性を示す核酸を提供する。前記核酸としては、本発明を特に限定するものではないが、配列表の配列番号 4記載のアミノ酸配列、または該配列において 1個以上、例えば 1〜10個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列で示され、かつ前記の配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするものが挙げられる。ここで、配列番号 4記載のアミノ酸配列おいて 1個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列としては、例えば配列番号 4記載のポリペプチドに 50%以上のホモロジ一を有するアミノ酸配列、好ましくは 70%以上のホモロジ一を有するアミノ酸配列、特に好ましくは 90%以上のホモロジ一を有するアミノ酸配列が例示される。

[0021] さらに、本発明の核酸は、前記の核酸にストリンジェントな条件でハイブリダィズ可能であり、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアゼ活性を有するポリペプチドをコ一ドする核酸を包含する。前記のストリンジェントな条件としては、 1989年、コールド'スプリング'ノヽーバ一'ラボラトリー発行、 J. サムブルック (J. Sambrook)ら編集、モレキユラ^ ~ ·クロー-ング：ァ 'ラボラトリ^ ~ ·マニュアル第 2版（Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 2nd ed. )等に記載された条件が例示される。具体的には、例えば 0. 5% SDS、 5 Xデンハルツ溶液、 0. 01% 変性サケ精子 DNAを含む 6 X SSC中、プローブとともに 65°Cにて 12〜20時間インキュベートする条件が挙げられる。プローブにハイブリダィズした核酸は、例えば 0. 5% SDSを含む 0. 1 X SSC中、 37°Cで洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後に検出することができる。

[0022] 本発明のポリペプチドをコードする核酸は、例えば下記のような手段により取得することができる。

[0023] 特定の塩基配列を認識して mRNAを切断するエンドリボヌクレアゼ活性を有する MazFや PemKのようなトキシンにアミノ酸配列上でホモロジ一を有する遺伝子は、配列特異的なリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の候補である。このような候補遺伝子は、例えば細菌のゲノムより見出すことができる。

[0024] 候補遺伝子は、例えば塩基配列情報を基に設計されたプライマーを用いた PCRにより細菌ゲノム力も単離することができる。全塩基配列が既知であれば DNA合成機を用いて候補遺伝子の全配列を合成することもできる。

[0025] 候補遺伝子力のタンパク発現は、候補遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換した適当な宿主、例えば大腸菌で実施することができる。宿主の RNAを分解する配列特異的リボヌクレアーゼの発現は宿主には致死的である可能性があり、誘導前まで候補遺伝子の発現は厳密に抑制される必要がある。例えば、 T7ポリメラーゼのプロモーターを利用する pETシステム（ノバジェン社製）、コールドショック発現制御系 pColdシステム (タカラバイオ社製)のような発現システムを利用することが好適である。候補遺伝子からの発現産物を簡便に精製するためには、その精製を容易とするために前記のヒスチジンタグのようなペプチドを発現産物に付加しておくことが有利である。そのためには、発現ベクターとしてこのようなペプチドのコード領域を含むものを使用すればよい。

[0026] エンドリボヌクレアーゼの活性の測定は、前記の、一本鎖 RNAを基質とする方法により実施することができる。切断部位は、切断した RNAを铸型とし、該 RNAに相補的なプライマーと逆転写酵素を用いたプライマー ·エクステンションにより同定することができる。前期のプライマー ·エクステンションでは切断部位で伸長反応が停止するため、伸長鎖の鎖長を電気泳動により決定すれば切断部位を同定することができる。さらに塩基配列特異性を厳密に同定するには、任意の配列を有するオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成し、候補遺伝子の発現産物を作用させた後、変性アクリルアミドゲル電気泳動等によって切断の有無を判定すればよい。

[0027] 3.本発明のポリペプチドの製造方法

本発明のポリペプチドは、例えば、（1)本発明のポリペプチドを生産する微生物の培養物からの精製、（2)本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有する形質転換体の培養物力もの精製、等の方法により製造することができる。

[0028] 本発明のポリペプチドを生産する微生物としては、本発明を特に限定するものではな！、が、 Neisseria属に属する細菌が例示される。例えば、 N. meningitides、特に好適には N. meningitides ATCC No. 13090株より本発明のポリペプチドを取得することができる。前記微生物の培養はその微生物の生育に適した条件で行えばよい。菌体あるいは培養液中に生産された目的のポリペプチドは、通常のタンパク質の精製に用いられる方法、例えば菌体の破砕、沈殿法 (硫安塩析等）による分画、各種のクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-テイク口マトグラフィ一、疎水クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー）等、あるいはこれらを組み合わせて精製することができる。 [0029] 前記の、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む組換え DNAで形質転換された形質転換体より、本発明のポリペプチドを取得することができる。前記の組換え DNAは、好ましくはポリペプチドをコードする核酸の上流に機能的に接続された適切なプロモーターが配置されている。なお、本発明のポリペプチドは宿主に対して致死的な作用を示すことがあるので、前記のプロモーター、ならびにプロモーターを含めた発現システムは本発明のポリペプチドをコードする核酸力の転写を厳密に制御しうるものであることが好ましい。このようなシステムとして、前記の pETシステム、 p Coldシステムが例示される。

[0030] 宿主となる細胞へは前記の組換え DNAがそのまま導入されてもよぐ適切なベクタ一、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクターに挿入されて導入されてもよい。さら〖こ、前記の組換え DNAが宿主の染色体に組み込まれていても構わない。形質転換される宿主には特に限定はなぐ例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物、動物、植物培養細胞、動物培養細胞等、組換え DNAの分野で通常使用されている宿主が挙げられる。

[0031] これらの形質転換体で産生された本発明のポリペプチドは、前記のような精製手法を利用して精製することができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸が、前期ポリペプチドの精製を容易とするためのペプチドが付加されたポリペプチドをコードするものであった場合には、精製は非常に容易となる。付加されたペプチドに応じた精製手法、例えば、ヒスチジン—タグに対しては金属キレート榭脂を、ダルタチオン S— トランスフェラーゼに対してはダルタチオン固定ィ匕榭脂を、それぞれ使用することにより、高純度のポリペプチドを簡便な操作で得ることができる。

[0032] 4.本発明のポリペプチドを用いた一本鎖 RNAの分解

本発明のポリペプチドを用いることにより、一本鎖 RNAを分解し、 RNA分解物を製造することができる。本発明のポリペプチドは塩基配列特異的に RNAを切断しうることから、生成する RNA分解物の平均の差長は前記ポリペプチドに認識される塩基配列の出現頻度に相関する。すなわち、本発明によりある鎖長分布を有する RNA分解物が提供される。さらに、その配列特異性を利用して RNA中の特定の領域を切り出すことも可能である。 [0033] さらに、本発明のポリペプチドにより一本鎖 RNAを選択的に分解することができる。本発明の一つの態様として、タンパク質合成系、例えば無細胞翻訳系や形質転換体中の mRN Aを本発明のポリペプチドで分解し、タンパク質の合成を阻害することができる。この際、本発明のポリペプチドに認識される塩基配列を含有しないように人為的に作製した、所望のタンパク質をコードする mRNAを前記の系に存在させておくことにより、当該 mRNAのみが分解を免れ、系内では所望のタンパク質が特異的に生成される。本態様は、特に高純度のタンパク質の製造に有用である。

実施例

[0034] 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する力本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

[0035] また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については 2001年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行、 J.サムブルック (J. Sambrook)ら編集、モレキユラ一クロー-ング：ァラボラトリーマニュアル第 3版（Molecular Cloning ： A Laboratory Manual, 3rd ed. )に記載の方法によった。

[0036] 実施例 1 Neisseria meningitides ATCC No. 13090株由来 NMB2038ホモログの単離と発現プラスミドの構築

Neisseria meningitides MC58株の pemK— related protein / locus― t ag NMB2038について、そこにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列および塩基配列を NCBI データベースより入手した（accession No. NP— 275029および NC— 003112)。 NMB2038の塩基配列情報より、ポリペプチド全長をコードする領域の DNAを PCRで増幅できるように、プライマー NMB2038— F (配列番号 1) およびプライマー NMB2038—R (配列番号 2)を合成した。

[0037] Neisseria meningitides (ATCC No. 13090)から SDS—protenaseK 法によりゲノム DNAを調製した。 50ngのゲノム DNA、プライマー NMB2038— Fおよび NMB2038— Rを使用し、 TaKaRa LA- PCR Kit ver. 2. 1 (タカラバィォ社製 )を用いた PCRを実施して 344bpの増幅 DNA断片を得た。この増幅断片を制限酵素 Ndelおよび Xholで消化してァガロース電気泳動に供し、 323bpの DNA断片をゲルより回収した。制限酵素 Ndelおよび Xholで消化しておいた pET21aベクター（ノバジェン社製）にこの 323bpの DNA断片を接続して得られた組換えプラスミドで大腸菌 JM109株をトランスフォーメーションした。こうして得られた形質転換体のコ口- 一よりプラスミドを調製し、その塩基配列を確認したうえ、これを発現ベクター pET— NMB2038Hlgと命名した。

[0038] こうして、発現ベクター pET—NMB2038Hlgに挿入された N. meningitides由来 NMB2038ホモログポリペプチドの塩基配列を配列番号 3に、アミノ酸配列を配列番号 4にそれぞれ示す。なお、前記の発現ベクター pET— NMB2038Hlgによれば、配列番号 4のアミノ酸配列のポリペプチドの C末端に 6残基のヒスチジンを含む 8アミノ酸残基力もなるヒスチジン一タグが付加されたポリペプチドが発現される。

[0039] 実施例 2 N. meningitides由来 NMB2038ホモログポリペプチドの調製

実施例 1で得られた発現ベクター PET—NMB2038 Hlgで大腸菌 BL21 (DE3) 株（ノバジェン社製）をトランスフォーメーションし、発現用大腸菌 pET— NMB2038 Hlg/BL21 (DE3)を得た。 pET— NMB2038 Hlg/BL21 (DE3)を 100 μ g /mlのアンピシリンを含む 5mlの LB培地中、 37。Cで培養し、 OD600nm = 0. 6 になったところで、 IPTG (タカラバイオ社製)を最終濃度 ImMになるように加えてポリペプチドの発現を誘導した。誘導開始後 2時間後に培養を終了し、菌体を遠心分離により回収した。菌体を 300 1のリシスバッファー（50mM NaH PO、 300mM N

2 4

aCl、 10mM イミダゾール、 pH8. 0)に懸濁した後、超音波破砕機（Handy sonic 、トミー社製)を用いて菌体を破砕した。遠心分離により回収した上清に 20 1の Ni— NTA agarose (キアゲン社製)をカ卩え、 4°C、 30分間放置した。遠心分離して回収した沈澱を 100 /z lの洗浄バッファー（50mM NaH PO、 300mM NaCl、 20mM

2 4

イミダゾール、 pH8. 0)で 2回洗浄した。洗浄後の沈殿に 20 1の溶出バッファー（ 50mM NaH PO、 300mM NaCl、 250mM イミダゾール、 pH8. 0)をカ卩えて

2 4

懸濁し、遠心して上清を回収した。同じ溶出操作をさらに 2回繰り返し、合計 60 1の、 NMB2038ホモログポリペプチドを含む試料を得た。この試料の一部を SDS— PA GEに供して予想されるサイズのポリペプチドが含有されて、ることを確認した。また、試料中のタンパク濃度は約 400ngZ μ 1であった。

[0040] 実施例 3 基質 RNAの調製ラムダファージ DNAを铸型とした in vitro transcriptionにより基質 RNAを調製した。

ラムダファージ DNA (Genbank accession No. J02459)の 28411〜29074に相当する領域に対応する配列の RNAを調製するために、プライマー LAS28951F ( 配列番号 5)、プライマー LAS2895 IF (配列番号 6)をそれぞれ合成した。プライマ一 LAS28951Fには T7プロモーターの塩基配列を挿入した。

[0041] ラムダファージ DNA (タカラバイオ社製）、プライマー LAS28951Fおよび LAS28 951Fを使用し、 TaKaRa PCR Amplification Kit (タカラバイオ社製）を用いた PCRを実施して増幅 DNA断片（684bp)を調製した、この DNA断片と in vitro Tr anscription Kit (タカラバイオ社製)を使用し、前記キットの取扱説明書に従って in vitro Transcriptionを行った。得られた反応液を終濃度 0. 5U/ μ 1の DNase 1 (タカラバィォ社製）で 37°C、 30分間処理した後、 Centrisep (Princeton Separa tion Inc.社製）を用いてゲルろ過を行い、ろ液についてフエノール/クロ口ホルム処理、クロ口ホルム処理、イソプロパノール沈澱を行って RNAを精製した。 RNAの沈澱は滅菌蒸留水に溶解した。この操作により 667塩基の LAS28951RNA (配列番号 7に LAS28951RNAの塩基配列を示す）が得られた。

[0042] 実施例 4 NMB2038ホモログポリペプチドによる RNA切断部位の同定

配列番号 8に示す塩基配列を有し、 5 '末端に ROX標識が付加されたプライマーである LAS28951PEROXを合成した。

[0043] 実施例 3で得た LAS28951RNA 25ngZ 1、実施例 2で得た NMB2038ホモ口グポリペプチド 4ngZ 1、 10mM Tris— HCl (pH7. 5)からなる 5 1の反応液を調製し、 37°C、 30分間インキュベートした。

[0044] 次に、以下のように逆転写反応を行った。上記の反応液全量を使用し、 2. 5 / μ 1 MMLV 逆転写酵素（タカラバイオ社製）、 0. 5mM dNTPs, 1U/ μ lRNase Inhibitor (タカラバイオ社製）、 0. 5pmol/ μ 1 LAS28951PEROXプライマーを含む全量 10 1の RT反応液を調製して 42°C、 60分間インキュベートした。反応終了後、 3倍量のサンプルバッファー（95%ホルムアミド、 20mM EDTA)をカ卩えた。 95 °C、 5分間熱処理をして、変性アクリルアミドゲル（6%アクリルアミド、 7M尿素、 1 X T BEバッファー）電気泳動を行った。また、ラムダファージ DNAを铸型に、 LAS 2895 1PEROXをプライマーに使用し、 TaKaRa Taq Cycle Sequencing Kit (タカラバイオ社製)を用いて調製したプライマー伸長産物を同時に電気泳動し、シーケンスラダーを形成させた。泳動後、蛍光イメージアナライザー FMBIOII Multiview( タカラバィォ社製)を用いて、蛍光画像を解析した。

[0045] その結果、 NMB2038ホモログポリペプチドを作用させた LAS28951RNAの逆転写産物はゲル上で主要な 2本のバンドを示した。このバンドの位置をシーケンスラダ一の位置に対応させて決定された切断部位を表 1に示す。この結果より、 NMB20 38ホモログポリペプチドの作用によって 5'— ACU— 3'の 5' 側で特異的に切断が起こっていることが明らかになった。

[表 1]

切断塩基番号 * 切断部位の配列 * *

29017 CGA /ACUGUU

28780 CAA /ACUCUU

* 切断塩基番号は切断部位の 3 ' 側の塩基番号（G e n b a n k a c c e s s ! o n N o . J 0 2 4 5 9 ) で示した。

* * / は切断部位を示す。

[0047] 実施例 5 オリゴリボヌクレオチドを基質とした塩基配列特異性の同定

さらに詳細に切断塩基特異性を調べるために、オリゴリボヌクレオチドを合成し、 N MB2038ホモログポリペプチドによる切断アツセィを行った。

[0048] 基質として、オリゴリボヌクレオチド MRI001から MRI016の 12種を合成した。 10 μ Μ オリゴリボヌクレオチド、実施例 2で得た ΝΜΒ2038ホモログタンパク 4ngZ μ 1 、 10mM Tris— HCl (pH7. 5)からなる 5 /z 1の反応液を 37°C、 30分間インキュべートした。反応物を 20%変性アクリルアミドゲル（20%アクリルアミド、 7M尿素、 0. 5 X TBEバッファー）電気泳動に供し、 SYBR GREEN II (タカラバイオ社製）で染色した後、蛍光イメージアナライザー FMBIOII Multiview (タカラバイオ社製）を用いて、蛍光画像を解析した。各オリゴリボヌクレオチドの切断の状況を表 2に示す。

[0049] 各オリゴリボヌクレオチドには、 NMB2038ホモログポリペプチドにより切断される可能性のある配列を 3箇所づっ設定してある。表 2では 5'側力切断部位 1、 2、 3と示した。また、切断の状況は完全切断を + + +、部分切断を + +、ごく弱い切断を +、完全未分解を一で示した。さらに、それぞれのオリゴリボヌクレオチドの切断の有無および切断の強さから、切断部位周辺の塩基配列を比較し、配列の特異性を評価した

。この結果を表 3に示す。

[0050] 以上の結果から、 NMB2038ホモログポリペプチドは、 5， -GA/ACU- 3' (/ は切断部位を示す)の配列を優先的に認識して RNAを特異的に切断することが明らかになつた。また、 5' -GA/AUU- 3' , 5'—GAZACC (または A)—3'、 5'—A AZACU— 3'および 5'— GUZACUも切断しうることが明らかになった。

[0051] [表 2]

塩基配列および切断部位

( I は切断された部位を示す)

1 2 3 1 2 3

MRI001 AAUCCC UAA/ACUC UAAACCCUAAAA ++

MRI003 AAAUUC UAAACAC UAACCUCUAAAA

MRI004 AAAAUC UAAACCC UAAUCUCUAAAA

MRI005 AGACUC UACACUC UAA/ACUCUAAAA +

MRI006 AA/ACUG UAA/ACUA UAA/ACUUUAAAA + ++

MRI007 AAAGA/AUCC UGA/ACUC UGA/AUAUGA + +++ +

MRI008 AAAGU/ACUC UGGACUC UGCACUCUA ++

MRI011 AAAGAAAUC UGAAGUC UGA/AUUCUA +++

MRI012 AAAGA/ACAC UGA/ACGC UGA/ACCCUA +++ + +++

MRI013 GGAAA/ACUC UCAACUC UUAACUCGG +++

MRI015 GCUGAGCUC UGACCUC UGA/UCUCGG +

MRI016 CACGA/ACUC GGA/ACUC AGA/ACUCGG +++ +++ +++ 切断の表示 +++は完全切断、 ++は部分切断、 +はごく弱い切断を示す。

[0052] [表 3-1]

名称切断部位塩基配列切断の強さ

- 3 -2 - 1 1 2 3 4

MRI007 2 U G A A C u C +++

MRI016 1 C G A A C u C +++

MRI016 2 G G A A C u C +++ 置 1016 3 A G A A C u C +++ 置 1013 1 A A A A C u c +++ 置 1011 3 U G A A U u c +++ 置 1012 1 A G A A C A c +++ 置 1012 3 U G A A C C c +++ 置 1008 1 A G U A C u c ++ 置 1001 2 U A A A C u c ++ 置 1006 2 U A A A C u A ++ 置 1006 3 U A A A C u U ++ 置 1006 1 A A A C u G +

MRI015 3 U G A U C u C + 置 1007 1 A G A A U c C +

MRI007 3 U G A A u A C +

MRI012 2 U G A A c G C + 置 1005 3 U A U A c u C +

MRI013 2 U C A A c u C

MRI013 3 U U A A c u C

切断部位：：切断された部位は、 -1と +1の間が切断されてレ、る。

[表 3- 2]

名称切断部位塩基配列切断の強さ

-3 -2 - 1 1 2 3 4

MRI008 2 U G G A C u C

MRI008 3 U G C A C u C

MRI015 1 U G A G c u c

MRI015 2 U G A C c u c

MRI011 1 A G A A A u c

MRI011 2 U G A A G u c

MRI005 1 A G A C u c

MRI005 2 U A C A C u c

MRI003 3 U A A C C u c

MRI004 3 u A A U C u c

MRI003 1 A A A u u c

MRI003 2 u A A A c A c

MRI004 1 A A A A u c

MRI004 2 u A A A c c c

MRI001 3 u A A A c c c

切断部位：切断された部位は、 -1と +1の間が切断されている。産業上の利用可能性 [0053] 本発明により、新規な配列特異的エンドリボヌクレアーゼが提供される。前記酵素は RNA中の特定の配列を認識して切断することができることから、 RNA分子の解析、 RNA断片の作成、細胞内での RNA切断を介した細胞の制御（例えばタンパク質生成の阻害)等に有用である

配列表フリーテキスト

[0054] SEQ ID NO:l; PCR primer NMB2038— F to amplify a DNA fragment encoding NMB2 038 protein.

SEQ ID NO:2; PCR primer NMB2038-R to amplify a DNA fragment encoding NMB2 038 protein.

SEQ ID NO 5; PCR primer LAS28951F to amplify a portion or lambda DNA.

SEQ ID NO 6; PCR primer LAS28951R to amplify a portion of lambda DNA.

SEQ ID NO 7; LAS28951RNA transcribed from a portion of lambda DNA.

SEQ ID NO 8; Primer LAS28951PEROX for reverse transcription of RNA.

SEQ ID NO 9; Oligoribonucleotide MRI001.

SEQ ID NO 10; Oligoribonucleotide MRI003.

SEQ ID NO 11; Oligoribonucleotide MRI004.

SEQ ID NO 12; Oligoribonucleotide MRI005.

SEQ ID NO 13; Oligoribonucleotide MRI006.

SEQ ID NO 14; Oligoribonucleotide MRI007.

SEQ ID NO 15; Oligoribonucleotide MRI008.

SEQ ID NO 16; Oligoribonucleotide MRI011.

SEQ ID NO 17; Oligoribonucleotide MRI012.

SEQ ID NO 18; Oligoribonucleotide MRI013.

SEQ ID NO 19; Oligoribonucleotide MRI015.

SEQ ID NO 20; Oligoribonucleotide MRI016.

Claims

請求の範囲

[1] 配列表の配列番号 4記載のアミノ酸配列、または該配列において 1個以上のァミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列で示され、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。

[2] 請求項 1記載のポリペプチドをコードする核酸。

[3] 配列表の配列番号 3記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項 2記載の核酸。

[4] 請求項 2または請求項 3記載の核酸にストリンジェントな条件でハイブリダィズ可能であり、かつ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸。

[5] 請求項 2〜4 、ずれ力 1項に記載の核酸を含んでなる組換え DNA。

[6] 請求項 5記載の組換え DNAにより形質転換されてなる形質転換体。

[7] 請求項 6記載の形質転換体を培養する工程、および該培養物中より配列特異的な

RNA切断活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする請求項 1のポリペプチドの製造方法。

[8] 一本鎖 RNAに請求項 1記載のポリペプチドを作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖 RNA分解物の製造方法。

[9] 一本鎖 RNAに請求項 1記載のポリペプチドを作用させる工程を包含することを特徴とする、一本鎖 RNAの分解方法。