WO2006118278A1 - 温度感受性リポソームおよび温度感受性薬剤放出システム - Google Patents

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WO2006118278A1
WO2006118278A1 PCT/JP2006/309052 JP2006309052W WO2006118278A1 WO 2006118278 A1 WO2006118278 A1 WO 2006118278A1 JP 2006309052 W JP2006309052 W JP 2006309052W WO 2006118278 A1 WO2006118278 A1 WO 2006118278A1
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WO
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ribosome
temperature
sensitive
polymer compound
group
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PCT/JP2006/309052
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Inventor
Kenji Kono
Sadahito Aoshima
Original Assignee
Kenji Kono
Sadahito Aoshima
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    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
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    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a temperature-sensitive ribosome whose membrane structure collapses at a specific temperature, and a temperature-sensitive drug release system comprising the temperature-sensitive ribosome and a drug.
  • Ribosomes are composed of lipid bilayers such as phospholipids and are closed vesicles with a particle size of several tens to several hundreds of nanometers and function as nanocapsules that can encapsulate various substances. It is known to do.
  • drug delivery systems DDS
  • DDS drug delivery systems
  • Liposomes used for such applications encapsulate hydrophilic drugs in the hydrophilic regions inside the closed endoplasmic reticulum and carry Z or hydrophobic drugs on the lipid bilayer.
  • the following may be considered.
  • the particle size of the ribosome containing the anticancer agent is set to about 200 nm. Therefore, by setting the particle size of the ribosome containing the anticancer agent to about 200 nm, the ribosome can leak out in the vicinity of the target cancer cell and reach the target cancer cell. In this way, the anticancer drug-containing ribosome can be accumulated specifically and at a high concentration in the site surrounding the target cancer cell.
  • ribosomes do not leak from the blood vessels around normal cells.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 for ribosomes that can be disintegrated at a specific temperature to release inclusions, excellent therapeutic effects can be obtained by using ribosomes encapsulating anticancer agents in combination with thermotherapy for cancer. It has been reported that
  • Patent Document 1 discloses a ribosome in which a polymer compound having a thermosensitive part and a hydrophobic part is held on a ribosome membrane via the hydrophobic part. Since such ribosomes can release inclusions at a specific temperature, for example, by administering a ribosome containing drugs to a human and warming the affected part, the inclusions can be released at that part. Is written!
  • Patent Document 1 describes that the structure of the lipid bilayer collapses in a temperature range of about 10 to: LOO ° C, and the components contained in the ribosome are released. ing.
  • Patent Document 1 The ribosome described in Patent Document 1 is considered to have a high tendency to be discharged out of the body before reaching the target site with a short residence time in blood.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-212755
  • Non-patent document 1 "Clinical cancer” No. 32, No. 13 (1986)
  • Non-Patent Document 2 "General Clinical" No. 37, No. 1 (1988)
  • the drug can be stably maintained at a temperature close to that of mammals, particularly humans, that is, around 34 to 38 ° C;
  • the drug can be rapidly released at a temperature away from the body temperature of mammals, particularly humans, that is, 38 ° C or higher, preferably around 40-45 ° C; (3) Long residence time in blood in mammals, particularly humans.
  • the present inventors have found that a ribosome composed of a ribosome membrane-constituting lipid, a polymer compound having a thermosensitive response portion and a hydrophobic portion, and polyethylene glycol (PEG),
  • the present invention was completed by finding that the collapse temperature of the ribosome membrane structure has the above-mentioned characteristics (1) to (3), which is 5 to 9 ° C. higher than the ribosome membrane structure collapse temperature of the conventional ribosome.
  • the present invention is a temperature-sensitive ribosome comprising a polymer compound having a heat-responsive portion and a hydrophobic portion, a polyethylene glycol, and a force ribosome membrane.
  • the present invention comprises a ribosome membrane-constituting lipid, a polymer compound having a heat-responsive portion and a hydrophobic portion, and polyethylene glycol, and the molar ratio of ribosome membrane-constituting lipid: polymer compound: polyethylene glycol is It is also a temperature-sensitive ribosome obtained by using a ribosome membrane-constituting lipid, a polymer compound, and polyethylene glycol at a ratio of 1: 0.003-0.2: 0.001-0.2.
  • the present invention also provides a temperature sensitive drug release system comprising the above temperature sensitive ribosome and a drug.
  • the present invention provides a therapeutic or prophylactic method comprising administering to a mammal, including a human in need of treatment or prevention, an effective amount of the temperature sensitive drug release system.
  • the membrane structure of the ribosome is disrupted and retained by the ribosome in a temperature range higher than the collapse temperature of the conventional ribosome, that is, in a temperature range away from human body temperature. It is possible to provide a temperature sensitive drug release system capable of releasing a drug and exhibiting a more practical drug release profile. Further, since the temperature-sensitive ribosome of the present invention contains polyethylene glycol, it can also exhibit a longer retention in blood.
  • the temperature-sensitive drug release system comprising an anti-cancer drug as a drug in the temperature-sensitive ribosome of the present invention is administered to a subject including a human, and is affected at an appropriate time after administration.
  • thermotherapy to heat the part to about 40 to 45 ° C.
  • the anticancer drug can be specifically and efficiently released at the affected part, and more preferably, DDS can be achieved.
  • FIG. 1 is a graph showing the change over time in the release rate of ADR from temperature-sensitive ribosomes containing adriamycin (ADR) according to the present invention (A: Example 1; B: Example 2; C: Comparative Example 1).
  • FIG. 2 is a graph showing the temperature dependence of the ADR release rate of ADR-containing temperature-sensitive ribosome force according to the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the ADR release rate when the temperature-sensitive ribosome of Example 1 of the present invention was incubated at 37 ° C. or 45 ° C. under conditions containing urchin fetal serum.
  • FIG. 4 is a graph showing the temperature dependence of the ADR release rate of the temperature-sensitive ribosome force containing ADR according to the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of examining the blood retention of the temperature-sensitive ribosome according to the present invention.
  • ⁇ unmodified ribosome
  • ⁇ PEG modified ribosome
  • ⁇ polymer compound modified ribosome
  • country temperature-sensitive ribosome of the present invention are shown.
  • FIG. 6 shows the amount of ribosome accumulated in each organ after A: 0.5 hour, B: 1 hour, C: 3 hours, D: 6 hours, E: 14 hours, F: 24 hours. It is a graph.
  • FIG. 7 is a graph showing changes in tumor volume after administration of an ADR-containing temperature-sensitive ribosome according to the present invention.
  • Mouth When HBS buffer solution is administered and warming power is applied
  • Country When HBS buffer solution is administered and heated
  • ⁇ Do not heat by administering ribosome of Comparative Example 2
  • ⁇ When the ribosome of Comparative Example 2 is administered and heated
  • ⁇ When the ribosome of Example 1 is administered and warmed
  • ⁇ When the ribosome of Example 1 is administered Shown when heated.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in tumor volume depending on heating time after administration of ADR-containing temperature-sensitive ribosome according to the present invention. This figure shows the change in tumor volume when the ribosome is administered and heated for 3 hours, and after 12 hours.
  • FIG. 9 Varying the dose of ADR contained in the temperature-sensitive ribosome containing ADR according to the present invention. It is a graph which shows the change of the tumor volume at the time of making it.
  • the ADR dose per unit weight of mice is 0 mg / kg-body weight (garden), 6 mg / kg-body weight ( ⁇ ), 8 mg / kg-body weight ( ⁇ ), and 12 mg / kg-body weight. ( ⁇ ).
  • FIG. 10 is a graph showing changes in body weight of mice by administration of ADR-containing temperature-sensitive ribosomes according to the present invention.
  • the change in the body weight of the mouse when the country: the temperature-sensitive ribosome of the present invention and the 4: HBS buffer solution are respectively administered is shown.
  • the ribosome of the present invention is composed of a ribosome membrane-constituting lipid, a polymer compound having a heat-responsive part and a hydrophobic part, and polyethylene glycol (PEG). Specifically, a polymer compound and PEG are supported on a ribosome membrane.
  • the substance “supported by the ribosome membrane” means that the substance may be bonded to the ribosome membrane and protrude from the surface force of the liposome membrane, or the lipid bilayer membrane constituting the ribosome membrane. A part or all of the material may be embedded in the material.
  • the temperature-sensitive ribosome of the present invention has a stable ribosome membrane structure in the vicinity of 34 to 39 ° C, can stably hold a drug that can be held in the ribosome, and is in the vicinity of 40 to 45 ° C. It is preferable that the ribosome membrane structure rapidly collapses and the drug can be released. That is, the drug release rate from the ribosome after incubation at 37 ° C for 3 minutes is 5% or less, more preferably 4.5% or less, and the drug with ribosome strength after incubation at 45 ° C for 3 minutes. It is preferable that the release rate is 85% or more, more preferably 87% or more.
  • the drug release rate in this specification is a value measured according to the method for measuring the release rate of adriamycin (ADR) described in the following Examples.
  • the mechanism by which the ribosome membrane structure is disrupted at a specific temperature is not clear, but when the temperature rises slowly, the thermosensitive responsive portion of the polymer compound is dehydrated, and the thermosensitive responsiveness is increased. It is considered that the hydrophobicity of the portion increases, and the heat-responsive portion originally carried outside the ribosome membrane enters all or part of the ribosome membrane and the ribosome membrane structure collapses.
  • the temperature at which the dehydrated polymer compound disrupts the structure of the ribosome membrane hereinafter also referred to as the ribosome membrane disruption temperature
  • Conventional ribosome ribosome It is thought that it can be made higher than the film collapse temperature.
  • PEG polyethylene glycol
  • polyethylene glycol (PEG) used for the temperature-sensitive ribosome of the present invention those usually used for the ribosome can be preferably used.
  • the ribosome disintegration temperature is preferred and can be within the range.
  • the above PEG preferably constitutes the temperature-sensitive ribosome of the present invention by bringing the PEG derivative into contact with the polymer compound and the ribosome membrane-constituting lipid.
  • (PEG) represents polyethylene glycol having a molecular weight as described above, and R ′ is a reaction that may be bonded to a hydrogen atom, a methoxy group, or (PEG) via a divalent bond.
  • R is a group that is reactive with a group possessed by a ribosome membrane lipid or a group derived from a lipid, and X is a linker.
  • R 'in the formula ( ⁇ ⁇ ) is a reactive group
  • the reactive group is not particularly limited.
  • Examples of the divalent bond include C 00—, 1 CH—, 1 CH CH 1, CH CH CH 1, COCH CH 1, COCH CH
  • the linker as X in the formula ( ⁇ ) can be appropriately selected according to the type of R, and examples thereof include one CO—, —COCH 2 CH 2 CO—, and —COCH 2 CH 2 CO 3.
  • PEG derivatives in which R in the formula ( ⁇ ) is a group reactive with a group possessed by a ribosome membrane lipid are described in, for example, W098Z32466, and these can be used.
  • Such a PEG derivative is bonded to a group possessed by a ribosome membrane-constituting lipid such as phosphatidylethanolamine and an amino group possessed by phosphatidylserine.
  • PEG is bound to the ribosome membrane.
  • the PEG derivative is preferably a compound in which R in the formula (III) is a group derived from a lipid.
  • Such compounds can be represented as PEG-lipid complexes.
  • the lipid moiety constituting the PEG lipid complex can enter the ribosome membrane, so that PEG is supported on the ribosome membrane.
  • the lipid constituting the PEG lipid complex may be a natural lipid or a synthetic lipid.
  • Natural lipids include phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, glyceport phospholipids such as phosphatidylglycerol and diphosphatidylglycerol; sphingoglycolipids such as cerebroside; glycerides such as diacyl glyceronole; Examples include steroids such as Enoregostero.
  • Synthetic lipids include synthetic lipids having reactive functional groups such as amino groups, hydroxyl groups, and carboxyl groups.
  • phosphatidylethanolamine, diacylglycerol and cholesterol are preferably selected. These lipids may be used alone or in combination of two or more.
  • the constituent fatty acids of the above phospholipids are not particularly limited, and examples include myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidonic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, lauric acid and the like.
  • PEG-lipid complex As described above, and examples thereof include the following (all are trade names, manufactured by Avanti Polar Lipids).
  • 1,2-dioleo oil sn-glyce mouth-3 [ ⁇ Toxy (polyethylene glycol) 550];
  • 1,2-dioleo oil sn-glyce mouth-3 [ ⁇ Toxy (polyethylene glycol) 3000];
  • the polymer compound used in the temperature-sensitive ribosome of the present invention is a polymer compound having a thermosensitive responsive moiety.
  • a polymer compound having a thermosensitive portion and a hydrophobic portion is preferable.
  • Such a polymer compound is preferably a block copolymer of a heat-sensitive bull monomer containing at least one hydratable heteroatom and a hydrophobic bull monomer.
  • Examples of the hydratable hetero atom include an oxygen atom and a nitrogen atom.
  • the upper limit of the number of hydratable heteroatoms is not particularly limited as long as the polymerization can be performed.
  • Groups containing hydratable heteroatoms include —CH—CH—0—, —CO—, —COO—, and —CO.
  • hydrophobic vinyl-based monomer a vinyl-based monomer having various aliphatic, alicyclic or aromatic hydrocarbon groups having about 3 to 40 carbon atoms, particularly about 4 to 30 carbon atoms. You can use mer.
  • the copolymerization ratio of the thermoresponsive vinyl monomer containing one or more heteroatoms and the hydrophobic bulle monomer varies depending on the type of each monomer, but is usually 300: 1. ⁇ 3: 1, especially 200: 1 ⁇ : L0: 1 is preferred. Within this range, the polymer compound can be stably retained on the ribosome membrane.
  • the number corresponding to the heat-responsive part of the number average molecular weight of the polymer compound is not particularly limited, but is usually about several hundred to several hundred thousand.
  • the molecular weight of the entire polymer compound is not particularly limited, but it may be usually several hundred to several hundred thousand in terms of number average molecular weight. Within this range, the ribosome membrane is stably held. More preferably ⁇ is about 2,000 to 50,000, more preferably ⁇ is about 10,000 to 25,000, particularly preferably about 11,000 to 22,000. The collapse temperature can be set to a narrower temperature range.
  • the molecular weight distribution (weight average molecular weight (Mw) Z number average molecular weight (Mn)) of the polymer compound is usually about 1 to 4, particularly about 1.0 to 1.5. Within this range, the collapse temperature of the liposome membrane structure can be set to a narrower temperature range.
  • the number average molecular weight and the weight average molecular weight of the polymer compound used in the present invention are values measured by the methods described in the following examples, respectively.
  • the temperature-sensitive ribosome of the present invention is preferably obtained by using the above polymer compound in an amount of about 0.1 to 20 mol% based on the total number of moles of the ribosome membrane-constituting lipid, polymer compound and PEG. More preferably, it is about 0.5-5 mol%. Within this range, the liposome can be made sufficiently temperature-sensitive and a liposome that is practically sufficiently stable can be obtained.
  • polymer compound include the following formula (I):
  • R 1 is a hydrogen atom, and the following formula ( ⁇ ):
  • X is the same or different and is a hydrogen atom or a halogen atom
  • R 11 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, or an aryl group.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a halogenated alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an aldehyde group, a vinyl group, a biphenyl group, Le Or an aralkyl group having 7 to 14 carbon atoms
  • R 3 is a hydrocarbon group having 4 to 30 carbon atoms
  • R 4 is a hydrogen atom, an alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, or a group derived from a polymerization terminator, mi or 5 to 500, ⁇ or 1 to 10, yi or 0 to: LOO. ]
  • R 2 in the above formula (I) is particularly preferably an alkyl group having about 1 to 4 carbon atoms.
  • R 3 in the above formula (I) is a hydrocarbon group having about 4 to 30 carbon atoms.
  • examples of such a group include an alkyl group, an aryl group, an aralkyl group, and the like.
  • a linear alkyl group having about 8 to 30 carbon atoms is preferred.
  • m: n may be about 300: 1 to 3: 1, particularly about 200: 1 to 10: 1.
  • y is preferably about 0 to 10. The longer the oxyethylene chain, the higher the collapse temperature of the liposome membrane structure.
  • the halogen atom as X in the above formula ( ⁇ ) is selected from a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.
  • the polymer compound of the above formula (I) can be obtained by polymerizing a monomer by a known method such as force polymerization that varies depending on the type of vinyl monomer.
  • a known method such as force polymerization that varies depending on the type of vinyl monomer.
  • living cationic polymerization is particularly preferable. Living cationic polymerization methods are described in, for example, JP-A-1-08202, JP-A-1-08203, JP-A-2001-055408, JP-A-2000-198825, JP-A-8-269118. Yes.
  • polymerization initiator for living cationic polymerization for example, the polymerization initiator described in JP-A-1-08202 or JP-A-1-08203, the effer method (US Pat. No. 4,276,394) is used.
  • Substituents obtained from polymerization initiators chlorine compounds having an aromatic ring at the a position (JP 2001-055408 A), polymerization initiators (Iodination) reported by Higashimura et al. In Macromolecules, 17, 265, 1984. Polymerization initiators combining hydrogen and iodine), polymerization initiators described in JP-A-62-48704, JP-A-64-62308, and the like. Can be mentioned.
  • the end of the growth does not disappear until the monomer disappears or until a polymerization terminator is added, so that the chain length of the thermosensitive portion and the hydrophobic portion, and thus the molecular weight of the polymer compound, is easy. To a desired value.
  • a polymer material having a narrow molecular weight distribution can be obtained as compared with other polymerization methods.
  • Preferable examples of the polymer compound include the following.
  • R 1 is a hydrogen atom or —C (H) (CH 3) (OCH 2 CH (CH 2) 2) or —C (H) (C
  • H is a group derived from a polymerization initiator such as (OC H OC H OCH), R 2 is CH, CH, n
  • m and n are number average molecules of the polymer compound.
  • the amount (Mn) is about 11,000 to 50,000, and the molecular weight distribution (MwZMn) is about 1.0 to 1.3. )
  • the compounds of the above formulas (IV) to (VI) are compounds in which the otatadecyloxy group as a side chain in the formulas (IV) to (VI) is substituted with a dodecyloxy group, a tetradecyloxy group or a hexadecyloxy group May be mixed in small amounts.
  • the octadecyloxy group as a side chain in the formulas (IV) to (VI) is a dodecyloxy group, a tetradecyloxy group, or a hexadecyloxy group. Substituted compounds can also be mentioned as preferred examples.
  • the preferable method for producing a high molecular compound is obtained by mixing two appropriate monomers in the presence of a polymerization initiator and a Lewis base (for example, ethyl acetate, tetrahydrofuran, etc.).
  • a polymerization initiator for example, ethyl acetate, tetrahydrofuran, etc.
  • it can be produced from a mixture by polymerization in an appropriate solvent (for example, toluene, hexane, etc.).
  • the polymerization initiator include 1-methoxyethoxyethyl acetate and 1- (isobutyl) ethyl acetate.
  • the polymerization can be stopped by adding ammoniacal methanol or ammonia.
  • column f is Journal of Polymer science: Part A: Polymer hemistry, Vol. 30, p.2407-2413 (1992); Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, Vol. 43, p 1155-1165 (2005); Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, Vol. 43, p.2712-2722 (2005).
  • amphiphilic lipids that are usually used as liposome membrane lipids can be used.
  • examples of such fats include phospholipids such as phosphatidic acid, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, cardiolipin, sphingomyelin, soybean phosphatidylcholine, and egg yolk phosphatidylcholine. It is done.
  • the constituent fatty acids of these phospholipids include myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidonic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid and the like. These can be used alone or in combination of two or more. In particular, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine are preferable.
  • a known cationic synthetic lipid can be used in addition to the above-described phospholipid.
  • Such cationic synthetic lipids include, for example, N— (a-trimethylammo-oacetyl) -didodecylglutamate, N— [1- (2,3 dioleyloxy) propyl] ⁇ , ⁇ , ⁇ Trimethylammonum chloride And quaternary ammonium salts such as 1,2 bis (oleoyloxy) 3- (trimethylammo-) propane. These lipids can be used alone or in combination of two or more.
  • the ribosome membrane-constituting lipid may include sterols such as cholesterol, lanosterol, and ergosterol.
  • the particle size of the temperature-sensitive ribosome of the present invention may be various particle sizes depending on the intended use as long as it is about 0.05 to 10 / zm.
  • the particle size is usually about 0.05 to 0.2 ⁇ m, especially about 0.05 to 0.1 ⁇ m. I like it.
  • the temperature-sensitive ribosome of the present invention is either a monolayer ribosome composed of a single lipid bilayer membrane or a multi-layer ribosome composed of a plurality of lipid bilayer membranes, as long as it is within the above particle size range. May be.
  • the temperature-sensitive ribosome of the present invention comprises a ribosome membrane-constituting lipid, a polymer compound, and a PEG derivative as described above in a known ribosome production method.
  • the ribosome membrane-constituting lipid: polymer compound: PEG It can be produced from a coconut paste by contacting at a molar ratio of 1: 0.003-0.2: 0.001-0.2.
  • the monore ratio of ribosome membrane-constituting lipid: polymer compound: PEG is more preferably 1: 0.003 to 0.1: 0.01 to 0.06, and still more preferably 1: 0.01 to 0.05: 0.01 to 0.03.
  • Known methods for producing ribosomes include the etastruder method, the ultrasonic method, the French press method, and the like. Details of these methods are described in “Ribosomes” (Shinochi Nojima, Junzo Sunamoto, Junzo Inoue, Nanedou) and “Ribosomes in Life Science” (Hiroshi Terada, Tetsuro Yoshimura, Springer's Fairlark Tokyo). Yes. [0067] For example, a method for producing the ribosome of the present invention by the etastruder method will be described.
  • the unsupported polymer compound, PEG derivative, and the like can be removed by gel filtration, ultracentrifugation, dialysis, or the like. If the substance to be removed has a charge, use ion exchange chromatography.
  • the order of mixing the ribosome membrane-constituting lipid, the polymer compound and the PEG derivative is not particularly limited.
  • a ribosome membrane-constituting lipid, a polymer compound, and a PEG derivative may be mixed at once, or a ribosome may be formed in advance using the etasomer method as described above after using a ribosome membrane-constituting lipid.
  • the molecular compound and the PEG derivative may be added simultaneously or separately to carry these components on the liposome membrane.
  • the thermosensitive responsive portion of the polymer compound and PEG may be carried on the outer surface of the ribosome membrane, It may be carried on the inner surface of the ribosome membrane, or may be carried on both the outer surface and the inner surface of the liposome membrane.
  • the thermosensitive responsive portion of the polymer compound and PEG may be carried on the outer surface of the ribosome membrane, It may be carried on the inner surface of the ribosome membrane, or may be carried on both the outer surface and the inner surface of the liposome membrane.
  • a temperature sensitive drug release system comprising the above temperature sensitive ribosome and a drug is also one of the present inventions.
  • the drug may be a hydrophilic substance or a hydrophobic substance.
  • it is a hydrophilic substance, it is contained in the hydrophilic region of the closed space inside the temperature-sensitive ribosome, and when it is a hydrophobic substance, it is carried on the temperature-sensitive ribosome membrane.
  • the drug is not particularly limited, and examples thereof include an anticancer agent and an anti-inflammatory agent used in combination with hyperthermia.
  • Anticancer agents include metal complexes such as cisbratin, carbobratin, tetraplatin, and iprobratin; anticancer antibiotics such as adriamycin (ADR), mitomycin, actinomycin, ansamitocin, bleomycin, Ara-C, and daunomycin; 5-FU, methotrexate And antimetabolites such as TAC-788; alkylating agents such as BCNU and CCNU; interferons ( ⁇ , j8, ⁇ ), and lymphokines such as various interleukins.
  • anti-inflammatory agents include predonin, Linderon, and Celestamine.
  • the temperature-sensitive ribosome may also include a gene for treatment of a disease instead of the drug.
  • genes include, but are not limited to, for example, an adenosine deaminase gene for the treatment of severe combined immunodeficiency, an LDL receptor gene for the treatment of familial hypercholesterolemia, and cancer.
  • IFN Interferon
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IL interleukin
  • TNF tumor necrosis factor
  • L ⁇ lymphotoxin
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • genes for the treatment of Arno-Ima disease, spinal cord injury, Parkinson's disease, arteriosclerosis, diabetes, hypertension and the like can be mentioned.
  • the amount of the drug is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of drug.
  • the drug is applied to the temperature-sensitive ribosome.
  • a known method can be used according to the type of the agent. The method is not limited, for example, a method in which a temperature-sensitive ribosome is formed according to the above-described method for producing a temperature-sensitive ribosome, and then the ribosome is immersed in a solution containing the drug to incorporate the drug into the ribosome,
  • the method for producing a temperature sensitive liposome include a method in which a solution containing a drug is placed in a container in which a thin film is formed, and then a drug is encapsulated by forming a ribosome membrane structure.
  • the temperature sensitive drug release system of the present invention preferably further comprises at least one pharmaceutical additive.
  • the temperature sensitive drug release system may be in the form of a solid preparation such as a tablet, powder or capsule, but is preferably in the form of a liquid preparation such as an injection preparation.
  • the liquid formulation may be provided as a dry product that is regenerated with water or other suitable excipient at the time of use.
  • the above tablets and capsules are enteric-coated by a usual method.
  • enteric coating those normally used in the field can be used.
  • Capsules can also contain either powder or liquid.
  • the pharmaceutical additive is a carrier
  • the carrier can be a solvent used in producing a temperature sensitive ribosome.
  • the pharmaceutical additive may be an excipient (eg, sugars such as lactose, sucrose, starches such as corn starch, cellulose such as crystalline cellulose) Arabic gum, magnesium aluminate metasilicate, calcium phosphate, etc.), lubricant (eg, magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, etc.), binder (eg, sugars such as mannitol, sucrose, crystals) Cellulose, polypyrrole pyrrolidone, hydroxypropylmethylcellulose, etc.), disintegrating agents (eg starches such as potato starch, celluloses such as carboxymethylcellulose, crosslinked polyvinylpyrrolidone, etc.), colorants, flavoring agents, etc.
  • excipient eg, sugars such as lactose, sucrose, starches such as corn starch, cellulose such as crystalline cellulose) Arabic gum, magnesium aluminate metasilicate, calcium phosphate, etc.
  • lubricant eg
  • the temperature-sensitive drug release system can be manufactured by mixing the temperature-sensitive ribosome containing the drug as it is or freeze-dried with the pharmaceutical additive. When the temperature-sensitive ribosome containing the drug is lyophilized, an appropriate excipient should be added before lyophilization.
  • the temperature-sensitive drug release system of the present invention By administering the temperature-sensitive drug release system of the present invention to a subject and heating the affected part to a temperature of 40 ° C or higher, preferably 40 to 47 ° C, more preferably 42 to 45 ° C.
  • the membrane structure of the temperature-sensitive ribosome can be disrupted to release the drug at the affected area.
  • an effective amount of the above-mentioned temperature sensitive drug release system is orally or parenterally administered to a subject in need of treatment or prevention, and the skin above the affected area of the subject is heated after a certain period of time.
  • a method of treating or preventing a disease is provided.
  • the subject is preferably a mammal, particularly preferably a human.
  • the certain period of time is preferably at least 3 hours after administration of the temperature sensitive drug release system, more preferably 3 to 48 hours, even more preferably 6 to 24 hours, and even more preferably 6 to 12 hours.
  • the temperature at which the skin above the affected area is heated is such that at least a part of the administered temperature-sensitive drug release system is destroyed and the skin above the affected area is not burned.
  • Any temperature is acceptable. For example, by heating the skin above the affected area to a temperature of 38-50 ° C, more preferably 39-47 ° C, and even more preferably 42-45 ° C, temperature sensitive drug release At least part of the system can be destroyed. During the above heating process, do not cause burns on the skin above the affected area.
  • the method of heating the skin above the affected area is not particularly limited as long as it is a method used for thermotherapy, and examples thereof include a method of irradiating an electromagnetic wave such as a laser or microwave.
  • the temperature sensitive drug release system described above can be achieved by either parenteral or oral routes. Can also be administered. For example, when an anticancer agent is used as a drug, administration by parenteral route, particularly intravenous injection is preferable.
  • the dose of the above-described temperature-sensitive drug release system can be appropriately selected according to the severity of the subject and the amount of drug contained in the ribosome.
  • the weight average molecular weight (Mw) and number average molecular weight (Mn) of the polymer compound were also calculated as a result of gel filtration chromatography (GPC).
  • GPC is performed using a high performance liquid chromatograph (TSKgel column G-200HXL + G- 3000 HXL + G-4000HXL (manufactured by Tosohichi Co., Ltd.), eluent: Kuroguchi Holm).
  • the molecular weight of the compound was calculated as polystyrene as Mw and Mn by calculating using polystyrene as a standard substance.
  • ADR adriamycin
  • Ribosomes containing ADR were dispersed in HBS buffer (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4), and the temperature of this ribosome dispersion was set to 10 ° C.
  • HBS buffer solution containing fetal calf serum (FCS) at various concentrations (0 to 50%) is brought to a predetermined temperature, and the ribosome dispersion is added to the FCS-containing HBS buffer solution so that the ribosome lipid concentration becomes 5 M.
  • fluorescence intensity was measured after a predetermined time.
  • ADR Since ADR is quenched at a high concentration, it does not emit fluorescence when encapsulated inside the ribosome, but it also fluoresces when the internal force of the ribosome is released into a buffer solution outside the ribosome. Therefore, by monitoring the fluorescence of the ribosome dispersion while raising the temperature of the buffer, the degree of ADR release from the ribosome can be examined.
  • the excitation wavelength and fluorescence wavelength of ADR were 470 nm and 590 nm, respectively.
  • ⁇ is the fluorescence intensity when incubated at a predetermined temperature for a predetermined time
  • F ' f is the fluorescence intensity when Triton X-100 is added and the ribosome is destroyed after 30 minutes at the specified temperature;
  • F f represents the fluorescence intensity when triton X-100 is added and the ribosome is broken after 30 minutes at 10 ° C.
  • octadecyl vinyl ether (ODV E) (0.2 mmol) diluted with toluene was sequentially added at the end of the polymerization of the EOEO VE monomer.
  • ODV E octadecyl vinyl ether
  • the polymerization reaction was stopped by adding ammoniacal methanol to the polymerization system at the end of the polymerization of the ODVE monomer.
  • the block copolymer was purified by washing the block copolymer solution diluted with dichloromethane with dilute hydrochloric acid to remove the residue of the polymerization initiator. Thereafter, the system was returned to neutrality and evaporated to remove solvent, unreacted monomer seed residues, and the like. In order to completely remove the unreacted monomer, it was dried in a vacuum dryer for 8 hours (80 ° C, 0.1 mmHg).
  • the copolymer obtained had an EOEOVE / ODVE copolymerization ratio of approximately 100/5.
  • EYPC 10 mg / ml yolk phosphatidylcholine
  • PEG5000 disearoylphosphatidylethanolamine (PE) complex (1,2-distearoyl—sn—glyce mouth—3—phosphoethanolamine—N— [poly (ethylene glycol) 5000], Avanti Polar Lipids Chloroform solution with 290 ⁇ L of the solution (made by Kogyo Co., Ltd.) and removing the chloroform using a rotary evaporator to form a thin film of ribosome membrane lipid, polymer compound and PEG on the inner wall of the flask.
  • the lipid concentration of the ribosome dispersion was measured according to the instruction manual for the phospholipid C test KOKO (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) kit. From the obtained results, ADR was added so that the ratio was 100 ⁇ g with respect to 1 ⁇ mol of lipid, and allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour to incorporate ADR into the ribosome.
  • Comparative Example 1 A ribosome was produced without retaining PEG in the same manner as in Example 1 except that the PEG-PE complex was not added.
  • the ADR encapsulation rate was measured for each ribosome of Examples 1 and 2 and Comparative Example 1.
  • FIG. 1 shows the results for A: the ribosome of Example 1; B: the ribosome of Example 2; C: the ribosome of Comparative Example 1.
  • the temperature-sensitive ribosome of the present invention has a higher temperature at which ADR is released compared to ribosomes that do not retain PEG.
  • the temperature-sensitive ribosome of Example 1 has a rapid increase in the ADR release rate especially at temperatures exceeding 40 ° C.
  • FIG. 3 is a graph showing the ADR release rate 3 minutes after the ribosome of Example 1 was incubated at 37 ° C. or 45 ° C.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1 except that the polymer compound was not added to Example 1, a ribosome without retaining the polymer compound was produced.
  • Example 1 a ribosome that retains neither the polymer compound nor PEG was produced in the same manner as in Example 1 except that the polymer compound and the PEG-PE complex were not added.
  • LNulin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 1 mg was dissolved in 90 ml of distilled water kept at 4 ° C. There Periodic acid (0.1M 10ml) was added to the mixture, and the mixture was stirred at 4 ° C for 15 minutes. Then add Ba (OH)
  • PBS containing 125 ⁇
  • irradiate with ultrasonic waves and hydrate the lipid by freezing in a 20 ° C methanol bath and thawing in a 20 ° C water bath 5 times.
  • Ribosomes were prepared by The obtained ribosome dispersion was passed through a polycarbonate membrane having a pore size of lOOnm in an ice bath using an etastrode to adjust the ribosome particle size.
  • 125 ⁇ - ⁇ -containing temperature-sensitive ribosomes were isolated by ultracentrifugating the ribosome dispersion (85000 ppm, 4 ° C, 30 min).
  • the ribosome pharmacokinetics were evaluated using ICR mice (male, 6 weeks old).
  • Various ribosome dispersions of the unmodified ribosome, PEG-modified ribosome, polymer compound-modified ribosome, and temperature-sensitive ribosome of the present invention containing 125 to TI obtained as described above were added in an amount of 500 g / unit of lipid.
  • the tail vein force of mice was also administered. Thereafter, blood was collected from the fundus vein under ether anesthesia at a predetermined time (0.5, 1, 3, 6, 14, 24 hr). The radioactivity in the obtained blood was evaluated by the ratio (%) to the total dose using a ⁇ counter (AUTO WELL GAMMA SYSTEM ARC-370M manufactured by ALOKA).
  • mice The total blood volume of mice was calculated as 7.3% of body weight.
  • the results are shown in FIG. FIG. 5 shows the results for ⁇ : unmodified ribosome, A: PEG-modified ribosome, ⁇ : polymer compound-modified ribosome, and country: temperature-sensitive ribosome of the present invention.
  • Each organ liver, spleen, kidney, heart, unmodified ribosome containing 125 I-TI, PEG-modified ribosome, polymer compound-modified ribosome, and temperature-sensitive ribosome of the present invention obtained as described above. Distribution to the lung) was carried out in the same manner as in the evaluation of the retention of ribosome in blood. All parts of each organ were used, and the amount of ribosome accumulated was measured over time (0.5, 1, 3, 6, 14, 24 hr).
  • FIG. 6 shows the amount of ribosome accumulated in each organ after A: 0.5 hour, B: 1 hour, C: 3 hours, D: 6 hours, E: 14 hours, and F: 24 hours.
  • FIG. 6 shows unmodified: unmodified ribosome, PEG-polymer: temperature-sensitive ribosome of the present invention, PEG: PEG-modified ribosome, and polymer: polymer compound-modified ribosome.
  • the temperature-sensitive ribosome of the present invention showed a blood retention similar to that of a PEG-modified ribosome known to have a high blood retention.
  • FIG. 6 shows that the temperature-sensitive ribosome force PEG-modified ribosome of the present invention shows the same body distribution.
  • Test Example 5 Anticancer activity by temperature-sensitive ribosome containing ADR
  • the tumor growth inhibitory effect by administering the temperature-sensitive ribosome of the present invention containing ADR and locally heating the tumor site was examined by the following experiment. Production of tumor-bearing mice
  • Mouse colon cancer cells were transplanted subcutaneously into the left flank of BALB / c mice (female, 7 weeks old) by 1.0 ⁇ 10 6 (PBS 50 ⁇ ) subcutaneously to allow the mice to carry cancer.
  • the experiment was conducted using tumor-bearing mice 10 days after tumor implantation (tumor volume: about 150 mm 3 ).
  • the temperature sensitive ribosome of Example 1 or the ribosome of Comparative Example 2 was administered to the tumor-bearing mouse via the tail vein so that the ADR dose per unit weight of the mouse was constant (6 mg / kg body weight).
  • HBS buffer was administered.
  • the tumor site was heated to 45 ° C. for 10 minutes using RF-hyperthermia HEH-100 (manufactured by OMRON). This temperature is the temperature on the skin of the mouse, and was measured using a digital thermometer DELTA SK-1 250MC (manufactured by Sato Keiki Seisakusho).
  • Anticancer activity was evaluated by measuring tumor volume and mouse body weight every two days immediately before administration of ribosome. The volume of the tumor was determined by measuring the short diameter and long diameter using calipers and calculating from the following formula.
  • Fig. 7 shows the results when the ribosomes were heated for 6 hours or administered with force.
  • the mouth, ⁇ , and ⁇ represent the cases where various ribosomes were not heated, and the countries, ⁇ , and ⁇ represent the results when various ribosomes were administered and heated.
  • the mouth and the country represent the results when the HBS buffer was administered, ⁇ and the results when the ribosome of Comparative Example 2 was administered, and ⁇ and ⁇ represent the results when the ribosome of Example 1 was administered.
  • Each measurement point represents the mean value SD for 4 mice.
  • the results in FIG. 8 show that tumor growth is most suppressed when the tumor site is locally heated 12 hours after administration of the temperature-sensitive ribosome of the present invention. Although the tumor growth-inhibiting effect is observed even after heating 3 hours after administration, a larger amount of the temperature-sensitive ribosome of the present invention is considered to have accumulated at the tumor site after 12 hours.
  • mice were used for each experiment. Each measurement point represents the mean value SD for 4 mice. The results are shown in FIG.
  • FIG. 10 The result is shown in FIG. In FIG. 10, the country shows the results when the temperature-sensitive ribosome of the present invention is administered, and the ⁇ shows the results when the HBS buffer is administered. Each measurement point is Mean value SD for 4 mice is shown.
  • the control mice have lost weight, whereas the mice that have been warmed by administration of the temperature-sensitive ribosome of the present invention containing ADR have increased body weight. did. This is because the control mice were weakened by the growth of the tumor and the body weight was reduced. In the mice heated with the temperature-sensitive ribosome of the present invention containing ADR, the tumor growth was suppressed. This is thought to be the result of weight loss accompanying tumor growth. From this result, it can be seen that even when the temperature-sensitive ribosome of the present invention is administered, no side effects such as weight loss are observed.
  • Example 1 an ADR-containing temperature-sensitive ribosome can be produced using a polymer compound produced as follows as the polymer compound.
  • Example 1 instead of PEG5000-distearoylphosphatidylethanolamine, PEG350-distearoylphosphatidylethanolamine (1,2 distearoyl sn-glycero 3-phosphoethanolamine N [ ⁇ -toxyl (polyethyleneglycol 350), manufactured by Avanti Polar Lipids) (Example 5), PEG2000 distearoylphos Fattydylethanolamine (1,2 Distearoyl sn Glyce 3 Phosphoethanolamine—N— [Poly (ethylene glycol) —2000] manufactured by Avanti Polar Lipids) (Example 6 PEG350-Dimyristoylphosphatidylethanolamine (1,2 Dimyristoyl sn-glyce 3-phosphoniethanolamine N [ ⁇ Toxy (polyethyleneglycol 350) manufactured by Avanti Polar Lipids (Example 7) PEG3000 Dimyristoyl phosphatidylethanolamine (1,2 dimyristoyl sn glyce
  • a temperature-sensitive ribosome that can release a drug at a target site and has a long residence time in blood when administered into human blood can be obtained.

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Abstract

　本発明は、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコールとが、リポソーム膜に担持されてなる温度感受性リポソームである。

Description

温度感受性リボソームおよび温度感受性薬剤放出システム 技術分野
[0001] 本発明は、特定温度でその膜構造が崩壊する温度感受性リボソーム、および該温 度感受性リボソームと薬剤とからなる温度感受性薬剤放出システムに関する。
背景技術
[0002] リボソームは、リン脂質など力 なる脂質二重膜で構成され、数十〜数百 nm程度の 粒径を持つ閉鎖小胞体で、様々な物質を封入することができるナノカプセルとして機 能することが知られている。近年、生体由来のリン脂質を用いて作成したリボソームと 、抗癌剤や治療用遺伝子のような薬剤とからなる、目的の部位に薬剤を送達するた めの薬物送達システム (DDS)が開発されている。このような用途に用いられるリポソ ームは、親水性の薬剤を閉鎖小胞体の内部の親水性領域に内包するか、および Z または疎水性の薬剤を脂質二重膜に担持する。
[0003] リボソームを用いた DDSの開発は広く行われており、血管中でのリボソームの滞留 性を向上させたり、目的とする臓器に確実にリボソームを送達するためにリボソーム表 面を抗体で修飾したりすることなどが行われている。
[0004] リボソームを用いて例えば抗癌剤を目的部位に送達するメカニズムとしては、次の ようなことが考えられる。癌細胞周辺の微小血管には 200nm程度の穴が多く存在し ている。よって、抗癌剤を含有するリボソームの粒径を 200nm程度とすることにより、 該リボソームは目的とする癌細胞付近で微小血管力 漏れ出して、目的の癌細胞に 到達することができる。このようにして、抗癌剤含有リボソームは、目的とする癌細胞 周辺部位に特異的にかつ高濃度で蓄積することができる。一方、正常な細胞の周辺 の微小血管にはこのような穴が存在しないので、正常な細胞周辺ではリボソームが血 管から漏れ出すことはない。
[0005] し力しながら、リボソームが含有する薬剤の効能を得るためには、薬剤含有リポソ一 ムが上記のメカニズムで目的部位に到達した後に、該薬剤がリボソームから効率的に 放出されることが必要である。 [0006] 非特許文献 1および 2には、特定温度で崩壊して内包物を放出できるリボソームに ついて、抗癌剤を内包させたリボソームを癌の温熱療法と併用することにより、優れた 治療効果が得られることが報告されて 、る。
[0007] 特許文献 1には、感熱応答性部分と疎水性部分とを有する高分子化合物を、その 疎水性部分を介してリボソーム膜に保持したリボソームが開示されている。このような リボソームは、内包物を特定温度で放出することができるので、例えば医薬品を内包 してなるリボソームをヒトに投与し、患部を温めることによりその部分で内包物を放出さ せることができることが記載されて!ヽる。
[0008] また特許文献 1には、このリボソームは、 10〜： LOO°C程度の温度範囲で脂質二重 膜の構造が崩壊し、該リボソームに内包される成分が放出されることが記載されてい る。
[0009] し力しながら、上記の特許文献 1に開示のリボソームは、ヒトの体温に近い 36°C付 近で崩壊するので、該リボソームを人体に投与したときに、目的部位に到達する前に リボソームに内包させた物質が放出され、目的部位で特異的にかつ効率よく物質を 放出させるのには不充分であると思われる。
[0010] また、特許文献 1に記載のリボソームは、血中滞留時間が短ぐ目的部位に到達す る前に体外に排出される傾向が高いと考えられる。
特許文献 1：特開 2003— 212755号公報
非特許文献 1 :「癌の臨床」第 32卷、第 13号（1986)
非特許文献 2 :「総合臨床」第 37卷、第 1号（1988)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 薬剤などを保持するリボソームを、医薬分野にお!ヽてより実用性の高 ヽ温度感受性 リボソームとするためには、次の特性を有することが望まれる。
(1)哺乳動物、特にヒトの体温に近い温度、すなわち 34〜38°C付近では薬剤を安 定的に保持することができる；
(2)哺乳動物、特にヒトの体温から離れた温度、すなわち 38°C以上、好ましくは 40〜 45°C付近で急激に薬剤を放出することができる； (3)哺乳動物、特にヒトの体内での血中滞留時間が長い。
[0012] 本発明者らは、鋭意検討の結果、リボソーム膜構成脂質と、感熱性応答部分およ び疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコール (PEG)とから構成さ れるリボソームは、リボソーム膜構造の崩壊温度が従来のリボソームのリボソーム膜構 造崩壊温度よりも 5〜9°C高ぐ上記の（1)〜（3)の特性を有することを見出して、本 発明を完成した。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明は、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリェチ レンダリコールと力 リボソーム膜に担持されてなる温度感受性リボソームである。 本発明は、リボソーム膜構成脂質と、感熱応答性部分および疎水性部分を有する 高分子化合物と、ポリエチレングリコールとから構成されてなり、リボソーム膜構成脂 質：高分子化合物：ポリエチレングリコールのモル比が 1： 0.003〜0.2： 0.001〜0.2 の割合で、リボソーム膜構成脂質と高分子化合物とポリエチレングリコールとを用いて 得られる温度感受性リボソームでもある。
また本発明は、上記の温度感受性リボソームと薬剤とからなる温度感受性薬剤放出 システムである。
さらに、本発明は、治療または予防を必要とするヒトを含む哺乳動物に、前記温度 感受性薬剤放出システムの有効量を投与することからなる治療または予防方法を提 供する。
発明の効果
[0014] 本発明の温度感受性リボソームを用いることにより、従来のリボソームの崩壊温度よ りも高温の温度範囲、すなわちヒトの体温力 離れた温度範囲でリボソームの膜構造 が崩壊してリボソームが保持する薬剤を放出することができる、より実用性に優れた 薬剤放出プロフィールを示す温度感受性薬剤放出システムを提供することができる。 また、本発明の温度感受性リボソームは、ポリエチレングリコールを含むことから、より 長い血中滞留性を示すこともできる。
例えば本発明の温度感受性リボソームに薬剤として抗癌剤を含有させた前記温度 感受性薬剤放出システムは、ヒトを含む対象者に投与し、投与後の適当な時期に患 部を 40〜45°C程度に加熱する温熱療法を施すことにより、患部で特異的に効率よく 抗癌剤を放出させることができ、より好まし 、DDSとすることができる。
図面の簡単な説明
[図 1]本発明によるアドリアマイシン (ADR)含有の温度感受性リボソームからの ADRの 放出率の時間変化を示すグラフである (A：実施例 1； B：実施例 2； C：比較例 1)。
[図 2]本発明による ADR含有の温度感受性リボソーム力 の ADRの放出率の温度依 存性を示すグラフである。
[図 3]本発明の実施例 1の温度感受性リボソームを、ゥシ胎児血清を含む条件下で、 37°Cまたは 45°Cでインキュベートしたときの ADRの放出率を示すグラフである。
[図 4]本発明による ADR含有の温度感受性リボソーム力 の ADRの放出率の温度依 存性を示すグラフである。
[図 5]本発明による温度感受性リボソームの血中滞留性について調べた結果を表す グラフである。この図において、♦:未修飾リボソーム、▲: PEG修飾リボソーム、〇： 高分子化合物修飾リボソーム及び國：本発明の温度感受性リボソームについての結 果を示す。
[図 6]本発明によるリボソームについて、 A: 0.5時間、 B: l時間、 C : 3時間、 D: 6時間、 E : 14時間、 F: 24時間後の各臓器におけるリボソームの蓄積量を示すグラフである。
[図 7]本発明による ADR含有の温度感受性リボソームを投与した後の腫瘍体積の変 化を表すグラフである。この図において、口： HBS緩衝液を投与して加温しな力つた 場合、國： HBS緩衝液を投与して加温した場合、△:比較例 2のリボソームを投与して 加温しな力つた場合、▲:比較例 2のリボソームを投与して加温した場合、〇：実施例 1のリボソームを投与して加温しな力つた場合、參：実施例 1のリボソームを投与して 加温した場合を示す。
[図 8]本発明による ADR含有の温度感受性リボソームを投与した後の加温時期による 腫瘍体積の変化を示すグラフである。この図において、リボソームを投与してから國： 3時間、 時間、參： 12時間後にそれぞれ加温した場合の腫瘍体積の変化を示 す。
[図 9]本発明による ADR含有の温度感受性リボソームに含まれる ADRの投与量を変 化させた場合の腫瘍体積の変化を示すグラフである。この図において、マウスの単位 重量あたりの ADR投与量が 0 mg/kg-体重 (園)、 6 mg/kg-体重 (▲)、 8 mg/kg-体重 (♦ )および 12 mg/kg-体重 (參)であった。
[図 10]本発明による ADR含有の温度感受性リボソームの投与によるマウスの体重変 化を表すグラフである。この図において、國：本発明の温度感受性リボソーム、 4 : HB S緩衝液をそれぞれ投与した場合のマウスの体重変化を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明のリボソームは、リボソーム膜構成脂質と、感熱応答性部分および疎水性部 分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコール (PEG)とから構成される。具体 的には、高分子化合物および PEGがリボソーム膜に担持されてなる。本明細書にお いて、物質が「リボソーム膜に担持される」とは、該物質がリボソーム膜に結合してリポ ソーム膜表面力 突出していてもよいし、リボソーム膜を構成する脂質二重膜に該物 質の一部分もしくは全体が埋め込まれて 、てもよ 、。
[0017] 本発明の温度感受性リボソームは、 34〜39°C付近ではリボソーム膜構造が安定に 構成されてリボソームに保持され得る薬剤を安定的に保持することができ、かつ 40〜 45°C付近で急激にリボソーム膜構造が崩壊して該薬剤を放出することができるのが 好ましい。すなわち、 37°Cで 3分間インキュベートした後のリボソームからの薬剤の放 出率が 5%以下、より好ましくは 4.5%以下であり、かつ 45°Cで 3分間インキュベート した後のリボソーム力もの薬剤の放出率が 85%以上、より好ましくは 87%以上である のが好ましい。本明細書における薬剤の放出率は、以下の実施例に記載のアドリア マイシン (ADR)の放出率の測定方法にしたがって測定される値である。
[0018] 本発明において、リボソーム膜構造が特定の温度で崩壊される機構は明確ではな いが、おそらぐ温度が上昇すると高分子化合物の感熱応答性部分が脱水和し、感 熱応答性部分の疎水性が増大して、当初リボソーム膜外で担持されていた感熱応答 性部分の全体または一部がリボソーム膜に入り、リボソーム膜の構造が崩壊すると考 えられる。本発明では、両親媒性である PEGが脱水和した高分子化合物に何らかの 相互作用を及ぼすことにより、脱水和した高分子化合物がリボソーム膜の構造を崩壊 させる温度（以下、リボソーム膜崩壊温度ともいう）を、従来のリボソームのリボソーム 膜崩壊温度に比べてより高くすることができると考えられる。
[0019] ポリエチレングリコール（PEG)について
本発明の温度感受性リボソームに用いられるポリエチレングリコール (PEG)は、通 常、リボソームに用いられるものを好適に用いることができる。このような PEGの分子 量 ίま、 120〜 12000力 S好ましく、より好ましく ίま 350〜12000、さらに好ましく ίま 350
〜5000である。このような範囲の分子量を有する PEGを用いると、リボソーム崩壊温 度を好ま 、範囲内にすることができる。
[0020] 上記の PEGは、 PEG誘導体を高分子化合物およびリボソーム膜構成脂質と接触さ せることにより、本発明の温度感受性リボソームを構成することとなるのが好ましい。 P
EG誘導体とは、次の式 (ΠΙ) :
R'—（PEG)— X— R (III)
(式中、（PEG)は上記のような分子量のポリエチレングリコールを表し、 R'は、水素原 子、メトキシ基、または（PEG)と 2価の結合手を介して結合していてもよい反応性基 であり、 Rは、リボソーム膜構成脂質が有する基と反応性を有する基または脂質に由 来する基であり、 Xはリンカ一である）
で表される化合物である。
[0021] 式 (ΠΙ)における R'が反応性基である場合、該反応性基としては特に限定されな 、 力 例えばアミノ基、 N-ヒドロキシスクシンイミドとのエステルを形成していてもよいカル ボキシル基、ピオチュル基、マレイミド基、ニトロフエ-ル基、アルデヒド基、ァセター ル基、トレシル基、チオール基などが挙げられる。 2価の結合手としては、例えば C 00—、 一 CH —、 一 CH CH 一、 CH CH CH 一、 COCH CH 一、 COCH CH
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
CH―、 一 NHCO—、 -NHCO -CH CH—などが挙げられる。
2 2 2
式 (ΠΙ)における Xとしてのリンカ一は、 Rの種類に応じて適宜選択することができ、 例えば一 CO—、 -COCH CH CO—、 -COCH CH CH CO などが挙げられる。
2 2 2 2 2
[0022] 式 (ΠΙ)における Rがリボソーム膜構成脂質の有する基と反応性を有する基である P EG誘導体については、例えば W098Z32466号などに記載されており、これらを 用いることができる。このような PEG誘導体は、リボソーム膜構成脂質の有する基、例 えばホスファチジルエタノールアミンゃホスファチジルセリンが有するァミノ基と結合で きるので、リボソーム膜に PEGが結合されることとなる。
[0023] 上記の PEG誘導体は、式 (III)における Rが脂質に由来する基である化合物が好 ましい。このような化合物は、 PEG—脂質複合体と表すことができる。このような PEG 誘導体は、リボソーム膜構成脂質と接触することにより、 PEG 脂質複合体を構成す る脂質部分がリボソーム膜に入り込むことができるので、 PEGがリボソーム膜に担持さ れることとなる。
[0024] 上記の PEG 脂質複合体を構成する脂質は、天然脂質であってもよいし、合成脂 質であってもよい。天然脂質としては、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジ ルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジル グリセロールなどのグリセ口リン脂質；セレブロシドなどのスフインゴ糖脂質；ジァシル グリセローノレなどのグリセリド；コレステロ一ノレ、ラノステロ一ノレ、エノレゴステロ一ノレなど のステロイドが挙げられる。合成脂質としては、アミノ基、水酸基、カルボキシル基など の反応性官能基を有する合成脂質が挙げられる。なかでも、ホスファチジルエタノー ルァミン、ジァシルグリセロールおよびコレステロール力 なる群より選択されるのが 好ましい。これらの脂質は、 1種を用いてもよぐ 2種以上を用いてもよい。上記のリン 脂質の構成脂肪酸としては特に限定されないが、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステア リン酸、ァラキドン酸、ォレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラウリン酸などが挙げられる
[0025] 上記のような PEG—脂質複合体は市販品を用いることができ、その例としては次の ようなものが挙げられる（いずれも Avanti Polar Lipids社製、商品名）。
1,2-ジミリストイル sn—グリセロー 3 ホスホエタノーノレアミン N [^トキシ (ポリ エチレングリコール) 350] ;
1,2-ジミリストイル sn—グリセロー 3 ホスホエタノーノレアミン N [^トキシ (ポリ エチレングリコール) 550] ;
1,2-ジミリストイル sn—グリセロー 3 ホスホエタノーノレアミン N [^トキシ (ポリ エチレングリコール) 750] ;
1,2-ジミリストイル sn—グリセロー 3 ホスホエタノーノレアミン N [^トキシ (ポリ エチレングリコール )ー 1000]； 1,2—ジミリストイルー sn—グリセ口- 3 [^トキシ (ポリ エチレングリコール ) 3000] ;
[0026] 1,2 ジミリストイルー sn—グリセロ- 3 [ポリ (ェチレ ングリコール ) 2000] ;
1,2—ジミリストイルー sn—グリセロ- 3 [ポリ (ェチレ ングリコール ) 5000] ;
[0027] 1,2 ジォレオイル sn—グリセ口- 3 [^トキシ (ポリ エチレングリコール) 350] ;
1,2—ジォレオイル sn—グリセ口- 3 [^トキシ (ポリ エチレングリコール) 550] ;
1,2—ジォレオイル sn—グリセ口- 3 [^トキシ (ポリ エチレングリコール) 750] ;
1,2—ジォレオイル sn—グリセ口- 3 [^トキシ (ポリ エチレングリコール )ー 1000]；
1,2—ジォレオイル sn—グリセ口- 3 [^トキシ (ポリ エチレングリコール ) 3000] ;
[0028] 1,2 ジォレオイル sn—グリセロ- - 3 [ポリ (ェチレ ングリコール ) 2000] ;
Figure imgf000010_0001
- 3 [ポリ (ェチレ ングリコール ) 5000] ;
[0029] 1,2-ジパルミトイル sn グリセ口一 3 ホスホエタノールァミン一 N - [ァミノ (ポリ エチレングリコール)— 2000]ナトリウム塩；
1,2-ジパルミトイル sn—グリセロー 3 ホスホエタノールアミンー N [ピオチュル (ポリエチレングリコール)— 2000]ナトリウム塩；
[0030] 1,2-ジパルミトイル sn—グリセロー 3 ホスホエタノールアミンー N [カルボキシ NHSエステル (ポリエチレングリコール) 2000]ナトリウム塩；
1,2 ジパルミトイルー sn—グリセ口一 3 ホスホエタノールァミン一 N— [マレイミド（ ポリエチレングリコール)一 2000]ナトリウム塩； [0031] 1,2 ジパルミトイル- -sn—グリセ口 -3—ホスホエタノールァミン一 N [^トキシ (ポ リエチレングリコール) 350];
1,2—ジパルミトイル- -sn—グリセ口 -3—ホスホエタノールァミン一 N [^トキシ (ポ リエチレングリコール) 550];
1,2—ジパルミトイル- -sn—グリセ口 -3—ホスホエタノールァミン一 N [^トキシ (ポ リエチレングリコール) 750];
1,2—ジパルミトイル- -sn—グリセ口 -3—ホスホエタノールァミン一 N [^トキシ (ポ リエチレングリコール) 1000];
1,2—ジパルミトイル- -sn—グリセ口 -3—ホスホエタノールァミン一 N [^トキシ (ポ リエチレングリコール) 3000];
[0032] 1,2 ジパルミトイル- -sn—グリセ口 -3—ホスホエタノールァミン一 N [ポリ (ェチレ ングリコーノレ)— 2000];
1,2—ジパルミトイル- -sn—グリセ口 -3—ホスホエタノールァミン一 N [ポリ (ェチレ ングリコーノレ)一 5000];
[0033] 1,2 ジステアロイノレ -sn—グリセ口 -3-ホスホエタノールアミンー N [メトキシ (ポ リエチレングリコール) - 350];
1,2—ジステアロイノレ -sn—グリセ口 -3-ホスホエタノールアミンー N [メトキシ (ポ リエチレングリコール) - 550];
1,2—ジステアロイノレ -sn—グリセ口 -3-ホスホエタノールアミンー N [メトキシ (ポ リエチレングリコール) - 750];
1,2—ジステアロイノレ -sn—グリセ口 -3-ホスホエタノールアミンー N [メトキシ (ポ リエチレングリコール) - 1000];
1,2—ジステアロイノレ -sn—グリセ口 -3-ホスホエタノールアミンー N [メトキシ (ポ リエチレングリコール) - 3000];
[0034] 1,2 ジステアロイノレ -sn—グリセ口 -3—ホスホエタノールァミン一 N— [ポリ (ェチレ ングリコーノレ)— 2000]
1,2—ジステアロイノレ -sn—グリセ口 -3—ホスホエタノールァミン一 N— [ポリ (ェチレ ングリコーノレ)一 5000]< [0035] 上記の温度感受性リボソームは、 PEGを、リボソーム膜構成脂質、高分子化合物お よび PEGの全モル数に対して 0.1〜30モル0 /0の量で用いて得られるのが好ましぐ より好ましくは 1〜6モル0 /0である。
[0036] 高分子化合物について
本発明の温度感受性リボソームに用いられる高分子化合物は、感熱応答性部分を 有する高分子化合物である。特に、感熱応答性部分と疎水性部分とを有する高分子 化合物であることが好ましい。このような高分子化合物は、水和可能なヘテロ原子を 1 個以上含む感熱応答性ビュル系モノマーと、疎水性ビュル系モノマーとのブロック共 重合体が好ましい。
[0037] 水和可能なヘテロ原子としては、酸素原子、窒素原子などが挙げられる。水和可能 なへテロ原子の数の上限は、重合を行える範囲であれば特に限定されない。水和可 能なヘテロ原子を含む基としては、— CH— CH— 0—、— CO—、— COO—、 -CO
2 2
NH—、 一NHCOO—などが挙げられる。
[0038] また、疎水性ビニル系モノマーとしては、炭素数 3〜40個程度、特に炭素数 4〜30 個程度の各種の脂肪族、脂環族または芳香族の炭化水素基を有するビニル系モノ マーを使用できる。
[0039] 前記のブロック共重合体において、ヘテロ原子を 1個以上含む感熱応答性ビニル 系モノマーと疎水性ビュル系モノマーとの共重合比率は、各モノマーの種類によって も異なるが、通常 300 : 1〜3 : 1程度、特に 200 : 1〜： L0 : 1程度が好ましい。この範囲 内であれば、高分子化合物をリボソーム膜に安定に保持できる。
[0040] 高分子化合物の数平均分子量のうち感熱応答性部分に該当する量は、特に制限 されないが、通常、数百〜数十万程度である。特に、 1,000〜30,000程度、さらに 特に 10,000〜20,000程度とすることが好ましぐこれによりリボソーム膜構造の崩壊 温度をより狭い温度範囲とすることができる。
[0041] 上記の高分子化合物全体の分子量は、特に制限されないが、通常、数平均分子 量で数百〜数十万程度とすればよい。この範囲内であれば、リボソーム膜に安定に 保持される。より好まし <は 2,000〜50,000程度、さらに好まし <は 10,000〜25,00 0程度、特に好ましくは 11,000〜22,000程度であり、これによりリボソーム膜構造の 崩壊温度をより狭い温度範囲とすることができる。
[0042] 上記の高分子化合物の分子量分布 (重量平均分子量 (Mw)Z数平均分子量 (Mn)) は、通常 1〜4程度、特に 1.0〜1.5程度が好ましい。この範囲内であれば、リポソ一 ム膜構造の崩壊温度をより狭い温度範囲とすることができる。
本発明に用いられる高分子化合物の数平均分子量および重量平均分子量は、そ れぞれ以下の実施例に記載の方法により測定した値である。
[0043] 本発明の温度感受性リボソームは、上記の高分子化合物を、リボソーム膜構成脂 質、高分子化合物および PEGの全モル数に対して 0.1〜20モル％程度用いて得ら れるのが好ましぐより好ましくは 0.5〜5モル％程度である。この範囲内であれば、リ ポソームを充分に温度感受性とすることができるとともに、実用上充分に安定なリポソ ームが得られる。
[0044] 高分子化合物の好適な具体例としては、以下の式 (I)：
[0045] [化 1]
R'-(CH— CH-) ~ (CH2—CH)—R4
ό 0 (り
R;i
CH ,
[0046] 〔式中、 R1は水素原子、以下の式 (Π) :
[0047] [化 2]
CX3—— CH——
O (ID
[0048] (式中、 Xは同一または異なって、水素原子またはハロゲン原子であり、 R11は水素原 子、炭素数 1〜20のアルキル基またはァリール基である。 )
で表される基または重合開始剤に由来する基であり、 R2は炭素数 1〜8のアルキル基 、炭素数 1〜8のハロゲン化アルキル基、アルデヒド基、フヱ-ル基、ビフヱ-ル基ま たは炭素数 7〜 14のァラルキル基であり、 R3は炭素数 4〜30の炭化水素基であり、
R4は水素原子または炭素数 1〜10のアルコキシ基または重合停止剤に由来する基 であり、 miま 5〜500、 ηίま 1〜10、 yiま 0〜： LOOである。〕
で表される化合物が挙げられる。
[0049] 上記の式 (I)における R2は、上記列挙した基のうち、特に炭素数 1〜4個程度のァ ルキル基であることが好まし 、。
[0050] 上記の式 (I)における R3は、炭素数 4〜30個程度の炭化水素基である力 このよう な基としては、アルキル基、ァリール基、ァラルキル基などが挙げられる。特に、炭素 数 8〜30個程度の直鎖アルキル基が好まし 、。
[0051] 上記の式（I)における mと nとの比率は、 、 R2、
Figure imgf000014_0001
R4の種類およびォキシエチレン 鎖の長さなどによっても異なる力 m： nが 300： 1〜3： 1程度、特に 200： 1〜10： 1程度と なるようにすればよい。
[0052] 上記のように、 yは 0〜： LOO程度であり、 y=0の場合にはォキシエチレンは存在しな い。 yは特に 0〜 10程度であることが好ましい。ォキシエチレン鎖が長いほど、リポソ ーム膜構造の崩壊温度を高くすることができる。
[0053] 上記の式 (Π)における Xとしてのハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原 子およびヨウ素原子から選択される。
[0054] 上記の式 (I)の高分子化合物は、ビニルモノマーの種類によっても異なる力 カチ オン重合などの公知の方法でモノマーを重合させることにより得ることができる。重合 方法としては、特に、リビングカチオン重合が好ましい。リビングカチオン重合法は、 例えば特開平 1-108202号公報、特開平 1-108203号公報、特開 2001-055408号公報 、特開 2000-198825号公報、特開平 8-269118号公報に記載されている。
リビングカチオン重合の重合開始剤としては、例えば特開平 1-108202号公報また は特開平 1-108203号公報に記載の重合開始剤、ィ-ファー法 (米国特許 4276394号 )で用いられて 、る重合開始剤 ( a位に芳香環を有する塩素化合物)から得られる置 換基（特開 2001- 055408号公報）、東村らにより Macromolecules,17,265,1984におい て報告されている重合開始剤 (ヨウ化水素とヨウ素とを組み合わせた重合開始剤)、特 開昭 62-48704号公報、特開昭 64-62308号公報に記載されて ヽる重合開始剤などが 挙げられる。
[0055] リビングカチオン重合によると、モノマーが無くなる力または重合停止剤を添加する まで成長末端が消滅しないため、感熱応答性部分および疎水性部分の各鎖長ひい ては高分子化合物の分子量を容易に所望の値にすることができる。また、他の重合 法に比べて、狭 、分子量分布の高分子材料を得ることができる。
[0056] 上記の高分子化合物の好ましい例は、次に挙げるものである。
[0057] [化 3]
Figure imgf000015_0001
R1— (CH2-CH)„r<CH2-CH)H- 4 I
に (CH2) i 7
0 I 2 17
CH3
0 0
、0 (vi)
2
[0058] (上記の各式中、 R1は、水素原子または- C(H)(CH )(OCH CH(CH ) )もしくは- C(H)(C
3 2 3 2
H )(OC H OC H OCH )のような重合開始剤に由来する基であり、 R2は CH、 C H、 n
3 2 4 2 4 3 3 2 5
-もしくはイソ- C Hまたは n-もしくはイソ- C Hであり、 R4は水素原子またはメトキシ基
3 7 4 9
のような重合停止剤に由来する基であり、 mおよび nは、高分子化合物の数平均分子 量 (Mn)が 11, 000〜50, 000程度であり、分子量分布 (MwZMn)が 1. 0〜1. 3程度 となるような値である。 )
なお、上記の式 (IV)〜(VI)の化合物は、式 (IV)〜(VI)における側鎖としてのオタタデ シルォキシ基がドデシルォキシ基、テトラデシルォキシ基またはへキサデシルォキシ 基で置換された化合物が少量混合して ヽてもよ ヽ。
[0059] また、上記の式 (IV)〜(VI)の化合物において、式 (IV)〜(VI)における側鎖としてのォ クタデシルォキシ基がドデシルォキシ基、テトラデシルォキシ基またはへキサデシル ォキシ基で置換されたィ匕合物も好ましい例として挙げることができる。
[0060] 上記の好ましい高分子化合物の製造方法は、例えば以下の実施例に記載されるよ うに、適切な 2種類のモノマーを、重合開始剤およびルイス塩基 (例えば酢酸ェチル、 テトラヒドロフランなど)の存在下に、適切な溶媒 (例えばトルエン、へキサンなど)中で 重合すること〖こより製造することができる。上記の重合開始剤としては、例えば 1—メト キシエトキシェチルアセテート、 1— (イソブチル)ェチルアセテートなどが挙げられる。 重合は、アンモニア性メタノール、アンモニアなどをカ卩えることにより停止することがで さる。具体的には、 f列 は Journal of Polymer science: Part A: Polymerし hemistry, V ol. 30, p.2407-2413 (1992);Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, Vol. 43, p.1155- 1165 (2005); Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistr y, Vol. 43, p.2712-2722 (2005)に記載される方法などにより製造することができる。
[0061] リボソーム蹲構成脂皙について
本発明の温度感受性リボソームにおいて、リボソーム膜構成脂質としては、リポソ一 ムの膜脂質として通常用いられる両親媒性の脂質を用いることができる。このような脂 質としては、例えばホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジ ルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシト ール、カルジォリピン、スフインゴミエリン、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチ ジルコリンなどのリン脂質が挙げられる。これらのリン脂質の構成脂肪酸としては、ミリ スチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ァラキドン酸、ォレイン酸、リノール酸、リノレン 酸などが挙げられる。これらは単独でまたは 2種以上組み合わせて使用できる。特に 、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミンが好ましい。 [0062] また、活性物質として遺伝子を含有する場合には、上記のリン脂質の他に、公知の カチオン性の合成脂質を用いることができる。このようなカチオン性の合成脂質として は、例えば N— ( a—トリメチルアンモ-オアセチル）—ジドデシルグルタメート、 N—〔 1— (2,3 ジォレイルォキシ）プロピル〕 Ν,Ν,Ν トリメチルアンモ -ゥムクロリドぉ よび 1 ,2 ビス（ォレオイルォキシ） 3— (トリメチルアンモ -ォ）プロパンなどの第 4 級アンモ-ゥム塩が挙げられる。これらの脂質は、単独でまたは 2種以上組み合わせ て用いることができる。
[0063] リボソーム膜構成脂質には、コレステロール、ラノステロール、エルゴステロールなど のステロールが含まれて 、てもよ 、。
[0064] 温度感^件リボソームについて
本発明の温度感受性リボソームの粒径は、 0.05〜10 /z m程度であればよぐ使用目 的に応じて種々の粒径とすることができる。例えば、抗癌剤を温度感受性リボソーム に保持させて、癌細胞に送達するための温度感受性薬剤放出システムとして用いる 場合には、通常 0.05〜0.2 μ m程度、特に 0.05〜0.1 μ m程度の粒径であることが好ま しい。
[0065] 本発明の温度感受性リボソームは、上記の粒径の範囲内であれば、一層の脂質二 重膜からなる単層リボソーム、または複数の脂質二重膜からなる多重層リボソームの いずれであってもよい。
[0066] 本発明の温度感受性リボソームは、公知のリボソームの製造方法において、上記の ようなリボソーム膜構成脂質と、高分子化合物と、 PEG誘導体とを、リボソーム膜構成 脂質：高分子化合物： PEGのモル比が、 1： 0.003〜0.2： 0.001〜0.2の割合で接触 させること〖こより製造することができる。リボソーム膜構成脂質：高分子化合物： PEG のモノレ比は、より好ましくは 1 : 0.003〜0.1 : 0.01〜0.06であり、さらに好ましくは 1 : 0.01〜0.05 : 0.01〜0.03である。
公知のリボソームの製造方法としては、エタストルーダー法、超音波法、フレンチプ レス法などが挙げられる。これらの方法の詳細は、「リボソーム」（野島庄七、砂本順三 、井上圭三編、南江堂)および「ライフサイエンスにおけるリボソーム」（寺田弘、吉村 哲郎編、シュプリンガー'フエアラーク東京）に記載されている。 [0067] 例えば、エタストルーダー法により本発明のリボソームを製造する方法について説 明する。所定量のリボソーム膜構成脂質、高分子化合物および PEG誘導体を、クロ 口ホルムなどの適当な有機溶媒に溶解させた溶液をそれぞれ調製し、容器内に入れ て混合する。次いで、エバポレーターを用いて溶媒を除去し、容器壁にリボソーム膜 構成脂質と高分子化合物と PEGとからなる薄膜を形成させる。この膜は、さらに 3〜1 2時間程度真空乾燥させることが好ましい。次いで、この容器内に緩衝液などの適当 な溶液を投入し、超音波処理またはボルテックスミキサーなどを用いて強く攪拌する ことによりリボソームを形成させることができる。得られたリボソーム分散液をェクストル ーダ一に通し、そのフィルタ一孔径を適宜設定することにより、リボソームの粒径を調 節することができる。
[0068] 上記のようにして得られたリボソーム分散液から、担持されなかった高分子化合物、 PEG誘導体などを、ゲルろ過法、超遠心法、透析法などにより除去することができる 。除去したい物質が電荷を有する場合には、イオン交換クロマトグラフィーを用いるこ とちでさる。
[0069] 上記の製造方法にお!、て、リボソーム膜構成脂質、高分子化合物および PEG誘導 体を混合する順序としては特に限定されない。例えば、リボソーム膜構成脂質、高分 子化合物および PEG誘導体を一度に混合してもよいし、リボソーム膜構成脂質を用 いて上記のようなエタストルーダー法などにより予めリボソームを形成させた後に、高 分子化合物および PEG誘導体を同時にまたは別々に添加して、これらの成分をリポ ソーム膜に担持させてもよ 、。
[0070] 上記のような方法により製造される本発明の温度感受性リボソームにおいて、高分 子化合物の感熱応答性部分および PEGは、リボソーム膜の外側表面に担持されるも のであってもよいし、リボソーム膜の内側表面に担持されるものであってもよいし、リポ ソーム膜の外側表面および内側表面の両方に担持されるものであってもよい。上記 の製造方法において、リボソーム膜構成脂質、高分子化合物および PEG誘導体を 一度に混合する場合は、高分子化合物の感熱応答性部分および PEGは、リポソ一 ム膜の外側表面および内側表面の両方に担持されるが、リボソームを形成させた後 に高分子化合物および PEG誘導体を同時にまたは別々に添加する場合は、高分子 化合物の感熱応答性部分および PEGは、リボソーム膜の外側表面にのみ担持され る。
[0071] 温度感受性薬剤放出システムにつ ヽて
上記の温度感受性リボソームと薬剤とからなる温度感受性薬剤放出システムも本発 明の一つである。
上記の薬剤は、親水性物質および疎水性物質のいずれであってもよい。親水性物 質である場合は、温度感受性リボソームの内部の閉鎖空間の親水性領域に含有され 、疎水性物質である場合は、温度感受性リボソーム膜に担持されることとなる。
[0072] 上記の薬剤としては、特に限定されないが、例えば温熱療法と併用される抗癌剤、 抗炎症剤などが挙げられる。抗癌剤としては、シスブラチン、カルボブラチン、テトラ プラチン、ィプロブラチンなどの金属錯体；アドリアマイシン (ADR)、マイトマイシン、ァ クチノマイシン、アンサマイトシン、ブレオマイシン、 Ara-C、ダウノマイシンなどの制癌 抗生物質； 5-FU、メトトレキセート、 TAC-788などの代謝拮抗剤； BCNU、 CCNUなど のアルキル化剤；インターフェロン（ α、 j8、 γ )、各種インターロイキンなどのリンホカ インなどが挙げられる。また、抗炎症剤としては、プレドニン、リンデロン、セレスタミン などが挙げられる。
[0073] 上記の温度感受性リボソームは、上記の薬剤の代わりに疾患の治療のための遺伝 子も含み得る。このような遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、重症複合型 免疫不全症の治療のためのアデノシンデァミナーゼ遺伝子、家族性高コレステロ一 ル血症の治療のための LDL受容体遺伝子、癌治療のためのインターフ ロン (IFN)— a、 β又は γ遺伝子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM- CSF)遺伝子、 各種インターロイキン (IL)遺伝子、腫瘍壊死因子 (TNF)— α遺伝子、リンホトキシン (L Τ) - β遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)遺伝子、 Τ細胞活性化共刺激因 子遺伝子などが挙げられる。その他、アルッノヽイマ一病、脊椎損傷、パーキンソン病 、動脈硬化症、糖尿病、高血圧症などの治療のための遺伝子も挙げられる。
上記の薬剤の量は特に限定されず、薬剤の種類などにより適宜選択することができ る。
[0074] 上記の温度感受性薬剤放出システムの製造において、温度感受性リボソームに薬 剤を含有させる方法としては、薬剤の種類に応じて公知の方法を用いることができる 。該方法としては限定されないが、例えば上記の温度感受性リボソームの製造方法 に従って温度感受性リボソームを形成させた後に、薬剤を含む溶液に該リボソームを 浸漬させて薬剤をリボソームの内部に取り込ませる方法、上記の温度感受性リポソ一 ムの製造方法において薄膜が形成された容器内に、薬剤を含む溶液を投入した後 にリボソーム膜構造を形成させて薬剤を封入する方法などが挙げられる。
[0075] 本発明の温度感受性薬剤放出システムは、さらに少なくとも 1種の医薬添加剤を含 むのが好ましい。該温度感受性薬剤放出システムは、錠剤、粉末、カプセルなどの 固形製剤の形態であってもよ 、が、注射製剤のような液体製剤の形態が好まし ヽ。 該液体製剤は、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供 してちよい。
上記の錠剤及びカプセルは、通常の方法により腸溶コーティングを施すことが望ま しい。腸溶コーティングとしては、当該分野において通常用いられるものを利用できる 。また、カプセルは粉末または液体のいずれを含有することもできる。
[0076] 上記の温度感受性薬剤放出システムが液体製剤である場合、医薬添加剤は、担体
(例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど） 、等張化剤 (例えば塩ィ匕ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤 (例えばト コフエロール、ァスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール 、ノ ベンなど)などを含み得る。上記の担体は、温度感受性リボソームを製造する際 に用いる溶媒であり得る。
[0077] 上記の温度感受性薬剤放出システムが固形製剤である場合、医薬添加剤は、賦形 剤 (例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶 セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リ ン酸カルシウムなど)、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレン グリコールなど）、結合剤 (例えばマン-トール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、 ポリビュルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、崩壊剤（例えば馬鈴 薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋 ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などを含み得る。 [0078] 上記の温度感受性薬剤放出システムは、上記の薬剤を含む温度感受性リボソーム をそのまま、または凍結乾燥させて、上記の医薬添加剤と混合することにより製造す ることができる。薬剤を含む温度感受性リボソームを凍結乾燥する場合、凍結乾燥す る前に適当な賦形剤を添加しておくのがよい。
[0079] 本発明の温度感受性薬剤放出システムを対象者に投与して、患部を 40°C以上、 好ましくは 40〜47°C、さらに好ましくは 42〜45°C付近の温度に加熱することにより、 温度感受性リボソームの膜構造を崩壊させて薬剤を患部で放出させることができる。 このような方法により、患部に到達したリボソーム力 薬剤を特異的に効率よく放出さ せることが可能になる。
よって、本発明により、治療または予防を必要とする対象者に、上記の温度感受性 薬剤放出システムの有効量を経口又は非経口的に投与し、一定期間経過後に対象 の患部上方の皮膚を加熱することを含む、疾患の治療または予防方法が提供される
[0080] 上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
上記の一定期間は、温度感受性薬剤放出システムの投与後少なくとも 3時間が好 ましぐより好ましくは 3〜48時間、さらに好ましくは 6〜24時間、さらにより好ましくは 6〜 12時間である。
[0081] 本発明の治療方法において、患部の上方の皮膚を加熱する温度としては、投与さ れた温度感受性薬剤放出システムの少なくとも一部分が破壊されかつ患部の上方の 皮膚に火傷が発生しない程度の温度であればよい。例えば、患部の上方の皮膚の 温度が 38〜50°C、より好ましくは 39〜47°C、さらに好ましくは 42〜45°C程度の温 度になるように加熱することにより、温度感受性薬剤放出システムの少なくとも一部分 を破壊することができる。上記の加熱の際には、患部上方の皮膚に火傷が発生しな V、ように、加熱する部位の皮膚に保護布などをあててもよ!、。
患部の上方の皮膚を加熱する方法としては、温熱療法にぉ 、て用いられる方法で あれば特に限定されず、例えばレーザー、マイクロ波のような電磁波を照射する方法 が挙げられる。
[0082] 上記の温度感受性薬剤放出システムは、非経口および経口経路のいずれによって も投与することができる。例えば薬剤として抗癌剤を用いる場合は、非経口経路、特 に静脈注射による投与が好ましい。
[0083] 上記の温度感受性薬剤放出システムの投与量は、対象の重篤度およびリボソーム に含有される薬剤の量に応じて適宜選択することができる。
実施例
[0084] 本発明を、以下の実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例 により何ら限定されるものではな 、。
<分子量の測定方法 >
高分子化合物の重量平均分子量 (Mw)および数平均分子量 (Mn)は、それぞれゲ ルろ過クロマトグラフィー (GPC)の結果力も算出した。 GPCは、高速液体クロマトグラフ (TSKgelカラム G-200HXL+G- 3000 HXL+G- 4000HXL (東ソ一社製）、溶離液：クロ口 ホルム）を用いて行い、そのクロマトグラフィーの結果から、被験化合物の分子量をポ リスチレンを標準物質として算出することにより、ポリスチレン換算 Mw及び Mnとして求 めた。
[0085] くアドリアマイシンの放出試験 >
薬剤として、蛍光物質であり、抗癌剤として知られるアドリアマイシン (ADR)を用いて 、以下の方法でリボソームからの ADRの放出について調べた。
ADRを含有するリボソームを HBS緩衝液 (20mM Hepes、 150mM NaCl、 pH7.4)に分 散させ、このリボソーム分散液の温度を 10°Cに設定した。種々の濃度 (0〜50%)で牛 胎児血清（FCS)を含有した HBS緩衝溶液を所定の温度にし、この FCS含有 HBS緩衝 溶液に、該リボソーム分散液をリボソーム脂質濃度が 5 Mとなるように加え、所定の 時間経過後に蛍光強度を測定した。
[0086] ADRは高濃度において消光するので、リボソーム内部に封入されているときには蛍 光を発しないが、リボソーム内部力もリボソーム外部の緩衝液中に放出されると蛍光 を発する。よって、緩衝液を昇温させながらリボソーム分散液の蛍光をモニターするこ とにより、リボソームからの ADRの放出の程度を調べることができる。 ADRの励起波長 および蛍光波長はそれぞれ 470 nmおよび 590 nmとした。
[0087] リボソームからの ADRの放出率（％)は、以下の式を用いて算出した。 放出率 (％) = (Ft X FfZF'f— ） X 100
ここで、 ^は、所定の温度で所定の時間インキュベートしたときの蛍光強度；
F'fは、所定の温度で 30分経過後にトリトン X— 100を添加してリボソームを破 壊したときの蛍光強度；
は、 10°Cにおける初期の蛍光強度；
Ffは、 10°Cにおいて 30分経過後にトリトン X— 100を添カ卩してリボソームを破 壊したときの蛍光強度を表す。
[0088] <高分子化合物の製造 >
溶媒としてトルエン (6.2 ml)、添加塩基として酢酸ェチル (10 mmol)、モノマーとして（ 2-エトキシ）エトキシェチルビ-ルエーテル（EOEOVE) (4 mmol)、重合開始剤として 1 -メトキシエトキシェチルアセテート (0.04 mmol)を用いた。これらをシュレンク管に分取 して 0°Cに冷却後、同様に冷却したェチルアルミニウムセスキク口ライド溶液 (0.2 mmol )を添加することで重合を開始した。さらに、ブロック共重合体を合成するため、 EOEO VEモノマーの重合終了時に、トルエンで希釈したォクタデシルビ-ルエーテル（ODV E) (0.2 mmol)を逐次添カ卩した。 ODVEモノマーの重合終了時にアンモニア性メタノー ルを重合系中に添加することによって重合反応を停止した。
、 、で、ジクロロメタンで希釈したブロック共重合体溶液を希塩酸で洗浄して重合 開始剤の残渣を除去することにより、ブロック共重合体を精製した。その後、系を中性 に戻し、溶媒、未反応モノマー種残渣などを除去するためにエバポレートした。完全 に未反応モノマーを除去するために、減圧乾燥機で 8時間乾燥した (80°C、 0.1 mmH g)。得られたブロック共重合体 (高分子化合物）の分子量分布 (Mw/Mn)および Mnは GPCで、組成比は NMRにより求めた。これにより、 Mn=15000、 Mw/Mn=1.24のブロック 共重合体が得られた。得られた共重合体の EOEOVE/ODVEの共重合比率は、ほぼ 100/5であった。
この高分子化合物は、上記の式 (IV)において、 R1 = - H; R2 = -C H； R4 = -OCHの
2 5 3 化合物である。
[0089] 実施例 1 温度感受性リボソームの製造
リボソーム膜構成脂質として、 10 mg/mlの卵黄ホスファチジルコリン (EYPC)のクロ口 ホルム溶液 0.5 mLおよび 10 mg/mlのコレステロールのクロ口ホルム溶液 0.218 mLを 用い、 20 mg/mLの上記で製造した高分子化合物（Mn=15000)のクロ口ホルム溶液 0. 281 mLと、 5 mg/mLの PEG5000—ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ PE)複合体（1,2—ジステアロイル— sn—グリセ口— 3—ホスホエタノールァミン— N— [ポリ (エチレングリコール) 5000]、 Avanti Polar Lipids社製）のクロ口ホルム溶液 290 μ Lと共に容積 10 mLのフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いてクロロホ ルムを除去することにより、フラスコ内壁にリボソーム膜構成脂質と高分子化合物と P EGとの薄膜を形成させた（EYPC：コレステロール：高分子化合物： PEG = 50 :45 : 3 : 2 (モル比））。
[0090] 次に、この容器に硫酸アンモ-ゥム溶液（125 mM硫酸アンモ-ゥム、 10 mM HEPE S、 2 mM EDTA、 pH 5.2) 1 mLを添カ卩し、超音波を 2分間照射してリボソームを形成さ せ、さらにエタストルーダー（Avestin社製、フィルタ一孔径 100 nm)を用いてリポソ一 ムの粒径を調節した。このリボソーム分散液を HBS緩衝液で平衡ィ匕したセファロース 4Bカラム (アマシャムノィォサイエンス社製）に通すことにより、リボソームの内部を酸 性に、外部を中性にした。次いで、リン脂質 Cテストヮコー (和光純薬工業社製)キット の使用説明書に沿って、リボソーム分散液の脂質濃度を測定した。得られた結果か ら 1 μ molの脂質に対して 100 μ gの割合となるように ADRを添カ卩して、 30°Cで 1時間 放置して、 ADRをリボソーム内部に取り込ませた。
[0091] 得られた ADR含有リボソーム分散液 5 μ Lをメタノールで 200倍に希釈し、波長 477 nmで吸光度を測定した。残りの ADR含有リボソーム分散液を HBSで平衡ィ匕したセフ ァロース 4Bカラムに通し、回収した分散液の脂質濃度をリン脂質—テストヮコーキット により測定した。また、回収した分散液 5 μ Lをメタノールで 200倍希釈し、波長 477 η mで吸光度を測定した。これらの値から、リボソームへの ADRの封入効率を計算した。
[0092] 実施例 2
実施例 1にお 、て PEG— PE複合体の量を 435 μ Uこする以外は実施例 1と同様に して、 PEGを EYPC：コレステロール：高分子化合物： PEG = 50 :45 : 3 : 3 (モル比）の 比で含む温度感受性リボソームを製造した。
[0093] 比較例 1 実施例 1にお 、て PEG— PE複合体を添加しな 、以外は実施例 1と同様にして、 P EGを保持しな 、リボソームを製造した。
実施例 1および 2ならびに比較例 1の各リボソームについて、 ADRの封入率を測定 した
結果を以下の表 1に示す。
[0094] [表 1] 封入率（％)
実施例 1 99.2
実施例 2 99.4
比較例 1 99.7
[0095] 表 1の結果から、 PEGを保持することによるリボソームへの ADRの封入効率に対す る影響はほとんどな 、と考えられる。
[0096] 試験例 1
実施例 1および 2ならびに比較例 1のリボソームについて、上記の ADRの放出試験 を用いて、リボソームからの ADRの放出率の時間変化を 30°C、 37°C、 39°C、 42°C、 43°C、 45°Cおよび 50°Cでそれぞれ測定した。
結果を図 1に示す。図 1は、 A:実施例 1のリボソーム； B :実施例 2のリボソーム； C : 比較例 1のリボソームについての結果を示す。
図 1の結果から、 PEGを導入することにより、 39°C以下の温度での ADRの放出率が 減少、することがゎカゝる。
[0097] 試験例 1で得られた結果において、各温度に到達してから 3分後の放出率の値を 用いて各温度と放出率の関係についてまとめたグラフを図 2に示す。
図 2の結果から、本発明の温度感受性リボソームは、 PEGを保持しないリボソーム に比べて、 ADRが放出される温度がより高温側にシフトしていることがわかる。また、 実施例 1の温度感受性リボソームは、特に、 40°Cを超える温度において ADRの放出 率が急激に増加することがわかる。
[0098] 試験例 2
より生体内に近い条件下で、温度感受性リボソーム力 の ADRの放出挙動を調べる ために本試験を行った。ゥシ胎児血清 (FCS)を 0、 10、 30または 50重量％の量で 含む HBS緩衝液中で、実施例 1の温度感受性リボソーム力もの ADRの放出率を、上 記の ADRの放出試験の手順に従って調べた。
結果を図 3に示す。
図 3は、実施例 1のリボソームを 37°Cまたは 45°Cでインキュベートしてから 3分後の ADRの放出率を示すグラフである。
図 3の結果から、本発明の温度感受性リボソーム力 の ADRの放出は、血清の影響 をあまり受けな 、ことがわかる。
[0099] 実施例 3
実施例 1にお 、て高分子化合物の量を 0.094 mUこする以外は実施例 1と同様にし て、 PEGを EYPC：コレステロール：高分子化合物： PEG = 50 :45 : 1 : 2 (モル比）の 比で含む温度感受性リボソームを製造した。
[0100] 比較例 2
実施例 1にお!、て高分子化合物を添加しな!、以外は実施例 1と同様にして、高分 子化合物を保持しな ヽリボソームを製造した。
[0101] 試験例 3
実施例 1および 3ならびに比較例 2のリボソームについて、試験例 1と同様にして各 温度に到達してから 3分後の ADR放出率を測定した。結果を図 4に示す。
[0102] 比較例 3
実施例 1にお 、て高分子化合物および PEG - PE複合体を添加しな 、以外は実施 例 1と同様にして、高分子化合物および PEGのいずれも保持しないリボソームを製造 した。
[0103] 試験例 4 リボソームの体内動態評価
本発明の温度感受性リボソームの血中滞留性およびマウス体内での分布を調べる ために、 1251標識チラミルィヌリン (125ΗΠ)を含有するリボソーム用いて、次の実験を行 つた ο
チラミルィヌリンの合成
4°Cに保った 90mlの蒸留水にィヌリン (和光純薬工業社製） lmgを溶解させた。そこ に、過ヨウ素酸 (0.1M 10ml)を加え、 4°Cで 15分間攪拌した。その後、 Ba(OH)を加えて
2 中和し、反応を停止させた。この溶液から過ヨウ素酸塩とヨウ素酸塩を遠心分離によ つて除去した。この上澄み液に NaH PO 4.3gとチラミン 0.55gを添カ卩し、 1.0M HC1を
2 4
用いて PH7.5に調整した。そこに、 NaBH CN 0.25gを添カ卩し、室温で 4時間攪拌し、 Na
3
BH 0.2gをカ卩え、さらに 1時間攪拌した。この溶液を Sephadex G- 25カラム (溶離液 H
4 2
0、 4°C)に通すことによって、チラミルィヌリンを得た。
[0104] 標識チラミルィヌリン ト TI)の合成
3.7GBq/mlの Na125I溶液 (0.1M NaOH)3 μ 1を 0.1M NaOH 47 μ 1で希釈した。この溶 液 20 1中に IODO- BEADS (登録商標） lodination Reagent (PIERCE社製)を 3ビーズ 加え、室温で 5分間反応させた。そこに、チラミルィヌリン (lmg/ml) 500 1をカ卩え、 15 分間室温で反応させた。このとき、 5分間隔でボルテックスを用いて攪拌した。 15分後 、この反応液力 ビーズを取り除くことによって、ヨウ素化反応を停止させた。この溶 液を Sephadex G- 25カラム (PBS pH7.4)に通すことによって未反応のヨウ素を除去し、 1 25ト TIを得た。
[0105] T-TT含有温度感 Jポソームの観告
実施例 1に記載の方法に従って、 EYPC：コレステロール：高分子化合物： PEG = 5 0 :45 : 3 : 2 (モル比）の組成の温度感受性リボソームの薄膜を容器内に形成させた。 そこに、 125ΗΠ含有 PBS 2mlを加え、超音波照射した後、 - 20°Cのメタノールバス中で の凍結および 20°Cのウォーターバス中での融解を 5回繰り返して脂質を水和させるこ とによってリボソームを調製した。得られたリボソーム分散液を、エタストルーダーを用 いてアイスバス中で孔径 lOOnmのポリカーボネート膜に通してリボソームの粒径を揃 えた。さらに、このリボソーム分散液を超遠心処理 (85000 ppm、 4°C、 30min)することに より、 125ι-τι含有温度感受性リボソームを単離した。
[0106] その他のリボソームの製造
上記の125 ΗΠ含有温度感受性リボソームの製造方法にぉ 、て、高分子化合物及び PEG— ΡΕ複合体を添加しな 、か (未修飾リボソーム)、高分子化合物を添加しな 、か (PEG修飾リボソーム)又は PEG— PE複合体を添加しないか (高分子化合物修飾リポ ノーム)のいずれかにより、125I-TIを含有する各種リボソームを製造した。 [0107] リボソームの血中滞留性の評価
リボソームの体内動態の評価は、 ICRマウス (雄性、 6週齢)を用いて行った。上記の ようにして得られた125ト TIを含有する未修飾リボソーム、 PEG修飾リボソーム、高分子 化合物修飾リボソーム、本発明の温度感受性リボソームの各種リボソーム分散液を、 脂質量として 500 g/匹の量でマウスの尾静脈力も投与した。その後、所定の時間 (0. 5、 1、 3、 6、 14、 24hr)に、エーテル麻酔下で眼底静脈より血液を採取した。得られた 血液中の放射活性を γカウンター (ALOKA製 AUTO WELL GAMMA SYSTEM ARC -370M)を用いて、全投与量に対する割合 (％)で評価した。なお、マウスの全血液量 を体重の 7.3%として計算した。結果を図 5に示す。なお、図 5においては、♦:未修飾 リボソーム、 A : PEG修飾リボソーム、〇：高分子化合物修飾リボソーム及び國：本発 明の温度感受性リボソームの結果を示す。
[0108] リボソームの体内分布の評価
上記のようにして得られた125I-TIを含有する未修飾リボソーム、 PEG修飾リボソーム 、高分子化合物修飾リボソーム、本発明の温度感受性リボソームの各種リボソームの 各臓器 (肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺)への分布を、上記のリボソームの血中滞留性 の評価と同様にして行った。各臓器は全部分を用い、リボソームの蓄積量を経時的 (0 .5、 1、 3、 6、 14、 24hr)に測定した。
[0109] 結果を図 6に示す。なお、図 6は、 A: 0.5時間、 B : l時間、 C : 3時間、 D : 6時間、 E : l 4時間、 F: 24時間後の各臓器におけるリボソームの蓄積量を示す。また、図 6におい て未修飾:未修飾リボソーム、 PEG—高分子:本発明の温度感受性リボソーム、 PEG ： PEG修飾リボソーム及び高分子：高分子化合物修飾リボソームを示す。
[0110] 図 5から明らかなように、本発明の温度感受性リボソームは、高い血中滞留性を有 することが知られている PEG修飾リボソームと同程度の血中滞留性を示した。また、 図 6からは、本発明の温度感受性リボソーム力 PEG修飾リボソームと同様の体内分 布を示すことが示された。
[0111] 試験例 5 ADR含有温度感受性リボソームによる抗癌活性
ADRを含有する本発明の温度感受性リボソームを投与し、腫瘍部位を局所加温す ることによる腫瘍成長抑制効果を、以下の実験により調べた。 担がんマウスの作製
BALB/cマウス (雌性、 7週齢)の左横腹にマウス大腸がん由来 Colon26細胞を 1.0 X 1 06個 (PBS 50 冲)皮下に移植することにより、マウスにがんを担持させた。
[0112] m ^mm^
腫瘍を移植してから 10日後 (腫瘍体積： 150mm3程度)の担がんマウスを用いて実験 を行った。マウスの単位重量あたりの ADR投与量が一定となるように (6 mg/kg-体重） 、実施例 1の温度感受性リボソーム又は比較例 2のリボソームを担がんマウスに尾静 脈投与した。対照として、 HBS緩衝液を投与した。投与カゝら所定の時間が経過した後 、 RF- hyperthermia HEH- 100 (オムロン社製）を用いて、 10分間、腫瘍部位を 45°Cに 加温した。この温度は、マウスの皮膚上の温度であり、デジタル温度計 DELTA SK-1 250MC (佐藤計量器製作所製)を用いて測定した。腫瘍の体積及びマウスの体重を、 リボソームの投与直前から 2日毎に測定することにより、抗癌活性を評価した。なお、 腫瘍の体積は、ノギスを用いて短径と長径を測定し、以下の式より計算して求めた。
Figure imgf000029_0001
(式中、 Lは腫瘍の長径 (mm)であり、 Wは腫瘍の短径 (mm)である）
実験を、 4匹のマウスについてそれぞれ行った。
[0113] 各種リボソームを投与後、 6時間で加温したかまたはしな力つた場合の結果を図 7 に示す。図 7において、口、△及び〇は各種リボソームを投与して加温しなかった場 合を表し、國、▲及び參は各種リボソームを投与して加温した場合の結果である。ま た、口及び國は HBS緩衝液を投与した場合、△及び は比較例 2のリボソームを投 与した場合、並びに〇及び參は実施例 1のリボソームを投与した場合の結果を表わ す。各測定点は、 4匹のマウスについての平均値士 SDを示す。
図 7から明らかなように、本発明の温度感受性リボソームを投与して腫瘍部位をカロ 温した場合 (拳)、腫瘍の成長を抑制できることがわ力る。
[0114] 加温時期の検討
上記の実験において、 ADRを含有する本発明の温度感受性リボソームを投与後、 3 時間 (園)、 6時間 (▲)又は 12時間 (參)経過したときに 10分間加温した場合の腫瘍成 長抑制効果について調べた結果を図 8に示す。リボソームの代わりに HBS緩衝液を 投与した場合の結果は、♦で表す。各測定点は、 4匹のマウスについての平均値士 SDを示す。
図 8の結果によれば、本発明の温度感受性リボソームを投与した 12時間後に腫瘍 部位を局所加温した場合に、腫瘍成長が最も抑制されることがわかる。投与の 3時間 後の加熱でも腫瘍の成長抑制効果は観察されるが、 12時間後にはより多量の本発 明の温度感受性リボソームが腫瘍部位に集積したと考えられる。
[0115] 投与量の枪討
上記の実験において、マウスの単位重量あたりの ADR投与量を 0 mg/kg-体重 (國） 、 6 mg/kg-体重 (▲)、 8 mg/kg-体重 (♦)および 12 mg/kg-体重 (參)とし、リボソームの 投与の 12時間後に腫瘍部位を加温し、腫瘍成長抑制効果に対する投与量の影響 について調べた。各実験について 4匹のマウスを用いた。各測定点は、 4匹のマウス についての平均値士 SDを示す。結果を図 9に示す。
図 9の結果から、 6〜12 mg/kg-体重の範囲の量で ADRを投与し、加温することによ り、いずれのマウスにおいても腫瘍成長が抑制される力 その効果は ADRの投与量 に依存して多くなることがわかる。また、 12 mg/kg-体重の量で ADRを投与したマウス では、腫瘍が完全に消失したマウスも存在した。また、 12 mg/kg-体重の量で ADRを 投与したマウスでは、加温しなくても初期の段階で多少の腫瘍成長抑制効果がみら れた (結果示さず)。
[0116] 試験例 6
本発明の温度感受性リボソームの投与による副作用が存在しないかについて調べ た。
上記のようにして作製した担がんマウスに、 12 mg/kg-体重の量の ADRとなるように 、 ADRを含有する本発明の温度感受性リボソームを投与した (n=4)。投与の 12時間後 に、上記のようにして腫瘍部位を 45°Cで 10分間加温した。これらのマウスの体重の 変化を調べた。対照として、 HBS緩衝液を投与して同様に局所加温したマウスの体 重の変化を調べた。
結果を図 10に示す。図 10において、國は本発明の温度感受性リボソームを投与し た場合の結果を示し、♦は HBS緩衝液を投与した場合の結果を示す。各測定点は、 4匹のマウスについての平均値士 SDを示す。
[0117] 図 10から明らかなように、対照のマウスは体重が減少しているのに対して、 ADRを 含有する本発明の温度感受性リボソームを投与して加温したマウスでは、体重が増 カロした。これは、対照のマウスは腫瘍が成長することにより衰弱して体重が減少した 力 ADRを含有する本発明の温度感受性リボソームを投与して加温したマウスでは、 腫瘍の成長が抑制されたので、腫瘍成長に伴う体重減少がおこらなカゝつたものと考 えられる。この結果から、本発明の温度感受性リボソームを投与しても、体重減少とい つた副作用は見られな 、ことがわかる。
[0118] 実施例 4
実施例 1において、高分子化合物として、次のようにして製造した高分子化合物を 用いて ADR含有温度感受性リボソームを製造することができる。
<高分子化合物の製造 >
1— (イソブチル)ェチルアセテート（4mM) (0.5ml)を開始剤として用い、酢酸ェチル（ 0.5ml)の存在下、トルエン（3.28ml)中、 0°Cでェトキシェチルビ-ルエーテル (EOVE) (O.lg)を 2.5時間重合した。その後さらにォクタデシルビ-ルエーテル（ODVE) (0.05 9g)を添加し引き続き 2時間重合を行なった。塩基性アンモニア（3ml)を添加すること によって重合を停止し、 EOVE-ODVE共重合体を得た。その後、触媒残查を除去す るため、希塩酸で洗浄した。さらに、溶媒、モノマーおよび重合開始剤を減圧留去し 、 EOVE-ODVE共重合体を精製した。得られたブロック共重合体 (高分子化合物)の M n=22000、 Mw/Mn=1.12であることがわかった。得られた共重合体の EOVE/ODVEの 共重合比率は、ほぼ 178/6であった。
この高分子化合物は、上記の式 (V)において、 R1 = - C(H)(CH )(OCH CH(CH ) );
3 2 3 2
R2 = -C H； R4 = -Hの化合物である。
2 5
[0119] 実施例 5〜8
実施例 1にお 、て、 PEG5000 -ジステアロイルホスファチジルエタノールァミンの 代わりに、 PEG350 -ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（1,2 ジステア ロイル sn—グリセロー 3—ホスホエタノールァミン N [^トキシ (ポリエチレングリコ 一ル)— 350]、 Avanti Polar Lipids社製）（実施例 5)、 PEG2000 ジステアロイルホス ファチジルエタノールァミン（1,2 ジステアロイル sn グリセ 3 ホスホェタノ ールァミン— N— [ポリ (エチレングリコール)— 2000] Avanti Polar Lipids社製）（実施 例 6 PEG350 -ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン（1,2 ジミリストイル sn—グリセ 3—ホスホエタノーノレアミン N [^トキシ (ポリエチレングリコー 350] Avanti Polar Lipids社製）（実施例 7 PEG3000 ジミリストイルホスファチ ジルエタノールァミン（1,2 ジミリストイル sn グリセ 3 ホスホエタノールアミ ン— N トキシ (ポリエチレングリコール)— 3000] Avanti Polar Lipids社製）（実施 例 8)をそれぞれ用いて、 ADR含有温度感受性リボソームを製造することができる。
[0120] 実施例 9 11
上記の実施例 1で用いた高分子化合物の製造にぉ 、て、 ODVEの代わりにドデシ ルビ-ルエーテル、テトラデシルビ-ルエーテルおよびへキサデシルビ-ル テ ルをそれぞれ用いて、式 (IV)の化合物のォクタデシルォキシ基がそれぞれドデシル ォキシ基、テトラデシルォキシ基およびへキサデシルォキシ基で置換された高分子 化合物 (それぞれ実施例 9 10及び 11)を得ることができる。これらの高分子化合物 を実施例 1の高分子化合物の代わりに用いて、 ADR含有の本発明の温度感受性リポ ソームを製造することができる。
産業上の利用可能性
[0121] 本発明により、薬剤を目的部位で放出させることができ、かつヒトの血液内に投与し た場合に血中滞留時間が長い温度感受性リボソームを得ることができる。

Claims

請求の範囲
[1] 感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコー ルと力 リボソーム膜に担持されてなる温度感受性リボソーム。
[2] リボソーム膜構成脂質と、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合 物と、ポリエチレングリコールと力 構成されてなり、
リボソーム膜構成脂質：高分子化合物：ポリエチレングリコールのモル比が 1： 0.003
〜0.2 : 0.001〜0.2の割合で、リボソーム膜構成脂質と高分子化合物とポリエチレン グリコールとを用いて得られる温度感受性リボソーム。
[3] 高分子化合物とポリエチレングリコール誘導体とを、リボソーム膜構成脂質と接触さ せることにより得られる請求項 1または 2に記載の温度感受性リボソーム。
[4] ポリエチレングリコール誘導体がポリエチレングリコール 脂質複合体であり、該ポ リエチレングリコール—脂質複合体を構成する脂質が、ホスファチジルエタノールアミ ン、ジァシルグリセロールおよびコレステロール力 なる群より選択される請求項 3に 記載の温度感受性リボソーム。
[5] ポリエチレングリコールの分子量力 350〜12000である請求項 1〜4のいずれ力 1 つに記載の温度感受性リボソーム。
[6] 高分子化合物が、水和可能なヘテロ原子を 1個以上含む感熱応答性ビュル系モノ マーと、疎水性ビュル系モノマーとのブロック共重合体である請求項 1〜5のいずれ 力 1つに記載の温度感受性リボソーム。
[7] 高分子化合物が、以下の式 (I)：
[化 1]
Figure imgf000033_0001
〔式中、 R1は水素原子、以下の式 (Π)：
[化 2]
CX,—— CH——
0 (ID
'
(式中、 Xは同一または異なって、水素原子またはハロゲン原子であり、 R11は水素原 子、炭素数 1〜20のアルキル基またはァリール基である。 )
で表される基または重合開始剤に由来する基であり；
R2は炭素数 1〜8のアルキル基、炭素数 1〜8のハロゲン化アルキル基、アルデヒド基 、フエ-ル基、ビフエ-ル基または炭素数 7〜 14のァラルキル基であり；
R3は炭素数 4〜30の炭化水素基であり；
R4は、水素原子または炭素数 1〜10のアルコキシ基または重合停止剤に由来する 基であり；
mは 5〜500であり；
nは 1〜10であり；
yは 0〜： L00である。〕
で表される化合物である請求項 1〜6のいずれか 1つに記載の温度感受性リボソーム
[8] 高分子化合物が、リビングカチオン重合により得られるものである請求項 1〜7のい ずれ力 1つに記載の温度感受性リボソーム。
[9] 請求項 1〜8のいずれか 1つに記載の温度感受性リボソームと薬剤とからなる温度 感受性薬剤放出システム。
[10] 薬剤が、抗癌剤である請求項 9に記載の温度感受性薬剤放出システム。
[11] 少なくとも 1種の医薬添加剤をさらに含む請求項 9または 10に記載の温度感受性 薬剤放出システム。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017150000A1 (ja) * 2016-02-29 2017-09-08 丸善石油化学株式会社 コポリマー、これを利用する抗血栓コーティング剤及び医療用具

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009072079A2 (en) 2007-12-07 2009-06-11 Koninklijke Philips Electronics N.V. Polymeric drug carrier for image-guided delivery
EP2067485A1 (en) 2007-12-07 2009-06-10 Koninklijke Philips Electronics N.V. Drug carrier providing MRI contrast enhancement
JP5382567B2 (ja) * 2008-05-02 2014-01-08 公立大学法人大阪府立大学 温度感受性リポソーム
JP5099787B2 (ja) * 2009-09-24 2012-12-19 積水化学工業株式会社 定量分析方法
EP2407157A1 (en) 2010-07-13 2012-01-18 Koninklijke Philips Electronics N.V. Lipid bilayer carrier for drugs or imaging agents
US20130302253A1 (en) 2011-01-28 2013-11-14 Koninklijke Philips N.V. Carriers for the local release of hydrophilic prodrugs
CN111065454A (zh) * 2017-06-26 2020-04-24 丸善石油化学株式会社 抗蛋白质吸附剂、抗蛋白质吸附膜和利用其的医疗用具
JP7406057B2 (ja) 2021-03-03 2023-12-27 東洋ビューティ株式会社 外用微粒子カプセル製剤及び皮膚外用剤

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003212755A (ja) * 2002-01-24 2003-07-30 Kansai Tlo Kk 温度感受性リポソーム

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003212755A (ja) * 2002-01-24 2003-07-30 Kansai Tlo Kk 温度感受性リポソーム

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KONO K. ET AL.: "Effect of poly(ethylene glycol) grafts on temperature-sensitivity of thermosensitive polymer-modified liposomes", J. CONTROL RELEASE, vol. 80, no. 1-3, 2002, pages 321 - 332, XP003004650 *
KONO K.: "Ondo Kanjusei Kobunshi Shushoku Liposome no Naiho Busshitsu Hoshutsu Kyodo", KOBUNSHI KAKO, vol. 50, no. 4, 2003, pages 174 - 180, XP003004651 *
OZAWA T.: "Kan'onsei Kobunshi o Mochiita PEG Shushoku Liposome no Ondo Kanjuseika. (Temperature-Sensitization of Poly(ethylene glycol)-Modified Liposomes by Using a Thermosensitive Polymer)", POLYMER PREPRINTS, JAPAN, vol. 54, no. 2, 2PF114, September 2005 (2005-09-01), pages 5014, XP003004652 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017150000A1 (ja) * 2016-02-29 2017-09-08 丸善石油化学株式会社 コポリマー、これを利用する抗血栓コーティング剤及び医療用具
CN108699191A (zh) * 2016-02-29 2018-10-23 丸善石油化学株式会社 共聚物、利用其的抗血栓涂布剂和医疗用具
JPWO2017150000A1 (ja) * 2016-02-29 2018-12-20 丸善石油化学株式会社 コポリマー、これを利用する抗血栓コーティング剤及び医療用具
CN108699191B (zh) * 2016-02-29 2021-08-31 丸善石油化学株式会社 共聚物、利用其的抗血栓涂布剂和医疗用具

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