WO2006109619A1 - ５－フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法 - Google Patents

５－フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006109619A1
WO2006109619A1 PCT/JP2006/307102 JP2006307102W WO2006109619A1 WO 2006109619 A1 WO2006109619 A1 WO 2006109619A1 JP 2006307102 W JP2006307102 W JP 2006307102W WO 2006109619 A1 WO2006109619 A1 WO 2006109619A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cytosine
deaminase
resistant
fluorouracil
expression
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/307102
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshinori Hamaji
Minoru Fujimori
Jun Amano
Shunichirou Taniguchi
Original Assignee
Anaeropharma Science Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anaeropharma Science Inc. filed Critical Anaeropharma Science Inc.
Priority to JP2007512917A priority Critical patent/JP4945440B2/ja
Priority to ES06731050.8T priority patent/ES2438565T3/es
Priority to EP06731050.8A priority patent/EP1867714B1/en
Priority to KR1020077025746A priority patent/KR101302088B1/ko
Priority to CN200680011344.6A priority patent/CN101155911B/zh
Priority to CA2603453A priority patent/CA2603453C/en
Priority to DK06731050.8T priority patent/DK1867714T3/da
Priority to US11/910,880 priority patent/US8734779B2/en
Publication of WO2006109619A1 publication Critical patent/WO2006109619A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention is useful as a solid tumor therapeutic agent, can grow in a tumor tissue under an anaerobic environment, can express cytosine 'deaminase (EC3.5.4.1; hereinafter CD), and
  • CD cytosine 'deaminase
  • the present invention relates to a method for producing a CD-expressing 5'-FU-resistant bacterium having at least an antitumor activity effective concentration of 5-fluorouracil (hereinafter referred to as 5-FU) resistance.
  • the present invention also relates to a 5-FU resistant bacterium, a pharmaceutical composition containing the resistant bacterium, and a solid tumor therapeutic agent containing the resistant bacterium.
  • CD is an enzyme that deaminates cytosine to uracil (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • CD is an enzyme that plays an important role in the metabolism of microorganisms, and is separated from a plurality of different microorganisms. Mammalian cells usually do not produce this CD (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • Many bacteria and fungi that produce CD convert 5-fluorocytosine (hereinafter 5-FC) to 5-FU, a highly toxic metabolite that is lethal to cells.
  • 5-FU inhibits abnormal RNA production and DNA synthesis, but the antifungal action of 5-FC is due to the abnormal RNA production and DNA synthesis inhibitory action of 5-FU.
  • 5-FC is taken into fungal cells by cytosine permease, and 5-FC is immediately converted into 5-FU by CD.
  • Intracellular 5-FU is converted to 5-FUDP by UMP-pyrophosphorylase via 5-FU MP.
  • the phosphorylation pathway further branches into two, and on the one hand, 5-FUTP force is generated on the other hand, 5-FdUMP.
  • 5-FUTP is incorporated into RNA instead of UTP to produce abnormal RNA, thereby inhibiting normal protein synthesis and consequently preventing fungal growth.
  • 5-FdUMP also acts as a potent inhibitor of thymidine synthase, which inhibits DNA synthesis' fission and exerts a bactericidal effect.
  • 5-FC cannot be deaminated to the toxic metabolite 5-FU, thus 5-FC has strong antibacterial activity. Even at the concentrations shown, it is non-toxic to mammalian cells.
  • 5-FU is a mammalian cell It has a strong cytotoxic effect on the skin and is widely used as an anticancer agent.
  • the CD gene has been isolated and cloned from Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. (See, for example, Non-Patent Documents 3 and 4.) Many researchers have found that introduction of this CD gene into mammalian cells reduces the selective sensitivity of these cells to 5-FC in vitro. (For example, see Non-Patent Documents 3 and 5). It has also been shown that tumor cells introduced with a CD gene using retroviral vectors can be eliminated in vivo by systemic treatment of animals with 5-FC (see, for example, Non-Patent Documents 6-8). ).
  • Non-Patent Document 9 replication-deficient adenovirus vectors (see, for example, Non-Patent Document 9) and cationic ribosomes (see, for example, Non-Patent Document 10) also introduced CD genes into human colon cancer cells and mouse giant cell lung cancer, respectively. It is used for entering. Gene expression in these tumor cells confers sensitivity to 5-FC.
  • Bifidobacterium longum is a gram-positive anaerobic bacterium, and its genome has a high GC content (see, for example, Non-Patent Document 12).
  • This bifido nocterum longum is non-pathogenic and constitutes the majority of normal mouth flora in the large intestine of humans and other animals (see, for example, Non-Patent Document 13).
  • Non-Patent Document 14 It enhances the immune response (see, for example, Non-Patent Document 14), has an inhibitory effect on the occurrence of cancer (see, for example, Non-Patent Document 15), and also protects the host from virus infectivity (see, for example, Non-Patent Document 16, 17), and may produce antibacterial substances (for example, see Non-patent Document 18).
  • Bifido pacterium species are widely fermented around the world Some are used in the preparation of dairy products.
  • the bifidobatterium plasmid is expected to be applied to probiotic vectors and oral vaccine vectors for infectious diseases.
  • a plasmid derived from bifidobatterium and a plasmid derived from Escherichia coli to produce a shuttle vector that mutually replicates between bifactacterium and Escherichia coli, and a target gene that encodes the target protein in the shuttle vector
  • a bifactic pacterium used for the production of the shuttle vector is used as a host cell for transformation into the produced recombinant vector.
  • a transformation method characterized by this is known (for example, see Patent Document 1).
  • bifact pacterium longum accumulates in solid tumors of hypoxia after systemic administration (see, for example, non-patent documents 19, 20). It was revealed that the recombinant plasmid pBLES 100-S-eCD harboring Escherichia coli codA fused with CD expresses CD in microorganisms (see, for example, Patent Document 2 and Non-Patent Documents 21 and 22). This confirms that it is effective for the long-distance bifidobatterium 'longum force enzyme-prodrug therapy.
  • the pBLES 100 used for the construction of the recombinant plasmid pBLESlOO—S—e CD is a shuttle vector constructed with pTB 6 of bifidobatterium 'longum BK51 and pBR322 of E. coli.
  • Powerful shuttle vector 1 pBLESlOO transforms bifidobacterium longum at an effective rate of 2.2 x 10 4 transformants // z gDNA and is stable in terms of structure and segregation in the cell (For example, see Non-Patent Document 23).
  • plasmids with unmodified DNA may be cleaved in microorganisms by restriction enzymes, so that a higher transformation rate is required for clones of foreign genes.
  • the present inventors have proposed plasmids pAVOOl and pBRASTAlOl that can transform bifidobatterium longum with a high efficiency exceeding 100 times that of pBLES 100 (see, for example, Non-Patent Document 24). ).
  • 5-FU has a strong cytotoxic effect on mammalian cells and is widely used as an anticancer agent.
  • the blood concentration will be about 1 gZml or less in order to avoid side effects on the patient.
  • the dose or blood concentration exceeds 1 gZml the time during which the blood concentration exceeds 1 ⁇ gZml must be at most about 1 hour.
  • the conventional method has fully demonstrated the anti-cancer effect of 5-FU. Under these circumstances, there was a strong need for a means of overcoming the problem of side effects of 5-FU while treating tumors with high concentrations of 5-FU.
  • Patent Document 1 Special Table 2004—519236
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-97144
  • Non-Patent Document 1 0, Donovan et al., Bact. Rev. 34: 278 (1970)
  • Non-Patent Document 2 Nishiyama et al, Cancer Res. 45: 1753 (1985)
  • Non-Patent Document 3 Austin et al., Pharmacol. 43: 380 (1992)
  • Non-Patent Document 4 Anderson et al., Arch. Microbiol. 152: 115 (1989)
  • Non-Patent Document 5 Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:33 (1992)
  • Non-Patent Document 6 Huber et al., Cancer Res. 53: 4619 (1993)
  • Non-Patent Document 7 Mullen et al., Cancer Res. 54: 1503 (1994)
  • Non-Patent Document 8 Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8302 (1994)
  • Non-Patent Document 9 Hirschowitz et al., Human Gene Ther. 6: 1055 (1995)
  • Non-Patent Document 10 Davis et al., Proc. AACR Abstract No. 2355, p345 (1996)
  • Non-Patent Document ll Clin. Microbiol. Rev. 11: 382-402.1998
  • Patent Document 12 Scardovi, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology vol 2, eds. Sn eath et al "pp.1418-1434 (1986)
  • Non-Patent Document 13 Mitsuoka, Elsevier Applied Science, pp 69-114 (1992)
  • Non-Patent Document 14 Yasui et al. J. Dairy Sci., 74, 1187-1195 (1991)
  • Non-Patent Document 15 Reddy et al., Cancer Res., 53, 3914-3918 (1993)
  • Non-Patent Document 16 Duffy et al., Pediatr. Res., 35, 690-695 (1994)
  • Non-Patent Document 17 Saaverdra et al., Lancet., 344, 1046-1049 (1994)
  • Non-Patent Document 18 discloses Japanese Patent Application Laidation (Kokakukanesutica, J. Food Prot., 56, 713-715 (1993)
  • Non-Patent Document 19 Yazawa et al. Cancer Gene Ther., 7, 269-274 (2000)
  • Non-Patent Document 20 Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001)
  • Non-Patent Document 21 Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366 (2002)
  • Non-patent literature 22 Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203 (2002)
  • Non-patent literature 23 Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212 (199 7)
  • Non-Patent Document 24 Tanaka et al., Biosci Biotechnol Biochem.; 69 (2): 422-425 (2005, Feb)
  • EnzymeZpro-drug therapy using CDZ5-FC is a treatment widely used in animal experiments and clinical trials.
  • Powerful EnzymeZpro When CD gene-transfected cells (bacteria) in drug therapy have improved 5-FU resistance, they cannot be killed by 5-FU, thus improving the survival of CD gene-introduced cells (fungi), and CDZ5 —EnzymeZpro using FC—The therapeutic effect of drug therapy can be expected to improve significantly.
  • the object of the present invention is to express CD that is useful as a therapeutic agent for such EnzymeZpro-drug therapy, and that can express CD and has an anti-tumor activity effective concentration of at least 5—FU resistance performance— The object is to provide a method for producing FU-resistant bacteria.
  • the subject of the present invention is also a 5-FU resistant bacterium capable of overcoming the problem of side effects of 5-FU while treating a tumor with a high concentration of 5-FU, and a pharmaceutical composition containing the resistant bacterium And a solid tumor therapeutic agent containing the resistant bacteria.
  • the present inventors have intensively studied in order to solve the above-mentioned problems, and subcultured a CD-expressing bacterium transformed by introducing a CD gene into a bacterium not expressing CD in the presence of 5 FC. It was found that by acclimation culture, 5-FU-resistant bacteria can be produced while maintaining CD activity. That is, when a CD-expressing bacterium is cultured with a predetermined amount of 5-FC added to the culture medium, 5-FC is gradually converted to 5-FU due to the enzymatic activity of the CD expressed along with the growth of the CD-expressing bacterium.
  • the present invention provides [1] a cytosine that can grow in a tumor tissue under an anaerobic environment, can express cytosine deaminase, and has at least an antitumor activity effective concentration of 5-fluorouracil.
  • cytosine deaminase expression A method for producing 5-fluorouracil-resistant bacteria, in which cytosine 'deaminase-expressing bacteria that can grow in tumor tissues in anaerobic environments are subcultured and conditioned in the presence of 5 fluorocytosine.
  • cytosine deaminase-expressing bacteria that can grow in tumor tissues in an anaerobic environment can grow in tumor tissues in an anaerobic environment, and ⁇ It does not express deaminase! It is a cytosine 'deaminase expressing bacterium transformed by introducing a cytosine ⁇ deminase gene into the bacterium [1] [3] The method described in [1] or [2], wherein the method is for producing a resistant bacterium, and [3] is subcultured in a medium supplemented with 2 to 5000 ⁇ g Zml of 5 fluorocytosine.
  • Cytosine 'deaminase-expressing bacteria that can grow in tumor tissue under anaerobic environment can grow in tumor tissue under anaerobic environment and express cytosine' deaminase
  • the method for producing a resistant bacterium according to any one of [1] to [3], characterized by being a bacterium, and [5] capable of growing in a tumor tissue in an anaerobic environment and having cytosine The method for producing a resistant bacterium according to [4], wherein the enterococcus that expresses deaminase is an enterobacteria that expresses cytosine 'deaminase, and [6] the enterobacterium that expresses cytosine' deaminase, Bifidobatterium cells expressing cytosine deaminase [7]
  • Bifidobatterum longum Bifidobatteri [13]
  • the method for producing a resistant bacterium according to [14], or [16] anaerobic environment Can be grown in a tumor tissue, can express cytosine deaminase, and has at least an anti-tumor activity effective concentration of 5-fluorouracil tolerance.
  • cytosine deaminase expression ⁇ Cytosine ⁇ deaminase expression ⁇ 5-Fluorouracil resistant bacteria characterized in that it is produced by the preparation method described in any one of [1] to [15].
  • [17] Can grow in tumor tissue in an anaerobic environment, express cytosine deaminase, and be supplemented with at least 2 ⁇ gZml of 5 fluorocytosine or 1 ⁇ g / ml of 5 fluorouracil.
  • Cytosine' deaminase expression ⁇ 5-Fluorourashinore metabibibate Batterium 'Longham, Bifidobatateru 'Brave or Bifido Batateru Cytosine 'deaminase expression described in [20] characterized by being' infantise ' ⁇ 5 Fluorouracil-resistant bacteria, and [22] Cytosine ⁇ Deaminase expression ⁇ 5-Fluorouracil-resistant Bifidobacterium spp. .
  • the solid tumor therapeutic agent characterized by being a 5-fluorouracil-resistant bacterium, [34] and the solid tumor therapeutic agent according to [33], further comprising a combination of lactulose.
  • FIG. 1 is a diagram showing a process of producing a shuttle vector pAVOOl of bifidobatterium and Escherichia coli, and a process of producing a shuttle vector pAVOOl-HU-eCD expressing CD.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of comparing the expression levels of CD protein in wild-type bifidobatterium 'longum and bifidobatterium / pAVOOl-HU-eCD.
  • FIG.3 Obtained from the results of comparison of CD protein enzyme activities (comparison of conversion activity of 5-FC ⁇ 5-FU) of wild-type bifidobatterium 'longum and bifidobatterium / pAVOOl-HU-eCD It is a figure which shows the aging bacteria count change obtained.
  • FIG. 4 Obtained from the results of comparison of CD protein enzyme activities (comparison of the conversion activity of 5-FC ⁇ 5-FU) of wild-type bifidobatterium 'longum and bifidobatterium / pAVOOl-HU-eCD It is a figure which shows the 5-FU density
  • a method for producing 5-FU-resistant bacteria CD-expressing bacteria that can grow in a tumor tissue in an anaerobic environment are subcultured in the presence of 5-FC.
  • a 5-FU-resistant strain can be produced by subculturing cultivated bacteria that can grow in tumor tissue under anaerobic environment and does not express CD in the presence of 5-FU.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method B comprising the steps of: (2) introducing a CD gene into the 5-FU resistant bacterium and transforming it.
  • the CD-expressing bacterium that can grow in a tumor tissue under an anaerobic environment in Method A is a bacterium that can grow in a tumor tissue under an anaerobic environment and expresses CD.
  • it may be a bacterium isolated from natural forces, or it can grow in a tumor tissue in an anaerobic environment and introduce a CD gene into a bacterium that does not express CD. Even transformed recombinant bacteria.
  • a bacterium that can grow in a tumor tissue under an anaerobic environment used in the method B and does not express CD it can grow in a tumor tissue under an anaerobic environment, in addition, it is not particularly limited as long as it expresses CD and is a cunning gonococcus!
  • bacteria examples include bacteria (bacteria) and fungi, and examples of the bacteria include Bifido butterium bacteria, Ability to specifically illustrate intestinal bacteria such as Clostridium bacteria, Lactobacillus bacteria, Streptococcus bacteria, Peptococcus bacteria, Enterococcus bacteria, Bataterides bacteria, and Pacteria bacteria Among them, Bifidobatterium bacteria are preferred.
  • Examples of the above-mentioned bacteria belonging to the genus Bifidobaterum include Bifidobatterium 'Longham, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium breve, Bifidobatterum' address Scentis (B. adolescentis ), Bifido Batterium 'Latatentes (B. lactentis), Bifidobacterium Bifidum (B. bifidum), Bifidobacterium' Syudulongum (B. ps eudolongum), Bifido Batterium 'Thermophilum (B.
  • thermophirum Bifidobacteria 'B. infantis', Bifido Batterium 'B. animalis' and the like. Among them, it is known that they are permanently present in the human intestine regardless of their ages. Bifido Batterium 'Longham, Bifido Batterium' Brebe, Bifido Bacterium 'Addresses Tei, Bifido Batterium It is preferable to use mu'bifidam, bifidobatterium 'infantis as a host fungus, and more preferred to use bifidobatterium longum.
  • All of these bacteria are commercially available, or can be easily obtained from depository agencies, such as Bifido Batterium 'Longham ATCC-15707, Bifido Batterium' Bifidum ATCC-11863, Bifido Batterium 'Infantice ATCC — 15697 can be used.
  • Bifido Batterium longum strains are not particularly limited, for example, Bifido Batterium 'Longham 105-A strain, Bifido Batterium' Longham aE-194b strain, Examples include Bacterium longum bs-601 strain and Bifidobatterum longum M101-2 strain, and Bifidobatterum longum 105-A strain is preferable.
  • Bifido Batterium breve Bifido Batterium breve standard strain (JCM1192), Bifido Batterium breve aS-1 strain Bifido Batterium Breve I—53—8W stock can be exemplified.
  • strain of bifid bataterum latatintis is not particularly limited, but for example, bifid bataterum latatintis standard strain (JCM1220) can be exemplified.
  • the subculture in Method A 5 passing in the presence of FC is performed on a culture medium (culture medium or agar plate) suitable for growth and growth of bacteria and fungi, for example, 2-5000. It can be carried out by culturing anaerobic culture at 37 ° C with 5-FC in the range of ⁇ g / ml, preferably 2 to 2000 ⁇ g / ml.
  • 5-B subculture in the presence of FU in the above-mentioned method B As conditioned culture, on a culture medium (culture medium or agar plate) suitable for growth and growth of bacteria and fungi, for example, 1 to : LOO ⁇ g / ml, preferably 2 to: Anaerobic culture at 37 ° C with 5-FU in the range of LOO ⁇ g / ml. In this way, 5-FU resistant bacteria can be collected with good reproducibility.
  • a culture medium culture medium or agar plate
  • a CD-expressing bacterium transformed by introducing a CD gene a CD-expressing vector used to prepare a bacterium transformed by introducing a gene that imparts the ability to grow in an anaerobic environment.
  • transformants are commercially available, such as the gene manual (Kodansha), Takagi Yasutaka, Gene manipulation experiment method (Kodansha), Molecular 'Cloning' (Cold Spring Harbor Laboratory) (1 982), Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Cloning 2nd edition ( Molecular Cloning, 2nd ed.) Cold Spring Spring Laboratory (1989), Methods in Enzymol., 194 (1991), Separate Experimental Medicine, Yeast Can be carried out according to the method described in Gene Experiment Method (Yodosha, 1994).
  • DNA encoding CD contains, for example, plasmid pAdexlCSCD (RIKEN Genebank RDB No. 1591) containing DNA encoding CD derived from E. coli or DNA encoding CD derived from E. coli. Those isolated from plasmid pMK116 can be used (DA Mead et al., Protein Engineering 1: 67-74 (1986)).
  • CD expression vectors for Bifidobacterium bacteria include recombinant plasmids carrying E. coli codA inserted downstream of the Bifidobacterium longum hup promoter pBLES 100—S—eCD ( Patent Document 1 and Non-Patent Document 21) and this pBLES 100— S—eCD improved bifido butteryum longumya bifund butteryum brave. 111; -6 0, or mutants of these plasmids can be particularly preferably exemplified.
  • the plasmid pBLESlOO—S—eCD mutant is a plasmid nucleic acid sequence variant derived from pBLESlOO—S—eCD, and can be used in the present invention in the same manner as pBLESlOO—S—eCD. Means.
  • the plasmid pAV001-HU-eCD variant is also a plasmid nucleic acid sequence variant derived from pAV001-HU-eCD, and in the present invention, similar to pAV001-HU-eCD. It means a plasmid that can be used for
  • the CD expression '5-FU-resistant bacterium in the present invention can grow in tumor tissue in an anaerobic environment, can express CD, and has at least an antitumor activity effective concentration of 5-FU.
  • the effective concentration of anti-tumor activity of 5-FU depends on the target tumor, patient, etc., but it cannot be said unconditionally. For example, a concentration of at least 0.05 to 0 .: L gZml may be exemplified. it can.
  • the instructions for the commercially available 5-FU formulation include that the 5-FU formulation should be continued in patients with advanced gastric cancer so that the blood concentration of 5-FU is approximately 0.6 gZml. Intravenous injection is described.
  • CD expression in the present invention 'More specific 5-FU resistance of 5-FU resistant bacteria is at least 1 to 2000 ⁇ g / ml, preferably 2 to 2000 ⁇ g / ml. — It can be grown in an anaerobic culture at 37 ° C in a culture medium (culture medium or agar plate) containing FU.
  • the expression of CD in the present invention '5-FU resistance of a 5-FU resistant bacterium is specifically expressed by the concentration of 5-FC, 2 to 5000 ⁇ g / ml, preferably 3 to 5000 ⁇ . It means that it can grow in an anaerobic culture at 37 ° C in a culture medium (culture medium or agar plate) containing 5-FC in the range of g / ml.
  • the expression of CD in the present invention '5-FU resistance of FU-resistant bacteria is determined by the culture medium (culture solution containing 5-FU having any numerical value within the above-mentioned numerical range of 5-FU. Or agar plates) that can grow when anaerobically cultured at 37 ° C, or a culture medium (culture solution or agar) that contains any 5-FC in the numerical range of 5-FC described above. Plate), it should be able to grow in anaerobic culture at 37 ° C.
  • the CD-expressing '5-FU-resistant bacteria of the present invention can grow in a medium supplemented with at least 1 gZml of 5-fluorouracil. It is desirable that it should be able to grow on a medium supplemented with at least 2 g / ml or more of 5-fluorocytosine.
  • the method for producing a CD-expressing 5-FU-resistant bacterium in the present invention is not particularly limited, and it may be isolated from nature, or the above-described method for producing a resistant bacterium of the present invention may be used. That is, the CD-expressing 5-FU resistant bacterium in the present invention may be a bacterium isolated from the natural world, or a recombinant bacterium using the above-described method for producing a resistant bacterium of the present invention. .
  • the CD expression '5-FU-resistant bacterium in the present invention is capable of growing in a tumor tissue in an anaerobic environment, can express CD, and has at least an antitumor activity effective concentration of 5 -FU.
  • it is not particularly limited as long as it is a bacterium or a fungus having these properties, but it is preferable to be a bacterium having such properties. More preferably, it is an enteric bacterium.
  • Preferred examples include Terium bacteria, Clostridium bacteria, Lactobacillus bacteria, Streptococcus bacteria, Peptococcus bacteria, Enterococcus bacteria, Bataterides bacteria, Eunocterium bacteria, etc.
  • a more preferred example is Pacteria bacteria.
  • the above-mentioned bacteria belonging to the genus Bifidobaterum are specifically Bifidobatterium 'Longham, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium breve, Bifidobatterum' address Scentis (B. adolescentis ), Bifido Batterium 'Latatentes (B. lactentis), Bifidobacterium Bifidum (B. bifidum), Bifidobacterium' Syudulongum (B. ps eudolongum), Bifido Batterium 'Thermophilum (B.
  • thermophirum Bifidobacteria 'B. infantis', Bifido Batterium 'B. animalis' and the like. Among them, it is known that they are permanently present in the human intestine regardless of their ages. Bifido Batterium 'Longham, Bifido Batterium' Brebe, Bifido Bacterium 'Addresses Tei, Bifido Batterium It is preferable to use mu'bifidam, bifidobatterium 'infantis as a host fungus, and more preferred to use bifidobatterium longum.
  • All of these bacteria are commercially available, or can be easily obtained from depository agencies, such as Bifido Batterium 'Longham ATCC-15707, Bifido Batterium' Bifidum ATCC-11863, Bifido Batterium 'Infantice ATCC — 15697 can be used.
  • Bifido Batterium longum strains which are not particularly limited, include, for example, Bifido Batterium 'longum 105-A strain, Bifidobatterum' longum aE-194b strain, Bifidobacterium longum Examples include bs-601 strain and bifidobatterium longum M101-2 strain. Among them, bifidobatterum longum 105-A strain is preferable.
  • Bifido Batterium breve Bifido Batterium breve standard strain (JCM1192)
  • JCM1192 Bifido Batterium breve aS-1 strain
  • Bifido Batterium Breve I—53—8W stock Bifido Batterium Breve I—53—8W stock
  • strain of bifidobatterium 'latatintis' is not particularly limited, but for example, bifidobatterium' latatentis standard strain (JCM1220) can be exemplified.
  • the Bifidobacterium bacterium having the above-mentioned properties is more specifically expressed by a CD expression 5-FU resistant bif, which carries the plasmid P B LESIOO-S-eCD or a plasmid variant thereof.
  • Idbataterum longum 105-A strain (Bifidobatterium longum 105-A strain transformed with plasmid pBLES 100—S—eCD or its plasmid mutant), plasmid p AVOO 1 -HU- CD expression that retains eCD or its plasmid variant ⁇ 5— FU-resistant bifidobatterium 'longum 105-A strain, plasmid pAVOOl — HU— that retains eCD or its plasmid variant ⁇ 5 — FU-resistant Bifidobacterium 'breve standard strain, plasmid pAVOOl—HU— ECD or CD variant carrying the plasmid variant ⁇ 5-FU-resistant Bifidobacterium' breve aS—1 strain, plasmid pAVOO 1— HU— eCD CD expression that retains the plasmid variant ⁇ 5— FU resistant bifidobacteria breve I
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains the CD-expressing 5-FU-resistant bacteria of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more of the CD-expressing 5-FU-resistant bacteria of the present invention.
  • the CD expression of the pharmaceutical composition of the present invention is such that the dose of 5-FU resistant bacterium is sufficient to express an amount of CD that can be converted into an effective therapeutic amount of 5-FU such as 5-FC force. As long as the amount is small, there is no particular restriction, but as little as possible is preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain an optional component in addition to the CD-expressing 5-FU-resistant bacterium of the present invention as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • optional components include pharmacologically acceptable carriers, excipients, diluents and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is converted into an effective amount of 5-FU by the CD-expressing 5-FU-resistant bacteria of the present invention. It can be used in combination with an amount of 5-FC that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention, but is preferably used in combination with a pharmaceutical composition containing 5-FC.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can display, for example, lactulose as such a saccharide, which can be combined with the saccharide capable of promoting the growth of the CD-expressing 5-FU-resistant bacteria of the present invention. .
  • X and Y in different forms and Y having the same form (for example, a form containing X and Y). Including cases.
  • both X and Y may contain other components.
  • the CD-expressing 5-FU resistant bacterium of the present invention grows in the tumor.
  • 5-FC is administered to a patient while the resistant bacteria are present in the tumor
  • 5-FC is converted to 5-FU by the action of CD in the tumor, and the tumor cells are killed.
  • CD expression of the present invention 5 FU-resistant bacteria can kill tumor cells 5— Survives even at FU concentrations and can sustain the enzyme action by CD. An excellent antitumor agent comprising FU resistant bacteria as an active ingredient can be obtained.
  • the CD-expressing 5-FU-resistant bacteria cannot grow in the portion other than the tumor in an anaerobic environment where the CD-expressing 5-FU-resistant bacteria of the present invention can grow.
  • the overall side effects of 5-FU can be significantly reduced compared to when 5-FU is administered as it is. Furthermore, since the antitumor effect of the solid tumor therapeutic agent of the present invention is high and specific for tumors, it has a much higher 5-FU concentration than when 5-FU is administered as it is. It can be realized within the tumor, and as a result, an extremely excellent antitumor effect can be obtained.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention include a liquid or solid preparation containing the CD-expressing 5-FU resistant bacterium of the present invention.
  • a liquid or solid preparation containing the CD-expressing 5-FU resistant bacterium of the present invention.
  • purify the CD expression • 5--FU resistant bacterial culture of the present invention and fill it with ample or vials with appropriate physiological saline solution or supplement or medicine additive as necessary.
  • the appropriate protective agent is added to the solution and filled in ampoules or vials, and then freeze-dried or L-dried. It can be manufactured by adding a protective agent and freeze-drying or L-drying and filling it into ampoules or vials.
  • parenteral administration is preferred, for example, subcutaneous injection, intravenous injection, local injection, intraventricular administration, and the like, and intravenous injection is most preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used in combination with 5-FC.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention and the administration method of 5-FC may be the same or different, and the administration may be simultaneous or at intervals.
  • FC is preferably administered after the administration of the pharmaceutical composition of the present invention, and after allowing sufficient time for the CD-expressing 5-FU-resistant bacteria of the present invention to grow sufficiently in tumor cells.
  • the dose of 5-FC used in combination with the pharmaceutical composition of the present invention can be converted from 5-FC to an effective therapeutic amount of 5-FU by the CD-expressing 5-FU-resistant bacteria of the present invention.
  • the amount is not particularly limited as long as the amount is sufficient, but it is preferable that the amount is as small as possible.
  • a force in the range of 5 to 200 mgZkg can be selected as appropriate.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with a saccharide that promotes the growth of the CD-expressing 5-FU resistant bacterium of the present invention, and examples of such saccharide include lactulose. Can do. Such saccharides may be administered simultaneously or at separate intervals as another pharmaceutical composition that may be contained and administered in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Bifido Batterium 'Longam and Escherichia coli shuttle vector pBLES 100 see Patent Document 2 and Non-Patent Document 23
  • Scal was added to the forward primer and Eaml 1051 restriction enzyme site was added to the reverse primer.
  • the cloning vector pGFPuv (DEFINI TION: Cloning vector pGFPuv. ACCESSION: U62636 VERSION: U62636.1 GI: 14 90528) purchased from Invitrogen is a multicloned gene at both ends. -Multi-Cloning Site (MCS), ampicillin resistance gene, and E. coli plasmid replication origin.
  • MCS Multi-Cloning Site
  • the ampicillin metagene site of pGFPuv was cleaved with restriction enzymes Eaml 1051 and Seal to prepare a long fragment that was removed.
  • a fragment (about HOObp) containing an AAD cassette obtained by cleaving pCRTOPO-Seal-AAD-Earn 11051 was prepared using restriction enzymes Eaml 1051 and Seal.
  • PGFP uv- SpR was prepared by ligating the above two fragments using T4DNA ligase. It was confirmed in Escherichia coli that the prepared plasmid pGFPuv-SpR was imparted with a spectinomycin-resistant trait, and at the same time the ampicillin-resistant trait was deleted.
  • pGFPuv—SpR was digested with the restriction enzymes Sail (present in the multicloning site upstream of the GFPuv gene) and Spel (present in the multicloning site downstream of the GFPuv gene), and the plasmid pAVN from which the GFPuv gene was deleted was obtained. Produced.
  • An approximately 1900 bp sequence containing SDO, DDO, AT—rich repeats and DnaA-binding motifs was identified as a plasmid replication unit for bifidobatterium longum.
  • a pCRTOPO-Apal-1900-Seal that was subcloned into the pCR-Bluntn-TOPO vector was prepared by PCR amplification of about 1900 bp containing the plasmid replication unit of Bifido Batterium 'longum from pTB6.
  • Apal restriction enzyme site was added to the foreprimer primer and Apal, respectively.
  • pCRTOP O-Apal 1900 Short fragment (about 1900 bp) digested with restriction enzymes Apal and Seal, as well as the long fragment (about 2400 bp) digested with restriction enzymes Apal and Seal, using T4DNA ligase In this way, a bifluid baterilium 'longum-E. Coli shuttle vector pAVOOl (about 4300 bp) was prepared.
  • pBLES100-S-eCD was cleaved with the restriction enzymes Hindlll and Spel, and about 2900 bp including the HU gene promoter motor, the CD gene derived from E. coli and the HU gene terminator was extracted.
  • the pAVOO1—HU— pAVOO1—HU— was combined with the above 2900 bp fragment using the T4DNA ligase to the long fragment obtained by cleaving the shuttle vector pAVOOl with Hindlll and Spel at the restriction enzyme cleavage site in the multicloning site.
  • An eCD (about 71 OObp) was prepared.
  • the bacterial cells were separated by centrifugation from a culture solution obtained by culturing wild-type bifidobatterium longum in an MRS medium at 37 ° C under anaerobic conditions, and a bacterial suspension suspended in an appropriate buffer solution was prepared.
  • the cytosine 'deaminase gene expression vector pAVOO 1 -HU-eCD was introduced into the cell suspension using the electopore position method described in Non-Patent Document 23.
  • Recombinant Bifido Batterium longum (Bifido Batterium longum / p AVOO 1 -HU-eCD) introduced is selected based on the formation of agar on an agar medium containing the antibiotic spectinomycin did.
  • Bifluid Batterium Longum / p AVOO 1 -HU- eCD or wild-type Bifidobacterium longum, MRS medium containing antibiotic spectinomycin, respectively Subcultured for more than 2 days under anaerobic conditions at 37 ° C
  • the bacterial cells (1 ⁇ 10 9 CFU) were separated by centrifugation, and after sonication, the intracellular proteins were extracted.
  • the extracted protein was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the expression of cytosine 'deaminase protein was confirmed by Western analysis.
  • Bifluid Batterium Longum / p AVOO 1 -HU- eCD or wild-type Bifidobacterium longum, MRS medium containing antibiotic spectinomycin, respectively Subcultured for more than 2 days under anaerobic conditions at 37 ° C
  • the cells (2 ⁇ 10 9 CFU) were separated by centrifugation and resuspended in 4.5 mL of MRS medium.
  • 0.5 mL of 5-FC (20 mgZmL) was added to a final concentration of 2 mgZmL, and the cells were cultured under anaerobic conditions at 37 ° C.
  • the stored bacteria had grown on the next day and maintained resistance to 5-FU.
  • the number of viable bacteria was measured using a plate assay method after culture, the wild type was below the detection limit (10 3 CFU / mL or less).
  • the stored bacterial solution was 2 to 3 X 10 9 CF UZmL bacteria have grown.
  • 5-FU is respectively applied on BL agar medium without BL agar medium and 5-FU included 250 ⁇ g / mL, 37 ° Raw after 2-3 days anaerobic culture in C The number of bacteria was measured. The experiment was performed in 5 series. The results are shown in Table 3. As can be seen from the results in Table 3, the 5-FU resistance traits of 5-FU-resistant bifidobatterium longum were maintained even after 30 days of continuous subculture.
  • Bifact pacterium longum from reference example 1 Zp AVOO 1 -HU- eCD (5-FU non-tolerant bifact pacterium longum) and bifido batterium longum obtained in Example 1 Zp AVOOl-HU-eCD (5-FU-resistant bifido pacteria longum) was subcultured for more than 2 days under anaerobic conditions at 37 ° C in MRS medium containing antibiotic spectinomycin. After that, 50 L of each culture was inoculated into MRS medium containing 5, 25, 50, 100, 250, 500 gZmL of 5-FC and cultured under anaerobic conditions at 37 ° C for 24 hours.
  • 5-FU-resistant bifactacterium longum was prepared at each 5-FU concentration.
  • 5-FU-resistant bifatebatterium 'longum prepared in a medium containing 1-: L 00 ⁇ g / mL of 5 -FU was transformed into 5-FU in the same manner as the 5-FU-resistant strain obtained in Example 1. It was resistant.
  • the 5-FU resistant strain obtained in Example 2 was transformed in the same manner as in Reference Example 1, and the expression of cytosine deaminase was confirmed.
  • the produced 5-FU resistant strain that expresses cytosine deaminase is resistant to 5-FU as in the 5-FU resistant strain obtained in Example 1, and its 5-FU resistant performance is at least 7 days. It was maintained above.
  • a 5-FU resistant bacterium such as a Bifidobacterium genus that is extremely useful for EnzymeZpro-drug therapy using CDZ5-FC and retains CD activity and is resistant to 5-FU.
  • a cancer patient is administered a Bifidopacteria bacterium that retains CD activity and is resistant to 5-FU
  • the Bifidopacteria bacterium grows in the tumor and is present in the tumor.
  • 5-FC is orally administered, it is absorbed from the intestinal tract, and the ability of CD in the tumor to convert 5-FC to 5-FU and kill the tumor cells.
  • the 5-FU-resistant Bifidobacterium bacteria can survive and continue the enzyme action by CD.
  • An excellent antitumor agent as an active ingredient can be obtained.
  • 5-FC is not converted to 5-FU, so compared with the case where 5-FU is administered as it is.
  • 5-Side effects caused by FU can be significantly reduced.
  • the antitumor effect of the solid tumor therapeutic agent of the present invention is high and specific for tumors, it has a much higher 5-FU concentration than when 5-FU is administered as it is. It can be realized in the tumor, and as a result, an extremely excellent antitumor effect can be obtained.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　本発明は、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン・デアミナーゼ（ＣＤ）を発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）耐性能を有するＣＤ発現・５－ＦＵ耐性菌の作製方法を提供するものである。具体的には、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるＣＤ発現菌を、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）の存在下で継代・馴化培養する方法Ａや、（１）嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、ＣＤを発現しない菌を５－ＦＵの存在下で継代・馴化培養して、５－ＦＵ耐性菌を作製する工程と、（２）該５－ＦＵ耐性菌に、ＣＤ遺伝子を導入して形質転換する工程とを有する方法Ｂである。さらに本発明は、該ＣＤ発現・５－ＦＵ耐性菌およびこれを含有する医薬組成物を提供するものである。

Description

明 細 書
5_フルォロウラシル耐性菌およびその作製方法
技術分野
[0001] 本発明は、固形腫瘍治療剤として有用な、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育 でき、シトシン'デァミナーゼ (EC3.5.4.1 ;以下 CD)を発現することができ、かつ、少な くとも抗腫瘍活性有効濃度の 5—フルォロウラシル (以下 5— FU)耐性能を有す CD 発現 ' 5—FU耐性菌の作製方法に関する。また、本発明は、 5— FU耐性菌、該耐性 菌を含有する医薬組成物、及び該耐性菌を含有する固形腫瘍治療剤に関する。 背景技術
[0002] CDは、シトシンをゥラシルに脱ァミノ化する酵素である（例えば、非特許文献 1参照 )。 CDは微生物の代謝に於いて重要な役割を果たす酵素であり、複数の異なる微生 物より分離されている力 哺乳動物細胞はこの CDを通常は産生しない（例えば、非 特許文献 2参照)。 CDを産生する多くの細菌及び真菌は、 5—フルォロシトシン（以 下 5—FC)を細胞に対して致死的な極めて毒性の強い代謝物、 5—FUに変換する。 5-FUは異常 RNAの生成と DNA合成を阻害するが、 5— FCの抗真菌作用はこの 5— FUの異常RNA生成とDNA合成阻害作用による。
[0003] すなわち、 5— FCはシトシンパ一ミアーゼによって真菌細胞内へ取り込まれ、細胞 内で 5— FCは CDによって直ちに 5— FUに変換される。細胞内の 5— FUは 5— FU MPを経て、 UMP—ピロホスホリラーゼによって 5— FUDPへ変換される。さらにその 先のリン酸化経路は 2つに分岐し、一方では 5— FUTP力 他方では 5— FdUMPが 生成される。ここで 5— FUTPは、 UTPの代りに RNAに取り込まれて異常な RNAを 生成することによって、正常なタンパク合成を阻害し、結果的に真菌の発育を阻止す ることになる。また、 5— FdUMPは、チミジン酸合成酵素に対する強力な阻害剤とし て働き、 DNA合成 '核分裂を阻害して殺菌的効果を現わす。
[0004] しかし、正常な哺乳動物細胞は有意な量の CDを発現しないため、 5— FCを有毒な 代謝物 5— FUに脱ァミノすることができず、従って 5— FCは強い抗菌活性を示す濃 度においても哺乳動物細胞に対しては無毒である。一方、 5— FUは哺乳動物細胞 に対しても強い細胞毒性作用を有しており、抗ガン剤として広く使用されている。
[0005] CD遺伝子は、大腸菌 (Escherichia coli)及び酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)より 分離され、クローン化されている。（例えば、非特許文献 3, 4参照)そして、多くの研 究者がこの CD遺伝子の哺乳動物細胞への導入により、イン'ビトロにおけるこれら細 胞の 5— FCに対する選択的感受性が低下することを示している（例えば、非特許文 献 3, 5参照)。また、レトロウイルスベクターを使った、 CD遺伝子を導入された腫瘍細 胞は、イン'ビボにおいて 5—FCによる動物の全身治療により排除できることも示され ている（例えば、非特許文献 6〜8参照)。さらに、複製欠損アデノウイルスベクター（ 例えば、非特許文献 9参照)及びカチオン性リボゾーム (例えば、非特許文献 10参照 )もまた、それぞれ、ヒト大腸癌細胞及びマウスの巨大細胞肺癌への CD遺伝子の導 入に利用されている。これら腫瘍細胞内での遺伝子発現は、 5— FCに対する感受性 を付与する。
[0006] 力ンジダ（Candida)等の真菌の感染症に用いられる 5— FCは耐性を得やす!/、こと が知られている（例えば、非特許文献 11参照)。 5—FCに対する耐性は、 5—FUへ の変換、 RNAへの取り込み等に関与する 、ずれかの酵素の喪失又は変異によって 起こりうるために、理論的には多様な耐性化機序が考えられるが、臨床的に最も頻度 が高いのは、カンジダ 'アルビカンスにおける UMP ピロホスホリラーゼの喪失、又 は活性低下に伴う耐性獲得であり、 5 FC感受性と UMP ピロホスホリラーゼ酵素 活性が明らかに相関することも知られて 、る。核相が一倍体であるカンジダ ·グラブラ ータでは、シトシンパ一ミアーゼゃ CDの欠損による耐性株も報告されて!、る。
[0007] 他方、ビフイドバタテリゥム ·ロンガム (Bifidobacterium longum)は、グラム陽性の嫌気 性細菌で、そのゲノムは GC含量が高い（例えば、非特許文献 12参照)。このビフイド ノ クテリゥム 'ロンガムは非病原性であり、ヒトゃ他の動物の大腸における、正常なミク 口フローラの大部分を構成している（例えば、非特許文献 13参照)。免疫反応を高め (例えば、非特許文献 14参照）、癌の発生に対して抑制効果を有し (例えば、非特許 文献 15参照）、ウィルス感染力も宿主を保護し (例えば、非特許文献 16, 17参照）、 抗菌物質を生産する可能性がある (例えば、非特許文献 18参照)等、宿主の健康を 促進する特性を有するとされている。ビフイドパクテリゥム種には、世界中で広く発酵 乳製品の調製に使用されているものもある。
[0008] さらに、ビフイドバタテリゥムのプラスミドは、プロバイオテイクスのベクターや、感染性 疾患の経口ワクチンのベクターへの応用を期待されている。例えば、ビフイドバタテリ ゥム由来のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドを利用してビフイドパクテリゥムと大腸 菌で相互複製されるシャトルベクターを製造する段階と、前記シャトルベクターに目 的蛋白質をコーディングする目的遺伝子を結合させて組換えベクターを製造する段 階とを有し、前記製造された組換えベクターに形質転換させるための宿主細胞として 前記シャトルベクターの製造に利用されたビフイドパクテリゥムを利用することを特徴と する形質転換方法が知られている (例えば、特許文献 1参照)。また、最近の報告に よって、全身投与後、低酸素の固形腫瘍にビフイドパクテリゥム 'ロンガムが蓄積し (例 えば、非特許文献 19, 20参照）、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム hupプロモーターと融 合した大腸菌 codAを保有する組換えプラスミド pBLES 100— S— eCDが、微生物 において CDを発現することが明らかとなった (例えば、特許文献 2及び非特許文献 2 1, 22参照)。これによつて、糸且換えビフイドバタテリゥム 'ロンガム力 酵素一プロドラッ グ療法に有効であることが裏付けられた。前記組換えプラスミド pBLESlOO— S— e CDの構築に用いられた pBLES 100は、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム BK51の pTB 6と大腸菌の pBR322と力 構築されたシャトルベクターである。力かるシャトルベクタ 一 pBLESlOOは、 2. 2 X 104形質転換体/ / z gDNAの有効率でビフイドバクテリウ ム ·ロンガムを形質転換し、その細胞中で構造的及び形質分離の点で安定して 、た ( 例えば、非特許文献 23参照)。ところが、トランスフエクシヨンの際に、未修飾 DNAを 有するプラスミドが制限酵素によって微生物中で切断される可能性があることから、 外来遺伝子のクローンユングには、更に高い形質転換率が必要とされ、本発明者ら は、 pBLES 100と比較して 100倍を超える高効率で、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム を形質転換しうるプラスミド pAVOOl及び pBRASTAlOlを提案して 、る（例えば、 非特許文献 24参照)。
[0009] 上述したように、 5— FUは哺乳動物細胞に対しても強い細胞毒性作用を有してお り、抗ガン剤として広く使用されている。しかし、 5— FUをそのまま患者に投与する際 には、患者への副作用を避けるために、例えば血中濃度で 1 gZml程度以下とな るように投与する力 又は血中濃度が 1 gZmlを超えるように投与する場合であつ ても、血中濃度が 1 μ gZmlを超えている時間はせいぜい 1時間程度とする必要があ つた。このような事情から、従来の方法では、 5— FUの抗ガン作用が十分に発揮され ているとは言い難力 た。このような状況下において、高濃度の 5— FUで腫瘍を処 理しつつ、 5—FUの副作用の問題を克服する手段が強く求められていた。
特許文献 1:特表 2004— 519236号公報
特許文献 2：特開 2002— 97144号公報
非特許文献 1:0， Donovan et al.， Bact.Rev.34:278 (1970)
非特許文献 2:Nishiyama et al, Cancer Res.45:1753 (1985)
非特許文献 3: Austin et al., Pharmacol.43: 380 (1992)
非特許文献 4: Anderson et al., Arch. Microbiol.152:115 (1989)
非特許文献 5:Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:33 (1992)
非特許文献 6:Huber et al., Cancer Res.53:4619 (1993)
非特許文献 7: Mullen et al., Cancer Res.54: 1503 (1994)
非特許文献 8:Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8302 (1994)
非特許文献 9:Hirschowitz et al., Human Gene Ther.6:1055 (1995)
非特許文献 10: Davis et al., Proc. AACR Abstract No.2355, p345 (1996) 非特許文献 ll:Clin. Microbiol. Rev.11:382-402.1998
特許文献 12:Scardovi, Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology vol 2, eds. Sn eath et al" pp.1418-1434 (1986)
非特許文献 13:Mitsuoka, Elsevier Applied Science, pp 69-114 (1992)
非特許文献 14:Yasui et al. J. Dairy Sci., 74, 1187-1195 (1991)
非特許文献 15:Reddy et al., Cancer Res., 53, 3914-3918 (1993)
非特許文献 16: Duffy et al., Pediatr. Res., 35, 690-695 (1994)
非特許文献 17:Saaverdra et al., Lancet., 344, 1046-1049 (1994)
非特許文献 18: Ibrahim et al., J. Food Prot., 56, 713-715 (1993)
非特許文献 19:Yazawa et al. Cancer Gene Ther., 7, 269-274 (2000)
非特許文献 20:Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001) 非特許文献 21 : Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366 (2002 )
非特許文献 22 : Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203 (2002) 非特許文献 23 : Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212 (199 7)
非特許文献 24 : Tanaka et al., Biosci Biotechnol Biochem. ;69(2):422-425 (2005, Feb )
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] CDZ5— FCを用いた EnzymeZpro— drug療法は動物実験、臨床試験等に広く 用いられている治療法である。力かる EnzymeZpro— drug療法における CD遺伝 子導入細胞 (菌）の 5— FU耐性が向上すると、 5— FUにより死滅することがな 、ため 、 CD遺伝子導入細胞（菌）の生存が向上し、 CDZ5—FCを用いた EnzymeZpro — drug療法の治療効果が有意に向上することが期待できる。本発明の課題は、この ような、 EnzymeZpro— drug療法の治療剤として有用な、 CDを発現することができ 、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の 5— FU耐性能を有する CD発現 · 5— FU 耐性菌を作製する方法を提供することにある。また、本発明の課題は、高濃度の 5— FUで腫瘍を処理しつつ、 5— FUの副作用の問題を克服することを可能とする 5— F U耐性菌、該耐性菌を含有する医薬組成物、及び該耐性菌を含有する固形腫瘍治 療剤を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討し、 CDを発現していない菌に C D遺伝子を導入して形質転換した CD発現菌を、 5 FCの存在下で継代 ·馴化培養 することにより、 CD活性を保持したまま 5— FU耐性菌を作製しうることを見い出した。 すなわち、 CD発現菌を、培養培地中に所定量の 5— FCを加えて培養すると、 CD発 現菌の増殖と共に発現した CDの酵素活性により徐々に 5— FCが 5— FUへと変換さ れ、所定量の 5— FCをカ卩えたにもかかわらず、初めは低濃度 5— FUで作用すること で、 CD発現菌の死滅を防ぎ、徐々に濃度が上がることで、耐性能を獲得した CD発 現 ' 5— FU耐性菌のみを選択的に培養することができることを見い出した。また、本 発明者らは、 CDを発現して 、な 、細菌を 5— FUの存在下で継代 ·馴化培養するこ とにより 5— FU耐性菌を作製した後、この 5— FU耐性菌に、 CD遺伝子を導入して 形質転換することによつても、 CD発現 ' 5— FU耐性菌を作製できることを見出した。 さらに、本発明者らは、このような方法で得られる 5— FU耐性菌を用いることによって 、高濃度の 5— FUで腫瘍を処理しつつ、 5— FUの副作用の問題を克服することを 可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 [1]嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン'デ アミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の 5—フルォ ロウラシル耐性能を有するシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌 の作製方法であって、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン'デアミ ナーゼ発現菌を、 5 フルォロシトシンの存在下で継代 ·馴化培養することを特徴と する耐性菌の作製方法や、 [2]嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシ ン 'デアミナーゼ発現菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シト シン ·デァミナーゼを発現しな!、菌に、シトシン ·デミナーゼ遺伝子を導入して形質転 換したシトシン'デァミナーゼ発現菌であることを特徴とする [1]に記載の耐性菌の作 製方法や、 [3] 2〜5000 μ gZmlの 5 フルォロシトシンを添カ卩した培地で継代'馴 化培養することを特徴とする [1]又は [2]に記載の耐性菌の作製方法や、 [4]嫌気的 環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン'デアミナーゼ発現菌が、嫌気的環境 下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼを発現するバクテリア であることを特徴とする [ 1]〜 [3]の ヽずれかに記載の耐性菌の作製方法や、 [5]嫌 気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼを発現する ノ クテリア力 シトシン'デァミナーゼを発現する腸内細菌であることを特徴とする [4] に記載の耐性菌の作製方法や、 [6]シトシン'デァミナーゼを発現する腸内細菌が、 シトシン'デァミナーゼを発現するビフイドバタテリゥム属細菌であることを特徴とする、 [5]に記載の耐性菌の作製方法や、 [7]シトシン'デァミナーゼを発現するビフイドバ クテリゥム属細菌力 シトシン'デァミナーゼを発現するビフイドバタテリゥム 'ロンガム、 ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、又はビフイドバタテリゥム 'インファンテイスであることを 特徴とする [6]に記載の耐性菌の作製方法や、 [8]シトシン'デァミナーゼを発現す るビフイドバタテリゥム属細菌力 S、シトシン .デアミナーゼを発現するビフイドバクテリウ ム ·ロンガムであることを特徴とする [7]に記載の耐性菌の作製方法や、 [9]嫌気的 環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン'デァミナーゼを発現することができ、 かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の 5—フルォロウラシル耐性能を有することを 特徴とするシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌の作製方法であ つて、（1)嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼ を発現しな 、菌を 5 -フルォロウラシルの存在下で継代 ·馴化培養して、 5 -フルォロ ゥラシル耐性菌を作製する工程と、（2)該 5—フルォロウラシル耐性菌に、シトシン' デァミナーゼ遺伝子を導入して形質転換する工程を有することを特徴とする耐性菌 の作製方法や、 [10] 1〜： LOO μ gZmlの 5—フルォロウラシルを添カ卩した培地で継 代'馴化培養することを特徴とする [9]に記載の耐性菌の作製方法や、 [11]嫌気的 環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼを発現していな ぃ菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼ を発現して ヽな 、バクテリアであることを特徴とする [9]又は [10]に記載の耐性菌の 作製方法や、 [12]嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デ アミナーゼを発現して ヽな 、バクテリアが、シトシン ·デァミナーゼを発現して 、な ヽ 腸内細菌であることを特徴とする [11]に記載の耐性菌の作製方法や、 [13]シトシン •デアミナーゼを発現していない腸内細菌力 シトシン'デァミナーゼを発現していな ぃビフイドパクテリゥム属細菌であることを特徴とする [12]に記載の耐性菌の作製方 法や、 [14]シトシン'デァミナーゼを発現していないビフイドバタテリゥム属細菌力 シ トシン ·デァミナーゼを発現して!/、な 、ビフイドバタテリゥム ·ロンガム、ビフイドバタテリ ゥム ·ブレーべ、又はビフイドバタテリゥム 'インファンテイスであることを特徴とする [ 13 ]に記載の耐性菌の作製方法や、 [15]シトシン'デァミナーゼを発現していないビフ イドバタテリゥム属細菌力 シトシン'デァミナーゼを発現していないビフイドバクテリウ ム.ロンガムであることを特徴とする [14]に記載の耐性菌の作製方法や、 [16]嫌気 的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン'デァミナーゼを発現することができ 、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の 5—フルォロウラシル耐性能を有するシトシ ン ·デアミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌であって、 [ 1 ]〜 [ 15]の!、ずれか に記載の作製方法で作製されることを特徴とするシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フ ルォロウラシル耐性菌や、 [17]嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシ ン 'デァミナーゼを発現することができ、かつ、少なくとも 2 μ gZmlの 5 フルォロシト シン又は 1 μ g/mlの 5 フルォロウラシルを添カ卩した培地で生育できることを特徴と するシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [18]シトシン ·デァ ミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌力 シトシン ·デアミナーゼ発現 · 5—フル ォロウラシル耐性バクテリアであることを特徴とする [ 16]又は [ 17]に記載のシトシン · デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [19] シトシン'デァミナーゼ発 現 · 5—フルォロウラシル耐性バクテリア力 シトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 -フルォロ ゥラシル耐性腸内細菌であることを特徴とする [ 18]に記載のシトシン'デァミナーゼ 発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [20]シトシン ·デアミナーゼ発現 · 5 フルォロ ゥラシル耐性腸内細菌が、シトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性ビ フイドパクテリゥム属細菌であることを特徴とする [19]に記載のシトシン ·デァミナーゼ 発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [ 21 ]シトシン'デアミナーゼ発現 · 5 フルォロ ゥラシル耐性ビフイドバタテリゥム属細菌力 シトシン'デァミナーゼ発現 · 5—フルォロ ゥラシノレ而性ビフイドバタテリゥム 'ロンガム、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、又はビフ イドバタテリゥム 'インファンテイスであることを特徴とする [20]に記載のシトシン'デァ ミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [22]シトシン ·デァミナーゼ発現 · 5— フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム属細菌力 シトシン .デアミナーゼ発現 · 5— フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム .ロンガムである [20]に記載のシトシン ·デ アミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [23] シトシン'デァミナーゼ発現' 5 -フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム力 プラスミド pBLES 100 - S eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フル ォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム.ロンガム 105— A株であることを特徴とする [22 ]に記載のシトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [24]シトシン •デァミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム力 プラ スミド pAVOOl— HU eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シトシン'デァミ ナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム 105— A株であ ることを特徴とする [23]に記載のシトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル 耐性菌や、 [25]シトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性ビフイドバクテ リウム 'ブレーべが、プラスミド pAVOO 1 -HU- eCD又はそのプラスミド変異体を保 持する、シトシン'デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバクテリウム' ブレーべ標準株であることを特徴とする [21]に記載のシトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [26]シトシン ·デアミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシ ル而性ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ力 プラスミド pAVOOl HU— eCD又はその プラスミド変異体を保持する、シトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性 ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ aS— 1株であることを特徴とする [21]に記載のシトシン •デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [27]シトシン ·デァミナーゼ発 現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ力 プラスミド pAVOOl— HU eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シトシン ·デァミナーゼ発現 · 5— フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム .ブレーべ I— 53— 8W株であることを特徴 とする [21]に記載のシトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [2 8]シトシン ·デアミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·インフ アンテイスが、プラスミド pAVOOl—HU— eCD又はそのプラスミド変異体を保持する 、シトシン'デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム 'インファ ンテイス標準株であることを特徴とする [21]に記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [29]シトシン ·デアミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシ ル而性ビフイドバタテリゥム 'インファンテイスが、プラスミド pAVOOl HU— eCD又 はそのプラスミド変異体を保持する、シトシン'デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシ ル耐性ビフイドバタテリゥム 'インファンテイス 1- 10— 5株であることを特徴とする [21] に記載のシトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌や、 [30] [16]〜[ 29]のいずれかに記載のシトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌を 含有することを特徴とする医薬組成物や、 [31] 5 フルォロシトシンと組み合わせて なることを特徴とする [30]に記載の医薬組成物や、 [32]さらに、ラクッロースと組み 合わせてなることを特徴とする [30]又は [31]に記載の医薬組成物や、 [33] 5 フ ルォロシトシンから有効治療量の 5—フルォロウラシルに変換できる量のシトシン 'デ アミナーゼを発現するのに十分な量のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フルォロゥラ シル耐性菌と、有効治療量の 5—フルォロウラシルに変換できる量の 5—フルォロシト シンとを組み合わせてなる固形腫瘍治療剤であって、シトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌が [ 16]〜 [29]の!、ずれかに記載のシトシン ·デァミナ一 ゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性菌であることを特徴とする固形腫瘍治療剤や、 [34 ]さらに、ラクッロースを組み合わせてなることを特徴とする [33]に記載の固形腫瘍治 療剤に関する。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]ビフイドバタテリゥム属と大腸菌のシャトルベクター pAVOOlの作製過程と、 CD を発現するシャトルベクター pAVOOl— HU— eCDとの作製過程を示す図である。
[図 2]野生型ビフイドバタテリゥム 'ロンガムとビフイドバタテリゥム/ pAVOOl—HU— eCDにおける、 CDタンパクの発現量の比較結果を示す図である。
[図 3]野生型ビフイドバタテリゥム 'ロンガムとビフイドバタテリゥム/ pAVOOl—HU— eCDにおける、 CDタンパク酵素活性の比較（5— FC→5— FUの変換活性比較)の 結果により得られた、経時菌数変化を示す図である。
[図 4]野生型ビフイドバタテリゥム 'ロンガムとビフイドバタテリゥム/ pAVOOl—HU— eCDにおける、 CDタンパク酵素活性の比較（5— FC→5— FUの変換活性比較)の 結果により得られた、 5— FU濃度を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明における 5— FU耐性菌の作製方法としては、嫌気的環境下にある腫瘍組 織内で生育できる CD発現菌を、 5— FCの存在下で継代 '馴化培養する方法 A、又 は、（1)嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、 CDを発現しない菌を 5 —FUの存在下で継代'馴化培養して、 5— FU耐性菌を作製する工程と、（2)該 5— FU耐性菌に、 CD遺伝子を導入して形質転換する工程とを有する方法 Bであれば特 に制限されない。
[0016] 上記方法 Aにおける嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できる CD発現菌とし ては、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、 CDを発現している菌であ る限り特に制限はされず、自然界力 単離した菌であってもよいし、嫌気的環境下に ある腫瘍組織内で生育でき、かつ、 CDを発現していない菌に CD遺伝子を導入して 形質転換した組み換え菌であってもょ 、。
[0017] また、上記方法 Bで用いられる、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ 、 CDを発現していない菌としては、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、か つ、 CDを発現して ヽな ヽ菌であれば特に制限されな!、。
[0018] 本発明の作製方法で用いられる、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できる菌 としては、バクテリア (細菌）や真菌を例示することができ、該バクテリアとして、ビフイド バタテリゥム属細菌、クロストリディウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカ ス属細菌、ぺプトコッカス属細菌、ェンテロコッカス属細菌、バタテロイデス属細菌、ュ 一パクテリゥム属細菌等の腸内細菌を具体的に例示することができる力 中でも、ビ フイドバタテリゥム属細菌が好まし 、。
[0019] 上記ビフイドバタテリゥム属細菌として、具体的にはビフイドバタテリゥム 'ロンガム、 ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ（Bifidobacterium breve)、ビフイドバタテリゥム 'アドレス センティス（B. adolescentis)、ビフイドバタテリゥム'ラタテンテイス（B. lactentis)、ビフ イドバクテリウム'ビフィダム（B. bifidum)、ビフイドバクテリウム'シユードロンガム（B. ps eudolongum)、ビフイドバタテリゥム 'サーモフィラム（B. thermophirum)、ビフイドバクテ リウム 'インファンテイス（B. infantis)、ビフイドバタテリゥム'アニマリス（B. animalis)な どを挙げることができる。中でも、年齢に関係なくヒトの腸内に常在していることが知ら れているビフイドバタテリゥム 'ロンガム、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、ビフイドバクテ リウム'アドレツセンテイス、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム、ビフイドバタテリゥム 'イン ファンティスを宿主菌として用いることが好ましく、ビフイドバタテリゥム ·ロンガムを用い ることがより好ましい。これらの菌は、いずれも市販されている力、または寄託機関か ら容易に入手することができ、例えば、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム ATCC— 15707 、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム ATCC— 11863、ビフイドバタテリゥム 'インファンテ イス ATCC— 15697を用いることができる。
[0020] ビフイドバタテリゥム ·ロンガムの株にっ ヽては特に制限されな 、が、例えばビフイド バタテリゥム 'ロンガム 105— A株、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム aE— 194b株、ビフィ ドバクテリゥム ·ロンガム bs - 601株、ビフイドバタテリゥム ·ロンガム M101 - 2株を例 示することができ、中でもビフイドバタテリゥム'ロンガム 105— A株を好ましく例示する ことができる。
[0021] また、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべの株についても特に制限されないが、例えばビ フイドバタテリゥム ·ブレーべ標準株 (JCM1192)、ビフイドバタテリゥム ·ブレーべ aS - 1株、ビフイドバタテリゥム ·ブレーべ I— 53— 8W株を例示することができる。
[0022] また、ビフイドバタテリゥム 'インファンテイスの株についても特に制限されないが、例 えばビフイドバタテリゥム 'インファンテイス標準株 (JCM1222)、ビフイドバタテリゥム 'ィ ンファンティス I— 10— 5株を例示することができる。
[0023] また、ビフイドバタテリゥム 'ラタテンテイスの株についても特に制限されないが、例え ばビフイドバタテリゥム 'ラタテンティス標準株 (JCM1220)を例示することができる。
[0024] 方法 Aにおける 5— FCの存在下での継代'馴化培養は、細菌、真菌のそれぞれ生 育や増殖に適した培養培地 (培養液あるいは寒天プレート）上に、例えば、 2-5000 μ g/ml、好ましくは 2〜2000 μ g/mlの範囲内の 5— FCをカ卩え、 37°Cで嫌気培 養すること〖こより行うことができる。
[0025] 5— FCを加えた培養培地で培養することにより、菌の増殖と共に発現した CDの酵 素で 5— FCが徐々〖こ 5— FUへと変換され、始めは低濃度で作用することで、培養菌 の死滅を防ぎ、徐々に濃度が上がることで、耐性能を獲得した培養菌のみを選択的 に培養することができる。このようにして、本発明の 5— FU耐性菌を再現性よく採取 することができる。
[0026] 上記方法 Bにおける 5— FUの存在下での継代.馴化培養としては、細菌、真菌の それぞれ生育や増殖に適した培養培地 (培養液あるいは寒天プレート）上に、例えば 、 1〜： LOO μ g/ml,好ましくは 2〜： LOO μ g/mlの範囲内の 5— FUをカ卩えた 37°Cで 嫌気培養することができる。このようにして、 5— FU耐性菌を再現性よく採取すること ができる。
[0027] CD遺伝子を導入して形質転換した CD発現菌ゃ、嫌気的環境下での生育能を付 与する遺伝子を導入して形質転換した菌を調製するために用いられる CD発現べク ターや形質転換菌の作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル (講談社)、 高木康敬編遺伝子操作実験法 (講談社)、モレキュラー 'クローユング (Molecular Clo ning)コーノレド 'スプリング'ノヽーノ 一'ラボラトリー (Cold Spring Harbor Laboratory) (1 982)、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 2版（Molecular Cloning, 2nd ed. )コールド'スプ リング.ハーバ^ ~ ·ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory) (1989)、メソッズ 'イン .ェンザィモロジ一（Methods in Enzymol. ) , 194 (1991)、実験医学別冊'酵母による 遺伝子実験法 (羊土社、 1994)等に記載された方法に従って行うことができる。また、 発現ベクターは、宿主菌に適したものを用いることが好ま 、。
[0028] CDをコードする DNAは、例えば、大腸菌由来の CDをコードする DNAを含有する プラスミド pAdexlCSCD (理化学研究所ジーンバンク RDB No. 1591)、または同じく 大腸菌由来の CDをコードする DNAを含有するプラスミド pMK116から単離されるもの を用いることができる（D. A. Mead et al.， Protein Engineering 1 : 67— 74 (1986) )。
[0029] 特に、ビフイドバタテリゥム属細菌用の CD発現ベクターとしては、ビフイドバクテリウ ム ·ロンガム hupプロモーターの下流に挿入した大腸菌 codAを保有する組換えプラ スミド pBLES 100— S— eCD (特許文献 1及び非特許文献 21参照）や、この pBLES 100— S— eCDを改良した、ビフイドバタテリゥム ·ロンガムゃビフイドバタテリゥム ·ブ レーべを形質転換しぅる 八¥001—111；ー6じ0、又はこれらのプラスミドの変異体を 特に好適に例示することができる。
[0030] プラスミド pBLESlOO— S— eCDの変異体とは、 pBLESlOO— S— eCDに由来す るプラスミド核酸配列の変異体であって、本発明において pBLESlOO— S— eCDと 同様に用いることのできるプラスミドを意味する。また、プラスミド pAV001—HU—e CDの変異体とは、同様に、 pAV001—HU— eCDに由来するプラスミド核酸配列の 変異体であって、本発明にぉ 、て p AV001— HU— eCDと同様に用いることのでき るプラスミドを意味する。
[0031] 本発明における CD発現 ' 5— FU耐性菌は、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生 育でき、 CDを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の 5— FU 耐性能を有している限り特に制限はされない。 5— FUの抗腫瘍活性の有効濃度は、 対象となる腫瘍や患者等によって左右されるため一概にはいえないが、例えば少なく とも 0. 05〜0.： L gZmlという濃度を例示することができる。 [0032] なお、市販されている 5— FU製剤（注射投与)の説明書には、 5— FU製剤を進行 胃がん患者に 5—FUの血中濃度が約 0. 6 gZmlとなるように持続静注したことが 記載されている。
[0033] 本発明における CD発現 ' 5—FU耐性菌のより具体的な 5—FU耐性能としては、 少なくとも 1〜2000 μ g/ml、好ましくは 2〜2000 μ g/mlの範囲内の 5— FUを含 む培養培地 (培養液あるいは寒天プレート）で、 37°Cで嫌気培養した場合に生育で きることをいう。
[0034] また、本発明における CD発現 ' 5—FU耐性菌の 5—FU耐性能を、 5—FCの濃度 で具体的に表すと、 2〜5000 μ g/ml、好ましくは 3〜5000 μ g/mlの範囲内の 5 —FCを含む培養培地 (培養液あるいは寒天プレート）で、 37°Cで嫌気培養した場合 に生育できることをいう。
[0035] 本発明における CD発現 ' 5— FU耐性菌の 5— FU耐性能は、前述の 5— FUの数 値範囲の範囲内のいずれかの数値の 5— FUを含む培養培地（培養液あるいは寒天 プレート）で、 37°Cで嫌気培養した場合に生育できる力 又は、前述の 5— FCの数 値範囲の範囲内のいずれかの数値の 5— FCを含む培養培地（培養液あるいは寒天 プレート）で、 37°Cで嫌気培養した場合に生育できればよいが、本発明の CD発現' 5— FU耐性菌の耐性能としては、少なくとも 1 gZml以上の 5—フルォロウラシルを 添加した培地で生育できる耐性能、あるいは、少なくとも 2 g/ml以上の 5—フルォ ロシトシンを添加した培地で生育できる耐性能であることが望ましい。
[0036] 本発明における CD発現 · 5— FU耐性菌の製造方法は特に制限されず、自然界か ら単離してもよいし、前述の本発明の耐性菌の作製方法等を用いてもよい。すなわち 、本発明における CD発現 · 5— FU耐性菌は、自然界から単離した菌であってもよい し、前述の本発明の耐性菌の作製方法等を用いた組み換え菌であってもょ 、。
[0037] 本発明における CD発現 ' 5—FU耐性菌としては、嫌気的環境下にある腫瘍組織 内で生育でき、 CDを発現することができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の 5 —FU耐性能を有して 、ると 、うこれらの性質を有して 、るバクテリア又は真菌である 限り特に制限はされないが、該性質を有しているバクテリアであることが好ましぐ該 性質を有している腸内細菌であることがより好ましい。腸内細菌としては、ビフイドパク テリゥム属細菌、クロストリディウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス属 細菌、ぺプトコッカス属細菌、ェンテロコッカス属細菌、バタテロイデス属細菌、ユー ノ クテリゥム属細菌等を好ましく例示することができ、中でもビフイドパクテリゥム属細 菌をより好ましく例示することができる。
[0038] 上記ビフイドバタテリゥム属細菌として、具体的にはビフイドバタテリゥム 'ロンガム、 ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ（Bifidobacterium breve)、ビフイドバタテリゥム 'アドレス センティス（B. adolescentis)、ビフイドバタテリゥム'ラタテンテイス（B. lactentis)、ビフ イドバクテリウム'ビフィダム（B. bifidum)、ビフイドバクテリウム'シユードロンガム（B. ps eudolongum)、ビフイドバタテリゥム 'サーモフィラム（B. thermophirum)、ビフイドバクテ リウム 'インファンテイス（B. infantis)、ビフイドバタテリゥム'アニマリス（B. animalis)な どを挙げることができる。中でも、年齢に関係なくヒトの腸内に常在していることが知ら れているビフイドバタテリゥム 'ロンガム、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、ビフイドバクテ リウム'アドレツセンテイス、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム、ビフイドバタテリゥム 'イン ファンティスを宿主菌として用いることが好ましく、ビフイドバタテリゥム ·ロンガムを用い ることがより好ましい。これらの菌は、いずれも市販されている力、または寄託機関か ら容易に入手することができ、例えば、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム ATCC— 15707 、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム ATCC— 11863、ビフイドバタテリゥム 'インファンテ イス ATCC— 15697を用いることができる。
[0039] ビフイドバタテリゥム ·ロンガムの株にっ ヽては特に制限されな 、が、例えばビフイド バタテリゥム 'ロンガム 105— A株、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム aE— 194b株、ビフィ ドバクテリゥム ·ロンガム bs - 601株、ビフイドバタテリゥム ·ロンガム M101 - 2株を例 示することができ、中でもビフイドバタテリゥム'ロンガム 105— A株を好ましく例示する ことができる。
[0040] また、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべの株についても特に制限されないが、例えばビ フイドバタテリゥム ·ブレーべ標準株 (JCM1192)、ビフイドバタテリゥム ·ブレーべ aS - 1株、ビフイドバタテリゥム ·ブレーべ I— 53— 8W株を例示することができる。
[0041] また、ビフイドバタテリゥム 'インファンテイスの株についても特に制限されないが、例 えばビフイドバタテリゥム 'インファンテイス標準株 (JCM1222)、ビフイドバタテリゥム 'ィ ンファンティス I— 10— 5株を例示することができる。
[0042] また、ビフイドバタテリゥム 'ラタテンテイスの株についても特に制限されないが、例え ばビフイドバタテリゥム 'ラタテンティス標準株 (JCM1220)を例示することができる。
[0043] 該性質を有しているビフイドバタテリゥム属細菌としてより具体的には、プラスミド PB LESIOO -S- eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、 CD発現 · 5 - FU耐性ビ フイドバタテリゥム ·ロンガム 105— A株（プラスミド pBLES 100— S— eCD又はそのプ ラスミド変異体で形質転換されたビフイドバタテリゥム 'ロンガム 105— A株）、プラスミ ド p AVOO 1 -HU- eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、 CD発現 · 5— FU耐 性ビフイドバタテリゥム 'ロンガム 105— A株、プラスミド pAVOOl— HU— eCD又はそ のプラスミド変異体を保持する、 CD発現 · 5— FU耐性ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ 標準株、プラスミド pAVOOl— HU— eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、 CD 発現 · 5 - FU耐性ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ aS— 1株、プラスミド pAVOO 1— H U— eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、 CD発現 · 5— FU耐性ビフイドバクテ リウム ·ブレーべ I— 53— 8W株、プラスミド pAVOOl—HU - eCD又はそのプラスミド 変異体を保持する、 CD発現 · 5— FU耐性ビフイドバタテリゥム'インファンテイス標準 株、プラスミド pAVOOl— HU—eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、 CD発現 • 5—FU耐性ビフイドバタテリゥム 'インファンテイス I - 10— 5株等を好ましく例示する ことができる。
[0044] 本発明の医薬組成物は、本発明の CD発現 · 5— FU耐性菌を含有している限り特 に制限はされない。また、本発明の医薬組成物は、本発明の CD発現 · 5— FU耐性 菌の 1種又は 2種以上を含有して 、てもよ 、。
[0045] また、本発明の医薬組成物の CD発現 · 5— FU耐性菌の投与量は、 5— FC力ら有 効治療量の 5— FUに変換できる量の CDを発現するのに十分な量である限り特に制 限はされな 、が、できる限り少な 、方が好ま 、。
[0046] 本発明の医薬組成物は、本発明の効果を妨げない限り、本発明の CD発現 · 5— F U耐性菌のほかに任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分として、例 えば、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、本発明の 医薬組成物は、本発明の CD発現 · 5— FU耐性菌によって有効量の 5— FUに変換 できる量の 5—FCと組み合わせて使用され、該 5—FCは本発明の医薬組成物に含 有させてもよいが、 5— FCを含有する医薬組成物と組み合わせて用いることが好まし い。さらに本発明の医薬組成物は、本発明の CD発現 ' 5—FU耐性菌の増殖を促進 することができる糖類と組み合わせてもよぐこのような糖類として例えばラクッロース を f列示することができる。
[0047] 本発明における「Xと Yと組み合わせてなる」には、 Xと Yを別の形態としたもの、 と Yを同一の形態 (例えば Xと Yを含有する形態）としたもののいずれの場合も含む。ま た、 Xと Yを別の形態としたものの場合、 X、 Yのいずれも他の成分をさらに含有して いる場合も含まれる。
[0048] 本発明の医薬組成物を患者に投与すると、本発明の CD発現 · 5— FU耐性菌は腫 瘍内で増殖する。該耐性菌が腫瘍内に存在している間に、患者に 5— FCを投与す ると、腫瘍内における CDの働きで 5—FCが 5—FUに変換されて、腫瘍細胞を死滅 させることができる。本発明の CD発現 · 5— FU耐性菌は、腫瘍細胞を死滅させること ができる 5— FU濃度においても生存し、 CDによる酵素作用を持続することができる ので、本発明の CD発現 ' 5— FU耐性菌を有効成分とする優れた抗腫瘍剤を得るこ とができる。また、本発明の CD発現 · 5— FU耐性菌が増殖できる、嫌気的環境下に ある腫瘍以外の部分では、該 CD発現 · 5— FU耐性菌が生育できないため、 5-FC は 5— FUに変換されず、 5— FUをそのまま投与した場合に比べて、 5— FUによる全 身性の副作用を格段に低く抑制することができる。さらに、本発明の固形腫瘍治療剤 の抗腫瘍効果が腫瘍への高 、特異性を有して 、ることから、 5— FUをそのまま投与 する場合に比べて、格段に高い 5— FU濃度を腫瘍内において実現することが可能と なり、その結果、極めて優れた抗腫瘍効果が得られる。
[0049] 本発明の医薬組成物の剤型としては、例えば、本発明の CD発現 · 5—FU耐性菌 を含有する液剤あるいは固形製剤を挙げることができる。液剤は、本発明の CD発現 •5— FU耐性菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩液若しくは 補液または医薬添加物をカ卩えてアンプルまたはバイアル瓶などに充填することにより 製造することができる。また、固形製剤は、液剤に適当な保護剤を添加してアンプル またはバイアル瓶などに充填した後凍結乾燥または L乾燥する力、液剤に適当な保 護剤を添加して凍結乾燥または L乾燥した後これをアンプルまたはバイアル瓶などに 充填することにより製造することができる。本発明の医薬組成物の投与方法としては、 非経口投与が好ましぐ例えば皮下注射、静脈注射、局所注入、脳室内投与等を行 うことができるが、静脈注射が最も好ましい。
[0050] なお、本発明の医薬組成物は、 5— FC組み合わせて用いられる。本発明の医薬組 成物の投与方法と、 5— FCの投与方法は同じであっても異なっていてもよぐまた、 投与も同時であってもよく隔時であってもよいが、 5—FCの投与は、本発明の医薬組 成物の投与後、本発明の CD発現 · 5— FU耐性菌が腫瘍細胞で十分生育できる時 間をお ヽた後に投与する方が好ま 、。
[0051] 本発明の医薬組成物と組み合わせて用いられる 5—FCの投与量は、本発明の CD 発現 · 5— FU耐性菌によって、 5— FCから有効治療量の 5— FUに変換できるのに 十分な量である限り特に制限はされないが、できる限り少ない方が好ましぐ例えば、 5〜200mgZkgの範囲内力も適宜選択することができる。
[0052] また、本発明の医薬組成物は、本発明の CD発現 · 5—FU耐性菌の増殖を促進す る糖類を組み合わせて用いることができ、このような糖類として、例えばラクッロースを 挙げることができる。このような糖類は、本発明の医薬組成物に、含有させて投与して もよぐ別の医薬組成物として、同時にあるいは隔時に投与してもよい。
[0053] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
参考例 1
[0054] [CD発現ビフイドバタテリゥム .ロンガムの作製]
特願 2004— 339677に記載されている方法により、 CD発現ビフイドバタテリゥム '口 ンガムを作製した。
1.シャトルベクター pAVOOlの構築
(プラスミドの構築）
ビフイドバタテリゥム 'ロンガムと大腸菌のシャトルベクター pBLES 100 (特許文献 2 及び非特許文献 23参照）よりェンテロコッカス'フエカリス（Enterococcus faecalis)由 来のスぺクチノマイシンアデ-ルトランスフェラーゼ (AADカセット）を含む配列を PC Rにより増幅し、 pCR— Bluntll— TOPOベクター（Invitrogen)にサブクロー-ングし 、 pCRTOPO— Seal— AAD— Eaml l05Iを作製した。なお、フォワードプライマー に Scal、リバースプライマーに Eaml 1051制限酵素サイトをそれぞれ付カ卩した。
[0055] 図 1に示すように、 Invitrogen社より購入したクロー-ングベクター pGFPuv (DEFINI TION： Cloning vector pGFPuv. ACCESSION： U62636 VERSION： U62636.1 GI : 14 90528) は GFPuv遺伝子とその両端のマルチクロー-ングサイト（Multi-Cloning Site 、 MCS)、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌プラスミド複製起点より構成されている。
[0056] この pGFPuvのアンピシリン而性遺伝子部位を制限酵素 Eaml 1051と Sealを用い て切断し、取り除いた長断片を作製した。同様に制限酵素 Eaml 1051と Sealを用い て、 pCRTOPO -Seal- AAD - Earn 11051を切断した AADカセット含む断片（約 HOObp)を作製した。上記 2つの断片を T4DNA リガーゼを用いて結合した pGFP uv— SpRを作製した。なお、作製したプラスミド pGFPuv— SpRのスぺクチノマイシ ン耐性形質付与を、また同時にアンピシリン耐性形質の欠失をそれぞれ大腸菌にて 確認した。
[0057] pGFPuv— SpRを制限酵素 Sail (GFPuv遺伝子上流のマルチクローユングサイト 内に存在）と Spel (GFPuv遺伝子下流のマルチクローユングサイト内に存在）で消化 し、 GFPuv遺伝子を削除したプラスミド pAVNを作製した。
[0058] ビフイドバタテリゥム 'ロンガム由来プラスミド pTB6の全塩基配列情報より、 RepB,
SDO, DDO, AT— rich repeats, DnaA- binding motifsを含む約 1900bpの配列をビ フイドバタテリゥム 'ロンガムのプラスミド複製ユニットとして同定した。 pTB6よりビフイド バタテリゥム 'ロンガムのプラスミド複製ユニットを含む約 1900bpを PCRにより増幅し 、 pCR—Bluntn—TOPOベクターへサブクローユングした pCRTOPO— Apal— 19 00— Sealを作製した。なお、フォア一ドプライマ一に Apal、リバースプライマーに Sc al制限酵素サイトをそれぞれ付加した。
[0059] pAVNを制限酵素 Apalと Sealで消化した長断片（約 2400bp)と同様に pCRTOP O-Apal 1900— Sealを制限酵素 Apalと Sealで消化した短断片（約 1900bp)を 、 T4DNAリガーゼを用いて結合した、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム—大腸菌シャト ルベクター pAVOOl (約 4300bp)を作製した。 [0060] 2. CD遺伝子発現ベクター pAVOOl— HU— eCD
(発現ベクターの構築）
次に、 pBLES100— S— eCDを制限酵素 Hindlllと Spelで切断し、 HU遺伝子プ 口モーター、大腸菌由来の CD遺伝子と HU遺伝子ターミネータ一含む約 2900bpを 抜き出した。同様にシャトルベクター pAVOOlをマルチクローユングサイト内にある制 限酵素切断部位で Hindlllと Spelで切断した長断片に、上記の約 2900bp断片を T 4DNAリガーゼを用 、て結合した p AVOO 1— HU— eCD (約 71 OObp)を作製した。
[0061] 3.じ0遺伝子発現べクター 八¥001—111；ー6じ0のビフィドバクテリゥム属への導 入
野生型ビフイドバタテリゥム ·ロンガムを MRS培地 37°C嫌気条件下で培養した培養 液から遠心分離により菌体を分離し、適当な緩衝液に懸濁した菌懸濁液を調製した 。次に、非特許文献 23に記されているエレクト口ポレーシヨン法を用いて、シトシン' デァミナーゼ遺伝子発現ベクター pAVOO 1 -HU- eCDを上記の菌懸濁液に導入 した。導入された組換えビフイドバタテリゥム ·ロンガム (ビフイドバタテリゥム ·ロンガム /p AVOO 1 -HU - eCD)は抗生剤スぺクチノマイシン含有寒天培地上でのコ口- 一形成を元に選別した。
[0062] (組換えビフイドバタテリゥム 'ロンガムにおけるシトシン'デァミナーゼの発現）
ビフイドバタテリゥム ·ロンガム/ p AVOO 1 -HU- eCDまたは野生型ビフイドバクテ リウム ·ロンガムをそれぞれ抗生剤スぺクチノマイシン含有 MRS培地 37°C嫌気条件 下で 2日以上継代培養した培養液力も遠心分離により菌体（1 X 109CFU)を分離し 、超音波破砕後、それぞれ菌体内タンパクを抽出した。上記抽出したタンパクを SDS —ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ウェスタン分析法にてシトシン'デァ ミナーゼタンパクの発現を確認した。なお、一次抗体としてゥサギ抗シトシン'デァミナ ーゼモノクローナル抗体（Sawaday Technology)、二次抗体として西洋ヮサビペルォ キシダ一ゼー抗ゥサギィムノグロブリン G複合体（Santa Cruz Biotechnology, Inc)をそ れぞれ用いた。シグナルの感光法として ECL法により発光させたシグナルを、冷却 C CDカメラ Fluo-S-MAX (BIO- RAD)を用いて検出した。その結果、野生型ビフイドバタ テリゥム 'ロンガムにおいてはシグナルが検出されずシトシン 'デアミナーゼが発現し ていなかったが、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム ZpAV001—HU— eCDにおいては シグナルが検出され、シトシン'デァミナーゼタンパクが発現していることを確認した（ 図 2参照)。
[0063] (ビフイドバタテリゥム ·ロンガム/ pAVOO 1 -HU- eCDにおけるシトシン ·デァミナ ーゼ酵素活性； 5— FC→5— FUの変換活性の測定）
ビフイドバタテリゥム ·ロンガム/ p AVOO 1 -HU- eCDまたは野生型ビフイドバクテ リウム ·ロンガムをそれぞれ抗生剤スぺクチノマイシン含有 MRS培地 37°C嫌気条件 下で 2日以上継代培養した培養液力も遠心分離により菌体 (2 X 109CFU)を分離し 、 4. 5mLの MRS培地に再度懸濁した。次に最終濃度 2mgZmLとなるよう 0. 5mL の 5— FC (20mgZmL)を添カ卩し 37°C嫌気条件下で培養した。 0、 4、 8、 18、 24時 間ごとの培養液から、遠心分離により菌体を取り除いた上清をそれぞれ回収し、ガス クロ分析（5— FU GC-MS methods, BML)により変換された 5— FU濃度を測定した 。経時菌数変化を図 3に、 5— FU濃度を図 4にそれぞれ示す。分析の結果、野生型 ビフイドバタテリゥム 'ロンガムにおいては極少量の 5— FUしか検出されなかったが、 ビフイドバタテリゥム 'ロンガム ZpAVOOl— HU— eCDにおいては 4時間後において 39. 2 g Z mL、 24時間後においては 102. 1 n g / mLの 5—FUが検出された 実施例 1
[0064] [ビフイドバタテリゥム ·ロンガム ZpAVOO 1 -HU- eCDの 5 - FUffif性菌]
参考例 1で得られたビフイドバタテリゥム ·ロンガム ZpAVOO 1 -HU- eCDを、 5— FCを 50 μ g/mL含む 5mLの抗生剤スぺクチノマイシン含有 MRS培地に植菌し、 3 7°C嫌気培養で 72時間培養した。次に、培養後の培地を lmL取り出し、同じく 5— F Cを 50 μ g/mL含む 9mLの抗生剤スぺクチノマイシン含有 MRS培地に植菌し、同 様の培養条件で 24時間培養した。この植菌作業を 3回繰り返し行うことにより、 5-F U耐性ビフイドバタテリゥム 'ロンガム/ pAVOOl— HU— eCDを作製した。次に、 5 —FUを 20 μ gZmL含む抗生剤スぺクチノマイシン含有 MRS培地に植菌し、同様 の培養条件で 24時間培養し、作製した 5—FU耐性ビフイドバタテリゥム .ロンガム ,ρ AV001— HU— eCDの 5— FUffif性生育を確認した。その後、菌はグリセロールと 懸濁してグリセロールストックとして 80°Cで保存した。この保存した菌体サンプルと 野生型ビフイドバタテリゥム 'ロンガムとを、 5— FUを 250 μ g/mL含む抗生剤スぺク チノマイシン含有 MRS培地に植菌し生育を比較したところ、野生型は生育しなかつ た力 保存したサンプルは翌日に菌が増殖し、 5— FUに対する耐性を保持していた 。培養後の菌液を平板測定法により生育菌数を測定したところ、野生型は検出限界 以下（103CFU/mL以下）であった力 保存したサンプルの菌液は 2〜3 X 109CF UZmL菌が生育して 、た。
[0065] [5—FU耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガムの 5—FU耐性濃度測定]
実施例 1で得られた 5— FU耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム ZpAVOO 1 -HU- eCDまたは野生型ビフイドバタテリゥム ·ロンガムをそれぞれ MRS培地 37°C嫌気条 件下で 2日以上継代培養した。これらの培養液を嫌気性希釈液で希釈した後、それ ぞれ 5— FU力 ， 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 gZmL含まれる BL寒 天培地上に塗布し、 37°Cで 2〜3日間嫌気培養した後の生育菌数を測定した。 5-F Uが含まれて!/、な!/、BL寒天培地を用いたものは 5連で、それ以外の 5— FU含有 BL 寒天培地を用いたものは 3連で試験を行った。その結果を表 1 (5— FU耐性ビフイド バタテリゥム 'ロンガム ZpAVOO 1— HU— eCD)及び表 2 (野生型ビフイドバクテリウ ム.ロンガム）に示す。表 1の結果力も分力るように、 5— FU耐性ビフイドバクテリウム' ロンガム/ pAVOOl— HU— eCDの 5— FUffif性濃度は 2000 μ g/mL以上であつ た。一方で野生型ビフイドバタテリゥム 'ロンガムは少なくとも 5— FU含量 25 gZmL 以上では生育しなかった (表 2)。
[0066] [表 1]
5— FU耐性ビフィ ドバクテリゥム ' ロンガム ZpAV O 0 1 — HU— e CD
Figure imgf000024_0001
s cl ：標準偏差
CV：変動係数
表 2]
野生型ビフィ ドバクテリゥム■ ロンガム
Figure imgf000024_0002
s d ：標準偏差
C V 変動係数
[5— FU耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガムの 5— FU耐性形質の維持]
実施例 1で得られた 5— FU耐性ビフイドパクテリゥム'ロンガム/ PAVOOI— HU— eCDを、抗生剤スぺクチノマイシン含有 MRS培地を用いて 37°C嫌気条件下で 2曰 以上継代培養した。該培養液5 μ Lを抗生剤スぺクチノマイシン含まない 5mLの MR S培地に植菌して 37。C嫌気条件下で 24時間培養を行い、培養後の菌液を同様にし て継代培養し、連続的に 300間継代培養を行った。連続継代培養 30日後の菌液を 嫌気性希釈液で希釈した後、 5— FUが 250μ g/mL含まれる BL寒天培地と 5— F Uを含まない BL寒天培地上にそれぞれ塗布し、 37°Cで 2〜3嫌気日間培養後の生 育菌数を測定した。実験は 5連で行った。その結果を表 3に示す。表 3の結果力 分 かるように、 5— FU耐性ビフイドバタテリゥム 'ロンガムの 5— FU耐性形質は、少なくと も連続継代培養 30日間行った後も維持されていた。
[表 3]
Figure imgf000025_0001
d ：標準偃差
C V：変動係数
[0070] [5— FU而性ビフイドパクテリゥム ·ロンガムと 5— FU非而性ビフイドバタテリゥム ·ロン ガムの 5— FC添加液体培地での培養]
参考例 1のビフイドパクテリゥム ·ロンガム Zp AVOO 1 -HU- eCD ( 5 - FU非耐'性 ビフイドパクテリゥム'ロンガム）と実施例 1で得られたビフイドバタテリゥム'ロンガム Zp AVOOl -HU-eCD (5— FU耐性ビフイドパクテリゥム ·ロンガム）をそれぞれ抗生 剤スぺクチノマイシン含有 MRS培地 37°C嫌気条件下で 2日以上継代培養した。そ の後、それぞれの培養液 50 Lを 5, 25, 50, 100, 250, 500 gZmLの 5- FCを 含む MRS培地に植菌し 37°C嫌気条件下で 24時間培養し、培養後の菌液の濁度（ OD = 600nm)を測定し、各菌の増殖の有無を調べた（表 4)。 5— FU非耐性ビフィ ドバクテリゥム.ロンガムは 5— FC濃度 50 g/mL以上の濃度の培地では著しく生 育が阻害されたが、 5— FU耐性ビフイドパクテリゥム'ロンガムは全ての濃度で生育し た。
[0071] [表 4] [ 5— F C含量 （M g /m L )
濁度測定 （O D = 6 0 0 n m) 5 25 1 50 100 250 500
5— F U非耐性ビフィ
ドバクテリゥム * ロン
参考例 1 ガム 6.43 4.29 1.92 0.68 0.19 0.09
5— F U耐性ビフィ ド
バクテリゥム · ロンガ
実施例 1 ム 5.73 5.38 4.J I 5.41 5.15 4.29 実施例 2
[0072] [5— FU添加培地を用いて作製したビフイドパクテリゥム 'ロンガム ZpAVOOl— HU — eCDの 5— FUffif性菌]
ビフイドパクテリゥム'ロンガムを、 5— FUを 1, 5, 10, 50, 100， 500 /z gZmL含 む 5mLの MRS培地に植菌し、 37°C嫌気培養で:!〜 5日間培養し、それぞれの濁度 (OD = 600nm)を測定し、生育の有無を調べた（表 5)。その結果、 5— FUを 500 gZmL含む培地では 5日後も全く生育せず、耐性株が作製できな力つた。次に、増 殖が確認された培養後の培地を lmL取り出し、同じ濃度の 5— FUを含む 9mLの M RS培地にそれぞれ植菌し、同様の培養条件で 24時間培養した。この植菌作業を 3 回繰り返し行うことにより、 5— FU耐性ビフイドパクテリゥム 'ロンガムをそれぞれの 5— FU濃度で作製した。次に、 MRS培地にそれぞれの 5— FU耐性ビフイドパクテリゥム 'ロンガムを植菌し、培養後の菌液をそれぞれ 250 μ gZmLの 5— FUを含む MRS 培地に植菌し、 24時間後の増殖の有無を濁度 (OD = 600nm)を用いて測定した（ 表 6)。その結果、 5— FUを 1〜： L 00 μ g/mL含む培地で作製した5— FU耐性ビフ イドバタテリゥム 'ロンガムは、実施例 1で得られた 5— FU耐性株と同様に 5— FUに 耐性であった。
[0073] [表 5] 耐性付与に使用した 5- FU濃度（W g mL)
OD = 600nm 1 5 10 50 1 00 500 1000
1 4.94 0,22 0.09 0.00 -0.05 -0.05 -0.06
2 4.94 4.39 5.51 0.44 0.01 -0.07 -0.08
培養日数 3 4.94 4.39 5.51 4.99 0.12 -0.08 -0.06
4 4.94 4.39 5.51 4.99 5.88 0.07 0.01
5 4.94 4.39 5.51 4.99 5.88 0.08 0.02
[0074] [表 6]
Figure imgf000027_0001
実施例 3
[0075] 実施例 2で得られた 5— FU耐性株を、参考例 1と同様の方法で形質転換し、シトシ ン ·デァミナーゼの発現を確認した。作製されたシトシン ·デァミナーゼ発現する 5— F U耐性株は、実施例 1で得られた 5— FU耐性株と同様に 5— FUに耐性があり、また 、その 5— FU耐性能は少なくとも 7日間以上維持された。
実施例 4
[0076] 実施例 1と同様にして、ビフイドパクテリゥム'ブレーべ、ビフイドパクテリゥム'インファ ンテイス、ビフイドパクテリゥム 'ラタテンテイスの 5— FU耐性株を作製した。以下の表 7 に 5— FU耐性ビフイドパクテリゥムの菌株一覧を記載する。
[0077] [表 7]
実施例 1と同様の方法で耐性を獲得させた菌株一覧
Figure imgf000028_0001
産業上の利用可能性
[0078] 本発明によると、 CDZ5— FCを用いた EnzymeZpro— drug療法に極めて有用 な、 CD活性を保持しかつ 5— FUに耐性を示すビフイドバタテリゥム属細菌等の 5— F U耐性菌を容易に作製することができる。例えば、癌患者に、 CD活性を保持しかつ 5— FUに耐性を示すビフイドパクテリゥム属細菌を投与すると、該ビフイドパクテリゥム 属細菌は腫瘍内で増殖し、腫瘍内に存在している間に、 5— FCを経口投与すると腸 管から吸収され、腫瘍内における CDの働きで 5— FCが 5— FUに変換されて、腫瘍 細胞を死滅させることができる力 腫瘍細胞を死滅させることができる 5— FU濃度に おいても、 5— FU耐性ビフイドバタテリゥム属細菌は生存し、 CDによる酵素作用を持 続することができるので、該ビフイドパクテリゥム属微生物を有効成分とする優れた抗 腫瘍剤を得ることができる。
[0079] また、本発明の CD発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌が増殖している腫瘍以外の 部分では、 5— FCは 5— FUに変換されないため、 5— FUをそのまま投与した場合 に比べて、 5— FUによる副作用を格段に低く抑制することができる。さらに、本発明 の固形腫瘍治療剤の抗腫瘍効果が腫瘍への高 、特異性を有して ヽることから、 5— FUをそのまま投与する場合に比べて、格段に高い 5— FU濃度を腫瘍内において実 現することが可能となり、その結果、極めて優れた抗腫瘍効果が得られる。

Claims

請求の範囲
[1] 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン'デァミナーゼを発現すること ができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の 5—フルォロウラシル耐性能を有す るシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性菌の作製方法であって、嫌 気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン'デァミナーゼ発現菌を、 5—フ ルォロシトシンの存在下で継代 ·馴化培養することを特徴とする耐性菌の作製方法。
[2] 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン'デアミナーゼ発現菌が、嫌気 的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼを発現しない 菌に、シトシン ·デミナーゼ遺伝子を導入して形質転換したシトシン ·デァミナーゼ発 現菌であることを特徴とする請求項 1に記載の耐性菌の作製方法。
[3] 2-5000 μ gZmlの 5—フルォロシトシンを添カ卩した培地で継代 '馴化培養すること を特徴とする請求項 1又は 2に記載の耐性菌の作製方法。
[4] 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育できるシトシン'デアミナーゼ発現菌が、嫌気 的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼを発現するバ クテリアであることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の耐性菌の作製方法
[5] 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼを発現す るバクテリア力 S、シトシン'デァミナーゼを発現する腸内細菌であることを特徴とする請 求項 4に記載の耐性菌の作製方法。
[6] シトシン'デァミナーゼを発現する腸内細菌力 シトシン'デァミナーゼを発現するビフ イドパクテリゥム属細菌であることを特徴とする、請求項 5に記載の耐性菌の作製方法
[7] シトシン'デァミナーゼを発現するビフイドバタテリゥム属細菌力 シトシン'デァミナ一 ゼを発現するビフイドバタテリゥム 'ロンガム、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、又はビフ イドパクテリゥム 'インファンテイスであることを特徴とする請求項 6に記載の耐性菌の 作製方法。
[8] シトシン'デァミナーゼを発現するビフイドバタテリゥム属細菌力 シトシン'デァミナ一 ゼを発現するビフイドバタテリゥム 'ロンガムであることを特徴とする請求項 7に記載の 耐性菌の作製方法。
[9] 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン'デァミナーゼを発現すること ができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の 5—フルォロウラシル耐性能を有す ることを特徴とするシトシン'デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌の作製方 法であって、
(1)嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナ一ゼを発 現しな 、菌を 5 -フルォロウラシルの存在下で継代 ·摩 I化培養して、 5 -フルォロゥラ シル耐性菌を作製する工程と、
(2)該 5—フルォロウラシル耐性菌に、シトシン ·デァミナーゼ遺伝子を導入して形質 転換する工程を有することを特徴とする耐性菌の作製方法。
[10] 1-100 μ gZmlの 5—フルォロウラシルを添カ卩した培地で継代 '馴化培養することを 特徴とする請求項 9に記載の耐性菌の作製方法。
[11] 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼを発現し ていない菌が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デアミ ナーゼを発現していないバクテリアであることを特徴とする請求項 9又は 10に記載の 耐性菌の作製方法。
[12] 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、シトシン'デァミナーゼを発現し て 、な 、バクテリアが、シトシン'デァミナーゼを発現して 、な 、腸内細菌であることを 特徴とする請求項 11に記載の耐性菌の作製方法。
[13] シトシン'デァミナーゼを発現していない腸内細菌力 シトシン'デァミナーゼを発現し て 、な 、ビフイドパクテリゥム属細菌であることを特徴とする請求項 12に記載の耐性 菌の作製方法。
[14] シトシン 'デアミナーゼを発現していないビフイドバタテリゥム属細菌力 シトシン'デァ ミナーゼを発現して!/、な!/、ビフイドバタテリゥム ·ロンガム、ビフイドバタテリゥム ·ブレー ベ、又はビフイドバタテリゥム 'インファンテイスであることを特徴とする請求項 13に記 載の耐性菌の作製方法。
[15] シトシン 'デアミナーゼを発現していないビフイドバタテリゥム属細菌力 シトシン'デァ ミナーゼを発現して 、な 、ビフイドバタテリゥム ·ロンガムであることを特徴とする請求 項 14に記載の耐性菌の作製方法。
[16] 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン'デァミナーゼを発現すること ができ、かつ、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の 5—フルォロウラシル耐性能を有す るシトシン ·デアミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌であって、請求項 1〜 15 のいずれかに記載の作製方法で作製されることを特徴とするシトシン'デァミナーゼ 発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌。
[17] 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、シトシン'デァミナーゼを発現すること ができ、かつ、少なくとも 2 μ g/mlの 5—フルォロシトシン又は 1 μ g/mlの 5—フル ォロウラシルを添加した培地で生育できることを特徴とするシトシン'デァミナーゼ発 現 · 5—フルォロウラシル耐性菌。
[18] シトシン'デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌力 シトシン'デァミナーゼ 発現 · 5 -フルォロウラシル耐性バクテリアであることを特徴とする請求項 16又は 17 に記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性菌。
[19] シトシン 'デアミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性バクテリア力 シトシン'デァミ ナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性腸内細菌であることを特徴とする請求項 18に 記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌。
[20] シトシン'デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性腸内細菌力 シトシン'デァミ ナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム属細菌であることを特徴と する請求項 19に記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌。
[21] シトシン'デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム属細菌力 シトシン ·デアミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム、 ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、又はビフイドバタテリゥム 'インファンテイスであることを 特徴とする請求項 20に記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性 菌。
[22] シトシン'デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム属細菌力 シトシン ·デアミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム である請求項 20に記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌。
[23] シトシン ·デアミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム 力 プラスミド pBLESlOO— S eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シトシン •デアミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム 105— A 株であることを特徴とする請求項 22に記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 フルォ ロウラシル耐性菌。
[24] シトシン ·デアミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム 力 プラスミド pAVOOl— HU— eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シトシン •デアミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ロンガム 105— A 株であることを特徴とする請求項 23に記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 フルォ ロウラシル耐性菌。
[25] シトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ 力 プラスミド pAVOOl— HU— eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シトシン •デァミナーゼ発現 · 5 -フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ブレーべ標準株 であることを特徴とする請求項 21に記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 フルォロ ゥラシル耐性菌。
[26] シトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ 力 プラスミド pAVOOl— HU— eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シトシン •デアミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ブレーべ aS— 1 株であることを特徴とする請求項 21に記載のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5 フルォ ロウラシル耐性菌。
[27] シトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ 力 プラスミド pAVOOl— HU— eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シトシン •デアミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム ·ブレーべ I 53— 8W株であることを特徴とする請求項 21に記載のシトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フ ルォロウラシル耐性菌。
[28] シトシン 'デアミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム 'インファン テイスが、プラスミド pAVOOl— HU—eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シ トシン 'デアミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム 'インファンテ イス標準株であることを特徴とする請求項 21に記載のシトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル而す性菌。
[29] シトシン 'デアミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム 'インファン テイスが、プラスミド pAVOOl— HU— eCD又はそのプラスミド変異体を保持する、シ トシン 'デアミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性ビフイドバタテリゥム 'インファンテ イス I— 10— 5株であることを特徴とする請求項 21に記載のシトシン ·デァミナーゼ発 現 · 5—フルォロウラシル耐性菌。
[30] 請求項 16〜29のいずれかに記載のシトシン'デァミナーゼ発現 · 5 フルォロウラシ ル耐性菌を含有することを特徴とする医薬組成物。
[31] 5 フルォロシトシンと組み合わせてなることを特徴とする請求項 30に記載の医薬組 成物。
[32] さらに、ラクッロースと組み合わせてなることを特徴とする請求項 30又は 31に記載の 医薬組成物。
[33] 5—フルォロシトシンから有効治療量の 5—フルォロウラシルに変換できる量のシトシ ン ·デァミナーゼを発現するのに十分な量のシトシン ·デァミナーゼ発現 · 5—フルォ ロウラシル耐性菌と、有効治療量の 5—フルォロウラシルに変換できる量の 5—フル ォロシトシンとを組み合わせてなる固形腫瘍治療剤であって、シトシン ·デァミナーゼ 発現 · 5 フルォロウラシル耐性菌が請求項 16〜29のいずれかに記載のシトシン' デァミナーゼ発現 · 5—フルォロウラシル耐性菌であることを特徴とする固形腫瘍治療 剤。
[34] さらに、ラクッロースを組み合わせてなることを特徴とする請求項 33に記載の固形腫 瘍治療剤。
PCT/JP2006/307102 2005-04-08 2006-04-04 ５－フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法 WO2006109619A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007512917A JP4945440B2 (ja) 2005-04-08 2006-04-04 ５−フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法
ES06731050.8T ES2438565T3 (es) 2005-04-08 2006-04-04 Bacterias resistentes a 5-fluorouracilo y método para su producción
EP06731050.8A EP1867714B1 (en) 2005-04-08 2006-04-04 5-fluorouracil-resistant bacteria and method for production thereof
KR1020077025746A KR101302088B1 (ko) 2005-04-08 2006-04-04 5-플루오로우라실 내성균 및 그 제조방법
CN200680011344.6A CN101155911B (zh) 2005-04-08 2006-04-04 5-氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法
CA2603453A CA2603453C (en) 2005-04-08 2006-04-04 5-fluorouracil-resistant bacteria and method for production thereof
DK06731050.8T DK1867714T3 (da) 2005-04-08 2006-04-04 5-fluoruracilresistente bakterier og fremgangsmåde til produktion deraf
US11/910,880 US8734779B2 (en) 2005-04-08 2006-04-04 5-fluorouracil-resistant bacteria and method for production thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005112557 2005-04-08
JP2005-112557 2005-04-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006109619A1 true WO2006109619A1 (ja) 2006-10-19

Family

ID=37086897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/307102 WO2006109619A1 (ja) 2005-04-08 2006-04-04 ５－フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8734779B2 (ja)
EP (1) EP1867714B1 (ja)
JP (1) JP4945440B2 (ja)
KR (1) KR101302088B1 (ja)
CN (1) CN101155911B (ja)
CA (1) CA2603453C (ja)
DK (1) DK1867714T3 (ja)
ES (1) ES2438565T3 (ja)
PT (1) PT1867714E (ja)
WO (1) WO2006109619A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007136107A1 (ja) 2006-05-24 2007-11-29 Anaeropharma Science Inc. 遺伝子輸送担体作製方法
WO2010119936A1 (ja) * 2009-04-17 2010-10-21 株式会社アネロファーマ・サイエンス 偏性嫌気性に変異化された乳酸菌およびその作製方法ならびに偏性嫌気性乳酸菌で機能する発現ベクター
KR20170002403A (ko) 2014-05-01 2017-01-06 가부시키가이샤 아네로파마·사이엔스 이종 폴리펩티드 발현 카세트

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102046791B (zh) 2008-04-17 2013-09-18 阿内罗药物科学株式会社 表达载体
CZ309218B6 (cs) * 2014-08-26 2022-06-01 Univerzita Palackého v Olomouci Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
WO2024187069A1 (en) * 2023-03-08 2024-09-12 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Engineering enterobacteria to site-specifically activate the anticancer prodrug 5-fluorocytosine for treating colon cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002097144A (ja) 2000-09-21 2002-04-02 Jun Amano 嫌気性菌を用いた遺伝子治療用医薬
JP2004519236A (ja) 2001-02-24 2004-07-02 ビフィド、カンパニー、リミテッド ビフィドバクテリウム由来の新規なプラスミド、これを利用した組換え発現ベクターおよび形質転換方法
JP2004339677A (ja) 2003-04-25 2004-12-02 Chisso Corp 難燃性繊維及びそれを用いた繊維成形体

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6110737A (en) * 1988-02-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Human platelet-derived growth factor receptor, type A
US6190657B1 (en) * 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
US6080849A (en) * 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
AU749695B2 (en) * 1997-09-10 2002-07-04 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
WO2001014579A2 (en) * 1999-08-26 2001-03-01 Vion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for delivery of an agent using attenuated salmonella containing phage
US6962696B1 (en) * 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
CA2342040C (en) * 2000-09-21 2012-07-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anaerobic bacterium as a drug for cancer gene therapy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002097144A (ja) 2000-09-21 2002-04-02 Jun Amano 嫌気性菌を用いた遺伝子治療用医薬
JP2004519236A (ja) 2001-02-24 2004-07-02 ビフィド、カンパニー、リミテッド ビフィドバクテリウム由来の新規なプラスミド、これを利用した組換え発現ベクターおよび形質転換方法
JP2004339677A (ja) 2003-04-25 2004-12-02 Chisso Corp 難燃性繊維及びそれを用いた繊維成形体

Non-Patent Citations (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Idenshi Manyuaru", KODANSHA
"Idenshi Sosa Jikkenhou", KODANSHA
"Jikken Igaku bessatsu, Kobo niyoru Idenshi Jikkenhou", 1994, YODOSHA
"Mitsuoka", 1992, ELSEVIER APPLIED SCIENCE, pages: 69 - 114
"Molecular Cloning", 1982, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
"Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
ANDERSON ET AL., ARCH. MICROBIOL., vol. 152, 1989, pages 115
AUSTIN ET AL., PHARMACOL., vol. 43, 1992, pages 380
CLIN. MICROBIOL. REV., vol. 11, 1998, pages 382 - 402
D.A.MEAD ET AL., PROTEIN ENGINEERING, vol. 1, 1986, pages 67 - 74
DAVIS ET AL., PROC. AACR ABSTRACT NO.2355, 1996, pages 345
DUFFY ET AL., PEDIATR. RES., vol. 35, 1994, pages 690 - 695
FUJIMORI ET AL., CURR. OPIN. DRUG DISCOV. DEVEL., vol. 5, 2002, pages 200 - 203
HIRSCHOWITZ ET AL., HUMAN GENE THER., vol. 6, 1995, pages 1055
HUBER ET AL., CANCER RES., vol. 53, 1993, pages 4619
HUBER ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 91, 1994, pages 8302
IBRAHIM ET AL., J. FOOD PROT., vol. 56, 1993, pages 713 - 715
MATSUMURA ET AL., BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 61, 1997, pages 1211 - 1212
METHODS IN ENZYMOLOGY, 1991, pages 194
MULLEN ET AL., CANCER RES., vol. 54, 1994, pages 1503
MULLEN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 89, 1992, pages 33
NAGLE D.P. ET AL.: "5-Fluorouracil-resistant strain of Methanobacterium thermoautotrophicum", J. BACTERIOL., vol. 169, no. 9, 1987, pages 4119 - 4123, XP003002948 *
NAKAMURA ET AL., BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 66, 2002, pages 2362 - 2366
NISHIYAMA ET AL., CANCER RES., vol. 45, 1985, pages 1753
O'DONOVAN ET AL., BACT.REV., vol. 34, 1970, pages 278
REDDY ET AL., CANCER RES., vol. 53, 1993, pages 3914 - 3918
SAAVERDRA ET AL., LANCET., vol. 344, 1994, pages 1046 - 1049
SCARDOVI ET AL., BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 2, 1986, pages 1418 - 1434
See also references of EP1867714A4 *
TANAKA ET AL., BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM., vol. 69, no. 2, February 2005 (2005-02-01), pages 422 - 425
YASUI ET AL., J. DAIRY SCI., vol. 74, 1991, pages 1187 - 1195
YAZAWA ET AL., BREAST CANCER RES. TREAT., vol. 66, 2001, pages 165 - 170
YAZAWA ET AL., CANCER GENE THER., vol. 7, 2000, pages 269 - 274

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007136107A1 (ja) 2006-05-24 2007-11-29 Anaeropharma Science Inc. 遺伝子輸送担体作製方法
EP2468861A1 (en) 2006-05-24 2012-06-27 Anaeropharma Science Inc. Method of constructing gene transport support
US8911721B2 (en) 2006-05-24 2014-12-16 Anaeropharma Science, Inc. Method of constructing gene transport support
WO2010119936A1 (ja) * 2009-04-17 2010-10-21 株式会社アネロファーマ・サイエンス 偏性嫌気性に変異化された乳酸菌およびその作製方法ならびに偏性嫌気性乳酸菌で機能する発現ベクター
US8338162B2 (en) 2009-04-17 2012-12-25 Anaeropharma Science, Inc. Obligately anaerobic mutant lactic acid bacterium and preparation method therefor, and expression vector functioning in obligately anaerobic lactic acid bacterium
KR20170002403A (ko) 2014-05-01 2017-01-06 가부시키가이샤 아네로파마·사이엔스 이종 폴리펩티드 발현 카세트
US10443061B2 (en) 2014-05-01 2019-10-15 Anaeropharma Science, Inc. Heterologous polypeptide expression cassette

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080006583A (ko) 2008-01-16
US8734779B2 (en) 2014-05-27
US20090280091A1 (en) 2009-11-12
PT1867714E (pt) 2013-12-05
JP4945440B2 (ja) 2012-06-06
KR101302088B1 (ko) 2013-08-30
CA2603453C (en) 2015-01-27
EP1867714A4 (en) 2008-12-31
CA2603453A1 (en) 2006-10-19
ES2438565T3 (es) 2014-01-17
DK1867714T3 (da) 2013-12-09
CN101155911A (zh) 2008-04-02
JPWO2006109619A1 (ja) 2008-11-06
EP1867714A1 (en) 2007-12-19
EP1867714B1 (en) 2013-09-18
CN101155911B (zh) 2015-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4945440B2 (ja) ５−フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法
Bron et al. Genetic characterization of the bile salt response in Lactobacillus plantarum and analysis of responsive promoters in vitro and in situ in the gastrointestinal tract
Lee et al. Genomic insights into bifidobacteria
US20220282262A1 (en) Synthesis of the fucosylated oligosaccharide lnfp-v
Yan et al. Bifidobacterium longum subsp. longum YS108R fermented milk alleviates DSS induced colitis via anti-inflammation, mucosal barrier maintenance and gut microbiota modulation
US10793825B2 (en) Modified gram positive bacteria and uses thereof
Song et al. Relationship between putative eps genes and production of exopolysaccharide in Lactobacillus casei LC2W
JP6606124B2 (ja) 炎症応答を減少させるための、リポテイコ酸が減少した組み換えラクトバチルス
WO2009150856A1 (ja) 酸素耐性付与遺伝子及びその利用
KR20020069324A (ko) 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법
WO2022006748A1 (en) Genetically engineered live bacteria and methods of constructing the same
US20230372453A1 (en) Engineered probiotics for expression of fiber-synthesizing enzymes in gut
TWI550085B (zh) 屍毒梭菌菌株及其應用
CN117355613A (zh) 产生以lnfp-i和2’-fl作为主要化合物的hmo共混物分布的方法
CN117487726A (zh) 一株具备内源性透明质酸涂层的基因工程菌及其构建方法与应用
Duong Functional Genomic Analysis and Protein Expression in Lactobacillus

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680011344.6

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007512917

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2603453

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006731050

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020077025746

Country of ref document: KR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11910880

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006731050

Country of ref document: EP