WO2006106976A1 - 細胞膜表面抗原に対する抗体のアッセイ法 - Google Patents

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Susumu Uchiyama
Kiichi Fukui
Sadahiko Suzuki
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Tottori University NUC
University of Osaka NUC
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Biomedics Inc
Osaka University NUC
Tottori University NUC
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    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a method for assaying or screening an antibody that binds to a cell membrane surface antigen.
  • cell membrane antigen molecules expressed on cell membranes such as receptors and adhesion molecules may not always be easy to prepare an antigen having a natural three-dimensional structure depending on its properties and expression pattern.
  • cell membrane antigen molecules often form complexes rather than monomers.
  • some cell membrane antigens are not soluble in the transmembrane portion but are insoluble or difficult to dissolve even in the extracellular domain.
  • Ordinary ELISA is often suitable as an antibody assay or screening method for these antigens. This is because, if it is difficult to prepare the three-dimensional structure of the extracellular domain as an immunizing antigen in a natural state, the three-dimensional structure may be further changed by attaching it to the plate with force.
  • the assembly is generally performed by Scatchard Analysis using a secondary antibody labeled with an isotope, but the number of specimens that can be tested at one time is small and the preparation 'test takes time. For this reason, it is not suitable for screening a large number of antibody clones, and it is desirable to establish a simpler method that can perform a large number of tests. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to measure the affinity of an antibody that binds to a membrane surface antigen of floating cells, and to use the measurement method to detect an antibody that binds to a membrane surface antigen. Or to provide a method of screening.
  • FIG. 1 Shows the measurement results (halftone image photograph) using an image analyzer.
  • the affinity measurement method of the present invention comprises (a) binding an antibody to be measured to a membrane surface antigen of human hematopoietic suspension cells, and (b) measuring the antibody to be bound to the membrane surface antigen and free measurement. Separating the antibody, and (c) binding the labeled antibody to the antibody to be measured bound to the membrane surface antigen at a site different from the antigen recognition site of the antibody to be measured. (D) separating the substance bound to the antibody to be measured bound to the membrane surface antigen from the free substance, and (e) detecting the label of the substance, and the antibody to be measured and the membrane surface antigen. In which the separation of (b) and (d) is performed by centrifugation or a filter that does not pass through cells, respectively.
  • the affinity measurement method of the present invention is for a membrane surface antigen of hematopoietic suspension cells, and is labeled as a substance that binds to the antibody to be measured at a site different from the antigen recognition site of the antibody to be measured.
  • Material, and separation of bound and free material (B / F separation) by centrifugation Except for separation or using a filter that does not allow cells to pass, it may be the same as the usual method for measuring the affinity between antigen and antibody, but in this measurement system, the number of floating cells is 5 X per tube. It is preferable that the number is about 10 5 . Further, it is possible to measure using a secondary antibody without directly labeling the antibody with a radioisotope.
  • the substance that binds to the antibody to be measured at a site different from the antigen recognition site of the antibody to be measured includes an antibody to the antibody to be measured (for example, an antibody to the Fc site), protein A, and protein G. It is done.
  • the label include fluorescent substances and magnetic beads.
  • the separation method is preferably the same.
  • the cells to be used are not particularly limited as long as they are floating cells that present the target antigen on the cell membrane surface, but should be normal animal cells, lined animal cell lines, or genetically engineered animal cell lines. Is preferred.
  • Specific examples of the procedure include the following. (1) After reacting floating cells with mouse monoclonal antibody (primary antibody), (2) removing the free (free) primary antibody by washing and centrifuging, and (3) reacting with fluorescently labeled anti-mouse secondary antibody (4) The free secondary antibody is removed by washing and centrifuging, and then (5) the fluorescence of the secondary antibody bound to the cell via the primary antibody is measured with a fluorescence image analyzer. (6) Prepare a calibration curve by measuring the concentration and the amount of fluorescence for the fluorescently labeled secondary antibody used, and calculate the amount of secondary antibody bound by converting the measured value to the concentration. The amount of free antibody is calculated by subtracting.
  • a more specific example of the procedure includes a method including the steps described below. 1) Select cells or cell lines with high antigen expression on the cell membrane, and obtain a sufficient number of cells
  • the affinity measurement method of the present invention it is possible to screen monoclonal antibodies that bind to a membrane surface antigen.
  • the assay and screening methods use the usual affinity measurement method to access monoclonal antibodies that bind to cell membrane surface antigens. And a method for screening a monoclonal antibody that binds to a cell membrane surface antigen.
  • the number of cells was measured using a Burker-Turk hemocytometer (manufactured by Kuruma Sales Co., Ltd. Cat. No. 03-303-1).
  • test antibody or Rituxan (positive control) 15 30, 50, 75, 100, 125, 150, 200 ng (1.5 to 51), 1.5 ml tubes (BM equipment, BM ring lock) Dispensing into the tube Cat.No.BM-15), 4 tubes without antibody were also prepared. Three samples were prepared for each test antibody. The suspension was added with 1% BSA (Wako Cat No. 013-07492 Lot PKH3483) -PBS solution at 100 1 (5xl0 5 cells) at a time, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour.
  • BSA Wi-A-PBS solution
  • FITC-labeled anti-mouse IgG (H & L) secondary antibody [GOAT Anti-mouse IgG ( H & L) Fluorescein conjugated, affinity purified Secondary antibody ⁇ Chemicon, Cat. No. AP124F, Lot 24021014] Add 100 l (500 ng / 100 ⁇ 1) of 1% BSA-PBS solution to the above cells and resuspend them in a dark, room temperature environment. And shake for 1 hour.
  • the cells thus obtained were suspended in 100 ⁇ l PBS and transferred to 96-well flat bottom plates (Sumitomo Bakelite E LISA PLATE Cat. No. 8496F).
  • the fluorescence amount of the secondary antibody was measured under the detection conditions of Fluorescense mode, 600v, 5263 ⁇ 4P / green (532nm), Focus bottom surface + 3mm using Typhoon9210 image Nafisa ( ⁇ Amersnam Bioscience).
  • PBS solution 1001 supplemented with 0, 12.5, 25, 50, 75, 100, 125, 150 ng of FITC-labeled secondary antibody was used as a control for preparing a calibration curve.
  • a calibration curve is created by measuring the amount of fluorescence at each concentration of FITC-labeled secondary antibody used as a control, and the amount (molar number or weight) of secondary antibody bound to the cell is determined. It was. Assuming that each primary antibody and FITC-labeled secondary antibody reacted at a ratio of 1: 2, the amount of primary antibody bound was calculated. The amount of free primary antibody was also determined by subtracting the amount of binding from the amount of added antibody. When the antibody concentration was converted to molar concentration, the molecular weight of the monoclonal antibody was set to 150,000.
  • the total amount [L total] of the ligand used is the sum of the free form and that bound to the receptor.
  • the total amount [R total] of the receptor is the sum of those not bound to the ligand and those bound to the ligand.
  • the number of receptors [R total] (maximum binding amount of test antibody) and the affinity between the receptor and the ligand are estimated by Scatchard analysis. If the above formulas ⁇ , ⁇ , ⁇ are transformed and substituted,
  • [LR] is represented by B (bound)
  • [L] is represented by! 7 (free)
  • [R total] is represented by B max (constant).
  • This equation is a linear function with B / F on the y axis and B on the x axis.
  • the straight line tilt force also has a Kd value.
  • Kd values have a dimension of concentration, with lower values having higher affinity
  • Fig. 2 shows the image of the image of the affinity measurement using the commercially available anti-CD20 monoclonal antibody Rituxan, test antibody A and test antibody B, which are positive controls, and Fig. 3 shows the saturation curve.
  • Figure 4 shows the results of the Scatchard analysis. From the above Scatchyard analysis
  • Kd value The dissociation constant (Kd value) was determined from the slope of the obtained linear function. Repeat the same experiment The obtained Kd values (average) were as follows.
  • the affinity of an antibody for a cell membrane surface antigen can be measured with high sensitivity, and the antibody can be assayed or screened using this.
  • the measurement method of the present invention is suitable for measuring the affinity of a monoclonal antibody that binds to the membrane surface antigen of hematopoietic cells, and can be tested in a simpler manner and in a shorter time than a method using radioisotope labeling.

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Abstract

膜表面抗原に対して結合する抗体の親和性を測定する方法、および、その測定方法を利用して、該抗原に対して結合する抗体をアッセイまたはスクリーニングする方法を提供する。抗原と抗体との親和性の測定において、抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞を用いるとともに、B/F分離を遠心分離又は細胞を通さないフィルターにより行う。

Description

明 細 書
細胞膜表面抗原に対する抗体のアツセィ法
技術分野
[0001] 本発明は、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体をアツセィまたはスクリーニング する方法に関する。
背景技術
[0002] 受容体や接着分子などの細胞膜上に発現する分子には、その性状や発現様式に より自然な立体構造を保持した抗原を調製することが必ずしも容易ではな ヽものがあ る。例えば、細胞膜抗原分子は、単量体ではなく複合体を形成することが多い。また 、細胞膜抗原には不溶性の膜貫通部分ばカゝりでなく細胞外ドメインにつ ヽても不溶 性または可溶ィ匕し難いものがある。通常の ELISAは、こうした抗原に対する抗体のァ ッセィ又はスクリーニング法として適して 、な 、ことが多 、。これは免疫抗原として細 胞外ドメインの立体構造を自然な状態で調製することが難しいば力りでなぐプレート に付着させることによりさらに立体構造の変化が起こる可能性があるためである。
[0003] 例えば、白血球抗原に対するも抗体の場合一般にはアイソトープ標識をした二次 抗体を用いた Scatchard Analysisでそのアツセィを行うが、一度に試験できる検体数 が少なく又準備'試験に時間がかかる。このため、多数の抗体クローンのスクリーニン グには不向きであり、より簡便で、多数の試験が行える方法の確立が望まれる。 発明の開示
[0004] 本発明の課題は、浮遊細胞の膜表面抗原に対して結合する抗体の親和性を測定 する方法、および、その測定方法を利用して、膜表面抗原に対して結合する抗体を アツセィまたはスクリーニングする方法を提供することである。
[0005] (1) (a)ヒト造血系浮遊細胞の膜表面抗原に被測定抗体を結合させ、（b)該膜表面 抗原に結合した被測定抗体と遊離の被測定抗体を分離し、（c)該膜表面抗原に結 合した被測定抗体に、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に 結合する物質であって標識された物質を結合させ、 (d)該膜表面抗原に結合した被 測定抗体に結合した該物質と、遊離の該物質を分離し、（e)該物質の標識を検出す ることを含む、被測定抗体と膜表面抗原との結合親和性を測定する方法であって、 ( b)及び (d)の分離を、それぞれ、遠心分離又は細胞を通さないフィルタ一により行う ことを特徴とする前記方法。
(2) (b)及び (d)の分離を、遠心分離により行う (1)に記載の方法。
(3) (b)及び (d)の分離を、細胞を通さないフィルタ一により行う（1)に記載の方法。
(4)細胞が正常動物細胞、ラインィ匕した動物細胞株または遺伝子操作された動物細 胞株である（1)〜（3)のいずれか 1項に記載の方法。
(5) (1)〜 (4)のいずれか 1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対して結 合するモノクローナル抗体をアツセィする方法。
(6) (1)〜 (4)のいずれか 1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対して結 合するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法。
図面の簡単な説明
[0006] [図 1]イメージアナライザーによる測定結果（中間調画像の写真)を示す。
[図 2]飽和曲線を示す。（X軸：添加抗体量 (ng)、 Y軸：蛍光強度）
[図 3]スキャッチヤード解析結果を示す。（X軸:結合量 nM、 Y軸:結合量 I遊離量） 発明を実施するための最良の形態
[0007] < 1 >本発明の親和性測定法
(1)本発明の親和性測定法は、（a)ヒト造血系浮遊細胞の膜表面抗原に被測定抗体 を結合させ、 (b)該膜表面抗原に結合した被測定抗体と遊離の被測定抗体を分離し 、（c)該膜表面抗原に結合した被測定抗体に、被測定抗体の抗原認識部位とは異 なる部位で被測定抗体に結合する物質であって標識された物質を結合させ、（d)該 膜表面抗原に結合した被測定抗体に結合した該物質と、遊離の該物質を分離し、 (e )該物質の標識を検出することを含む、被測定抗体と膜表面抗原との結合親和性を 測定する方法であって、（b)及び (d)の分離を、それぞれ、遠心分離又は細胞を通さ ないフィルタ一により行うことを特徴とする。
[0008] 本発明の親和性測定法は、造血系浮遊細胞の膜表面抗原に対するものであること 、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物質であつ て標識された物質を用いること、結合したものと遊離のものの分離 (B/F分離)を遠心 分離又は細胞を通さないフィルタ一により行うことの他は、抗原と抗体との親和性を測 定する通常の方法と同様でよいが、本測定系において浮遊細胞数は 1チューブ当た り 5 X 105個前後にすることが好ましい。また、抗体を直接ラジオアイソトープ標識せず に、二次抗体を用いて測定することが可能である。
[0009] たとえば、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物 質としては、被測定抗体に対する抗体 (たとえば、 Fc部位に対する抗体)、プロテイン Aやプロテイン Gなどが挙げられる。標識としては、蛍光物質、磁気ビーズなどが挙げ られる。
[0010] 本発明の親和性測定法においては、分離方法が同じであることが好ましい。
[0011] 用いる細胞は、標的とする抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞である限り、特 に限定されないが、正常動物細胞、ライン化した動物細胞株または遺伝子操作され た動物細胞株であることが好まし 、。
[0012] 具体的な手順の例としては、次のものが挙げられる。（1)浮遊細胞とマウスモノクロ ーナル抗体 (一次抗体)を反応後、 (2)遊離 (フリー)の一次抗体を洗浄および遠心 により除去し、（3)蛍光標識された抗マウス二次抗体を反応させ、（4)洗浄および遠 心により遊離の二次抗体を除去し、その後（5)細胞に一次抗体を介して結合した二 次抗体の蛍光量を蛍光イメージアナライザーで測定する。さらに (6)用いた蛍光標識 二次抗体について濃度と蛍光量を測定することで検量線を作成し、測定値を濃度に 換算することで結合した二次抗体量を求め、添加抗体量力 結合量を引くことで遊離 の抗体量を算出する。
[0013] より具体的な手順の例としては、以下に記載するステップよりなる方法が挙げられる 。 1)細胞膜上の抗原発現量が多い細胞または細胞株を選択し、充分な細胞数が得 られる
まで培養する。
2)遠心により該細胞を回収し洗浄する。
3)被検モノクローナル抗体又は陽性コントロール抗体を含む溶液中に細胞を懸濁す る。 4)一定時間振とう反応させた後、遠心して細胞を回収し、すばやく洗浄する。
5)回収した細胞を蛍光標識二次抗体を含む溶液中に懸濁する。 6)—定時間振とう反応させた後、遠心して細胞を回収し、洗浄する。
7)細胞を再度懸濁して 96ゥエルプレートのゥエルに移し、蛍光強度をイメージアナラ ィザ一で検出する。
8)検出後、結合した抗体量とフリーの抗体量を画像力 数値ィ匕し、スキャッチャ—ド' プロットから解離定数 (Kd値)を求める。
[0014] 本方法においては、細胞をホルムアルデヒドなどの架橋剤で固定せずに用いるた め、細胞表面上の立体構造を維持したままの標的とする細胞膜表面抗原とモノクロ ーナル抗体との結合親和性を測定することが可能である。
[0015] 本発明の親和性測定法を利用して、膜表面抗原に対して結合するモノクローナル 抗体のアツセィゃスクリーニングが可能である。アツセィ及びスクリーニングの方法は 、親和性測定法として本発明の親和性測定法を利用する他は、通常の、親和性測定 方法を利用して、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をアツセィす る方法、及び、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をスクリーニン グする方法と同様でよい。
[0016] 本発明の効果が得られる理由は、以下の説明によって拘束されるものではないが、 以下のように考えられる。
[0017] 親和性測定において、浮遊細胞を用いることにより感度が上昇する理由としては、 固定化すると固相表面の面積により細胞量が限定される一方、浮遊細胞では細胞数 を多くすることができるためと考えられる。また浮遊状態での細胞には表面全体の抗 原に抗体が結合可能であるのに対し、固定ィ匕すると抗体が結合可能な細胞表面積 が減少することも理由の一つである。力 tlえて、細胞を架橋して固相化する場合には、 固相化に伴いェピトープが消滅したり、その立体構造が変化したりする可能性があり 、ナチュラルな状態の抗原に対する親和性が測定できな力つたり、親和性が低く評価 される恐れがある力 本発明の親和性測定法においてはこのような恐れがない。 実施例 1
[0018] CD20分子に対するモノクローナル抗体の結合親和性の定量的測定を実施例を参 照して説明する。
[0019] 目的とする抗原を細胞表面で発現して!/ヽるヒト B細胞株 Raji及び、 CD20抗原を発現 していない細胞として Jurkat細胞株を用いた。共に RPMI1640 (ナカライ、 Cat.No.3026 4-85、 Lot L4K2844)に 10%ゥシ胎仔血清 FCS(BIOLOGICAL IND. Cat.No.04- 001- 1 A、 Lot 815242、補体成分を非働化するためあら力じめ 56度 30分加温したもの）を添 加した培地で 37度 CO濃度 5%の COインキュベーター (SANYO MCO-175M)で培養
2 2
、週 2回の継代により維持した。
[0020] 細胞数の測定は、 Burker-Turk血球計算盤 (ヱルマ販売 (株) Cat.No.03-303-1)を用 いて行った。
[0021] 継代後 3〜4日目のコンフルェントな細胞の培養液を多本架冷却遠心機 LX-120 (T OMY)で室温、 3000r.p.m.で 3分間遠心し、上清を除き、細胞を回収した。ここで用い た回転数と時間は遠心分離と上清除去を繰り返し行っても細胞数が変化しない条件 である。細胞の表面に残った培地及び FCSを除くため（洗浄）、回収した細胞を Dulbe cco s Pnospnate Buffered Saline (-) without Ca and Mg [PBS (-)、 (NaCl:Wako、 Cat. No.191—01665、 Na HPO： Wako、 Cat.No.197—02865、 Lot ASF2635、 KCl:Wako、 Ca
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t.No.163— 0334T、 Lot CEQ7122、 KH PO： Wako、 Cat.No.169—0425、 Lot ELG7616
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)〕で懸濁後、 3000 r.p.m.で 3分間遠心して上清を除く操作を 2回行った。洗浄を終え た細胞を 1%BSA (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483 )- PBS溶液で懸濁し、細胞 密度を 5xl06個/ mlに調整した。
[0022] 一次抗体として、試験抗体又はリツキサン（陽性コントロール） 15, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 200 ng (1.5〜5 1)を各々、 1.5mlチューブ（ビーェム機器、 BMリングロック チューブ Cat.No.BM-15)に分注し、同時に抗体を入れないチューブも 4本用意した 。また、各々の試験抗体あたり 3点のサンプルを準備した。そこに、 1%BSA (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483 )- PBS溶液で懸濁液を 100 1 (細胞数 5xl05個）ずつ加 えて混和し、室温で 1時間振とう反応させた。
[0023] 反応後、微量高速冷却遠心機 MX-100 (TOMY)で室温、 3000 r.p.m.3分間遠心分 離し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の一次抗体を除くため 200 1の PB Sで懸濁し、 3000 r.p.m.で 3分間遠心し上清を除く操作を 2回行った。
[0024] 次に細胞に結合した一次抗体を検出するため、細胞と結合した一次抗体に対して 過剰量（500ng)の FITC標識抗マウス IgG (H&L)二次抗体〔GOAT Anti-mouse IgG( H&L) Fluorescein conjugated, affinity purified Secondary antibody ^ Chemicon、 Cat. No.AP124F、 Lot 24021014] 1% BSA- PBS溶液 100 l (500ng/100 μ 1)を上記細胞に 添加'懸濁し、遮光、室温のもと 1時間振とう反応した。反応後、 3000 r.p.m.で 3分間 遠心し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の FITC標識抗マウス IgG (H&L) 抗体を除くため、 200 1の PBSで懸濁し 3000 r.p.m.で 3分間遠心し上清を除く操作を 2回行った。
[0025] こうして得た細胞を 100 μ 1 PBSで懸濁し、 96ゥエル平底プレート（住友ベークライト E LISA PLATE Cat.No.8496F)へ移した。二次抗体の蛍光量を Typhoon9210イメージ ナフィサ ~~ (Amersnam Bioscience) 用 ヽて、 Fluorescense mode, 600v, 526¾P/ gr een(532nm)、 Focus底面 +3mmの検出条件で測定した。この際、 FITC標識二次抗体 を 0, 12.5, 25, 50, 75, 100, 125, 150 ng添カ卩した PBS溶液 100 1を検量線作成用のコ ントロールとして用いた。
[0026] 検出後、画像を画像解析ソフト Image Quant (Amersham Bioscience)を使用し、数 値化を行った後、 Excel (Microsoft)で解析を行った。この際、プレート、 PBS溶液、お よび細胞に非特異的に結合した FITC標識二次抗体に由来するバックグラウンド値と して、細胞と FITC標識二次抗体のみを反応させたものの測定値を求め、その 4点の 平均値を各サンプルの蛍光強度の値から差し引いた。こうして、細胞に結合した FIT C標識二次抗体の蛍光量を得た。更に、コントロールとして用いた各濃度の FITC標 識二次抗体での蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合して 、る二次 抗体の量 (モル数または重量)を求めた。各一次抗体と FITC標識二次抗体が 1： 2の 割合で反応していると仮定し、結合している一次抗体量を算出した。また遊離の一次 抗体量は添加量力も結合量を差し引いて求めた。抗体濃度をモル濃度に換算する 際、モノクローナル抗体の分子量を 150000とした。
[0027] 添加する一次抗体の増加に伴い結合反応が飽和して蛍光強度が一定量に達する ことを確認するとともに、細胞表面の抗原数及び解離定数 (Kd値)を算出するため、 スキャッチヤード解析（Scatchard,G.; Ann.N.Y.Acad.Sci.,51: 660-672,1949、分子生 物学研究のための新培養細胞実験法;羊土社、実験医学別冊バイオマニュアル UP シリーズ改訂第 2版、 212-217参照）を行った。このとき、数値は各サンプルについて 3 点の値の平均値を用いた。
[0028] 試験抗体：リガンド (L)と細胞表面抗原：レセプター（R)の結合はリガンド ·レセプタ 一複合体 (LR)と次の反応式で示される。
L+R< ~~LR
遊離リガンド濃度〔L〕、非結合型レセプター濃度〔R〕、レセプターと結合したリガンド 濃度〔LR〕として、平衡下での解離定数 Kdは
Kd=〔L〕〔R〕/〔し R〕 ·'··Ι
用いるリガンドの全量〔L total]は遊離型とレセプターに結合したものとの和になる。
[L total] = [L] + [LR]----II
一方、レセプターも総量〔R total]はリガンドに結合していないものと結合したものと の和になる。
[R total] = [R] + [LR]----III
このレセプターの数〔R total] (試験抗体の最大結合量）とレセプターとリガンドとの 親和性を Scatchard解析で推定する。上記 Ι,Π,ΠΙの式を変形、代入すると、
[LR]/[L] = - l/Kd[LR] + [R total] / Kd
[LR]を B (bound)、〔L〕を!7 (free) で表し、〔R total]を B max (定数）で示すと
B/F = - l/KdB + Bmax I Kd
が得られる。この式は B/Fを y軸に Bを x軸にとる一次関数となる。直線の傾き力も Kd 値を
得、 y¾片から Bmaxを得ることができる。 Kd値は濃度の次元をもち、低い値ほど高い 親和
性を示す。（結合定数 Ka = 1/ Kd)
[0029] <結果 >
陽性コントロールである市販の抗 CD20モノクローナル抗体リツキサン、試験抗体 A 及び試験抗体 Bを用いて親和性測定を行った場合の、イメージアナライザー画像を 図 2に、飽和曲線を図 3に、スキャッチヤード（Scatchard)解析の結果を図 4に示す。ま た、上記スキャッチヤード解析より
得られた一次関数の傾きより、解離定数（Kd値）を求めた。同様の実験を繰り返し行 い、得られた Kd値 (平均）は以下のとおりであった。
[表 1]
表 1
Figure imgf000010_0001
産業上の利用分野
本発明の測定法を用いることにより細胞膜表面抗原に対する抗体の親和性を高感 度で測定でき、また、これを利用して抗体をアツセィまたはスクリーニングすることがで きる。本発明の測定法は、造血系細胞の膜表面抗原に結合するモノクローナル抗体 の親和性の測定に適しており、ラジオアイソトープ標識を利用した方法に較べて簡便 で且つ短時間で試験ができる。

Claims

請求の範囲
[1] (a)ヒト造血系浮遊細胞の膜表面抗原に被測定抗体を結合させ、（b)該膜表面抗原 に結合した被測定抗体と遊離の被測定抗体を分離し、 (c)該膜表面抗原に結合した 被測定抗体に、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合す る物質であって標識された物質を結合させ、（d)該膜表面抗原に結合した被測定抗 体に結合した該物質と、遊離の該物質を分離し、（e)該物質の標識を検出することを 含む、被測定抗体と膜表面抗原との結合親和性を測定する方法であって、（b)及び (d)の分離を、それぞれ、遠心分離又は細胞を通さないフィルタ一により行うことを特 徴とする前記方法。
[2] (b)及び (d)の分離を、遠心分離により行う請求項 1に記載の方法。
[3] (b)及び (d)の分離を、細胞を通さないフィルタ一により行う請求項 1に記載の方法。
[4] 細胞が正常動物細胞、ライン化した動物細胞株または遺伝子操作された動物細胞 株である請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。
[5] 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対して結合 するモノクローナル抗体をアツセィする方法。
[6] 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対して結合 するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法。
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