WO2006104213A1 - 反応容器、反応容器処理装置及び診断装置 - Google Patents

反応容器、反応容器処理装置及び診断装置 Download PDF

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WO2006104213A1
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Nobuhiro Hanafusa
Koretsugu Ogata
Ryuh Konoshita
Hiroyuki Kuroki
Rika Satou
Ryoko Imagawa
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Shimadzu Corporation
Toppan Printing Co., Ltd.
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    • G01N2035/0436—Sample carriers adapted for special purposes with pre-packaged reagents, i.e. test-packs

Definitions

  • Reaction vessel Reaction vessel, reaction vessel processing device and diagnostic device
  • the present invention is a reaction container suitable for conducting various automatic analyzes such as chemical reactions and on-site, for example, genetic analysis studies, and genomic DNA of animal and plant such as human beings using the same.
  • reaction vessels for detecting polymorphisms of NPs, especially SNPs (base polymorphisms), and diagnosis of disease incidence using the results of genetic polymorphism detection the relationship between the type of drug administered, effects and side effects
  • the present invention relates to a device for performing diagnosis and the like.
  • the patient force is also taken a nucleic acid sample and the pattern 2 allele or pattern 2 in the sample.
  • a marker gene that is linkage disequilibrium with an allele is detected, and if a pattern 2 allele or a single gene that is linkage disequilibrium with a pattern 2 allele is detected, it is determined that the patient is susceptible to sepsis ( (See Patent Document 1).
  • Human fit for the diagnosis of one or more single nucleotide polymorphisms in a gene, one or more positions of human nucleic acids: 1953, 3453, 3888 (each EMBL accession number X Determine positions in 51602;), 519, 786, 1422, 1429 (according to positions in EMBL accession numbers D6401 6), 454 (according to SEQ ID No. 3) and 696 (according to SEQ ID No. 5), fit — The human constitution is determined by referring to the polymorphism in one gene (see Patent Document 2).
  • a plurality of nucleotide sequences including at least one single nucleotide polymorphism site are obtained.
  • Amplification using nom DNA and multiple pairs of primers at the same time, and using a plurality of amplified base sequences bases of single nucleotide polymorphic sites contained in the base sequence are discriminated by a typing process.
  • the invader method or Tuckman PCR method is used as the typing process (see Patent Document 3).
  • Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2002-533096
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-299366
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-300894
  • Patent Document 4 Japanese Patent No. 3452717
  • Non-Patent Document 1 Hsu TM, Law S. M, Duan S, Neri BP, Kwok PY, "Genotyping s ingle—nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence polarization detection", Clin. Chem., 2001 Aug ; 47 (8): 1373-7
  • a first object of the present invention is to provide a reaction vessel suitable for automating measurement of chemical reaction and detection of gene polymorphism.
  • the second object of the present invention is to provide an apparatus for automating chemical reaction measurement and gene polymorphism detection using the reaction container of the present invention.
  • the third object of the present invention is to provide an apparatus for automatically diagnosing the disease morbidity using the genetic polymorphism detection result according to the present invention and diagnosing the relationship between the kind and effect of the administered drug and side effects. Is to provide.
  • a reaction vessel of the present invention for achieving the first object is formed of at least one reaction part that is formed on a flat substrate and causes the sample to react, and is formed as a recess in the substrate. And at least a non-volatile liquid containing portion containing non-volatile liquid having a low specific gravity and sealed with a film.
  • the reaction container of the present invention further comprises at least one reagent container formed as a recess on the same substrate, containing a reagent used for the sample reaction, and sealed with a film to constitute a sample reaction reagent kit. But, okay.
  • the reagent or non-volatile liquid sealed with the film is inserted into the reaction container processing apparatus of the present invention by inserting the nozzle through the film or after the film is removed. By doing so, it can be sucked into the nozzle and transferred to another place such as a reaction section.
  • This reaction vessel is used for measuring various reactions including chemical reactions and biochemical reactions.
  • One use of this reaction vessel as a reaction reagent kit is to detect genetic polymorphism.
  • the first form of the reaction vessel for detecting a gene polymorphism is a reaction vessel for detecting a gene polymorphism by injecting a biological sample subjected to a gene amplification reaction into this reaction vessel.
  • the reaction container of the first form includes a typing reagent storage unit that stores typing reagents prepared corresponding to a plurality of polymorphic sites as a reagent storage unit, and the reaction unit includes a plurality of polymorphic site.
  • a gene polymorphism diagnostic reagent kit is constituted by including a plurality of probe arrangement parts individually holding fluorescent probes corresponding to each.
  • the second form of the reaction container for detecting a gene polymorphism is a complex that binds to the counter-application reagent kit of the first form with a plurality of polymorphic sites sandwiched as reagent storage parts.
  • a gene amplification reagent containing portion containing a gene amplification reagent containing a number of primers is further included, and a reaction reaction portion further comprising an amplification reaction portion for performing a gene amplification reaction on the mixture of the gene amplification reagent and the sample.
  • the liquid dispensing port of the amplification reaction section has an opening shape corresponding to the tip shape of the dispensing nozzle, and is arranged at the tip of the dispensing nozzle. It is preferred to be composed of an elastic material that can be closely adhered. Since the amplification reaction part repeats a site changing the temperature, it is preferable that the substrate has high thermal conductivity. Therefore, it is preferable that the substrate thickness of the amplification reaction part is thinner than other parts.
  • the number of required primers is not necessarily twice the number of types of polymorphic sites.
  • “a plurality of primers that bind to each of a plurality of polymorphic sites” refers to two or more polymorphic sites only when a pair of primers binds to one polymorphic site. It is used to mean the type of primer necessary to amplify multiple polymorphic sites, including the case of binding between.
  • Polymorphisms include mutations, deletions, duplications, metastases and the like.
  • a typical polymorphism is SNP.
  • Biological samples are blood, saliva, genomic DNA, and the like.
  • An example of a gene amplification reagent is a PCR reaction reagent.
  • the typing system that has already been constructed requires a small amount of DNA to be collected first.
  • the force needs to be pretreated by extracting the DNA. For this purpose, time and labor are required for the pretreatment.
  • the typing process can be performed by using the in-house method or the Tackman PCR method.
  • the typing reagent is an invader reagent or a Taqman PCR reagent.
  • FIG. 11 schematically shows a detection method for detecting a genetic polymorphism using the reaction container of the present invention as a genetic polymorphism diagnostic reagent kit.
  • the PCR method is used for the amplification process and the invader method is used for the typing process.
  • PCR reaction reagent 4 is preliminarily prepared and contains a plurality of primers for the SNP site to be measured, pH buffer for adjusting pH, and four types of deoxyribonucleotides. , Thermostable synthase, and salts such as MgCl and KC1
  • the PCR method of the amplification step that may be used in the present invention is to simultaneously amplify a plurality of target SNP sites.
  • the biological sample may be subjected to nucleic acid extraction operation or may not be subjected to nucleic acid extraction operation.
  • nucleic acid extraction is performed and multiple genomic DNAs containing these SNP sites are amplified by direct PCR using biological sample force, gene amplification including multiple primers for those SNP sites
  • the reaction reagent is allowed to act on the biological sample, and when it is mixed with Sample 2, the PCR reaction is initiated under the condition that the pH at 25 ° C is 8.5–9.5.
  • pH buffer solution various pH buffer solutions can be used in addition to a combination of tris (hydroxymethyl) aminomethane and a mineral acid such as hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid and the like.
  • the pH-adjusted buffer is preferably used in PCR reaction reagents at concentrations between 1 OmM and 1 OOmM! /.
  • a primer is an oligonucleotide that serves as a starting point for DNA synthesis by a PCR reaction. Primers may be synthesized or isolated from the biological world
  • the synthase is an enzyme for DNA synthesis using a primer with a primer and includes a chemical synthesis system.
  • Suitable synthases include E. coli DNA polymerase I, E. coli DNA polymerase Klenow fragment, T4 DNA polymerase, TaqDNA polymerase, T. litoralis DNA polymerase, TthDNA polymerase, PfuDNA polymerase, Hot Start Taq polymerase , KOD DNA polymerase, EX Taq DNA polymerase, reverse transcriptase, and other forces are not limited to these.
  • “Thermal stability” is high temperature, preferably 65-95. It means the property of a compound that retains its activity even at ° C.
  • a PCR reaction is performed on a mixture of the biological sample 2 and the PCR reaction reagent 4 according to a predetermined temperature cycle.
  • the PCR temperature cycle includes three steps: denaturation, primer attachment (annealing), and primer extension, and DNA is amplified by repeating the cycle.
  • the denaturation step is 94 ° C for 1 minute
  • the primer attachment step is 55 ° C for 1 minute
  • the primer extension is 72 ° C for 1 minute.
  • the biological sample may have been subjected to genome extraction operation, here, a sample that has been subjected to genome extraction operation is used. Even in biological samples that have not been subjected to genome extraction, DNA is released from blood cells and cellular forces at high temperatures during the PCR temperature cycle, and the reaction proceeds as reagents necessary for the PCR reaction come into contact with the DNA.
  • Invader reagent 6 is added as a typing reagent.
  • Invader Reagent 6 contains a fluorescent FRET probe and a Talibase (Cleavase).
  • Fret probes are fluorescently labeled oligos that have a sequence completely unrelated to genomic DNA, and the sequence is often the same regardless of the type of SNP.
  • the reaction solution to which the invader reagent 6 has been added is added to the plurality of probe placement portions 8 to cause a reaction.
  • an envelope probe and a reporter probe are individually held corresponding to each of the plurality of SNP sites, and the reaction solution reacts with the invader probe and corresponds to the reporter probe. Fluoresce if SNP is present.
  • the invader method used in the typing process is a method of typing SNP sites by hybridizing an allele-specific oligo and DNA containing SNP to be typed.
  • DNA containing SNP and SNP to be typed A method that uses two reporter probes and one invader probe specific to each allele and an enzyme that has special endonuclease activity when it recognizes and cleaves the DNA structure. Yes (see Patent Document 3) 0
  • the film can be penetrated by a nozzle.
  • At least the non-volatile liquid dispensed in the reaction section is a recess capable of holding the non-volatile liquid.
  • a sample injecting portion for injecting a sample may be further provided as a recess in the same substrate.
  • the reaction part is covered with a peelable sealing material before use, and the typing reagent is an invader reagent or a Taqman PCR reagent.
  • the reaction vessel treatment apparatus of the present invention for achieving the second object includes a reaction section for causing a sample to react, and a non-volatile liquid containing non-volatile liquid having a specific gravity lower than that of the reaction liquid.
  • the reaction vessel processing apparatus further includes a reaction temperature control unit that controls the temperature of the reaction unit, and the control unit 116 can also control the temperature of the reaction temperature control unit.
  • the first form thereof further includes a typing reagent storage section that stores a typing reagent as a reaction container, and a plurality of multiple reaction containers.
  • a genetic polymorphism diagnosis reaction container equipped with a plurality of probe placement parts each holding a fluorescent probe corresponding to each type site.
  • the reaction temperature control unit includes a typing reaction temperature control unit 110 that controls the temperature of the probe placement unit to a temperature at which the reaction liquid of the sample and the typing reagent reacts with the probe.
  • the container processing apparatus further includes a fluorescence detection unit 64 that detects fluorescence by irradiating each probe placement unit with excitation light.
  • the control unit 118 is The temperature control of the reaction temperature control unit 110 and the detection operation of the fluorescence detection unit 64 are also controlled.
  • the typing reaction temperature control unit 110 serves as a temperature control unit for the invader reaction.
  • the second form of using this reaction container processing apparatus as a gene polymorphism detection apparatus accommodates a gene amplification reagent including a plurality of primers that bind to each of a plurality of polymorphic sites as a reaction container.
  • the gene polymorphism diagnosis reaction vessel is further provided with the gene amplification reagent containing portion, and the reaction portion further includes an amplification reaction portion for performing a gene amplification reaction on the mixture of the gene amplification reagent and the sample.
  • an amplification reaction temperature control unit that controls the temperature of the amplification reaction unit as a reaction temperature control unit to a temperature for gene amplification that amplifies DNA in the reaction solution of the sample and the gene amplification reagent.
  • 120 is further provided, and the control unit 118 also performs temperature control of the amplification reaction temperature control unit 120.
  • the amplification reaction temperature control unit 120 serves as a temperature control unit for a temperature cycle for the PCR reaction.
  • a personal computer (PC) 122 may be connected to the control unit 118 in order to operate the control unit 118 also with an external force or display a test result.
  • An example of a nozzle is a tip that can be detachably mounted at the tip 1.
  • the diagnostic device of the present invention is an anti-transgenic polymorphism diagnostic reaction in the reaction container of the present invention.
  • Database diagnostic value based on polymorphic analysis results detected by database, display device, reaction vessel processing device, database storing all diagnostic values for specific polymorphism or combination of multiple polymorphisms And a diagnostic processing device for reading out and displaying on the display device.
  • the reaction vessel of the present invention is a non-volatile liquid having a specific gravity lower than that of the reaction part and the reaction liquid on one substrate. Since the body is contained, covering the surface of the reaction liquid with a non-volatile liquid in the reaction part can prevent the reaction liquid from evaporating even if the reaction liquid is heated in the reaction part. Furthermore, the one equipped with a reagent container becomes a reagent kit for sample reaction, eliminating the trouble of separately arranging the reagents.
  • this reaction container is used as a genetic polymorphism diagnostic reagent kit
  • a typing reagent storage unit a non-volatile liquid storage unit, and a probe placement unit are integrally provided.
  • These DNA polymorphic sites can be typed at the same time for DNA samples with amplified type sites, and polymorphic typing can be performed in a simple process in a short time.
  • the second form of using this reaction container as a genetic polymorphism diagnostic reagent kit further includes a gene amplification reagent storage part and an amplification reaction part as a single unit. After a plurality of target polymorphic sites are amplified simultaneously, the polymorphic sites can be typed at the same time, and polymorphic typing can be performed in a simple process in a short time.
  • the film that seals the reagent and the non-volatile liquid can be penetrated by the nozzle, the liquid can be easily transferred in the reaction vessel processing apparatus.
  • reaction part becomes a recess and can hold the non-volatile liquid, evaporation of the reaction liquid in the reaction part can be more effectively prevented.
  • reaction part is covered with a peelable sealing material, it can be covered with a sealing material before use, and the sealant can be peeled off during use to prevent dust and dirt from adhering before use.
  • the liquid dispensing port of the amplification reaction section has an opening shape corresponding to the tip shape of the dispensing nozzle and is made of an elastic material that can be in close contact with the tip of the dispensing nozzle By doing so, it is possible to easily perform the operation of injecting the mixed liquid into the amplification reaction section and recovering the reaction liquid from the amplification reaction section.
  • the dispensing operation can be performed with a simple mechanism.
  • the diagnostic device of the present invention it is possible to display the diagnostic value based on the typing power of the polymorphism. Can be executed automatically.
  • mineral oil mineral oil
  • vegetable oil animal oil, silicone oil, diphenyl ether, or the like
  • mineral oil is a liquid hydrocarbon mixture obtained by distillation with petrolatum, and is also called fluid nophine, fluid petrolatum, white oil, etc., and includes low specific gravity diesel oil.
  • Animal oils such as cod liver oil, baboon oil, dicin oil, orange luffy oil or shark liver oil can be used.
  • canola oil, tonsil oil, cottonseed oil, corn oil, olive oil, peanut oil, safflower oil, sesame oil, soybean oil, and the like can be used.
  • FIG. 2A and 2B show a first embodiment of the reaction vessel, FIG. 2A is a front view, and FIG. 2B is a plan view.
  • a reagent container 14 and a non-volatile liquid container 16 are formed as recesses on the same side of the flat substrate 10.
  • Mineral oil is used as the non-volatile liquid, and hereinafter, the non-volatile liquid container is referred to as a mineral oil container.
  • a reaction part 18 is also formed on the same side of the substrate 10.
  • the reagent container 14 and the mineral oil container 16 are sealed with a film 20, and when the reagent and mineral oil are sucked with a nozzle and transferred to another place, the film 20 is removed! /
  • the suction force with the nozzle or the film 20 can be penetrated with the nozzle, and the nozzle is penetrated to suck with the nozzle.
  • Such a film 20 is, for example, an aluminum foil, a laminated film of aluminum and a resin film such as PET (polyethylene terephthalate) film, and is bonded by adhesion so that it does not easily peel off. .
  • the surface of the substrate 10 is covered from above the film 20 with a releasable sealing material 22 having a size covering the reagent storage unit 14, the mineral oil storage unit 16 and the reaction unit 18.
  • An example of a specific use of this reaction vessel is a genetic polymorphism diagnostic reagent kit that injects a sample reaction solution obtained by amplifying DNA by PCR reaction and detects SNP by invader reaction. It has become.
  • a genetic polymorphism diagnostic reagent kit that injects a sample reaction solution obtained by amplifying DNA by PCR reaction and detects SNP by invader reaction. It has become.
  • FIG. 2A and FIG. 2B an embodiment as a genetic polymorphism diagnostic reagent kit will be described in detail.
  • a sample injection part 12 On the same side of the flat substrate 10, a sample injection part 12, a typing reagent storage part 14, and a mineral oil storage part 16 are formed as recesses.
  • a plurality of probe placement portions 18 are also formed on the same side of the substrate 10.
  • the sample injection unit 12 is for injecting a biological sample reaction solution obtained by amplifying DNA by a PCR reaction. However, the sample injection unit 12 is provided in an empty state before the sample is injected yet.
  • the typing reagent storage unit 14 stores 10 to 300 L of a typing reagent prepared corresponding to a plurality of polymorphic sites, and the mineral oil storage unit 16 stores 20 to 20 mineral oil to prevent the reaction liquid from evaporating. 300 L is contained, and the typing reagent container 14 and the mineral oil container 16 are sealed with a film 20 that can be penetrated by a nozzle.
  • Each probe placement unit 18 individually holds a fluorescent probe corresponding to each of a plurality of polymorphic sites, and when mineral oil from the mineral oil storage unit 16 is dispensed. It becomes a recess that can hold the mineral oil.
  • the size of the concave portion of each probe placement portion 18 is, for example, a circle having a diameter of 100111 to 2111111 and a depth of m to 1.5 mm.
  • the surface of the substrate 10 is covered with a peelable seal material 22 having a size covering the sample injection part 12, the typing reagent storage part 14, the mineral oil storage part 16 and the probe placement part 18 from above the film 20. It is covered.
  • the sealing material 22 is also an aluminum foil, a laminated film of aluminum and resin, etc., and is attached to such an extent that the adhesive strength is weaker than that of the film 20 and can be peeled off.
  • the substrate 10 is formed of a material having a low autofluorescence property (low fluorescence emission from itself and a property of light transmission), such as polycarbonate. It is made.
  • the thickness of the substrate 10 is 0.3 to 4 mm, preferably 1 to 2 mm. From the viewpoint of low autofluorescence, the thickness of the substrate 10 is preferably thinner.
  • the sealing material 22 is peeled off during use.
  • the typing reagent container 14 and the mineral oil container 16 are sealed! /, And the film 20 is left untouched! /. 2 to 20 L of the sample reaction solution 24, in which DNA is amplified by PCR reaction, is injected into the sample injection section 12 by a pipette 26 or the like. Thereafter, the reaction container is attached to the detection device.
  • the nozzle 28 penetrates the film 20 and is inserted into the typing reagent container 14 to inhale the typing reagent, and the typing reagent is injected into the sample by the nozzle 28. Transferred to part 12.
  • the sample injection unit 12 the sample reaction solution and the typing reagent are mixed by repeating the suction and discharge by the nozzle 28.
  • the reaction solution of the PCR reaction solution and the typing reagent is dispensed to each probe placement portion 18 by the nozzle 28.
  • Mineral oil is dispensed from each mineral oil container 16 to each probe placement unit 18 by a nozzle 28.
  • the dispensing of the mineral oil to the probe placement unit 18 may be before the reaction solution is dispensed to the probe placement unit 18.
  • Each probe placement unit 18 dispenses 0.5 to 10 ⁇ L of mineral oil, and the mineral oil covers the surface of the reaction solution.
  • Typing with heating in the typing reaction temperature control unit of the detection device Prevent evaporation of the reaction solution during the reaction time.
  • each probe placement section 18 if the reaction solution reacts with the probe and there is a predetermined SNP, the probe force also emits fluorescence. Fluorescence is detected by irradiating excitation light on the back side force of the substrate 10.
  • FIGS. 5A, 5B, and 5C show a second embodiment of the reaction vessel.
  • Fig. 5 (b) is a front view
  • Fig. 5 (b) is a plan view
  • Fig. 5C is an enlarged cross-sectional view taken along the line XX in Fig. 5 (b).
  • This reaction vessel is subjected to a nucleic acid extraction operation, injecting a biological sample as a sample, and performing both amplification of DNA by PCR reaction and SNP detection by invader reaction.
  • a biological sample that has not been subjected to nucleic acid extraction may be injected.
  • the same sample injection section 12, typing reagent storage section 14, mineral oil storage section 16, and a plurality of probe placement sections 18 as in the embodiment of FIGS. 2A and 2B are formed on the same side of the flat substrate 10a.
  • a gene amplification reagent storage unit 30, a PCR end solution injection unit 31, and an amplification reaction unit 32 are further formed on the same side of the substrate 10a.
  • the gene amplification reagent container 30 is also formed as a recess in the substrate 10a, and a plurality of polymorphic sites and the like are formed. A gene amplification reagent containing a plurality of primers that are bound to each other is housed. The gene amplification reagent container 30 is sealed with a film 20 that can be penetrated by a nozzle together with the typing reagent container 14 and the mineral oil container 16. The gene amplification reagent storage unit 30 stores 2 to 300 L of PCR reaction reagent. As in the embodiment of FIGS. 2A and 2B, the typing reagent container 14 contains 10 to 300 L of typing reagent, and the mineral oil container 16 contains 20 to 300 ⁇ L of mineral oil. Yes.
  • the PCR end solution injection part 31 is for mixing the reaction solution that has been subjected to the PCR reaction in the amplification reaction part 32 and the typing reagent, and is formed as a recess in the substrate 10a, and is empty before use. Provided in.
  • the amplification reaction unit 32 allows a gene amplification reaction to be performed on the mixture of the PCR reaction reagent and the sample.
  • Fig. 6 shows an enlarged cross section of the amplification reaction section 32.
  • Fig. 6 is a cross-sectional view taken along the line Y-Y in Fig. 5B.
  • the liquid dispensing ports 34a, 34b of the amplification reaction section 32 have openings 36a, 36b corresponding to the shape of the tip of the nozzle 28, and PDMS ( (Polydimethylsiloxane) and silicone rubber.
  • PDMS Polydimethylsiloxane
  • the lower surface side of the substrate 10a of that part is thin as shown in FIG. 5C and FIG.
  • the thickness of the portion is, for example, 0.2 to 0.3 mm.
  • the sample injection unit 12 is subjected to a nucleic acid extraction operation, and is supplied with an empty sample, but a sample is not yet injected before use. .
  • the typing reagent container 14 as in the embodiment of FIGS. 2A and 2B accommodates typing reagents prepared corresponding to a plurality of polymorphic sites, and the mineral oil container 16 evaporates the reaction liquid. Contains mineral oil to prevent it.
  • Each probe placement section 18 also individually holds a fluorescent probe corresponding to each of a plurality of polymorphic sites as in the embodiment of FIGS. 2A and 2B. When oil is dispensed, it becomes a recess that can hold the mineral oil It is.
  • the surface of the substrate 10a is a force on the film 20, a sample injection part 12, a PCR end liquid injection part 31, a typing reagent storage part 14, a mineral oil storage part 16, a gene amplification reagent storage part 30, an amplification reaction part. 32 and the probe placement part 18 are covered with a peelable sealing material 22 of a size!
  • the material of the film 20 and the sealing material 22 and the method of attaching them are the same as in the embodiment of FIGS. 2A and 2B.
  • the substrate 10a is also made of a material such as a low autofluorescent and light-transmitting resin, such as polycarbonate, in order to measure fluorescence from the bottom side.
  • the thickness of the substrate 10 is l ⁇ 2mm
  • the sealing material 22 is peeled off during use.
  • Typing Reagent storage unit 14 mineral oil storage unit 16 and gene amplification reagent storage unit 30 are sealed and V and film 20 are not peeled off.
  • the injected sample is a sample reaction solution in which DNA is amplified by a PCR reaction externally.
  • the sample injected in this example is a biological sample that has not been subjected to nucleic acid extraction.
  • the sample may be a biological sample subjected to a nucleic acid extraction operation. After sample injection, this reaction vessel is attached to the detector.
  • the PCR reaction reagent is sucked through the nozzle 28 force film 20 and inserted into the gene amplification reagent container 30, and the PCR reaction reagent is 5 to 20 L is transferred to the sample injection section 12 by the nozzle 28.
  • the sample injection unit 12 the sample reaction solution and the PCR reaction reagent are mixed to become a PCR reaction solution by repeating suction and discharge by the nozzle 28.
  • the PCR reaction solution is injected into the amplification reaction section 32 through the nozzle 28. That is, the nozzle 28 is inserted into one port 34a of the amplification reaction section 32 and the PCR reaction solution 38 is injected, and the PCR reaction solution 38 is prevented from evaporating during the reaction in the amplification reaction section 32.
  • the Noznore 28 will make After injection, the surface of the PCR reaction solution 38 at the ports 34a and 34b is covered with mineral oil 40.
  • the force at which the PCR reaction solution is recovered by the nozzle 28 is completed, the force at which the PCR reaction solution is recovered by the nozzle 28.
  • the mineral oil is supplied from one port 34a of the amplification reaction unit 32. 40 is injected.
  • the PCR reaction solution 38a is pushed to the other port 34b. Therefore, the nozzle 28 is inserted, and the PCR reaction solution 38a is sucked into the nozzle 28.
  • Ports 34a and 34b have openings 36a and 36b that are shaped according to the shape of nozzle 28 and are made of an elastic material, so that nozzle 28 adheres to ports 34a and 34b to prevent liquid leakage, Easy injection and recovery of PCR reaction solution.
  • the PCR reaction solution 38a after completion of the reaction collected from the amplification reaction unit 32 by the nozzle 28 is transferred to the PCR end solution injection unit 31 and injected.
  • the nozzle 28 passes through the film 20 and is inserted into the typing reagent container 14, and the typing reagent is sucked.
  • the typing reagent is transferred to the PCR end solution injection unit 31 by the nozzle 28 and injected.
  • the In the PCR end solution injecting section 31, the PCR reaction solution and the typing reagent are mixed by repeating suction and discharge through the nozzle 28.
  • a reaction solution of the PCR reaction solution and the typing reagent is dispensed in an amount of 0.5 to 4 ⁇ L to each probe placement portion 18 by the nozzle 28.
  • Mineral oil is dispensed from the mineral oil storage section 16 to each probe placement section 18 by a nozzle 28. The dispensing of the mineral oil to the probe placement unit 18 may be performed before the reaction solution is dispensed to the probe placement unit 18.
  • mineral oil covers the surface of the reaction solution and prevents evaporation of the reaction solution during the typing reaction time accompanied by heating in the typing reaction temperature control unit of the detection device.
  • each probe placement section 18 if the reaction solution reacts with the probe and there is a predetermined SNP, the probe force also emits fluorescence. Fluorescence is detected by irradiating excitation light on the back side force of the substrate 10.
  • PCR reaction reagents are known, such as primers, DNA polymerase and TaqStart (CLONTECH Laboratorie, as described in paragraph [0046] of Patent Document 3. Reagents including s) can be used. In addition, AmpDirect (manufactured by Shimadzu Corporation) may be mixed in the PCR reaction reagent.
  • primer for example, SNP IDs 1 to 20 described in Table 1 of Patent Document 3 and SEQ ID NOs: 1 to 40 can be used.
  • An invader reagent is used as a typing reagent.
  • Invader Atsy Kit manufactured by Third Wave Technology
  • a signal buffer, a fret probe, a structure-specific DNA degrading enzyme, and an allele-specific probe are prepared at concentrations as described in paragraph [0046] of Patent Document 3.
  • FIG. 9 shows an example of a simplified reaction container processing apparatus for detecting SNP in a biological sample using the reaction container of the present invention as a reagent kit.
  • a pair of heat blocks 60 and 62 are arranged on the upper and lower sides to constitute a reaction vessel mounting portion, and five samples injected into the reaction vessel 41 of the present invention are placed on the lower heat block 60 in parallel. It is installed side by side.
  • These heat blocks 60 and 62 can move in the Y direction indicated by the arrows.
  • the upper heat block 62 is provided with a window that can be opened and closed so that the lid opens when the liquid is transferred, sucked or discharged by the nozzle 28.
  • the lower heat block 60 includes an amplification reaction temperature control unit that controls the temperature of the amplification reaction unit 32 to a predetermined temperature cycle, and the temperature of the probe placement unit 18 to a temperature at which the DNA and the probe are reacted.
  • the temperature of the amplification reaction temperature controller is set so that the cycle is repeated, for example, in three stages of 94 ° C., 55 ° C. and 72 ° C. in that order.
  • the temperature of the typing reaction temperature controller is set to 63 ° C, for example.
  • an amplification reaction temperature control section that controls the temperature of the amplification reaction section is not necessary.
  • a detector 64 for detecting fluorescence is disposed below the heater block 60, and the detector 64 moves in the direction of arrow X in the figure to detect fluorescence from the probe placement unit 18.
  • the heater block 60 has an opening for fluorescence detection.
  • Fluorescence detection is performed on each probe by moving the probe placement section 18 in the Y direction and moving the detector 64 in the X direction.
  • a liquid supply arm 66 is provided as a dispensing unit, and the liquid supply arm 66 includes the nozzle 28.
  • a disposable tip 70 is detachably attached to the tip of the nozzle 28.
  • a control unit 118 is disposed near them.
  • the control unit 118 includes a CPU and holds a program for operation.
  • the control unit 118 controls the temperature control of the typing reaction unit 110 and the amplification unit 120 realized by the heat blocks 60 and 62, the detection operation of the fluorescence detection unit 64, and the dispensing operation of the liquid feeding arm 66 of the dispensing unit 112. .
  • the control unit 118 also needs to have a function for controlling the temperature of the amplification unit.
  • FIG. 10 shows the detector 64 in detail.
  • the detector 64 includes a laser diode (LD) or a light emitting diode (LED) 92 that emits 473 nm laser light as an excitation light source, and the laser light is condensed and irradiated on the bottom surface of the probe placement portion of the reaction vessel 41.
  • Lens 94, 96 The lens 94 condenses the laser light from the laser diode 92 into parallel light, and the lens 96 is an objective lens that converges and irradiates the collimated laser light on the bottom surface of the reaction vessel 41.
  • the objective lens 96 also acts as a lens that collects the fluorescence generated from the reaction vessel 41.
  • a dichroic mirror 98 is provided between the pair of lenses 94 and 96, and the dichroic mirror 98 has wavelength characteristics set so as to transmit excitation light and reflect fluorescence.
  • a dichroic mirror 100 is further arranged on the optical path of reflected light (fluorescence) of the dichroic mirror 98.
  • the dichroic mirror 100 has a wavelength characteristic that reflects 525 nm light and transmits 605 nm light!
  • the lens 102 and the photodetector 104 are arranged on the optical path of the reflected light by the dichroic mirror 100 so as to detect the fluorescence of 525 nm, and the fluorescent light of 605 nm is detected on the optical path of the transmitted light by the dichroic mirror 100.
  • a lens 106 and a photodetector 108 are arranged on the screen. Two types of fluorescence detection by these two detectors 104 and 108 enable each probe placement position. The presence or absence of an SNP corresponding to the invader probe immobilized on the nuclei and whether the SNP is homozygous or heterozygous is detected.
  • the labeling phosphor for example, FAM, ROX, VIC, TAMRA, Redmond Red, etc. can be used.
  • the detector 64 in FIG. 10 is configured to be excited with excitation light from one light source and measure fluorescence at two wavelengths, but the detector 64 is differently excited for measuring fluorescence at two wavelengths. It may be configured to use two light sources so that it can be excited by wavelength.
  • the diagnostic apparatus of the present invention is for genetic polymorphism diagnosis of the anti-container of the present invention] ⁇ treats the container] ⁇ container treatment 200, disc device, drum device, etc. Diagnosis of specific polymorphisms or combinations of multiple polymorphisms Value of stored memory 202 Database stored 202 LCD display or display device of CRT 204] ⁇ Analysis of polymorphism generated by container processing device 200 Based on the results, he diagnosed from the database 202 and read it out and displayed it on the display 204.
  • the present invention can be used for various automatic analyzes in, for example, genetic analysis research and clinical fields.
  • humans, animals, and plant genomes can be used.
  • DNA polymorphisms, especially SNPs (base nucleotide polymorphisms) can be detected, and the results can be used to diagnose disease morbidity and diagnoses such as the relationship between the type and effect of drugs and side effects. It can also be used for animal and plant variety determination, infectious disease diagnosis (type determination of infecting bacteria), and the like.
  • FIG. 1 is a block diagram schematically showing the present invention.
  • FIG. 2A is a front view of a first embodiment of a reaction vessel.
  • FIG. 2B is a plan view of the first embodiment of the reaction vessel.
  • FIG. 3A is a front view showing the first half of the process of the SNP detection method using the reaction container of the same example.
  • FIG. 3B is a plan view showing the first half of the process of the SNP detection method using the reaction container of the example.
  • FIG. 4A is a front view showing the latter half of the process of the SNP detection method using the reaction container of the same example.
  • FIG. 4B is a plan view showing the latter half of the process of the SNP detection method using the reaction container of the same example.
  • FIG. 5A is a front view showing a second embodiment of the reaction vessel.
  • FIG. 5B is a plan view showing a second embodiment of the reaction vessel.
  • FIG. 5C is an enlarged cross-sectional view taken along the line X—X in FIG. 5B, showing a second embodiment of the reaction vessel.
  • FIG. 6A is an enlarged cross-sectional view taken along the line Y—Y in FIG. 5B with the reaction solution injected into the amplification reaction part in the same example.
  • FIG. 6B is an enlarged cross-sectional view taken along the line Y-Y in FIG. 5B in a state where the amplification reaction part in the same example is recovered with the reaction solution.
  • FIG. 7A is a front view showing the first half of the process of the SNP detection method using the reaction container of the same example.
  • FIG. 7B is a plan view showing the first half of the process of the SNP detection method using the reaction container of the same example.
  • FIG. 8A is a front view showing the latter half of the process of the SNP detection method using the reaction vessel of the same example.
  • FIG. 8B is a plan view showing the latter half of the process of the SNP detection method using the reaction container of the same example.
  • FIG. 9 is a schematic perspective view showing an example of a simplified reaction container processing apparatus for detecting SNP in a biological sample using the reaction container of the present invention as a reagent kit.
  • FIG. 10 is a schematic configuration diagram showing a detector in the detection apparatus.
  • FIG. 11 is a flowchart schematically showing an SNP detection method to which the present invention may relate.
  • Fig. 121 is a block ⁇ ! Schematically showing the diagnostic apparatus of the present invention.

Abstract

　種々の測定を自動化するのに適する反応容器を提供する。 　好ましい形態では、平板状の基板１０の同じ側にサンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４及びミネラルオイル収容部１６が凹部として形成されており、さらに複数のプローブ配置部１８も形成されている。タイピング試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６はフィルム２０で封止されており、基板１０の表面はフィルム２０上からサンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及びプローブ配置部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。液の移送はノズルにより行なわれる。

Description

明 細 書
反応容器、反応容器処理装置及び診断装置
技術分野
[0001] 本発明は化学反応を初め、現場において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研 究ゃ臨床を行なうのに適する反応容器と、それを用いて人間を初めとする動物ゃ植 物のゲノム DNAの多型、特に SNP (—塩基多型）を検出するための反応容器処理 装置、並びにその遺伝子多型検出結果を用いて病気罹患率の診断、投与薬剤の種 類と効果及び副作用との関係の診断などを行なう装置に関するものである。
背景技術
[0002] 遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記 のようなものが提案されて 、る。
患者が敗血症に罹りやすいか否力及び Z又は敗血症に急速に進行しやすいか否 かを決定するために、患者力も核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパタ ーン 2対立遺伝子、又はパターン 2対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子 を検出し、パターン 2対立遺伝子又はパターン 2対立遺伝子と連鎖不平衡であるマ 一力一遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する (特許文献 1 参照。）。
[0003] ヒトの fit— 1遺伝子中の 1又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために 、ヒトの核酸の 1又はそれ以上の位置： 1953、 3453、 3888 (各々 EMBL受理番号 X 51602中の位置に従う;)、 519、 786、 1422、 1429 (各々 EMBL受理番号 D6401 6中の位置に従う）、 454 (配列番号 3に従う）及び 696 (配列番号 5に従う）の配列を 決定し、 fit— 1遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定する（ 特許文献 2参照。）。
[0004] SNP部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告され ている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
比較的に少量のゲノム DNAを用いて数十万箇所に及ぶ SNP部位についてタイピ ングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲ ノム DNA及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配 列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程によ り判別する。そのタイピング工程として、インべーダ法又はタックマン PCR法を用いる (特許文献 3参照。）。
特許文献 1：特表 2002— 533096号公報
特許文献 2：特開 2001— 299366号公報
特許文献 3：特開 2002— 300894号公報
特許文献 4 :特許第 3452717号公報
非特許文献 1： Hsu T. M., Law S. M, Duan S, Neri B. P., Kwok P. Y., "Genotyping s ingle— nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence p olarization detection", Clin. Chem., 2001 Aug;47(8): 1373-7
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の第 1の目的は、化学反応の測定や遺伝子多型検出を自動化するのに適 する反応容器を提供することである。
本発明の第 2の目的は、本発明の反応容器を用いて化学反応測定や遺伝子多型 検出を自動化する装置を提供することである。
本発明の第 3の目的は、本発明による遺伝子多型検出結果を用いて病気罹患率 の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断を自動的に行なう ための装置を提供することである。
課題を解決するための手段
[0006] 第 1の目的を達成するための本発明の反応容器は、平板状の基板に形成されサン プルに反応を起こさせる少なくとも 1つの反応部と、基板に凹部として形成され、反応 液よりも比重の低い不揮発性液体を収容しフィルムで封止された不揮発性液体収容 部とを少なくとも備えたものである。
本発明の反応容器は、同じ基板に凹部として形成され、サンプルの反応に使用さ れる試薬を収容しフィルムで封止された少なくとも 1つの試薬収容部をさらに備えて サンプルの反応用試薬キットを構成して 、てもよ 、。 [0007] フィルムで封止された試薬や不揮発性液体は、本発明の反応容器処理装置内に おいてそのフィルムを貫通してノズルを挿入することにより、又はそのフィルムを剥が した後にノズルを挿入することにより、そのノズルに吸入し、反応部などの他の場所に 移送することができる。
[0008] この反応容器は、化学反応、生化学反応を初め、種々の反応の測定に用いられる ものである。この反応容器を反応用試薬キットとした場合の 1つの用途として、遺伝子 多型検出を挙げることができる。遺伝子多型検出用の反応容器とした場合の第 1の 形態は、生体サンプルとして遺伝子増幅反応がなされたものをこの反応容器に注入 して遺伝子多型を検出する反応容器である。その第 1の形態の反応容器は、試薬収 容部として複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピン グ試薬収容部を含み、反応部として前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍 光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を含んで遺伝子多型 診断用試薬キットを構成して 、るものである。
[0009] 遺伝子多型検出用の反応容器とした場合の第 2の形態は、上記の第 1の形態の反 応用試薬キットに、試薬収容部として複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複 数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさら〖こ 含み、反応部として遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応 を行なわせる増幅反応部をさらに含んだものである。
[0010] 第 2の形態の遺伝子多型診断用試薬キットにおいては、増幅反応部の液分注用ポ ートは分注ノズルの先端形状に対応した開口形状をもち、分注ノズルの先端に密着 できる弾性素材で構成されて 、ることが好ま 、。増幅反応部は温度を変化させるサ イタルを繰り返すことから基板の熱伝導性が高い方が好ましい。そのために、増幅反 応部の基板肉厚が他の部分よりも薄くなつて 、ることが好ま 、。
[0011] ここで、多型部位とプライマーの関係を示すと、 1つの多型部位を増幅するために はその多型部位をはさんで結合する一対のプライマーが必要になる。対象となる生 体サンプルには複数種類の多型部位が存在するので、それらの多型部位が互いに 離れた位置に存在する場合には多型部位の種類の数の 2倍の種類のプライマーが 必要になる。しかし、 2つの多型部位が接近している場合には、それらの多型部位そ れぞれをはさんでプライマーを結合させて増幅することも、またそれらの 2つの多型部 位の間にはプライマーを結合させず、 2つの多型部位の配列の両側にのみプライマ 一を結合させて増幅することもできる。したがって、必要なプライマーの種類は必ずし も多型部位の種類の数の 2倍になるわけではな 、。本発明における「複数の多型部 位それぞれをはさんで結合する複数のプライマー」とは一対のプライマーが 1つの多 型部位をはさんで結合する場合だけでなぐ 2又はそれ以上の多型部位をはさんで 結合する場合も含めて、複数の多型部位を増幅するのに必要な種類のプライマーと いう意味で使用している。
多型には変異、欠失、重複、転移等が含まれる。多型の代表的なものは SNPであ る。
生体サンプルは血液、唾液、ゲノム DNAなどである。
遺伝子増幅試薬の一例は PCR反応試薬である。
[0012] SNPのタイピングには増幅工程に入る段階でゲノム DNAの調整が必須であり、そ こに手間とコストがかかる。 DNAを増幅する PCR法だけに着目すれば、前処理なし で血液などのサンプルから直接 PCR反応を行なわせる方法も提案されて 、る。そこ では、遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法におい て、遺伝子を含むサンプル中の遺伝子包含体もしくは遺伝子を含むサンプルそのも のを遺伝子増幅反応液に添加して、添加後の該反応液の pHが 8.5— 9.5 (25°C)で 遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する（特許文献 4参照。；)。
[0013] 既に構築されているタイピングシステムは、タイピングしょうとする複数の SNP領域 を PCR法で増幅するために、最初に採取する DNA量は少なくてすむ力 PCR法で 増幅する前に予め生体サンプル力も DNAを抽出しておくという前処理が必要である 。そのためにその前処理に時間と手間が力かる。
直接 PCR法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数の S NP部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されてい なかった。
タイピング工程はインべ一ダ法ゃタックマン PCR法を使用することができる。その場 合、タイピング試薬はインべーダ試薬又はタックマン PCR試薬である。 [0014] 図 11は本発明の反応容器を遺伝子多型診断用試薬キットとして使用して遺伝子多 型を検出する際の検出方法を概略的に示したものである。ここでは、増幅工程には P CR法、タイピング工程にはインべ一ダ法を使用するものとして説明する。
PCR工程では血液などの生体サンプル 2に PCR反応試薬 4を添カ卩する力、逆に P CR反応試薬 4に生体サンプル 2を添加する。
[0015] PCR反応試薬 4は予め調整されたものであり、測定しょうとする SNP部位のための 複数のプライマーを含み、それに pHを調整するための pH緩衝液、 4種類のデォキ シリボヌクレオチド類、熱安定性合成酵素、及び MgCl、 KC1等の塩類などの必要な
2
試薬が添加されている。その他に、界面活性剤や蛋白などの物質を必要に応じて添 加することができる。本発明で用いることのある増幅工程の PCR法は、 目的とする複 数の SNP部位を同時に増幅させるものである。生体サンプルは核酸抽出操作を施し ているものであってもよぐ核酸抽出操作を施していないものであってもよい。核酸抽 出操作を施して 、な 、生体サンプル力 直接 PCR法によりそれらの SNP部位を含 む複数のゲノム DNAを増幅させる場合には、それらの SNP部位のための複数のプ ライマーを含む遺伝子増幅反応試薬を生体サンプルに作用させ、サンプル 2と混合 したときに 25°Cでの pHが 8.5— 9.5となる条件下で PCR反応を起こさせる。
[0016] pH緩衝液は、トリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組 合せのほか、種々の pH緩衝液を使用することができる。 pH調整された緩衝液は、 P CR反応試薬の中で 1 OmMから 1 OOmMの間の濃度で使用するのが好まし!/、。 プライマーは PCR反応による DNA合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをい う。プライマーは合成したものであってもよぐ生物界から単離したものであってもよい
[0017] 合成酵素はプライマー付カ卩による DNA合成用の酵素であり、化学合成系も含む。
適切な合成酵素としては、 E. coliの DNAポリメラーゼ I、 E. coliの DNAポリメラーゼ のクレノーフラグメント、 T4DNAポリメラーゼ、 TaqDNAポリメラーゼ、 T. litoralis D NAポリメラーゼ、 TthDNAポリメラーゼ、 PfuDNAポリメラーゼ、 Hot Start Taqポリ メラーゼ、 KOD DNAポリメラーゼ、 EX TaqDNAポリメラーゼ、逆転写酵素などがあ る力 これらに限定されるものではない。「熱安定性」は、高温下、好ましくは 65— 95 °cでもその活性を保持する化合物の性質を意味する。
[0018] PCR工程では、生体サンプル 2と PCR反応試薬 4との混合液を所定の温度サイク ルに従って PCR反応を行なわせる。 PCR温度サイクルは、変性、プライマー付着 (ァ ニーリング)及びプライマー伸長の 3工程を含み、そのサイクルを繰り返すことにより D NAを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が 94°Cで 1分間、プライマー付着工 程が 55°Cで 1分間、プライマー伸長が 72°Cで 1分間である。生体サンプルはゲノム 抽出操作を施したものであってもよ 、が、ここではゲノム抽出操作を施して ヽな 、もの を使用する。ゲノム抽出操作を施していない生体サンプルであっても、 PCR温度サイ クルの高温下で DNAが血球や細胞力 遊離し、 PCR反応に必要な試薬が DNAに 接触して反応が進む。
[0019] PCR反応終了後、タイピング試薬としてインべーダ試薬 6が添加される。インべーダ 試薬 6には蛍光を発するフレット（FRET)プローブ及びタリベース（Cleavase :構造特 異的 DNA分解酵素）が含まれている。フレットプローブはゲノム DNAと全く無関係な 配列をもつ蛍光標識オリゴであり、 SNPの種類によらず配列は共通であることが多い
[0020] 次に、インべーダ試薬 6が添加された反応液を複数のプローブ配置部 8に添カ卩して 反応をさせる。各プローブ配置部 8には、複数の SNP部位のそれぞれに対応してィ ンベーダブローブとレポータープローブが個別に保持されており、反応液がインべ一 ダプローブと反応し、そのレポータープローブに対応する SNPが存在すれば蛍光を 発する。
[0021] インべーダ法については、特許文献 3の段落 [0032]から [0034]に詳しく記載されて いる。
各レポータープローブはそれに対応した SNPの塩基に応じて 2種類のものを用意 すれば、その SNPがホモ接合体であるかへテロ接合体であるかを判別することがで きる。
[0022] タイピング工程で使用するインべーダ法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象の SNPを含む DNAとをハイブリダィゼーシヨンすることにより SNP部位をタイピングす る方法であり、タイピング対象の SNPを含む DNAと、タイピング対象の SNPのそれ ぞれのアレルに特異的な 2種類のレポータープローブ及び 1種類のインべーダプロ ーブと、 DNAの構造を認識して切断すると ヽぅ特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有す る酵素とを用いる方法である (特許文献 3参照。 )0
[0023] 本発明の反応容器において、前記フィルムはノズルで貫通可能なものであることが 好ましい。
反応部のうち少なくとも不揮発性液体が分注されるものはその不揮発性液体を保 持できる凹部となって 、ることが好ま 、。
同じ基板に凹部として形成され、サンプルを注入するためのサンプル注入部をさら に備えていてもよい。
少なくとも反応部は、使用前は剥離可能なシール材で被われて 、ることが好ま 、 タイピング試薬はインべーダ試薬又はタックマン PCR試薬である。
[0024] 第 2の目的を達成するための本発明の反応容器処理装置は、サンプルに反応を起 こさせる反応部、及び反応液よりも比重の低!ヽ不揮発性液体を収容した不揮発性液 体収容部を少なくとも備えた反応容器を装着する反応容器装着部と、図 1に示される ように、ノズル 28による吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する 分注部 112と、分注部 112の分注動作を少なくとも制御する制御部 118とを備えて 、 る。
この反応容器処理装置は反応部の温度を制御する反応温度制御部をさらに備え、 制御部 116は反応温度制御部の温度制御も行なうようにすることができる。
[0025] この反応容器処理装置を遺伝子多型検出装置として使用する場合には、その第 1 の形態は、反応容器としてタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部をさらに 備え、反応部として複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを 個別に保持した複数のプローブ配置部を備えた遺伝子多型診断用反応容器を使用 する。そして、図 1に示されるように、反応温度制御部としてプローブ配置部の温度を サンプルとタイピング試薬との反応液をプローブと反応させる温度に制御するタイピ ング反応温度制御部 110を備え、この反応容器処理装置は各プローブ配置部に励 起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部 64をさらに備える。制御部 118はタイピ ング反応温度制御部 110の温度制御及び蛍光検出部 64の検出動作も制御するも のとなる。
タイピング反応としてインべーダ反応を使用する場合は、タイピング反応温度制御 部 110はインべーダ反応のための温調部となる。
[0026] この反応容器処理装置を遺伝子多型検出装置として使用する第 2の形態は、反応 容器として複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺 伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさらに備え、反応部として遺伝子 増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部 をさらに備えた遺伝子多型診断用反応容器を使用する。そして、図 1に示されるよう に、反応温度制御部として増幅反応部の温度をサンプルと遺伝子増幅試薬との反応 液内で DNAを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御 部 120をさらに備え、制御部 118は増幅反応温度制御部 120の温度制御も行なうも のとなる。
[0027] 遺伝子増幅反応として PCR反応を使用する場合は、増幅反応温度制御部 120は PCR反応のための温度サイクル用の温調部となる。
制御部 118を外部力も操作したり検査結果を表示したりするために、制御部 118に パーソナルコンピュータ（PC) 122を接続してもよい。
ノズルの一例は、先端に使 1、捨て可能なチップを着脱可能に装着したものである。 反応容器の液体収容部がフィルムで封止されて 、て、そのフィルムで封止された状 態で反応容器処理装置に装着される場合には、そのチップにより反応容器のフィル ムを貫通して液の吸入を行なうものとなる。
[0028] 第 3の目的を達成するための本発明の診断装置は、本発明の反応容器のうちの遣 伝子多型診断用反]^容器を処理する本発明の反]^容器処理装置 、特定の多型又 は複数の多型の組合せにっ 、ての診断値を記憶したデータベースと、表示装置と、 反応容器処理装置により検出された多型解析結果に基づいてデータベース力 診 断値を読み出して表示装置に表示する診断処理装置とを備えて 、る。
発明の効果
[0029] 本発明の反応容器は、 1つの基板に反応部と反応液よりも比重の低い不揮発性液 体を収容しているので、反応部で反応液の表面を不揮発性液体で被うことにより、反 応液が反応部で加熱されても反応液が蒸発してしまう事態をさけることができる。 さらに試薬収容部も備えたものは、サンプルの反応用試薬キットとなって、試薬を別 途配置する煩わしさがなくなる。
[0030] この反応容器を遺伝子多型診断用試薬キットとして使用する第 1の形態は、タイピ ング試薬収容部、不揮発性液体収容部及びプローブ配置部を一体的に備えている ので、複数の多型部位が増幅された DNAサンプルにつ 、てそれらの多型部位を同 時にタイピングすることができ、多型のタイピングを簡単な工程で短時間に行なうこと ができる。
[0031] また、この反応容器を遺伝子多型診断用試薬キットとして使用する第 2の形態は、さ らに遺伝子増幅試薬収容部と増幅反応部まで一体的に備えているので、生体サン プルから目的とする複数の多型部位を同時に増幅させた後に、それらの多型部位を 同時にタイピングすることができ、多型のタイピングを簡単な工程で短時間に行なうこ とがでさる。
[0032] 試薬や不揮発性液体を封止して!/ヽるフィルムをノズルで貫通可能なものとしておけ ば、反応容器処理装置内での液の移送が容易になる。
反応部が凹部となって ヽて不揮発性液体を保持できるようになっておれば、反応部 での反応液の蒸発をより効果的に防ぐことができる。
反応部を剥離可能なシール材で被っておけば、使用前はシール材で被っておき、 使用時にシール材を剥離することにより、使用前に埃や汚れの付着を防止することが できる。
[0033] 増幅反応部を備えている反応容器においては、増幅反応部の液分注用ポートを分 注ノズルの先端形状に対応した開口形状にして分注ノズルの先端に密着できる弾性 素材で構成しておけば、増幅反応部への混合液の注入動作、及び増幅反応部から の反応液の回収を容易に行なうことができるようになる。
[0034] 本発明の反応容器処理装置では、ノズルにより液の移送を行なうので、簡単な機構 で分注動作を行なうことができる。
本発明の診断装置では、多型のタイピング力 それに基づ 、た診断値の表示まで を自動的に実行することができるようになる。
発明を実施するための最良の形態
[0035] 反応液よりも比重の低 、不揮発性液体としては、ミネラルオイル (鉱油）、植物油、 動物油、シリコーンオイル又はジフエニルエーテルなどを用いることができる。ミネラ ルオイルはペトロラタム力 蒸留により得られる液体の炭化水素混合物であり、流動 ノ フィン、流動ペトロラタム、ホワイト油などとも呼ばれ、低比重の軽油も含む。動物 油としてはタラの肝油、ォヒヨウ油、二シン油、オレンジラフィー油又はサメの肝油など を用いることができる。また、植物油としてはカノーラ油、扁桃油、綿実油、トウモロコ シ油、ォリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油などを用いることができ る。
[0036] 図 2A及び図 2Bは反応容器の第 1の実施例であり、図 2Aは正面図、図 2Bは平面 図である。
平板状の基板 10の同じ側に試薬収容部 14及び不揮発性液体収容部 16が凹部と して形成されている。不揮発性液体としてはミネラルオイルを使用し、以後、不揮発 性液体収容部をミネラルオイル収容部と称す。基板 10の同じ側にはさらに、反応部 1 8も形成されて 、る。試薬収容部 14とミネラルオイル収容部 16はフィルム 20で封止さ れており、試薬とミネラルオイルをノズルで吸入して他の場所に移送する際には、そ のフィルム 20を取り除!/、てノズルで吸入する力、又はそのフィルム 20をノズルで貫通 可能なものとしてお 、てノズルを貫通させてノズルで吸入する。そのようなフィルム 20 は、例えばアルミニウム箔、アルミニウムと PET (ポリエチレンテレフタレート）フィルム などの榭脂フィルムとの積層膜などであり、容易に剥がれないように融着ゃ接着によ り貼りつけられている。
基板 10の表面は、フィルム 20上から、試薬収容部 14、ミネラルオイル収容部 16及 び反応部 18を被う大きさの剥離可能なシール材 22で被われている。
[0037] この反応容器の具体的な用途の一例は、 PCR反応により DNAを増幅させたサン プル反応液を注入し、インべーダ反応により SNPを検出する遺伝子多型診断用試 薬キットとなったものである。図 2A及び図 2Bを参照して、その遺伝子多型診断用試 薬キットとしての実施例を詳細に説明する。 平板状の基板 10の同じ側にサンプル注入部 12、タイピング試薬収容部 14、及びミ ネラルオイル収容部 16が凹部として形成されている。基板 10の同じ側にはさらに、 複数のプローブ配置部 18も形成されている。
[0038] サンプル注入部 12は PCR反応により DNAを増幅させた生体サンプル反応液が注 入されるものであるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されな 、空の状態で 提供される。タイピング試薬収容部 14は複数の多型部位に対応して調製されたタイ ビング試薬を 10〜300 L収容しており、ミネラルオイル収容部 16は反応液の蒸発 を防ぐためのミネラルオイルを 20〜300 L収容しており、これらのタイピング試薬収 容部 14とミネラルオイル収容部 16はノズルで貫通可能なフィルム 20で封止されてい る。
[0039] 各プローブ配置部 18は複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプロ ーブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部 16からのミネラルオイルが分注さ れたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となって 、る。各プローブ配置部 18 の凹部の大きさは、例ぇば直径が100 111〜2111111、深さが m〜1.5mmの円形 である。
[0040] 基板 10の表面は、フィルム 20上から、サンプル注入部 12、タイピング試薬収容部 1 4、ミネラルオイル収容部 16及びプローブ配置部 18を被う大きさの剥離可能なシー ル材 22で被われている。このシール材 22もアルミニウム箔、アルミニウムと榭脂との 積層膜などであるが、貼りつけ強度はフィルム 20よりは弱ぐ粘着剤などにより剥離可 能な程度に貼りつけられている。
[0041] 基板 10は底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性 (それ自身からの蛍光発 生が少な 、性質のこと)で光透過性の榭脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形 成されている。基板 10の厚さは 0.3〜4mm、好ましくは l〜2mmである。低自蛍光 性の観点力も基板 10の厚さは薄 、方が好ま 、。
[0042] この実施例の反応容器の使用方法を示す。
図 3に示されるように、使用時にシール材 22が剥がされる。タイピング試薬収容部 1 4とミネラルオイル収容部 16を封止して!/、るフィルム 20は剥がされな!/、でそのまま残 つている。 サンプル注入部 12に外部で PCR反応により DNAが増幅されたサンプル反応液 2 4がピペット 26などにより 2〜20 L注入される。その後、この反応容器が検出装置 に装着される。
[0043] 検出装置において、図 4に示されるように、ノズル 28がフィルム 20を貫通してタイピ ング試薬収容部 14に挿入されてタイピング試薬が吸入され、タイピング試薬はそのノ ズル 28によりサンプル注入部 12に移送される。サンプル注入部 12ではノズル 28に よる吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル反応液とタイピング試薬が混合さ れる。
[0044] その後、 PCR反応液とタイピング試薬との反応液がノズル 28により各プローブ配置 部 18へ分注される。各プローブ配置部 18にはノズル 28によりミネラルオイル収容部 16からミネラルオイルが分注される。プローブ配置部 18へのミネラルオイルの分注は 、プローブ配置部 18への反応液の分注前であってもよい。各プローブ配置部 18で はミネラルオイルが 0.5〜10 μ Lずつ分注されて、そのミネラルオイルが反応液の表 面を被 、、検出装置のタイピング反応温度制御部での加熱を伴なうタイピング反応 時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部 18では反応液がプローブと反応して所定の SNPがあればその プローブ力も蛍光が発せられる。蛍光は基板 10の裏面側力も励起光を照射すること により検出する。
[0045] 図 5Α、図 5Β及び図 5Cは反応容器の第 2の実施例である。図 5Αは正面図、図 5Β は平面図、図 5Cは図 5Βの X— X線位置での拡大断面図である。
この反応容器は核酸抽出操作を施して ヽな 、生体サンプルをサンプルとして注入 し、 PCR反応による DNAの増幅と、インべーダ反応による SNP検出を共に行なうも のである。ただし、核酸抽出操作を施していない生体サンプルを注入してもよい。
[0046] 平板状の基板 10aの同じ側に、図 2A及び図 2Bの実施例と同じサンプル注入部 12 、タイピング試薬収容部 14、ミネラルオイル収容部 16、及び複数のプローブ配置部 1 8が形成されている。この反応容器では、さらに遺伝子増幅試薬収容部 30、 PCR終 了液注入部 31、及び増幅反応部 32が基板 10aの同じ側に形成されている。
[0047] 遺伝子増幅試薬収容部 30も基板 10aに凹部として形成され、複数の多型部位そ れぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容している。 遺伝子増幅試薬収容部 30はタイピング試薬収容部 14及びミネラルオイル収容部 16 とともに、ノズルで貫通可能なフィルム 20で封止されている。遺伝子増幅試薬収容部 30には PCR反応試薬が 2〜300 L収容されている。タイピング試薬収容部 14には 図 2A及び図 2Bの実施例と同様に、タイピング試薬が 10〜300 L収容されており、 ミネラルオイル収容部 16には 20〜300 μ Lのミネラルオイルが収容されている。
[0048] PCR終了液注入部 31は増幅反応部 32で PCR反応を終了した反応液とタイピング 試薬とを混合するためのもので、基板 10aに凹部として形成され、使用前の状態では 空の状態で提供される。
増幅反応部 32は PCR反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を 行なわせるものである。
[0049] 増幅反応部 32の部分の断面を拡大して図 6に示す。図 6は図 5Bの Y— Y線位置で の断面図である。図 6に示されるように、増幅反応部 32の液分注用ポート 34a, 34b はノズル 28の先端形状に対応した形状の開口 36a, 36bをもち、ノズル 28の先端に 密着できるように PDMS (ポリジメチルシロキサン）やシリコーンゴムなどの弾性素材 で構成されている。
[0050] 増幅反応部 32は熱伝導率をよくするためにその部分の基板 10aの下面側が、図 5 C、図 6に示されるように肉厚が薄くなつている。その部分の肉厚は、例えば 0. 2〜0 . 3mmである。
サンプル注入部 12は、この実施例では核酸抽出操作を施して!/ヽな!ヽ生体サンプ ルが注入されるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されな ヽ空の状態で提供 される。
[0051] 図 2A及び図 2Bの実施例と同じぐタイピング試薬収容部 14は複数の多型部位に 対応して調製されたタイピング試薬を収容しており、ミネラルオイル収容部 16は反応 液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルを収容して 、る。
各プローブ配置部 18も図 2A及び図 2Bの実施例と同じぐ複数の多型部位のそれ ぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部 16からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部とな つている。
[0052] 基板 10aの表面は、フィルム 20上力ら、サンプル注入部 12、 PCR終了液注入部 3 1、タイピング試薬収容部 14、ミネラルオイル収容部 16、遺伝子増幅試薬収容部 30 、増幅反応部 32及びプローブ配置部 18を被う大きさの剥離可能なシール材 22で被 われて!/、る。フィルム 20とシール材 22の材質及びその貼りつけ方法は図 2A及び図 2Bの実施例と同じである。
基板 10aも底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の榭脂、例 えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板 10の厚さは l〜2mmである
[0053] この実施例の反応容器の使用方法を示す。
図 7A及び図 7Bに示されるように、使用時にシール材 22が剥がされる。タイピング 試薬収容部 14、ミネラルオイル収容部 16及び遺伝子増幅試薬収容部 30を封止して V、るフィルム 20は剥がされな!/、でそのまま残って!/、る。
サンプノレ注入部 12にサンプノレ 25力ピペット 26などにより 0.5〜2 μ L注入される。 図 2Α及び図 2Βの実施例では、注入されるサンプルは外部で PCR反応により DNA が増幅されたサンプル反応液である力 この実施例で注入されるサンプルは核酸抽 出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。サンプルは核酸抽出操作 を施した生体サンプルであってもよい。サンプル注入後、この反応容器が検出装置 に装着される。
[0054] 検出装置において、図 8Α及び図 8Βに示されるように、ノズル 28力フィルム 20を貫 通して遺伝子増幅試薬収容部 30に挿入されて PCR反応試薬が吸入され、 PCR反 応試薬はそのノズル 28によりサンプル注入部 12に 5〜20 L移送される。サンプル 注入部 12ではノズル 28による吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル反応液 と PCR反応試薬が混合されて PCR反応液となる。
[0055] 次に、図 6Αに示されるように、その PCR反応液がノズル 28により増幅反応部 32へ 注入される。すなわち、ノズル 28が増幅反応部 32の一方のポート 34aに挿入されて その PCR反応液 38が注入され、続いて増幅反応部 32での反応中に PCR反応液 3 8力 S蒸発するのを防ぐために、ポート 34a, 34bにノズノレ 28によりミネヽラノレ才ィノレ 40力 S 注入されてポート 34a, 34bでの PCR反応液 38の表面がミネラルオイル 40で被われ る。
[0056] PCR反応終了後、 PCR反応液がノズル 28により回収される力 このとき回収を容 易にするために、図 6Bに示されるように、増幅反応部 32の一方のポート 34aからミネ ラルオイル 40が注入される。反応終了後の PCR反応液 38aは他方のポート 34bに押 しやられる。そこで、そのノズル 28が挿入され、 PCR反応液 38aがノズル 28に吸入さ れる。ポート 34a, 34bはその開口 36a, 36bの形状がノズル 28の形状に合わせて形 成され、かつ弾性素材で形成されているので、ノズル 28がポート 34a, 34bに密着し て液漏れを防ぎ、 PCR反応液の注入と回収の操作が容易である。
ノズル 28により増幅反応部 32から回収された反応終了後の PCR反応液 38aは PC R終了液注入部 31に移送されて注入される。
[0057] 次に、ノズル 28がフィルム 20を貫通してタイピング試薬収容部 14に挿入されてタイ ビング試薬が吸入され、タイピング試薬はそのノズル 28により PCR終了液注入部 31 に移送されて注入される。 PCR終了液注入部 31ではノズル 28による吸入と吐出が 繰り返されることにより、 PCR反応液とタイピング試薬が混合される。
[0058] その後、 PCR反応液とタイピング試薬との反応液がノズル 28により各プローブ配置 部 18へ 0.5〜4 μ L分注される。各プローブ配置部 18にはノズル 28によりミネラルォ ィル収容部 16からミネラルオイルが分注される。プローブ配置部 18へのミネラルオイ ルの分注は、プローブ配置部 18への反応液の分注前であってもよい。各プローブ配 置部 18ではミネラルオイルが反応液の表面を被 、、検出装置のタイピング反応温度 制御部での加熱を伴なうタイピング反応時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部 18では反応液がプローブと反応して所定の SNPがあればその プローブ力も蛍光が発せられる。蛍光は基板 10の裏面側力も励起光を照射すること により検出する。
[0059] 以下、各反応試薬の組成を示して、本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的 範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
PCR反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献 3の段落 [0046]に記載され ているような、プライマー、 DNAポリメラーゼ及び TaqStart (CLONTECH Laboratorie s社製)を含む反応試薬を使用することができる。また、 PCR反応試薬には AmpDirect (島津製作所製)が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献 3の表 1 に記載されている SNP ID1〜20、配列番号を 1〜40などを使用することができる。
[0060] タイピング試薬としてインべーダ試薬を使用する。そのインべーダ試薬としては、ィ ンベーダーアツセィキット（Third Wave Technology社製）を使用する。例えば、シグナ ルバッファー、フレットプローブ、構造特異的 DNA分解酵素及びアレル特異的プロ ーブを特許文献 3の段落 [0046]に記載されているような濃度に調製されたものであ る。
[0061] 図 9は本発明の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルの SNPを検出する ための簡易型反応容器処理装置の一実施例を示したものである。装置内に上下に 一対のヒートブロック 60と 62が配置されて反応容器装着部を構成しており、本発明 の反応容器 41にサンプルが注入されたものが 5枚平行に下側ヒートブロック 60上に 並べて設置される。これらのヒートブロック 60, 62は、矢印で示される Y方向に移動 することができる。
上側のヒートブロック 62にはノズル 28による液の移送や吸入、吐出の際に蓋が開く ように開閉可能な窓が設けられて 、る。
[0062] 下側のヒートブロック 60は増幅反応部 32の温度を所定の温度サイクルになるように 制御する増幅反応温度制御部と、プローブ配置部 18の温度を DNAとプローブとを 反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部とを備えて!/、る。増幅反応温 度制御部の温度は、例えば 94°C、 55°C及び 72°Cの 3段階にその順に変化させられ 、そのサイクルが繰り返されるように設定されている。タイピング反応温度制御部の温 度は、例えば 63°Cに設定されている。
反応容器 41として図 2A及び図 2Bの実施例のように増幅反応部を備えていないも のを使用する場合には、増幅反応部の温度を制御する増幅反応温度制御部は不要 である。
[0063] またヒータブロック 60の下部には蛍光検出を行なう検出器 64が配置されており、検 出器 64は図の矢印 X方向に移動してプローブ配置部 18からの蛍光を検出する。ヒ 一タブロック 60には蛍光検出のために開口が設けられている。反応容器装着部によ るプローブ配置部 18の Y方向移動と、検出器 64の X方向移動により各ブローブでの 蛍光検出を行なう。
ノズル 28による液の移送や吸入、吐出を行なうために、分注部として送液アーム 66 が設けられており、送液アーム 66はノズル 28を備えている。ノズル 28はその先端に 使い捨て可能なチップ 70が着脱可能に装着される。
[0064] ヒートブロック 60, 62、蛍光検出部 64及び送液アーム 66の動作を制御するために 、それらの近くに制御部 118が配置されている。制御部 118は CPUを備えて、動作 のためのプログラムを保持している。制御部 118はヒートブロック 60, 62により実現さ れるタイピング反応部 110や増幅部 120の温度制御、蛍光検出部 64の検出動作、 及び分注部 112の送液アーム 66の分注動作を制御する。
反応容器 41として図 2A及び図 2Bの反応容器のように遺伝子増幅反応部を備えて V、な 、ものを使用する場合には、遺伝子増幅反応部の温度を制御する増幅部は必 要ではなぐ制御部 118も増幅部の温度制御のための機能を備える必要がな 、。
[0065] 図 10は検出器 64を詳細に示したものである。検出器 64は励起光源として 473nm のレーザ光を発するレーザダイオード (LD)や発光ダイオード (LED) 92を備え、そ のレーザ光を反応容器 41のプローブ配置部の底面に集光して照射する一対のレン ズ 94, 96を備えている。レンズ 94はレーザダイオード 92からのレーザ光を集光して 平行光にするものであり、レンズ 96は平行にされたレーザ光を反応容器 41の底面に 収束させて照射する対物レンズである。対物レンズ 96はまた、反応容器 41から発生 する蛍光を集光するレンズとしても作用する。一対のレンズ 94, 96の間にはダイク口 イツクミラー 98が設けられており、ダイクロイツクミラー 98は励起光を透過させ、蛍光を 反射させるように波長特性が設定されて 、る。ダイクロイツクミラー 98の反射光 (蛍光） の光路上にはさらにダイクロイツクミラー 100が配置されている。ダイクロイツクミラー 1 00は 525nmの光を反射し 605nmの光を透過するように波長特性が設定されて!、る 。ダイクロイツクミラー 100による反射光の光路上には 525nmの蛍光を検出するよう にレンズ 102と光検出器 104が配置され、ダイクロイツクミラー 100による透過光の光 路上には 605nmの蛍光を検出するようにレンズ 106と光検出器 108が配置されてい る。この 2つの検出器 104, 108による 2種類の蛍光検出により、各プローブ配置位置 に固定されたインべーダプローブに対応した SNPの有無と、その SNPがホモ接合体 であるかヘテロ接合体であるかが検知される。標識蛍光体としては、例えば FAM、 R OX、 VIC, TAMRA、 Redmond Redなどを使用することができる。
[0066] 図 10の検出器 64は 1光源による励起光で励起し、 2波長の蛍光を測定するよう〖こ 構成されているが、検出器 64としては 2波長の蛍光測定のために異なる励起波長で 励起できるように 2光源を使用するように構成してもよ ヽ。
[0067] 本発明の診断装置は、闵 12に示されるように、本発明の反 容器のうちの遺伝子 多型診断用 ] ^容器を処理する ] ^容器処 置 200 、ディスク 置やドラム 置などの記憶装置力^なり、特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断 値 記憶したデータベース 202 液晶ディスプレーや CRTな^の表示装置 204 ]^容器処理装置 200により檢出された多型解析結奥に某づいてデータベース 20 2から診断彼 読み出して表示装置 204に表示するコンピュータからなる診断処理装 置 206 備 ている„
産業上の利用可能性
[0068] 本発明は種々の化学反応の測定のほか、例えば遺伝子解析の研究や臨床分野に おいて、種々の自動分析に利用することができ、例えば、人間を初めとして、動物や 植物のゲノム DNAの多型、特に SNP (—塩基多型）を検出することができ、さらにそ の結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係 などの診断のほか、動物や植物の品種判定、感染症診断 (感染菌の型判定)などを 行なうのにも利用することができる。
図面の簡単な説明
[0069] [図 1]本発明を概略的に示すブロック図である。
[図 2A]反応容器の第 1の実施例の正面図である。
[図 2B]反応容器の第 1の実施例の平面図である。
[図 3A]同実施例の反応容器を使用した SNP検出方法の工程の前半部を示す正面 図である。
[図 3B]同実施例の反応容器を使用した SNP検出方法の工程の前半部を示す平面 図である。 [図 4A]同実施例の反応容器を使用した SNP検出方法の工程の後半部を示す正面 図である。
圆 4B]同実施例の反応容器を使用した SNP検出方法の工程の後半部を示す平面 図である。
[図 5A]反応容器の第 2の実施例を示す正面図である。
[図 5B]反応容器の第 2の実施例を示す平面図である。
[図 5C]反応容器の第 2の実施例を示す図 5Bの X— X線位置での拡大断面図である
[図 6A]同実施例での増幅反応部を反応液が注入された状態で図 5Bの Y— Y線位置 での拡大断面図として示す図である。
[図 6B]同実施例での増幅反応部を反応液を回収する状態で図 5Bの Y— Y線位置で の拡大断面図として示す図である。
[図 7A]同実施例の反応容器を使用した SNP検出方法の工程の前半部を示す正面 図である。
圆 7B]同実施例の反応容器を使用した SNP検出方法の工程の前半部を示す平面 図である。
[図 8A]同実施例の反応容器を使用した SNP検出方法の工程の後半部を示す正面 図である。
圆 8B]同実施例の反応容器を使用した SNP検出方法の工程の後半部を示す平面 図である。
圆 9]本発明の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルの SNPを検出するた めの簡易型反応容器処理装置の一実施例を示す概略斜視図である。
圆 10]同検出装置における検出器を示す概略構成図である。
圆 11]本発明が関係することのある SNP検出方法を概略的に示すフローチャート図 である。
「図 121本発明の診断装置を概略的に示すブロック^！であ
符号の説明
2 サンプル 4 PCR反応試薬
6 インべーダ試薬
8 プローブ配置部
10, 10a 基板
12 サンプル注入部
14 タイピング試薬収容部
16 ミネラルオイル収容部
18 プローブ配置部
20 フィルム
22 シール材
28 ノズル
30 遺伝子増幅試薬収容部
31 PCR終了液注入部
32 増幅反応部
34a, 34b 増幅反応部のポ、
36a, 36b ポー卜の開口
41 反応容器
60, 62 ヒー卜ブロック
64 検出器
66 送液アーム
70 チップ
Q0 _反 容器湖
02 データベース
04 _ ^m
06 診断処理装置

Claims

請求の範囲
[1] 平板状の基板に形成されサンプルに反応を起こさせる少なくとも 1つの反応部と、 前記基板に凹部として形成され、反応液よりも比重の低!ヽ不揮発性液体を収容しフ イルムで封止された不揮発性液体収容部と、
を少なくとも備えて!/ヽることを特徴とする反応容器。
[2] 前記基板に凹部として形成され、前記サンプルの反応に使用される試薬を収容しフ イルムで封止された少なくとも 1つの試薬収容部をさらに備えてサンプルの反応用試 薬キットを構成して 、る請求項 1に記載の反応容器。
[3] 前記試薬収容部として複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容 したタイピング試薬収容部を含み、
前記反応部として前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプロ一 ブを個別に保持した複数のプローブ配置部を含み、
遺伝子多型診断用試薬キットを構成している請求項 2に記載の反応容器。
[4] 前記試薬収容部として複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマ 一を含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさらに含み、 前記反応部として前記遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅 反応を行なわせる増幅反応部をさらに含んでいる請求項 3に記載の反応容器。
[5] 前記増幅反応部の液分注用ポートは分注ノズルの先端形状に対応した開口形状を もち、分注ノズルの先端に密着できる弾性素材で構成されて ヽる請求項 4に記載の 反 J心容器。
[6] 前記増幅反応部の基板肉厚が他の部分よりも薄くなつている請求項 4又は 5に記載 の反応容器。
[7] 前記フィルムはノズルで貫通可能なものである請求項 1から 6の 、ずれかに記載の反 J心谷器。
[8] 前記反応部のうち少なくとも前記不揮発性液体が分注されるものはその不揮発性液 体を保持できる凹部となっている請求項 1から 7のいずれかに記載の反応容器。
[9] 前記基板に凹部として形成され、サンプルを注入するためのサンプル注入部をさら に備えて!/、る請求項 1から 8の 、ずれかに記載の反応容器。
[10] 少なくとも前記反応部は、使用前は剥離可能なシール材で被われている請求項 1カゝ ら 9の ヽずれかに記載の反応容器。
[11] 前記不揮発性液体はミネラルオイル、植物油、動物油、シリコーンオイル及びジフエ
-ルエーテル力もなる群力も選ばれた液体である請求項 1から 10のいずれかに記載 の反応容器。
[12] 対象とする多型が一塩基多型である請求項 3から 11の 、ずれかに記載の反応容器
[13] 前記サンプルは核酸抽出操作を施して 、な 、生体サンプルである請求項 8から 12の
V、ずれかに記載の反応容器。
[14] 前記遺伝子増幅試薬は PCR反応試薬である請求項 8から 12のいずれかに記載の 反 J心容器。
[15] 前記タイピング試薬はインべーダ試薬又はタックマン PCR試薬である請求項 3から 1
4の 、ずれかに記載の反応容器。
[16] サンプルに反応を起こさせる反応部、及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体を 収容した不揮発性液体収容部を少なくとも備えた反応容器を装着する反応容器装 着部と、
ノズルによる吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する分注部と、 前記分注部の分注動作を少なくとも制御する制御部と、
を備えた反応容器処理装置。
[17] 前記反応部の温度を制御する反応温度制御部をさらに備え、
前記制御部は前記反応温度制御部の温度制御も行なう請求項 16に記載の反応 容器処理装置。
[18] 前記反応容器はタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部をさらに備え、前記 反応部として複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に 保持した複数のプローブ配置部を備えた遺伝子多型診断用反応容器であり、 前記反応温度制御部として前記プローブ配置部の温度を前記サンプルと前記タイ ビング試薬との反応液を前記プローブと反応させる温度に制御するタイピング反応温 度制御部を備え、 該反応容器処理装置は前記各プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出す る蛍光検出部をさらに備え、
前記制御部は前記タイピング反応温度制御部の温度制御及び前記蛍光検出部の 検出動作も制御する請求項 17に記載の反応容器処理装置。
[19] 前記反応容器は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを 含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさらに備え、前記反応部 として前記遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわ せる増幅反応部をさらに備えた遺伝子多型診断用反応容器であり、
前記反応温度制御部として前記増幅反応部の温度を前記サンプルと遺伝子増幅 試薬との反応液内で DNAを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反 応温度制御部をさらに備え、
前記制御部は前記増幅反応温度制御部の温度制御も行なう請求項 18に記載の 反応容器処理装置。
[20] 前記ノズルは先端に使い捨て可能なチップを着脱可能に装着したものであり、前記 反応容器は液体の収容部がフィルムで封止されており、そのフィルムで封止された状 態で該反応容器処理装置に装着され、前記チップによりそのフィルムを貫通して液 の吸入を行なう請求項 16から 19のいずれかに記載の反応容器処理装置。
[21] 請求項 18から 20の 、ずれかに記載の反応容器処理装置と、
特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値を記憶したデータベース と、 前記反応容器処理装置により検出された多型解析結果に基づいて前記データべ ースから診断値を読み出して前記表示装置に表示する診断処理装置 、を備えた診 断装置。
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