WO2006103215A1 - Verwendung von hydrophobinen zur schmutzabweisenden behandlung von harten oberflächen - Google Patents

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WO2006103215A1
WO2006103215A1 PCT/EP2006/061069 EP2006061069W WO2006103215A1 WO 2006103215 A1 WO2006103215 A1 WO 2006103215A1 EP 2006061069 W EP2006061069 W EP 2006061069W WO 2006103215 A1 WO2006103215 A1 WO 2006103215A1
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WO
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hydrophobin
hydrophobins
cleaning agent
hard
treatment
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PCT/EP2006/061069
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Heike Becker
Claus Bollschweiler
Thomas Subkowski
Ulf Baus
Hans-Georg Lemaire
Marvin Karos
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
    • C09D5/16—Antifouling paints; Underwater paints
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Definitions

  • hydrophobins for dirt-repellent treatment of hard surfaces
  • the present invention relates to the use of hydrophobins for stain-resistant treatment of hard surfaces, in particular in combination with surface cleaning, a hard surface stain-resistant treatment, hard surface cleaners and hard surfaces having a stain-resistant coating comprising hydrophobins.
  • These may be permanent, dirt-repellent coatings, for example coatings that are based on the lotus effect.
  • Such a temporary soil-repelling effect can be achieved, for example, by substances in a detergent formulation which are applied during cleaning of the surface.
  • Essential areas of application of such cleaners are household applications, such as cleaners for the kitchen or sanitary sector, but also industrial applications, such as cleaner for car washing.
  • EP-A 467 472 discloses a composition for increasing the hydrophilicity of hard surfaces, for example household surfaces, in order to achieve easier cleaning in subsequent cleaning steps.
  • the formulation contains a water-soluble, ionic or nonionic polymer, for example a cationic polymer with quaternized ammonium alkyl methacrylate units.
  • the disclosed detergent formulations contain from 0.02 to 5% by weight of the polymer.
  • WO 03/002620 discloses the use of (meth) acrylic acid dialkylaminoalkyl esters as soil-release polymers for hard surfaces, for example pebble floors or stainless steel surfaces.
  • the disclosed detergent formulations contain from 0.1% to 5% by weight of the polymer.
  • DE-A 100 61 897 discloses cleaning agents which contain hydrophilic, silicate-containing particles which lead to an improved soil release while at the same time reducing redeposition.
  • the particles deposit on the surface of the substrates to be cleaned and thus change the surface properties.
  • Hydrophobins are small proteins of about 100 to 150 amino acids, which are characteristic of filamentous fungi, for example Schizophyllum commune. They usually have 8 cysteine units.
  • Hydrophobins have a marked affinity for interfaces and are therefore suitable for coating surfaces.
  • Teflon can be coated by means of hydrophobins to obtain a hydrophilic surface.
  • Hydrophobins can be isolated from natural sources. However, it is also possible to synthesize non-naturally occurring hydrophobins by means of chemical and / or biotechnological production processes. Our earlier application DE 102005007480.4 discloses a preparation process for hydrophobins which are not found in nature.
  • WO 96/41882 proposes the use of hydrophobins as emulsifiers, thickeners, surface-active substances, for hydrophilicizing hydrophobic surfaces, for improving the water resistance of hydrophilic substrates, for producing oil-in-water emulsions or for water-in-oil emulsions. Furthermore, pharmaceutical applications such as the production of ointments or creams and cosmetic applications such as skin protection or the production of hair shampoos or hair rinses are proposed.
  • EP-A 1 252 516 discloses the coating of windows, contact lenses, biosensors, medical devices, containers for carrying out experiments or for storage, hull fuming, solid particles or frame or body of passenger cars with a solution containing hydrophobins at a temperature of 30 to 80 0 C.
  • WO 03/53383 discloses the use of hydrophobins for treating keratin materials in cosmetic applications.
  • WO 03/10331 discloses a hydrophobin-coated sensor, for example a measuring electrode, to which non-covalently further substances, e.g. electroactive substances, antibodies or enzymes are bound.
  • the soil-repellent treatment is carried out in combination with a cleaning of the surface.
  • the invention in a second aspect, relates to a method for stain resistant hard surface treatment comprising contacting the surface with a composition comprising at least one hydrophobin and at least one solvent.
  • the invention in a third aspect, relates to a cleaning agent for hard surfaces, which comprises at least one hydrophobin, at least one surfactant and at least one solvent.
  • the invention in a fourth aspect, relates to hard surfaces comprising a hydrophobin-containing, soil-repellent coating.
  • hard surfaces is known to those skilled in the art and is not or only slightly compressible surfaces, in particular smooth surfaces, for example surfaces of glass, ceramics, metals, such as stainless steel or brass, enamel, plastic and / or.
  • painted surfaces include the surface of painted automotive bodies or the surface of household appliances, and the hard surfaces may be, in particular, typical household surfaces, such as the surface of tiles, floors, fixtures, sinks, etc.
  • Dirt-repellent is known to the person skilled in the art, which prevents or prevents their contamination by means of a dirt-repellent treatment of a surface at least more difficult and / or facilitates the detachment of dirt from the surface.
  • Dirt is in a known manner to all types of unwanted contamination of hard surfaces with solid and / or liquid substances.
  • Examples of dirt include fats, oils, egg whites, leftovers, dust or soil.
  • Contaminations can also be calcium deposits, such as dried-on traces of water that form due to the hardness of the water.
  • Other examples include residues of personal care cleaners and conditioners, or insoluble lime soaps which may form from such cleansing and conditioning agents associated with water hardness, and which may be deposited on hard surfaces such as sinks, shower trays or bathtubs.
  • At least one hydrophobin is used for the dirt-repellent treatment of the hard surfaces. Only one hydrophobin or a mixture of several different hydrophobins can be used.
  • hydrophobins in the context of this invention is to be understood below as meaning polypeptides of the general structural formula (I)
  • X is selected for each of the 20 naturally occurring amino acids (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, Glu, GIy) can stand.
  • X may be the same or different.
  • the indices standing at X each represent the number of amino acids
  • C stands for cysteine, alanine, serine, glycine, methionine or threonine, wherein at least four of the amino acids denoted by C represent cysteine
  • the indices n and m are independent of each other for natural numbers of 0 and 500, preferably 15 to 300.
  • the polypetides according to formula (I) are further characterized by the property that at room temperature after coating a glass surface, they increase the contact angle of a water droplet of at least 20 °, preferably at least 25 °, more preferably at least 30 °, and most preferably at least 35 °, in each case compared with the contact angle of a water droplet of the same size with the uncoated glass surface.
  • the amino acids designated C 1 to C 8 are preferably cysteines; but they can also be replaced by other amino acids of similar space filling, preferably by alanine, serine, threonine, methionine or glycine. However, at least four, preferably at least 5, more preferably at least 6 and in particular at least 7, of the positions C 1 to C 8 should consist of cysteines. Cysteines can either be reduced in the proteins according to the invention or can be mixed with one another. train sulfide bridges. Particularly preferred is the intramolecular formation of CC bridges, in particular those with at least one, preferably 2, more preferably 3 and most preferably 4 intramolecular disulfide bridges. In the exchange of cysteines described above by amino acids of similar space filling, it is advantageous to replace those C positions in pairs, which can form intramolecular disulfide bridges with one another.
  • cysteines, serines, alanines, glycines, methionines or threonines are also used in the positions indicated by X, the numbering of the individual C positions in the general formulas may change accordingly.
  • X, C and the indices standing at X have the above meaning
  • the subscripts n and m are numbers between 0 and 300
  • the proteins are further characterized by the above-mentioned contact angle change.
  • X, C and the indices standing at X have the above meaning
  • the indices n and m are numbers between 0 and 200
  • the proteins continue to be characterized by the contact angle change mentioned above, and at least 6 of the C named amino acids is cysteine. Most preferably, all amino acids C are cysteine.
  • radicals X n and X m may be peptide sequences that are naturally also linked to a hydrophobin. However, one or both residues may also be peptide sequences that are not naturally linked to a hydrophobin. Including such radicals X N and / or X m are to be understood, in which a naturally occurring in a hydrophobin peptide sequence is extended tidsequenz by a non-naturally occurring in a hydrophobin.
  • X n and / or X m are naturally non-hydrophobic peptide sequences, such sequences are generally at least 20, preferably at least 35, more preferably at least 50, and most preferably at least 100 amino acids in length.
  • Remainder not linked to a hydrophobin should also be referred to below as a fusion partner. This is to say that the proteins consist of a hydrophobin part and a fusion partner part, which in nature do not coexist in this form.
  • the fusion partner portion can be selected from a variety of proteins. It is also possible to link a plurality of fusion partners with a hydrophobin part, for example at the amino terminus (X n ) and at the carboxy terminus (X m ) of the hydrophobin part. However, it is also possible, for example, to link two fusion partners with a position (X n or X m ) of the protein according to the invention.
  • fusion partners are polypeptides that occur naturally in microorganisms, in particular in E. coli or Bacillus subtilis.
  • fusion partners are the sequences yaad (SEQ ID NO: 15 and 16), yaae (SEQ ID NO: 17 and 18) and thioredoxin.
  • fragments or derivatives of said sequences which comprise only a part, preferably 70-99%, particularly preferably 80-98% of said sequences, or in which individual amino acids or nucleotides are altered relative to said sequence.
  • proteins used according to the invention may also be modified in their polypeptide sequence, for example by glycosylation, acetylation or else by chemical crosslinking, for example with glutaraldehyde.
  • One property of the proteins used in the invention is the change in surface properties when the surfaces are coated with the proteins.
  • the change in the surface properties can be determined experimentally by measuring the contact angle of a water drop before and after coating a surface with the protein and determining the difference between the two measurements.
  • the implementation of contact angle measurements is known in principle to the person skilled in the art.
  • the exact experimental conditions for measuring the contact angle are shown in the experimental section.
  • the proteins used according to the invention have the property of increasing the contact angle of a water drop on a glass surface by at least 20 °, preferably at least 25 °, particularly preferably at least 30 °.
  • a comparison of the amino acid sequences shows that the length of the region between cysteine C 3 and C 4 is significantly shorter in class II hydrophobins than in class I hydrophobins. Class II hydrophobins also have more charged amino acids than class I.
  • hydrophobins for carrying out the present invention are the hydrophobins of the type dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basF, basf2, which are structurally characterized in the following sequence listing. It may also be just parts or derivatives thereof. It is also possible to link together a plurality of hydrophobins, preferably 2 or 3, of the same or different structure and to link them to a corresponding suitable polypeptide sequence which is not naturally associated with a hydrophobin.
  • fusion proteins having the polypeptide sequences shown in SEQ ID NO: 20, 22, 24 and the nucleic acid sequences coding for them, in particular the sequences according to SEQ ID NO: 19, 21, 23.
  • proteins which are starting from the sequences shown in SEQ ID NO. 20, 22 or 24 represented by exchange, insertion or deletion of at least one, up to 10, preferably 5, more preferably 5% of all amino acids, and still have at least 50% of the biological property of the starting proteins are particularly preferred embodiments.
  • the biological property of the proteins is understood to mean the already described change in the contact angle by at least 20 °.
  • polypeptides used according to the invention can be prepared chemically by known methods of peptide synthesis, for example by solid-phase synthesis according to Merri- field.
  • Naturally occurring hydrophobins can be isolated from natural sources by suitable methods. As an example, let Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) or WO 96/41882.
  • fusion proteins can preferably be effected by genetic engineering processes in which a nucleic acid sequence coding for the fusion partner and a hydrophobin part, in particular a DNA sequence, are combined in such a way that that the desired protein is produced in a host organism by gene expression of the combined nucleic acid sequence.
  • a nucleic acid sequence coding for the fusion partner and a hydrophobin part, in particular a DNA sequence are combined in such a way that that the desired protein is produced in a host organism by gene expression of the combined nucleic acid sequence.
  • Suitable host organisms (production organisms) for said production process may be prokaryotes (including archaea) or eukaryotes, especially bacteria including halobacteria and methanococci, fungi, insect cells, plant cells and mammalian cells, more preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacilli, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (or related cells) and others.
  • prokaryotes including archaea
  • eukaryotes especially bacteria including halobacteria and methanococci, fungi, insect cells, plant cells and mammalian cells, more preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Asperg
  • expression constructs obtained under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences a nucleic acid sequence coding for a polypeptide used according to the invention, as well as vectors comprising at least one of these expression constructs for the production of hydrophobins can be used.
  • constructs employed include a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3'-downstream, and optionally other common regulatory elements, each operably linked to the coding sequence.
  • “Operational linkage” is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended in the expression of the coding sequence.
  • operably linked sequences are targeting sequences as well as enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are for. As described in Goeddel, Gene Expression Technolgy: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more of the aforementioned "enhancer" sequences operably linked to the promoter allow increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • the nucleic acids may be contained in one or more copies in the construct.
  • the construct may also contain further markers such as antibiotic resistance or auxotrophic complementing genes, optionally for selection on the construct.
  • Advantageous regulatory sequences for the method are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq T7, T5, T3, gal , trc, ara, rhaP (rhaPBAD) SP6, lambda PR or imlambda P promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • Further advantageous regulatory sequences are contained, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1.MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • the nucleic acid construct, for expression in a host organism is advantageously inserted into a vector, such as a plasmid or a phage, which allows for optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as a plasmid or a phage
  • all other vectors known to the person skilled in the art ie, z.
  • viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, Transposons.lS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA, as well as the Agrobacterium system to understand.
  • vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally. These vectors represent a further embodiment of the invention.
  • Suitable plasmids are described, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-III "3-B1, tgt11 or pBdCI, in Streptomycespl J101, pIJ364, pIJ702 or pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 or pBD214, in Corynebacterium for pSA77 or pAJ667, in fungi pALS1, pIL12 or pBB116, in yeasts 2alpha, pAG-1,
  • the nucleic acid construct additionally contains 3'- and / or 5'-terminal regulatory sequences for the expression of the further genes contained. tion of expression, which are selected depending on the selected host organism and gene or genes for optimal expression.
  • genes and protein expression are intended to allow the targeted expression of genes and protein expression. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors may preferably have a positive effect on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • the vector containing the nucleic acid construct or the nucleic acid can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA may consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or the nucleic acid.
  • An expression cassette is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • Common recombination and cloning techniques are used, such as those described, for example, in T. Maniatis, EFFritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989) and in TJ Silhavy, ML Berman and LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Colard Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1984) and Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is inserted for expression in a suitable host organism, advantageously into a host-specific vector which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and may be taken, for example, from "Cloning Vectors" (Pouwels PH et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). With the help of the vectors recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector and can be used to produce the polypeptides used in the invention.
  • the recombinant constructs described above are introduced into a suitable host system and expressed.
  • Homologously recombined microorganisms can also be produced.
  • a vector is prepared which contains at least a portion of a gene or a coding sequence to be used according to the invention, wherein optionally at least one amino acid deletion, addition or substitution has been introduced to alter the sequence, e.g. B. functionally disrupted ("knockout" - vector).
  • the introduced sequence can, for. Also be a homologue from a related microorganism or be derived from a mammalian, yeast or insect source.
  • the vector used for homologous recombination may be designed such that the endogenous gene is mutated or otherwise altered upon homologous recombination, but still encodes the functional protein (eg, the upstream regulatory region may be altered such that thereby the expression of the endogenous protein is changed).
  • the altered portion of the gene used according to the invention is in the homologous recombination vector.
  • suitable vectors for homologous recombination is e.g. As described in Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid or nucleic acid construct used according to the invention.
  • microorganisms such as bacteria, fungi or yeast are used as host organisms.
  • Gram-positive or gram-negative bacteria preferably bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae, particularly preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium or Rhodococcus are advantageously used .
  • the organisms used in the production process for fusion proteins are grown or bred, depending on the host organism, in a manner known to those skilled in the art.
  • Microorganisms are usually stored in a liquid medium containing a carbon source, usually in the form of sugars, a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese and magnesium salts and, where appropriate, vitamins, at temperatures between 0 undiOO 0 C, preferably between 10 to 60 0 C attracted to oxygen.
  • the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is, regulated during the cultivation or not.
  • the cultivation can be done batchwise, semi-batchwise or continuously. Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • the enzymes may be isolated from the organisms by the method described in the Examples or used as crude extract for the reaction.
  • the polypeptides or functional, biologically active fragments thereof used according to the invention can be prepared by means of a recombinant process in which a polypeptide-producing microorganism is cultured, optionally the expression of the polypeptides induced and isolated from the culture.
  • the polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • the recombinant microorganism can be cultured and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 0 C and a pH of 6 to 9. Specifically, suitable culturing conditions are described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted if the polypeptides are not secreted into the culture medium and the product recovered from the lysate by known protein isolation techniques.
  • the cells can optionally by high-frequency ultrasound, by high pressure, such as. B. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods are digested.
  • Purification of the polypeptides can be achieved by known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, and by other conventional methods, such as ultrafiltration, crystallization, salting out , Dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, FG, Biochemische Harvey Methoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • vector systems or oligonucleotides for the isolation of the recombinant protein, which extend the cDNA by certain nucleotide sequences and thus code for altered polypeptides or fusion proteins which serve, for example, a simpler purification.
  • suitable modifications include so-called "tags" as anchors, such as the modification known as hexa-histidine anchors, or epitopes that can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988 , Antibodies: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor (NY) Press).
  • Suitable tags include HA, calmodulin BD, GST, MBD; Chitin-BD, Steptavidin-BD-Avi-Tag, Flag-Tag, T7 etc.
  • anchors can be used to attach the proteins to a solid support, such as.
  • a polymer matrix serve, which may be filled for example in a chromatography column, or may be used on a microtiter plate or other carrier.
  • the corresponding purification protocols are available from the commercial affinity tag providers.
  • the proteins prepared as described can be used both directly as fusion proteins and after cleavage and separation of the fusion partner as "pure" hydrophobins.
  • a potential cleavage site (specific recognition site for proteases) in the fusion protein between the hydrophobin part and the fusion partner part.
  • Suitable cleavage sites are, in particular, those peptide sequences which otherwise do not occur in the hydrophobin part or in the fusion partner part, which can be easily determined with bioinformatic tools.
  • Particularly suitable are, for example, BrCN cleavage on methionine, or protease-mediated cleavage with factor Xa, enterokinase, thrombin, TEV cleavage (Tobacca etch virus protease).
  • the hydrophobins can be used in bulk.
  • the hydrophobins are preferably used as formulations or compositions in at least one suitable solvent.
  • hydrophobins for carrying out the invention are not limited. It is possible to use one hydrophobin or else several different ones. The skilled person makes a suitable choice. For example, fusion proteins such as yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) or yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21) can be used.
  • the solvents for formulations may be water and / or organic solvents. Of course, solvent mixtures can also be used.
  • the type of solvent depends on the hydrophobin, the type of acting surface and the application and will be selected by the expert. For household applications, water or aqueous formulations are generally preferred. In industrial applications, both aqueous, predominantly aqueous and non-aqueous formulations are suitable.
  • the solvent is preferably water or mixtures of water and water-miscible organic solvents.
  • organic solvents include water-miscible monohydric or polyhydric alcohols, such as, for example, methanol, ethanol, n-propanol, i-propanol, ethylene glycol, propylene glycol or glycerol.
  • it may also be ether alcohols.
  • examples include monoalkyl ethers of (poly) ethylene or (poly) propylene glycols such as ethylene glycol monobutyl ether.
  • the type and amount of water-soluble and organic solvents are chosen by the person skilled in the art.
  • aqueous mixtures contain at least 80% by weight of water with respect to the sum of all solvents.
  • Preferred solvents besides water are alcohols.
  • the aqueous solutions of the hydrophobins obtained in the synthesis, isolation and / or purification of the hydrophobins can preferably be used. Depending on their purity, they may also contain residues of auxiliaries from the synthesis.
  • the hydrophobins can also initially be isolated as a substance, for example by freeze-drying, and formulated in a second step.
  • the amount of hydrophobins in the formulation may be determined by those skilled in the art according to the nature of the surface and / or application. But there are already relatively small amounts sufficient to achieve a dirt-repellent effect. An amount of from 0.0001 to 1% by weight with respect to the sum of all constituents of the formulation has proven useful, without the invention being restricted to this range. The amount is preferably from 0.0005 to 0.5% by weight and more preferably from 0.001 to 0.1% by weight.
  • the composition used is preferably a cleaning agent, for example glass cleaner, floor cleaner, all-purpose cleaner, bathroom cleaner, rinse aid, dishwashing detergent for hand or machine cleaning of dishes, machine cleaners, metal degreasers, high-pressure cleaners, alkaline cleaners, acid cleaners, top degreasers or dairy cleaners ,
  • the cleaning agent according to the invention comprises in addition to a solvent and at least one hydrophobin in a manner known in principle one or more surfactants in effective amounts.
  • compositions may also be hard surface pretreatment or post-treatment agents, in particular glass, ceramics or floors.
  • the surfactants may be anionic, nonionic, amphoteric and / or cationic surfactants. Such surfactants and their particular preferred purpose are known in principle to those skilled in the art.
  • anionic surfactants include fatty alcohol sulfates, alkyl ether sulfates, alkanesulfonates, alkylbenzenesulfonates or alkyl phosphates.
  • the free acids or salts thereof can be used.
  • nonionic surfactants include alkoxylated C 8 -C 22 alcohols, such as fatty alcohol alkoxylates or oxo alcohol alkoxylates, alkylphenol ethoxylates having C 6 -C 14 -alkyl chains and from 5 to 30 moles of ethylene oxide units, alkyl polyglucosides having from 8 to 22 in the alkyl chain, alkylamine alkoxylates or alkylamide ethoxylates.
  • alkoxylated C 8 -C 22 alcohols such as fatty alcohol alkoxylates or oxo alcohol alkoxylates, alkylphenol ethoxylates having C 6 -C 14 -alkyl chains and from 5 to 30 moles of ethylene oxide units, alkyl polyglucosides having from 8 to 22 in the alkyl chain, alkylamine alkoxylates or alkylamide ethoxylates.
  • amphoteric surfactants include alkyl betaines, alkyl amide betaines, aminopropionates, aminoglycinates or amphoteric imidazolium compounds.
  • cationic surfactants include substituted or unsubstituted, geradketti- ge or branched quaternary ammonium salts, for example C 8 - 6 -Dialkyldimethylammonium- halides, imidazolium dialkoxydimethylammonium halides or with all, long chain alkyl tigern.
  • the formulation may optionally further comprise further components, for example additives and / or auxiliaries.
  • additives and / or auxiliaries include acids or bases, for example, carboxylic acids or ammonia, buffer systems, polymers, inorganic particles such as SiO 2 or silicates, dyes, fragrances or biocides.
  • Further examples of additives are listed in DE-A 101 60 993, in particular Sections [0074] to [0131]. The person skilled in the art makes a suitable choice with regard to the type and amount of additional components, depending on the application.
  • the hard surface antisoiling treatment is accomplished by contacting the hard surface with a composition comprising at least one hydrophobin and at least one solvent.
  • the "contacting" depends on the nature of the article, for example, by spraying, rinsing or wiping the surface with the composition, or by dipping the entire article in the formulation, which is naturally only for non-installed objects
  • the duration of the treatment is determined by a specialist and may take from a few seconds to several hours, after which the surface can be rinsed to remove excess treatment solution, for example with water.
  • the antisoiling treatment may be particularly advantageously used in combination with a cleaning, i. take place in the course of the actual cleaning process itself.
  • a cleaning agent is used which, as described above, comprises at least one hydrophobin, at least one surfactant and at least one solvent.
  • the treatment can be carried out at temperatures below room temperature, can be carried out at room temperature or at elevated temperatures, for example at 20 to 100 ° C, preferably 20 to 60 0 C.
  • the treatment at temperatures of not more than 30 0 C is performed, in particular 20 to 30 0 C.
  • the treated surface After treating with the composition, the treated surface is dried. Drying of the treated surface can, as it were, be done at room temperature, or it can be dried at elevated temperatures.
  • the treatment and optionally the drying of the surface may be followed by a thermal aftertreatment of the surface at elevated temperatures, for example at temperatures of up to 120.degree.
  • the thermal aftertreatment can of course also be combined with the drying.
  • the temperatures are in a thermal post-treatment 30 to 100 ° C, particularly preferably 40 to 80 0 C and for example 50 to 70 0 C.
  • the duration of treatment will be determined by the skilled man, for example it may be from 1 min to 10 h.
  • a hard surface which has a dirt-repellent coating comprising at least one hydrophobin.
  • the coating is usually at least one monomolecular layer of the hydrophobin on the surface.
  • the antisoiling effect can be determined by methods known in the art, for example by comparing the removability of soil by rinsing with water from an untreated and a hydrophobin-treated surface.
  • the hydrophobins have a clear effect even in small amounts. Already the treatment with a composition containing only 0.01% by weight of hydrophobins leads to a significantly improved soil release.
  • the inventive, dirt-repellent treatment is particularly advantageous for ceramic surfaces, such as tiles.
  • the treatment can also achieve a clear hydrophobization of the surface. This is a further advantage, especially in damp rooms, such as bathrooms.
  • Oligonucleotides Hal570 and Hal571 were used to perform a polymerase chain reaction.
  • the PCR fragment obtained contained the coding sequence of the gene yaaD / yaaE from Bacillus subtilis, and at the ends in each case an NcoI or BglII restriction cleavage site.
  • the PCR fragment was purified and cut with the restriction endonucleases NcoI and BglII.
  • This DNA fragment was used as an insert and cloned into the vector pQE60 from Qiagen, previously linearized with the restriction endonucleases NcoI and BglI.
  • the resulting vectors pQE60YAAD # 2 / pQE60YaaE # 5 can be used to express proteins consisting of, YAAD :: HIS 6 and YAAE :: HIS 6 , respectively.
  • Hal570 gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
  • Hal571 gcagatctccagccgcgttcttgcatac
  • Hal572 ggccatgggattaacaataggtgtactagg
  • Hal573 gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
  • the oligonucleotides KaM 416 and KaM 417 Using the oligonucleotides KaM 416 and KaM 417, a polymerase chain reaction was carried out.
  • the template DNA used was genomic DNA of the mold Aspergillus nidulans.
  • the resulting PCR fragment contained the coding sequence of the hydrophobin gene dewA and an N-terminal factor Xa proteinase cleavage site.
  • the PCR fragment was purified and digested with the restriction endonuclease se BamHI cut. This DNA fragment was used as insitu and cloned into the vector pQE60YAAD # 2 previously linearized with the restriction endonuclease BglII.
  • the resulting vector # 508 can be used to express a fusion protein consisting of, YAAD :: Xa :: dewA :: HIS 6 .
  • KaM416 GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
  • KaM417 CCCGTAG CTAGTG G ATCCATTG AAGG CCG CATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
  • plasmid # 513 The cloning of plasmid # 513 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 434 and KaM 435.
  • KaM434 GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
  • plasmid # 507 The cloning of plasmid # 507 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG C
  • Plasmid # 506 The cloning of plasmid # 506 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG
  • Plasmid # 526 was analogous to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM464 and KaM465.
  • the template DNA used was Schyzophyllum commune cDNA (see Appendix).
  • KaM464 CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: G CTAACAG ATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
  • 100 g cell pellet (100-500 mg hydrophobin) are made up to 200 ml total volume with 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5 and resuspended.
  • the suspension is treated with an Ultraturrax type T25 (Janke and Kunkel, IKA-Labortechnik) for 10 minutes and then for 1 hour at room temperature with 500 units of benzonase (Merck, Darmstadt, Order No. 1.01697.0001) to break down the nucleic acids incubated.
  • filter with a glass cartridge P1.
  • two homogenizer runs are carried out at 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.).
  • the homogenate is centrifuged (Sorvall RC-5B GSA rotor, 250 ml centrifuge tube, 60 minutes, 4 0 C, 12,000 rpm, 23,000 g), the supernatant placed on ice and the pellet resuspended in 100 ml sodium phosphate buffer, pH 7.5, resuspended , Centrifugation and resuspension are repeated 3 times with the sodium phosphate buffer containing 1% SDS at the third repetition.
  • 50 ml of the hydrophobin-containing supernatant are applied to a 50 ml nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 column (Amersham) which has been equilibrated with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • the column is washed with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer and the hydrophobin is then eluted with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer containing 200 mM imidazole. To remove the imidazole, the solution is dialyzed against 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • Figure 1 shows the purification of the prepared hydrophobin
  • Lanes 3 - 5 OD 280 maxima of the elution fractions
  • the hydrophobin of Figure 1 has a molecular weight of about 53 kD.
  • the smaller bands partially represent degradation products of the hydrophobin.
  • the contact angle measurement was performed on a device Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002). The measurement was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • a solution of the fusion protein yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) prepared according to Example 8 was used in water.
  • Ceramic tile glossy white, 10 cm x 15 cm (Novocker), wiped with ethanol and water.
  • aqueous hydrophobin solution having a concentration of 100 ⁇ g / ml was dropped (1.3 ⁇ m hydrophobin / cm 2 ) and gently rubbed with a cloth so that the entire surface was covered. The tile was then dried lying for 24 h in air.
  • the tile was then rinsed with water and placed in a beaker of water for 3 ⁇ 10 min. Fresh water was used for each rinse. The tile was then dried standing in air. Contact angle measurement and dirt repellent effect
  • the tiles were then rinsed 3 times with 500 ml each of water. While the dirt did not detach from the untreated surface, a partial removal of soil from the hydrophobin-pretreated tile was observed.

Abstract

Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen, insbesondere in Kombination mit einer Reinigung der Oberfläche, Verfahren zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen, Reinigungsmittel für harte Oberflächen sowie harte Oberflächen mit einer schmutzabweisenden, Hydrophobine umfassenden Beschichtung.

Description

Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzab- weisenden Behandlung von harten Oberflächen, insbesondere in Kombination mit einer Reinigung der Oberfläche, ein Verfahren zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen, Reinigungsmittel für harte Oberflächen sowie harte Oberflächen mit einer schmutzabweisenden, Hydrophobine umfassenden Beschichtung.
Es ist bekannt, harte Oberflächen, wie beispielsweise Glas, Keramik oder Fußböden mit schmutzabweisenden Beschichtungen zu versehen. Diese Ausrüstungen sollen die Schmutzhaftung vermindern, die Verschmutzung von Oberflächen zumindest erschweren und nachfolgende Reinigungen erleichtern. So sollen beispielsweise Fette, Öle oder Kalkrückstände leichter ablösbar sein, oder es soll das Auftreten eingetrockneter Wasserspuren beim Ablaufen von Wasser vermieden werden.
Hierbei kann es sich um permanente, schmutzabweisende Beschichtungen, beispielsweise um dem Lotuseffekt nachempfundene Beschichtungen handeln.
Es kann sich aber auch um einen temporären Schutz handeln. Ein derartiger, temporärer schmutzabweisender Effekt kann beispielsweise durch Substanzen in einer Reinigerformulierung erreicht werden, welche beim Reinigen der Oberfläche aufgetragen werden. Wesentliche Anwendungsgebiete derartiger Reiniger sind Haushaltsanwendungen, wie Reiniger für den Küchen- oder Sanitärbereich, aber auch industrielle An- Wendungen, wie beispielsweise Reiniger für die Autowäsche.
EP-A 467 472 offenbart eine Zusammensetzung zur Erhöhung der Hydrophilie von harten Oberflächen, beispielsweise Oberflächen im Haushalt, um ein erleichtertes Reinigen in nachfolgenden Reinigungsschritten zu erreichen. Die Formulierung enthält ein wasserlösliches, ionisches oder nichtionisches Polymer, beispielsweise ein kationisches Polymer mit quaternisierten Ammoniumalkylmethacrylat-Einheiten. Die offenbarten Reinigerformulierungen enthalten 0,02 bis 5 Gew. % des Polymeren.
WO 03/002620 offenbart die Verwendung von (Meth)acrylsäuredialkylaminoalkylestern als Soil-Release-Polymere für harte Oberflächen, beispielsweise Feinsteinböden oder Edelstahloberflächen. Die offenbarten Reinigerformulierungen enthalten 0,1 bis 5 Gew. % des Polymeren.
DE-A 100 61 897 offenbart Reinigungsmittel, welche hydrophile, silikathaltige Partikel enthalten, die zu einer verbesserten Schmutzablösung bei gleichzeitiger Verringerung der Wiederanschmutzung führen. Die Partikel lagern sich auf der Oberfläche der zu reinigenden Substrate an und verändern so die Oberflächeneigenschaften. Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteristisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf.
Hydrophobine weisen eine ausgeprägte Affinität zu Grenzflächen auf und eignen sich daher zur Beschichtung von Oberflächen. So lässt sich beispielsweise Teflon mittels Hydrophobinen unter Erhalt einer hydrophilen Oberfläche beschichten.
Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Es können aber auch natürlich nicht vorkommende Hydrophobine mittels chemischer und/oder biotechnologischer Herstellverfahren synthetisiert werden. Unsere ältere Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart ein Herstellverfahren für Hydrophobine, die nicht in der Natur vorkommen.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen vorgeschlagen worden.
WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Ver- besserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-inWasser-Emulsionen oder von Wasser-in-ÖI-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen.
EP-A 1 252 516 offenbart die Beschichtung von Fenstern, Kontaktlinsen, Biosensoren, medizinischen Vorrichtungen, Behältern zur Durchführung von Versuchen oder zur Lagerung, Schiffrümpfen, festen Teilchen oder Rahmen oder Karosserie von Personenkraftwagen mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 800C.
WO 03/53383 offenbart die Verwendung von Hydrophobinen zum Behandeln von Ke- ratin-Materialien in kosmetischen Anwendungen.
WO 03/10331 offenbart einen mit Hydrophobin beschichteten Sensor, beispielsweise eine Messelektrode, an den nicht kovalent weitere Substanzen, z.B. elektroaktive Substanzen, Antikörper oder Enzyme gebunden sind.
Keine der zitierten Schriften offenbart die Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen. Aufgabe der Erfindung war es, neuartige Techniken zur Schmutzabweisung bereit zu stellen.
Dementsprechend wurde die Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisen- den Behandlung harter Oberflächen gefunden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die schmutzabweisende Behandlung in Kombination mit einer Reinigung der Oberfläche vorgenommen.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen, bei dem man die Oberfläche mit einer Zusammensetzung umfassend mindestens ein Hydrophobin sowie mindestens ein Lösemittel in Kontakt bringt.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Reinigungsmittel für harte Oberflä- chen, welches mindestens ein Hydrophobin, mindestens ein Tensid sowie mindestens ein Lösemittel umfasst.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung harte Oberflächen, welche eine Hydrophobine umfassende, schmutzabweisende Beschichtung aufweisen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass schon äußerst geringe Mengen von Hydrophobinen zu einer wirksamen, schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen ausreichend sind.
Zu der Erfindung ist im Einzelnen das Folgende auszuführen:
Der Begriff „harte Oberflächen" ist dem Fachmann bekannt. Es handelt sich um nicht oder nur in geringem Maße kompressible Oberflächen, insbesondere um glatte Oberflächen, zum Beispiel Oberflächen aus Glas, Keramik, Metallen, wie beispielsweise Edelstahl oder Messing, Emaille, Kunststoff und/oder um lackierte Oberflächen. Beispiele lackierter Oberflächen umfassen die Oberfläche von lackierten Automobilkarosserien oder die Oberfläche von Haushaltsgeräten. Bei den harten Oberflächen kann es sich insbesondere um typische, im Haushalt vorkommende Oberflächen handeln, wie beispielsweise die Oberfläche von Fliesen, Fußböden, Armaturen, Waschbecken, Duschwannen, Badwannen, Toiletten, Duschkabinen, Badezimmermöbeln, Küchenmöbeln wie Tischen, Stühlen, Schränken, Arbeitsflächen oder sonstigen Möbeln, Spiegeln, Fenstern, Geschirr, Besteck, Gläsern, Porzellangegenständen oder die Oberflächen von Haushaltsgeräten wie Waschmaschinen, Geschirrspülmaschinen, Herde oder Dunstabzugshauben.
Der Begriff „schmutzabweisend" ist dem Fachmann bekannt. Mittels einer schmutzabweisenden Behandlung einer Oberfläche wird deren Verschmutzung verhindert oder zumindest erschwert und/oder die Ablösung von Schmutz von der Oberfläche erleichtert. Bei Schmutz handelt es sich in bekannter Art und Weise um alle Arten unerwünschter Kontamination von harten Oberflächen mit festen und/oder flüssigen Stoffen. Beispiele von Schmutz umfassen Fette, Öle, Eiweiße, Speisereste, Staub oder Erde. Bei Verschmutzungen kann es sich auch um Kalkablagerungen wie beispielsweise eingetrocknete Wasserspuren handeln, die sich aufgrund der Wasserhärte bilden. Weitere Beispiele umfassen Reste von Reinigungs- und Pflegemitteln zur Körperpflege oder auch unlösliche Kalkseifen, die sich aus derartigen Reinigungs- und Pflegemitteln in Verbindung mit Wasserhärte bilden können, und die sich auf harten Ober- flächen wie beispielsweise Waschbecken, Duschverkleidungen oder Badewannen niederschlagen können.
Erfindungsgemäß wird zur schmutzabweisenden Behandlung der harten Oberflächen mindestens ein Hydrophobin verwendet. Es kann nur ein Hydrophobin oder ein Ge- misch mehrerer, verschiedener Hydrophobine eingesetzt werden.
Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne dieser Erfindung sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)
Xn-C -Xi_50-C -X0-5-C -Xi-IOQ-C -Xi-IOQ-C -X-i-so-C -XQ-5-C -X-I-SO-CJ -Xn (I)
verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der mit C benannten Aminosäuren für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen von 0 und 500, bevorzugt von 15 bis 300.
Die Polypetide gemäß Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30°, und ganz besonders bevorzugt mindestens 35° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Die mit C1 bis C8 benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C1 bis C8 aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Di- sulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumer- füllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der ein- zelnen C-Positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.
Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)
Xn-C -X3-25-C -Xo-2"C -X5-50-C -X2-35"C -X2-Is-C -Xo-2-C -X3_35"C -Xm (II)
zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 300 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen.
Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)
Figure imgf000006_0001
(III)
eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindestens 6 der mit C benannten Aminosäuren um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Aminosäuren C um Cystein.
Bei den Resten Xn und Xm kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste Xn und/oder Xm zu ver- stehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptid- sequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Pep- tidsequenz verlängert ist.
Falls es sich bei Xn und/oder Xm um natürlicherweise nicht in Hydrophobinen vorkom- mende Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.
Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (Xn) und am Carboxyterminus (Xm) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (Xn oder Xm) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden.
Besonders geeignete Fusionspartner sind Polypeptide, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusioπspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 15 und 16 ) , yaae (SEQ ID NO: 17 und 18 ) und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, bevorzugt 70-99%, besonders bevorzugt 80-98% der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind.
Die erfindungsgemäß verwendeten Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidse- quenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.
Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Proteine ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschich- tung einer Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die genauen experimentellen Bedingungen zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Proteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel eines Wassertropfens auf einer Glasoberfläche um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern.
Im Hydrophobinteil der bisher bekannten Hydrophobine sind die Positionen der polaren und unpolaren Aminosäuren konserviert, was sich in einem charakteristischen Hydrophobizitätsplot äußert. Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften und in der Hydrophobizität führten zur Einteilung der bisher bekannten Hydrophobine in zwei Klassen, I und Il (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437). Die assemblierten Membranen aus Klasse I Hydrophobinen sind hochgradig unlöslich (selbst gegenüber 1% SDS bei erhöhter Temperatur) und können nur durch konzentrierte Trifluoressigsäure (TFA)1 bzw. Ameisensäure wieder dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu sind die assemblierten Formen von Klasse Il Hydrophobinen weniger stabil. Sie können bereits durch 60%iges Ethanol, bzw. 1% SDS (bei Raumtemperatur) wieder aufgelöst werden.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass die Länge des Bereichs zwischen Cystein C3 und C4 bei Klasse II Hydrophobinen deutlich kürzer ist, als bei Hydrophobi- nen der Klasse I. Klasse Il Hydrophobine weisen weiterhin mehr geladene Aminosäuren als Klasse I auf.
Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, die im nach- folgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobine, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.
Besonders geeignet zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die Fusionsproteine mit den in SEQ ID NO: 20, 22, 24 dargestellten Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 19, 21 , 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10. bevorzugt 5 , besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebe- ne Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merri- field herstellen.
Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.
Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäure- sequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist in unserer älteren Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart.
Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfahren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschließlich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Asper- gillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula poly- morpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a..
Im Rahmen der vorliegenden Erfindungen können Expressionskonstrukte, erhalten unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen, eine für ein erfin- dungsgemäß verwendetes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte zur Herstellung von Hydrophobinen eingesetzt werden.
Vorzugsweise umfassen eingesetzte Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.
Unter einer "operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie En- hancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Techno- logy : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.
Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer"-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.
Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotro- phien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-,lpp-lac-,laclq-T7- , T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR-oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1.MFalpha, AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten.
Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons.lS- EIe- mente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium- System zu verstehen.
Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,plN-lll"3-B1 , tgt11 oder pBdCI, in StreptomycesplJ101 , plJ364,plJ702 oderplJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacteri- um pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ams- terdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'-und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steige- rung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Ge- nexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage"zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. etal., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. andWiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor inser- tiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen wer- den. Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co- Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Pro- tocols in Molecular Biology, F.Ausubel etal., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäß zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu verändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockout"- Vektor). Die ein- gebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromauf- wärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäß verwendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503.
Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder euka- ryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram- positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacte- riaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomy- ces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.
Die im Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoff- quelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 undiOO 0C, bevorzugt zwischen 10 bis 60 0C unter Sauer- stoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH-Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch"-weise, "semi-batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide oder funktionelle, biologisch aktive Fragmente davon können mittels eines rekombinanten Verfahrens hergestellt werden, bei dem man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB-oder LB- Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 400C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Labo- ratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfah- ren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharo- se-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativerGelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Ber- lin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben. Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die beispielsweise einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa- Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies : A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N. Y. ) Press). Weitere geeignete Tags sind z.B. HA, Calmodulin-BD, GST, MBD; Chitin-BD, Steptavidin-BD-Avi- Tag, Flag-Tag, T7 etc. Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann. Die entsprechenden Reinigungsprotokolle sind von den kommerziellen Affinitäts-Tag-Anbietern erhältlich.
Die wie beschrieben hergestellten Proteine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine verwendet werden.
Wenn eine Abtrennung des Fusionspartners vorgesehen ist, empfiehlt es sich eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle geeignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin, oder durch Protease vermittelte Spaltlung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacca etch virus Protease).
Zur erfindungsgemäßen Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen können die Hydrophobine in Substanz verwendet werden. Bevorzugt werden die Hydrophobine aber als Formulierungen bzw. Zusammensetzungen in mindestens einem geeigneten Lösemittel eingesetzt.
Die Auswahl der Hydrophobine zur Ausführung der Erfindung ist nicht beschränkt. Es können ein Hydrophobin oder auch mehrere verschiedene eingesetzt werden. Der Fachmann trifft eine geeignete Auswahl. Beispielsweise können Fusionsproteine, wie beispielsweise yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) oder yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21 ) eingesetzt werden.
Bei den Lösemitteln für Formulierungen kann es sich um Wasser und/oder organische Lösemittel handeln. Selbstverständlich können auch Lösemittelgemische eingesetzt werden. Die Art des Lösemittels richtet sich nach dem Hydrophobin, der Art der zu be- handelnden Oberfläche sowie der Anwendung und wird vom Fachmann entsprechend gewählt. Für Haushaltsanwendungen werden im Allgemeinen Wasser oder wässrige Formulierungen bevorzugt. Bei Industrieanwendungen kommen sowohl wässrige, ü- berwiegend wässrige sowie auch nichtwässrige Formulierungen in Frage.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Lösemittel um Wasser oder Gemische aus Wasser und mit Wasser mischbaren, organischen Lösemitteln. Beispiele derartiger organischer Lösemittel umfassen mit Wasser mischbare einwertige oder mehrwertige Alkohole, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, Ethylenglykol, Propylengly- kol oder Glycerin. Weiterhin kann es sich auch um Etheralkohole handeln. Beispiele umfassen Monoalkylether von (Poly)ethylen- oder (Poly)propylenglykolen wie Ethylen- glykolmonobutylether. Art und Menge der wasserlöslichen sowie der organischen Lösemittel werden vom Fachmann gewählt. Bevorzugt enthalten wässrige Gemische mindestens 80 Gew. % Wasser bzgl. Der Summe aller Lösemittel. Bevorzugte Löse- mittel neben Wasser sind Alkohole.
Zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Zusammensetzung können bevorzugt die bei der Synthese, Isolierung und/oder Reinigung der Hydrophobine erhaltenen wässrigen Lösungen der Hydrophobine eingesetzt werden. Diese können je nach Reinheit noch Reste von Hilfsstoffen aus der Synthese enthalten. Selbstverständlich können die Hydrophobine aber auch zunächst als Substanz isoliert werden, beispielsweise durch Gefriertrocknen, und erst in einem zweiten Schritt formuliert werden.
Die Menge der Hydrophobine in der Formulierung kann vom Fachmann je nach der Art der Oberfläche und/oder der Anwendung bestimmt werden. Es sind aber schon relativ kleine Mengen ausreichend, um eine schmutzabweisende Wirkung zu erzielen. Bewährt hat sich eine Menge von 0,0001 bis 1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile der Formulierung, ohne dass die Erfindung damit auf diesen Bereich beschränkt sein soll. Bevorzugt beträgt die Menge von 0,0005 bis 0,5 Gew. % und be- sonders bevorzugt 0,001 bis 0,1 Gew. %.
Bevorzugt handelt es sich bei der verwendeten Zusammensetzung um ein Reinigungsmittel, wie beispielsweise Glasreiniger, Fußbodenreiniger, Allzweckreiniger, Badreiniger, Klarspüler, Geschirrspülmittel zur Hand- oder Maschinenreinigung von Ge- schirr, Maschinenreiniger, Metallentfetter, Hochdruckreiniger, alkalische Reiniger, saure Reiniger, Spitzenentfetter oder Molkereireiniger. Das erfindungsgemäße Reinigungsmittel umfasst neben einem Lösemittel und mindestens einem Hydrophobin in prinzipiell bekannter Art und Weise eines oder mehrere Tenside in wirksamen Mengen.
Bei den Zusammensetzungen kann es sich auch um Vor- oder Nachbehandlungsmittel für harte Oberflächen, insbesondere für Glas, Keramik oder Fußböden handeln. Bei den Tensiden kann es sich um anionische, nichtionische, amphotere und/oder kationische Tenside handeln. Derartige Tenside sowie deren jeweils bevorzugter Einsatzweck sind dem Fachmann prinzipiell bekannt.
Beispiele anionischer Tenside umfassen Fettalkoholsulfate, Alkylethersulfate, Alkansul- fonate, Alkylbenzolsulfonate oder Alkylphosphate. Es können die freien Säuren oder Salze davon eingesetzt werden.
Beispiele nichtionischer Tenside umfassen alkoxylierte C8-C22-Alkohole wie Fettalkoho- lalkoxylate oder Oxoalkoholalkoxylate, Alkylphenolethoxylate mit C6-C14-Alkylketten und 5 bis 30 Mol Ethylenoxideinheiten, Alkylpolyglucoside mit 8 bis 22 in der Alkylket- te, Alkylaminalkoxylate oder Alkylamidethoxylate.
Beispiele amphoterer Tenside umfassen Alkylbetaine, Alkylamidbetaine, Aminopropio- nate, Aminoglycinate oder amphotere Imidazoliumverbindungen.
Beispiele kationischer Tenside umfassen substituierte oder unsubstituierte, geradketti- ge oder verzweigte quartäre Ammoniumsalze, z.B. C8-6-Dialkyldimethylammonium- halogenide, Dialkoxydimethylammoniumhalogenide oder Imidazoliumsalze mit langket- tigern Alkylrest.
Weitere Beispiele von Tensiden sind in DE-A 101 60 993, Abschnitten [0056] bis [0073] aufgeführt.
Der Fachmann trifft hinsichtlich von Art und Menge der Tensiden eine geeignete Auswahl. Bewährt hat sich eine Menge von 0,01 bis 30 Gew. % Tenside bezüglich der Summe aller Komponenten der Formulierung.
Die Formulierung kann optional darüber hinaus noch weitere Komponenten, beispiels- weise Zusatzstoffe und/oder Hilfsmittel umfassen. Beispiele derartiger Komponenten umfassen Säuren oder Basen, beispielsweise Carbonäuren oder Ammoniak, Puffersysteme, Polymere, anorganische Partikel wie SiO2 oder Silikate, Farbstoffe, Duftstoffe oder Biozide. Weitere Beispiele von Zusatzstoffen sind in DE-A 101 60 993, insbesondere Abschnitte [0074] bis [0131] aufgeführt. Der Fachmann trifft hinsichtlich der Art und Menge zusätzlicher Komponenten je nach der Anwendung eine geeignete Auswahl.
Erfindungsgemäß wird die schmutzabweisende Behandlung harter Oberflächen vorgenommen, indem man die harte Oberfläche mit einer Zusammensetzung umfassend mindestens ein Hydrophobin sowie mindestens ein Lösemittel in Kontakt bringt. Das „In-Kontakt-Bringen" richtet sich nach der Art des Gegenstandes. Es kann beispielsweise durch Besprühen, Spülen oder Wischen der Oberfläche mit der Zusammensetzung erfolgen oder auch durch Eintauchen des gesamten Gegenstandes in die Formulierung. Letzteres ist naturgemäß nur bei nicht eingebauten Gegenständen mög- lieh. Die Behandlungsdauer wird vom Fachmann festgelegt. Sie kann wenige Sekunden bis zu mehreren Stunden dauern. Die Oberfläche kann nach der Behandlung zur Entfernung überschüssiger Behandlungslösung nachgespült werden, beispielsweise mit Wasser.
Die schmutzabweisende Behandlung kann besonders vorteilhaft in Kombination mit einer Reinigung, d.h. im Zuge des eigentlichen Reinigungsvorganges selbst erfolgen. Hierzu wird ein Reinigungsmittel eingesetzt, welches wie oben beschrieben mindestens ein Hydrophobin, mindestens ein Tensid sowie mindestens ein Lösemittel um- fasst.
Die Behandlung kann bei Temperaturen unterhalb von Raumtemperatur, bei Raumtemperatur oder bei erhöhten Temperaturen vorgenommen werden, beispielsweise bei 20 bis 100°C, bevorzugt 20 bis 600C. Bevorzugt wird die Behandlung bei Temperaturen von nicht mehr als 300C vorgenommen, insbesondere 20 bis 300C.
Nach dem Behandeln mit der Zusammensetzung wird die behandelte Oberfläche getrocknet. Das Trocknen der behandelten Oberfläche kann, quasi von selbst, bei Raumtemperatur erfolgen, oder es kann auch bei erhöhten Temperaturen getrocknet werden.
An die Behandlung sowie ggf. das Trocknen der Oberfläche kann sich eine thermische Nachbehandlung der Oberfläche bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise bei Temperaturen von bis zu 120°C anschließen. Die thermische Nachbehandlung kann natürlich auch kombiniert mit der Trocknung vorgenommen werden. Bevorzugt betragen die Temperaturen bei einer thermischen Nachbehandlung 30 bis 100°C, besonders bevorzugt 40 bis 800C und beispielsweise 50 bis 700C. Die Behandlungsdauer wird vom Fachmann festgelegt, sie kann beispielsweise von 1 min bis 10 h betragen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist eine harte Oberfläche erhältlich, die eine schmutzabweisende, mindestens ein Hydrophobin umfassende Beschichtung aufweist. Bei der Beschichtung handelt es sich in der Regel mindestens um eine monomolekulare Schicht des Hydrophobins auf der Oberfläche.
Die schmutzabweisende Wirkung kann mittels prinzipiell bekannter Methoden bestimmt werden, beispielsweise, indem man die Ablösbarkeit von Schmutz durch Abspülen mit Wasser von einer unbehandelten und einer mit Hydrophobinen behandelten Oberfläche vergleicht. Die Hydrophobine weisen bereits in geringen Mengen eine deutliche Wirkung auf. Bereits die Behandlung mit einer nur 0,01 Gew. % Hydrophobine enthaltenden Zusammensetzung führt zu einer deutlich verbesserten Schmutzablösung.
Die erfindungsgemäße, schmutzabweisende Behandlung eignet sich besonders vorteilhaft für keramische Oberflächen, wie beispielsweise für Fliesen. Hier kann über die schmutzabweisende Wirkung hinaus durch die Behandlung auch noch eine deutliche Hydrophobierung der Oberfläche erreicht werden. Dies ist insbesondere in Feuchträumen, wie beispielsweise Badezimmern ein weiterer Vorteil.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
Teil A:
Herstellung und Test der erfindunqsqemäß verwendeten Hydrophobine
Beispiel 1
Vorarbeiten für die Klonierunq von vaad-His J vaaE-HiSs
Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (HaI 572/ HaI 573) wurde eine PoIy- merase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD / yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine Ncol bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS6 bzw. YAAE::HIS6 verwendet werden.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 : gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
Beispiel 2
Klonierung von vaad-Hvdrophobin DewA-Hisg
Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklea- se BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als I nsert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 klo- niert.
Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS6 verwendet werden.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAG CTAGTG G ATCCATTG AAG G CCG CAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC
Beispiel 3
Klonierung von vaad-Hvdrophobin RodA-Hiss
Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Beispiel 4
Klonierung von vaad-Hvdrophobin BASF1-HJSR
Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG C
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 5
Klonierung von vaad-Hvdrophobin BASF2-Hisg
Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte. DNA Sequenz - Hydrophobin
BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang). KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG
C
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 6
Klonierunq von vaad-Hvdrophobin SC3-Hisg
Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.
Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: G CTAACAG ATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
Beispiel 7
Fermentation des rekombinanten E. coli Stammes vaad-Hvdrophobin DewA-HiSg
Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His6 expri- mierenden E. coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 11 Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert. 13.51 LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 2Ol Fermenter mit 0,51 Vorkultur
(OD6oonm 1:10 gegen H2O gemessen) animpfen. Bei einer OD6onm von -3.5 Zugabe von 140ml 10OmM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.
Beispiel 8
Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins
(Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminales His6-tag besitzen)
100 g Zellpellet (100 - 500 mg Hydrophobin) werden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001 ) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1 ) filtriert. Zum Zellaufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 40C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA- Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im Überstand enthalten (Abbildung 1 ). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahr- scheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E. coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Ni- ckel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.
Abbildung 1 zeigt die Reinigung des hergestellten Hydrophobins:
Spur i: Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1:10 Verdünnung)
Spur 2: Durchlauf = Eluat Waschschritt
Spuren 3 - 5: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen
Das Hydrophobin der Abbildung 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die klei- neren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.
Beispiel 9
Technische Prüfung: Charakterisierung des Hvdrophobins durch Kontaktwinkelände- rung eines Wassertropfens auf Glas
Substrat:
Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim): Konzentration Hydrophobin: 100 μg/mL
Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur 800C) in 5OmM Na-Acetat pH 4
+ 0,1% Tween 20 danach Glasplättchen mit Hydrohobin - Beschichtung waschen in destilliertem Wasser danach Inkubation 10min / 800C / 1% SDS-Lösung in dest. Wasser Waschen in dest. Wasser Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°; eine Beschichtung mit dem funktionellen Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his6) ergab Kontaktwin- kel von 75 ± 5°.
Teil B:
Verwendung der Hvdrophobine zur schmutzabweisenden Beschichtung von harten
Oberflächen
Verwendete Lösung:
Für die anwendungstechnischen Versuche wurde eine Lösung des gemäß Beispiel 8 hergestellten Fusionsproteines yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) in Wasser eingesetzt. Konzentration des Hydrophobins in Lösung: 100 μg/ml (0,01 Gew. %).
Verwendete harte Oberfläche:
Keramikfliese, weiss glänzend, 10 cm x 15 cm (Fa. Novocker), mit Ethanol und Wasser abgewischt.
Verwendeter Schmutz:
Für die Tests wurde IKW-Ballastschmutz verwendet (gemäß Seifen, Fette, Öle, Wachse (SÖFW) -Journal, 124. Jg., 14/98, S. 1029)
Durchführung der Behandlung
Auf eine Fliese wurden 2 g der oben erwähnten, wässrigen Hydrophobinlösung mit einer Konzentration von 100 μg/ml aufgetropft (1,3 μm Hydrophobin/cm2) und mit einem Tuch leicht verrieben, so dass die gesamte Oberfläche bedeckt war. Die Fliese wurde daraufhin liegend für 24 h an Luft getrocknet.
Anschließend wurde die Fliese mit Wasser abgespült und für 3x10 min in ein Becherglas mit Wasser gestellt. Für jedes Spülen wurde frisches Wasser verwendet. Die Fliese wurde dann stehend an Luft getrocknet. Kontaktwinkelmessunq und schmutzabweisende Wirkung
Auf der behandelten Fliese wurde mit einem Wassertropfen (S μl, Methode wie oben beschrieben) ein Kontaktwinkel von 56° gemessen (Mittelwert aus 10 Messungen). Eine unbehandelte Fliese im Vergleich zeigt einen Kontaktwinkel von 20°. Die Fliese wurde also deutlich hydrophobiert.
Auf die behandelte Fliese und zum Vergleich auch auf eine unbehandelte wurden mit einer Transferpipette jeweils 50, 100 und 200 μg IKW-Ballastschmutz punktförmig auf- getragen und für eine h bei Raumtemperatur getrocknet.
Die Fliesen wurden dann 3 x mit jeweils 500 ml Wasser gespült. Während sich von der unbehandelten Oberfläche der Schmutz dabei nicht ablöste, konnte von der mit Hydrophobin vorbehandelten Kachel eine teilweise Schmutzablösung beobachtet wer- den.
Die Vorbehandlung mit Hydrophobin führte somit zu einer geringeren Schmutzhaftung auf der Oberfläche der Kachel.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die schmutzabweisende Behandlung in Kombination mit einer Reinigung der Oberfläche vorgenommen wird.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Behandlung ein Reinigungsmittel umfassend mindestens ein Hydrophobin, ein Ten- sid sowie ein Lösemittel einsetzt.
4. Verfahren zur schmutzabweisenden Behandlung harter Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oberfläche mit einer Zusammensetzung umfassend mindestens ein Hydrophobin sowie ein Lösemittel in Kontakt bringt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zusammensetzung um ein Reinigungsmittel umfassend mindestens ein Hydrophobin, ein Tensid sowie ein Lösemittel handelt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Hydrophobine in der Zusammensetzung 0,0001 bis 1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile der Zusammensetzung beträgt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung bei Temperaturen unterhalb von 300C vornimmt.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Hydrophobinen um mindestens ein Fusions-Hydrophobin handelt.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Oberfläche um im Haushalt vorkommende Oberflächen handelt.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der harten Oberfläche um eine ausgewählt aus der Gruppe der Oberflächen von Fliesen, Fußböden, Armaturen, Waschbecken, Duschwannen, Badwannen, Toiletten, Duschkabinen, Badezimmermöbeln, Möbeln, Spiegeln, Geschirr, Besteck, Gläsern, Porzellangegenständen oder die Oberflächen von Haushaltsgeräten handelt.
11. Reinigungsmittel für harte Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass das Reinigungsmittel mindestens ein Hydrophobin, mindestens ein Tensid sowie ein Lösemittel umfasst.
12. Reinigungsmittel gemäß Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei mindestens einem der Lösemittel um Wasser handelt.
13. Reinigungsmittel gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Hydrophobine 0,0001 bis 1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile des Reinigungsmittels beträgt.
14. Reinigungsmittel gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Hydrophobine 0,001 bis 0,1 Gew. % bezüglich der Summe aller Bestandteile des Reinigungsmittels beträgt.
15. Harte Oberfläche, umfassend eine schmutzabweisende Beschichtung, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtung mindestens ein Hydrophobin umfasst.
16. Harte Oberfläche gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Ober- fläche durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 10 erhältlich ist.
17. Harte Oberfläche gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich dass es sich bei der harten Oberfläche um eine ausgewählt aus der Gruppe der Oberflächen von Fliesen, Fußböden, Armaturen, Waschbecken, Duschwan- nen, Badwannen, Toiletten, Duschkabinen, Badezimmermöbeln, Möbeln, Spiegeln, Geschirr, Besteck, Gläsern, Porzellangegenständen oder die Oberflächen von Haushaltsgeräten handelt.
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