WO2006075668A1 - 安定化されたヒトIgG2およびIgG3抗体 - Google Patents

安定化されたヒトIgG2およびIgG3抗体 Download PDF

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monoclonal antibody
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Hideaki Yoshida
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Definitions

  • the present invention relates to IgG2 and IgG3 antibodies with improved stability, which are obtained by introducing mutations into the constant regions of HgG2 and IgG3 heavy chains.
  • Immunoglobulins are glycoproteins present in serum and tissue fluids of all mammals and have a function of recognizing foreign antigens. Antibody binding to antigen activates the complement system and promotes cell phagocytosis, antibody-dependent cytotoxicity, mediator release, and antigen presentation through the Fc receptor (FcR) present on the cell surface Involved in biological defense through activation of effector functions.
  • FcR Fc receptor
  • IgG human immunoglobulins
  • IgA immunoglobulins
  • IgM immunoglobulins
  • IgD immunoglobulins
  • IgG can be further divided into four subclasses consisting of IgGl, IgG2, IgG3 and IgG4, and IgA can be further divided into two subclasses which also have IgAl and IgA2 strength.
  • the basic structure of an immunoglobulin consists of two homologous light chains (L chains) and two homologous heavy chains (H chains). Immunoglobulin class and subclass are determined by the heavy chain.
  • each immunoglobulin has a different function. For example, complement binding ability increases in the order of IgM> IgG3> IgGl> IgG2, and affinity for Fc receptor I increases in the order of IgG3> Ig Gl> IgG4> IgG2.
  • IgGl, IgG2 and IgG4 can bind to protein A.
  • the object of the present invention is to produce highly stable mutants of HI HgG2 and IgG3 antibodies.
  • IgG2 and IgG3 antibodies are unstable at low pH, and more specifically, aggregates can be easily formed at low pH.
  • the stabilized HgG2 antibody of the present invention has, in its heavy chain constant region, at least the 300th position shown by the EU index (Kabat et. Al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition) by Kabat et al. F is replaced by Y (the alphabet is a single letter of an amino acid, the number is the EU index by Kabat et al., And so on), the 309th V is replaced by L or the 339th T is replaced by A.
  • Is replaced with Y and the 309th V is replaced with L.
  • at least the EU index by Kabat et al. The 300th F indicated by the box is replaced with Y, and the 339th ⁇ is replaced with ⁇ .
  • at least the 309th V shown in the EU index by Kabat et al. Is replaced with L and the 339th T is replaced with A.
  • the CH2 domain is substituted with the CH2 domain of the IgGl heavy chain in the heavy chain constant region.
  • the CH2 domain is replaced with the CH2 domain of the Ig G1 heavy chain, or the CH2 and CH3 domains are replaced with the CH2 and CH3 domains of the IgGl heavy chain!
  • the stabilized HgG3 antibody of the present invention has, in its heavy chain constant region, at least the 392rd N shown by the EU index by Kabat et al. Is substituted with K or the 397th M force. Yes.
  • the 300th F shown by the EU index by Kabat et al. Is further substituted with Y.
  • the 435th R shown by the EU index by Kabat et al. Is further substituted with H.
  • the 435th R substitution with H is the protein of human IgG3 antibody It aims to enable purification by A (Ito S et. Al., Exp Clin Immunogenet. 1990, 7 (2): 91-100.) O
  • the CH3 domain in the heavy chain constant region is substituted with the CH3 domain of the IgGl heavy chain.
  • the CH3 domain is replaced with the CH3 domain of the Ig G1 heavy chain, or the CH2 and CH3 domains are replaced with the CH2 and CH3 domains of the IgGl heavy chain!
  • mutations for reducing or enhancing CDC activity and / or ADCC activity can be introduced into the constant region of IgG3 heavy chain with respect to the above-mentioned substitution.
  • the present invention also provides a method for producing an antibody comprising the above-mentioned substitution, a method for inhibiting aggregation of an antibody comprising the above-described substitution, or a composition containing the above-described antibody.
  • the present invention is as follows.
  • the IgG heavy chain according to any one of [1] to [3], comprising a substitution of P at position 331 with S.
  • a monoclonal antibody comprising the IgG heavy chain of any one of [1] to [4].
  • IgG heavy chain and hybridoma KM341-1-19 (Accession No. FERM BP-7759) produced by [6] [6] Light chain having variable region of light chain of monoclonal antibody produced, Monoclonal monoclonal antibody .
  • a monoclonal antibody comprising a heavy chain of a monoclonal antibody that also produces a host force comprising the IgG heavy chain of [15] and an expression vector comprising the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 32.
  • a method for producing an IgG heavy chain comprising a step of substituting 00th F with Y.
  • a method for producing an IgG heavy chain comprising a step of replacing the 09th V with L.
  • a method for producing an IgG heavy chain comprising a step of replacing the 39th T with A.
  • a production method comprising the production method of the monoclonal antibody according to any one of [17] to [19].
  • [0042] including a step of culturing a host containing an expression vector having the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 30 in a culture solution to obtain a heavy chain of the culture and / or the host force monoclonal antibody.
  • the manufacturing method of IgG heavy chain The manufacturing method of IgG heavy chain.
  • a host comprising a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 30 and an expression vector having the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 32 is cultured in a culture solution, and the culture and / or the host cell or the like is cultured.
  • a method for producing a monoclonal antibody comprising a step of obtaining the monoclonal antibody.
  • [0044] including culturing a host containing an expression vector having the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 34 in a culture solution, and obtaining IgG heavy chains from the culture and / or the host. Production method of IgG heavy chain.
  • a host comprising a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 34 and an expression vector having the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 36 is cultured in a culture solution, and the culture and / or the host cell or the like is cultured.
  • a method for producing a monoclonal antibody comprising a step of obtaining the monoclonal antibody.
  • a host comprising an expression vector having a polynucleotide encoding the heavy chain and light chain of the monoclonal antibody of [5] is cultured in a culture solution, and the culture and / or the monoclonal from the host are cultured.
  • a method for producing a monoclonal antibody comprising a step of obtaining an antibody.
  • [0047] A method for inhibiting monoclonal antibody aggregation, comprising substituting Y at the 300th F shown by the EU index by Kabat et al. In the constant region of human IgG2 heavy chain.
  • a method for inhibiting aggregation of a monoclonal antibody comprising substituting the 309th V shown by the EU index by Kabat et al. In the constant region of human IgG2 heavy chain with L.
  • [28] A method for inhibiting the aggregation of a monoclonal antibody, comprising substituting A at the 339th T shown by the EU index by Kabat et al. In the constant region of human IgG2 heavy chain.
  • a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody according to any one of [7], [9], [11] and [16] as an active ingredient.
  • composition comprising the monoclonal antibody of any one of [31] [7], [9], [11] and [16].
  • a method for producing an IgG heavy chain comprising a step of replacing 92nd N with K.
  • a method for producing an IgG heavy chain comprising a step of replacing 97th M with V.
  • [36] A production method comprising the production method of the monoclonal antibody according to [34] or [35].
  • a method for inhibiting aggregation of a monoclonal antibody comprising substituting 92nd N for K.
  • a method for inhibiting aggregation of a monoclonal antibody comprising substituting 97th M with V.
  • a composition comprising the monoclonal antibody of any of [40] [33], [36] and [37].
  • the present invention includes the following aspects.
  • [42] A light chain having a variable region of a light chain of a monoclonal antibody produced by the IgG heavy chain and hybridoma 2105 (Accession No. BP-8024) of [41], a potent monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody comprising a heavy chain of a monoclonal antibody that also produces a host force comprising the IgG heavy chain of [50] and an expression vector comprising the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 36.
  • composition comprising the monoclonal antibody according to any one of [54] [42], [44], [46] and [51].
  • the antibody of the invention is characterized in that aggregate formation, particularly at low pH, is reduced while maintaining binding to an antigen. Therefore, the antibody of the present invention can be stably produced as a pharmaceutical product. Furthermore, when administered to a subject, it is easy to avoid side effects caused by mixing of antibody aggregates and can be used safely.
  • the present invention has improved stability by replacing the 392rd N with K, the 397th M with V, or the 300th F with Y in the amino acid sequence of IgG3 heavy chain!
  • These antibodies are characterized in that aggregate formation, particularly at low pH, is reduced while retaining binding to the antigen. Therefore, the antibody of the present invention can be stably produced as a pharmaceutical product. Further, when administered to a subject, it is easy to avoid the side effects caused by the contamination of antibody aggregates and can be used safely.
  • an antibody with reduced ADCC and / or CDC can be obtained by substituting the 331st proline with serine, etc.
  • ADCC and / or CDC When administered to a subject It can avoid the side effects caused by ADCC and / or CDC and can be used safely as a medicine.
  • FIG. 1A is a graph showing the binding activity (Ramos cell binding activity) of anti-CD40 antibody KM341-1-19 mutants to Ramos cells.
  • FIG. 1B is a view showing the binding activity (Ramos cell binding activity) of the mutant of anti-CD40 antibody KM341-1-19 to Ramos cells.
  • FIG. 1C is a graph showing the binding activity (Ramos cell binding activity) of anti-CD40 antibodies KM341-1-19 and 2105 to Ramos cells.
  • FIG. 2A is a graph showing CD95 expression promotion (CD95 expression inducing activity in Ramos cells) by a mutant of anti-CD40 antibody KM341-1-19 in Ramos cells.
  • FIG. 2B is a graph showing CD95 expression promotion (CD95 expression inducing activity in Ramos cells) by a mutant of anti-CD40 antibody KM341-1-19 in Ramos cells.
  • FIG. 2C is a graph showing CD 95 expression promotion (CD95 expression inducing activity in Ramos cells) by anti-CD40 antibodies KM341-1-19 and 2105 mutants in Ramos cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding activity (Ramos cell binding activity) of the mutant of anti-CD40 antibody 4D 11 to Ramos cells.
  • FIG. 4 is a graph showing suppression of CD95 expression (antagonist activity evaluation) by a mutant of anti-CD40 antibody 4D11 in Ramos cells.
  • the IgG heavy chain has two region forces: a variable region that determines the binding specificity to an antigen and a constant region that is involved in the expression of an effector function of an antibody.
  • the variable region has a structurally different antigen binding site sequence due to recombination of the genes constituting it and introduction of somatic mutation. This provides the feature that a large number of foreign antigens can be recognized.
  • an antibody since an antibody is a molecule that primarily controls a biological defense function against foreign microorganisms, viruses, and cancers, it also has a function of killing and removing cells to which the antibody is bound, and this is called an effector function. .
  • This killing function antibody-dependent cellular cytotoxicity (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity 0 or less, abbreviated as ADCC), and complement-dependent cytotoxic activity (Complement-Dependent Cytotoxicity 0 or less, abbreviated as CDC) ) It is said that.
  • ADCC refers to the cytotoxic activity induced by the activation of cells by binding to the antibody constant region via FcR expressed on the surface of macrophage, NK cells, neutrophils, etc.
  • CDC refers to the cytotoxic activity caused by the activated complement system when an antibody binds to an antigen.
  • the stability of IgG2 and IgG3 antibodies can be improved while retaining specific binding to an antigen.
  • antibody stability can be improved by replacing the 300th F with Y, the 309th V with L, or the 339th T with A. . These substitutions may be carried out alone or in combination.
  • antibody stability can be improved by replacing the CH2 domain of IgG2 heavy chain with CH2 domain of IgGl heavy chain, or CH2 and CH3 domain of IgG2 heavy chain with CH2 and CH3 domains of IgGl heavy chain. .
  • antibody stability is improved by replacing 392rd N with K, 397th M with V, or 300th F with Y. can do. These substitutions may be carried out alone or in combination. Also, antibody stability can be improved by replacing the CH3 domain of the IgG3 heavy chain with the CH3 domain of the IgG1 heavy chain, or the CH2 and CH3 domains of the IgG3 heavy chain with the CH2 and CH3 domains of the IgG1 heavy chain. .
  • a variant antibody in which a domain of a certain subclass is replaced with a domain of another subclass is sometimes referred to as a domain swap variant antibody.
  • an antibody with improved stability means that an antigen-binding ability does not decrease and an aggregate is not easily formed even under acidic conditions, that is, low pH conditions, for example, at pH 4 or lower.
  • an antibody refers to an antibody.
  • it refers to an antibody with a low aggregate content when purified using Protein A or Protein G affinity ram.
  • it refers to an antibody having an aggregate content of 10% or less, preferably 5% or less, and more preferably 1% or less when treated with PH3.5 for 10 minutes or 60 minutes.
  • the content of aggregates can be determined by, for example, liquid chromatography.
  • an antibody having improved physical properties is an antibody in which ADCC and / or CDC is adjusted to a desired strength in addition to stability, and has a binding ability to FcR to a desired level.
  • the regulation of ADCC and / or CDC and the ability to bind to FcR can be performed by introducing mutations into the antibody.
  • ADCC and / or CDC can be reduced or enhanced by further introducing appropriate mutations into the antibody with improved stability.
  • L235, D265, D270, ⁇ 322, ⁇ 331, ⁇ 329 (the alphabet is a single amino acid notation.
  • the numbers indicate the EU index by Kabat et al. (Kabat et. Al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition). The same shall apply hereinafter) is considered to play an important role in the complement activity of HI HgG, and substitution of this site with another amino acid can reduce CDC activity (Esohe E. Idusogie). et. al. J. Immunol. 2000, 164: 4178-4184, Yuanyuan Xu et. al. J. Biol. Chem. 1994, 269: 3469-3474, Brekek, OH et.
  • Glu233- Ser239, Gly316- Lys338, Lys274- Arg301, Tyr407- Arg416, Asn297, Glu318, Leu234- Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299 and Ala327-Ile332 are involved in the binding of IgG and FcR.
  • ADCC activity can be reduced by introducing a difference. Specifically, the ability to bind to FcR can be reduced by substituting L235 for E and G237 for A.
  • the antibodies of the present invention also include antibodies with enhanced ADCC and / or CDC.
  • the antibody of the present invention has one or more, preferably 1-20, 1-17, 1-16, 1-15, amino acid mutations that enhance or reduce the above ADCC and Z or CDC activity. 1-14 pieces, 1-13 pieces, 1-12 pieces, 1-11 pieces, 1-10 pieces, 1-9 pieces, 1-8 pieces, 1-7 pieces, 1-6 pieces, 1-5 pieces 1 to 4, 1 to 3 or 1 or 2
  • an anti-CD40 antibody is mentioned. More specifically, an antibody having the light and heavy chain variable regions of hybridoma KM341-1-19 (accession number BP-7759) or Hypridoma 2105 (accession number BP-8024) is produced. Examples are antibodies having the variable regions of the light and heavy chains of an antibody.
  • the IgG3 antibody heavy chain is replaced with 392nd N-cap, 397th M-force W, or 300th F is replaced with Y. There are no restrictions on the improved antibody! /, For example, anti-CD40 antibody.
  • CD40 refers to Clark et al. (EA Clark et. Al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986) or Stamenkovic et al. (I. Stamenkovic et. Al., EMBO J. 8). : 1403, 1989), and particularly an antigenic polypeptide expressed on the surface of B cells, DCs, macrophages, endothelial cells, epithelial cells, or their tumor cells. is there.
  • Anti-CD40 antibody means a monoclonal antibody and a polyclonal antibody against cell-expressed CD40, full-length CD40 or partial-length CD40. Preferably monoclonal antibody It is.
  • the "agonist" action of an anti-CD40 antibody is an action that promotes the binding of its ligand to CD40 expressed on the surface of cells such as B cells, tumor cells or rod cells.
  • CD40 ligand exerts one or more effects on CD40-expressing cells on CD40-expressing cells
  • agonistic antibody means an antibody having such effects .
  • One of the effects on CD40-expressing cells is, for example, promotion of B cell proliferation or antibody production.
  • the "antago-stick" action of an anti-CD40 antibody is an action that inhibits binding of its ligand to CD40 expressed on the surface of cells such as B cells, tumor cells or rod cells, or It means the action of neutralizing one or more of the effects of CD40 ligand on CD40-expressing cells, and “antagonistic antibody” means an antibody having such action.
  • One of the effects on CD40-expressing cells is, for example, suppression of B cell proliferation or antibody production.
  • Antibodies are derived from genes encoding immunoglobulin heavy chain variable regions and heavy chain constant regions and light chain variable regions and light chain constant regions (collectively referred to as “antibody genes”). Is.
  • the antibodies of the present invention include antibodies having any immunoglobulin class and isotype.
  • the protein (antigen) to which the antibody of the present invention binds is not limited, for example, CD40.
  • CH1 domain “hinge domain”, “CH2 domain” and “CH3 domain” refer to a part of the antibody heavy chain constant region, and are EU index of Kabat et al. (Kabat et. Al., Sequenc es of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition).
  • the CHI domain is the EU index 118 to 215, the hinge domain is the EU index 216 to 237, the CH2 domain is the EU index 238 to 340, and the CH3 domain is the EU index 341 to 446.
  • Human antibody means an antibody that is an expression product of a human-derived antibody gene.
  • human IgG2 J00230 (SEQ ID NO: 64), AJ250170 (SEQ ID NO: 65), AF 449616 (SEQ ID NO: 66), AF449617 (SEQ ID NO: 67), AF449618 (SEQ ID NO: 68), Z4980 2 (SEQ ID NO: 69) or Z49801 (SEQ ID NO: 70)
  • human IgG3 is M12958, K01313 (SEQ ID NO: 71), X16110 (SEQ ID NO: 72), X99549 (SEQ ID NO: 73), AJ390236 (SEQ ID NO: 74), AJ390237 (SEQ ID NO: 75), AJ390238 (SEQ ID NO: 76), AJ390241 (SEQ ID NO: 77), AJ390242 (SEQ ID NO: 78), AJ390246 (SEQ ID NO:
  • Hi HgG heavy chain is a heavy chain consisting of a heavy chain variable region and a heavy chain constant region of hi HgG.
  • human IgG2 heavy chain is a heavy chain composed of a heavy chain variable region and a heavy chain constant region of HgG2.
  • Hi-HgG antibody is an antibody that also has the ability of HI-HgG heavy chain and human light chain.
  • a “hi HgG2 antibody” is an antibody that also has the ability of a heavy HgG2 heavy chain and a human light chain.
  • the antibody of the present invention comprises a method for isolating an antibody gene from a hyperidoma well known to those skilled in the art, sequence information on the human antibody constant region of the above known human antibody gene, and site-specific mutation to the gene. It can be suitably produced by using an introduction method or the like.
  • the antibody of the present invention can be obtained by incorporating an antibody gene into an expression vector, introducing the vector into an appropriate host cell, and collecting and purifying the cell or cell culture supernatant.
  • a phage or plasmid that can be autonomously propagated in the host cell or integrated into the chromosome of the host cell is used.
  • plasmid DNA examples include plasmids derived from Escherichia coli, Bacillus subtilis, or yeast.
  • phage DNA examples include ⁇ phage.
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the target gene. Examples include bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CHO cells, etc.) and insect cells.
  • bacteria E. coli, Bacillus subtilis, etc.
  • yeast yeast
  • animal cells COS cells, CHO cells, etc.
  • insect cells insect cells.
  • Methods for introducing a gene into a host are known, and arbitrary methods (for example, a method using calcium ions, an electoporet method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a phosphate power) And the Ryusum method, the lipofussion method, etc.).
  • Examples of the method for introducing a gene into an animal described later include a microinjection method, a method for introducing a gene into an ES cell using an erect mouth position or lipofection method, and a nuclear transfer method.
  • culture means any of (a) culture supernatant, (b) cultured cells or cultured cells or disrupted products thereof, and (c) secretions of transformants.
  • a medium suitable for the host to be used is used, and a stationary culture method, a culture method using a roller bottle, or the like is employed.
  • the antibody is collected by disrupting the microbial cells or cells.
  • the target antibody is produced outside the cells or cells, use the culture solution as it is, or remove the cells or cells by centrifugation or the like.
  • the target antibody is isolated and purified from the culture by using a general biochemical method using various chromatographies used for protein isolation and purification alone or in appropriate combination. Can do.
  • transgenic animal production technique an animal host in which the gene of the target antibody is incorporated into an endogenous gene, for example, transgeneic ushi, transgeneic goat, transgeneic hitch. It is also possible to produce a di- or transgenic pig and obtain a large amount of monoclonal antibody derived from the antibody gene from milk secreted from the transgenic animal (Wright, G., et al. (1991) Bio / Technology 9, 830-83 4). When hybridomas are cultured in vitro, Hypridoma can be grown, maintained and stored in the culture supernatant according to the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test study and the culture method. It is possible to carry out using any known nutrient medium such as that used to produce monoclonal antibodies, or any nutrient medium derived from a known basal medium.
  • a pharmaceutical composition containing a purified preparation of the antibody of the present invention is also included in the scope of the present invention.
  • a pharmaceutical composition preferably includes a physiologically acceptable diluent or carrier in addition to the antibody, and may be a mixture with other drugs or other drugs such as antibiotics.
  • Suitable carriers include physiological saline, phosphate phosphate Examples include, but are not limited to, saline, phosphate buffered saline glucose solution, and buffered saline.
  • the antibody may be freeze-dried (freeze-dried) and reconstituted and used by adding the above buffered aqueous solution as needed.
  • the routes of administration are oral routes and parenteral routes including intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injection or delivery.
  • the effective amount administered as a combination of an effective amount of the antibody of the present invention and an appropriate diluent and a pharmacologically usable carrier is 0.0001 mg to 100 mg per kg of body weight per time. It is administered every 2 to 8 weeks.
  • agonistic anti-CD40 antibody is an immunostimulator (antiviral agent, anti-infective agent), and A, B as pathogens.
  • C, D, or E hepatitis virus, HIV, influenza virus, simple herpesvirus, cytomegalovirus, EB winores, papillomavirus, chlamydia, mycoplasma, toxoplasma, malaria, trypanosomes, tuberculosis, etc.
  • an antitumor agent, and target tumors include, for example, malignant tumors containing cancer cells expressing CD40, such as lymphoma (for example, Hodgkin lymphoma), leukemia, malignant melanoma, spleen cancer, lung cancer, ovarian cancer, bladder cancer, Examples include breast cancer, colon cancer, prostate cancer, and head and neck cancer. Or it is an autoimmune disease therapeutic agent, and rheumatism is illustrated as a target disease. Or multiple of these diseases may occur simultaneously. Alternatively, it can be used in combination with a vaccine such as a cancer-specific peptide as an adjuvant.
  • a vaccine such as a cancer-specific peptide as an adjuvant.
  • a composition containing the antibody of the present invention is also included in the scope of the present invention.
  • the composition contains other components such as a buffer (for the purpose of moderate pH change, such as sodium glutamate), a stabilizer (to increase the chemical or physical stability of the antibody).
  • a buffer for the purpose of moderate pH change, such as sodium glutamate
  • a stabilizer to increase the chemical or physical stability of the antibody.
  • glycine for example, glycine
  • a surfactant for example, polysorbate
  • the composition is, for example, an aqueous solution or lyophilized.
  • the composition can be used, for example, as a reagent for antigen analysis. Since the antibody to which amino acid or domain substitution of the present invention has been applied is applied, aggregate formation is suppressed as compared with the antibody. The composition can also be produced efficiently with force. In addition, antibody aggregation is unlikely to occur in the analysis solution for antigen analysis, and the result can be obtained with high accuracy.
  • anti-CD40 antibodies described in WO02 / 088186 it has light chain and heavy chain variable regions of an antibody (hereinafter referred to as 341-119 antibody) produced by hybridoma KM341-1-19 (Accession No. BP-7759)
  • Antibodies and antibodies having the light chain and heavy chain variable regions of antibodies produced by Hypridoma 2105 (Accession No. BP-8024) (hereinafter referred to as 2105 antibody) were prepared.
  • the antibody produced by Hypridoma KM341-1-19 (Accession No.BP-7759) and the antibody produced by Hypridoma 2105 (Accession No.BP-8024) must be agonistic antibodies!
  • the antibody 341- 1 19 is an antibody produced by the hybridoma KM341-1-19, and the hybridoma KM341-1-19 has the accession number FERM BP-7759 as of September 27, 2001. Deposited at the Patent Organism Depositary Center (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (Tsukuba Rinto, 1-chome, 1-Chuo, 6th, Ibaraki, Japan).
  • the 2105 antibody is an antibody produced by the hybridoma 2105, and the ibridoma 2105 has the accession number FERM BP-8024 on April 17, 2002. It is deposited in Tsukuba Sakaihigashi, 1-chome, 1-chome, 1-center, 6) in Ibaraki, Japan.
  • nucleotide sequences encoding the variable regions of the heavy and light chains of the 341-1-19 antibody and the amino acid sequences of the heavy and light chains are shown below, respectively.
  • the signal sequence also starts the 50th adenine (A) force.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 109th [adenine] ([A]) and the 110th cytosine (C), and the boundary between the variable region and the constant region is the 493th adenine (A). It is located between the 494th guanine (G) (using gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • SEQ ID NO: 2 Signal sequence and variable region in heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of 341-1-19 antibody Is located between the 20th serine (S) and the 21st glutamine (Q), and the boundary between the variable region and the constant region is between the 148th serine (S) and the 149th alanine (A). To position.
  • the base sequence of the heavy chain variable region of the 341-1-19 antibody is from the 110th cytosine (C) to the 493th adenine (A) in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the 341-1-19 antibody is from the 21st glutamine (Q) to the 148th serine (S) in SEQ ID NO: 2.
  • the signal sequence in the light chain base sequence (SEQ ID NO: 3) of the 341-1-19 antibody also starts with the 29th terminal zanin (A) force.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 88th [adenine] ([A]) and the 89th guanine (G), and the boundary between the variable region and the constant region is the 400th adenine (A).
  • Located between the 401st [cytosine] ([C]) (using gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th glycine (G) and the 21st glutamic acid (E),
  • the boundary between the variable region and the constant region is located between the 124th lysine (K) and the 125th [arginine] ([R])
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of the 341-1-19 antibody is from 89th guanine (G) to 400th adenine (A) in SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of the 341-1-19 antibody is from the 21st glutamic acid (E) to the 124th lysine (K) in SEQ ID NO: 4.
  • the signal sequence also starts the 70th adenine (A) force.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 126th [thymine] ([T]) and the 127th guanine (G), and the boundary between the variable region and the constant region is the 495th adenine (A) and 496.
  • Located between the second guanine (G) (using gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 19th cysteine (C) and the 20th glutamic acid (E).
  • the boundary of the constant region is located between the 142nd serine (S) and the 143rd alanine (A).
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the 2105 antibody is the 127th position in SEQ ID NO: 5.
  • the guanine (G) force is up to the 495th adenine (A).
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the 2105 antibody is from the 20th glutamic acid (E) to the 142nd cerine (S) in SEQ ID NO: 6.
  • the signal sequence also starts the 28th adenine (A) force.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 87th [adenine] ([A]) and the 88th guanine (G), and the boundary between the variable region and the constant region is the 405th adenine (A) and 406 It is located between the second [cytosine] ([C]) (using gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th glycine (G) and the 21st glutamate (E).
  • the boundary of the stationary region is located between the 126th lysine (K) and the 127th [arginine] ([R]).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of the 2105 antibody is from the 88th guanine (G) to the 405th adenine (A) in SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of the 2105 antibody is from the 21st glutamic acid (E) to the 126th lysine (K) in SEQ ID NO: 8.
  • the present inventors digested and purified a DNA fragment containing the heavy and light chains of 4D11 (having IgG4 subclass), which is an anti-CD40 antibody, and its mutant 4D11PE (4D11 antibody gene heavy chain and light chain) with BglII and Nhel.
  • N5KG4PE was replaced with N5KG4PE vector (IDEC Pharmaceuticals)
  • N5KG4PE was the IgG4 constant region, S228P and L235E, and N5KG4P contains the S228P point mutation, respectively.
  • N5KG4PE was the IgG4 constant region, S228P and L235E
  • N5KG4P contains the S228P point mutation, respectively. Under the condition of incubating at 37 ° C for 1 min and 10 min after charging to 0.1M citrate buffer (pH 2.7), about 10% aggregates are formed.
  • the domain swap mutant antibody IgG [l / l / 2/2] ([1 / 1/2/2] refers to the CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, and CH3 domain in order from the left.
  • the CH1 domain is derived from IgG1 and hinge domain.
  • Is derived from IgGl the CH2 domain is derived from IgG2
  • the CH3 domain is derived from IgG2. The same shall apply below. ), IgG [2/2 / l / l], IgG [2/2 / l / 2], IgG [2/2/2 / l] were prepared as described below.
  • IgG [l / l / 2/2] consists of N5KG1-Val Lark (lDEC Pharmaceuticals: hereinafter abbreviated as N5KG1), a primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEQ ID NO: 9), 24ch4: AG GGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT (SEQ ID NO: In 10), the reaction at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds was performed 15 times.
  • the antibody expression vector N5KG2 (IDEC Pharmaceuticals, US Patent 6001358, “G2” indicates that the heavy chain constant region is derived from IgG2 (hereinafter the same)) is used as a primer and primer 24ch3: AAGGACACTCTCATGATCTCCC GGACCCCT ( Using SEQ ID NO: 11) and linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 12), reactions at 98 ° C. for 1 second, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were performed 15 times.
  • the reaction After purifying the amplified DNA fragment with a PCR purification kit and mixing two equal amounts of the two purified DNA fragments, the reaction at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds is performed 5 times, and the primers linkH and linkH2 Reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector. This expression vector was named N5KG1122.
  • IgG [2/2 / l / l] is N5KG2 in a saddle type
  • primer linkH gggtacgtcctcacattcagtgatc ag
  • 24ch4 AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT (SEQ ID NO: 10)
  • 98 ° C for 1 second 60 ° C30 seconds
  • 72 ° C 30 seconds reaction was carried out 15 times, and at the same time, N5KG1 was used as a saddle
  • primer 24ch3 AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT (SEQ ID NO: 11)
  • linkH2 tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 12)
  • 98 ° C 1 second The reaction was carried out 15 times at 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds.
  • IgG [2/2 / l / 2] is the N5KG2211 prepared as described above, and the primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEQ ID NO: 9), CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCT CTCGGGGCTGCCC (SEQ ID NO: 13) at 98 ° C1 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds went.
  • IgG [2/2/2 / l] is N5KG2 in a saddle type, primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (SEQ ID NO: 9), CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC (IS column number 13) at 98 ° C for 1 second, 60 ° C30 Second, the reaction at 72 ° C for 30 seconds was performed 15 times.
  • primers CH3cons GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACAC C (SEQ ID NO: 14), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 12), 15 reactions at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds went.
  • the reaction is performed 5 times at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and the primers linkH and linkH2 And reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector. This expression vector was named N5KG2221.
  • Each expression vector was digested with BglII and Nhel, and the light chain variable region and heavy chain variable region of the 341-1-19 antibody were inserted to complete the expression vector.
  • antibodies having the light and heavy chain variable regions of the antibody produced by Hyperidoma KM341-1-19 (Accession No. BP-7759) and Hyperidoma 2105 (Accession No. BP-8024) are produced.
  • 341G2Ser and 2105 G2Ser were prepared as antibodies having the light and heavy chain variable regions of the live antibody.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 60th [adenine] ([A]) and the 61st cytosine (C),
  • the boundary between the variable region and the constant region is located between the 444th adenine (A) and the 445th guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the base sequence of the heavy chain variable region of 341G2Ser is from the 61st cytosine (C) to the 444th adenine (A) in SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of 341G2Ser is from the 21st glutamine (Q) to the 148th serine (S) in SEQ ID NO: 16.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 60th [adenine] ([A]) and the 61st guanine (G).
  • the boundary of the constant region is located between the 372rd adenine (A) and the 373rd [cytosine] ([C]) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th glycine (G) and the 21st glutamate (E), and the boundary between the variable region and the constant region. Is located between the 124th lysine (K) and the 125th [arginine] ([R]).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of 341G2Ser is from 61st guanine (G) to 372nd adenine (A) in SEQ ID NO: 17.
  • amino acid sequence of the light chain variable region of 341G2Ser is from the 21st glutamic acid (E) to the 124th lysine (K) in SEQ ID NO: 18. [0144] 341G2Ser light chain full nucleotide sequence (SEQ ID NO: 17)
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 57th [thymine] ([T]) and the 58th guanine (G).
  • the region boundary is located between the 426th adenine (A) and the 427th guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 19th cysteine (C) and the 20th glutamic acid (E), and the variable region and the constant region.
  • the boundary of is located between the 142nd serine (S) and the 143rd alanine (A).
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of 2105G2Ser is from the 58th guanine (G) to the 426th adenine (A) in SEQ ID NO: 19.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of 2105G2Ser is from the 20th glutamic acid (E) to the 142nd serine (S) in SEQ ID NO: 20.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 60th [adenine] ([A]) and the 61st guanine (G).
  • the boundary of the normal region is located between the 378th adenine (A) and the 379th [cytosine] ([C]) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th glycine (G) and the 21st glutamic acid (E).
  • the region boundary is located between the 126th lysine (K) and the 127th [arginine] ([R]).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of 2105G2Ser is from 61st guanine (G) to 378th adenine (A) in SEQ ID NO: 21.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of 2105G2Ser is from the 21st glutamic acid (E) to the 126th lysine (K) in SEQ ID NO: 22.
  • Aggregate content of the antibody solution was analyzed using a high performance liquid chromatograph (Shimadzu) and TSK-G3000 SW column (Tosohichi) and 20mM sodium phosphate and 500mM NaCl pH 7.0 as solvents. went.
  • a high performance liquid chromatograph Shiadzu
  • TSK-G3000 SW column Tosohichi
  • 20mM sodium phosphate and 500mM NaCl pH 7.0 as solvents. went.
  • the molecular weight marker for gel filtration HPLC Oriental Yeast Co., Ltd.
  • the force was also calculated as the content of aggregates.
  • the aggregate content of each antibody sample purified by the method shown in Example 2 was measured by the method of Example 3, and was 0% for all samples.
  • the aggregate content of the antibody solution after the low pH treatment was measured by the method shown in Example 3.
  • Example 4 in 341-G2Ser antibody domains as IgGl and CH2 domains of the constant region swap variant antibody I g G [2/2 / l / 2], since it was found that most aggregates does not occur, further to In order to narrow down the amino acid residues that contribute to the suppression of aggregate formation, 6 amino acid residues that differ between IgGl and IgG4 present in the CH2 domain of the 341G2Ser antibody (274, 296, indicated by the EU index by Kabat et al., Focusing on the 300th, 309th, 327th, and 339th), each variant that was converted from IgG2 amino acid residue to IgGl amino acid residue (341-G2Ser [Q274K] (the 274th Gin residue was converted to Lys, The same shall apply hereinafter), 341-G2Ser [F296Y], 341-G2Ser [F300Y], 341-G2Ser [V309L], 341-G2Ser [G327A
  • the amino acid in the constant region was obtained by site-directed mutagenesis using the GeneEditor TM in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Promega) using the DNA of the anti-CD40 antibody 341-G2Ser expression vector (N5KG2Ser-341) as a cage.
  • Various mutant DNAs encoding the substitutes were prepared.
  • Q274K AGACCCCGA G GTCAAGTTCA ACTGGTACGT G (SEQ ID NO: 23), F296Y: CGGGAGGAGC AG TACAACAG CACGTTCC (SEQ ID NO: 24), F300Y: AGTTCAACAG CACGTACCG T GTGGTCAGC (SEQ ID NO: 25), V309L: GCGTCCTCAC CGTTCTGCAC CAGGA CTGG (SEQ ID NO: 26), G327A: AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCTCC (SEQ ID NO: 27), T339A: GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC C (SEQ ID NO: 28) were used.
  • the mutant After synthesizing the mutagenesis strand by annealing the target mutagenesis oligonucleotide and the selection Oligonucleotide supplied with the kit with the vertical DNA to synthesize the mutagenesis strand, only the mutant will grow in the presence of GeneEditor TM Antibiotic Selection Mix. Mutants were selected. More specifically, the dsDNA template was incubated under alkaline conditions (0.2 M NaOH, 0.2 mM EDTA (final concentration)) at room temperature for 5 minutes, and then 2M ammonium acetate (pH 4.6) was added to 1/10 volume volume. The mixture was neutralized and collected by force ethanol precipitation.
  • alkaline conditions 0.2 M NaOH, 0.2 mM EDTA (final concentration)
  • GeneEditor TM Antibiotic Selection Mix Presence of plasmid DNA from transformant Escherichia coli transformed and cultured in the competent cell BMH 71-18 mutS, and then transformed the competent cell JM109 with the DNA. TM Seeded on LB plate containing Antibiotic Selection Mix. For each mutant, the transformant produced on the plate was cultured, the plasmid DNA was purified, and the DNA base sequence was analyzed. As a result of the DNA base sequence, six types of expression vectors of anti-CD40 antibody mutants into which the target amino acid mutation was introduced were obtained.
  • Plasmids DNA expressing 1 amino acid substitution mutant protein of these anti-CD40 antibodies are N5KG2Ser-341-Q274K ⁇ N5KG2Ser-341-F296Y ⁇ N5KG2Ser-341-F300Y ⁇ N5K G2Ser-341-V309L, N5KG2Ser-341-G327A, N5KG2Ser -It was named 341- T339A.
  • Example 5 Using the 1-amino acid variant antibody expression vector of Example 5, expression and purification were performed according to Example 2, subjected to low pH treatment according to Example 4, and the aggregate content was measured according to Example 3.
  • Example 6 As shown in Example 6, from the study using a 1 amino acid substitution product of the CH2 domain of the 341G2Ser antibody, mutants in which the formation of aggregates is partially suppressed (341-G2Ser [F300Y], 341-G2Ser [V309L , And 341-G2Ser [T339A]), and in order to further promote the inhibition of aggregate formation, create a mutant that has any one or two of the three amino acid mutations in combination. did.
  • the mutants produced were 341-G2Ser [F300Y / V309L] (300th amino acid residue F was converted to Y, 309th V was converted to L, and so on), 341-G2Ser [F300 Y / T339A] 341-G2Ser [V309L / T339A], 341-G2Ser [F300Y / V309L / T339A] (300th F converted to Y, 309th V converted to L, and 339th T converted to A) is there.
  • the mutant expression vector can be prepared by introducing a longer oligonucleotide for mutagenesis, or two or more of these oligonucleotides simultaneously into a vertical vector DNA in order to introduce mutations at multiple sites.
  • GeneEditor TM in vitro of Example 5 except that it was annealed
  • the site-directed mutagenesis system (Promega) was used for site-directed mutagenesis.
  • 341-G2Ser [F300Y / V309L] was prepared.
  • F300Y and T339A used in 5 were used to prepare 341-G2Ser [V309L / T339A], V309L and T339A, and 341-G2Ser [F300Y / V309L / T339A] were used to prepare F300YV309L and T339A.
  • the candidate plasmid DNA of the antibody expression vector was selected by DNA base sequence analysis, and expression vectors for four types of anti-CD40 antibody mutants into which the desired amino acid mutation was introduced were obtained. Plasmid DNAs expressing these anti-CD40 antibody mutant proteins are named N5K G2Ser-341-F300Y / V309L, N5KG2Ser-341-F300Y / T339A, N5KG2Ser-341-V309L / T339A, N5KG2Ser-341-F300Y / V309L / T339A did.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 60th adenine (A) and the 61st cytosine (C) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th serine (S) and the 21st glutamine (Q) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 60th adenine (A) and the 61st guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th glycine (G) and the 21st glutamic acid (E) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • 2105G2Ser can suppress the formation of aggregates under low pH conditions if it has an IgG2 constant region with a mutation of F300YV309LT339A in which three amino acids of the CH2 domain are converted to amino acids of IgGl.
  • a DNA fragment containing the light chain variable region and heavy chain variable region of N5KG2Ser-341-F300Y / V309L / T339A was excised by digestion with BglII and Nhel, and instead of 2105 light chain variable region and heavy chain variable region. Inserted.
  • the obtained plasmid DNA expressing the mutant protein of the 2105 antibody was named N5KG2Ser-2105-F300YV309LT339A.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 57th thymine (T) and the 58th guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • SEQ ID NO: 35 the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 19th cysteine (C) and the 20th glutamic acid (E) (using the gene sequence prediction software (Signal Pver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is the 60th adenine (A). Located between the 61st guanine (G) (using gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 20th glycine (G) and the 21st glutamic acid (E) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the antibody was expressed and purified by the method of Example 2, and the methods of Example 4 and Example 3 were used. Then, the stability of low pH was examined.
  • the cell suspension (100 ⁇ l 1well) was dispensed into a 96-well round bottom plate (Betaton Dickinson).
  • the culture supernatant (50 ⁇ 1) of each hyperidoma was added and incubated at ice temperature for 30 minutes.
  • a HgG1 antibody against human serum albumin was used, adjusted to a concentration of 2 g / ml in Hypridoma culture medium, and incubated at ice temperature for 15 minutes after addition of 501.
  • 50 ⁇ l of 250-fold diluted R-PE fluorescently labeled anti-human antibody (Southern Biotechnology) was added and incubated at ice temperature for 15 minutes.
  • the suspension was suspended in 300 to 5001 FACS buffer, and the fluorescence intensity of each cell was measured with FACS (FACSort, FACScan, Betaton Dickinson).
  • 341-1-19 and 2105 are known as antigen antibodies.
  • the effect of antibody antigen activity on the structural change of the constant region was investigated.
  • CD95 expression is increased by adding CD40 ligand.
  • the agonist activity of the antibody was evaluated using the key to increase the expression of CD95 as an index by adding the antibody to the cell.
  • l.OxlO 6 / ml Ramos cell suspension was seeded on a 96-well plate at 50 ⁇ l / well.
  • the culture supernatant or purified antibody was added to a 96 well plate at 100 ⁇ / weU. After overnight culture, the cells were collected and analyzed using FACS using R-PE labeled anti-CD95 antibody (Pharmingen NJ).
  • the light chain and heavy chain variable of the 4D11 antibody Antibodies were made using the regions. These two antibodies are known to act as antagonists.
  • the 4D11 antibody is an antibody produced by the hybridoma 4D11.
  • Hypridoma 4D11 has the accession number FERM BP-7758 on September 21, 2001, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biology Center ( It is deposited at 1-chome, 1-chome, 1-chome, 1-chome, 6), Ibaraki, Japan.
  • nucleotide sequences encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of the 4D11 antibody, and the amino acid sequences of the heavy chain and the light chain are shown below.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 93rd [cytosine] ([C]) and the 94th cytosine (C).
  • the boundary between the variable region and the constant region is located between the 456th adenine (A) and the 457th guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 26th serine (S) and the 27th glutamine (Q).
  • the boundary of the constant region is located between the 147th serine (S) and the 148th alanine (A).
  • the nucleic acid sequence of the heavy chain variable region of the 4D11 antibody is from the 94th cytosine (C) to the 456th adenine (A) in SEQ ID NO: 38.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of 4D11 is from the 27th glutamine (Q) to the 147th serine (S) in SEQ ID NO: 39.
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 124th [thymine] ([T]) and the 125th guanine (G).
  • the boundary between the variable region and the constant region is located between the 442nd adenine (A) and the 443rd [cytosine] ([C]) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)) .
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 22nd cysteine (C) and the 23rd alanine (A).
  • the boundary of the stationary region is located between the 128th lysine (K) and the 129th [arginine] ([R]).
  • the nucleic acid sequence of the light chain variable region of the 4D11 antibody is from the 125th guanine (G) to the 442nd adenine (A) in SEQ ID NO: 40.
  • the light chain variable region of 4D11 The amino acid sequence is from the 23rd alanine (A) to 128th lysine (K) in SEQ ID NO: 41.
  • the domain swap mutant antibody I g G [l / l / 3 / is also used in the IgG3 antibody to identify the IgGl region involved in the suppression of aggregate formation at low pH.
  • 3] [l / l / 3/3] is the order of the left force in the order of CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, and CH3 domain, CH1 domain is derived from IgG1, hinge domain is derived from IgG1, CH2 domain is derived from IgG3, and This means that the CH3 domain is derived from IgG3! /, And is interpreted in the same manner.), IgG [3/3 / l / l], IgG [3/3 / l / 3], IgG [3 / 3/3 / l] was prepared as described below.
  • IgG [l / l / 3/3] consists of N5KG1-Val Lark (lDEC Pharmaceuticals: hereinafter abbreviated as N5KG1), a primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEQ ID NO: 9), 13chl-R: GTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCA (sequence) 98 with the number 42). C 1 second, 60 ° C. 30 seconds, 72 ° C. 30 seconds reaction was performed 15 times. At the same time, antibody expression vector N5KG3 (IDEC Pharm aceuticals, US Pat.
  • linkH2 tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 12) was used, and the reaction at 98 ° C. for 1 second, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was performed 15 times.
  • Purify the amplified DNA fragment with a PCR purification kit mix two equal amounts of the purified DNA fragment, and then perform the reaction at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds 5 times. And reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cleaved with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector. This expression vector was named N5KG1133.
  • IgG [3/3 / l / l] is N5KG3 in a saddle type, primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (SEQ ID NO: 9) 13chl-R: GTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 42), 60 ° C for 1 second, 60 ° The reaction at C30 seconds and 72 ° C for 30 seconds was performed 15 times.
  • primer 13chl TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC (SEQ ID NO: 43), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 12), 15 reactions at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds went.
  • Purify the amplified DNA fragment using PCR purification kit After two equal amounts of the purified DNA fragments were mixed, the reaction was performed 5 times at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, and the primers were linked and linkedH2 were reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector. This expression vector was named N5KG3311.
  • IgG [3/3 / l / 3] was prepared by using N5KG3311 prepared as described above in a saddle type, primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEQ ID NO: 9), CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCT CTCGGGGCTGCCC (SEQ ID NO: 13) at 98 ° C1 Second, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds, the reaction was repeated 15 times.
  • IgG [3/3/3 / l] is N5KG3 in a saddle type, primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (SEQ ID NO: 9), CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC (IS column number 13) at 98 ° C for 1 second, 60 ° C30 Second, the reaction at 72 ° C for 30 seconds was performed 15 times.
  • primers CH3cons GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACAC C (SEQ ID NO: 14), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 12), 15 reactions at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds went.
  • the reaction is performed 5 times at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and the primers linkH and linkH2 And reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector. This expression vector was named N5KG3331.
  • Each expression vector was digested with BglII and Nhel, and the light chain variable region and heavy chain variable region of 4D11 were inserted to complete the expression vector.
  • Example 13 [Expression of CD3 antibody of IgG3] Purification and measurement of aggregate content of purified product
  • the prepared expression vector DNA was expressed according to Example 2, and the obtained culture supernatant (Ig G (approx. 300 ⁇ g) was charged to HiTrap rProtein G HP (force ram volume lml) (Amersham Biosciences), an affinity column for antibody purification, washed with PBS (-), 20 mM citrate buffer ( The solution was eluted in pH 2.7) and collected in a tube containing 200 mM phosphate buffer (pH 7.0). Table 5 shows the aggregate content of each antibody sample after purification.
  • the 4D 11-G3 antibody has an aggregate content of 20% or more, whereas the domain swap mutant antibody (4D11-G [3311] and 4D11-G [3331] in which the CH3 region of the constant region is converted to Ig Gl. ]), It was found that the proportion of aggregates improved to very low IgGl levels.
  • the 4D11-G [3311] domain swap mutant antibody was found to be equivalently stable even under low pH treatment conditions compared to the case where the entire constant region was IgGl (Table 6). .
  • 4D11-G [3331] was suppressed to an aggregate content of 3% or less even after 60 minutes of incubation, and stability at low pH was confirmed.
  • Table 6 shows the low pH stability of IgG3 / IgGl domain swap mutant antibodies.
  • IgG3 [E356D] has N5KG3 as a saddle, primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (SEQ ID NO: 9)
  • E356D-r CTTGGTCATCTCATCCCGGGATGGGGG (SEQ ID NO: 44) 98 ° C 1 second, 60 ° C 30 seconds, 72 ° C 30 seconds The reaction was repeated 15 times.
  • IgG3 [M358L] has N5KG3 as a saddle, primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (SEQ ID NO: 9) M358L-r: CTGGTTCTTGGTCAGCTCCTCCCGGGG (SEQ ID NO: 46) 98 ° C 1 second, 60 ° C 30 seconds, 72 ° C 30 seconds The reaction was repeated 15 times.
  • antibody expression vector Using N5KG3 as a saddle, primer M358L: TCCCGGGAGGAGCTGACCAAGAACCA G (SEQ ID NO: 47), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 12) was used for 15 reactions at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. . After purifying the amplified DNA fragment with a PCR purification kit and mixing two equal amounts of the purified DNA fragment, the reaction is performed 5 times at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and the primers linkH and linkH2 And reacted 15 times. The amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector. This expression vector was named N5KG3-M358L.
  • IgG3 [N392K] has N5KG3 as a saddle, primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (SEQ ID NO: 9)
  • N392K-r GGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTC (SEQ ID NO: 48) 98 ° C 1 second, 60 ° C 30 seconds, 72 ° C 30 seconds The reaction was repeated 15 times.
  • primers N392K GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC C (SEQ ID NO: 49), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 12), reaction at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds I went 15 times.
  • the reaction is performed 5 times at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and the primers linkH and linkH2 And reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector.
  • This expression vector was named N5KG3-N392K.
  • IgG3 [I422V] uses N5KG3 as a saddle, primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatca g (SEQ ID NO: 9)
  • I422V-r GGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTG (SEQ ID NO: 50) at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds The reaction was repeated 15 times.
  • primers I422V CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC (SEQ ID NO: 51), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEQ ID NO: 12), reaction at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds I went 15 times.
  • the reaction at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds is performed 5 times, and the primers linkH and linkH2 are added. In addition, it reacted 15 times.
  • the amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector. This expression vector was named N5KG3-I422V.
  • IgG3 [R435H] has N5KG3 as a saddle and primer linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (SEQ ID NO: 9)
  • R435H CCCGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT CTTCTGCGTGTAGTGGTTGTG (SEQ ID NO: 52) was reacted 30 times at 98 ° C for 1 second, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds.
  • the amplified DNA fragment was cut with Nhel and BamHI and replaced with the IgGl constant region of the N5KG1 vector. This expression vector was named N5KG3-R435H.
  • Each expression vector was digested with BglII and Nhel, and the light chain variable region and heavy chain variable region of 4D11 were inserted to complete the expression vector.
  • N5KG3-4D11 DNA was obtained by site-directed mutagenesis using the GeneEditor TM in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Promega) shown in Example 5.
  • Mutant DNA was prepared as a mold.
  • the mutagenesis oligonucleotide (5, terminal phosphorylated), the oligonucleotide M397V: CACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGA C (SEQ ID NO: 53) was used.
  • the candidate plasmid DNA of the mutant antibody expression vector obtained by the site-directed mutagenesis method is selected by DNA base sequence analysis to obtain an expression vector of the mutant into which the target amino acid mutation has been introduced. did.
  • This expression vector was named N5KG3-M397V.
  • Example 16 From studies using a single amino acid substitution product of the constant region of IgG3 antibody, mutants (4D11-G3 [N392K] and 4D11-G3 [M39] in which the formation of aggregates is partially suppressed. 7V] was found, and a mutant (4D11-G3 [N392KM397V]) having these two amino acid mutations was also prepared with the aim of further enhancing the effect of inhibiting the formation of aggregates.
  • the oligonucleotide for mutagenesis is N392KM397V: GGGCAGCCGG AGAACA ACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCC (SEQ ID NO: 54)
  • Oligonucleotides of the obtained mutant antibody expression vector candidate plasmid DNA were selected by DNA base sequence analysis to determine the desired amino acid mutation. Obtained an expression vector of the incoming anti-CD40 antibody variants. Plasmid DNA expressing mutant ⁇ white anti-CD40 antibody was named N5KG3-4D11- N392KM397V.
  • Example 13 and Example 14 the CH3 domain of IgG3 heavy chain is replaced with the CH3 domain of IgGl heavy chain, or the CH2 domain and CH3 domain of IgG3 heavy chain are replaced with the CH2 domain and CH3 domain of IgGl heavy chain.
  • IgG1 and IgG3 present in the CH2 domain of IgG3 antibody to further narrow down the amino acid residues that contribute to the suppression of aggregate formation. Among the amino acid residues that differ between the two, it was found that it was further involved in the suppression of IgG2 aggregate formation shown in Example 6.
  • Each mutant was prepared by converting the amino acid residue power of 4D11-G [3331] to IgGl amino acid residues. did.
  • the mutants produced were 4D11-G [3331] [F300Y] (the 300th amino acid residue F of domain swap mutant 4DU-G [3331] was converted to Y, and so on), 4D11-G [3331 ] [T33 9A], 4D 11-G [3331] [F300YT339A] (convert 300th F to Y and 339th ⁇ to)).
  • a mutant expression vector is prepared by annealing two types of oligonucleotides simultaneously into a vector DNA that is in a cage shape.
  • GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis Systenu This was carried out according to the site-directed mutagenesis method by Kuchi Mega Co.).
  • G3_F300Y CAGTACAACA GCAC GTACCG TGTGGTCAGC (SEQ ID NO: 55) is used for 4D11-G [3331] [F300Y]
  • G3—T 339A is used for 4D11-G [3331] [T339A].
  • Plasmid DNAs expressing these anti-CD40 antibody mutant proteins were designated as N5KG [3331] -4D11-F300Y, N5KG [33311-4D11—T339A, N5KG [3331] -4D11—F300YT339A.
  • the expression vector DNA prepared in Examples 17 and 18 was expressed according to Example 2. From the obtained culture supernatant (about 300 g as IgG), HiTrap, which is an antibody purification affinity column shown in Example 13, was used. Purification by rProtein G HP was performed. Table 8 shows the aggregate content of each antibody sample after purification. The 4D11-G3 antibody had an aggregate content of about 30%, whereas no mutant was detected in any of the mutants.
  • the low pH stability was confirmed for three types of mutants with amino acid substitutions in the CH2 domain in 4D11-G [3331].
  • the purified antibody of Example 19 was subjected to low pH treatment according to Example 4, and then the aggregate content was measured according to Example 3.
  • 4D 11-G3 [N392KM397V] [R435H] is the antibody that can improve the stability of IgG3 antibody in consideration of the analysis results on the stability improvement of IgG3 and IgGl domain swap mutant antibodies and various amino acid variants.
  • 4D11-G3 [F300Y] [N392KM397V] [R435H] were produced and evaluated.
  • 4D11- G3 [N392KM397V] [R435H] is the 392rd amino acid residue N of the IgG3 antibody, the 397th amino acid residue M to V, and the 435th amino acid residue. This is a 3 amino acid residue variant in which R is converted to H.
  • 4D11- G3 [F300Y] [N392KM397V] [R435H] is a 4 amino acid residue variant obtained by converting F at the 300th amino acid residue to Y in addition to 4D11-G3 [N392KM397V] [R435H].
  • the mutation of the amino acid residue of R435H was introduced to enable purification of the antibody protein by ProteinA (Ito S et. Al., Exp Clin Immunogenet.
  • the mutant expression vector was prepared using the GeneEditor TM in vitro Site-Directed Mutage nesis System (Example 5) except that the N5KG3-R435H expression vector shown in Example 12 was used as a cage. This was carried out according to the site-directed mutagenesis method by Promega).
  • 4D11-G3 [N392KM397V] [R435H] was prepared using N392K M397V: GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGA CTCCGA CGGCTCC (SEQ ID NO: 57), 4D11- G3 [F300Y] [N392KM397V]
  • N392KM397V 4D11- G3 [F300Y]
  • a plurality of oligonucleotides of G3-F300Y: CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC (SEQ ID NO: 58) and N392KM397V were simultaneously annealed to the vector DNA in a cage shape.
  • Example 5 Performing site-directed mutagenesis as shown in Example 5, and selecting the obtained candidate plasmid DNA for each mutant antibody expression vector by DNA base sequence analysis. An expression vector of the anti-CD40 antibody mutant was obtained. Plasmid DNAs expressing these anti-CD40 antibody mutant proteins were named N5KG3-4D11- [N392KM397V] [R435H], N5KG3-4D11- [F300Y] [N392KM397V] [R435H].
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 78th cytosine (C) and the 79th cytosine (C) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • SEQ ID NO: 60 the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 26th serine (S) and the 27th glutamine (Q) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 66th thymine (T) and the 67th guanine (G) (using the gene sequence prediction software (Signal P ver.2)).
  • the boundary between the signal sequence and the variable region is located between the 22nd cysteine (C) and the 23rd alanine (A) (using gene sequence prediction software (Signal P ver. 2)).
  • the cell suspension (100 ⁇ l 1well) was dispensed into a 96-well round bottom plate (Betaton Dickinson).
  • the culture supernatant (50 ⁇ 1) of each hyperidoma was added and incubated at ice temperature for 30 minutes.
  • As a negative control a HgG1 antibody against human serum albumin was used, adjusted to a concentration of 2 g / ml in Hypridoma culture medium, and incubated for 15 minutes under ice temperature after addition of 50 1.
  • 50 ⁇ l of 250-fold diluted R-PE fluorescent-labeled anti-human antibody (Southern Biotechnology) was added and incubated at ice temperature for 15 minutes.
  • the suspension was suspended in 300 to 5001 FACS buffer, and the fluorescence intensity of each cell was measured by FACS (FACSort, FACS can, manufactured by Betaton Dickinson).
  • the binding ability of the domain swap mutant antibody and the mutant antibody remained unchanged (FIG. 3).
  • the unit of the amount of antibody binding on the vertical axis is the average fluorescence intensity.
  • the isotype control value is 5.01.
  • 4D11 and KM281-1-10 are known as antagonist antibodies.
  • the effect of the antagonist activity of the antibody due to structural changes in the constant region was investigated.
  • CD95 expression is increased by adding CD40 ligand.
  • the antagonist activity of the antibody was evaluated using as an index whether the increase in the expression of CD95 can be suppressed by adding the antibody.
  • l.OxlO 6 cells / ml Ramos cell suspension was seeded on a 96-well plate at 50 ⁇ l / well.
  • the culture supernatant or purified antibody was adjusted to 2 g / ml with the medium, and added to a 96 well plate at 100 1 / well.
  • Soluble CD40 ligand (ALEXIS CORPORATION) 4 g / ml and anti-FLAG antibody (M2, Sigma) 4 g / ml were added to the medium and added to a 96-well plate at 50 ⁇ l / well. After culturing, the cells were collected and analyzed using FACS using an R-PE labeled anti-CD95 antibody (Pharmingen NJ).

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Abstract

　ヒト抗体IgG2、3サブクラスの、安定性の高い変異体の提供。 　ヒトIgG2重鎖の定常領域において、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFがYに、309番目のVがLに、もしくは339番目のTがAに置換されているIgG重鎖、およびヒトIgG3重鎖の定常領域において、少なくともKabatらによるEUインデックスにより示される392番目のNがKに、もしくは397番目のMがVに置換されているIgG重鎖、ならびにこれらの重鎖を含むモノクローナル抗体。

Description

明 細 書
安定ィ匕されたヒト IgG2および IgG3抗体
技術分野
[0001] 本発明は、ヒ HgG2および IgG3重鎖の定常領域に変異を導入することにより得られ た、安定性が改善された IgG2および IgG3抗体に関するものである。
背景技術
[0002] 免疫グロブリンは、すべての哺乳動物の血清や組織体液中に存在する糖蛋白質で 、外来抗原を認識する働きをもっている。抗体の抗原への結合により、補体系の活性 化や、細胞表面に存在する Fcレセプター（FcR)を介し、細胞の食作用、抗体依存性 細胞障害作用、メディエーターの遊離、抗原提示作用の亢進など、エフェクター機能 の活性化を介して、生体防御にかかわつている。
[0003] ヒトの免疫グロブリンには、 IgG、 IgA、 IgM、 IgDおよび IgEからなる 5つの異なったクラ スが存在する。 IgGはさらに IgGl、 IgG2、 IgG3および IgG4からなる 4つのサブクラス、ま た IgAはさらに IgAlおよび IgA2力もなる 2つのサブクラスに分類することができる。免疫 グロブリンの基本構造は、 2本の相同な軽鎖 (L鎖）と、 2本の相同な重鎖 (H鎖)から 成り立つている。免疫グロブリンのクラスとサブクラスは H鎖によって決定される。
[0004] それぞれの免疫グロブリンは異なった機能をもつことが解っている。たとえば、補体 結合能は、 IgM〉IgG3〉IgGl〉IgG2の順で高ぐ Fcレセプター Iへの親和性は、 IgG3〉Ig Gl〉IgG4〉IgG2の順で高い。またプロテイン Aに対して、 IgGl、 IgG2および IgG4が結合 することが可能である。
[0005] ヒト抗体は、血液力も採取精製されたものが医薬品として使用されているが、近年数 多くのモノクローナル抗体に関して臨床試験が実施されており、上巿されているもの も数多くある。しかし、医薬品用途で上巿または臨床開発されているモノクローナル 抗体の多くは IgGlサブクラスのもので IgG2、 IgG3サブクラスのものはほとんどない。 Ig G2は補体の活性ィ匕において、副経路を活性ィ匕できる唯一の IgGであり、インフルェン ザなどの感染症との関連が報告されている。 IgG2はまた、抗体依存性細胞障害作用 がほとんどないことが知られている。一方、 IgG3は、抗体依存性補体活性化能、抗体 依存性細胞障害作用が非常に強 、ことが知られて 、る。このような特徴を生かすこと により、新しい活性をもつ抗体医薬品の開発が期待できる。
[0006] しかし、 IgG2、 IgG3に関しては、ほとんど医薬品として開発された経験がないために 、その製造技術に関して、不確定な部分が多い。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本件発明は、ヒ HgG2および IgG3抗体の、安定性の高い変異体を作製することを目 的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、 IgG2および IgG3抗体が低 pHにおいて不安定性であること、具体的 には低 pHにお 、て凝集体を作りやす 、ことを見出した。
[0009] 一般的に、抗体を医薬品として製造する際に、プロテイン Aを用いて、ァフィ-ティ 一精製する方法が用いられる。このとき、プロテイン Aに結合した抗体を溶出するため に、低 pHの緩衝液を用いる場合が多い。また、ウィルス除去のためにも、一定時間、 低 pHで処理することが望ましい。この際に生成する凝集体が医薬品に混入すること によって、インフュージョンリアクション、補体の活性化あるいは抗体依存性細胞障害 作用が亢進することが報告されており、それらが副作用につながることが容易に推定 される。このため、凝集体の量をできるだけ低くすることは、非常に重要となる。
[0010] そこで、 IgG2および IgG3抗体の重鎖定常領域の一部のアミノ酸構造をかえることに より、低 pHにおける凝集体生成を抑制できることを見出した。
[0011] 本件発明における、ヒト IgG2および IgG3抗体の改変についての基本的な考えかた を下記に詳述する。本発明の安定化されたヒ HgG2抗体は、その重鎖定常領域にお いて、少なくとも Kabatらによる EUインデックス（Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition)により示される 300番目の Fが Yに置換（ アルファベットはアミノ酸の一文字表記。数字は Kabatらによる EUインデックス、以下 同様。）、 309番目の Vが Lに置換または 339番目の Tが Aに置換されている。好ましく は、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより示される 300番目の Fが Yに、および 309番目の Vが Lに置換されている。また好ましくは、少なくとも Kabatらによる EUインデ ックスにより示される 300番目の Fが Yに、および 339番目の Τが Αに置換されている。ま た好ましくは、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより示される 309番目の Vが L に、および 339番目の Tが Aに置換されている。更に好ましくは、少なくとも Kabatらによ る EUインデックスにより示される 300番目の Fが Yに、 309番目の Vが Lに、および 339番 目の Tが Aに置換されて!、る。
[0012] また、本発明の安定化されたヒ HgG2抗体は、その重鎖定常領域において、少なく とも CH2ドメインが IgGl重鎖の CH2ドメインに置換されている。例えば CH2ドメインが Ig G1重鎖の CH2ドメインに、あるいは CH2および CH3ドメインが IgGl重鎖の CH2および CH3ドメインに置換されて!、る。
[0013] さらに、 D270、 K322、 P329、 P331を Αに置換する力、あるいは、 P331を Sや Gに変換 することによって（アルファベットはアミノ酸の一文字表記。数字は Kabatらによる EUィ ンアッタス (Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Pift h edition)を示す）、安定性を改善し、かつ CDC活性を低減させることができる。
[0014] また、さらに L235を E、 G237を Aに置換することにより、安定性を改善し、力つ ADCC 活性を低減させることができる。また、上記とは逆に、 CDC活性および/または ADCC 活性を増強させるための変異も適宜導入できる。
[0015] 本発明の安定化されたヒ HgG3抗体は、その重鎖定常領域において、少なくとも Ka batらによる EUインデックスにより示される 392番目の Nが Kに置換または 397番目の M 力 に置換されている。好ましくは、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより示さ れる 392番目の Nが Kに、および 397番目の Mが Vに置換されている。
[0016] また、好ましくは、上述の 392番目および Zまたは 397番目の置換に対して、更に Ka batらによる EUインデックスにより示される 300番目の Fが Yに置換されている。
[0017] また、好ましくは、上述の 392番目、 397番目および 300番目の置換に関して、更に K abatらによる EUインデックスにより示される 435番目の Rが Hに置換されている。例えば 、上記の 392および 435番目が置換されているか、 397および 435番目が置換されてい る力、 392、 397および 435番目が置換されている力、 392、 300および 435番目が置換さ れているか、 397、 300および 435番目が置換されている力、あるいは 392、 397、 300お よび 435番目が置換されている。 435番目の Rの Hへの置換は、ヒト IgG3抗体の Protein Aによる精製を可能とすることを目的としている（Ito S et. al.， Exp Clin Immunogenet. 1990, 7(2):91-100.) o
[0018] また、本発明の安定化されたヒ HgG3抗体は、その重鎖定常領域において、少なく とも CH3ドメインが IgGl重鎖の CH3ドメインに置換されている。例えば CH3ドメインが Ig G1重鎖の CH3ドメインに、あるいは CH2および CH3ドメインが IgGl重鎖の CH2および CH3ドメインに置換されて!、る。
[0019] さらに、上述の置換に対して、 CDC活性および/または ADCC活性を低減または増 強させるための変異を IgG3重鎖の定常領域に導入することができる。
[0020] また、本発明は、上述置換を含む抗体の製造方法、あるいは上記置換を含む抗体 の凝集抑制方法、あるいは上述の抗体を含有する組成物である。
[0021] すなわち、本発明は以下の通りである。
[0022] [1] ヒ HgG2重鎖の定常領域において、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより 示される 300番目の Fが Yに置換されて!、る IgG重鎖。
[0023] [2] ヒ HgG2重鎖の定常領域において、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより 示される 309番目の Vが Lに置換されて!ヽる IgG重鎖。
[0024] [3] ヒ HgG2重鎖の定常領域において、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより 示される 339番目の T力 に置換されて!、る IgG重鎖。
[0025] [4] 重鎖定常領域のアミノ酸の置換力 Kabatらによる EUインデックスにより示される
331番目の Pの Sへの置換を含む、 [1]〜[3]のいずれかの IgG重鎖。
[0026] [5] [1]〜[4]のいずれかの IgG重鎖を含む、モノクローナル抗体。
[0027] [6] ハイプリドーマ KM341-1-19 (受託番号 FERM BP-7759)が産生するモノクローナ ル抗体の重鎖の可変領域を有する [1]〜[4]のいずれかの IgG重鎖。
[0028] [7] [6]の IgG重鎖およびハイブリドーマ KM341-1-19 (受託番号 FERM BP-7759)が 産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、力 なるモノクローナ ノレ抗体。
[0029] [8] 配列番号 2で示される IgG重鎖の可変領域を有する [1]〜[4]のいずれかの IgG重 鎖。
[0030] [9] [8]の IgG重鎖および配列番号 4で示される IgG軽鎖の可変領域を有する軽鎖、 力 なるモノクローナル抗体。
[0031] [10] 配列番号 31で示されるポリペプチド力もシグナル配列が除かれた部分力もな る [4]の IgG重鎖。
[0032] [11] [10]の IgG重鎖および配列番号 33で示されるポリペプチド力 シグナル配列が 除かれた部分力もなるモノクローナル抗体の軽鎖、力もなるモノクローナル抗体。
[0033] [12] 配列番号 30で示されるポリヌクレオチド。
[0034] [13] [12]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
[0035] [14] [13]の発現ベクターを含む宿主。
[0036] [15] [14]の宿主力 産生される [4]の IgG重鎖。
[0037] [16] [15]の IgG重鎖及び配列番号 32で示されるポリヌクレオチドを有する発現べク ターを含む宿主力も産生されるモノクローナル抗体の軽鎖、力もなるモノクローナル 抗体。
[0038] [17] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3
00番目の Fを Yに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[0039] [18] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3
09番目の Vを Lに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[0040] [19] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3
39番目の Tを Aに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[0041] [20] [17]〜[19]のいずれかのモノクローナル抗体の製造方法を含む製造方法。
[0042] [21] 配列番号 30で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培 養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主力 モノクローナル抗体の重鎖を取 得する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[0043] [22] 配列番号 30で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号 32で示されるポリヌク レオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/また は該宿主カゝらモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製 造方法。
[0044] [23] 配列番号 34で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培 養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主から IgG重鎖を取得する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[0045] [24] 配列番号 34で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号 36で示されるポリヌク レオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/また は該宿主カゝらモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製 造方法。
[0046] [25] [5]のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを有 する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主か らモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
[0047] [26] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3 00番目の Fを Yに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
[0048] [27] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3 09番目の Vを Lに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
[0049] [28] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3 39番目の Tを Aに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
[0050] [29] [7]、 [9]、 [11]および [16]のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として 含む医薬組成物。
[0051] [30] 腫瘍、病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる [29]の医薬 組成物。
[0052] [31] [7]、 [9]、 [11]および [16]のいずれかのモノクローナル抗体を含む組成物。
[0053] [32] ヒ HgG3重鎖の定常領域において、少なくとも Kabatらによる EUインデックスによ り示される 397番目の Mが Vに置換されている IgG重鎖。
[0054] [33] [32]の IgG重鎖を含む、モノクローナル抗体。
[0055] [34] ヒト IgG3重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3
92番目の Nを Kに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[0056] [35] ヒト IgG3重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3
97番目の Mを Vに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[0057] [36] [34]または [35]のモノクローナル抗体の製造方法を含む製造方法。
[0058] [37] [33]のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを有 する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主か らモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
[0059] [38] ヒト IgG3重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3
92番目の Nを Kに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
[0060] [39] ヒト IgG3重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 3
97番目の Mを Vに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
[0061] [40] [33]、 [36]および [37]のいずれかのモノクローナル抗体を含む組成物。
[0062] さらに、本発明は以下の態様を含む。
[0063] [41] ハイプリドーマ 2105 (受託番号 BP-8024)が産生するモノクローナル抗体の重 鎖の可変領域を有する [1]〜[4]のいずれかの IgG重鎖。
[0064] [42] [41]の IgG重鎖およびハイブリドーマ 2105 (受託番号 BP-8024)が産生するモノ クローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、力 なるモノクローナル抗体。
[0065] [43] 配列番号 6で示される IgG重鎖の可変領域を有する [1]〜[4]のいずれかの IgG 重鎖。
[0066] [44] [43]の IgG重鎖および配列番号 8で示される IgG軽鎖の可変領域を有する軽鎖
、力 なるモノクローナル抗体。
[0067] [45] 配列番号 35で示されるポリペプチド力 シグナル配列が除かれた部分力 な る [4]の IgG重鎖。
[0068] [46] [45]の IgG重鎖および配列番号 37で示されるポリペプチド力 シグナル配列が 除かれた部分力もなるモノクローナル抗体の軽鎖、力もなるモノクローナル抗体。
[0069] [47] 配列番号 34で示されるポリヌクレオチド。
[0070] [48] [47]のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
[0071] [49] [48]の発現ベクターを含む宿主。
[0072] [50] [49]に記載の宿主力も産生される [4]の IgG重鎖。
[0073] [51] [50]の IgG重鎖及び配列番号 36で示されるポリヌクレオチドを有する発現べク ターを含む宿主力も産生されるモノクローナル抗体の軽鎖、力もなるモノクローナル 抗体。
[0074] [52] [42]、 [44]、 [46]および [51]のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分とし て含む医薬組成物。
[0075] [53] 腫瘍、病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる [52]の医薬 組成物。
[0076] [54] [42]、 [44]、 [46]および [51]のいずれかのモノクローナル抗体を含む組成物。
発明の効果
[0077] IgG2重鎖のアミノ酸配列にお!/、て、 300番目の Fを Yへ、 309番目の Vを Lへ、または 3 39番目の Tを Aへ置き換えることによって安定性を改善した本発明の抗体は、抗原に 対する結合性を保持しつつ、凝集体形成、特に低 pHにおける凝集体形成が低減さ れているという特徴を備えている。従って、本発明の抗体は医薬品として安定的に製 造することができる。さらに、被験体に投与した場合、抗体の凝集体の混入によって 弓 Iき起こされる副作用を回避することが容易になり、安全に用 、ることができる。
[0078] IgG3重鎖のアミノ酸配列にお!/、て、 392番目の Nを Kへ、 397番目の Mを Vへ、または 300番目の Fを Yへ置き換えることによって安定性を改善した本発明の抗体は、抗原 に対する結合性を保持しつつ、凝集体形成、特に低 pHにおける凝集体形成が低減 されているという特徴を備えている。従って、本発明の抗体は医薬品として安定的に 製造することができる。さらに、被験体に投与した場合、抗体の凝集体の混入によつ て弓 Iき起こされる副作用を回避することが容易になり、安全に用 、ることができる。
[0079] さらに、上記の安定性の改善に加えて 331番目のプロリンのセリンへの置換等によ つて、 ADCCおよび/または CDCが低減された抗体を得ることができ、被検体に投与 した場合、 ADCCおよび/または CDCにより引き起こされる副作用を回避することがで き、さらに医薬品として安全に用いることができる。
[0080] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-005794号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0081] [図 1A]抗 CD40抗体 KM341-1-19の変異体の Ramos細胞に対する結合活性（Ramos 細胞結合活性)を示す図である。
[図 1B]抗 CD40抗体 KM341-1-19の変異体の Ramos細胞に対する結合活性（Ramos 細胞結合活性)を示す図である。 [図 1C]抗 CD40抗体 KM341-1-19および 2105の変異体の Ramos細胞に対する結合活 性 (Ramos細胞結合活性)を示す図である。
[図 2A]Ramos細胞における抗 CD40抗体 KM341-1-19の変異体による CD95発現促進 (Ramos細胞における CD95発現誘導活性）を示す図である。
[図 2B]Ramos細胞における抗 CD40抗体 KM341-1-19の変異体による CD95発現促進 (Ramos細胞における CD95発現誘導活性）を示す図である。
[図 2C]Ramos細胞における抗 CD40抗体 KM341-1-19および 2105の変異体による CD 95発現促進 (Ramos細胞における CD95発現誘導活性)を示す図である。
[図 3]抗 CD40抗体 4D 11の変異体の Ramos細胞に対する結合活性（Ramos細胞結合 活性)を示す図である。
[図 4]Ramos細胞における抗 CD40抗体 4D11の変異体による CD95発現抑制（アンタゴ 二スト活性評価)を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0082] 1. IgG2抗体および IgG3抗体の安定性の改善および物性の改善
IgG重鎖は、抗原への結合特異性を決定する可変領域および抗体のエフヱクタ一 機能発現に関与する定常領域の 2つの領域力 なる。可変領域は、それを構成する 遺伝子の組換えと体細胞変異の導入により、抗原結合部位の配列が構造上異なる。 このことが、非常に多くの外来抗原を認識することができるという特徴をもたらす。
[0083] また、抗体は本来外来の微生物、ウィルスや癌に対する生体防御機能をつかさどる 分子であるため、抗体が結合した細胞を殺傷して取り除く作用を兼ね備えており、こ れをエフヱクタ一機能と呼ぶ。この殺傷機能は 2種類あり、抗体依存性細胞性細胞傷 害活性（Antibody- Dependent Cellular Cytotoxicity0以下、 ADCCと略記）、及び補 体依存性細胞傷害活性（Complement- Dependent Cytotoxicity0以下、 CDCと略記） といわれている。 ADCCは、 Macrophage, NK細胞、好中球などがその表面に発現し ている FcRを介して、抗体の定常領域と結合し、細胞が活性ィ匕することにより誘導され る細胞障害活性のことをいう。一方、 CDCは抗体が抗原と結合することによって、活 性化された補体系によって引き起こされる細胞障害活性のことを言う。これらの活性 は、抗体のサブクラスによって、その活性の強弱が異なることが解っている（Charles A . Janeway et. al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/ Garland Publishing Inc.
) o
[0084] 本発明によれば、抗原への特異的結合性を保持しつつ、 IgG2および IgG3抗体の 安定性を改善することができる。具体的には、 IgG2重鎖のアミノ酸配列において、 300 番目の Fを Yへ、 309番目の Vを Lへ、または 339番目の Tを Aへ置き換えることによって 抗体の安定性を改善することができる。これらの置換を単独で有していてもよいし、組 合せて有していてもよい。また、 IgG2重鎖の CH2ドメインを IgGl重鎖の CH2ドメインに 、あるいは IgG2重鎖の CH2および CH3ドメインを IgGl重鎖の CH2および CH3ドメイン に置換することによって抗体の安定性を改善することができる。また、本発明によれ ば IgG3重鎖のアミノ酸配列において、 392番目の Nを Kへ、 397番目の Mを Vへ、また は 300番目の Fを Yへ、置き換えることによって抗体の安定性を改善することができる。 これらの置換を単独で有していてもよいし、組合せて有していてもよい。また、 IgG3重 鎖の CH3ドメインを IgGl重鎖の CH3ドメインに、あるいは IgG3重鎖の CH2および CH3 ドメインを IgGl重鎖の CH2および CH3ドメインに置換することによって抗体の安定性を 改善することができる。
[0085] 本発明にお 、て、あるサブクラスのドメインを他のサブクラスのドメインに置換した変 異抗体をドメインスワップ変異抗体ということがある。
[0086] 本発明にお 、て、安定性を改善した抗体とは、酸性条件下すなわち低 pH条件下、 例えば pH4以下においても抗原への結合能が低下することなぐかつ凝集体を形成 しにくい抗体をいう。または、 ProteinAまたは ProteinG親和力ラムを用いて精製した場 合、凝集体の含有量が低い抗体をいう。例えば PH3.5で 10分間または 60分間処理し た場合に形成される凝集体の含有率が 10%以下、好ましくは 5%以下、さらに好まし くは 1%以下である抗体をいう。凝集体の含有率は、例えば液体クロマトグラフィーに より柳』定することができる。
[0087] また、本発明にお 、て物性を改善した抗体とは、安定性に加えて、 ADCCおよび/ または CDCを所望の強さに調節した抗体、 FcRへの結合能を所望の程度に調節した 抗体をいい、 ADCCおよび/または CDCの調節、 FcRへの結合能の調節は、抗体に 変異を導入することにより行うことができる。 [0088] 安定性を改善した抗体に、更に適当な変異を導入することによって、 ADCCおよび /または CDCを低減または増強させることができる
たとえば、 L235、 D265、 D270、 Κ322、 Ρ331、 Ρ329 (アルファベットはアミノ酸の一文 字表記。数字は Kabatらによる EUインデックス (Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition)を示す。以下同様。）は、ヒ HgGの補体 活性ィ匕能に重要な役割を果たしていると考えられており、この部位を他のアミノ酸に 置換することによって、 CDC活性を低減できる（Esohe E. Idusogie et. al. J. Immunol. 2000, 164:4178-4184, Yuanyuan Xu et. al. J. Biol. Chem. 1994, 269:3469-3474, Br ekke, O.H. et. al. Eur. J. Immunol. 1994, 24:2542, Morgan, A., et. al., Immunology 1995, 86:319, Lund, J" et. al" J. Immunol, 1996, 157:4963, Tao, M. H" et. al" J. Exp. Med. 1993, 178:661)。具体的には、 D270、 K322、 P329、 P331を Aに置換するこ とにより可能である。また、 P331を Sや Gに変換することによつても可能である。
[0089] また、 Glu233- Ser239、 Gly316- Lys338、 Lys274- Arg301、 Tyr407- Arg416、 Asn297 、 Glu318、 Leu234- Ser239、 Asp265- Glu269、 Asn297- Thr299および Ala327- Ile332は IgGと FcRの結合に関与していると考えられており（Duncan, A. R.， Woof, J. M., Partri dge, L. J" Burton, D. R., and Winter, G. (1988) Nature 332, 563—564、 Gessner, J. E., Heiken, H., Tamm, A., and Schmidt, R. E. (1998) Ann. Hematol. 76, 23ト 248、 Gavin, A., Hulett, M., and Hogarth, P. M. (1998) in The Immunoglobulin Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity (van de Winkel, J. G.J. , and Hogarth, P. M., eds) , pp. 11-35, Kluwer Academic Publishers Group, Dordrech t, The Netherlands ^ Sautes, C. (1997) in Cell-mediated Effects of Immunoglobulins ( Fridman, W. H. , and Sautes, C, eds) , pp. 29—66, R. G. Landes Co., Austin, TX、 Da'ron, M. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234、 Canfield, S. M., and Morrison , S. L. (1991) J. Exp. Med. 173, 1483—1491、 Chappel, M. S.， Isenman, D. E.， Everet t, M., Xu, Y.-Y., Dorrington, K. J., and Klein, M. H. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 9036-9040、 Woof, J. M., Partridge, L. J., Jefferis, R., and Burton, D. R. (1986) Mol. Immunol. 23, 319—330、 Wines, B. D.， Powell, M. S.， Parren, P. W.H.I., Barnes, N.， and Hogarth, P. M. (2000) J. Immunol. 164, 5313— 5318)、この領域に変 異を導入することにより、 ADCC活性の低減が可能であると考えられる。具体的には L 235を E、 G237を Aに置換することにより、 FcRとの結合能を低減させることが可能であ る。
[0090] また、上述の逆の変異を導入することにより、安定性を改善した抗体の、 ADCCおよ び/または CDCを増強することも可能である。本発明の抗体は、 ADCCおよび/または CDCを増強した抗体も包含する。
[0091] 本発明の抗体は、上記の ADCCおよび Zまたは CDC活性の増強または低減させる アミノ酸の変異を 1以上、好ましくは 1〜20個、 1〜17個、 1〜16個、 1〜15個、 1〜14 個、 1〜13個、 1〜12個、 1〜11個、 1〜10個、 1〜9個、 1〜8個、 1〜7個、 1〜6個、 1〜5個、 1〜4個、 1〜3個または 1もしくは 2個有する。
[0092] IgG2抗体の重鎖の 300番目の F力 Wへ、 309番目の V力 へまたは 339番目の Tが Aへ 置換された安定性を改善した抗体またはこれらの置換を組合せて有し安定性を改善 した抗体には制限はないが、例えば抗 CD40抗体が挙げられる。より具体的には、ハ イブリドーマ KM341-1-19 (受託番号 BP-7759)が産生する抗体の軽鎖および重鎖の 可変領域を有する抗体あるいはハイプリドーマ 2105 (受託番号 BP-8024)が産生する 抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体が例示される。また IgG3抗体の重 鎖の 392番目の Nカ へ、 397番目 M力 Wへ、または 300番目の Fが Yへ置換された安定 性を改善した抗体またはこれらの置換を組合せて有し安定性を改善した抗体には制 限はな!/、が、例えば抗 CD40抗体が挙げられる。
[0093] 2.定義
本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
[0094] 「CD40」とは、クラークら (E. A. Clark et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986)又はスタメンコビックら（I. Stamenkovic et. al., EMBO J. 8:1403, 1989)により示 されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、特に B細胞、 DC、マクロファ ージ、内皮細胞、上皮細胞、あるいはそれらの腫瘍細胞表面に発現する抗原ポリべ プチドである。
[0095] 「抗 CD40抗体」とは、細胞発現 CD40、全長 CD40又は部分長 CD40に対するモノク ローナル抗体およびポリクローナル抗体を意味する。好ましくはモノクローナル抗体 である。
[0096] 抗 CD40抗体が有する「ァゴ二スト」作用とは、 B細胞、腫瘍細胞又は榭状細胞など の細胞表面上に発現する CD40にそのリガンドが結合することを促進する作用、ある いは、 CD40リガンドが CD40発現細胞に与える影響の 1つ以上を、 CD40を発現する 細胞に与える作用を意味し、「ァゴ二スティック抗体」とは、そのような作用を有する抗 体を意味する。 CD40発現細胞に与える影響の 1つとして、例えば B細胞増殖促進あ るいは抗体産生促進が挙げられる。
[0097] 抗 CD40抗体が有する「アンタゴ-スティック」作用とは、 B細胞、腫瘍細胞又は榭状 細胞などの細胞表面上に発現する CD40にそのリガンドが結合することを阻害する作 用、あるいは、 CD40リガンドが CD40発現細胞に与える影響の 1つ以上を中和する作 用を意味し、「アンタゴニスティック抗体」とはそのような作用を有する抗体を意味する 。 CD40発現細胞に与える影響の 1つとして、例えば B細胞増殖抑制あるいは抗体産 生抑制が挙げられる。
[0098] 「抗体」とは、ィムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに 軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域をコードする遺伝子（「抗体遺伝子」と総称する）に 由来するものである。本発明の抗体には、いずれのィムノグロブリンクラス及びアイソ タイプを有する抗体をも包含する。本発明の抗体が結合する蛋白質 (抗原）には制限 はなぐ例えば CD40が挙げられる。
[0099] 「CH1ドメイン」、 「ヒンジドメイン」、 「CH2ドメイン」および「CH3ドメイン」とは、抗体重 鎖定常領域の一部分を示しており、 Kabatらの EUインデックス（Kabat et. al.， Sequenc es of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition)に っ ヽ飞いる。 CHIト メインは EUインデックス 118から 215、ヒンジドメインは EUインデックス 216から 237、 CH2 ドメインは EUインデックス 238から 340、 CH3ドメインは EUインデックス 341から 446の配 列からなる部分である。
[0100] 「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。これまで に知られて 、るヒト IgG2としては J00230 (配列番号 64)、 AJ250170 (配列番号 65)、 AF 449616 (配列番号 66)、 AF449617 (配列番号67)、 AF449618 (配列番号 68)、 Z4980 2 (配列番号 69)または Z49801 (配列番号 70)などが、またヒト IgG3としては M12958、 K01313 (配列番号 71)、 X16110 (配列番号 72)、 X99549 (配列番号 73)、 AJ390236 ( 配列番号 74)、 AJ390237 (配列番号 75)、 AJ390238 (配列番号 76)、 AJ390241 (配列 番号 77)、 AJ390242 (配列番号 78)、 AJ390246 (配列番号 79)、 AJ390247 (配列番号 80)、 AJ390252 (配列番号 81)、 AJ390244 (配列番号 82)、 AJ390254 (配列番号 83) 、 AJ390260 (配列番号 84)、 AJ390262 (配列番号 85)、 AJ390272 (配列番号 86)、 AJ 390276 (配列番号 87)または AJ390279 (配列番号 88)などが挙げられる（以上の記号 は遺伝子の GenBankァクセッション番号である）。配列番号 64から 88に表される配列 はそれぞれの塩基配列を示す。
[0101] 「ヒ HgG重鎖」とは、重鎖可変領域およびヒ HgGの重鎖定常領域からなる重鎖であ る。例えば「ヒト IgG2重鎖」は重鎖可変領域およびヒ HgG2の重鎖定常領域からなる重 鎖である。
[0102] 「ヒ HgG抗体」とは、ヒ HgG重鎖およびヒト軽鎖力もなる抗体である。例えば「ヒ HgG2 抗体」はヒ HgG2重鎖およびヒト軽鎖力もなる抗体である。
[0103] 本発明の抗体は、当業者に周知であるハイプリドーマからの抗体遺伝子の単離方 法、上記の公知のヒト抗体遺伝子のヒト抗体定常領域の配列情報、遺伝子への部位 特異的変異導入方法等を用いることにより適宜作製しうる。
[0104] 本発明の抗体は、抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み、ベクターを適当な宿主 細胞に導入し、細胞もしくは細胞の培養上清から回収、精製すること〖こより得ることが できる。
[0105] ベクターには、宿主細胞で自律的に増殖し得るか、宿主細胞の染色体に組み込ま れ得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミド DNAとしては、大腸菌、枯草菌 又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージ DNAとしては λファージ等が挙 げられる。
[0106] 形質転換に使用する宿主としては、 目的の遺伝子を発現できるものであれば特に 限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞 (COS 細胞、 CHO細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
[0107] 宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、任意の方法 (例えばカルシウムイオンを 用いる方法、エレクト口ポレーシヨン法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸力 ルシゥム法、リポフエクシヨン法等）が挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入 する方法としては、マイクロインジェクション法、 ES細胞にエレクト口ポレーシヨンゃリポ フエクシヨン法を使用して遺伝子を導入する方法、核移植法などが挙げられる。
[0108] 本発明において、「培養物」とは、（a)培養上清、（b)培養細胞若しくは培養菌体又 はその破砕物、（c)形質転換体の分泌物のいずれをも意味するものである。形質転 換体を培養するには、使用する宿主に適した培地を用い、静置培養法、ローラーボト ルによる培養法などが採用される。
[0109] 培養後、目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細 胞を破砕することにより抗体を採取する。また、目的抗体が菌体外又は細胞外に生 産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞 を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる各種クロマトグラフィーを用 Vヽた一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記 培養物中から目的の抗体を単離精製することができる。
[0110] さらに、トランスジヱニック動物作製技術を用いて、目的抗体の遺伝子が内在性遺 伝子に組み込まれた動物宿主、例えばトランスジエニックゥシ、トランスジエニックャギ 、トランスジエニックヒッジ又はトランスジエニックブタを作製し、そのトランスジエニック 動物から分泌されるミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大 量に取得することも可能である（Wright, G., et al. (1991) Bio/Technology 9, 830-83 4)。ノ、イブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験 研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイプリドーマを増殖、維持及 び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような 既知栄養培地、あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用 Vヽて実施することが可能である。
[0111] 3.医薬組成物
また、本発明の抗体の精製された製剤を含有する医薬組成物もまた、本発明の範 囲内に含まれる。このような医薬組成物は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に 許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、他の抗体または抗生物質のような 他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩 衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含ま れるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥 (フリーズドライ） し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することに理再構成して使用し てもよい。投与経路は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注 射または配薬を含む非経腸的ルートである。
[0112] この場合、本発明の抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得るキヤ リアとの組合せとして投与される有効量は、 1回につき体重 lkgあたり 0.0001mg〜100 mgであり、 2日から 8週間間隔で投与される。
[0113] 本発明の抗体を含む医薬組成物を使用する場合は、ァゴニスティック抗 CD40抗体 については、免疫賦活化剤 (抗ウィルス剤、抗感染症剤）であり、病原体としては A、 B 、 C、 D、または E型肝炎ウィルス、 HIV、インフルエンザウイルス、単純へルぺスウィル ス、サイトメガロウィルス、 EBウイノレス、パピローマウィルス、クラミジァ、マイコプラズマ 、トキソプラズマ、マラリア、トリパノソ一マ、結核などが例示される。または抗腫瘍剤で あり、対象腫瘍としては例えば CD40を発現した癌細胞を含む悪性腫瘍、例えばリン パ腫 (例えばホジキンリンパ腫)、白血病、悪性黒色腫、脾臓癌、肺癌、卵巣癌、膀胱 癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、頭頸部癌が挙げられる。または自己免疫疾患治療剤 であり、対象疾患としてはリウマチが例示される。または、これらの疾患が複数併発し てもよい。あるいは、ガン特異的ペプチドなどのワクチンとアジュバントとして併用する ことちでさる。
[0114] 4.組成物
また、本発明の抗体を含有する組成物もまた、本発明の範囲内に含まれる。組成 物は抗体以外に、他の成分たとえば緩衝剤 (pH変化を穏やかにすることを目的とし、 例えばグルタミン酸ナトリウムが挙げられる）、安定化剤 (抗体の化学的あるいは物理 的な安定性を高めることを目的とし、例えばグリシンが挙げられる）、界面活性剤 (例 えば、ポリソルベートが挙げられる）あるいは防腐剤などを含む。組成物は、例えば、 水溶液あるいは凍結乾燥である。当該組成物は、例えば、試薬として抗原の分析に 使用することができる。本発明のアミノ酸またはドメイン置換が施された抗体は、それ が施されて 、な 、抗体に比べて凝集体生成が抑制されて 、るため、収率等の観点 力も効率的に組成物が製造できる。また、抗原分析での分析溶液中において、抗体 の凝集が起こりにく 、ので、精度の高 、結果が得られる。
実施例
[0115] 本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に よって限定されるものではない。
[0116] 実施例 1 抗 CD40抗体、 IgGl/IgG2定常領域融合体の作製
WO02/088186に記載の抗 CD40抗体のうち、ハイブリドーマ KM341- 1- 19 (受託番 号 BP-7759)が産生する抗体 (以下、 341— 1 19抗体)の軽鎖および重鎖の可変 領域を有する抗体およびハイプリドーマ 2105 (受託番号 BP-8024)が産生する抗体（ 以下、 2105抗体)の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体を作製した。ハイプリ ドーマ KM341-1-19 (受託番号 BP-7759)が産生する抗体およびハイプリドーマ 2105 ( 受託番号 BP-8024)が産生する抗体はァゴニスティック抗体であることが分力つて!/、る
[0117] 341— 1 19抗体はハイブリドーマ KM341- 1-19の産生する抗体であり、ノ、イブリド 一マ KM341-1-19は、受託番号 FERM BP-7759で、 2001年 9月 27日付で、独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1中央第 6)に寄託されている。また、 2105抗体はハイブリドーマ 2105の産 生する抗体であり、ノ、イブリドーマ 2105は、受託番号 FERM BP-8024で、 2002年 4月 17日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城 県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に寄託されている。
[0118] 341-1-19抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする塩基配列並びに重鎖及び 軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
[0119] 341-1-19抗体の重鎖塩基配列（配列番号 1)における、シグナル配列は 50番目の アデニン (A)力も始まる。シグナル配列と可変領域の境界は 109番目の [アデニン] ([A ])と 110番目のシトシン (C)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は 493番目のァ デニン (A)と 494番目のグァニン (G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Sig nal P ver.2)を使用）。
[0120] 341-1-19抗体の重鎖アミノ酸列（配列番号 2)における、シグナル配列と可変領域 の境界は 20番目のセリン (S)と 21番目のグルタミン (Q)の間に位置し、可変領域と定常 領域の境界は 148番目のセリン (S)と 149番目のァラニン (A)の間に位置する。
[0121] 以上より、 341-1-19抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号 1における 110 番目のシトシン (C)から 493番目のアデニン (A)までである。また、 341-1-19抗体 の重 鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号 2における 21番目のグルタミン (Q)から 148番 目のセリン (S)までである。
[0122] 341-1-19抗体の軽鎖塩基配列（配列番号 3)における、シグナル配列は、 29番目の 了ザニン (A)力も始まる。シグナル配列と可変領域の境界は 88番目の [アデニン] ([A]) と 89番目のグァニン (G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は 400番目のアデ ニン (A)と 401番目の [シトシン] ([C])の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Sig nal P ver.2)を使用）。
[0123] 341-1-19抗体の軽鎖アミノ酸列（配列番号 4)における、シグナル配列と可変領域 の境界は 20番目のグリシン (G)と 21番目のグルタミン酸 (E)の間に位置し、可変領域と 定常領域の境界は 124番目のリジン (K)と 125番目の [アルギニン] ([R])の間に位置する
[0124] 以上より、 341-1-19抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号 3における 89番 目のグァニン (G)から 400番目のアデニン (A)までである。また、 341-1-19抗体の軽鎖 可変領域のアミノ酸配列は、配列番号 4における 21番目のグルタミン酸 (E)から 124番 目のリジン (K)までである。
[0125] 341 - 1 - 19 重鎖塩基配列 (配列番号： 1)
重鎖アミノ酸配列（配列番号： 2) WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
341 - 1 - 19 軽鎖塩基配列 (配列番号 : 3)
Figure imgf000022_0001
341 - 1 - 19 軽鎖アミノ酸配列（配列番号： 4)
Figure imgf000022_0002
TFGPGTKVDIKRT
2105抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする DNA並びに重鎖及び軽鎖のアミノ 酸配列をそれぞれ以下に示す。
[0126] 2105抗体 の重鎖塩基配列（配列番号 5)における、シグナル配列は 70番目のアデ ニン (A)力も始まる。シグナル配列と可変領域の境界は 126番目の [チミン] ([T])と 127 番目のグァニン (G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は 495番目のアデニン (A)と 496番目のグァニン (G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P v er.2)を使用）。
[0127] 2105抗体の重鎖アミノ酸列（配列番号 6)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 19番目のシスティン (C)と 20番目のグルタミン酸 (E)の間に位置し、可変領域と定 常領域の境界は 142番目のセリン (S)と 143番目のァラニン (A)の間に位置する。
[0128] 以上より、 2105抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号 5における 127番目 のグァニン (G)力 495番目のアデニン (A)までである。また、 2105抗体の重鎖可変領 域のアミノ酸配列は、配列番号 6における 20番目のグルタミン酸 (E)から 142番目のセ リン (S)までである。
[0129] 2105抗体の軽鎖塩基配列（配列番号 7)における、シグナル配列は、 28番目のアデ ニン (A)力も始まる。シグナル配列と可変領域の境界は 87番目の [アデニン] ([A])と 88 番目のグァニン (G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は 405番目のアデニン (A)と 406番目の [シトシン] ([C])の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を使用）。
[0130] 2105抗体の軽鎖アミノ酸列（配列番号 8)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 20番目のグリシン (G)と 21番目のグルタミン酸 (E)の間に位置し、可変領域と定常 領域の境界は 126番目のリジン (K)と 127番目の [アルギニン] ([R])の間に位置する。
[0131] 以上より、 2105抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号 7における 88番目の グァニン (G)から 405番目のアデニン (A)までである。また、 2105抗体の軽鎖可変領域 のアミノ酸配列は、配列番号 8における 21番目のグルタミン酸 (E)から 126番目のリジン (K)までである。
[0132] 2105 重鎖塩基配列 (配列番号 : 5)
Figure imgf000023_0001
2105 重鎖アミノ酸配列（配列番号: 6) TALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK
2105 軽鎖塩基配列 (配列番号 : 7)
Figure imgf000024_0001
CGGTG
2105 軽鎖アミノ酸配列（配列番号: 8)
Figure imgf000024_0002
WLTFGGGTKVEIKRTV
本発明者らは、抗 CD40抗体である 4D11 (IgG4サブクラスを有する）やその変異体で ある 4D11PE (4D11抗体遺伝子の重鎖、軽鎖を含む DNA断片を、 BglII、 Nhelで消化、 精製した後、 N5KG4PEベクター（IDEC Pharmaceuticals)につなぎ換えて作製した。 N 5KG4PEは IgG4定常領域に、 S228P及び L235E、 N5KG4Pは S228Pの点変異をそれぞ れ含む。）の培養上清を Protein Aカラム（アマシャムバイオサイエンス社）にチャージ し 0.1Mクェン酸バッファー（pH2.7)により溶出した後 37°Cで 1分間および 10分間イン キュペートした条件下において、約 10%の凝集体が生成するのに対し、 4D11の定常 領域を IgGlとした 4D114D11G1においては、ほとんど凝集体が生じないことを見出し ている（特願 2003— 431408)。同様に、 IgG2においてもドメインスワップ変異抗体を用 いて、低 pHにおける凝集体形成抑制にかかわる IgGlの領域を特定するために、ドメ インスワップ変異抗体 IgG[l/l/2/2] ([1/1/2/2]は、左から順に CH1ドメイン、ヒンジドメ イン、 CH2ドメインおよび CH3ドメインに関して、 CH1ドメインは IgGl由来、ヒンジドメイ ンは IgGl由来、 CH2ドメインは IgG2由来および CH3ドメインは IgG2由来であることを意 味している。以下同様に解釈する。）、 IgG[2/2/l/l]、 IgG[2/2/l/2]、 IgG[2/2/2/l]、 を以下に述べるように作製した。
[0133] IgG[l/l/2/2]は、 N5KG1- Val Lark(lDEC Pharmaceuticals:以下 N5KG1と略記）を 铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (配列番号 9)、 24ch4: AG GGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT (配列番号 10)で 98°C1秒、 60°C30秒 、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、抗体発現ベクター N5KG2 (IDEC Pharmac euticals, US Patent 6001358、「G2」は、重鎖定常領域が IgG2由来であることを示す（ 以下、同様）。）を铸型として、プライマー 24ch3: AAGGACACTCTCATGATCTCCC GGACCCCT (配列番号 11)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を用い て、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60°C3 0秒、 72°C30秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2をカ卩えて、 15回反応した。 増幅した DNA断片を Nhel, BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き 換えた。この発現ベクターを N5KG1122と名づけた。
[0134] IgG[2/2/l/l]は、 N5KG2を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag ( (配列番号 9)、 24ch4: AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT (配列番 号 10)で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、 N5KG1を铸 型として、プライマー 24ch3: AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT (配列 番号 11)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を用いて、 98°C1秒、 60°C 30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を PCR purification kitで精 製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の 反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2をカ卩えて、 15回反応した。増幅した DNA断 片を Nhel, BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。この発現 ベクターを N5KG2211と名づけた。
[0135] IgG[2/2/l/2]は、上記のように作製した N5KG2211を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (配列番号 9)、 CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCT CTCGGGGCTGCCC (配列番号 13)で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回 行った。同時に、 N5KG2を铸型として、プライマー CH3cons: GGGCAGCCCCGAGA GCCACAGGTGTACACC (配列番号 14)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番 号 12)を用いて、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DN A断片を PCR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 9 8°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2をカ卩えて、 15回反応した。増幅した DNA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl 定常領域と置き換えた。この発現ベクターを N5KG2212と名づけた。
[0136] IgG[2/2/2/l]は、 N5KG2を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (配列番号 9)、 CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC (IS 列番号 13)で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、 N5KG1 を铸型として、プライマー CH3cons: GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACAC C (配列番号 14)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を用いて、 98°C1 秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C3 0秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。増幅した D NA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。こ の発現ベクターを N5KG2221と名づけた。
[0137] それぞれの発現ベクターを BglII、 Nhelで消化し、 341-1-19抗体の軽鎖可変領域お よび重鎖可変領域を挿入し発現ベクターを完成させた。
[0138] また、ハイプリドーマ KM341-1-19 (受託番号 BP-7759)が産生する抗体の軽鎖およ び重鎖の可変領域を有する抗体およびハイプリドーマ 2105 (受託番号 BP-8024)が産 生する抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体として 341G2Serおよび 2105 G2Serを作製した。
[0139] 341G2Serの重鎖塩基配列（配列番号 15)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 60番目の [アデニン] ([A])と 61番目のシトシン (C)の間に位置し、可変領域と定常 領域の境界は 444番目のアデニン (A)と 445番目のグァニン（G)の間に位置する（遺伝 子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を使用）。
[0140] 341G2Serの重鎖アミノ酸列（配列番号 16)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 20番目のセリン (S)と 21番目のグルタミン (Q)の間に位置し、可変領域と定常領域 の境界は 148番目のセリン (S)と 149番目のァラニン (A)の間に位置する。
[0141] 以上より、 341G2Serの重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号 15における 61番目 のシトシン（C)から 444番目のアデニン (A)までである。また、 341G2Serの重鎖可変領 域のアミノ酸配列は、配列番号 16における 21番目のグルタミン (Q)から 148番目のセリ ン (S)までである。
[0142] 341G2Ser重鎖全塩基配列（配列番号： 15)
341G2Sser重鎖全アミノ酸配列（配列番号： 16)
Figure imgf000028_0001
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
341G2Serの軽鎖塩基配列（配列番号 17)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 60番目の [アデニン] ([A])と 61番目のグァニン (G)の間に位置し、可変領域と定常 領域の境界は 372番目のアデニン (A)と 373番目の [シトシン] ([C])の間に位置する（遺 伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を使用）。
341G2Serの軽鎖アミノ酸列（配列番号 18)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 20番目のグリシン (G)と 21番目のグルタミン酸 (E)の間に位置し、可変領域と定常 領域の境界は 124番目のリジン (K)と 125番目の [アルギニン] ([R])の間に位置する。以 上より、 341G2Serの軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号 17における 61番目のグ ァニン (G)から 372番目のアデニン (A)までである。また、 341G2Serの軽鎖可変領域の アミノ酸配列は、配列番号 18における 21番目のグルタミン酸 (E)から 124番目のリジン ( K)までである。 [0144] 341G2Ser軽鎖全塩基配列（配列番号： 17)
Figure imgf000029_0001
GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
341G2Ser軽鎖全アミノ酸配列（配列番号： 18)
Figure imgf000029_0002
KSFNRGEC
2105G2Serの重鎖塩基配列（配列番号 19)における、シグナル配列と可変領域の 境界は 57番目の [チミン] ([T])と 58番目のグァニン (G)の間に位置し、可変領域と定常 領域の境界は 426番目のアデニン (A)と 427番目のグァニン (G)の間に位置する（遺伝 子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を使用）。
[0145] 2105G2Serの重鎖アミノ酸列（配列番号 20)における、シグナル配列と可変領域の 境界は 19番目のシスティン (C)と 20番目のグルタミン酸 (E)の間に位置し、可変領域と 定常領域の境界は 142番目のセリン (S)と 143番目のァラニン (A)の間に位置する。 [0146] 以上より、 2105G2Serの重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号 19における 58番目 のグァニン（G)から 426番目のアデニン (A)までである。また、 2105G2Serの重鎖可変 領域のアミノ酸配列は、配列番号 20における 20番目のグルタミン酸 (E)から 142番目 のセリン (S)までである。
[0147] 2105G2Ser重鎖全塩基配列（配列番号： 19)
GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
2105G2Ser重鎖全アミノ酸配列（配列番号： 20)
Figure imgf000031_0001
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2105G2Serの軽鎖塩基配列（配列番号 21)における、シグナル配列と可変領域の 境界は 60番目の [アデニン] ([A])と 61番目のグァニン (G)の間に位置し、可変領域と定 常領域の境界は 378番目のアデニン (A)と 379番目の [シトシン] ([C])の間に位置する（ 遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を使用）。
[0148] 2105G2Serの軽鎖アミノ酸列（配列番号 22)における、シグナル配列と可変領域の 境界は 20番目のグリシン (G)と 21番目のグルタミン酸 (E)の間に位置し、可変領域と定 常領域の境界は 126番目のリジン (K)と 127番目の [アルギニン] ([R])の間に位置する。 以上より、 2105G2Serの軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号 21における 61番目 のグァニン (G)から 378番目のアデニン (A)までである。また、 2105G2Serの軽鎖可変領 域のアミノ酸配列は、配列番号 22における 21番目のグルタミン酸 (E)から 126番目のリ ジン (K)までである。
[0149] 2105G2Ser軽鎖全塩基配列（配列番号： 21)
2105G2Ser軽鎖全アミノ酸配列（配列番号： 22)
Figure imgf000032_0001
VTKSFNRGEC
実施例 2 ドメインスワップ変異抗 CD40抗体、及び、アミノ酸置換変異体抗体の発現 '精製
実施例 1で作製した発現ベクター DNAを EndoFree Plasmid Kit (キアゲン社）にて調 製し、 FreeStyle™ 293 Expression System (インビトロジェンライフテクノロジ一社）を用 V、て、メーカー指定のプロトコールに従って発現ベクターを浮遊性 293細胞 (インビト ロジェンライフテクノロジ一社）に導入して、一過性発現により各抗体を含む培養上清 を得た。孔径 0.22 μ mのメンブランフィルター（MILLIPORE製）で濾過した培養上清（I gGとして約 500 μ g)を抗体精製用ァフニティーカラムである HiTrap rProtein A FF (力 ラム体積 lml) (アマシャムバイオサイエンス社）にチャージし、 PBS (-)で洗浄後 20mM クェン酸バッファー（PH3.4)により溶出し、 200mMリン酸バッファー（pH7.0)を含むチ ユーブに回収した。
[0150] 実施例 3 抗体溶液の凝集体の含有率の測定
抗体溶液の凝集体含有率は、高速液体クロマトグラフ装置（島津社製)及び TSK— G3000 SWカラム（東ソ一社製）と、溶媒として 20mMリン酸ナトリウム、 500mM NaCl pH 7.0を用いて分析を行った。溶出位置をゲルろ過 HPLC用分子量マーカー (オリエンタ ル酵母社) (Cat No.40403701)と比較することで、抗体蛋白の単量体とそれ以上の凝 集体のピークを同定して、それぞれのピーク面積力も凝集体の含有率を算出した。
[0151] 実施例 4 ドメインスワップ変異抗 CD40抗体の安定性の評価
実施例 2に示す方法で精製完了した各抗体サンプルの凝集体の含有率は、実施 例 3の方法で測定したところ、全試料とも 0%であった。それら精製した抗体サンプル 300 1に対し、 200mMクェン酸ナトリウム、 50mM NaClから成るバッファー（pH2.7) 60 μ 1を添カ卩して ρΗ3.5に調整し、 37°Cで 10分間あるいは 60分間インキュベートした後、 その低 pH処理溶液 150 μ 1に対して 500mMリン酸ナトリウムバッファー（pH8.0)を 37.5 1加えることにより中和した。低 pH処理後の抗体溶液の凝集体含有率は、実施例 3 に示す方法で測定した。
[0152] その結果、少なくとも CH2ドメインが IgGl由来 (IgG[2/2/l/l]或は IgG[2/2/l/2])で あれば、定常領域全体力 ¾G1である場合と同程度に低 pHで安定であることが判明し た (表 1)。表 1は、 IgG2/IgGlドメインスワップ変異抗体の低 pHにおける安定性を示す
[表 1]
Figure imgf000033_0001
氐 pHにおけるインキュべ一ション時間 実施例 5 IgG2の CH2ドメインの 1アミノ酸変異体の作製
実施例 4で 341-G2Ser抗体の定常領域の CH2ドメインを IgGlとしたドメインスワップ 変異抗体 IgG[2/2/l/2]において、ほとんど凝集体が生じないことを見出したので、更 に凝集体形成抑制に寄与しているアミノ酸残基を絞り込むために、 341G2Ser抗体の CH2ドメイン内に存在する IgGlと IgG4間で異なるアミノ酸残基 6箇所 (Kabatらによる E Uインデックスにより示される 274、 296、 300、 309、 327、 339番目）に注目して、 IgG2の アミノ酸残基から IgGlのアミノ酸残基に変換した各変異体 (341-G2Ser[Q274K] (274 番目の Gin残基を Lysへ変換、以下同様）、 341- G2Ser[F296Y]、 341- G2Ser[F300Y]、 341- G2Ser[V309L]、 341- G2Ser[G327A]、 341- G2Ser[T339A])を作製した。抗 CD40 抗体の 341- G2Ser発現ベクター（N5KG2Ser- 341)の DNAを铸型として、 GeneEditor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis System (プロメガ社）を用いた部位特異的変異導 入法により、定常領域のアミノ酸置換体をコードする各種の変異 DNAを調製した。変 異導入用オリゴヌクレオチド (5，末端リン酸ィ匕済み）としては、 Q274K:AGACCCCGA G GTCAAGTTCA ACTGGTACGT G (配列番号 23)、 F296Y: CGGGAGGAGC AG TACAACAG CACGTTCC (配列番号 24)、 F300Y:AGTTCAACAG CACGTACCG T GTGGTCAGC (配列番号 25)、 V309L : GCGTCCTCAC CGTTCTGCAC CAGGA CTGG (配列番号 26)、 G327A:AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCTCC (配 列番号 27)、 T339A: GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC C (配列番 号 28)の各オリゴヌクレオチドを用いた。 目的の変異導入用オリゴヌクレオチドと上記 キット付属の Selection Oligonucleotideを铸型 DNAとアニーリングさせて変異導入鎖を 合成した後、 GeneEditor™ Antibiotic Selection Mix存在下では変異体のみが増殖す ることを利用して変異体を選択した。より具体的には、 dsDNAテンプレートをアルカリ 条件下（0.2M NaOH、 0.2mMEDTA (最終濃度））室温で 5分間インキュベートした後、 2M酢酸アンモ-ゥム（pH4.6)を 10分の 1容量カ卩えて中和して力 エタノール沈殿に より回収した。 6種類に変異体ごとに別のチューブ中で、アルカリ変性処理した铸型 D NAに、変異導入用オリゴヌクレオチドと新しい抗生物質耐性獲得用 Selection Oligon ucleotide (Top Select 01igo、 5，末端リン酸化）、及び、キット添付のアニーリングバッ ファーをカ卩えた後、 75°Cで 5分間保温し、 37°Cにゆっくり下げることによりアニーリング を行なった。次に、変異鎖の合成と連結のために、キット付属の Synthesis 10 X buffer 、 T4 DNA Polymerase,及び T4 DNA ligaseをカ卩えて、 37°Cで 90分反応を行なった。 G eneEditor™ Antibiotic Selection Mix存在下でコンビテントセル BMH 71-18 mutSに 形質転換して培養した形質転換体大腸菌よりプラスミド DNAを調製し、更にその DNA によりコンビテントセル JM 109を形質転換後、 GeneEditor™ Antibiotic Selection Mix を含む LBプレートに播種した。各変異体について、プレートに生じた形質転換体を 培養して、プラスミド DNAを精製して DNA塩基配列を解析した。 DNA塩基配列の結果 、目的とするアミノ酸変異が導入された 6種類の抗 CD40抗体変異体の発現ベクター を取得した。それら抗 CD40抗体の 1アミノ酸置換変異体蛋白を発現するプラスミド DN Aを N5KG2Ser- 341- Q274Kゝ N5KG2Ser- 341- F296Yゝ N5KG2Ser- 341- F300Yゝ N5K G2Ser- 341- V309L、 N5KG2Ser- 341- G327A、 N5KG2Ser- 341- T339Aと命名した。
[0154] 実施例 6 1アミノ酸変異体の凝集体形成抑制評価
実施例 5の 1アミノ酸変異体の抗体発現ベクターを用いて、実施例 2に従って発現、 精製し、実施例 4に従って低 pH処理を行い、実施例 3に従って、凝集体の含有率を 測定した。
[0155] その結果、 1アミノ酸変異により、 IgGlや IgG[2/2/l/2]のレベルまで低 pHにおける 凝集体の生産が抑制される変異体は見出されなかった力 341-G2Ser[F300Y]、 341- G2Ser[V309L]、及び 341- G2Ser[T339A]では完全ではな!/、が、一部抑制されることが 確認された（表 2)。表 2は、 IgG2の CH2ドメインに IgGlの 1アミノ酸置換を導入した時 の低 pHにおける安定性を示す。
[表 2]
精製抗体 凝集体 （％)
10分間1 ^ 60分
341-G2Ser [Q27iK] L31 -ί.79
341-G2Ser [F296Y1 0.93 3.S8
341-G2Ser [ 300Y] 0.00 2.24
34l -G2S^r [V309L] Ο.ϋΟ 2.61
341-G2Ser [G327A] 0.94 4.35
341-G2Ser [T339A] 0,00 3.6G
341-G1 0,00 0.00
3 1-G2fter 0.97 4.80
*低 ρΗにおけるィンキュベーシヨン時間
実施例 7
実施例 6に示したように、 341G2Ser抗体の CH2ドメインの 1アミノ酸置換体を用いた 検討から、凝集体の生成が一部分抑制される変異体 (341-G2Ser[F300Y]、 341-G2S er[V309L]、及び 341- G2Ser[T339A])が見出せたので、更に凝集体形成抑制を促進 するために、その 3箇所の 1アミノ酸変異のいずれか 2つ、或は全て組み合わせて有 する変異体を作製した。作製した変異体は、 341-G2Ser[F300Y/V309L] (300番目の アミノ酸残基である Fを Y、更に 309番目の Vを Lへ変換、以下同様）、 341- G2Ser[F300 Y/T339A]、 341- G2Ser[V309L/T339A]、 341- G2Ser[F300Y/V309L/T339A] (300番 目の Fを Y、 309番目の Vを L、及び 339番目の Tを Aへ変換）の 4種類である。変異体発 現ベクターの作製法は、複数箇所の変異導入を行なうために、新たに作製したより長 い変異導入用オリゴヌクレオチド、或はそれらオリゴヌクレオチドを 2つ以上同時に铸 型となるベクター DNAにアニーリングさせた以外は、実施例 5の GeneEditor™ in vitro
Site-Directed Mutagenesis System (プロメガ社）による部位特異的変異導入法に従 つて実施した。変異導入用オリゴヌクレオチドとしては、 341- G2Ser[F300Y/V309L]作 製に ίま F300YV309L:AGTTCAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCAC CGT TCTGCACCAG GACTGG (配列番号 29)を、 341- G2Ser[F300Y/T339A]作製 には実施例 5で用いた F300Y及び T339Aを、 341- G2Ser[V309L/T339A]作製には V3 09L及び T339Aを、 341- G2Ser[F300Y/V309L/T339A]作製には F300YV309L及び T3 39Aを使用した。実施例 5で示した部位特異的変異導入法を行い、得られた各変異 抗体発現ベクターの候補プラスミド DNAについて DNA塩基配列解析による選択を実 施して、目的とするアミノ酸変異が導入された 4種類の抗 CD40抗体変異体の発現べ クタ一を取得した。それら抗 CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミド DNAを N5K G2Ser- 341- F300Y/V309L、 N5KG2Ser- 341- F300Y/T339A、 N5KG2Ser- 341- V309L /T339A、 N5KG2Ser- 341- F300Y/V309L/T339Aと命名した。
[0157] 341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の重鎖をコードする塩基配列並びに重鎖のアミ ノ酸配列を以下に示す。
[0158] 341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 重鎖塩基配列（配列番号： 30)
配列番号 30における、シグナル配列と可変領域の境界は 60番目のアデニン (A)と 61番目のシトシン (C)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2) を使用)。
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 重鎖アミノ酸配列（配列番号： 31)
Figure imgf000038_0001
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号 31における、シグナル配列と可変領域の境界は 20番目のセリン (S)と 21 番目のグルタミン (Q)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を 使用)。
[0160] 341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の軽鎖をコードする塩基配列並びに軽鎖のアミ ノ酸配列を以下に示す。
[0161] 341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 軽鎖塩基配列（配列番号： 32)
GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号 32における、シグナル配列と可変領域の境界は 60番目のアデニン (A)と 61番目のグァニン (G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2) を使用)。
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 軽鎖アミノ酸配列（配列番号： 33)
Figure imgf000039_0001
KSFNRGEC
配列番号 33における、シグナル配列と可変領域の境界は 20番目のグリシン (G)と 2 1番目のグルタミン酸 (E)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver. 2)を使用)。
実施例 8 341G2Serの変異体の凝集体形成抑制評価
実施例 7の 341G2Serの変異体発現ベクターを用いて、実施例 2に従って発現、精 製し、実施例 4に従って低 pH処理を行い、実施例 3に従って凝集体の含有率を測定 し低 pHにおける安定性を評価した。
その結果、 341- G2Ser[F300Y/V309L/T339A]において最も低 pHにおける凝集体 の生産が抑制されることが確認された (表 3)。
[表 3]
Figure imgf000040_0001
'低 pHにおけるインキュベーション時間
[0165] 実施例 9 2105G2Serの低 pHによる凝集体形成抑制の検証
341G2Serと同じく 2105G2Serについても、 CH2ドメインの 3つのアミノ酸を IgGlのアミ ノ酸に変換した F300YV309LT339Aの変異を持つ IgG2の定常領域を持たせた場合、 低 pH条件下での凝集体形成が抑制可能であるか検討した。 N5KG2Ser-341-F300Y /V309L/T339Aの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む DNA断片を BglII、 Nhel で消化することにより切り出し、その代わりに 2105の軽鎖可変領域および重鎖可変領 域を挿入した。得られた 2105抗体の変異体蛋白を発現するプラスミド DNAを N5KG2S er- 2105- F300YV309LT339Aと命名した。
[0166] 2105-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の H鎖全長をコードする DNA並びに H鎖のアミ ノ酸配列を以下に示す。
[0167] 2105-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 重鎖塩基配列（配列番号： 34)
GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号 34における、シグナル配列と可変領域の境界は 57番目のチミン (T)と 58 番目のグァニン (G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を 使用)。
2015-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 重鎖アミノ酸配列（配列番号： 35)
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号 35における、シグナル配列と可変領域の境界は 19番目のシスティン (C) と 20番目のグルタミン酸 (E)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P v er.2)を使用）。
[0169] 2105-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の軽鎖をコードする塩基配列並びに軽鎖のァ ミノ酸配列を以下に示す。
[0170] 2105-G2Ser[F300YV309LT339A] 軽鎖塩基配列（配列番号： 36)
Figure imgf000042_0001
配列番号 36における、シグナル配列と可変領域の境界は 60番目のアデニン (A)と 61番目のグァニン (G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2) を使用)。
[0171] 2105-G2Ser[F300YV309LT339A] 軽鎖アミノ酸配列（配列番号： 37)
Figure imgf000043_0001
VTKSFNRGEC
配列番号 37における、シグナル配列と可変領域の境界は 20番目のグリシン (G)と 2 1番目のグルタミン酸 (E)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver. 2)を使用)。
[0172] 同発現ベクター、及び、対象として N5KG2Ser-2105と N5KG1-2105の各発現べクタ 一を用いて、実施例 2の方法で抗体を発現'精製し、実施例 4及び実施例 3の方法で 、低 pHの安定性を調べた。
[0173] その結果、 2015抗体においては定常領域が IgGlの抗体でさえ凝集体の生成が高 く 341G2Serの場合ほどの効果はみられなかった力 2105- G2Serとその変異体である 2105-G2Ser[F300YV309LT339A]を比較すると、後者で安定性が高まることを確認し た (表 4)。
[表 4]
Figure imgf000043_0002
[0174] 実施例 10 抗 CD40抗体の Ramos細胞に対する結合活性
実施例 2で作製したドメインスワップ変異抗体および実施例 5で作製した変異体抗 体が、もとの抗体と同等の結合活性を示すかどうか調べるために、 CD40を発現する R amos[ATCC]細胞への結合活性を測定した。
[0175] 2xl06/mlの濃度で Ramos細胞株を 0.1%NaN、 2%FCS含有 PBSの染色バッファー（SB
3
)に浮遊させた。細胞浮遊液（100 μ 1Ζゥエル）を 96-well丸底プレート（ベタトンディッ キンソン社製）に分注した。各々のハイプリドーマの培養上清 (50 μ 1)を加え、氷温下 30分間インキュベートした。陰性コントロールとしてヒト血清アルブミンに対するヒ HgG 1抗体を用い、ハイプリドーマ培養培地で 2 g/mlの濃度に調製し、 50 1添加後氷温 下 15分間インキュベートした。 SBで洗浄した後、 250倍希釈した R-PE蛍光標識抗ヒト 抗体 (Southern Biotechnology社製) 50 μ 1を加え、氷温下 15分間インキュベートした。 S Βで 2回洗浄した後、 300〜500 1の FACS緩衝液に懸濁し、 FACS (FACSort, FACSc an,ベタトンディッキンソン社製)で各細胞の蛍光強度を測定した。
[0176] その結果、ドメインスワップ変異抗体および変異体抗体で結合性は変化無力つた（ 図 1A、 B、 C)。図 1A、 B、 Cにおいて、縦軸の抗体結合の単位は平均蛍光強度である 。図 1A、 Bおよび Cにおける isotype controlの値はそれぞれ 7.15、 7.15および 5.01で ある。
[0177] 実施例 11 Ramos細胞における抗 CD40抗体による CD95発現促進
341-1-19、 2105はァゴ-スト抗体として知られている。抗体の持つァゴ-スト活性が 、定常領域の構造変化による影響を調べた。 Ramos細胞は、 CD40リガンドを添加す ることにより、 CD95の発現上昇が観察される。この細胞に、抗体を添加することにより 、 CD95の発現が上昇するカゝを指標に、抗体のァゴニスト活性を評価した。
[0178] l.OxlO6個/ mlの Ramos細胞懸濁液を 96ゥエルプレートに 50 μ 1/wellで播種した。培 養上清又は精製抗体を、 96ゥエルプレートに 100 Ι/weU添加した。一晩培養後、細 胞を集め R- PE標識抗 CD95抗体 (Pharmingen NJ)を用い、 FACSを使って解析した。
[0179] その結果、定常領域の構造変化によって、抗体のアンタゴ-スト活性に変化は見ら れなかった（図 2A、 B、 C)。図 2A、 B、 Cにおいて、縦軸の CD95発現量の単位は平均 蛍光強度である。図 2A、 Bおよび Cにおける isotype controlの値はそれぞれ 7.58、 7.5 8および 6.29である。
[0180] 実施例 12 抗 CD40抗体、 IgGl/IgG3定常領域融合体の作製
WO02/088186に記載の抗 CD40抗体のうち、 4D11抗体の軽鎖および重鎖の可変 領域を用いて抗体を作製した。なお、これら 2つの抗体はアンタゴニストとして作用す ることが分かっている。
[0181] 4D11抗体はハイブリドーマ 4D11の産生する抗体であり、ハイプリドーマ 4D11は、受 託番号 FERM BP-7758で、 2001年 9月 21日付で、独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に寄託 されている。
[0182] 4D11抗体の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列並びに重鎖 及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
[0183] 4D11抗体の重鎖核酸配列（配列番号 38)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 93番目の [シトシン] ([C])と 94番目のシトシン (C)の間に位置し、可変領域と定常 領域の境界は 456番目のアデニン (A)と 457番目のグァニン (G)の間に位置する（遺伝 子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を使用）。
[0184] 4D11抗体の重鎖アミノ酸列（配列番号 39)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 26番目のセリン (S)と 27番目のグルタミン (Q)の間に位置し、可変領域と定常領域 の境界は 147番目のセリン (S)と 148番目のァラニン (A)の間に位置する。
[0185] 以上より、 4D11抗体の重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号 38における 94番目 のシトシン (C)から 456番目のアデニン (A)までである。また、 4D11の重鎖可変領域の アミノ酸配列は、配列番号 39における 27番目のグルタミン (Q)から 147番目のセリン (S) までである。
[0186] 4D11抗体の軽鎖核酸配列（配列番号 40)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 124番目の [チミン] ([T])と 125番目のグァニン (G)の間に位置し、可変領域と定常 領域の境界は 442番目のアデニン (A)と 443番目の [シトシン] ([C])の間に位置する（遺 伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を使用）。
[0187] 4D11抗体の軽鎖アミノ酸列（配列番号 41)における、シグナル配列と可変領域の境 界は 22番目のシスティン (C)と 23番目のァラニン (A)の間に位置し、可変領域と定常領 域の境界は 128番目のリジン (K)と 129番目の [アルギニン] ([R])の間に位置する。
[0188] 以上より、 4D 11抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号 40における 125番目 のグァニン (G)から 442番目のアデニン (A)までである。また、 4D11の軽鎖可変領域の アミノ酸配列は、配列番号 41における 23番目のァラニン (A)から 128番目のリジン (K) までである。
4D11 重鎖塩基配列 (配列番号 : 38)
Figure imgf000046_0001
AGC
4D11 重鎖アミノ酸配列（配列番号： 39)
Figure imgf000046_0002
TAADTAVYYCTRPWRYFGWFDPWGQGTLVTVSSAS
4D11 軽鎖塩基配列 (配列番号 :40)
Figure imgf000046_0003
ACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG
4D11 軽鎖アミノ酸配列（配列番号: 41) FNSYPTFGQGTKVEIKRT
IgG2抗体と同様に、 IgG3抗体においてもドメインスワップ変異抗体を用いて、低 pH における凝集体形成抑制にかかわる IgGlの領域を特定するために、ドメインスワップ 変異抗体 IgG[l/l/3/3] ([l/l/3/3]は、左力も順に CH1ドメイン、ヒンジドメイン、 CH2ド メインおよび CH3ドメインに関して、 CH1ドメインは IgGl由来、ヒンジドメインは IgGl由 来、 CH2ドメインは IgG3由来および CH3ドメインは IgG3由来であることを意味して！/、る 。以下同様に解釈する。）、 IgG[3/3/l/l]、 IgG[3/3/l/3]、 IgG[3/3/3/l]、を以下に述 ベるように作製した。
[0190] IgG[l/l/3/3]は、 N5KG1- Val Lark(lDEC Pharmaceuticals:以下 N5KG1と略記）を 铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (配列番号 9)、 13chl- R: GTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCA (配列番号 42)で 98。C 1秒、 60°C30 秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、抗体発現ベクター N5KG3 (IDEC Pharm aceuticals, US Patent 6001358、「G3」は、重鎖定常領域が IgG3由来であることを示 す（以下、同様）。）を铸型として、プライマー 13chl: TGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGAC (配列番号 43)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を 用いて、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を P CR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60 °C30秒、 72°C30秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応し た。増幅した DNA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と 置き換えた。この発現ベクターを N5KG1133と名づけた。
[0191] IgG[3/3/l/l]は、 N5KG3を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (配列番号 9) 13chl-R: GTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCA (配列番 号 42)で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、 N5KG1を铸 型として、プライマー 13chl: TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC (配列 番号 43)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を用いて、 98°C1秒、 60°C 30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を PCR purification kitで精 製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の 反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2をカ卩えて、 15回反応した。増幅した DNA断 片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。この発現 ベクターを N5KG3311と名づけた。
[0192] IgG[3/3/l/3]は、上記のように作製した N5KG3311を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (配列番号 9)、 CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCT CTCGGGGCTGCCC (配列番号 13)で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回 行った。同時に、 N5KG3を铸型として、プライマー CH3cons: GGGCAGCCCCGAGA GCCACAGGTGTACACC (配列番号 14)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番 号 12)を用いて、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DN A断片を PCR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98 °C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2をカ卩えて、 1 5回反応した。増幅した DNA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定 常領域と置き換えた。この発現ベクターを N5KG3313と名づけた。
[0193] IgG[3/3/3/l]は、 N5KG3を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (配列番号 9)、 CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC (IS 列番号 13)で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、 N5KG1 を铸型として、プライマー CH3cons: GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACAC C (配列番号 14)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を用いて、 98°C1 秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C3 0秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。増幅した D NA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。こ の発現ベクターを N5KG3331と名づけた。
[0194] それぞれの発現ベクターを BglII、 Nhelで消化し、 4D11の軽鎖可変領域および重鎖 可変領域を挿入し発現ベクターを完成させた。
[0195] 実施例 13 IgG3の CD40抗体の発現'精製、及び精製品の凝集体含有率の測定 作製した発現ベクター DNAを実施例 2に従って発現を行 ヽ、得られた培養上清 (Ig Gとして約 300 μ g)を抗体精製用ァフニティーカラムである HiTrap rProtein G HP (力 ラム体積 lml) (アマシャムバイオサイエンス社）にチャージし、 PBS (-)で洗浄後 20 mM クェン酸バッファー（pH2.7)により溶出し、 200mMリン酸バッファー（pH7.0)を含むチ ユーブに回収した。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表 5に示した。 4D 11-G3抗体は凝集体の含量が 20%以上であるのに対して、定常領域の CH3領域を Ig Glに変換したドメインスワップ変異抗体（4D11-G[3311]、及び 4D11-G[3331])におい ては、凝集体の割合が非常に少なぐ IgGlレベルまで改善することが見出された。
[表 5]
Figure imgf000049_0001
[0196] 実施例 14 IgG3と IgGlのドメインスワップ変異抗 CD40抗体の低 pH安定性の評価
4D11- G[3331]において抗体精製用ァフニティーカラム精製後の凝集体の生成が 顕著に抑制されることが示されたので、さらに低 pH安定性を調べる目的で、実施例 1 3の 4D 11- G[3331]及び 4D 11- G[3311]ドメインスワップ変異抗体の精製抗体を用 、て 、実施例 4に従って低 pH処理後、実施例 3に従って凝集体の含有率を測定した。
[0197] その結果、 4D11-G[3311]ドメインスワップ変異抗体は、低 pH処理条件においても 定常領域全体が IgGlである場合と比較して同等以上に安定であることが判明した（ 表 6)。また、 4D11-G[3331]についても 60分間のインキュベーション処理においても 3 %以下の凝集体含量に抑えられており、低 pHでの安定性が確認された。表 6は、 IgG 3/IgGlドメインスワップ変異抗体の低 pHにおける安定性を示す。
[表 6] 精製抗体 凝集体 （％)
10分 IT 60分間 A
4D11-G[3331j 85 2.51
-1D11 G[331I] 0.00 0.72
4D11 G1 2.01 1.80
'低 pHにおけるィンキュベーシヨン時間
[0198] 実施例 15 IgG3の CH3定常領域 1アミノ酸変異体の作製
ドメインスワップ変異体を用いた解析結果から、 ProteinGを用いたァフィユティー精 製においては IgG3の凝集形成に関与するのは、主に CH3であることが解ったため、 C H3ドメイン内に存在する IgGlと IgG3間で異なるアミノ酸残基 6箇所 (Kabatらによる EU インデックスにより示される 356、 358、 392、 397、 422、 435番目）に注目して、 IgG3のァ ミノ酸残基力も IgGlのアミノ酸残基に変換した各変異体 (4D11-G3[E356D] (356番目 の E残基を Dへ変換、以下同様）、 4D11- G3[M358L]、 4D11- G3[N392K]、 4D11- G3[ M397V]、 4D11- G3[I422V]、 4D11- G3[R435H])を作製した。
[0199] IgG3[E356D]は、 N5KG3を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (配列番号 9) E356D- r: CTTGGTCATCTCATCCCGGGATGGGGG (配列番号 44 )で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、抗体発現ベクター N5KG3を铸型として、プライマー E356D: CCCCCATCCCGGGATGAGATGACCAA G (配列番号 45)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を用いて、 98°C1 秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C3 0秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。増幅した D NA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。こ の発現ベクターを N5KG3— E356Dと名づけた。
[0200] IgG3[M358L]は、 N5KG3を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (配列番号 9) M358L- r: CTGGTTCTTGGTCAGCTCCTCCCGGGA (配列番号 46 )で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、抗体発現ベクター N5KG3を铸型として、プライマー M358L: TCCCGGGAGGAGCTGACCAAGAACCA G (配列番号 47)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を用いて、 98°C1 秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C3 0秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。増幅した D NA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。こ の発現ベクターを N5KG3— M358Lと名づけた。
[0201] IgG3[N392K]は、 N5KG3を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (配列番号 9) N392K-r: GGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTC (配列番号 48 )で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、抗体発現ベクター N5KG3を铸型として、プライマー N392K: GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC C (配列番号 49)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を用いて、 98°C1 秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を PCR purification kitで精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C3 0秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。増幅した D NA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。こ の発現ベクターを N5KG3—N392Kと名づけた。
[0202] IgG3[I422V]は、 N5KG3を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatca g (配列番号 9) I422V - r: GGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTG (配列番号 50) で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。同時に、抗体発現ベクター N 5KG3を铸型として、プライマー I422V: CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC ( 配列番号 51)、 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (配列番号 12)を用いて、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒の反応を 15回行った。増幅した DNA断片を PCR purification kit で精製し、 2つの精製 DNA断片を等量混合したのち、 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30 秒の反応を 5回行い、プライマー linkH、 linkH2を加えて、 15回反応した。増幅した DN A断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクターの IgGl定常領域と置き換えた。この 発現ベクターを N5KG3— I422Vと名づけた。
[0203] IgG3[R435H]は、 N5KG3を铸型として、プライマー linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatc ag (配列番号 9) R435H: CCCGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT CTTCTGCGTGTAGTGGTTGTG (配列番号 52)で 98°C1秒、 60°C30秒、 72°C30秒 の反応を 30回行った。増幅した DNA断片を Nhel、 BamHIで切断し、 N5KG1ベクター の IgGl定常領域と置き換えた。この発現ベクターを N5KG3— R435Hと名づけた。
[0204] それぞれの発現ベクターを BglII、 Nhelで消化し、 4D11の軽鎖可変領域および重鎖 可変領域を挿入し発現ベクターを完成させた。
[0205] 4D11- G3[M397V]については、実施例 5に示した GeneEditor™ in vitro Site-Direct ed Mutagenesis System (プロメガ社）を用いた部位特異的変異導入法により、 N5KG3 -4D11の DNAを铸型として変異 DNAを調製した。変異導入用オリゴヌクレオチド (5， 末端リン酸化済み）としては、 M397V: CACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGA C (配列番号 53)のオリゴヌクレオチドを用いた。部位特異的変異導入法により得られ た変異抗体発現ベクターの候補プラスミド DNAにつ ヽて、 DNA塩基配列解析による 選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された変異体の発現ベクターを取得 した。この発現ベクターを N5KG3— M397Vと名づけた。
[0206] 実施例 16 4D11-G3の変異体の凝集体形成抑制評価
IgG3のアミノ酸残基から IgGlのアミノ酸残基に変換した各変異体 (4D11-G3[E356D ]、 4D11- G3[M358L]、 4D11- G3[N392K]、 4D11- G3[M397V]、 4D11- G3[I422V]、 4D1 1-G3[R435H])について、各発現ベクター DNAを実施例 2に従って発現を行い、得ら れた培養上清 (IgGとして約 500 /z g)から、実施例 13に従って精製を実施した。精製 後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表 7に示した。表 7に示すように、 4D11-G[ N392K]、及び 4D11- G[M397V])においては、 4D11- G3抗体、及び、他の 1アミノ酸残 基変異体の凝集体の含量が 20%以上であるのに対して、 10%前後と凝集体の割合 が減少することが見出された。
[表 7]
Figure imgf000053_0001
[0207] 実施例 17 4D11-G3の変異体の凝集体形成抑制評価（2)
実施例 16に示したように、 IgG3抗体の定常領域の 1アミノ酸置換体を用いた検討か ら、凝集体の生成が一部分抑制される変異体 (4D11-G3[N392K]及び 4D11-G3[M39 7V]が見出せたので、更に凝集体形成抑制効果を高めることを目的に、この 2箇所の アミノ酸変異をあわせ持つ変異体 (4D11- G3[N392KM397V])を作製した。変異体発 現ベクターの作製法は、実施例 5の GeneEditor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis System (プロメガ社）による部位特異的変異導入法に従って、変異導入用オリゴヌク レオチド（5，末端リン酸化済み）としては、 N392KM397V: GGGCAGCCGG AGAACA ACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCC (配列番号 5 4)のオリゴヌクレオチドを用いた。得られた変異抗体発現ベクターの候補プラスミド D NAについて DNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導 入された抗 CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。抗 CD40抗体の変異体蛋 白を発現するプラスミド DNAを N5KG3-4D11- N392KM397Vと命名した。
[0208] 実施例 18 4D11-G3の変異体の凝集体形成抑制評価（3)
実施例 13及び実施例 14において、 IgG3重鎖の CH3ドメインを IgGl重鎖の CH3ドメ インに、あるいは IgG3重鎖の CH2ドメインおよび CH3ドメインを IgGl重鎖の CH2ドメイ ンおよび CH3ドメインに、置換することによって抗体の安定性を改善することができる ことが確認できたことから、更に凝集体形成抑制に寄与しているアミノ酸残基を絞り込 むために、 IgG3抗体の CH2ドメイン内に存在する IgGlと IgG3間で異なるアミノ酸残基 の中で、さらに実施例 6で示した IgG2の凝集体形成抑制に関与することが判明したァ ミノ酸残基 2箇所 (Kabatらによる EUインデックスにより示される 300、 309番目）に注目 して、 4D11-G[3331]のアミノ酸残基力も IgGlのアミノ酸残基に変換した各変異体を作 製した。作製した変異体は、 4D11- G[3331][F300Y] (ドメインスワップ変異体 4DU-G[ 3331]の 300番目のアミノ酸残基である Fを Yへ変換、以下同様）、 4D11- G[3331][T33 9A]、 4D 11-G[3331] [F300YT339A] (300番目の Fを Y、及び 339番目の Τを Αへ変換） の 3種類である。変異体発現ベクターの作製法は、 4D11- G[3331][F300YT339A]の 場合に 2種類のオリゴヌクレオチドを同時に铸型となるベクター DNAにアニーリングさ せ 7こ W外 fま、 施 f列 5の GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis Systenuノ。 口メガ社）による部位特異的変異導入法に従って実施した。変異導入用オリゴヌタレ ォチドとしては、 4D11- G[3331][F300Y]作製には G3_F300Y: CAGTACAACA GCAC GTACCG TGTGGTCAGC (配列番号 55)を、 4D11- G[3331][T339A]作製には G3— T 339A： GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGACAGCC C (配列番号 56)を、 341- G2Ser[V309L/T339A]作製には G3_F300Y及び G3_ T339Aを使用した。実施例 5で示 した部位特異的変異導入法を行 ヽ、得られた各変異抗体発現ベクターの候補プラス ミド DNAについて DNA塩基配列解析による選択を実施して、 目的とするアミノ酸変異 が導入された 3種類の抗 CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。それら抗 CD4 0抗体の変異体蛋白を発現するプラスミド DNAを N5KG[3331]- 4D11- F300Y、 N5KG[ 33311-4D11— T339A、 N5KG[3331]— 4D 11— F300YT339Aと命名した。
実施例 19 アミノ酸置換変異体抗体の発現'精製、及び精製品の凝集体含有率の 測定
実施例 17及び 18で作製した発現ベクター DNAを実施例 2に従って発現を行い、 得られた培養上清 (IgGとして約 300 g)から、実施例 13で示した抗体精製用ァフニ ティーカラムである HiTrap rProtein G HPによる精製を実施した。精製後の各抗体サ ンプルの凝集体の含有率を表 8に示した。 4D11-G3抗体は凝集体の含量が 30%程 度であるのに対して、いずれの変異体とも凝集体は検出されな力つた。
[表 8] 粘 ¾杭体 凝集体 ί%)
4D11-G3 29.7
4Dll-G3[ 392KM397Vl 0+0
4Dll-Gf3331][F300Yl 0,0
4Dll-Gi333l][T339A] 0.0
4D11-G[3331][F300Y 339A] 0.0
[0210] 実施例 20 アミノ酸置換変異体抗体の低 pH安定性の評価
4D11-G[3331]に CH2ドメイン内にアミノ酸置換をカ卩えた変異体 3種類にっ 、て、低 pH安定性を確認した。実施例 19の精製抗体を用いて、実施例 4に従って低 pH処理 後、実施例 3に従って凝集体の含有率を測定した。
[0211] その結果、 4D11- G[3331]のアミノ酸置換体は、精製後の凝集体精製が抑制される だけでなぐ低 pH処理条件においても凝集体の生成が抑制されており、安定性が改 善されることが確認された。表 9は、 IgG3/IgGlドメインスワップ変異抗体の低 pHにお ける安定性を示す。
[表 9]
Figure imgf000055_0001
*低 pH fcおけるインキュべ一ション時間
[0212] 実施例 21 IgG3の定常領域アミノ酸変異体の作製
IgG3と IgGlのドメインスワップ変異抗体と各種アミノ酸変異体の安定性改善に関す る解析結果を総合的に考慮して、 IgG3抗体の安定性を最も改善できる抗体として 4D 11-G3 [N392KM397V][R435H],及び 4D11- G3[F300Y][N392KM397V][R435H]を作 製し、その評価を行なった。 4D11- G3 [N392KM397V][R435H]は、 IgG3抗体の 392番 目のアミノ酸残基である Nを に、 397番目のアミノ酸残基である Mを Vに、そして 435番 目のアミノ酸残基である Rを Hに変換した 3アミノ酸残基の変異体である。また、 4D11- G3[F300Y][N392KM397V][R435H]は、 4D11-G3 [N392KM397V][R435H]に加えて、 更に 300番目のアミノ酸残基の Fを Yに変換した 4アミノ酸残基変異体である。ただし、 両変異体とも R435Hのアミノ酸残基の変異は、抗体蛋白質の ProteinAによる精製を 可能とするために導入した（Ito S et. al., Exp Clin Immunogenet. 1990, 7(2):91- 100. ) o変異体発現ベクターの作製法は、実施例 12に示した N5KG3— R435H発現べクタ 一 DNAを铸型とした以外は、実施例 5の GeneEditor™ in vitro Site-Directed Mutage nesis System (プロメガ社）による部位特異的変異導入法に従って実施した。変異導 入用オリゴヌクレオチドとしては、 4D11- G3 [N392KM397V][R435H]作製には N392K M397V: GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGA CTCCGA CGGCTCC (配列番号 57)を、 4D11- G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 作製には G3— F300Y: CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC (配列番号 58)及び N392KM397Vの複数のオリゴヌクレオチドを同時に铸型となるベクター DNA にアニーリングさせた。実施例 5で示した部位特異的変異導入法を行い、得られた各 変異抗体発現ベクターの候補プラスミド DNAについて DNA塩基配列解析による選択 を実施して、 目的とするアミノ酸変異が導入された 2種類の抗 CD40抗体変異体の発 現ベクターを取得した。それら抗 CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミド DNA を N5KG3- 4D11- [N392KM397V][R435H]、 N5KG3- 4D11- [F300Y][N392KM397V][R 435H]、と命名した。
[0213] 4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]の重鎖をコードする塩基配列並びに重鎖 のアミノ酸配列を以下に示す。
[0214] 4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 重鎖塩基配列（配列番号： 59)
配列番号 59における、シグナル配列と可変領域の境界は 78番目のシトシン (C)と 7 9番目のシトシン (C)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を 使用)。
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 重鎖アミノ酸配列（配列番号： 60)
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号 60における、シグナル配列と可変領域の境界は 26番目のセリン (S)と 27 番目のグルタミン (Q)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を 使用)。
[0216] 4D11- G3[F300Y][N392KM397V][R435H]の軽鎖をコードする塩基配列並びに重鎖 のアミノ酸配列を以下に示す。
[0217] 4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 軽鎖塩基配列（配列番号： 61)
配列番号 61における、シグナル配列と可変領域の境界は 66番目のチミン (T)と 67 番目のグァニン (G)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2)を 使用)。
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 軽鎖アミノ酸配列（配列番号： 62)
Figure imgf000059_0001
SPVTKSFNRGEC
配列番号 62における、シグナル配列と可変領域の境界は 22番目のシスティン (C) と 23番目のァラニン (A)の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Signal P ver.2 )を使用)。
実施例 22 4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び 4D11— G3[F300Y][N392KM397 V][R435H]抗体の精製品の凝集体形成抑制評価
4D11-G3 [N392KM397V][R435H],及び 4D11- G3[F300Y][N392KM397V][R435H] について、発現ベクター DNAを実施例 2に従って発現を行い、得られた培養上清 (Ig Gとして約 400 μ g)から、実施例 2に示した方法で HiTrap rProtein A FFを用いて精製 を行なった。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表 10に示した。実施例 1 0や実施例 13に示したように、 4D11-G3抗体の凝集体の含量が 20%以上であるの に対して、これら変異体においては、 IgGl抗体並に凝集体の割合が 1%以下に減少 し、大幅に凝集体の生成が抑制されることが見出された。
[表 10] ^製抗体 凝集体 {%)
4D11-G1 0.84
4Dll-G[S31l] 0.00
4D11-G[3331] 0.30
4D11 G3 LN392K¾1397\r] [R435H] 0.00
4Dll G3lF300YJlN392KM397V][R435H] 0.44
[0220] 実施例 23 4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び 4D11— G3[F300Y][N392KM397
V][R435H]抗体の低 pH安定性の評価
4D11-G3 [N392KM397V][R435H],及び 4D11- G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 抗体について、低 pH安定性を確認した。実施例 15の精製抗体を用いて、実施例 4に 従って低 pH処理後、実施例 3に従って凝集体の含有率を測定した。
[0221] その結果、これらのアミノ酸置換体は、精製後の凝集体生成が抑制されるだけでな ぐ低 pH処理条件においても凝集体の生成が抑制されており、安定性が改善される ことが確認された。表 11は、 IgG3/IgGlドメインスワップ変異抗体の低 pHにおける安 定性を示す。
[表 11]
Figure imgf000060_0001
実施例 24 抗 CD40抗体の Ramos細胞に対する結合活性
実施例 12および 13で作製したドメインスワップ変異抗体および 1アミノ酸置換変異 体抗体が、もとの抗体と同等の結合活性を示すかどうか調べるために、 CD40が発現 する Ramos[ATCC]細胞への結合活性を測定した。
[0223] 2xl06/mlの濃度で Ramos細胞株を 0.1%NaN、 2%FCS含有 PBSの染色バッファー（SB
3
)に浮遊させた。細胞浮遊液（100 μ 1Ζゥエル）を 96-well丸底プレート（ベタトンディッ キンソン社製）に分注した。各々のハイプリドーマの培養上清 (50 μ 1)を加え、氷温下 30分間インキュベートした。陰性コントロールとしてヒト血清アルブミンに対するヒ HgG 1抗体を用い、ハイプリドーマ培養培地で 2 g/mlの濃度に調製し、 50 1添加後氷 温下 15分間インキュベートした。 SBで洗浄した後、 250倍希釈した R-PE蛍光標識抗ヒ ト抗体 (Southern Biotechnology社製) 50 μ 1を加え、氷温下 15分間インキュベートした。 SBで 2回洗浄した後、 300〜500 1の FACS緩衝液に懸濁し、 FACS (FACSort, FACS can,ベタトンディッキンソン社製)で各細胞の蛍光強度を測定した。
[0224] その結果、ドメインスワップ変異抗体および変異体抗体で結合性は変化無力つた（ 図 3)。図 3中、縦軸の抗体結合量の単位は平均蛍光強度である。 isotype controlの 値は 5.01である。
[0225] 実施例 25 Ramos細胞における抗 CD40抗体による CD95発現抑制
4D11および KM281-1-10はアンタゴ-スト抗体として知られている。抗体の持つアン タゴニスト活性が、定常領域の構造変化による影響を調べた。 Ramos細胞は、 CD40リ ガンドを添加することにより、 CD95の発現上昇が観察される。このとき、抗体を添加す ることにより、 CD95の発現上昇が抑制できるかどうかを指標に、抗体のアンタゴ-スト 活性を評価した。
[0226] l.OxlO6個/ mlの Ramos細胞懸濁液を 96ゥエルプレートに 50 μ 1/wellで播種した。培 養上清又は精製抗体を 2 g/mlに培地で調整し、 96ゥエルプレートに 100 1/well添 カロした。可溶性 CD40リガンド（ALEXIS CORPORATION)を 4 g/mlと抗 FLAG抗体（ M2、シグマ） 4 g/mlとを培地に添カ卩し、 96ゥエルプレートに 50 μ 1/well添カ卩した。一 晚培養後、細胞を集め R-PE標識抗 CD95抗体 (Pharmingen NJ)を用い、 FACSを使つ て解析した。
[0227] その結果、定常領域の構造変化によって、抗体のアンタゴニスト活性に変化は見ら れなかった（図 4)。図 4中、縦軸の CD95発現量の単位は平均蛍光強度である。 isoty pe controlおよび CD40(- )の値は、それぞれ 27.17および 6.59である。 ヒト IgG3重鎖定常領域には多型が存在し、以下がコンセンサス配列である。本発明 の変異を下記コンセンサス配列 (配列番号 63)に適用した重鎖定常領域を有する抗 体も本発明に含まれる。下記配列中、例えば下線を付した 300番目の F、 399番目の T 、 392番目の N、 397番目の Mおよび 435番目の Rを変異させることにより、本発明の安 定ィ匕抗体を得ることができる。
Figure imgf000062_0001
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。
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配列番号 9〜 14、 23〜29および 42〜58 プライマー

Claims

請求の範囲
[I] ヒト IgG2重鎖の定常領域において、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより示さ れる 300番目の Fが Yに置換されて!、る IgG重鎖。
[2] ヒト IgG2重鎖の定常領域において、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより示さ れる 309番目の V力^に置換されて!、る IgG重鎖。
[3] ヒト IgG2重鎖の定常領域において、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより示さ れる 339番目の Tが Aに置換されて!、る IgG重鎖。
[4] 重鎖定常領域に Kabatらによる EUインデックスにより示される 331番目の Pの Sへの置 換を含む、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の IgG重鎖。
[5] 請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載の IgG重鎖を含む、モノクローナル抗体。
[6] ハイプリドーマ KM341-1-19 (受託番号 FERM BP-7759)が産生するモノクローナル抗 体の重鎖の可変領域を有する請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の IgG重鎖。
[7] 請求項 6に記載の IgG重鎖およびハイプリドーマ KM341-1-19 (受託番号 FERM BP-7
759)が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、力らなるモノク ローナル抗体。
[8] 配列番号 2で示される IgG重鎖の可変領域を有する請求項 1〜4の 、ずれか 1項に記 載の IgG重鎖。
[9] 請求項 8に記載の IgG重鎖および配列番号 4で示される IgG軽鎖の可変領域を有する 軽鎖、力もなるモノクローナル抗体。
[10] 配列番号 31で示されるポリペプチド力 シグナル配列が除かれた部分力もなる請求 項 4に記載の IgG重鎖。
[II] 請求項 10に記載の IgG重鎖および配列番号 33で示されるポリペプチド力もシグナル 配列が除かれた部分力 なるモノクローナル抗体の軽鎖、力 なるモノクローナル抗 体。
[12] 配列番号 30で示されるポリヌクレオチド。
[13] 請求項 12に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
[14] 請求項 13に記載の発現ベクターを含む宿主。
[15] 請求項 14に記載の宿主から産生される請求項 4に記載の IgG重鎖。
[16] 請求項 15に記載の IgG重鎖及び配列番号 32で示されるポリヌクレオチドを有する発 現ベクターを含む宿主力 産生されるモノクローナル抗体の軽鎖、力 なるモノクロ一 ナル抗体。
[17] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 300番 目の Fを Yに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[18] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 309番 目の Vを Lに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[19] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 339番 目の Tを Aに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[20] 請求項 17〜 19のいずれか 1項に記載の製造方法を含むモノクローナル抗体の製造 方法。
[21] 配列番号 30で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液 中で培養し、該培養物及び/または該宿主から IgG重鎖を取得する工程を含む、 IgG 重鎖の製造方法。
[22] 配列番号 30で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号 32で示されるポリヌクレオチ ドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該 宿主力 モノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方 法。
[23] 配列番号 34で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液 中で培養し、該培養物及び/または該宿主から IgG重鎖を取得する工程を含む、 IgG 重鎖の製造方法。
[24] 配列番号 34で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号 36で示されるポリヌクレオチ ドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該 宿主力 モノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方 法。
[25] 請求項 5に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチ ドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該 宿主力 モノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方 法。
[26] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 300番 目の Fを Yに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
[27] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 309番 目の Vを Lに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
[28] ヒト IgG2重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 339番 目の Tを Aに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
[29] 請求項 7、 9、 11および 16のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体を有効成分と して含む医薬組成物。
[30] 腫瘍、病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる請求項 29に記載 の医薬組成物。
[31] 請求項 7、 9、 11および 16のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体を含む組成 物。
[32] ヒト IgG3重鎖の定常領域において、少なくとも Kabatらによる EUインデックスにより示さ れる 397番目の M力 に置換されて!、る IgG重鎖。
[33] 請求項 32に記載の IgG重鎖を含む、モノクローナル抗体。
[34] ヒト IgG3重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 392番 目の Nを Kに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[35] ヒト IgG3重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 397番 目の Mを Vに置換する工程を含む、 IgG重鎖の製造方法。
[36] 請求項 34または 35に記載の製造方法を含むモノクローナル抗体の製造方法。
[37] 請求項 33に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチ ドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該 宿主力 モノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方 法。
[38] ヒト IgG3重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 392番 目の Nを Kに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
[39] ヒト IgG3重鎖の定常領域における Kabatらによる EUインデックスにより示される 397番 目の Mを Vに置換することを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。 請求項 33、 36および 37のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体を含む組成物
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