WO2006068212A1 - リパーゼ阻害剤及び皮膚疾患の予防・治療剤 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a lipase inhibitor and a prophylactic / therapeutic agent for skin diseases caused by bacterial lipase.
  • Skin diseases caused by bacterial lipase include, for example, inflammatory cases caused by lipase produced by the microorganism Propionibacterium acnes (hereinafter referred to as P. acnes) present in the skin.
  • P. acnes Propionibacterium acnes
  • Inflammatory eczema such as acne, pimples, sardines, and comedones, dandruff caused by increased lipase activity of skin resident bacteria, and generation of body odor such as side odor.
  • plant extracts are effective for prevention and treatment of acne, for example, one or two selected from bilberry (Vaccinium vitis-idaea L.) extract and its extract fractions.
  • bilberry Vaccinium vitis-idaea L.
  • microbial lipase inhibitors containing more than one species
  • Patent Document 3 skin external preparations for preventing and treating millet
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-244379
  • Patent Document 2 JP 2002-97147 A
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-115466
  • An object of the present invention is to provide a novel lipase inhibitor and a prophylactic / therapeutic agent for skin diseases caused by bacterial lipase. Means for solving the problem
  • cranberry extract is useful as an agent for preventing and treating skin diseases caused by lipase inhibitors and bacterial lipases.
  • the present inventors fractioned the active ingredient in the Cranberry extract, confirmed that it was proanthocyanidin, and completed the present invention. That is, the present invention relates to the following.
  • a lipase inhibitor containing proanthocyanidin as an active ingredient 1.
  • a lipase inhibitor comprising cranberry extract containing proanthocyanidins as an active ingredient.
  • a food, beverage, pharmaceutical or cosmetic comprising the lipase inhibitor according to item 1.
  • a prophylactic and therapeutic agent for skin diseases caused by bacterial lipase containing proanthocyanidin as an active ingredient.
  • a prophylactic / therapeutic agent for skin diseases caused by bacterial lipase comprising a cranberry extract containing proanthocyanidins as an active ingredient.
  • the present invention is a lipase inhibitor containing proanthocyanidin as an active ingredient.
  • the lipase include bacterial lipases, specifically those derived from skin resident bacteria such as P. acnes.
  • Proanthocyanidins refer to a group of compounds in which flavan 3-ol or flavan 3,4-diol is a structural unit and bonded by condensation or polymerization at the 4-position to the 6-position or the 4-position to the 8-position.
  • the proanthocyanins of the present invention include proanthocyanates such as polymeric procyanidins, prodelphidins, and propellergodins composed of trimers, tetramers, and even 10-mers of structural units. Gin and their stereoisomers are also included.
  • one or more of the bonds between the structural units are a carbon-oxygen bond (ether bond) at the 2-position 7-position hydroxyl group in addition to the carbon-carbon bond at 4-position 6-position or 4-position 8-position.
  • ether bond a carbon-oxygen bond
  • A-type bond a structure in which structural units are bonded to each other via two bonds (A-type bond)
  • A-type proanthocyanines are also included.
  • a type proanthocyanin is abundant in cranberries and peanuts.
  • proanthocyanidins from the viewpoint of the effect as a lipase inhibitor, a mixture of proanthocyanidin pentamer to 9mer, or proanthocyanidin trimer to 7mer It is particularly preferred to use a multimer such as a mixture of
  • a type A proanthocyanin trimer is represented by the following formula.
  • the proanthocyanin of the present invention may be an isolated and purified pure product or a plant extract containing broanthocyanin.
  • the plant extract can be obtained by extracting plants containing proanthocyanines such as grapes, oysters, apples, pine, peanuts, chestnuts, azuki beans and cranberries with water or organic solvents.
  • the plant extract can be further subjected to distillation under reduced pressure, spray drying, freeze drying, or the like to remove the solvent and increase the proanthocyanin content.
  • Lipase inhibitors containing proanthocyanidins as active ingredients are food and drink, pharmaceuticals or It can be used orally or parenterally with cosmetics.
  • Proanthocyanin is preferably added in such a way that the weight is, for example, 1 mg to 10 gZ adult Z days, more preferably 10 mg to LgZ adult Z days.
  • a lipase inhibitor comprising a cranberry extract containing proanthocyanidins as an active ingredient:
  • the present invention also provides a lipase inhibitor comprising a cranberry extract containing proanthocyanidin as an active ingredient.
  • Lipases include bacterial lipases, specifically those derived from skin resident bacteria such as P. acnes.
  • Cranberries are small fruit pods that originate in both Europe and North America.
  • the original species and cultivars can be used.
  • the cultivar is a fruit tree of about 20cm in height of the Vaccinium macrocarpon species or Vaccinium oxycoccus species native to Winsconsin, USA. Examples include Stevens, Benlear, Pilgrim, Early black, and Bergman.
  • a "cranberry extract containing proanthocyanidin” (hereinafter simply referred to as “cranberry extract”) is a cranberry extract having lipase inhibitory activity and a yarn and composition containing proanthocyanin Say.
  • the proanthocyanidins include, as described above, proanthocyanates such as polymer procyanidins, prodelphidins, and propellagogins, which have a trimeric, tetrameric, or even 10-mer or more power unit. Gin and their stereoisomers.
  • the extract can be obtained by extracting a cranberry plant under conditions containing proanthocyanidin. Cranberry seeds, fruits, pulp, peels and other tissues can be used as raw materials for extraction. Cranberry juice or fruit juice concentrate is also included in the Cranberry extract of the present invention.
  • a composition having a lipase inhibitory activity can be obtained by extracting the above extraction raw material under suitable conditions using water or an organic solvent.
  • Organic solvents include, for example, water-soluble alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol, acetone, ethyl methyl ketone, acetonitrile, 1,4-dioxane, N, N-dimethylformamide (D MF), acetic acid and the like.
  • the water-soluble organic solvent may be used alone, or may be used by mixing with water at an arbitrary ratio.
  • the cranberry extract obtained above can also be used as an active ingredient of the present invention. Further, in order to further enhance the activity of the extract, a column chromatograph using Cefadettas, polyamide, silica gel, ODS, etc. Purification / separation operations such as membrane separation using cellulose membranes, liquid-liquid separation using ethyl acetate-water, etc., and decomposition of impurities by addition of microorganisms such as yeast may be performed. As shown in the Examples, since proanthocyanin in the cranberry extract has a lipase inhibitory activity, it is preferable to employ conditions for increasing the content of proanthocyanin in the purification and separation operation.
  • cranberry juice When concentrating cranberry juice, it can be concentrated by any of the following methods, such as liquid membrane flow-down method, TASTE method, ultrafiltration method, reverse osmosis membrane method, freeze-drying method, and concentration method under reduced pressure.
  • a lipase inhibitor containing cranberry extract containing proanthocyanidins as an active ingredient can be added to foods, drinks, pharmaceuticals or cosmetics and used orally or parenterally.
  • the cranberry extract may be added so that the dry weight of the extract is, for example, lOmg to: LOOgZ adult Z day, preferably 100 mg to 10 gZ adult Z day.
  • the present invention also relates to a preventive / therapeutic agent for skin diseases caused by bacterial lipase, comprising proanthocyanidin or cranberry extract as an active ingredient.
  • Proanthocyanin and cranberry extract can exert a preventive or therapeutic effect on skin diseases caused by bacterial lipase through lipase inhibitory activity.
  • the bacterial lipase is a lipase derived from a skin resident bacterium such as P. acnes.
  • Skin diseases include, for example, the generation of body odors such as millet, pimples, cooking, comedones, dandruff, side odors, etc. caused by lipases derived from skin resident bacteria such as P. acnes.
  • the weight is, for example, from lmg to 10gZ adult Z days, preferably from lOmg to: LgZ adult Z days. It can be taken orally.
  • the dry weight of the extract is, for example, 1 Omg ⁇ : LOOgZ adult Z day, preferably 100mg to 10gZ adult Z day, the dose may be taken orally or parenterally.
  • the above intake may be set appropriately according to the physical condition, gender, age, and purpose of intake (prevention, treatment or symptom reduction).
  • the present invention is a food, drink, pharmaceutical or cosmetic containing the above-mentioned preventive or therapeutic agent for skin diseases.
  • the agent of the present invention is used as a food or drink, the proanthocyanidin or cranberry extract may be added to an appropriate food or drink, such as a beverage, confectionery, seasoning, or side dish.
  • the agent of the present invention can also be used as a functional food of capsule, granule, fine granule, syrup or drink type.
  • proanthocyanidin or cranberry extract can be formulated as an oral preparation, an external preparation for skin or an injection with other components.
  • Oral preparations include tablets, capsules, granules, fine granules, syrups, and drinks, and parenteral preparations include sterile solutions, suspensions and other injections, ointments, creams, solutions, etc. And other external preparations.
  • Other ingredients used in the formulation include, for example, excipients, integration agents, lubricants, swelling agents, sweeteners, coating agents, fragrances, preservatives, antioxidants, buffering agents and the like.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be contained in addition to the above materials.
  • the proanthocyanidin or cranberry extract may be prepared as a cosmetic together with a commonly used base material. Its usage is preferably applied to the skin.
  • cranberry extract was used as a sample to confirm bacterial lipase inhibitory activity and therapeutic effect against skin diseases (acne). Subsequently, the active ingredient in the cranberry extract was fractionated, and it was confirmed that it was proanthocyanin. In the examples, the unit of numerical values is% by weight unless otherwise specified.
  • the cells were cultured at 32 ° C for 48 hours to obtain a single colony of P. acnes.
  • the obtained colonies were cultured at 32 ° C. for 48 hours in an anaerobic GAM liquid medium (Nissi).
  • the bacterial cells are collected by centrifugation, then dispersed and washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), and sonicated in the same buffer under ice-cooling to give a crude enzyme solution containing lipase derived from P. acnes. Got. (2) Preparation of cranberry extract
  • the following extracts were prepared using cranberries mainly composed of Stevens species and used as test samples.
  • Fresh raw cranberry fruit lOOOOg was squeezed with a squeezer and then concentrated under reduced pressure. As a concentrated solution, 100 g was obtained.
  • the cranberry juice concentrate had a solid content of 50%, a total polyphenol content of 1.3%, a total proanthocyanin content of 0.5%, and a total anthocyanin content of 0.2%.
  • This cranberry juice concentrate had a solid content of 50%, a total polyphenol content of 4.8%, a total proanthocyanin content of 2.3%, and a total anthocyanin content of 0.6%.
  • Cranberry fruit juice concentrate (solid content 50%, total polyphenol content 1.3%) 50 g was purified by column chromatography using Sepa beads (200 g). In column chromatography, the juice concentrate was diluted with 250 ml of ion exchange water, adsorbed onto the column, washed with ion exchange water, and then eluted with 70% aqueous ethanol. Fractions containing polyphenol were collected, concentrated under reduced pressure, and then lyophilized to obtain 1.6 g of powder. This high purity cranberry extract has a total polyphenol content of 34.2% and a total proanthocyanin content. 12. 6%, total anthocyanin content 2.4%.
  • the cranberry extract prepared in (2) was added as a test sample to the lipase-containing crude enzyme solution of (1) at various concentrations, and the lipase inhibitory activity of the cranberry extract was evaluated.
  • the ribose activity was measured by a fluorescence measurement method using 4-methylumbelliferyoleate (4-MU-oleate; Sigma).
  • Example 1 demonstrates that cranberry extract is useful as a lipase inhibitor.
  • test drinks containing cranberry extract on skin diseases was evaluated by the following method.
  • Fructose, acidulant, etc. were mixed with cranberry juice mainly composed of Stevens seeds to prepare a beverage (125 ml) having the following composition.
  • Composition Energy 68kcal, Protein Og, Lipid Og, Carbohydrate 17g, Sodium 86mg, Vitamin C 37.5mg, Cranberry-derived compound (800mg quinic acid, Total positive phenol content 21 lmg, Total proanthocyanin content 41mg, Total Anthocyanin content
  • the subjects were healthy adult women in their 30s who were aware of rough skin, breakouts, and acne.
  • the purpose and contents of the test were fully explained in advance and written consent was obtained.
  • Test group (12 women, 35.5 ⁇ 0.6) who took the test subjects' skin after taking the skin measurements in consideration of attributes such as age, physique, skin quality, constitution, etc. (2 years old) or a control group (12 females, 35. 1 ⁇ 0. 5 years old) for seasonal variation measurement that does not specify drink intake in particular, so that the prior skin condition is as even as possible It was.
  • the test group received two test drinks daily, one in the morning and one in the evening.
  • the test period was 4 weeks, and each test item was measured three times before intake, 2 weeks after intake, and 4 weeks after intake. Life during the test period was not particularly limited except for the intake of the test drink.
  • the skin diagnosis by a beauty specialist was performed by visual inspection and palpation to diagnose the skin condition.
  • Diagnosis items by visual inspection are ⁇ Finger millet breakout '', ⁇ Transparency '', ⁇ Blemish '', ⁇ Redness '', ⁇ Smoothness '', and Diagnostic items by palpation are ⁇ Moistness '', ⁇
  • the three items were “smoothness” and “total skin condition”.
  • the criteria for diagnostic items are very bad (1 point), poor power (2 points), slightly bad (3 points), neither (4 points), slightly good (5 points), and quite good (6 points) ), Very good (7 points), 7 grades, replaced with scores.
  • the specialists who performed the visual inspection and palpation considered not to divide the group to which the test subject belongs. The results are shown in Table 2.
  • the growth inhibition test of P. acnes was conducted by the following method.
  • Example 2 A single colony of P. acnes obtained in Example 1 was inoculated into 10 mL of GAM liquid medium for anaerobic bacteria, and the bacterial solution that had been allowed to stand at 32 ° C for 48 hours was then boiled and degassed with physiological saline. 10-fold diluted, the out lmL to solidified anaerobes for GAM agar 10 cm 2 dish it was uniformly coated by Konra di bars.
  • a sample aqueous solution having a predetermined concentration was infiltrated into a sterilized filter paper having a diameter of 18 mm, and was allowed to stand in the center of an agar medium coated with bacterial cells. The bacteriostatic action was evaluated by comparing the diameters of circles formed by inhibiting the growth of the fungi after culturing at 32 ° C for 48 hours. As a positive control, salt benzalcoum was used. The results are shown in Table 3.
  • Non-polyphenol fraction 10. Og powder was obtained. The total polyphenol content in the powder was 0.1%, the total proanthocyanin content was 0.0%, and the total anthocyanin content was 0.0%.
  • the fraction eluted with 100 ml of 70% aqueous ethanol solution was concentrated under reduced pressure from the column after elution of the “non-polyphenol fraction”, and then freeze-dried to give 0.5 g of “polyphenol fraction” powder.
  • the total polyphenol content in the powder was 59.0%, the total proanthocyanin content was 33.1%, and the total anthocyanin content was 7.3%.
  • the above-mentioned "polyphenol fraction” was fractionated by the method described in Journal of the Science Food and Agriculture (81: 1306-1313, 2001). Specifically, 2 g of the “polyphenol fraction” was subjected to column chromatography using Sephadex LH20 (300 ml), ion-exchanged water, 50% aqueous ethanol solution, ethanol, a 1: 1 mixture of ethanol and methanol, methanol, 80 Elution was sequentially performed with 6 kinds of aqueous solutions of 800% acetone (800 ml each), and each fraction was concentrated under reduced pressure and then lyophilized to obtain the following 6 kinds of fractions.
  • Example 1 Using the cranberry extract obtained in Example 1 as an active ingredient, it is possible to prepare foods, drinks, pharmaceuticals or cosmetics containing a prophylactic / therapeutic agent for skin diseases caused by bacterial lipase.
  • This tablet can be used as an internal medicine or functional food.
  • Capsules containing 50 mg of cranberry extract, 6 mg of potato starch, 4 mg of light anhydrous keyed acid, 1 mg of calcium stearate, 80 mg of lactose as a tablet are obtained by conventional methods.
  • a solution in which the following components (1) to (6) are mixed and dissolved and a solution in which the components (7) to (10) are mixed and dissolved are mixed and made uniform to obtain a lotion.
  • a novel lipase inhibitor derived from cranberry extract containing proanthocyanidin as an active ingredient and a prophylactic / therapeutic agent for skin diseases caused by bacterial lipase containing the same as an active ingredient
  • foods and drinks, pharmaceuticals or cosmetics containing the same can be provided.

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Abstract

　本発明は、「プロアントシアニジン」又は「プロアントシアニジンを含有するクランベリー抽出物」を有効成分とする、リパーゼ阻害剤、細菌性リパーゼに起因する皮膚疾患の予防・治療剤、及び、これらを含む飲食品、医薬品または化粧品を提供する。

Description

明 細 書
リパーゼ阻害剤及び皮膚疾患の予防 ·治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、主としてリパーゼ阻害剤及び細菌性リパーゼに起因する皮膚疾患の予 防'治療剤に関する。
背景技術
[0002] 細菌性リパーゼに起因する皮膚疾患として、例えば、皮膚に存在する微生物プロピ ォ-バタテリゥム.ァクネス（Propionibacterium acnes,以下、 P. acnesと記載する）が産 生するリパーゼに起因する炎症性の二キビ、吹出物やおでき、面疔などの炎症性湿 疹ゃ、皮膚常在菌のリパーゼ活性の亢進が原因となるふけ症、脇臭等の体臭の発生 などが挙げられる。
[0003] 二キビの原因は、 P. acnesが産生するリパーゼによって脂肪が分解される結果、分 離した脂肪酸による炎症の惹起や P. acnes自身の増殖促進効果によってさらに炎症 が増悪するためと考えられている (特許文献 1参照)。また、脂肪酸が酸化された過酸 化脂肪酸の働きにより、さらに-キビが悪ィ匕すると考えられている。
従来より、二キビの予防 ·治療のために植物抽出物が有効であることは公知であり、 例えばコケモモ（Vaccinium vitis-idaea L.)抽出物及びその抽出分画物より選択した 1種又は 2種以上を含有してなる微生物性リパーゼ阻害剤 (特許文献 2参照）、ブロア ントシァ-ジンを含有する-キビ予防および治療用皮膚外用剤 (特許文献 3参照）が 知られている。
特許文献 1：特開 2004— 244379号公報
特許文献 2：特開 2002— 97147号公報
特許文献 3：特開 2004 - 115466号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、新規なリパーゼ阻害剤及び細菌性リパーゼに起因する皮膚疾患の予防 •治療剤の提供を課題とする。 課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、クランベリー抽出物がリパーゼ阻害剤及び細菌性リパーゼに起因 する皮膚疾患の予防 ·治療剤として有用であることを見出した。また本発明者らはクラ ンベリー抽出物中の有効成分を分画し、それがプロアントシァ-ジンであることを確 認し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下に関する。
1.プロアントシァ-ジンを有効成分とする、リパーゼ阻害剤。
2.プロアントシァニジンを含有するクランベリー抽出物を有効成分とする、リパーゼ 阻害剤。
3.リパーゼが Propionibacterium acnes由来である、 1.または 2.記載のリパーゼ阻害 剤。
4.上記 1.〜3.のいずれ力 1項に記載のリパーゼ阻害剤を含有する、飲食品、医薬 品または化粧品。
5.プロアントシァ-ジンを有効成分とする、細菌性リパーゼに起因する皮膚疾患の 予防，治療剤。
6.プロアントシァニジンを含有するクランベリー抽出物を有効成分とする、細菌性リ パーゼに起因する皮膚疾患の予防'治療剤。
7.細菌性リパーゼに起因する皮膚疾患が-キビ、吹出物、おでき、面疔、ふけ症、 脇臭である、上記 5.または 6.記載の予防'治療剤。
8.上記 5.〜7.のいずれ力 1項に記載の予防'治療剤を含有する、飲食品、医薬品 またはィ匕粧品。
発明を実施するための最良の形態
[0006] 1.プロアントシァ-ジンを有効成分とするリパーゼ阻害剤：
本発明は、プロアントシァ-ジンを有効成分とする、リパーゼ阻害剤である。リパー ゼとしては、細菌性リパーゼ、具体的には P. acnesなどの皮膚常在菌を由来とするも のが挙げられる。
プロアントシァニジンとは、フラバン 3—オールまたはフラバン 3, 4—ジオール を構成単位として、 4位— 6位又は 4位— 8位で縮合もしくは重合により結合した化合 物群をいう。 [0007] なお、本発明のプロアントシァ-ジンには、構成単位の 3量体、 4量体さらに 10量体 以上からなる高分子のプロシア-ジン、プロデルフィ-ジン、プロペラルゴ-ジン等の プロアントシァ-ジン、およびそれらの立体異性体等も含まれる。
また本発明のプロアントシァ-ジンには、構成単位間の結合の一つ以上が、 4位— 6位又は 4位 8位の炭素 炭素結合に加えて 2位 7位水酸基の炭素 酸素結合 (エーテル結合)を有する、すなわち、構成単位が互いに 2つの結合 (A型結合)を介 して結合している構造を有するプロアントシァ-ジン、いわゆる、 A型プロアントシァ- ジンも含まれる。 A型プロアントシァ-ジンは、クランベリーや落花生などに多く含まれ ている。
[0008] 本発明においては、これらのプロアントシァ-ジンの中でも、リパーゼ阻害剤として の効果の点から、プロアントシァ-ジン 5量体〜 9量体の混合物、又はプロアントシァ 二ジン 3量体〜 7量体の混合物等の多量体を使用することが特に好ましい。
本発明のプロアントシァ-ジンの一例として、 A型プロアントシァ-ジン 3量体を次 式に示す。
Figure imgf000004_0001
[0009] 本発明のプロアントシァ-ジンは、単離精製された純品であってもよぐまた、ブロア ントシァ-ジンを含有する植物抽出物であってもよい。植物抽出物は、ブドウ、カキ、 リンゴ、マツ、落花生、くり、ァズキ、クランベリー等のプロアントシァ-ジンを含有する 植物体を、水や有機溶媒で抽出することにより得られる。
植物抽出物を更に減圧留去、スプレードライ、あるいは凍結乾燥等に供することに より溶媒を除去し、プロアントシァ-ジン含量を高めることができる。
プロアントシァ-ジンを有効成分とするリパーゼ阻害剤は、飲食品、医薬品または 化粧品に添カ卩して、経口あるいは非経口的に使用できる。プロアントシァ-ジンは、 重量として、例えば、 lmg〜10gZ成人 Z日であることが好ましぐ更に好ましくは 10 mg〜： LgZ成人 Z日となるように添カ卩すればよい。
[0010] 2.プロアントシァニジンを含有するクランベリー抽出物を有効成分とする、リパーゼ 阻害剤：
また本発明は、プロアントシァ-ジンを含有するクランベリー抽出物を有効成分とす る、リパーゼ阻害剤である。リパーゼとしては、細菌性リパーゼ、具体的には P. acnes などの皮膚常在菌を由来とするものが挙げられる。
クランベリーとは、ヨーロッパ、北アメリカ両大陸を原産とする小果榭であり、本発明 では、その原種及び栽培品種が使用できる。栽培品種としては、アメリカのウィンスコ ンシン州の原産でッッジ科スノキ属マクロカルポン種（Vaccinium macrocarpon)又は ォキソコカス種 (Vaccinium oxycoccus)の榭高約 20cm程度の果樹で、品種名はクラ ゥリー（Crowley)、ステイーブンス (Stevens)、ベンレアー (Benlear)、ピルグリム（Pilgri m)、アーリーブラック（Early black)、バークマン（Bergman)などがある。
[0011] 「プロアントシァ-ジンを含有するクランベリー抽出物」（以下単に「クランベリー抽出 物」という）とは、リパーゼ阻害活性を有するクランベリー抽出物であり、且つプロアン トシァ-ジンを含有する糸且成物をいう。ここで、プロアントシァ-ジンとしては、上記の とおり、構成単位の 3量体、 4量体さらに 10量体以上力もなる高分子のプロシア-ジ ン、プロデルフィ-ジン、プロペラルゴ-ジン等のプロアントシァ-ジン、およびそれら の立体異性体が挙げられる。
該抽出物は、プロアントシァ-ジンを含有する条件で、クランベリーの植物体を抽出 することにより得られる。クランベリーの種子、果実、果肉、果皮類などの組織が抽出 原料として利用可能である。また、クランベリー果汁または果汁濃縮物も、本発明のク ランべリー抽出物に含まれる。
上記の抽出原料を、水又は有機溶媒等を用いて適当な条件下で抽出することによ り、リパーゼ阻害活性を有する組成物が得られる。有機溶媒とは例えば、メタノール、 エタノール、イソプロパノール、 n—ブタノール等の水溶性アルコール類、アセトン、ェ チルメチルケトン、ァセトニトリル、 1, 4—ジォキサン、 N, N—ジメチルホルムアミド（D MF)、酢酸等である。水溶性有機溶媒は単独で用いてもよいが、任意の比で水と混 合して用いてもよい。
[0012] 上記で得られたクランベリー抽出物を本発明の有効成分として使用することもできる 力 更に、抽出物の活性を更に高めるため、セフアデッタス、ポリアミド、シリカゲル、 O DS等を用いたカラムクロマトグラフ、セルロース膜等を用いた膜分離、酢酸ェチルー 水等を用いた液液分離、酵母等の微生物の添加による不純物の分解など精製-分 離操作を行ってもよい。実施例に示す通り、クランベリー抽出物中のプロアントシァ- ジンがリパーゼ阻害活性を有しているので、精製'分離操作に際しては、プロアントシ ァ-ジン含量を高める条件を採用することが好ましい。
クランベリー果汁の濃縮を行う場合は、液膜流下式、 TASTE式、限外濾過法、逆 浸透膜法、凍結乾燥法、減圧下濃縮する方法などいずれの方法でも濃縮することが できる。
プロアントシァニジンを含有するクランベリー抽出物を有効成分とするリパーゼ阻害 剤は、飲食品、医薬品または化粧品に添加し、経口あるいは非経口的に使用できる 。クランベリー抽出物は、抽出物の乾燥重量として例えば lOmg〜： LOOgZ成人 Z日 、好ましくは 100mg〜10gZ成人 Z日となるように添加すればよい。
[0013] 3.細菌性リパーゼに起因する皮膚疾患の予防 ·治療剤
また本発明は、プロアントシァ-ジン又はクランベリー抽出物を有効成分とする、細 菌性リパーゼに起因する皮膚疾患の予防 ·治療剤である。プロアントシァ-ジン及び クランベリー抽出物は、リパーゼ阻害活性を通じて、細菌性リパーゼに起因する皮膚 疾患の予防または治療効果を発揮することができる。細菌性リパーゼとは、例えば、 P . acnesなどの皮膚常在菌を由来とするリパーゼである。皮膚疾患とは、例えば、 P. ac nesなどの皮膚常在菌由来のリパーゼに起因する-キビ、吹出物、おでき、面疔、ふ け症、脇臭等の体臭の発生などである。
プロアントシァニジンを皮膚疾患の予防.治療剤の有効成分として使用する場合、 重量として例えば lmg〜10gZ成人 Z日、好ましくは lOmg〜： LgZ成人 Z日程度の 量を、服用者が経口あるいは非経口的に摂取すればよい。また、クランベリー抽出物 を皮膚疾患の予防 ·治療剤として使用する場合は、抽出物の乾燥重量として例えば 1 Omg〜： LOOgZ成人 Z日、好ましくは 100mg〜10gZ成人 Z日程度の量を、服用者 が経口あるいは非経口的に摂取すればよい。上記の摂取量は、摂取者の体調、性 別、年齢、摂取の目的（予防、治療または症状軽減等）に応じて適宜設定すればよ い。
[0014] また本発明は、上記した皮膚疾患の予防，治療剤を含有する、飲食品、医薬品また は化粧品である。本発明の剤を飲食品として使用する場合、プロアントシァ-ジン又 はクランベリー抽出物を、適当な飲食品、例えば飲料、菓子、調味料、惣菜に添加す ればよい。また、本発明の剤は、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤またはドリ ンク剤タイプの機能性食品として使用することもできる。
本発明の剤を医薬品として使用する場合、プロアントシァ-ジン又はクランベリー抽 出物を他の成分とともに経口剤、皮膚外用剤または注射剤などとして製剤化すること ができる。経口剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、ドリンク 剤等が、非経口剤としては無菌溶液剤、懸濁液剤等の注射剤、軟膏剤、クリーム、水 剤等の外用剤等が挙げられる。製剤化において使用される他の成分とは例えば、賦 形剤、統合剤、潤滑剤、膨化剤、甘味料、被覆剤、香料、防腐剤、酸化防止剤、緩 衝剤等である。また、カプセル剤の場合は、上記の材料に加えて油脂のような液体担 体を含有させることちできる。
[0015] 本発明の剤を化粧品として使用する場合は、プロアントシァ-ジン又はクランベリー 抽出物を、通常使用される基材とともに化粧品として調製すればよい。その使用法と しては、皮膚に塗布することが好適である。
実施例
[0016] 以下、実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される ものではない。実施例ではまず、クランベリー抽出物を試料として、細菌性リパーゼ阻 害活性及び皮膚疾患 (二キビ）に対する治療効果を確認した。次いで、クランベリー 抽出物中の有効成分を分画し、それがプロアントシァ-ジンであることを確認した。尚 、実施例中の数値の単位は、特に断りのない限り重量％である。
[0017] 実施例 1
〔クランベリー抽出物のリパーゼ阻害活性評価試験〕 以下の方法により、クランベリー抽出物の、細菌性リパーゼ阻害活性を評価した。
(1)細菌性リパーゼの調製
白金耳にて搔き取ったヒト皮脂を煮沸脱気した後冷却した生理食塩水 lOmLに分 散し、うち lmLを嫌気性菌用 GAM寒天培地 (ニッスィ）に塗布した。
塗布後、 32°C、 48時間培養して P. acnesの単一コロニーを得た。得られたコロニー を、嫌気性菌用 GAM液体培地 (ニッスィ)にて 32°C、 48時間培養した。菌体を遠心 回収した後に 50mM Tris- HCl(pH7. 4)にて 2回分散洗浄し、同緩衝液中にて氷 冷下において超音波破砕して P. acnes由来のリパーゼを含む粗酵素液を得た。 (2)クランベリー抽出物の調製
ステイーブンス (Stevens)種を主としたクランベリーを用いて以下の抽出物を調製し 、試験試料とした。
a)クランベリー果汁濃縮液
新鮮な生のクランベリー果実 lOOOgを、搾汁機にて搾汁した後、減圧下に濃縮した 。濃縮液として、 100gを得た。このクランベリー果汁濃縮液の固形分は 50%、総ポリ フエノール含量 1. 3%、総プロアントシァ-ジン含量 0. 5%、総アントシァニン含量 0 . 2%であった。
b)クランベリー抽出濃縮液
新鮮なクランベリー果実の搾汁残渣 200gに熱水 2リットルをカ卩えて 2時間 90°Cにカロ 温し、固液分離して、抽出液を得た。この抽出液を、減圧下に濃縮し、濃縮液 8gを得 た。このクランベリー果汁濃縮液の固形分は 50%、総ポリフエノール含量 4. 8%、総 プロアントシァ-ジン含量 2. 3%、総アントシァニン含量 0. 6%であった。
c)高純度クランベリー抽出物
クランベリー果実の果汁濃縮液（固形分 50%、総ポリフエノール含量 1. 3%) 50gを 、セパビーズ (200g)を用いたカラムクロマトグラフィーにて精製した。カラムクロマトグ ラフィ一は、果汁濃縮液をイオン交換水 250mlで希釈後、カラムに吸着させ、イオン 交換水で洗浄、ついで 70%エタノール水溶液で溶出した。ポリフエノールを含む画 分を集めた後、減圧下濃縮し、ついで凍結乾燥して、粉末 1. 6gを得た。この高純度 クランベリー抽出物の総ポリフエノール含量は 34. 2%、総プロアントシァ-ジン含量 12. 6%、総アントシァニン含量 2. 4%であった。
[0019] (3)リパーゼ阻害活性試験
上記（1)のリパーゼ含有粗酵素液に、試験試料として（2)で調製したクランベリー 抽出物を各種濃度で加え、クランベリー抽出物のリパーゼ阻害活性を評価した。リバ ーゼ活性は、 4- methylumbellifery卜 oleate(4- MU- oleate;Sigma社)を用 、た蛍光測定 法により測定した。
[0020] まず、 4- MU- oleate、粗酵素液及び試験試料を共存させ、遊離した 4- methyHimbel liferone(4-MU)の蛍光強度を測定した（Ex, 355nm:Em, 460nm)。遊離した 4-MU 量は 4-MUで作製した検量線カゝら算出し、 1分間あたりの遊離 4-MU量としてリパーゼ 活性を評価した。それぞれのリパーゼ活性は Student t検定をもちいて有意差検定を 行い、コントロールとの差を評価した。結果を表 1に示す。
[0021] 表丄
P.acnes由来リパーゼ阻害活性試験 (n=5)
遊離 4MU (pmol/min)
試料名 濃度
Mean SD b)p(t-TEST) 阻害率(％) a)0.00000 128.74 ± 7.38 1.000 0.0
クランベリー 0.00625 116.40 ± 5.02 0.033 9.6
果汁濃縮液 0.01250 105.20 ± 3.19 0.001 18.3
(%) 0.02500 56.66 ± 3.73 0.000 56.0
0.05000 30.54 士 22.98 0.000 76.3
0.10000 18.40 土 4.20 0.000 85.7
»)0.00000 115.28 ± 44.44 1.000 0.0
クランべリ一 0.00625 66.76 土 6.23 0.074 42.1
抽出濃縮液 0.01250 51.93 士 18.49 0.039 55.0
(%) 0.02500 54.13 士 11.52 0.037 53.0
0.05000 42.05 土 2.32 0.017 63.5
0.10000 32.59 ± 0.70 0.010 71.7
a)0.00000 113.21 ± 3.03 1.000 0.0
純度
0.00313 120.89 ± 3.41 0.002 9.2
クランべリ一 0.00625 101.95 ± 2.60 0.000 23.5
抽出物
0.01250 72.67 ± 7.38 0.000 45.4
(mg/mL)
0.02500 45.81 土 6.03 0.000 65.6
0.05000 42.61 土 5.43 0.000 68.0
a)試験未添加におけるリバーゼ活性を示す。
b)試料未添加のリパーゼ活性に対する有意差。
c)試料未添加のリパーゼ活性阻害率を 0%とした相対値。 いずれの試験試料も、濃度依存的に P. acnes由来リパーゼ阻害活性を示した。実 施例 1によりクランベリー抽出物がリパーゼ阻害剤として有用であることが示された。
[0022] 実施例 2
〔皮膚疾患 (二キビ）に対する評価試験〕
以下の方法により、クランベリー抽出物を含む試験飲料の、皮膚疾患 (二キビ）に対 する効果を評価した。
(1)試験飲料
ステイーブンス（Stevens)種を主としたクランベリー果汁に、果糖、酸味料などを配 合し、以下組成の飲料（1本 125ml)を調製した。
組成:エネルギー 68kcal、たんぱく質 Og、脂質 Og、炭水化物 17g、ナトリウム 86mg、ビタミン C 37. 5mg、クランベリー由来のィ匕合物（キナ酸 800mg、総ポジフ ェノール含量 21 lmg、総プロアントシァ-ジン含量 41mg、総アントシァニン含量
9mg)。
[0023] (2)試験対象者
試験対象者は、肌荒れや吹き出物、二キビなどの自覚を持つ 30歳代の健常成人 女性とした。なお、試験実施に際しては、ヘルシンキ宣言の精神に則り、事前に試験 の趣旨および内容を十分に説明し書面による同意を得た。
試験対象者を、年齢や体格、肌質、体質などの属性を考慮し事前の肌測定後、ク ランべリー果汁濃縮液飲料を摂取する試験群 (女性 12名、 35. 5±0. 6歳)または特 に飲料の摂取を指定しない季節変動計測のための対照群 (女性 12名、 35. 1 ±0. 5歳）の 2群に、事前の肌状態ができるだけ均等になるように割り付けた。
[0024] (3)試験スケジュールおよび摂取方法
試験群には試験飲料を毎日朝'夕 1本ずつ、 1日計 2本摂取させた。試験期間は 4 週間で、各試験項目の測定は、摂取前、摂取 2週間後、摂取 4週間後の 3回行った。 試験期間中の生活は、試験飲料の摂取以外は、特に制限事項は設けな力つた。
[0025] (4)有効性の評価
有効性の評価は、美容専門家 (美容に関する専門知識を有する人）による肌状態 の診断によって実施した。 a)美容専門家による肌診断
美容専門家による肌診断は、視診 ·触診を実施し、肌状態を診断した。視診による 診断項目は、「二キビ'吹き出物」、「透明感」、「シミ 'ソバカス」、「赤み」、「きめのよさ」 、の 5項目、触診による診断項目は、「しっとりさ」、「なめらかさ」、「総合的肌状態」の 3項目とした。診断項目の判定基準は、非常に悪い（1点）、力なり悪い（2点）、やや 悪い（3点）、どちらでもない (4点）、やや良い（5点）、かなり良い（6点）、非常に良い ( 7点）の 7段階で、スコアに置き換えて評価した。なお、美容専門家による肌診断でに おいて、視診'触診を行う専門家は、試験対象者がどの群に属しているか分力 ない ように配慮した。結果を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000011_0001
試験群において、二キビ'吹き出物 (視診)および赤み (視診）において有意な改善 が観察された。また、しっとり感、滑らかさなど総合的な肌状態の改善が認められた。 クランベリー抽出物が二キビに対する治療効果を有することが示された。 [0027] 実施例 3
[P. acnesの生育阻害試験〕
実施例 1で調製したクランベリー抽出物を試料とし、以下の方法により P. acnesの生 育阻害試験を行った。
実施例 1で得た P. acnesの単一コロニーを嫌気性菌用 GAM液体培地 10mLに植 菌し、 32°Cで 48時間静置培養した菌液を、煮沸脱気した生理食塩水にて 10倍希釈 し、うち lmLを 10cm2シャーレに固化した嫌気性菌用 GAM寒天培地に対しコンラー ジ棒にて均一塗布した。直径 18mmの滅菌濾紙に対し、所定の濃度の試料水溶液 を浸透させ、菌体を塗布した寒天培地の中央に静置した。 32°Cで 48時間培養後、 菌生育が阻害されて形成される円の直径を比較することにより、静菌作用を評価した 。なお、陽性対照品として塩ィ匕ベンザルコ-ゥムを用いた。結果を表 3に示す。
[0028] 3
Figure imgf000012_0001
その結果、いずれの試験試料 (クランベリー果汁濃縮液、クランベリー抽出濃縮液、 高純度クランベリー抽出物の各 10%および 20%水溶液）においても、 P. acnesに対 する生育阻害は認められな力つた。よって、クランベリー抽出物は P. acnesに対する 抗菌作用を有して ヽな ヽことが示された。
実施例 2におけるクランベリー抽出物による-キビの治療効果は、 P. acnesの生育阻 害ではなぐ P. acnesのリパーゼ阻害によって発揮されたと考えられる。
[0029] 実施例 4
〔クランベリー抽出物中の有効成分の分画〕
上記のリパーゼ阻害活性試験系を用いてクランベリー抽出物中の有効成分を分画 し、それがプロアントシァ-ジンであることを確認した。
実施例 1記載のクランベリー果汁濃縮液 40gを、アンバーライト XAD7HP (50ml) を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、非吸着及びイオン交換水 100mlで溶出し た画分を、減圧下濃縮した後、凍結乾燥し、「非ポリフエノール画分」 10. Ogの粉末を 得た。該粉末中の総ポリフエノール含量は 0. 1%、総プロアントシァ-ジン含量 0. 0 %、総アントシァニン含量 0. 0%であった。さらに、「非ポリフエノール画分」を溶出し た後のカラムから、 70%エタノール水溶液 100mlで溶出した画分を減圧下濃縮した 後、凍結乾燥し、「ポリフ ノール画分」 0. 5gの粉末を得た。該粉末中の総ポリフ ノ ール含量は 59. 0%、総プロアントシァ-ジン含量 33. 1%、総アントシァニン含量 7 . 3%であった。
[0030] 次に、上記の「ポリフエノール画分」を、 Journal of the Science Food and Agriculture (81: 1306-1313, 2001)に記載の方法で分画した。すなわち、「ポリフエノール画分」 2 gをセフアデックス LH20 (300ml)を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、イオン交 換水、 50%エタノール水溶液、エタノール、エタノールとメタノールの 1 : 1混合溶液、 メタノール、 80%アセトン水溶液の 6種類の溶液 (各 800ml)で順に溶出し、それぞ れの画分を減圧下濃縮した後、凍結乾燥し、以下 6種の分画物を得た。
[0031] (1)イオン交換水で溶出した「ヒドロキシ桂皮酸画分」 0. 51g
(2) 50%エタノール水溶液で溶出した「アントシァニン画分」 0. 46g
(3)エタノールで溶出した「フラボノール配糖体画分」 0. 12g
(4)エタノールとメタノールの 1： 1混合溶液で溶出した「プロアントシァ-ジン単量体 〜2量体画分」0. 15g
(5)メタノールで溶出した「プロアントシァ-ジン 3量体〜 7量体画分」 0. 32g
(6) 80%アセトン水溶液で溶出した「プロアントシァ-ジン 5量体〜 9量体画分」 0. 2 2g
上記で調製した計 8種の分画物について、実施例 1記載の方法でリパーゼ阻害活 性試験を実施し、各試験試料の 50%阻害濃度 (IC50値)を求めた。なお、 IC50値が 小さ!/ヽほど阻害活性が強 ヽことを示す。結果を表 4に示す。 [0032] 表 4
Figure imgf000014_0001
[0033] クランベリー果汁濃縮液の分画物のうち、「ポリフエノール画分」、特に、「プロアント シァ-ジン 3量体〜 7量体画分」および「プロアントシァ-ジン 5量体〜 9量体画分」に P. acnes由来リパーゼに対する強い阻害活性があることが認められた。プロアントシァ 二ジンがリパーゼ阻害剤として有用であることが示された。
[0034] 実施例 5
実施例 1で得たクランベリー抽出物を有効成分として、細菌性リパーゼに起因する 皮膚疾患の予防'治療剤を含有する飲食品、医薬品または化粧品を調整することが できる。
<錠剤タイプの内服剤または機能性食品 >
クランベリー抽出物 10mg、乳糖 80mg、トウモロコシデンプン 8mg、ステアリン酸マ グネシゥム 2mg、以上を 1錠分として常法により錠剤化する。この錠剤は、内服用の 医薬品または機能性食品として使用できる。
く硬質カプセルタイプ内服剤または機能性食品 >
クランベリー抽出物 50mg、バレイショデンプン 6mg、軽質無水ケィ酸 4mg、ステア リン酸カルシウム lmg、乳糖 80mg、以上を 1錠分として含むカプセルを常法により得 る。
[0035] <皮膚外用剤 >
下記成分 (5)、（6)および (7)の一部を加熱混合し、 75°Cに維持した混合物を、下 記成分（1)〜(4)を加熱混合し、 75°Cに維持した混合物に徐々に加え、これを冷却 しながら成分（7)の残部で溶解した成分 (8)および（9)を加え、軟膏を得る。
(成分） (%)
(1)ステアリン酸 18. 0% (2)セタノール 4. 0% (3) dl— α—トコフエロール 0. 2 % (4)フエノキシエタノール 0. 5% (5)トリエタノールァミン 2. 0% (6)グリセリン 5 . 0% (7)精製水 残量 (8)高純度クランベリー抽出物 1. 0% (9)グリチルリチン酸 ジカリウム 0. 5%
[0036] <皮膚塗布用化粧品 >
下記成分（1)〜 (6)を混合溶解した溶液と、成分 (7)〜（10)を混合溶解した溶液と を混合して均一にし、化粧水を得る。
(1)グリセリン 10. 0% (2) 1, 3—ブチレングリコール 6. 0% (3)高純度クランベリ 一抽出物 30. 0% (4)クェン酸 0. 1% (5)クェン酸ナトリウム 0. 3% (6)精製水 残量（7)ポリオキシエチレン（60Ε. Ο. )硬化ヒマシ油 0. 5% (8)エチルアルコール 8. 0% (9)パラォキシ安息香酸メチル 0. 1% (10)香料
産業上の利用可能性
[0037] 本発明によれば、プロアントシァ-ジンを有効成分とする、クランベリー抽出物由来 の新規なリパーゼ阻害剤、及びこれを有効成分とする、細菌性リパーゼに起因する 皮膚疾患の予防'治療剤並びにこれを含有する飲食品、医薬品または化粧品を提 供することができる。

Claims

請求の範囲
[I] プロアントシァ-ジンを有効成分とする、リパーゼ阻害剤。
[2] プロアントシァニジンが、プロアントシァニジン 5量体〜 9量体である請求項 1記載の リパーゼ阻害剤。
[3] プロアントシァニジンが、プロアントシァニジン 3量体〜 7量体である請求項 1記載の リパーゼ阻害剤。
[4] プロアントシァ-ジンを含有するクランベリー抽出物を有効成分とする、リパーゼ阻 害剤。
[5] プロアントシァニジンが、プロアントシァニジン 5量体〜 9量体である請求項 4記載の リパーゼ阻害剤。
[6] プロアントシァ-ジンが、プロアントシァ-ジン 3量体〜 7量体である請求項 4記載の リパーゼ阻害剤。
[7] リパーゼが Propionibacterium acnes由来である、請求項 1〜6の何れかに記載のリ パーゼ阻害剤。
[8] 請求項 1〜7のいずれか 1項に記載のリパーゼ阻害剤を含有する、飲食品、医薬品 または化粧品。
[9] プロアントシァ-ジンを有効成分とする、細菌性リパーゼに起因する皮膚疾患の予 防 *治療剤。
[10] プロアントシァニジンが、プロアントシァニジン 5量体〜 9量体である請求項 9記載の 皮膚疾患の予防'治療剤。
[II] プロアントシァ-ジンが、プロアントシァ-ジン 3量体〜 7量体である請求項 9記載の 皮膚疾患の予防'治療剤。
[12] プロアントシァニジンを含有するクランベリー抽出物を有効成分とする、細菌性リバ ーゼに起因する皮膚疾患の予防'治療剤。
[13] プロアントシァニジンが、プロアントシァニジン 5量体〜 9量体である請求項 12記載 の皮膚疾患の予防'治療剤。
[14] プロアントシァ-ジンが、プロアントシァ-ジン 3量体〜 7量体である請求項 12記載 の皮膚疾患の予防 ·治療剤。 細菌性リパーゼに起因する皮膚疾患が二キビ、吹出物、おでき、面疔、ふけ症、脇 臭である、請求項 9〜14の何れかに記載の予防'治療剤。
請求項 9〜15のいずれか 1項に記載の予防 ·治療剤を含有する、飲食品、医薬品 またはィ匕粧品。
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