WO2006067913A1 - フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 - Google Patents

フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 Download PDF

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WO2006067913A1
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fucose
gene
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Masayuki Tsuchiya
Shigeyuki Iijima
Izumi Sugo
Yasuo Sekimori
Kiyoshi Habu
Masamichi Sugimoto
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a recombinant protein, particularly an antibody, using a cell in which the function of a fucose transporter is inhibited.
  • An antibody can exert an antitumor effect by ADCC (antibody dependent cytotoxicity) activity or CDC (complement dependent cytotoxicity) activity.
  • An antibody is a glycoprotein to which a sugar chain is bound, and it is known that the strength of the cytotoxic activity of an antibody can vary depending on the type and amount of the sugar chain bound to the antibody. In particular, it has been reported that the amount of fucose bound to an antibody is strongly related to the strength of cytotoxic activity (see Non-Patent Document 1). Furthermore, in order to obtain an antibody with enhanced cytotoxic activity, a recombinant antibody that does not have fucose is produced by producing an antibody that catalyzes the binding of fucose to a sugar chain during antibody production. A method has been reported (see Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 Shi elds et al., J Biol Chem., 277 (30), 26733-26740, 2002 Patent Document 1 International Publication No. W000 / 61739 Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a recombinant protein in which fucose binding is lost or reduced easily and reliably.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing an antibody in which the binding of fucose disappears or decreases and the cytotoxic activity is enhanced.
  • the present invention further aims to provide a host cell for producing such a protein.
  • fucose binds to the antibody in antibody-producing cells
  • GDP binds to fucose taken up into the cell
  • GDP-fucose is taken up into the Golgi, where the fucose of GDP-fucose is protein.
  • N-acetildarcosamine which is added as a sugar chain.
  • antibody molecules The Fc region has two sites where glycoside-linked sugar chains bind, and fucose binds to the N-glycoside-linked sugar chain N-acetylyldarcosamine moiety (Pate L. j Smith etal. J. Cell Biol. 2002, 158, 8 (H- 815 ). 't
  • the present inventors can inhibit fucose incorporation into the Golgi apparatus, and as a result can inhibit the addition of fucose to the antibody.
  • the present invention has been completed by producing cells in which both fucose transport genes on the chromosome are disrupted.
  • to inhibit the addition of fucose to an antibody does not require that all of the produced antibody does not contain fucose, and the ratio of the protein to which fucose is added in the antibody composition is reduced. If you do.
  • the present invention is as follows.
  • a method for producing a protein comprising culturing the cell according to any one of [1] to [8].
  • FIG. 1 is a diagram showing the structures of three types of sunset-getting vectors.
  • Figure 2 shows the structure of the band that appears after the first-stage knockout and is cut with Bglll.
  • - Figure 3 is a photograph showing the results of Southern blot analysis of the first stage knockout.
  • FIG. 4 is a graph showing the homologous recombination efficiency of the second stage knocker.
  • Fig. 5 is a photograph showing the results of Southern blot analysis of a fucose transport gene-deficient strain.
  • FIG. 6 shows the results of fucose expression analysis of a fucose transporter gene-deficient strain (wild / KO).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of fucose expression analysis of a fucose transporin gene-deficient strain (K0 / K0).
  • FIG. 8 shows ADCC activity of each anti-HM1.24 antibody when human PBMC is used and ARH-77 is the target cell.
  • FIG. 9 is a graph showing ADCC activity of each anti-GPC3 antibody using husk PBMC and HuH-7 as a target cell.
  • J Figure 10 shows normal phase HPLC chromatography of 2-AB sugar chains prepared from FT-K0 cell-producing humanized anti-HM1.24 antibody (a) and CH0 cell-produced, humanized anti-HM1.2 antibody (b).
  • FIG. 10 shows normal phase HPLC chromatography of 2-AB sugar chains prepared from FT-K0 cell-producing humanized anti-HM1.24 antibody (a) and CH0 cell-produced, humanized anti-HM1.2 antibody (b).
  • Figure 11 shows the normal-phase HPLC chromatogram of agaractosyl 2-AB-modified glycan prepared from FT-K0 cell-producing humanized anti-GPC3 antibody (a, b, c) and CH0 cell-produced humanized anti-GPC3 antibody.
  • FIG. 11 shows the normal-phase HPLC chromatogram of agaractosyl 2-AB-modified glycan prepared from FT-K0 cell-producing humanized anti-GPC3 antibody (a, b, c) and CH0 cell-produced humanized anti-GPC3 antibody.
  • FIG. 12 is a diagram showing the estimated structure of peaks G (0) and G (0) -Fuc shown in FIG.
  • FIG. 13 is a diagram showing a DSC (differential scanning calorimeter) measurement chart for the FT-K0 cell-producing antibody (a) and the CH0 cell-producing antibody (b).
  • DSC differential scanning calorimeter
  • the fucose transporter means a polypeptide having fucose transport activity.
  • the fucose transporter when expressed on the cell membrane, the fucose transporter is usually incorporated into the cell, and the fucose transporter is the Golgi. If it is expressed on the membrane, fucose is usually taken into the Golgi.
  • a preferred fucose transporter is a Chinese hamster fucose transporter, and more preferably a fucose transporter having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the Chinese hamster fucose transport gene.
  • the function of the fucose transporter is inhibited, thereby inhibiting the incorporation of fucose into the Golgi body. It can be inhibited and the amount of fucose transported into the Golgi can be reduced.
  • Inhibiting the function of the fucose transporter in the cell means reducing or eliminating the fucose transport activity of the fucose transporter. . Inhibition of the function of the fucose transporter in the cell may be carried out by any method, but a method 'inhibiting the expression of the fucose transporter is preferred.
  • the inhibition of expression of fucose ⁇ transporters is not particularly limited as long as the number of fucose transporters with normal transport ability is reduced, but fucose using a futuristic targeting vector etc.
  • a method of deleting (knockout) the gene encoding fusugai (fucose transporter gene) is preferred.
  • cells have fucose transporter genes on both chromosomes, but cells in which the function of the fucose transporter of the present invention is inhibited have both fucose transporter genes on the chromosome deleted.
  • the cell in which the function of the fucose transporter of the present invention is inhibited is not particularly limited as long as two fucose transporter genes on the chromosome are deleted, but the fucose transporter gene present on the chromosome is not limited. It is preferred that all of these are deleted. For example, when three fucose transporter genes are present on a chromosome, it is preferable that three fucose transporter genes are deleted. Whether all fucose transporter genes on the chromosome are deleted or not can be examined, for example, using Southern plot analysis described in the Examples, or the FISH method.
  • the protein produced by the production method of the present invention may be any protein, but is usually a glycoprotein, preferably an antibody.
  • the type of antibody produced by the method of the present invention is not particularly limited, and is intended to reduce mouse antigens, rat antibodies, rabbit antibodies, Hedge antibodies, camel antibodies, human antibodies, etc. Recombinant antibodies artificially modified as
  • a chimeric antibody or a humanized antibody can be used as appropriate.
  • Recombinant antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is an antibody composed of a non-human mammal, for example, a mouse antibody heavy chain, light chain variable region and a human antibody heavy chain, light chain constant region, and a DNA encoding the mouse antibody variable region.
  • Humanized antibodies are reconstituted ( reshaped) human antibody, which is the complementarity determining region (CDR) of mammals other than baboon, such as mouse antibody, transplanted to human antibody ⁇ complementarity determining region
  • CDR complementarity determining region
  • the FR of human antibody to be ligated via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a good antigen binding site.
  • the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato, K. et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856 .) 0 also
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with the desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to have antigen-binding activity. It is also possible to obtain the desired human antibody (see Japanese Patent Publication No. 59878). Further, a desired rabbit antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos. W0 93/12227, W0 92 / 03918
  • variable region of a human antibody can be expressed as a single-chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single-chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared based on the sequence to obtain a human antibody.
  • the antibody may be a low molecular weight antibody such as an antibody fragment or a modified product of the antibody as long as it can bind to the antigen.
  • antibody fragments, Fab, F (ab 'earthenware pots 2, Fv or single Chie in Fv and Fv of H chain and L chain were ligated via a suitable linker.
  • ScFv Human, JS et al., Pro Natl Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883
  • Diabody etc.
  • genes encoding these antibody fragments were constructed and introduced into expression vectors.
  • Diabody is a variable region and variable region linker, etc.
  • Fragments joined with for example, scFv etc.
  • diabody-constituting fragment ⁇ is a dimerized form, usually containing two VLs and two VHs (P. Holliger et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993), EP404097, W093 / 11161, Johnson et al., Method in Enzymol ogy, 203, 88-98, (1991), Holliger et al.
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the recombinant polypeptide is produced by a known method known to those skilled in the art. It is possible. After Typically the MA that encodes a polypeptide, which is suitable expression base Kuta one 'embedded, a transformant obtained by introducing this into a suitable host cell times 1 yield to obtain an extract, Chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, etc., or subjecting the antibody to the polypeptide of the present invention to an affinity matrix in which the antibody is immobilized on the column, or a combination of these columns. Can be purified and prepared.
  • the protein when expressed in a host cell (for example, animal cell or E. coli) as a fusion polypeptide with dalbutione S-transferase protein or as a recombinant polypeptide to which multiple histidines are added.
  • a host cell for example, animal cell or E. coli
  • the expressed recombinant polypeptide can be purified using a Daryuthion column or a nickel column. After purification of the fusion polypeptide, if necessary, a region other than the target polypeptide can be cleaved with thrombin or factor Xa to remove it.
  • the protein produced by the production method of the present invention is preferably an antibody whose cytotoxic activity is affected by the bound fucose.
  • the present invention includes a host cell capable of producing a foreign protein, wherein the expression of both fucose transporter genes present on the chromosome is artificially suppressed.
  • exogenous protein refers to a protein not derived from the cell itself.
  • host cell There are no particular restrictions on the host cell.
  • Cells to be added can be used. More specifically, various animal cells can be used, and CH0 cells are preferred. In the present invention, CH0 cells in which the ghost transporter gene is knocked down can be preferably used.
  • Animal cells include mammalian cells such as CHO (J. Exp. Med. (1995) 108,
  • COS COS
  • 3T3 myeloma
  • BHK baby hamster kidney
  • HeLa monkey kidney
  • Vero amphibian cells, such as Xenopus laevis oocytes (Valle, et al., Ature (1981) 291,
  • insect cells such as Sf9 and Sf2K Tn5 are known.
  • CH0 cell for example, dhfr-CH0 (Proc. Natl.
  • CH0 cells are particularly preferred for the purpose of mass expression.
  • vectors include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)) and pEGF-BOS (Nucleic
  • Plant-derived expression vectors eg, ⁇ 1, pMH2
  • animal virus-derived expression vectors eg, pHSV, pMV, pAdexLcw
  • retrovirus-derived expression vectors eg, pZIPneo
  • yeast-derived expression Vector eg “Pichia Expression Kit”
  • NVIK SP-Q01 Bacillus subtilis-derived expression vectors (for example, pPL608, PKTH50) and the like.
  • host cells are CH0 cells, vectors derived from mammals Is preferably used.
  • Promoters normally required for expression in cells such as SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV- LTR promoter, EFlo; promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promotion, etc., and genes for selecting transformation into cells (eg, drugs It is more preferable to have a drug resistance gene that can be discriminated by an agent (neomycin, G418, etc.). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a vector having a DHFR gene complementary to CH0 cells lacking the nucleic acid synthesis pathway can be introduced and amplified with methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • the gene expressing the SV40 T antigen can be
  • the COS cell can be transformed with a vector having SV40 replication origin (such as pcD).
  • SV40 replication origin those derived from poliovirus, adenovirus, ushipapilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is selected as a selectable marker for amplification of the gene copy number in the host cell system.
  • Aminoglycoside transferase (APH) gene thymidine kinase (TK) gene, enterococcus xanthyanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) Gene, dihydrofolate reductase (dhir) gene, and the like.
  • Vectors can be introduced into host cells by, for example, the calcium phosphate method, DEAE dextran method, Cationic ribosome D0TAP (Boehringer Mannheim) method, electoral position method, lipofussion method, etc. It is.
  • Cell culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM can be used as a culture medium for animal cells.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used together, or serum-free culture can be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30 to 40 t: for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
  • Examples of cells in which the expression of both fucose transporter genes on the chromosome is artificially suppressed include cells in which both of the fucose transporter genes present on the chromosome are disrupted.
  • Gene disruption means to suppress the expression of a gene by performing partial deletion, substitution, insertion, addition, etc. in the base sequence of the gene.
  • ⁇ suppress gene expression “Includes the case where the gene itself is expressed but the gene encoding the protein having the normal function is not expressed. J Moreover, not only the case where gene expression is completely suppressed but also the case where it is partially suppressed is included in the “gene disruption” of the present invention.
  • Gene deficiency (knock ⁇ )” and “gene inactivation” are also used as equivalent meanings to “gene disruption”.
  • a cell in which a gene has been disrupted by homologous recombination using gene binding is called a cell in which the gene has been knocked out.
  • a cell in which the gene encoding the fucose transporter is disrupted is one of the cells in which the expression of the fucose transporter is artificially suppressed.
  • Cells in which the gene encoding the fucose transporter is disrupted usually have a significantly reduced amount of fucose present in the Golgi, compared to cells in which the fucose transporter gene has not been disrupted, or Is reduced or deficient, or the activity of fucose uptake into the Golgi apparatus in the cell is reduced or deficient.
  • the amount of fucose in the Golgi body can be measured by isolating the Golgi body from cells and extracting sugar, followed by antigen-antibody reaction, sugar-lectin binding reaction, liquid chromatography, electrophoresis, and the like.
  • fucose transport ability in cells and fucose uptake activity into the Golgi apparatus in cells can be measured using fucose labeled with a fluorescent substance or radioisotope, for example.
  • Gene disruption can be performed, for example, by homologous recombination.
  • the homologous recombination method is a method in which only the target gene is arbitrarily modified by homologous gene recombination between a gene on the chromosome and the foreign DNA, and the gene coding sequence is divided for the purpose of dividing the gene. Insert another DNA sequence into exon.
  • a selection marker such as a neomycin resistance gene derived from bacteria is generally used as the gene-sequencing sequence. Based on the sequence information of the fucose transporter gene described in this specification. Targeting vector design and to prepare a, yo j physician if homologous recombination fucose transporter gene to be'll disrupted using the targeting vector.
  • a replacement vector is a homologous region linked to the 5 'and 3' side of the mutation to be introduced, a marker for positive selection, a restriction enzyme site for linearizing the vector outside the homologous region, homology It may include a marker for negative selection arranged outside the region, a restriction enzyme cleavage site for mutation detection, and the like.
  • the evening-getting vector is edited by Kenichi Yamamura et al.
  • the evening-getting vector may be either an insertion type or a replacement type.
  • recombination can be caused by evening gating using Cre-Lox system. Evening using the Crelo ox system can be performed according to the method described in JP-T-503015, for example.
  • known selection methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, and poly A selection may be used.
  • poly A selection may be used for identification of homologous recombinants.
  • either PCR or Southern blotting can be used.
  • cells in which the fucose transporter gene of the present invention is disrupted can be obtained by randomly introducing mutations into cells as long as both of the two pairs of fucose transporters of the chromosome are defective.
  • a method for randomly introducing mutations a method for screening cells in which the fucose transporter gene has been disrupted by randomly introducing a gene disruption vector containing the best force into the genome of the cell,
  • One example is a method of screening a cell in which a fucose transport gene has been disrupted by introducing a random mutation with a chemical mutagen such as ENU (N-ethy ⁇ N-t ro sou r e a). Screening for cells that are no longer producing fucose transport
  • the activity of fucose transporter may be used as an indicator, Ting can also be performed by Northern plotting using the transcription and expression of the fucose transporter gene as an index.
  • the cell in which the fucose transport gene of the present invention is disrupted can be obtained from an animal in which the fucose transporter gene is knocked out.
  • An animal in which the fucose transporter gene has been knocked out can be produced by destroying the fucose transport of an ES cell by the above-described method and using the ES cell by the method described in, for example, W002 / 33054.
  • Examples of animals used in this case include, but are not limited to, goats, buyu, hidge, ushi, mice, hamsters, rats and the like.
  • a cell line that does not have the fucose transporter gene can be obtained.
  • the foreign protein is an antibody
  • fucose is not bound to N-daricoside-linked sugar chains bound to two sugar chain-binding sites present in the Fc regions of the two H chains of one antibody molecule
  • Such an antibody not bound to fucose has enhanced cytotoxic activity.
  • it is not necessary that all of the produced antibody is free of fucose. It suffices if the percentage of protein to which fucose is added decreases.
  • the total sugar chain is 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 85% or more, particularly preferably 90%. More than% does not have fucose added.
  • the present invention provides for deletion of both fucose transporter genes on the chromosome. Including non-human animals. By using such an animal, a recombinant polypeptide can be produced in vivo. iIntroduce DNA encoding the protein of interest into these animals to produce and recover the polypeptide in the animal's body.
  • the “host” in the present invention includes these animals. When animals are used, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, bushes, hidges, mice, and bushes can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applicat ions, 1993).
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide inherently produced in milk such as goat / 3 casein.
  • a DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transferred to a female goat.
  • the target polypeptide can be obtained from the milk produced by the lance genie goat born from the goat that received the embryo or its progeny.
  • Hormones may be used in Transgene goats as appropriate to increase the amount of milk containing polypeptides produced from Transgene goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994 ) 12, 699-702).
  • the resulting polypeptide can be isolated from within the host cell or extracellularly (such as medium) and purified as a substantially pure and homogeneous polypeptide. Separation and purification of the polypeptide may be carried out using separation and purification methods used in normal polypeptide purification, and is not limited in any way. For example, chromatographic power ram, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. Alternatively, the polypeptides can be separated and purified by combining them.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (St rategies for
  • the polypeptide can be arbitrarily modified or the peptide partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after the polypeptide is purified.
  • protein-modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, darcosidase, etc.
  • the gene encoding the H chain or L chain of the antibody produced by the production method of the present invention has a known sequence.
  • a gene encoding the antibody can be obtained by cloning from a hyperidoma producing a monoclonal antibody, or can be obtained from an antibody library.
  • a high-pridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, a desired antigen or a cell that expresses the desired antigen is used as a sensitizing antigen, which is immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cell is combined with a known parent cell by a normal cell fusion method. It can be produced by fusing and screening monoclonal antibody-producing cells (hypridoromas) by conventional screening methods.
  • variable region (V region) cDNA of the antibody By synthesizing the variable region (V region) cDNA of the antibody using reverse transcriptase from the resulting mRNA of the high-pridoma and ligating it with the MA encoding the desired antibody constant region (C region), the H chain Alternatively, a gene encoding the L chain can be obtained.
  • the sensitizing antigen upon immunization is not particularly limited, and for example, the desired full-length protein or partial peptide can be used.
  • Antigens can be prepared by methods known to those skilled in the art, for example, according to methods using baculovirus (eg, W098 / 46777).
  • Hypridoma can be prepared according to, for example, the method of Milstein et al.
  • the immunogenicity of the antigen When the immunogenicity of the antigen is low, it may be immunized by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • Antibodies expressed and produced as described above are usually used in protein purification. And can be purified by known methods. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining affinity columns such as protein A columns, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Ant ibod ies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Springing Harbor Laboratory, 1988).
  • a known means can be used for the measurement of the antigen binding activity (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent immunoassay can be used.
  • sugar chain structure of the protein produced using the cells of the present invention is based on the two-dimensional sugar chain mapping method (Anal. Biochem,, 171, 73, (1988), biochemical experiment method 23-glycoprotein sugar chain Research method Can be performed by the method described in Etsuko Takahashi, Academic Publishing Center (1989), etc. Furthermore, sugar chains can also be analyzed by mass spectrometry such as MALDI-T0F-MS.
  • the stability such as heat stability, of the protein not produced with the addition of fucose produced using the cells of the present invention is equivalent to the protein with the addition of fucose.
  • the antibody produced by the method of the present invention is an antibody having increased cytotoxic activity.
  • cytotoxic activity in the present invention examples include, for example, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity, complement-dependent cytotoxicity (complement-dependent cytotoxicity). : CDC) activity.
  • ADCC activity means the cytotoxic activity by the complement system
  • ADCC activity means that when a specific antibody is attached to the cell surface antigen of the target cell, the Fc ”receptor-containing cell ( Immune cells, etc.) binds via Fcr receptors and impairs the target cells.
  • ADCC activity or CDC activity can be measured by a known method (for example, Current protocol s in Immunology, Chapter 7. Immunological studies in humans, Ed i tor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). Specifically, first, effector cells, complement solution, and target cells are prepared.
  • CEDARLANE Dilute Baby Rabbit Complement 10-fold in medium containing 10% FBS (GIBC0) to prepare a complement solution.
  • ADCC activity or CDC activity is measured.
  • To measure ADCC activity add target cells and 50 1 antibodies to a 96-well U-bottom plate (86 1 ⁇ 011 0 ⁇ 1 ⁇ 115011) and incubate for 15 minutes on ice. Then add effector cells ⁇ and incubate in a carbon dioxide incubator for 4 hours. The final antibody concentration should be 0 or 10 zg / ml. After incubation, 100 1 supernatant is collected and radioactivity is measured with a gamma counter (COBRA IIAUT0-GMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Co Immediate any). Cytotoxic activity) can be determined by (A-C) I (B-C) X 100. A is the radioactivity (cpm) in each sample, B is the radioactivity (cpm) in the sample with 1% NP-40 (manufactured by Hanai), C is the radioactivity (cpm) of the sample containing only the target cells .
  • the fucose transporter gene of the present invention has been disrupted, wherein the fucose transporter gene has not been disrupted.
  • the ADCC activity of the prepared antibody is compared by determining the antibody concentration that gives 50% cytotoxic activity from the antibody concentration-cytotoxic activity (%) curve, it is prepared using animal cells in which the fucose transporter gene is disrupted.
  • the antibody concentration that gives 50% cytotoxic activity of the prepared antibody is half the antibody concentration that gives 50% cytotoxic activity of an antibody prepared using animal cells in which the fucose transport gene has not been disrupted, preferably 1/5, more preferably 1/10.
  • the ADCC activity of an antibody prepared using an animal cell in which the fucose transporter gene of the present invention is disrupted is higher than that of an antibody prepared using an animal cell in which the fucose transporter gene is not disrupted. 2 times or more, preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more.
  • the present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • Hyg5_BH and Hyg3-NT primers from PCDNA3.1 / Hygro (Invitrogen)
  • the Hygromyc in resistance gene by adding the BamHI site and TGCGC sequence 5 'to the start codon of Hyg, Hyg was extracted by adding the Not I site to the 3 'side, including the region up to the SV40 polyA addition signal, in the same sequence as the 5' side of the start codon of the fucose transporter gene.
  • Hyg3-NT 5'- GCG GCC GCC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CG -3 '(SEQ ID NO: 4) Fucos transporter evening-getting vector ver. 1 (hereinafter referred to as K01 vector)
  • the PMC IDT-A vector (Yagi T, Pro Natl. Acad. Sci. USA vol. 87, P9918-9922, 1990) is located on the 5 'side of the fucose transporter (SEQ ID NO: 1 ⁇ ). 3 ⁇ 4 of the base sequence No. 2, 780 Sma I to No. 4, 232 BamH 1), 3 'side (No. 4, 284 to No. 10, 934 Sac I), and Hyg “fragment” (Fig.
  • Hyg f has no promoter added to it, so that when homozygous recombination occurs, the fucose transporter promoter causes Hyg f to However, even if only one copy of the vector is introduced into the cell by homologous recombination, Hygr is not always expressed enough to acquire resistance to hygromycin B. Note that the K01 vector was cleaved with Not I. And introduced it into the cell by the K01 vector. Fucose transport evening one will be lacking 41 base pairs of Ekuson 1 including the start codon, it is considered to lose the function
  • the mouse pgk-1 gene promoter was excised with EcoR I-Ps t I from the PKJ 2 vector (Popo H, Biochemical Genetics vol. 28, p299-308, 1990), and pBluescr ipt (Stratagene) PBSK-pgk-1 was prepared by cloning into the EcoR I-Pst I site.
  • Hyg r is by PCR with cDNA 3. 1 / Hygro than Hyg5-AV and Hyg3-BH bra one more, appends the EcoT22 I Sai Bok and Kozak sequence at the 5 'side of the hyg r, until SV40 polyA addition signal Hyg "was extracted by adding a BamH I site to the 3 'side including the region.
  • This Hyg r (EcoT22 I -BamH I) a fragment of pBSK-pgk-1 Ps t I -BamH I Sa I insert to me, to prepare a pBSK-pgk- Bok Hyg r.
  • Fucos Transport Yui's Evening-Getting Vector ver. 2 (K02 Vector) (Referred to as Yuichi) is the 5th side of the fucose transport evening of the pMC lDT-A vector (No. 2, 780 Sma I to No. 4, 232 BamHI of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1) , 3, (from Nd. 4, 284 to Sac I of No. 10, 934), and the pgk-g Hyg f fragment (Fig. 1).
  • the K02 vector has Hyg 'added with the promoter of the pgk-1 gene, so even when only one copy of the vector is introduced into the cell by homologous recombination, it gains resistance to hygromycin B. Note that the K02 vector was cut into Not I and introduced into the cell, which caused the loss of function because the fucose lance was missing 46 base pairs of exon 1 including the start codon. Conceivable.
  • the pPUR vector (BD Biosciences) was digested with Ps t I and BamH I, and the excised fragment (Puro was inserted into PB t-BamH I size of pBSK-pgk-1 and pBSK-pgk- Pu ro r was produced.
  • the fucose transporter evening getting vector ver. 3 (hereinafter referred to as K03 vector) is added to the pMC lDT-A vector on the 5 ′ side of the fucose transporter (No. 2 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1).
  • K03 vector was digested with Not I and introduced into cells.
  • the K03 vector causes the fucose transpodium to lose 46 base pairs of exon 1 including the start codon and lose its function.
  • the cells were suspended in 200 ml of SFMI I (+) medium, and the cells were seeded at 100 1 / well in 20 96-well flat bottom plates (Iwaki cat. 1860-096). Plates at C0 2 incubator for 24 hours, after incubation at 37, was added drug.
  • K01 vector or K02 vector was introduced into CH0 cells, respectively, and selection with hygromycin B (Invitrogen cat. 10687-010) was performed 24 hours after the introduction of the vector.
  • Hygromycin B was dissolved in SFMI I (+) to a concentration of 0.3 mg / ml, and 100 1 / well was added.
  • CH0 cells used for screening are cultured in a 96-well flat-bottom plate, and after removing the culture supernatant, add 50 1 / well of cell lysis buffer and heat at 55 for 2 hours, followed by 95 :, 15 minutes. By heating
  • Proteinase K was inactivated to form a PCR-type kit.
  • Cell lysis buffer is 10 X LA buffer II per well (supplied with Yu Takara LA TaQ) 5 ⁇ 1, 103 ⁇ 4 NP-40 (Roche cat. 1 332 473) 2.5 z K proteinase K (20mg / ml, evening color company cat. 9033) 4 K and distilled water (Nacalai Tesque cat. 36421-35) 38. 5 1
  • PCR reaction mixture is the above PCR sample 1 1, 10 X LA buffer II 5 K MgCl 2 (25 mM) 5 K dNTP (2.5 mM) 5 1, primer (each ⁇ ⁇ ⁇ ) 2 K LA Taq (5 IU 1 cat. RR002B) 0. and distilled water 29. (total 50 ⁇ 1).
  • TP-F4 and THygro-Rl were used as the PCR primers for screening the cells into which the KOI vector was introduced, and TP-F4 and THygro-F1 were used as the PCR primers for screening the cells into which the K02 vector was introduced.
  • PCR of cells transfected with K01 vector was pre-heated at 95 for 1 minute, 95t for 30 seconds, 6 (40 seconds for TC for 30 seconds, and 60 minutes for 2 minutes for amplification cycles, and Screening for cells transfected with the K02 vector for preheating for 1 minute at 95, 30 seconds at 95, and 40 cycles of amplification cycle for 3 minutes at 70, And at 70, double heating was performed for 7 minutes.
  • the primers are as follows. In a sample of cells that have undergone homologous recombination, about 1.6 kb of DNA is amplified for the K01 vector and about 2. Okb of the K02 vector. Primer is TP- F4 is outside the vector, and 5 'set to fucose transposase Isseki one genomic region side, THygro- F l, and THygro- R1 is set in the Hyg r in the vector It was.
  • Genomic DNA was adjusted to 10 S from cultured cells according to a conventional method, and Southern blotting was performed. From the region of base sequence No. 2, 113-No. 2,500 of SEQ ID NO: 1, a 387 bp probe was prepared by PCR using the following two primers and confirmed by Southern plotting. Used for. Genomic DNA was cut with Bgl I I.
  • Bgl-F 5'- TGT GCT GGG AAT TGA ACC CAG GAC-3 '(SEQ ID NO: 1 1)
  • Fig. 2 shows the structure of the band that appears after cutting with Bgl II after the first-stage knockout
  • Fig. 3 shows the data when the Southern plot was actually performed.
  • One to seven types of cells that had undergone homologous recombination with the K01 vector and the K02 vector were used in the experiment.
  • the only cell obtained with the K01 vector was named 5C1, but later analysis revealed that it was composed of multiple cell populations, so it was cloned by limiting dilution and used in subsequent experiments. .
  • One of the cells obtained with the K02 vector was named 6E2.
  • Method 1 K02 vector and 5 ⁇ cells (K01), Method 2. ⁇ 02 vector and 6 ⁇ 2 cells ( ⁇ 02) Method 3. K03 vector and 6E2 cells (K02).
  • Vectors were introduced into each cell, and selection with hygromycin ⁇ and puromycin ( ⁇ Tairai Tesque, cat. 29455-12) was started 24 hours after vector introduction.
  • Hygromycin B was adjusted to a final concentration of 1 mg / m in Method 1 and 7 mg / ml in Method 1.
  • Method 3 hygromycin B was added so that the final concentration of 0.15 mg / ml and puromycin was 8 g / ml.
  • Method 1 Screening for Method 1 was performed by both PCR to detect cells that had undergone homologous recombination with the K01 vector and K02 vector described above.
  • Method 2 the following PCR primers were designed. TPS-F 1 was set in the region of No. 3, 924-3, 950 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and SHygro-Rl was set in No. 4, 248-4, 274.
  • This PCR primer amplifies 350 bp of the gene region of the fucose transporter that is deleted by the K02 vector. Therefore, in PCR screening in Method 2, cells that were not amplified at 350 bp were regarded as cells that were completely deficient in the fucose transporter gene.
  • PCR conditions were 95 for 1 minute pre-heating, 95 for 30 seconds, 70 for 1 minute for 35 cycles, and 70 for 7 minutes for 7 minutes.
  • TPS-F 1 5'- CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC -3 '(SEQ ID NO: 1 3)
  • RSGR-A was used. PCR conditions were 95 minutes for 1 minute preheat at 95, 30 seconds for 95, 30 seconds for 60, 35 cycles for 2 minutes for 72, and 7 minutes for 72 ⁇ . Heated. In a sample of cells that have undergone homologous recombination with the K03 vector, approximately 1.6 kb of DNA is amplified. This PCR detects cells that have undergone homologous recombination with the K03 vector, and the homologous recombination with the K02 vector remains. I also confirmed that
  • Method 1 analyzed 616 cells, of which 18 cells were considered to be homologous recombinants (homologous recombination efficiency was 2.9 «(Fig. 4).
  • Method 2 analyzed 524 cells, of which homologous. (The homologous recombination efficiency was about 0.4%.)
  • Method 3 analyzed 382 cells, of which 7 cells were considered homologous recombinants. (Homologous recombination efficiency is about 1.8%) o
  • FIG. 5 shows a Zamblot analysis (FIG. 5) and fucose expression.
  • Figure 6 shows the results for wi ld / KO and Figure 7 shows the results for K0 / K0. From the above results, the following was found.
  • Humanized anti-HM1.24 antibody expression vector AHM (I) / N5KG1 (W02005 / 014651) is Ssp I
  • humanized anti-GPC3 antibody H chain is version K
  • L chain Asn33 is Arg PCXND3 / hGC33 / K / Arg, which is a vector for expressing the modified antibody gene (Reference Example 1 to Reference Example 3 described later) substituted for, was cleaved with Pvu I and used in the experiment.
  • Example 3 Establishment of antibody-producing cells
  • the fucose transporter-deficient strain (FT-K0 cells, clone name 3F2) obtained in Example 1 was passaged. 8 ⁇ 10 6 pieces of 3F2 were suspended in 0.8 mL of Dulbecco's phosphate buffer. 25 g of each antibody expression vector was added to the cell suspension, and the cell suspension was transferred to Gene Pulse Cuvette. After standing for 10 minutes on ice, the GENE-PULSER II is 1.5 kV, The vector was introduced into the cells by electroporation under the condition of 25 zFD. After introducing the vector, the cells were suspended in 40 mL of SFMII (+) medium, and the cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates (Izuki) with IOO / well.
  • the culture supernatant was collected from the antibody-expressing strain and charged to Hitrap rProtein A (Pharmacia CAT # 17-5080-01) using a P-1 pump (Pharmacia). After washing with a binding buffer (20 mM sodium phosphate (pH 7.0)), elution was performed with an elution buffer (0. lMGlycin-HCl (pH 2.7)). The eluate was immediately neutralized with a neutralization buffer (1M Tris-HCl (pH 9.0)). The antibody elution fraction was selected and pooled by DC protein assay (BIO-RAD CAT # 500-0111), and then concentrated to about 2 mL with Centriprep-YM10 (Millipore CAT # 4304).
  • Peripheral blood collected from healthy individuals with heparin was diluted 1-fold with PBS (-) and overlaid on Ficoll-PaQueTM PLUS (Amersham). After centrifugation (500 ⁇ g, 30 minutes, 20 :), the intermediate layer, which is a mononuclear cell fraction, was collected. After washing 3 times, it was suspended in 10% FBS / RPMI to obtain a human PBMC solution.
  • A is the mean value of radioactivity (cpm) in each well
  • B is the target cell with 100 NP-40 aqueous solution (Nonidet P-40, Code No.252-23, Nacalai Tesque) and 103 ⁇ 4FBS / RPMI medium.
  • C shows the mean value of radioactivity (cpm) in wells with 150 L of 10% FBS / RPMI medium added to target cells.
  • the test was performed in triplicate, and ADCC activity (average value and standard deviation were calculated for «.
  • the ADCC activity of human anti-HM1.24 antibody using human PBMC is shown in FIG.
  • the white outline shows the activity of the wild type CH0 cell-producing humanized anti-HM1.24 antibody, and the black outline shows the activity of the FT-K0 cell-producing humanized anti-HM1.24 antibody.
  • the FT-K0 cell-producing humanized anti-HM1.24 antibody showed stronger ADCC activity compared to the Wild Type CH0 cell-producing humanized anti-HM1.24 antibody. It was revealed that ADCC activity was enhanced.
  • Example 6 In vitro ADCC activity of humanized anti-GPC3 antibody produced by FT-K0 cells
  • HuH-7 cells Human Science Research Resource Bank
  • 10% FBS / D-MEM medium are detached from the dish using Cell Dissociation Buffer (Invitrogen), and 96-well U-shaped bottom plate (Falcon)
  • Cell Dissociation Buffer Invitrogen
  • Falcon 96-well U-shaped bottom plate
  • N-Glycosidase F (Roche diagnostics) was allowed to act to release sugar chains from proteins (Weitzhandler M. et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 83:12 (1994),
  • the obtained 2-AB sugar chain was dereagentd by solid phase extraction using a cellulose cartridge and then concentrated by centrifugation to obtain a purified 2-AB sugar chain.
  • N ⁇ Glycosidase F (Roche diagnostics) is allowed to act on the FT-K0 cell-producing antibody of the present invention and the CH0 cell-producing antibody as a control sample to release the sugar chain from the protein i ⁇ (Weitzhandler M. et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 83: 12 (1994), 1670-1675). After deproteinization with ethanol (Schenk B. et a in The Journal of Clinical Investigation 108: 11 (2001), 1687-1695), concentrated to dryness and fluorescently labeled with 2-aminopyridine (Bigge JC et al., Analytical Biochemistry 230: 2 (1995), 229-238).
  • the obtained 2-AB-glycan was removed by solid phase extraction using a cellulose cartridge and then concentrated by centrifugation to obtain a purified 2-AB-glycan.
  • ⁇ -Galactosidase (Seikagaku Corporation) was allowed to act on the purified 2-AB sugar chain to obtain a galactosyl 2-AB sugar chain.
  • the sample solution was used.
  • Full-length cDNA encoding chick GPC3 was prepared from colon cancer cell line Caco2 by a conventional method.
  • the 1st strand cDNA thus obtained was converted into a saddle shape and amplified by PCR reaction using Advantage2 kit (CLONTECH).
  • 2 1 Caco2-derived cDNA, 1 1 sense j primer (GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT: SEQ ID NO: 15), 1 ⁇ 1 antisense primer (GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC: SEQ ID NO: 16), 51 1 Advantage2 lOxPCR buffer, 8 1 dNTP mix (1.25 mM), 1.
  • a soluble GPC3 protein lacking the hydrophobic region (564-580 amino acids) on the C-terminal side was prepared as an immunity protein for the production of anti-GPC3 antibodies.
  • Antisense primer using full-length human GPC3 cDNA as a cage ATA GAA TTC CAC
  • PCXND2- Flag inserts the DHFR gene expression site of pCHOI (Hirata et al., FEBS letter 1994; 356; 244-248) into the Hindlll site of pCXN2 (Niwa et al., Gene 1991; 108; 193-199), and A Flag tag sequence was added downstream of the multicloning site, and it was designed to be expressed as a Flag tag added protein.
  • the prepared expression plasmid DNA is introduced into CH0 cell DXB11 strain and selected by 500 g / mL gene ticin.
  • a soluble GPC3 highly expressing CH0 strain was obtained. Large-scale culture of soluble GPC3 highly expressing CH0 strain was performed using a 1700 cm 2 roller bottle, and the culture supernatant was collected and purified. The culture supernatant was charged into DEAE separose Fast Flow (Amersham), washed, and then eluted with a buffer containing 500 mM NaCl. Next, affinity purification was performed using Anti-Flag M2 agarose affinity gel (SIGMA). Elution with 200 g / mL FLAG peptide went. After concentration with Centriprep-10 (Millipore), gel filtration with Superdex 200 HR 10/30 (Amersham) was performed to remove the FLAG peptide. Finally, buffer replacement was performed by concentrating using a DEAE sepharose Fast Flow column and elution with PBS without Tween 20 (containing 500 mM NaCl).
  • SIGMA Anti-Flag M2 agarose affinity gel
  • GPC3 is modified by heparan sulfate to become a macromolecule.
  • a soluble GPC3 core protein having a point mutation introduced at the heparan sulfate addition site was prepared and used for screening.
  • the soluble GPC3 (1-563) was used as a cage, and cDNA was prepared by substituting Ser at positions 495 and 509 with Ala by assembly PCR. At this time, primers were designed so that a His tag was added to the C-terminus, and the resulting cDNA was cloned into the PCXND3 vector.
  • PCXND3 was prepared by inserting the DHFR gene expression site of pCHOI into the Hindlll site of PCXN2. The produced expression plasmid DNA was introduced into the DXB11 strain, and selection with 500 g / mL Genetic in gave a soluble GPC3 core protein highly expressing CH0 strain.
  • a 10 g full-length human GPC3 gene expression vector and 60 ⁇ SuperFect (QIAGEN) were mixed to form a complex, and then added to CH0 cell DXB11 strain for gene transfer. After 24 hours at C0 2 incubator, with AMEM (GIBCO BRL Co.) containing Geneticin and 10% FBS at a final concentration of 0.5 mg / mL, and start the selection. The resulting Geneticin resistant colonies were collected and cells were cloned by limiting dilution. Each cell clone was solubilized, and expression of full-length human GPC3 was confirmed by Western blot using an anti-GPC3 antibody to obtain a stable expression cell line.
  • AMEM GEBCO BRL Co.
  • Dilute soluble GPC3 core protein with coating buffer (0.lmol / L NaHC0 3 (pH9.6), 0.02% (w / v) NaN 3 ) to lg / mL and add to the immunoplate. At that time, I left it for coating.
  • Dilution buffer 50 mmol / L Tris-HCl (pH8.1), 1 mmol / L gCl 2 , 150 mmol / L NaCl, 0.053 ⁇ 4 (v / v) Tween 20, 0.02% (w / v) NaN 3 , l3 ⁇ 4
  • anti-GPC3 antibody was added and left at room temperature for 1 hour.
  • the homology between human GPC3 and mouse GPC3 shows a high homology of 94% at the amino acid level, so it is difficult to obtain anti-GPC3 antibodies even when immunizing normal mice, and MRL / MpJUmmCrj -lpr / lpr mice (hereinafter referred to as MRL / lpr mice, purchased from Japan Charles River) were used as immunized animals. Immunization starts at 7 weeks of age or 8 weeks of age. For the first immunization, soluble GPC3 is prepared to 100 ⁇ g / head, and Freund's complete adjuvant (FCA, Becton Dickinson) is used. The emulsion was administered subcutaneously.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • the product prepared to 50 g / head was emulsified with Freund's incomplete Adjuban® (FIA, Becton Dickinnon) and administered subcutaneously. Thereafter, booster immunization was performed 5 times at weekly intervals. Two of them were diluted in PBS to give a final immunization of 50 xg / head and administered into the tail vein.
  • the spleen cells were removed, mixed with mouse myeloma cells P3_X63Ag8Ul (purchased from P3UK AKC) to a ratio of 2: 1, and cells were gradually added by adding PEG1500 (Roche Diagnostics). Fusion was performed.
  • RPMI 1640 medium GBC0BRL
  • dilute PEG1500 remove PEG1500 by centrifugation, and then resuspend the suspension in RPMI 1640 with 10% FBS to a 100-well culture plate. Sowing.
  • RPMI 1640 (hereinafter HAT) with 10% FBS, 1 X HAT media supplement (SIGMA), 0.5 x BM-Condimed HI Hybridoma cloning supplement (Roche Diagnostics) to 100 zL / well Medium) was added.
  • Half of the culture broth was replaced with HAT medium after 2, 3 and 5 days, and screening was performed using the culture supernatant after 7 days.
  • the reverse transcription reaction was at 42 for 1 hour and 30 minutes.
  • 50 L of PCR solution consists of 5 IL lOxAdvantage 2 PCR Buffer, 5 lOxUniversal Primer A Mix, 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH), 2.5 L Product of 10 pmole of synthetic oligonucleotide MHC-IgGl, MHC-IgG2a, MHC-IgG2b or kappa, 30 seconds at 94 initial temperature, 5 seconds at 94, 72 at Repeat the 3 minute cycle 5 times, 94 for 5 seconds, 70 for 10 seconds, 72 for 3 minutes 5 times, 94 for 5 seconds and 68 for 10 seconds.
  • M3C1K M13B3, M1E7, M3B8, M11FK M19B1K M6BK M18D4, M5B9, M10D2, L9G11 H chain variable region nucleotide sequences are SEQ ID NOS: 2 5, 26, 2 7, 28, 29, 30, 31 , 33, 34, 35, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 3 6, 3 7, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, the base sequence of the chain variable region is SEQ ID NO: 47 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 5 8, 5 9, 60, 61, 62, 63, 64, 65, Shown in 66, 6 7 and 68.
  • the heavy chain and light chain variable region sequences of the anti-GPC3 antibody were linked to human IgGl and kappa chain constant region sequences.
  • PCR was performed using a synthetic oligonucleotide complementary to the 5 'terminal base sequence of the variable chain region of each antibody and having a Kozak sequence and a synthetic oligonucleotide complementary to the 3' terminal base sequence having a Nhel site.
  • the obtained PCR product was cloned into the pB-CH vector in which the human IgGl constant region was inserted into the pBluescript KS + vector (Toyobo). Nhel site allows mouse heavy chain variable region and human G H chain (A 1 chain) Constant region is connected.
  • the prepared H chain gene fragment was cloned into the expression vector PCXND3.
  • a synthetic oligonucleotide having a Kozak sequence complementary to the 5, terminal base sequence of the L chain variable region of each antibody and a synthetic oligonucleotide complementary to the 3 ′ terminal base sequence having the BsiWI site were used.
  • PCR is performed, and the resulting PCR product contains the human kappa chain constant region as the pBluescript KS + vector.
  • an anti-GPC3 mouse-one human chimeric antibody expression vector a gene fragment obtained by digesting the pUCAG vector with the L-chain gene fragment inserted with the restriction enzyme Hindlll (Takara Shuzo) was inserted into the H-chain gene. It was ligated to the restriction enzyme Hindi II cleavage site of pCXND3 and cloned. This plasmid expresses neomycin resistance gene, DHFR gene, and anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody gene in animal cells.
  • a stable expression cell line using CH0 cells (DG44 strain) was prepared as follows.
  • Genes were introduced by the electopore position method using Gene Pulserll (Bio Rad).
  • a mixture of 25 g of each anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody expression vector and 0.75 ml of CH0 cells (lxlO 7 cells Zm 1) suspended in PBS was cooled on ice for 10 minutes, transferred to a cuvette, and then 1.5 kV A pulse was given at a capacity of 25 FD.
  • the cells treated with electoporation were suspended in 40 mL of CH0-S-SFMII medium (Invitrogen) containing 1-fold concentration of HT supplement (Invitrogen).
  • a 50-fold diluted solution was prepared in the same medium, and dispensed into a 96-well culture plate with lOO i 1well. C0 24 hours of culture at 2 incubator (5% C0 2), Genetic in the (Invitrogen) for 2 weeks culture was added to a concentration of 0.5 mg / mL. The amount of IgG in the culture supernatant of the well in which colonies of transformed cells exhibiting geneticin resistance were observed was measured by the following concentration determination method. High-producing cell lines are sequentially expanded, and anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody stable expression cell lines are obtained and cultured in large quantities The culture supernatant was obtained. Purification of each anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody was performed using Hi Trap Protein G HP (Amersham).
  • GC-3 was prepared to 100 g / head and emulsified with FCA was administered under the skin. Two weeks later, the preparation prepared to 50 g / head was emulsified with FIA and administered subcutaneously. After 5 immunizations, all mice were subjected to final immunization (50 g / head) in the tail vein for cell fusion. Screening was performed by ELISA using an immunoplate on which soluble GPC3 core protein was immobilized. Positive clones were monochromatized by limiting dilution. As a result, 5 clones (GC199, GC202, GC33, GC179, GC194) having strong binding activity to GPC3 were obtained.
  • variable regions of the H chain and L chain were cloned according to the above method, and the sequences were determined.
  • Two types of sequences were cloned for the L chain of GC194.
  • the base sequence of the heavy chain variable region of GC199, GC202, GC33, GC179, and GC194 is shown in SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, and 73, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NOs: 74, 75, 76, and 77, respectively. 78.
  • the base sequence of the L chain variable region of GC199, GC202, GC33, GC179, GC194 (1), GC194 (2) is SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 85, respectively. Shown at 86, 87, 88, 89, 90.
  • the signal sequence of Accession Number S40357 having high homology with AB064105 was used for the signal sequence of the L chain.
  • Humanized antibodies were prepared by grafting complementary antigen-determining regions (hereinafter CDR) into the framework regions (hereinafter FR) of these antibodies. Specifically, about 50 bases of synthetic oligo DNA was designed to hybridize about 20 bases, and these synthetic oligo DNAs were assembled by PCR to produce genes encoding each variable region.
  • Expression vector HEFgr 1 which was cleaved with the Hindlll sequence inserted at the end of the synthetic oligo DNA at the 5 'end and the BamHI sequence inserted at the end of the synthetic oligo DNA at the 3' end, and the human IgGl constant region was cloned. G cloned into the expression vector HEFg / in which the kappa chain constant region was cloned (
  • the H chain and L chain were named ver. A. Humanized GC33 (ver. A for both H and L chains)
  • Ver. C ver. F
  • ver. H ver. I
  • ver. J ver.
  • amino acid sequence is SEQ ID NO: 98, 99, 10
  • Asn-Gly is known as a particularly deamidable sequence (Rocinson et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 2001; 98; 944-949.).
  • the Asn33 in CDR1 of the humanized GC33L chain ver.
  • a variable region shown in SEQ ID NO: 105 is the primary sequence Asn-Gly. Expected.
  • the culture supernatant which was transiently expressed by introduction into COS 7 cells using Fugene6 (Roche) together with HEFgr 1 which was GC33H chain ver. K cloned, was collected.
  • the antibody concentration was quantified by sandwich ELISA using an anti-human IgG antibody, and the binding activity of the modified antibody was evaluated by ELISA in which a soluble GPC3 core protein was immobilized.
  • the modified antibody (N33D) in which Asn33 was replaced with Asp had lost its binding activity, and the deamidation of Asn33 was considered to have a large effect on the binding activity.
  • amino acid sequence of the light chain CDR1 of the above-mentioned modified antibody is represented by SEQ ID NO: 10 (G34A), SEQ ID NO: 110 (G34D), SEQ ID NO: 1 1 1 (G34E), SEQ ID NO: 1 1 2 (G34F), SEQ ID NO: 1 1 3 (G34H), SEQ ID NO: 1 1 4 (G34N), SEQ ID NO: 1 1 5 (G34T), SEQ ID NO: 1 1 6 (G34Q), SEQ ID NO: 1 1 7 (G34I), SEQ ID NO: 1 1 8 (G34K), SEQ ID NO: 1 1 9 (G34L), SEQ ID NO: 1 2 0 (G34S), SEQ ID NO: 1 2 1 (G34W), SEQ ID NO: 1 2 2
  • G34Y SEQ ID NO: 1 2 3 (G34R), SEQ ID NO: 1 2 4 (G34V), and SEQ ID NO: 1 2 5 (G34P).
  • amino acid sequences of the light chain variable regions of the above-described modified antibodies are shown in SEQ ID NO: 1 2 6 (G34A), SEQ ID NO: 1 2 7 (G34D), SEQ ID NO: 1 2 8 (G34E), SEQ ID NO: 1, respectively.
  • G34F SEQ ID NO: 1 3 0 (G34H), SEQ ID NO: 1 3 1 (G34N), SEQ ID NO: 1 3 2 (G34T), SEQ ID NO: 1 3 3 (G34Q), SEQ ID NO: 1 3 4 (G34I ), SEQ ID NO: 1 3 5 (G34K), SEQ ID NO: 1 3 6 (G34L), SEQ ID NO: 1 3 7 (G34S), SEQ ID NO: 1 3 8
  • the present invention provides a cell in which the expression of both fucose transporter genes on the chromosome is artificially suppressed, and when the cell is used for protein production, a recombinant protein having no fucose is produced. can do.
  • the recombinant protein without fucose has reduced cytotoxic activity compared to the protein with fucose, and the stability is equivalent to the protein with fucose.
  • Proteins are particularly advantageous in recombinant antibodies used as antibody medicines.

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Abstract

　フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた組換えタンパク質、特に抗体の作製方法に関し、相同染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞を提供する。

Description

明細書
フコーズトランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製 法 技術分野
本発明は、 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた組換え タンパク質、 特に抗体の作製方法に関する。 背景技術
抗体は、 ADCC (抗体依存性細胞障害） 活性や CDC (補体依存性細胞障害） 活性 により抗腫瘍効果を発揮しうる。 抗体は糖鎖が結合した糖タンパク質であり、 抗 体の細胞障害活性の強さは抗体に結合する糖鎖の種類および量により変化しうる ことが知られている。 特に、 抗体と結合したフコースの量が細胞障害活性の強さ に強く拘わっていることが報告されている （非特許文献 1参照）。 さらに、 細胞障 害活性が増強された抗体を得るために抗体産生の際に糖鎖へのフコースの結合を 触媒する酵素を発現させないように操作し、 フコースを有しない組換え抗体を作 製する方法が報告されている （特許文献 1参照）。
非特許文献 1 Shi elds et al. , J Biol Chem. , 277 (30) , 26733-26740, 2002 特許文献 1 国際公開公報 W000/61739号公報 発明の開示
本発明は、 容易かつ確実にフコースの結合が消失または低下した組換えタンパ ク質を製造する方法の提供を目的とする。 特にフコースの結合が消失または低下 し、 細胞障害活性が増強された抗体を製造する方法の提供を目的とする。 本発明 は、 さらにこのようなタンパク質を産生するための宿主細胞を提供することを目 的とする。
抗体産生細胞中で抗体にフコースが結合する機構として、 細胞内に取り込まれ たフコースに GDPが結合し、その後 GDP-フコースがゴルジ体中に取り込まれゴル ジ体中で GDP-フコースのフコースがタンパク質に糖鎖として付加されている N- ァセチルダルコサミンに転移することが知られている。 具体的には、 抗体分子の Fc領域には、 グリコシド結合糖鎖が結合する部位が 2箇所あり、 N-グリコシド 結合糖鎖め N-ァセチルダルコサミン部分にフコースが結合する （Pate L. j Smith etal. J. Cell Biol. 2002, 158, 8(H- 815)。 ' t
本発明者らは、 染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子を破壊する ことにより、 ゴルジ体へのフコースの取り込みが阻害され、 結果として抗体にフ コースが付加されるのを阻害することができると考え、 染色体上の両方のフコー ストランスポー夕一遺伝子を破壊した細胞を作製することにより、 本発明を完成 させるに至った。
本発明において、 抗体へのフコースの付加を阻害するとは、 製造される抗体全 てがフコースが付加されていないことは必要ではなく、 抗体組成物中のフコース が付加されているタンパク質の割合が減少していればよい。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
[I] 染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制 されている細胞。
[2] フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていることを特徴とする [1] の細胞。
[3] 動物細胞である [1]または [2]の細胞。
[4] 動物がチャイニーズハムスター細胞である、 [3]の細胞。
[5] 動物細胞が CH0細胞である [4]の細胞。
[6] 遺伝子の破壊がジーンターゲティングベクターを用いた相同組換えにより 行われる、 [2]から [5]のいずれかの細胞。
[7] 外来タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする [ 1]から [6]のいずれかの細胞。
[8] 外来タンパク質をコードする遺伝子が抗体をコードする遺伝子である [7] の細胞。
[9] [1]から [8]のいずれかの細胞を培養することを特徴とするタンパク質の 製造方法。
[10] タンパク質が抗体である [9]の製造方法。
[I I] フコースが付加されていないタンパク質を製造することを特徴とする [ 10]の製造方法。
[1 2] 細胞を用いて組換えタンパク質を製造する際に、 染色体上の両方 toフコ ーストランスポーター遺伝子の発現を人為的に抑制することを特徴とする、 タン パク質へのフコース付加阻害方法。
[1 3〗 遺伝子の発現の人為的抑制が、 遺伝子を欠損することによる行われるこ とを特徴とする [1 2]のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
[14] タンパク質が抗体である [1 2]または [1 3〗のタンパク質へのフコース 付加阻害方法。
[1 5] 細胞が CH0細胞である [1 2]から [14]のいずれかのタンパク質へのフ コース付加阻害方法。 本明細書は本願の優先権の基礎である PCT国際特許出願 PCT/JP2004/019261の 明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 3種類の夕ーゲッティングベクターの構造を示す図である。
図 2は、 第一段階のノックアウト後、 Bgl llによる切断で、 出現するバンドの 構造を示す図である。 - 図 3は、 第一段階のノックァゥ卜のサザンブロット解析の結果を示す写真であ る。
図 4は、 第二段階のノックァゥ卜の相同組み換え効率を示す図である。
図 5は、 フコーストランスポー夕一遺伝子欠損株のサザンブロット解析の結果 を示す写真である。
図 6は、 フコーストランスポーター遺伝子欠損株（wild/KO) のフコースの発現 解析の結果を示す図である。
図 7は、 フコーストランスポ一夕一遺伝子欠損株（K0/K0) のフコースの発現解 析の結果を示す図である。
図 8は各抗 HM1.24抗体の、 ヒト PBMCを用い ARH-77を標的細胞とした場合の ADCC活性を示す図である。 図 9は、各抗 GPC3抗体の、ヒ卜 PBMCを用い HuH- 7を標的細胞とした場合の ADCC 活性を示す図である。 J 図 1 0は、 FT-K0細胞産生ヒト化抗 HM1. 24抗体（a)および CH0細胞産生,ヒト化 抗 HM1. 2 抗体（b)から調製した 2-AB化糖鎖の順相 HPLCクロマトグラムを示す図 である。
図 1 1は、 FT-K0細胞産生ヒト化抗 GPC3抗体（a, b, c)および CH0細胞産生ヒ ト化抗 GPC3抗体から調製したァガラクトシル 2- AB化糖鎖の順相 HPLCクロマトグ ラムを示す図である。
図 1 2は、 図 1 1で示したピーク G (0)および G (0) - Fucの推定構造を示す図で ある。
図 1 3は、 FT-K0細胞産生抗体（a)および CH0細胞産生抗体（b)についての DSC (示差走査熱量計） 測定チャートを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明においてフコーストランスポーターとはフコース輸送活性を有するポリ ペプチドのことをいい、 例えば、 フコーストランスポーターが細胞膜上に発現し ている場合には通常、 フコースを細胞内に取り込み、 フコーストランスポーター がゴルジ膜上に発現している場合には通常、 フコースをゴルジ体内に取り込む。 本発明においては好ましいフコーストランスポー夕一はチャイニーズハムスター フコーストランスポーターであり、 より好ましくは配列番号 2に記載されたアミ ノ酸配列を有するフコーストランスポーターである。 配列番号 1にはチヤィニー ズハムスターフコーストランスポー夕一遺伝子の塩基配列を示す。
ゴルジ体は主にゴルジ膜上に存在するフコーストランスポーターを介して、 フ コースをゴルジ体内に取り込んでいることから、 該フコーストランスポーターの 機能を阻害することにより、 ゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害すること ができ、 ゴルジ体内に取り込まれるフコースの量を減少させることが可能である 細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害するとは、 フコーストランスポ —ターのフコース輸送活性を低下または消滅させることをいう。 細胞のフコーストランスポーターの機能の阻害はどのような方法で行われても よいが、 'フコーストランスポーターの発現を阻害する方法が好ましい。 j フコース卜ランスポーターの発現阻害は、 正常な輸送能を有するフコーストラ ンスポーターの数が減少する限り、 特に制限はされないが、 フコーストランスポ 一夕一を標的とした夕ーゲティングベクターなどを用いてフコース卜ランスポー 夕一をコードする遺伝子 （フコーストランスポーター遺伝子） を欠失 （ノックァ ゥト） する方法が好ましい。
通常、 細胞は染色体上の両方にフコーストランスポーター遺伝子を有している が、 本発明のフコーストランスポーターの機能が阻害された細胞は、 染色体上の 両方のフコーストランスポーター遺伝子が欠失している。 又、 本発明のフコース トランスポーターの機能が阻害された細胞は、 染色体上の 2つのフコーストラン スポーター遺伝子が欠失していれば特に限定されないが、 染色体上に存在するフ コーストランスポー夕一遺伝子の全てが欠失していることが好ましい。 例えば、 染色体上に 3つのフコーストランスポーター遺伝子が存在する場合には、 3つの フコーストランスポーター遺伝子が欠失していることが好ましい。 染色体上の全 てのフコーストランスポーター遺伝子が欠失しているか否かは、 例えば、 実施例 記載のサザンプロット解析や、 あるいは F I S H法などを用いて調べることが可 能である。
本発明の製造方法により作製されるタンパク質はどのようなタンパク質でもよ いが、 通常、 糖タンパク質であり、 好ましくは抗体である。
本発明の方法により作製する抗体の種類は特に制限されず、 マウス抗体、 ラッ ト抗体、 ゥサギ抗体、 ヒッジ抗体、 ラクダ抗体、 ヒト抗体等や、 ヒトに対する異 種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体
、 例えば、 キメラ抗体、 ヒト化抗体等を適宜用いることができる。 遺伝子組換え 型抗体は、 既知の方法を用いて製造することができる。 キメラ抗体は、 ヒト以外 の哺乳動物、 例えば、 マウス抗体の重鎖、 軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、 軽 鎖の定常領域からなる抗体であり、 マウス抗体の可変領域をコードする DNAをヒ ト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、 これを発現ベクターに組み込んで 宿主に導入し産生させることにより得ることができる。 ヒト化抗体は、 再構成 （ reshaped) ヒト抗体とも称され、 ヒ卜以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相 補性決定領域 (CDR ; complementar i ty de termining region) をヒト抗体^相補性 決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られ,ている
。 具体的には、 マウス抗体の CDR とヒ卜抗体のフレームワーク領域 （f ramework region； FR) を連結するように設計した DNA配列を、 末端部にオーバーラップす る部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成 する。 得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする MAと連結し、 次いで発現 ベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産生させることにより得られる （欧 州特許出願公開番号 EP 239400, 国際特許出願公開番号 W0 96/02576参照）。 CDR を介して連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形 成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切 な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のァミノ 酸を置換してもよい （Sato, K. e t al. , Cancer Res, 1993, 53, 851-856. ) 0 また
、 ヒト抗体の取得方法も知られている。 例えば、 ヒトリンパ球を in vi t roで所望 の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、 感作リンパ球をヒ卜ミエロー マ細胞、例えば U266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得 ることもできる （特公平卜 59878参照）。 また、 ヒト抗体遺伝子の全てのレパート リーを有するトランスジエニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒ卜 抗体を取得することができる （国際特許出願公開番号 W0 93/12227, W0 92/03918
, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735 参照）。 さらに、 ヒト 抗体ライブラリーを用いて、 パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られ ている。 例えば、 ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体 （scFv) としてファージディ スプレイ法によりファージの表面に発現させ、 抗原に結合するファージを選択す ることができる。 選択されたファージの遺伝子を解析すれば、 抗原に結合するヒ ト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。 抗原に結合す る scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を基に適当な発現ベクターを作製 し、 ヒト抗体を取得することができる。 これらの方法は既に衆知であり、 W0
92/01047, W0 92/20791, W0 93/06213, W0 93/11236, W0 93/19172, W0 95/01438,
W0 95/15388を参考にすることができる。 また、 抗体は抗原に結合することができれば、 抗体断片等の低分子化抗体ゃ抗 体の修飾物などであってもよい。 例えば、 抗体断片としては、 Fab、 F(ab'う 2、 Fv 又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカーで連結させたシングルチエイン Fv.(scFv) (Huston, J. S. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) 、 Diabody などが挙げられる。 このような抗体断片を得るには、 これら抗体断片 をコードする遺伝子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細 胞で発現させればよい （例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ； Better, M. and Horwitz, A. H. , Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra, A. , Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ； Lamoyi, E.， Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ； Rousseaux, J. et al. , Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W. , Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。 Diabodyは、 可変領域と可変領域をリン カー等で結合したフラグメント （例えば、 scFv等） （以下、 Diabodyを構成するフ ラグメン卜） を 2つ結合させて二量体化させたものであり、 通常、 2つの VLと 2 つの VH を含む（P. Holliger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993)、 EP404097号、 W093/11161号、 Johnson et al. , Method in Enzymol ogy, 203, 88-98, (1991)、 Holliger et al. , Protein Engineering, 9, 299-305, (1996) 、 Perisic et al. , Structure, 2, 1217-1226, (1994)、 John et al. , Protein Engineering, 12 (7), 597-604, (1999) 、 Holliger et al, - Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 90, 6444-6448, (1993) 、 Atwell et al. , Mol. Immunol.33, 1301-1312, (1996))。
抗体の修飾物として、 ポリエチレングリコール（PEG)等の各種分子と結合した 抗体を使用することもできる。 又、 抗体に放射性同位元素、 化学療法剤、 細菌由 来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能であり、 特に放射性標 識抗体は有用である。 このような抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的な修飾を 施すことによって得ることができる。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野において すでに確立されている。
ぐ本発明の方法によるタンパク質の製造方法 >
組み換えポリペプチドの製造方法は、 当業者に知られている公知の方法で行う ことが可能である。 一般的にはポリペプチドをコードする MAを、 適当な発現べ クタ一に'組み込み、 これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回1収し、 抽出物を得た後、 イオン交換、 逆相、 ゲル濾過などのクロマトグラフィー„ ある いは本発明のポリべプチドに対する抗体をカラムに固定したァフィ二ティーク口 マトグラフィ一にかけることにより、 または、 さらにこれらのカラムを複数組み 合わせることにより精製し、 調製することが可能である。
また、 タンパク質をダル夕チオン S-トランスフェラ一ゼタンパク質との融合ポ リペプチドとして、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリぺプチド として宿主細胞 （例えば、 動物細胞や大腸菌など） 内で発現させた場合には、 発 現させた組み換えポリペプチドはダル夕チオンカラムあるいはニッケルカラムを 用いて精製することができる。 融合ポリペプチドの精製後、 必要に応じて融合ポ リペプチドのうち、 目的のポリペプチド以外の領域を、 トロンビンまたはファク 夕一 Xaなどにより切断し、 除去することも可能である。
本発明の製造方法において製造されるタンパク質としては、 結合したフコース により細胞傷害活性が影響を受ける抗体が好ましい。
抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換 え技術を用いて抗体を産生させる方法は当業者によく知られている （例えば、 Car l, A. K. Borrebaeck, James, W. Larr i ck, THERAPEUTI C MONOCLONAL ANTIBODIES, Publ i shed in the Un i ted Kingdom by MACMILLAN PUBL I SHERS LTD, 1990参照）。 <本発明のタンパク質の製造方法において用いる細胞および該細胞を用いての夕 ンパク質の製造 >
さらに、 本発明は外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、 染色体に 存在するフコーストランスポーター遺伝子の両方の発現が人為的に抑制されてい る細胞を包含する。
このような、 染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為 的に抑制されている細胞を宿主細胞として外来タンパク質を発現させることによ り、 フコースの結合していないタンパク質を得ることができる。 ここで、 外来の タンパク質とはその細胞自体に由来しないタンパク質をいう。 宿主細胞には特に 制限はなく、 例えば、 組換えタンパク質を発現させた際に該タンパク質に糖が付 加される細胞等を用いることができる。 より具体的には種々の動物細胞などを用 いるこどができ、 好ましくは CH0細胞である。 本発明においては特にフゴースト ランスポーター遺伝子がノックァゥ卜された CH0細胞を好適に使用するこ,とがで きる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Med. (1995) 108，
945)、 COS, 3T3、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney), HeLa、 Vero、 両生類 細胞、 例えばアフリカッメガエル卵母細胞 （Valle, et al. , ature (1981) 291,
358-340)、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 Sf9、 Sf2K Tn5が知られている。 CH0細 胞としては、例えば、 DHFR遺伝子を欠損した CH0細胞である dhfr- CH0(Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) や CHO K - 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1968) 60, 1275) などを例示することができる。 動物細胞において、 大量発現を 目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。
上記の外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、 フコーストランスポ 一ターの機能が阻害されている細胞に産生させようとする抗体等の外来タンパク 質をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを組込めば、 フコースの結合して いないタンパク質を得ることができる。 ベクターとしては、 例えば、 哺乳動物由 来の発現ベクター （例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、 pEGF-BOS (Nucleic
Acids. Res.1990, 18 (17) , p5322)、 pEF、 pC画）、 昆虫細胞由来の発現ベクター ( 例えば「Bac_to - BAC baculovairus expression systenu (ギブコ BRL社製）、 pBacPAK8
)、 植物由来の発現ベクター （例えば ρΜΗ1、 pMH2)、 動物ウィルス由来の発現べク 夕一 （例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw), レトロウイルス由来の発現ベクター （例 えば、 pZIPneo)、 酵母由来の発現ベクター （例えば、 「Pichia Expression Kit」
(インビトロゲン社製）、 NVIK SP- Q01)、 枯草菌由来の発現べクタ一 （例えば、 pPL608、 PKTH50) 等が挙げられるが、 宿主細胞を CH0細胞とする場合には哺乳動 物由来のベクターを使用することが好ましい。
CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とする場合には
、 通常、 細胞内で発現させるために必要なプロモーター、 例えば SV40プロモー夕 一 (Mulliganら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV- LTRプロモ一夕一、 EFlo;プロ モーター （Mizushimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMVプロモー 夕一などを持っており、 細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 （例えば、 薬 剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬剤耐性遺伝子） を有す ればさらに好ましい。 このような特性を有するベクターとしては、 例えば pMAM 、 pDR2、 pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV、 pOP 13などが挙げられる。
さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、 核酸合成経路を欠損した CH0 細胞にそれを相補する DHFR遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メトトレキセ一 ト （MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目的 とする場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用い て SV40の複製起点を持つベクター （pcDなど） で形質転換する方法が挙げられる 。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ ローマウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞 系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクタ一は選択マーカーとして、 アミノグ リコシドトランスフェラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大 腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhir) 遺伝子等を含むことができる。
宿主細胞へのベクタ一の導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキスト ラン法、 カチォニックリボソーム D0TAP (ベーリンガーマンハイム社製） を用い た方法、 エレクト口ポレーシヨン法、 リポフエクシヨンなどの方法で行うことが 可能である。
細胞の培養は、 公知の方法に従い行うことができる。 例えば、 動物細胞の培養 液として、 例えば、 DMEM、 MEM, RPMI 1640, IMDM を使用することができる。 その 際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用することもできるし、 無血清培養して もよい。 培養時の pHは、 約 6〜8であるのが好ましい。 培養は、 通常、 約 30〜40 t:で約 15〜200時間行い、 必要に応じて培地の交換、 通気、 攪拌を加える。
染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制され ている細胞として、 染色体に存在するフコーストランスポーター遺伝子の両方が 破壊された細胞を挙げることができる。
「遺伝子の破壊」 とは、 遺伝子の塩基配列に部分的な欠失、 置換、 挿入、 付加 等を行い、 該遺伝子の発現を抑制することをいう。 ここで 「遺伝子の発現を抑制 」 には、 遺伝子自体は発現するが、 正常な機能を有するタンパク質をコードする 遺伝子が発現されない場合も含まれる。 J 又、 遺伝子の発現が完全に抑制されている場合だけでなく、 部分的に抑制され ている場合も本発明の 「遺伝子の破壊」 に含まれる。 「遺伝子の欠損 （ノックァゥ 卜）」 および 「遺伝子の不活性化」 も 「遺伝子の破壊」 と同等の意味として用いら れる。 さらに、 ジーン夕ーゲティングを用いた相同組換えにより遺伝子が破壊さ れた細胞を遺伝子がノックアウトされた細胞という。 フコーストランスポーター をコードする遺伝子を破壊した細胞は、 フコーストランスポーターの発現が人為 的に抑制されている細胞の 1つである。
フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した細胞は、 通常、 ゴル ジ体内に存在するフコースの量がフコーストランスポーター遺伝子が破壊されて いない細胞に比べ有意に減少する、 または、 細胞内におけるフコース輸送能が低 下または欠損する、 または、 細胞内のゴルジ体へのフコース取込み活性が低下ま たは欠損する。
特に、 相同染色体の 2対のフコース卜ランスポーター遺伝子の両方が欠損した 細胞は、 片方のみのフコーストランスポーターが欠損した細胞と比較して、 上記 の性質がより顕著に現れる。
ゴルジ体中のフコースの量は細胞よりゴルジ体を単離し糖を抽出し、 抗原抗体 反応、 糖とレクチンの結合反応、 液体クロマトグラフィー、 電気泳動等により測 定することができる。 また、 細胞内におけるフコース輸送能および細胞内のゴル ジ体へのフコース取込み活性は例えば、 蛍光物質やラジオァイソトープ等で標識 したフコースを用いて測定することができる。
遺伝子の破壊は、 例えば、 相同組換え法により行うことが可能である。
相同組換え法は、 染色体上の遺伝子と外来 DNAとの間で相同的遺伝子組換えに よって目的の遺伝子だけを任意に改変する方法をいい、 タンパク質をコードする 配列を分断する目的で、 その遺伝子のェクソンに別の DNA配列を挿入する。 ジー ン夕ーゲティングベクターを持つ細胞を同定しやすくするため、 遺伝子を分断す る配列には一般にバクテリア由来のネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカ 一を用いる。 本明細書に記載のフコーストランスポーター遺伝子の配列情報を基 にターゲティングベクターを設計 ·作製し、 該ターゲティングベクターを用いて 破壊しょうとするフコーストランスポーター遺伝子を相同組換えすればよ jい。 例 えば、 置換型ベクターは、 導入する変異の 5'および 3'側に連結された相同領域、 ポジティブセレクション用のマーカー、 相同領域の外側でベクターを直鎖状化す るための制限酵素部位、 相同領域の外側に配置されたネガティブセレクション用 のマーカー、 変異検出用の制限酵素切断部位等を含むことができる。 夕ーゲティ ングベクターは、 山村研一ら編 トランスジエニック動物 共立出版株式会社
1997年 3月 1 日、相沢慎一 ジーンターゲティング ES細胞を用いた変異マウス の作製 バイオマニュアルシリーズ 8 羊土社 1995、 Hogan e t a l. ,
Man ipu l at ing the Mouse Embryo, Co l d Spr ing Hoarbor Labora t ory Pres s ( 1944)
、 Joyner, A. L. , Gene Targe t ing, A Prac t ical Approach Ser i es, IRL Press ( 1993)
、 松村正實ら編 実験医学別冊 新遺伝子工学八ンドブック （改定第 3版） 羊 土社 1999 等に記載の方法に従って作製することができる。 夕ーゲティングべ クタ一は挿入型および置換型のどちらを用いてもよい。 また、 Cre- l ox 系を用い た夕ーゲティングにより組換えを起こさせることもできる。 Cre- l ox 系を用いた 夕ーゲティングは、 例えば特表平 Π-503015号公報に記載の方法に従って行うこ とができる。 相同組換えを起こした相同組換え体の選別方法としては、 ポジティ ブ選択、 プロモーター選択、 ネガティブ選択、 ポリ A選択等の公知の選択方法を 用いればよい。 相同組換え体の同定は、 PCR 法でもサザンブロッテイング法のい ずれの方法をも用いることができる。
さらに、 本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞は、 染色 体の 2対のフコーストランスポーターの両方が欠損する限り、 細胞にランダムに 変異を導入しても得ることができる。 ランダムに変異を導入する方法として、 マ 一力一の入った遺伝子破壊べクタ一を細胞のゲノムにランダムに導入してフコー ストランスポーター遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングする方法と、
ENU (N- e t hy卜 N-n i t ro s ou r e a)等の化学変異原でランダムな変異を導入してフコー ストランスポー夕一遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングする方法が挙げら れる。 フコーストランスポー夕一が産生されなくなった細胞のスクリーニングは
、 フコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、 ウエスタンブロッ ティングゃノーザンプロッティングによりフコーストランスポーター遺伝子の転 写、 発現を指標にして行うこともできる。 j さらに本発明のフコーストランスポー夕一遺伝子が破壊された細胞は、 ，フコー ストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物から得ることができる。 フコ ーストランスポーター遺伝子をノックァゥトした動物は、 ES細胞のフコーストラ ンスポ一夕一を前記方法で破壊し、 該 ES細胞から例えば、 W002/33054号公報に 記載の方法で作出することができる。 この際用いる動物としては、 限定されない がャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 マウス、 ハムスター、 ラット等が挙げられる。 フ コーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物から株化細胞を作製する ことにより、 フコーストランスポーター遺伝子を有しない株化細胞を得ることが できる。
本発明の染色体上の 2つのフコーストランスポーター遺伝子の両方が破壊され た宿主細胞で外来の組換えタンパク質を産生させた場合、 細胞中のフコースがゴ ルジ体中にトランスポートされないためタンパク質へのフコースの付加が阻害さ れる。 フコーストランスポーター遺伝子が破壊された宿主細胞で産生した組換え タンパク質は、 フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない宿主細胞で 産生した組換えタンパク質に比較して結合しているフコース量が有意に少なく、 好ましくは検出できない。 外来タンパク質が抗体の場合、 抗体 1分子の 2つの H 鎖の Fc領域に存在する 2箇所の糖鎖結合部位に結合した N -ダリコシド結合糖鎖 にフコースが結合していないものが得られる。 このようなフコースが結合してい ない抗体は細胞傷害活性が増強されている。 なお、 本発明の細胞を用いて、 抗体 へのフコースの付加が阻害された抗体を製造する場合、 製造される抗体全てがフ コースが付加されていないことは必要ではなく、 抗体組成物中のフコースが付加 されているタンパク質の割合が減少していればよい。
例えば、 本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊されている動物細胞 を用いて作製した抗体において、 総糖鎖の 50%以上、 好ましくは 70%以上、 さら に好ましくは 85 %以上、特に好ましくは 90%以上が、 フコースが付加されていな い。
さらに、 本発明は、 染色体上のフコーストランスポーター遺伝子の両方が欠損 した動物（ヒトを除く） も包含する。 このような動物を用いることにより in vivo で組換えポリペプチドを産生することができる。 i これらの動物に目的とするタンパク質をコードする DNAを導入し、 動物の体内 でポリペプチドを産生させ、 回収する。 本発明における 「宿主」 とは、 これらの 動物などを包含する。 動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系が ある。 哺乳類動物としては、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用いることが でさる (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Appl icat ions, 1993)。
例えば、 目的とする DNAを、 ャギ /3カゼインのような乳汁中に固有に産生され るポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。 次いで、 こ の融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ移植する 。 胚を受容したャギから生まれる卜ランスジエニックャギ又はその子孫が産生す る乳汁から、 目的のポリペプチドを得ることができる。 トランスジエニックャギ から産生されるポリべプチドを含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンを トランスジエニックャギに使用してもよい （Ebert, K. M. e t al. , B io/Technology (1994) 12, 699—702)。
得られたポリペプチドは、 宿主細胞内または細胞外 （培地など） から単離し、 実質的に純粋で均一なポリぺプチドとして精製することができる。 ポリベプチド の分離、 精製は、 通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、 精製方法を 使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマトグラフィー力 ラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免疫沈降、 SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶等を適宜選 択、 組み合わせればポリペプチドを分離、 精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、 ィ オン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆相クロ マトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる （St rategies for
Prote in Puri f icat ion and Characteri zat ion : A Laboratory Course Manual. Ed
Dan ie l R. Marshak e t al. , Co ld Spr ing Harbor Laboratory Press, 1996)。 こ れらのクロマトグラフィーは、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPLC、 FPLC等の 液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 なお、 ポリペプチドを精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用さ せることにより、 任意に修飾を加えたり部分的にぺプチドを除去すること でき る。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 リシ ルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 ダルコシダーゼなどが用いられる 本発明の製造方法により製造される抗体の H鎖又は L鎖をコードする遺伝子は 既知の配列を用いることも可能であり、 又、 当業者に公知の方法で取得すること も可能である。 例えば、 モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマから抗体 をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能であるし、 抗体ライ ブラリから取得することも可能である。 ハイプリ ドーマは、 基本的には公知技術 を使用し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 所望の抗原や所望の抗原を 発現する細胞を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免 疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法により、 モノクローナルな抗体産生細胞 （ハイプリ ドー マ） をスクリーニングすることによって作製できる。 得られたハイプリドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域） の cDNAを合成し、 これを 所望の抗体定常領域 （C領域） をコードする MAと連結することにより H鎖又は L鎖をコードする遺伝子を得ることができる。 免疫の際の感作抗原としては特に 限定されないが、 例えば、 目的の全長タンパク質や、 部分ペプチドなどを用いる ことができる。 抗原の調製は、 当業者に公知の方法により行うことができ、 例え ば、 バキュロウィルスを用いた方法 （例えば、 W098/46777など） などに準じて行 うことができる。 ハイプリドーマの作製は、 たとえば、 ミルスティンらの方法 （ Kohler, G.， and Mi l s te in, C. , Methods Enzymol. 1981, 73, 3-46. ) 等に準じ て行うことができる。 抗原の免疫原性が低い場合には、 アルブミン等の免疫原性 を有する巨大分子と結合させ、 免疫を行えばよい。
抗体ライブラリについては既に多くの抗体ライブラリが公知になっており、 又
、 抗体ライブラリの作製方法も公知であるので、 当業者は適宜抗体ライブラリを 入手することが可能である。
上述のように発現、 産生された抗体は、 通常のタンパク質の精製で使用されて いる公知の方法により精製することができる。 例えば、 プロテイン Aカラムなど のァフィ '二ティーカラム、 クロマトグラフィーカラム、 フィルター、 限外爐過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わせることにより、 抗体を分離、 精製す,ること 力できる（Ant ibod ies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spr ing Harbor Laboratory, 1988)。
抗体の抗原結合活性（Ant ibod ies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することが できる。 例えば、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法）、 EIA (酵素免疫測定法）、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明の細胞を用いて産生させたタンパク質の糖鎖構造の解析は、 2次元糖鎖 マップ法 (Anal. Bi ochem, , 171, 73, (1988)、 生物化学実験法 23-糖タンパク質糖鎖 研究法 高橋禮子編 学会出版センター （1989)等に記載の方法により行うこと ができる。 さらに、糖鎖を MALDI-T0F- MS等の質量分析により解析することもでき る。
また、 本発明の細胞を用いて産生させたフコースが付加されていないタンパク 質の熱安定性等の安定性はフコースが付加されたタンパク質と同等である。
抗体の細胞障害活性
本発明の方法で製造される抗体は細胞障害活性が増加した抗体である。
本発明における細胞障害活性とは、 例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害 (ant ibody-dependent ce l l-med iated cytotoxic i ty： ADCC)活性、 補体依存性細胞 障害 （complement-dependent cytotoxic i ty： CDC) 活性などを挙げることができ る。 本発明において、 CDC活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、 ADCC活 性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、 その Fc部分に FC T" 受容体保有細胞 （免疫細胞等） が Fc r受容体を介して結合し、 標的細胞に障害を 与える活性を意味する。
抗体が ADCC活性を有するか否か、又は CDC活性を有するか否かは公知の方法に より測定することができる（例えば、 Current protocol s in Immunology, Chapter7. Immunol ogic s tud ies in humans, Ed i tor, John E, Col igan e t al. , John Wi ley & Sons, Inc. , (1993)等）。 具体的には、 まず、 エフェクター細胞、 補体溶液、 標的細胞の調製を行う。
(1) 'エフェクター細胞の調製 i CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、 RPMI 1640培地（GIBC0社製）中で脾臓細胞 を分離する。 10%ゥシ胎児血清（FBS、 HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、 細胞 濃度を 5xl06/mlに調製し、 エフェクター細胞を調製する。
(2) 補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement (CEDARLANE社製）を 10% FBS含有培地（GIBC0社製）に て 10倍希釈し、 補体溶液を調製する。
(3) 標的細胞の調製
膝臓癌細胞株（AsPC- 1、 Capan - 2等）を 0.2mCiの 5lCr-sodium chromate (Amersham Pharmacia Biotech社製）とともに、 10% FBS含有 DMEM培地中で 37 にて 1時間 培養することにより放射性標識する。 放射性標識後、 細胞を 10% FBS 含有 RPMI1640培地にて 3回洗浄し、 細胞濃度を 2xl05/ml に調製して、 標的細胞を調 製する。
次いで、 ADCC活性、 又は CDC活性の測定を行う。 ADCC活性の測定の場合は、 96 ゥエル U底プレート（86じ1^011 0^1^115011社製）に、 標的細胞と、 抗体を 50 1ず つ加え、 氷上にて 15分間反応させる。 その後、 エフェクター細胞 ΙΟΟμΙを加え 、炭酸ガスインキュベータ内で 4時間培養する。抗体の終濃度は 0または 10 zg/ml とする。 培養後、 100 1 の上清を回収し、 ガンマカウンター（COBRA IIAUT0-GMMA 、 MODEL D5005、 Packard Instrument Co即 any社製）で放射活性を測定する。 細胞 障害活性は）は（A-C) I (B-C) X 100により求めることができる。 Aは各試料における 放射活性（cpm)、 B は 1% NP-40(半井社製）を加えた試料における放射活性（cpm) 、 Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm)を示す。
一方、 CDC活性の測定の場合は、 96ゥエル平底プレー卜（Becton Dickinson社 製）に、 標的細胞と、 抗 PepT抗体を 50 ずつ加え、 氷上にて 15分間反応させる 。その後、 補体溶液 100 /1を加え、 炭酸ガスインキュベータ内で 4時間培養する 。 抗体の終濃度は 0または 3/xg/mlとする。 培養後、 100^1の上清を回収し、 ガ ンマカウンターで放射活性を測定する。細胞障害活性は ADCC活性の測定と同様に して求めることができる。 例えば、 本発明のフコーストランスポー夕一遺伝子が破壊されている動物細胞 を用いて作製した抗体と同種の動物細胞であって、 フコーストランスポ」ター遺 伝子が破壊されていない動物細胞を用いて作製した抗体の ADCC活性を、抗体濃度 -細胞障害活性 （％) 曲線から 50%細胞障害活性を与える抗体濃度を求めて比較 した場合、 フコーストランスポーター遺伝子が破壊されている動物細胞を用いて 作製した抗体の 50 %細胞障害活性を与える抗体濃度はフコーストランスポー夕 一遺伝子が破壊されていない動物細胞を用いて作製した抗体の 50 %細胞障害活 性を与える抗体濃度の 1/2、 好ましくは 1/5、 さらに好ましくは 1/10である。 す なわち、 本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊されている動物細胞を 用いて作製した抗体の ADCC活性は、フコーストランスポーター遺伝子が破壊され ていない動物細胞を用いて作製した抗体に比較して、 2倍以上、 好ましくは 5倍 以上、 さらに好ましくは 10倍以上増強される。 本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によって限定されるものではない。
実施例 1 CH0細胞におけるフコーストランスポー夕一遺伝子の破壊
1 . 夕一ゲッティングベクターの構築
( 1 ) K01ベクターの作製
PCDNA3. 1/Hygro (インビトロジェン社） より Hyg5_BHと Hyg3-NTのプライマー で PCRすることによって、 Hygromyc in耐性遺伝子 （Hyg の開始コドンの 5'側に BamH Iサイトと TGCGCの配列を付加することで、 フコーストランスポーター遺伝 子の開始コドンの 5'側と同じ配列にし、 SV40 polyA付加シグナルまでの領域を含 む 3'側には Not Iサイ 卜を付加して Hyg「を抜き出した。
フォヮ一ドプライマ一
Hyg5-BH 5'- GGA TCC TGC GCA TGA AAA AGC CTG AAC TCA CC -3' (配列番号 3 ) リバースプライマー
Hyg3-NT 5'- GCG GCC GCC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CG -3' (配列番号 4 ) フコーストランスポーターの夕ーゲッティングベクター ver. 1 (以下、 K01べク 夕一と称する）は PMC IDT- Aベクター（Yagi T, Pro Nat l. Acad. Sc i. USA vol. 87, P9918-9922, 1990) に、 フコーストランスポーターの 5'側 （配列番号 1 ίこ ¾す塩 基配列の No. 2, 780の Sma Iから No. 4, 232の BamH 1)、3'側（No. 4, 284から No. 10, 934 の Sac Iまで）、 及び Hyg「フラグメントを各々挿入することで構築した （図 1 )。 ベクタ一の特徴としては、 Hyg「にプロモーターが付加されていないことから、 相 同組み換えを起こしたときにフコーストランスポーターのプロモーターによって 、 Hygfが発現することとなる。 しかしながら、 相同組み換えによって 1 コピーの みベクターが細胞に導入されても、 ハイグロマイシン Bに対する耐性を獲得する ほど Hygrが発現するとは限らない。 なお、 K01ベクターは Not Iで切断して細胞 に導入した。 K01 ベクターによって、 フコーストランスポー夕一は開始コドンを 含むェクソン 1の 41塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる
( 2 ) pBSK-pgk-卜 Hygrの作製
PKJ 2 ベクター (Popo H, B iochemical Gene t ics vol. 28, p299 - 308, 1990) よ りマウス pgk- 1 遺伝子のプロモーターを EcoR I-Ps t I によって切り出し、 pB l uescr ipt (ストラタジーン社）の EcoR I-Ps t I サイ トにクローニングして pBSK-pgk-1 を作製した。 Hygrは cDNA3. 1/Hygroより Hyg5-AVと Hyg3-BHのブラ イマ一で PCRすることによって、 Hygrの 5'側に EcoT22 Iサイ 卜と Kozak配列を付 加し、 SV40 polyA付加シグナルまでの領域を含む 3'側には BamH Iサイ トを付加 して Hyg「を抜き出した。
フォヮ一ドプライマ一
Hyg5-AV 5 - ATG CAT GCC ACC ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC -3' (配列番号 5 ) リバースプライマ一
Hyg3-BH 5' - GGA TCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG CTT C -3， (配列番号 6 ) この Hygr (EcoT22 I -BamH I ) フラグメントを pBSK-pgk-1 の Ps t I -BamH Iサ ィ 卜に挿入し、 pBSK-pgk-卜 Hygrを作製した。
( 3 ) K02ベクターの作製
フコーストランスポー夕一の夕ーゲッティングベクター ver. 2 (以下、 K02べク 夕一と称する） は pMC lDT- Aベクタ一にフコーストランスポー夕一の 5，側（配列番 号 1に示す塩基配列の No. 2, 780の Sma Iから No. 4, 232の BamH I)、3，（Nd. 4, 284 から No. 10, 934の Sac Iまで）、 及び pgk-卜 Hygf フラグメントを各々挿人するこ とで構築した （図 1 )。 K01ベクターと異なり、 K02ベクターは Hyg「に pgk-1遺伝 子のプロモーターが付加されていることから、 相同組み換えによって 1コピーの みベクターが細胞に導入されても、 ハイグロマイシン Bに対する耐性を獲得する 。 なお、 K02ベクターは Not Iで切断して細胞に導入した。 K02ベクターによって 、フコース卜ランスポー夕一は開始コドンを含むェクソン 1の 46塩基対を欠損す ることになり、 機能を失うものと考えられる。
( 4 ) pBSK-pgk-卜 Purorの作製
pPURベクター （BD Biosc iences社） を Ps t I と BamH Iで切断し、 切り出され たフラグメント （Puroリ を pBSK- pgk-1 の Ps t I -BamH I サイ 卜に挿入し、 pBSK-pgk-卜 Pu rorを作製した。
( 5 ) K03ベクターの作製
フコーストランスポーターの夕一ゲッティングベクター ver. 3 (以下、 K03べク ターと称する） は pMC lDT- Aベクターにフコーストランスポーターの 5'側（配列番 号 1に示す塩基配列の No. 2, 780の Sma Iから No. 4, 232の BamH 1)、3'側（No. 4, 284 から No. 10， 934の Sac I まで）、 及び pgk-卜 Purof フラグメントを各々挿入する ことで構築した （図 1 )。 なお、 pgk-卜 Purofの 3'末端には、 以下に示すスクリー ニング用のプライマーが結合する配列を予め付加しておいた。 なお、 K03 ベクタ 一は Not Iで切断して細胞に導入した。 K03ベクターによって、 フコーストラン スポ一夕一は開始コドンを含むェクソン 1の 46塩基対を欠損することになり、機 能を失うものと考えられる。
リバースプライマー
RSGR-A 5'- GCT GTC TGG AGT ACT GTG CAT CTG C -3' (配列番号 7 )
以上の 3種類の夕ーゲッティングベクターを用いて、 フコーストランスポー夕 一遺伝子のノックアウトを試みた。
2 . CH0細胞へのベクターの導入 CHO-S-SFMI I HT- (インビトロジェン社、 cat 12052-098)に HT Supplement (100X) (インビトロジェン社 cat. 11067-030) とペニシリンストレプトマイシ^ (ィ ンビトロジェン社 cat. 15140-122) を CH0-S- SFMI I HT-の容量に対して > それ ぞれ 1/100 量を加えた。 これを培養用の培地 （以下、 SFMI I (+)と称する） とし て CH0細胞の DXB11株を継代し、 さらに遺伝子導入後の.培養もこの SFMI I (+)で行 つた。 8 X 106個の CH0細胞を 0. 8mLのダルベッコリン酸緩衝液（以下、 PBS と略 す。 インビトロジェン社 cat 14190-144)に懸濁した。 細胞懸濁液に gの夕 ーゲッティングベクターを加え、 Gene Pulser Cuvet te (4mffl) (バイオラッ ド社 cat. 1652088) に細胞懸濁液を移した。 氷上で 10分間放置した後に、 GENE- PULSER I I (バイオラッド社 code No. 340BR) で 1. 5kV， 25 FDの条件で、 エレクトロボ レーシヨン法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞を 200ml の SFMI I (+)培地に懸濁して 20枚の 96穴平底プレート （イワキ社 cat. 1860-096 ) に 100 1/ゥエルで細胞を播きこんだ。 プレートを C02インキュベータ内で、 24 時間、 37でで培養した後、 薬剤を添加した。
3 . ノックアウトの第一段階
K01ベクター、 もしくは K02ベクターをそれぞれ CH0細胞に導入し、 ベクタ一 導入から 24時間後にハイグロマイシン B (インビトロジェン社 cat. 10687-010 ) による選抜を行った。 ハイグロマイシン Bは 0. 3mg/ml になるように SFMI I (+) に溶解し、 100 1/ゥエル添加した。
4 . PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
( 1 ) PCR用のサンプルの調整
相同組み換え体は PCR法によってスクリーニングした。 スクリーニングで用い る CH0細胞は 96穴平底プレー卜で培養し、培養上清除去後に細胞溶解用の緩衝液 を 50 1/ゥエル加えて 55で、 2時間加温し、 続いて 95 ：、 15分加熱することで
、 プロティナーゼ Kを失活させて PCRの錶型とした。 細胞溶解用の緩衝液は、 1 ゥエルあたり 10 X LA 緩衝液 I I (夕カラ社 LA TaQに添付） 5 ^ 1、 10¾ NP-40 ( ロッシュ社 cat. 1 332 473) 2. 5 z K プロティナーゼ K (20mg/ml、 夕カラ社 cat. 9033) 4 K 及び蒸留水 （ナカライテスク社 cat. 36421-35) 38. 5 1で 構成されている。
( 2 ) PCRの条件
PCR反応混合物は上記の PCRサンプル 1 1、 10 X LA緩衝液 I I 5 K MgC l2 (25mM) 5 K dNTP (2. 5mM) 5 1、プライマー（各 Ι Ο Μ) 2 K LA Taq (5 IU 1 cat. RR002B) 0. 及び蒸留水 29. (全 50 ^ 1)とした。 KOIベクターを導入した細胞のス クリーニングには、 TP-F4と THygro- Rl、 K02ベクターを導入した細胞のスクリ一 ニングには、 TP-F4と THygro- F 1を PCRプライマーに用いた。
K01ベクターを導入した細胞の PCRは、 95でにて 1分間の前加熱、 95tにて 30 秒間、 6(TCにて 30秒間、 及び 60でにて 2分間の増幅サイクル 40サイクル、 並び に にて 7分の複加熱とした。 K02ベクターを導入した細胞のスクリーニング には 95でにて 1分間の前加熱、 95でにて 30秒間、 及び 70でにて 3分間の増幅サ ィクル 40サイクル、 並びに 70でにて 7分の複加熱とした。
プライマーは以下の通りで、相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、 K01 ベクターでは、 約 1. 6kb、 K02ベクターでは約 2. Okbの DNAが増幅される。 プライ マーは TP- F4がベクターの外側で、 かつ 5'側のフコーストランスポ一夕一のゲノ ム領域に設定し、 THygro- F l、 及び THygro- R1 はベクター内の Hygrの中に設定し た。
フォワードプライマー （Κ01， K02)
TP-F4 5 - GGA ATG CAG CTT CCT CAA GGG ACT CGC -3' (配列番号 8 ) リバースプライマー（K01)
THygro-Rl 5'- TGC ATC AGG KG GAG ACG CTG TCG AAC -3' (配列番号 9 ) リバースプライマー（K02)
THygro- F 1 5'- GCA CTC GTC CGA GGG CAA AGG AAT AGC -3' (配列番号 1 0 )
5 . PCRスクリーニング結果
K01 ベクターを導入した細胞は 918個を解析し、 そのうち相同組み換え体と考 えられる細胞は 1個であった （相同組み換え効率は約 0. l また、 K02ベクター を導入した細胞は 537個を解析し、 そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は 17個であった （相同組み換え効率は約 3. 2%)。
6 . サザンブロット解析
さらに、 サザンプロット法によっても確認を行った。 培養した細胞から定法に 従ってゲノム DNAを 10 S調整し、サザンブロットを行った。配列番号 1に示す塩 基配列の No. 2， 113 - No. 2, 500 の領域から、 以下の二種類のプライマーを用いて PCR法により 387bpのプローブを調整し、 これをサザンプロット法による確認に 用いた。 ゲノム DNAは Bgl I Iで切断した。
フォワードプライマー
Bgl-F： 5'- TGT GCT GGG AAT TGA ACC CAG GAC -3' (配列番号 1 1 )
リバースプライマー
Bgl-R： 5'- CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C -3' (配列番号 1 2 )
Bgl I Iによる切断によって、フコーストランスポーターの染色体からは約 3. Okb 、 K01ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約 4. 6kb、 K02ベクタ一で 相同組み換えを起こした染色体からは約 5. Okbのバンドがそれぞれ出現する。 図 2は第一段階のノックアウト後、 Bgl I I による切断で、 出現するバンドの構造を 示す図であり、 図 3は実際にサザンプロットを行ったときのデータを示したもの である。 K01ベクター、 及び K02ベクターによって相同組み換えを起こした細胞 のそれぞれ 1、 7種類を実験に用いた。 K01ベクターで唯一獲得された細胞は 5C 1 と名付けたが、 その後の解析により複数の細胞集団から構成されることが明らか になったので、 限界希釈によってクローン化し、 その後の実験に用いることにし た。 また、 K02ベクターで獲得された細胞の一つを 6E2と名付けた。
7 . ノックァゥ卜の第二段階
K01 ベクター、 及び K02ベクターによって相同組み換えが成功した細胞に対し
、 3 種類のベクターを用いて、 フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損し た細胞株の樹立を試みた。 ベクターと細胞の組み合わせは、 以下の通りである。 方法 1. K02ベクターと 5Π細胞 （K01)、 方法 2. Κ02ベクターと 6Ε2細胞（Κ02) 、 方法 3. K03ベクターと 6E2細胞（K02)。 ベクターをそれぞれの細胞に導入し、 ベクター導入から 24時間後にハイグロマイシン Β、 ピューロマイシン （^力ライ テスク社、 ca t. 29455- 12) による選抜を開始した。 ハイグロマイシン Bは方法 1 では最終濃度が lmg/mし 方法 1では最終濃度が 7mg/ml になるようにした。 さら に方法 3では、 ハイグロマイシン Bの最終'濃度が 0. 15mg/ml、 ピューロマイシン の最終濃度が 8 g/mlになるように添加した。
8 . PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
サンプルの調整は前述の通り。 方法 1 に関するスクリーニングは、 前述の K01 ベクター、 及び K02ベクターで相同組み換えを起こした細胞を検出する PCRを両 方行った。 方法 2に関しては、 下記の PCRプライマーを設計した。 配列番号 1に 示す塩基配列の No. 3, 924-3, 950の領域に TPS-F 1を、 No. 4, 248-4, 274に SHygro-Rl を設定した。 この PCRプライマーによって、 K02ベクターにより欠損するフコー ストランスポーターの遺伝子領域の 350bpが増幅される。 従って、 方法 2におけ る PCRスクリーニングにおいては、 350bpが増幅されないものを、 フコーストラ ンスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞とみなすことにした。 PCR の条件は、 95でにて 1分間の前加熱、 95 にて 30秒間、 70でにて 1分間の増幅サイクル 35 サイクル、 並びに 70でにて 7分の複加熱とした。
フォヮ一ドプライマ一
TPS-F 1： 5'- CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC -3' (配列番号 1 3 )
リバ一スプライマ一
SHygro-Rl： 5'- TCA GAG GCA GTG GAG CCT CCA GTC AGC -3' (配列番号 1 4 ) 方法 3 に関しては、 フォワードプライマーに TP- F4、 リバースプライマーに
RSGR-Aを用いた。 PCRの条件は、 95でにて 1分間の前加熱、 95でにて 30秒間、 60 でにて 30秒間、 72でにて 2分間の増幅サイクル 35サイクル、 並びに 72^にて 7 分の複加熱とした。 K03 ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のサンプ ルでは、 約 1. 6kbの DNAが増幅される。 この PCRで K03ベクタ一によって相同組 み換えを起こした細胞を検出するとともに、 K02 ベクターでの相同組み換えが残 つていることも確認した
9 . PCRスクリーニング結果
方法 1では 616 個を解析し、 そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は 18 個であった （相同組み換え効率は 2. 9« (図 4 )。 方法 2では 524個を解析し、 そ のうち相同組み換え体と考えられる細胞は 2個であった （相同組み換え効率は約 0. 4%)。 さらに、 方法 3では 382個を解析し、 そのうち相同組み換え体と考えられ る細胞は 7個であった （相同組み換え効率は約 1. 8%) o
1 0 . サザンブロット解析
前述の方法に準じて解析を行った。 その結果、 解析できた細胞のうち、 フコー ストランスポーターの遺伝子が完全に欠損している細胞を 1つ見出した。 第一段 階のノックアウトでは、 PCR とサザンブロットの解析結果が一致したが、 この第 二段階のノックアウトでは、 一致しなかつだ。 この原因としては、 1. 例えば、 方 法 1で K01、 Κ02のそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在している、 2. フコーストランスポーター遺伝子が一対 （2遺伝子） ではなく複数対 （あるい は 3遺伝子以上）存在する、 3. 第一段階のノックアウトが成功した細胞株を培養 していると、 継代中に残ったフコーストランスポー夕一遺伝子がコピー数を増や すことなどの可能性が考えられた。
1 1 . フコースの発現解析
さらに、 PCRで相同組み換え体と判断された 26の細胞におけるフコースの発現 を解析した。 5 g/mL ( Lens cul inaris Agglut inin, FITC Conj ugate (ベクター ラボラトリー社 cat. FL-1041)、 2. 5¾ の FBS、 0. 02 のアジ化ナトリウムを含む
PBS (以下、 FACS溶解液と称する） 100 1で I X 106個の細胞を氷冷中で 1時間染 色した。 その後、 FACS溶解液で細胞を 3回洗浄して FACSCal ibur (べクトンディ ッキンソン社） で測定を行った。 その結果、 サザンプロット解析でフコーストラ ンスポーターの遺伝子が完全に欠損していると判断された細胞のみ、 フコースの 発現が低下していることが明らかになった。 図 5から 7は得られたクローンのサ ザンブロット解析（図 5 )と、 フコースの発現を示した図である。図 6は、 wi ld/KO の結果を示し、 図 7は、 K0/K0の結果を示す。 以上の結果より以下のことが判明した。
フコーストランスポー夕一の遺伝子が完全に欠失している細胞は 1株しかなく 、 スクリーニングした数が 616個であったことを考えると、 相同組み換えの頻度 は約 0. 163!と低い結果になった。第二段階のノックァゥ卜で、 PCRとサザンブロッ 卜の解析結果が一致しなかった理由は、 前述のようにいくつか考えられるが、 方 法 3においては、 2種類の薬剤で選抜しているため、 得られた細胞株が K02べク ター、 K03 ベクターのそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在してい るとは考えられない。 また、 その他の PCRで相同組み換えを起こしたと判断され た細胞株もすベて、 複数の細胞集団から構成されているとは考えにくい。 前述の ようにフコーストランスポーター遺伝子が 3以上存在した場合には、 細胞におけ る夕一ゲッティングは格段に難しくなり、 K01ベクターのような Hy が発現しに くいもの使用し、 なおかつ数多くのスクリーニングを行わないと相同組み換え体 が得られないものと考えられた。 実施例 2 抗体発現ベクターの調製
ヒト化抗 HM1. 24 抗体発現ベクター、 AHM (I) /N5KG1 (W02005/014651)は Ssp I にて、 また、 ヒト化抗 GPC3抗体の H鎖がバージョン Kであって、 L鎖の Asn33を Arg に置換した改変抗体遺伝子 （後記の参考実施例 1〜参考実施例 3 ) を発現す るベクターである pCXND3/hGC33/K/Argは Pvu Iにて切断し実験に用いた。 実施例 3 抗体産生細胞の樹立
SFMI I (+)培地にハイグロマイシン Bの最終濃度が l mg/ffllになるように調製し
、 実施例 1で得られたフコーストランスポーター欠損株 （FT-K0 細胞、 クローン 名 3F2) を継代した。 8 X 106個の 3F2を 0. 8 mLのダルベッコリン酸緩衝液に懸 濁した。 細胞懸濁液に 25 gの各抗体発現ベクターを加え、 Gene Pul ser Cuve t te に細胞懸濁液を移した。 氷上で 10分間放置した後に、 GENE- PULSER I Iで 1. 5 kV, 25 zFDの条件で、 エレクトロポレーシヨン法によりベクターを細胞に導入した。 ベクターを導入後、 細胞を SFMII (+)培地 40 mLに懸濁して 96穴平底プレしト （ ィヮキ社）に IOO /ゥエルで細胞を播きこんだ。 プレートを C02インキユ^ー夕 内で、 24時間、 37でで培養した後、 Geneticin (インビトロジェン社、 cat. 10131-027 ) を終濃度 0.5 mg/mLになるように添加した。 薬剤に耐性になった細胞の抗体産、 生量を測定し、 ヒト化抗 HM1.24抗体産生細胞株、 ヒト化抗 GPC3抗体産生細胞株 をそれぞれ樹立した。 実施例 4 抗体の精製
抗体発現株より培養上清を回収し、 P-1 ポンプ （Pharmacia) を用いて Hitrap rProtein A (Pharmacia CAT# 17-5080- 01)にチャージした。 結合バッファ (20mM Sodium phosphate (pH7.0) ) にて洗浄後、 溶出バッファ (0. lMGlycin-HCl (pH2.7) ) で溶出した。 溶出液は直ちに中和バッファ （1M Tris-HCl (pH9.0)) で中和した 。 DC protein assay (BIO- RAD CAT# 500-0111)により抗体の溶出画分を選択しプ ールした後、 Centriprep- YM10 (Millipore CAT# 4304)にて 2 mL程度まで濃縮し た。 次に、 20 mM酢酸バッファ， 150mMNaCl, (pH6.0)にて平衡化した Superdex200 26/60 (Pharmacia)を用いてゲルろ過により分離した。モノマー画分のピークを回 収し、 Centriprep- YM10にて濃縮後、 MILLEX- GW 0.22 m Filter Unit (Millipore CAT# SLGV 013SL)を用いて Filtrationした後、 4t:で保管した。 精製された抗体 の濃度は、 280nmの吸光度を測定し、 モル吸光計数から換算し:た。 実施例 5 FT- K0細胞産生ヒト化抗 HM1.24抗体の in vitro ADCC活性
1. ヒ卜 PBMC溶液の調製
健常人よりへパリ ン加採血した末梢血を、 PBS (-)で 1 倍に希釈し、 Ficoll-PaQueTM PLUS (Amersham社）に重層した。 これを遠心 （500xg、 30分間、 20 :) した後、 単核球画分である中間層を分取した。 3 回洗浄後、 10% FBS/RPMI に懸濁し、 ヒト PBMC溶液とした。
2. 標的細胞の調製
l(nFBS/RPMI 1640培地で培養した ARH- 77細胞 （ATCC) を、 ピペッティングでデ イツシュから剥離し、 チューブ内で遠心後 lOO^L の培地に懸濁させた。 そこに 5.55MBQ'の Cr- 51を加え、 ^炭酸ガスインキュベータ中 37 ：、 1時間培養し、 こ の細胞を培地で 2回洗浄し、 10%FBS/RPMI 1640培地を加え、 96ゥエル U字底プレ ート （Falcon) の各ゥエルに lx 104細胞/ゥエルで分注し、 標的細胞とした。
3. クロム遊離試験 （ADCC活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液 50 Lを添加し、室温で 15分反応させた 後に、 ヒト PBMC溶液 (5 X105 細胞/ゥエル） を加え、 5 炭酸ガスインキ ュべ一夕中 37で、 4時間培養し、 培養後、 プレートを遠心分離し、 培養上清 100 til 中の放射活性をガンマカウンターで測定した。 下式により特異的クロム遊離 率を求めた。
特異的クロム遊離率 (¾) = (A-C) X 100/ (B-C)
Aは各ゥエルにおける放射活性 （cpm) の平均値、 Bは標的細胞に ^ NP- 40水溶液 (Nonidet P-40、 Code No.252-23, ナカライテスク株式会社） を 100 し 10¾FBS/RPMI培地を 50/ L添加したゥェルにおける放射活性 （cpm) の平均値、 C は標的細胞に 10%FBS/RPMI培地を 150 L添加したゥエルにおける放射活性 （cpm ) の平均値を示す。 試験は三重に行い、 ADCC 活性 （« について平均値および標 準偏差を算出した。
抗 HM1.24抗体のヒト PBMCを用いた ADCC活性を図 8に示す。白抜きは Wild Type の CH0細胞産生ヒト化抗 HM1.24抗体の活性を、黒塗りは FT- K0細胞産生ヒト化抗 HM1.24抗体の活性をそれぞれ示す。 FT- K0細胞産生ヒト化抗 HM1.24抗体は、 Wild Typeの CH0細胞産生ヒト化抗 HM1.24抗体に比較して強い ADCC活性を示したこと より、 FT-K0細胞で産生させた抗体の ADCC活性が増強されることが明らかとなつ た。 実施例 6 FT- K0細胞産生ヒト化抗 GPC3抗体の in vitro ADCC活性
1. ヒト PBMC溶液の調製
健常人よりへパリン加採血した末梢血を、 PBS (-)で 1 倍に希釈し、
Ficoll-PaQueTM PLUS (Amersham社） に重層した。 これを遠心 （500xg、 30分間 、 20 ) した後、 単核球画分である中間層を分取した。 3回洗浄後、 10%FBS/RPMI に懸濁し、' ヒト PBMC溶液とした。
2 . 標的細胞の調製
10%FBS/D-MEM培地で培養した HuH-7細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バン ク） を、 Cell Dissociation Buffer (Invi trogen 社）を用いてディッシュから剥 離し、 96ゥエル U字底プレート （Falcon) の各ゥエルに 1 X 104細胞/ゥエルで分 注し、 1日間培養した。 培養後、 5.55MBQの Cr- 51を加え、 5 炭酸ガスインキュ ベー夕中 37 、1時間培養し、この細胞を培地で 1回洗浄し、 50 Lの 10%FBS/D- MEM 培地を加え標的細胞とした。
3. クロム遊離試験 （ADCC活性）
ヒト PBMC溶液の調製、クロム遊離試験は実施例 1に記載の方法に従って行った 。ヒト化抗 GPC3抗体のヒト PBMCを用いた ADCC活性を図 9に示す。白抜きは Wild Typeの CH0細胞産生ヒト化抗 GPC3抗体の活性を、 黒塗りは FT-K0細胞産生ヒト 化抗 GPC3抗体の活性をそれぞれ示す。 FT-K0細胞産生ヒト化抗 GPC3抗体は、 Wild Typeの CH0細胞産生ヒト化抗 GPC3抗体に比較して強い ADCC活性を示したことよ り、 FT- K0細胞で産生させた抗体の ADCC活性が増強されることが明らかとなった
実施例 7 FT- K0細胞産生ヒト化抗 HM1.24抗体糖鎖の解析
1. 2-ァミノべンズアミ ド標識糖鎖（2 - AB化糖鎖）の調製
本発明の FT- K0 細胞産生抗体、 及び対照試料として CH0 細胞産生抗体に、
N-Glycosidase F (Roche diagnost ics)を作用させ、 糖鎖をタンパク質から遊離さ せた (Weitzhandler M. et al.， Journal of Pharmaceutical Sciences 83 :12 (1994) ,
1670-1675) o エタノールを用いた除タンパク質後（SchenkB. et al., The Journal of Clinical Investigation 108: 11 (2001) , 1687 - 1695)、 濃縮乾固し、 2 -ァミノ ピリジンによる蛍光標識を行った（Bigge J. C. et al. , Analytical Biochemistry
230:2 (1995), 229-238)。 得られた 2-AB化糖鎖を、 セルロースカートリッジを用 いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、 精製 2- AB化糖鎖とした。
2. 精製 2-AB化糖鎖の順相 HPLCによる分析 前項の方法で、 本発明の FT- K0細胞産生抗体、 及び対照試料として CH0細胞産 生抗体に'ついて 2-ΑΒ化糖鎖の調製を行った後、 アミドカラム （東ソー製 ^TSKgel Amide- 80) による順相 HPLC分析を行い、 クロマトグラムを比較した。 CH0細胞産 生抗体では G(0)- Fuc はわずかにしか含まれておらず、 ァガラク トシル糖鎖 （ G(0) +G(0) -Fuc) に占める G(0)- Fucの割合 1.5%程度であった。 一方、 FT- Κ0細 胞産生抗体では G(0)- Fucが 90%以上含まれていた （図 1 0および表 1)。 表 1
ァガラクトシル 2- AB化糖鎖の順相 HPLC分析から推定された各糖鎖の相対比
糖鎖名 . CHO FT-KO
G(0)-Fuc 1.5¾ 92.4¾
G(0) 98.5% 7.6% 実施例 8 FT-KO細胞産生ヒト化抗 GPC3抗体糖鎖の解析
1. 2-ァミノべンズアミ ド標識糖鎖 （2- AB化糖鎖） の調製
本発明の FT- K0 細胞産生抗体、 及び対照試料として CH0 細胞産生抗体に、 N-Glycosidase F (Roche diagnost ics)を作用させ、 糖鎖をタンパク質から遊離さ i± (Weitzhandler M. et al. , Journal of Pharmaceutical Sciences 83: 12 (1994) , 1670-1675)。 エタノールを用いた除タンパク質後 (Schenk B. et aに The Journal of Clinical Investigation 108:11 (2001), 1687-1695)、 濃縮乾固し、 2-ァミノ ピリジンによる蛍光標識を行った (Bigge J. C. et al. , Analytical Biochemistry 230:2(1995), 229-238)。 得られた 2 - AB化糖鎖を、 セルロースカートリッジを用 いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、 精製 2- AB化糖鎖とした。 次に、 β -Galactosidase (生化学工業） を精製 2- AB 化糖鎖に作用させ、 ァガラクトシル 2-AB化糖鎖とした。
2. ァガラクトシル 2-AB化糖鎖の順相 HPLCによる分析
前項の方法で、 本発明の FT- K0細胞産生抗体、 及び対照試料として CH0細胞産 生抗体についてァガラクトシル 2-AB化糖鎖の調製を行った後、 アミドカラム（東 ソー製 TSKge l Amide- 80)による順相 HPLC分析を行い、 クロマトグラムを比較し た。 CH0細胞産生抗体では G (0)が主成分として存在しており、 フコースの付加さ れていない G (0) -Fucはピーク面積比として 4%程度であった。一方， FT- K0,細胞産 生抗体では G (0) -Fucが主成分であり、いずれの産生株においてもピーク面積比と して 90¾以上存在していた（図 1 1および表' 2 )。 図 1 2には、 ピーク G (0)および G (0) -Fucの推定構造を示す。 表 2
ァガラクトシル 2-AB化糖鎖の順相 HPLC分析から推定された各糖鎖の相対比
糖鎖名 CHO FT-KO-a FT-KO-b FT-KO- c
G (0) -Fuc 4. 0¾ 92. 4% 92. 5% 93. 2%
G (0) 96. 0¾ 7. 6% 7. 5% 6. 8% 実施例 9 FT-KO細胞産生ヒト化抗 GPC3抗体の熱安定性分析
1 . DSC測定用試料溶液の調製
200匪 ol/Lの塩化ナトリゥムを含む 20 mol/Lの酢酸ナトリゥム緩衝溶液（pH6. 0 )を透析外液とし、 これに 700 g相当量の抗体溶液を封入した透析膜を浸して一 昼夜透析し， 試料溶液とした。
2 . DSCによる熱変性温度測定
試料溶液およびリファレンス溶液（透析外液）を十分に脱気した後、 これらをそ れぞれ熱量計セルに封入し 20* での熱平衡化を十分に行った。次に DSC走査を 20 で〜 100でで約 1K/分走査速度で行った。 結果は、 温度の関数としての変性ピーク の頂点として表される （図 1 3 )。 本測定より、 CH0細胞産生抗体および FT-K0細 胞産生抗体における熱変性温度は同等であった。 参考実施例 1 抗 GPC 3抗体の作製
1 . ヒトグリピカン 3 (GPC3)の cDNAクローニング
ヒ卜 GPC3をコードする全長 cDNAは、 大腸癌細胞株 Caco2より常法により調製 した 1st strand cDNAを铸型とし、 Advantage2 kit (CLONTECH社） を用いた PCR 反応により増幅した。 すなわち、 2 1 の Caco2由来 cDNA、 1 1 のセンス jプライ マー （GATATC- ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT：配列番号 1 5)、 1^1 のアンチセン スプライマー （GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC ： 配列番号 1 6 )、 5 1 の Advantage2 lOxPCR buffer, 8 1 の dNTP mix (1.25 mM)、 1. O 1 の Advantage polymerase Mixを含む 50 1の反応液を、 94 で 1分、 63 X：で 30秒、 68 X：で 3 分からなるサイクルを 35 回行った。 PCR 反応による増幅産物は pGEM- T Easy Vector System I (Promega社） を用いて TAベクター pGEM- T easyに挿入した。 ABI3100DNAシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、 ヒト GPC3の全長をコ ードする cDNAを単離した。 配列番号 1 7で表される配列はヒト GPC3遺伝子の塩 基配列を、配列番号 1 8で表される配列はヒト GPC3タンパク質のアミノ酸配列を 示す。
2. 可溶型 GPC3の作製
抗 GPC3 抗体作製のための免疫タンパク質として、 C末端側の疎水性領域 （ 564-580アミノ酸） を欠損させた可溶型 GPC3タンパク質を作製した。
完全長ヒト GPC3 cDNAを铸型としてアンチセンスプライマ一 （ATA GAA TTC CAC
CAT GGC CGG GAC CGT GCG C：配列番号 1 9) と EcoRI認識配列、 Kozak配列を加 えたセンスプライマー （ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C：配列番号
2 0) を用いて PCRを行った。 得られた PCR断片（1711bp)を PCXND2- Flagにクロ 一二ングした。 PCXND2- Flagは、 pCXN2(Niwaら、 Gene 1991; 108; 193- 199)の Hindlll 部位に pCHOI (Hirataら、 FEBS letter 1994； 356； 244-248) の DHFR遺伝子発 現部位を挿入し、 また、 マルチクローニングサイ 卜の下流に Flagタグ配列を付加 し、 Flagタグ付加タンパクとして発現されるよう設計した。 作製された発現ブラ スミ ド DNAを CH0細胞 DXB11株へ導入し、 500 g/mL Genet icinでの選抜により
、 可溶型 GPC3高発現 CH0株を得た。 1700 cm2ローラーボトルを用い可溶型 GPC3 高発現 CH0株の大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清を DEAE sep arose Fast Flow (Amersham社）にチャージし、 洗浄後、 500mM NaClを含むバ ッファにより溶出した。 次に、 Anti- Flag M2 agarose affinity gel (SIGMA社） を用いてァフィ二ティー精製を行った。溶出は 200 g/mLの FLAGぺプチドにより 行っ た。 Centriprep-10(Millipore 社） によ る濃縮後、 Superdex 200 HR 10/30 (Amersham社）によるゲルろ過を行い FLAGぺプチドを除去した。最後 DEAE sepharose Fast Flowカラムを用いて濃縮し、同時に Tween20を含まない PBS,(500mM の NaClを含む） で溶出を行うことによりバッファ置換を行った。
3. 可溶型 GPC3コアタンパク質の作製
GPC3はへパラン硫酸による修飾を受け巨大分子となる。 抗 GPC3抗体のスクリ 一二ングにおいてへパラン硫酸に対する抗体を排除する為、 へパラン硫酸付加部 位に点変異を導入した可溶型 GPC3コアタンパク質を作製し、スクリーニングに用 いた。
上記可溶型 GPC3 (1-563) を錶型とし、 アッセンブリー PCR法によって 495番目 と 509番目の Serを Alaに置換させた cDNAを作製した。 この際、 C末端に His夕 グが付加されるようにプライマーを設計し、 得られた cDNAを PCXND3ベクターに クローニングした。 PCXND3は、 PCXN2の Hindlll部位に pCHOIの DHFR遺伝子発現 部位を挿入して作製した。 作製された発現プラスミ ド DNAを DXB11株へ導入し、 500 g/mL Genetic in での選抜により、 可溶型 GPC3 コアタンパク質高発現 CH0 株を得た。
1700 cm2ローラーボトルを用い大量培養を行い、 培養上清を回収し精製を行つ た。培養上清を Q sepharose Fast Flow (Amersham社）にチヤ一ジし、洗浄後、 500mM NaClを含むリン酸バッファにより溶出した。次に、 Chelating sephafose Fast Flow (Amersham社） を用いてァフィ二ティー精製を行った。 10〜150mMのイミダゾール でグラジェント溶出を行った。 最後に Q sepharose Fast Flowを用いて濃縮し、 500mM NaClを含むリン酸バッファにより溶出した。
還元条件下にて SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、 70kDa、 40kDa、 30kDaの 3つのバンドが得られた。 ABI492 protein sequencer (Appl ied Biosystems 社） を用いてアミノ酸シークェンスを行った結果、 30kDaのバンドは GPC3の 359 番目以降、 もしくは 375 番目以降のアミノ酸配列と一致し、 GPC3 は Arg358 と Ser359の間、 若しくは Lys374と Val375の間で切断を受け、 40kDaの N末端断片 と 30kDaの C末端側断片に分割していることが判明した。
4. 全長ヒト GPC3発現 CH0細胞の作製 フローサイ トメトリを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、 全長 GPC3 を発現す'る CH0細胞の樹立を行った。
10 gの全長ヒト GPC3遺伝子発現べクタ一と 60^ の SuperFect (QIAGEN社 ) を混合し、 複合体を形成させた後に、 CH0細胞 DXB11株に添加することにより 、 遺伝子導入を行った。 C02インキュベータで 24 時間培養後、 終濃度 0.5mg/mL の Geneticinおよび 10% FBSを含む aMEM (GIBCO BRL社） を用いて、 選抜を開 始した。 得られた Geneticin耐性コロニーを集め、 限界希釈法により細胞のクロ 一二ングを行った。それぞれの細胞クローンを可溶化し、抗 GPC3抗体を用いたゥ エスタンブロットにより全長ヒト GPC3の発現を確認し、安定発現細胞株を取得し た。
5. ELISAによる結合活性の評価
可溶型 GPC3 コアタンパク質を l g/mL となるようにコーティングバッファ (0. lmol/L NaHC03 (pH9.6) , 0.02% (w/v) NaN3)で希釈したものをィムノプレート に加え、 4 にてー晚放置しコーティ ングした。 希釈バッファ （50 mmol/L Tris-HCl (pH8.1) , 1 mmol/L gCl2, 150 mmol/L NaCl, 0.05¾ (v/v) Tween 20, 0.02% (w/v) NaN3, l¾(w/v) BSA)にてブロッキング処理を行った後、 抗 GPC3抗体 を加え、 室温で 1時間放置した。 リンスバッファ（0.05¾ (v/v) Tween 20, PBS)に て洗浄後、 アルカリホスファタ一ゼ標識した抗マウス IgG抗体（ZYMED社） を加え 、 室温で 1時間放置した。 リンスバッファにて洗浄後、 SIGMA104 (SIGMA社） を 1 mg/mL となるように基質バッファ (50匪 ol/L NaHC03 (PH9.8) , 10 mmol/L MgC に 希釈したものを添加し、 室温で 1時間発色させた後、 Benchmark Plus (BI0-RAD) を用いて吸光度 （405nm， 参照波長 655ηπι) を測定した。
6. 可溶型 GPC3の免疫およびハイプリ ドーマの選抜
ヒト GPC3 とマウス GPC3のホモロジ一はアミノ酸レベルで 94%の高い相同性を 示すため、通常のマウスに免疫しても抗 GPC3抗体を得難い可能性を考え、 自己免 疫疾患マウスである MRL/MpJUmmCrj-lpr/lprマウス （以下、 MRL/lprマウス、 日 本チャールズ · リバ一より購入） を免疫動物として用いた。 7 週齢、 もしくは 8 週齢より免疫を開始し、初回免疫には可溶型 GPC3を 100^g/headとなるように調 製し、 フロイント完全アジュバント （FCA、べクトンディッキンソン社） を用いて ェマルジヨン化したものを皮下に投与した。 2週間後に 50 g/headとなるように 調製した'ものをフロイント不完全アジュバン卜 （FIA、べクトンディッキンノン社 ) でェマルジヨン化したものを皮下に投与した。 以降 1週間間隔で追加免疫を合 計 5回行った。 その内 2匹に対し、 最終免疫として 50 xg/headとなるように PBS に希釈し尾静脈内に投与した。 最終免疫の 4日後、 脾臓細胞を摘出し、 マウスミ エローマ細胞 P3_X63Ag8Ul (P3UK AKCより購入） と 2: 1になるように混合し、 PEG1500 (ロシュ ·ダイァグノスティック社） を徐々に加える事により細胞融合を 行った。 慎重に RPMI 1640培地 （GIBC0BRL社） を加え PEG1500を希釈し、 遠心操 作により PEG1500を除去した後、 10%FBS入り RPMI 1640にて懸濁したものを 100 /ゥエルとなるように 96穴培養プレートに播種した。 翌日、 100 zL/ゥエルと なるように 10%FBS、 1 X HAT media supplement (SIGMA社）、 0.5 x BM-Condimed HI Hybridoma cloning supplement (ロシュ ·ダイァグノスティック社） を含む RPMI 1640 (以降、 HAT培地） を添加した。 2、 3、 5日後に培養液の半分を HAT培地 に置き換え、 7 日後の培養上清を用いてスクリーニングを行った。 スクリーニン グは可溶型 GPC3コアタンパク質を固相化したィムノプレートを用いた ELISAによ り行った。 陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。 その 結果、 GPC3に対して強い結合活性を有する抗体を 1 1クローン （M3C11、 M13B3、 M1E7、 M3B8、 M11FK L9G1K M19B1K M6BK M麵、 M5B9、 M10D2) 取得した。 7. 抗 GPC3抗体可変領域のクローニング
抗 GPC3抗体産生ハイプリドーマより抽出した Total RNAを用いて、 RT- PCR法 によって増幅した。 Total RNAは、 RN sy Plant Mini Kits (QIAGEN社） を用い て 1 X107細胞のハイブリドーマより抽出した。 1 β gの Total RNA を使用して 、 SMART RACE cDNA Amplification Kit (CL0NTECH社）、 以下の合成オリゴヌクレ ォチド：
マウス IgGl定常領域配列に相補的な合成ォリゴヌクレオチド MHC- IgGl
GGG CCA GTG GAT AGACAG ATG (配列番号 2 1 )
マウス IgG2a定常領域配列に相補的な合成ォリゴヌクレオチド MHC-IgG2a
CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG (配列番号 2 2 )
マウス IgG2b定常領域配列に相補的な合成ォリゴヌクレオチド MHC-IgG2b CAG GGG CCA GTG GAT AGA CTG ATG (配列番号 2 3 )
またはマウス κ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチド kiippa GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG (配列番号 24)
を用い、 5 ' 末端側遺伝子断片を増幅した。
逆転写反応は 42 で 1時間 30 分間反応した。 PCR 溶液 50 L は、 5 I L の lOxAdvantage 2 PCR Buffer, 5 の lOxUniversal Primer A Mix, 0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、 1 の Advantage 2 Polymerase Mix (以上、 CLONTECH 社製）、 2.5 Lの逆転写反応産物、 10 pmoleの合成オリゴヌクレオチド MHC- IgGl 、 MHC- IgG2a、 MHC- IgG2bまたは kappaを含有し、 94 の初期温度にて 30秒間そ して 94でにて 5秒間、 72でにて 3分間のサイクルを 5回反復し、 94 にて 5秒間 、 70 にて 10秒間、 72でにて 3分間のサイクルを 5回反復し、 さらに 94でにて 5秒間、 68でにて 10秒間、 72でにて 3分間のサイクルを 25回反復した。 最後に 反応産物を 72でで 7分間加熱した。 各 PCR産物は QIAduick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 ァガロースゲルから精製した後、 pGEM-T Easyベクタ 一 （Promega社製） へクローニングし、 塩基配列を決定した。
M3C1K M13B3, M1E7、 M3B8、 M11FK M19B1K M6BK M18D4、 M5B9、 M10D2、 L9G11 の H鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号 2 5、 26、 2 7、 2 8、 2 9、 30、 3 1、 3 2、 33、 34、 35に、 アミノ酸配列をそれぞれ配列番号 3 6 、 3 7、 38、 39、 40、 4 1、 42、 43、 44、 45、 46に、 鎖可変 領域の塩基配列を配列番号 47、 48、 49、 50、 5 1、 52、 53、 54、 55、 56、 57に、 アミノ酸配列をそれぞれ配列番号 5 8、 5 9、 60、 6 1 、 6 2、 63、 64、 6 5、 66、 6 7、 68に示す。
8. 抗 GPC3抗体マウス—ヒトキメラ抗体の作製
抗 GPC3抗体の H鎖および L鎖可変領域配列をヒト IgGlおよび κ鎖定常領域配 列に連結した。 各抗体の Η鎖可変領域の 5 ' 末端側塩基配列に相補的でコザック 配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよび Nhel部位を有する 3 '末端側塩基配 列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて PCRを行い、 得られた PCR産物を ヒト IgGl定常領域が pBluescript KS +ベクター （東洋紡社） に挿入されている pB-CHベクターにクローニングした。 Nhel部位により、 マウス H鎖可変領域とヒ ト H鎖 （ァ 1鎖） 定常領域が連結している。 作製された H鎖遺伝子断片を発現べ クタ一 PCXND3にクローニングした。 また、 各抗体の L鎖可変領域の 5， 末端側塩 基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよび BsiWI部 位を有する 3 ' 末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて PCR を行い、 得られた PCR産物をヒト kappa鎖定常領域が pBluescript KS +ベクター
(東洋紡社） に挿入されている pB-CLベクターにクローニングした。 BsiWI部位 により、 ヒト L鎖可変領域と定常領域が連結している。 作製された L鎖遺伝子断 片を発現ベクター PUCAGクローニングした。 本ベクター pUCAGは、 pCXN (Niwa ら 、 Gene 1991;108:193-200) を制限酵素 BamHIで消化して得られる 2.6kbpの断片 を PUC19ベクター （東洋紡社） の制限酵素 BamHI部位に連結し、 クローニングし たベクターである。
抗 GPC3マウス一ヒトキメラ抗体発現ベクターを作製するために、 L鎖遺伝子断 片が挿入された pUCAGベクタ一を制限酵素 Hindlll (宝酒造社） で消化して得ら れる遺伝子断片を H鎖遺伝子が挿入された pCXND3の制限酵素 Hindi II切断部位に 連結し、 クローニングした。 本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝 子、 DHFR遺伝子、 抗 GPC3マウスーヒトキメラ抗体遺伝子を発現する。
CH0細胞 （DG44株） を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。
Gene Pulserll (Bio Rad社製） を用いたエレクト口ポレーシヨン法により遺伝子 導入した。 25 gの各抗 GPC3マウス一ヒトキメラ抗体発現ベクターと PBSに懸濁 した CH0細胞 （ lxlO7細胞 Zm 1 ) の 0.75mlを混合したものを氷上で 10分間冷 却し、 キュベットに移した後に 1.5kV、 25 FDの容量にてパルスを与えた。 室温 にて 10 分間の回復期間の後、 エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 HT supplement (Invitrogen 社） を 1倍濃度で含む CH0- S- SFMII 培地 （Invitrogen 社） 40mLに懸濁した。 同様の培地で 50倍希釈溶液を作製し、 96ゥエル培養用プ レートに lOO i 1 ゥエルで分注した。 C02インキュベータ （5 %C02) で 24時間 培養後、 Genetic in (Invitrogen社） を 0.5mg/mLになるように添加して 2週間培 養した。 Geneticin 耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたゥエルの培 養上清中の IgG量について以下に示す濃度定量法で測定した。 高産生細胞株を順 次拡大培養し、 抗 GPC3マウスーヒトキメラ抗体安定発現細胞株を取得し、 大量培 養を行い、 培養上清を得た。.各抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体.の精製は、 Hi Trap ProteinG HP (Amersham社） を用いて行った。
9. GC-3の免疫およびハイプリ ドーマの選抜
得られた抗 GPC3抗体のうち、 M11F1、 M3B8のみが強い CDC活性を示したことか ら、 CDC活性にはェピトープ依存性があることが判明した。 ADCC活性、 CDC活性 を併せもつ抗体の取得を目的とし、 M11F1、 M3B8のェピトープを含む GST融合夕 ンパク質である GC-3 の免疫を行った。 GC- 3 は上記方法により大量に精製し、 Superdex75 (Amersham社） を用いてゲルろ過を行い、 バッファを PBSに置換した もめを免疫蛋白として使用した。 Balb/c (日本チャールズリバ一より購入） 3 匹 、 MRL/lpr3匹に対し、 上記方法に従い GC-3の免疫を行った。 初回免疫には GC-3 を 100 g/head となるように調製し、 FCAを用いてェマルジヨン化したものを皮 下に投与した。 2週間後に 50 g/headとなるように調製したものを FIAでェマル ジョン化したものを皮下に投与した。 5 回免疫の後、 全マウスに対し最終免疫 （ 50 g/head) を尾静脈内に行い細胞融合を行った。 スクリーニングは可溶型 GPC3 コアタンパク質を固相化したィムノプレートを用いた ELISAにより行った。 陽性 クローンについては限界希釈法によりモノクロ一ン化した。 その結果、 GPC3に対 して強い結合活性を有する抗体を 5クローン （GC199、 GC202, GC33、 GC179、 GC194 ) 取得した。
GC199、 GC202、 GC33、 GC179、 GC194について上記方法に従い H鎖、 L鎖の可変 領域をクローニングし、 配列を決定した。 GC194の L鎖については 2種類の配列 がクローニングされた。 GC199、 GC202、 GC33、 GC179, GC194の H鎖可変領域の塩 基配列をそれぞれ配列番号 69、 70、 7 1、 72、 73に、 アミノ酸配列をそ れぞれ配列番号 74、 75、 76、 77、 78に示す。 GC199、 GC202, GC33、 GC179 、 GC194(1)、 GC194(2)の L鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号 79、 80 、 81、 82、 83、 84に、 アミノ酸配列をそれぞれ配列番号 85、 86、 8 7、 88、 89、 90に示す。 参考実施例 2 GC33のヒト化
公開されている Kabat Database (f tp://ftp. ebi. ac. uk/pub/databases/ kabat/)、 および ImMunoGeneTics Database (IMGT)より抗体の配列データを入手 し、 H鎖可変領域、 L鎖可変領域に分けてホモロジ一検索を行った。 その結果、 H 鎖可変領域は DN13 (Smithsonら、 Mo 1 Immunol. 1999； 36： 113- 124)と高い相同性 を持つことが分かった。 また、 L鎖可変領域は Accession number AB064105の homo sapiens IGK mRNA for immunoglobulin kappa light chain VLJ region, partial cds, clone:K64と高い相同性を持つことが分かった。 また、 L鎖のシグナル配列 については AB064105と相同性の高い Accession Number S40357のシグナル配列を 利用した。 これらの抗体のフレームワーク領域（以下、 FR)に相補性抗原決定領域 (以下、 CDR) を移植したヒト化抗体を作製した。 具体的には、 50 base程度の合成オリゴ DNAを約 20 base程度ハイブリダィズ するように設計し、 これらの合成オリゴ DNAを PCR法によりアッセンプリさせて 各可変領域をコードする遺伝子を作製した。 5 ' 端の合成オリゴ DNAの末端に挿 入した Hindlll配列、 および 3 ' 端の合成オリゴ DNAの末端に挿入した BamHI配 列で切断し、 ヒト IgGl定常領域がクローニングされた発現ベクター HEFgr 1、 ヒ ト κ鎖定常領域がクローニングされた発現ベクター HEFg/ へクローニングした （
Satoら、 Mol Immunol. 1994； 37卜 381)。 このようにして作製したヒト化 GC33は
H鎖、 L鎖それぞれ ver. aと命名した。 H鎖、 L鎖ともに ver. aのヒト化 GC33(ver. a
/ver. a) はマウス GC33可変領域の抗体 （mouse / mouse) と比較して結合活性が 低かった。 H鎖と L鎖についてマウス GC33配列と ver. a配列をキメラに組み合わ せた抗体 （mouse I ver. a, ver. a I mouse) を作製し結合活性を評価した結果、 ver. a I mouse で結合活性の低下が認められ、 アミノ酸置換による結合活性の低 下は H鎖に起因する事が判明した。 そこで、 H鎖の改変体 ver. (：、 ver. f、 ver. h
、 ver. i、 ver. j、 ver. kを作製した。 全てのヒト化 GC33はマウス GC33可変領域 を有するキメラ抗体と同等の結合活性を示した。 ヒト化 GC33H鎖可変領域 ver. a
、 ver. c、 ver. f, ver. h、 ver. i、 ver. j、 ver. kの塩基配列を配列番号 9 1、 92
、 93、 94、 95、 96、 97に、 アミノ酸配列を配列番号 98、 99、 1 0
0、 10 1、 1 02、 1 03、 1 04に示す。 ヒト化 GC33L鎖可変領域 ver. aの 塩基配列を配列番号 1 05に、 アミノ酸配列を配列番号 1 06に示す。 ヒト化 GC33H鎖可変領域 ver. i、 ver. j、 ver. kでは、 6番目のグルタミン酸が グルタミンに置換されているが、 これらの抗体は熱安定性が顕著に増加し いた
参考実施例 3 ヒト化 GC33L鎖の改変
タンパク質の脱アミド化については一次配列依存的な脱アミド化の反応速度定 数が知られており、 Asn-Gly が特に脱アミド化し易い配列として知られている （ Rocinsonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001； 98； 944-949. )。 配列番号 1 0 5に示されるヒト化 GC33L鎖 ver. a可変領域の CDR1内にある Asn33については、 一次配列が Asn-Glyであることから、 脱アミド化が容易に起きやすい配列である 事が予想された。
Asn33の脱アミド化による結合活性に対する影響を評価する為に、 Asn33を Asp に置換した改変抗体を作製した。点変異の導入には、 Quick Change Site-Directed
Mutagenesis Kit (Stratagene社） を使用した。 すなわち、 125 ngのセンスプラ イマ一 （CTT GTA CAC AGT GAC GGA AAC ACC TAT：配列番号 1 07)、 125 ngのァ ンチセンスプライマー （ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG：配列番号 1 08
)、 5 iLの 10x reaction buffer, 1 の dNTP mix, 10 ngのヒト化 GC33L鎖 ver. a がクローニングされた HEFgK、 \ ]xlの Piu Turbo DNA Polymeraseを含む 50 L の反応液を、 95でで 30秒、 55でで 1分、 68 で 9分からなるサイクルを 12回行 つた。 その後制限酵素 Dpnlを加え 37 で 2時間消化したものを添付の XU-Blue コンビテン卜細胞に導入し形質転換体を得た。 正しく変異の導入されたクローン について、 可変領域を切り出し、 再度 HEFgKへクローニングし直した。 ヒト化
GC33H鎖 ver. kがクロ一ニングされた HEFgr 1と共に Fugene6 (Roche社） を用い て COS 7細胞へ導入し一過性に発現させた培養上清を回収した。 抗ヒト IgG抗体 を用いたサンドィツチ ELISAにより抗体濃度を定量し、可溶型 GPC3コアタンパク 質を固相化した ELISAにより改変抗体の結合活性を評価した。 Asn33を Aspに置 換した改変抗体 （N33D) では結合活性が消失しており、 Asn33 で脱アミド化が起 きた場合結合活性に与える影響は大きいと考えられた。 Asn33 'の脱アミ ド化を抑制する方法として、 Gly34を他のアミノ酸に改変する方 法が報告されている （W003057881A1 )。 上記方法に従い、 Qu ick Change Si te-Di rected Mutagenes i s Ki t を用い Cys、 Me t を除く他の 17アミノ酸に置換 した改変抗体 G34A、 G34D、 G34E、 G34F、 G34H、 G34N、 G34P、 G34Q、 G34L G34K、 G34L、 G34V、 G34W、 G34Y、 G34R、 G34S、 G34T を作製し、 COS 7細胞一過性発現培 養上清を用いて結合活性の評価を行った。 その結果、 Pro (G34P)、 Val (G34V)以 外へのアミノ酸置換は結合活性を維持している事が判明した。 上述の改変抗体の軽鎖 CDR1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 1 0 9 (G34A) 、 配列番号 1 1 0 (G34D)、 配列番号 1 1 1 (G34E)、 配列番号 1 1 2 (G34F)、 配 列番号 1 1 3 (G34H)、 配列番号 1 1 4 (G34N)、 配列番号 1 1 5 (G34T)、 配列番 号 1 1 6 (G34Q)、 配列番号 1 1 7 (G34I)、 配列番号 1 1 8 (G34K)、 配列番号 1 1 9 (G34L)、 配列番号 1 2 0 (G34S)、 配列番号 1 2 1 (G34W)、 配列番号 1 2 2
(G34Y)、配列番号 1 2 3 (G34R)、配列番号 1 2 4 (G34V)、配列番号 1 2 5 (G34P ) に記載する。 また、 上述の改変抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、 それぞ れ配列番号 1 2 6 (G34A)、 配列番号 1 2 7 (G34D)、 配列番号 1 2 8 (G34E) , 配 列番号 1 2 9 (G34F)、 配列番号 1 3 0 (G34H)、 配列番号 1 3 1 (G34N) , 配列番 号 1 3 2 (G34T)、 配列番号 1 3 3 (G34Q)、 配列番号 1 3 4 (G34I)、 配列番号 1 3 5 (G34K)、 配列番号 1 3 6 (G34L)、 配列番号 1 3 7 (G34S)、 配列番号 1 3 8
(G34W 配列番号 1 3 9 (G34Y)、配列番号 1 4 0 (G34R 配列番号 1 4 1 (G34V )、 配列番号 1 4 2 (G34P) に記載する。 産業上の利用可能性
本発明は、 染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的 に抑制されている細胞を提供し、 該細胞をタンパク質の製造に用いた場合、 フコ ースを有しない組換えタンパク質を製造することができる。 フコースを有しない 組換えタンパク質は、 フコースを有するタンパク質に比べ細胞障害活性が低減さ れており、 また、 安定性はフコースを有するタンパク質と同等である。 本発明の タンパク質は、 特に抗体医藥として用いる組換え抗体において有利である。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 また、.添付の請求の範囲に記載される技術思 想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能 であることは当業者には容易に理解されるであろう。 本発明はこのような変形お よび変更をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲
1 . 染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制 されている細胞。
2 . フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていることを特徴とする請求 項 1記載の細胞。
3 . 動物細胞である請求項 1または 2記載の細胞。
4 . 動物がチャイニーズハムスター細胞である、 請求項 3記載の細胞。
5 . 動物細胞が CH0細胞である請求項 4記載の細胞。
6 . 遺伝子の破壊がジーンターゲティングベクターを用いた相同組換えにより 行われる、 請求項 2から 5のいずれか 1項に記載の細胞。
7 . 外来タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請 求項 1から 6のいずれか 1項に記載の細胞。
8 . 外来タンパク質をコ一ドする遺伝子が抗体をコードする遺伝子である請求 項 7記載の細胞。
9 . 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載の細胞を培養することを特徴とする タンパク質の製造方法。
1 0 . タンパク質が抗体である請求項 9記載の製造方法。
1 1 . フコースが付加されていないタンパク質を製造することを特徴とする請 求項 1 0記載の製造方法。
1. 2 . 細胞を用いて組換えタンパク質を製造する際に、 染色体上の両方のフコ 一ストランスポーター遺伝子の発現を人為的に抑制することを特徴とする、 タン パク質へのフコース付加阻害方法。
1 3 . 遺伝子の発現の人為的抑制が、 遺伝子を欠損することによる行われるこ とを特徴とする請求項 1 2記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
1 4 . タンパク質が抗体である請求項 1 2または 1 3に記載のタンパク質への フコース付加阻害方法。
1 5 . 細胞が CH0細胞である請求項 1 2から 1 4のいずれか 1項に記載のタン パク質へのフコース付加阻害方法。
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PCT/JP2004/019261 WO2006067847A1 (ja) 2004-12-22 2004-12-22 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
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US (2) US20090061485A1 (ja)
EP (4) EP1829961A4 (ja)
JP (2) JPWO2006067847A1 (ja)
WO (2) WO2006067847A1 (ja)

Cited By (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008020586A1 (en) 2006-08-14 2008-02-21 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibody
WO2008047925A1 (fr) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Composition pharmaceutique comprenant un anticorps anti-hb-egf comme ingrédient actif
WO2008093688A1 (ja) 2007-01-30 2008-08-07 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. キメラFcγレセプター及び該レセプターを用いたＡＤＣＣ活性測定方法
WO2009001840A1 (ja) 2007-06-25 2008-12-31 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. ADCC活性又はCDC活性を有する抗Prominin-1抗体
WO2009041062A1 (ja) 2007-09-28 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 血漿中動態が改善されたグリピカン３抗体
WO2009087978A1 (ja) 2008-01-11 2009-07-16 The University Of Tokyo 抗cldn6抗体
WO2009122667A1 (ja) * 2008-04-04 2009-10-08 中外製薬株式会社 肝癌治療剤
WO2009125825A1 (ja) 2008-04-11 2009-10-15 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
WO2010074192A1 (ja) 2008-12-26 2010-07-01 国立大学法人東京大学 抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療
WO2011021381A1 (ja) 2009-08-17 2011-02-24 株式会社未来創薬研究所 抗hb-egf抗体を有効成分として含む医薬組成物
WO2011122011A2 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies with modified affinity to fcrn that promote antigen clearance
WO2012067176A1 (ja) 2010-11-17 2012-05-24 中外製薬株式会社 血液凝固第viii因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子
WO2012073992A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
WO2012144208A1 (ja) 2011-04-18 2012-10-26 国立大学法人東京大学 抗itm2a抗体を用いる癌の診断および治療
WO2013002362A1 (ja) 2011-06-30 2013-01-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
WO2013047752A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 抗原の消失を促進する抗原結合分子
WO2013046704A2 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha THERAPEUTIC ANTIGEN-BINDING MOLECULE WITH A FcRn-BINDING DOMAIN THAT PROMOTES ANTIGEN CLEARANCE
WO2013047729A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 標的抗原に対する免疫応答を誘導する抗原結合分子
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
WO2013100120A1 (ja) 2011-12-28 2013-07-04 中外製薬株式会社 ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤
WO2013118858A1 (ja) 2012-02-09 2013-08-15 中外製薬株式会社 抗体のFc領域改変体
WO2013125667A1 (ja) 2012-02-24 2013-08-29 中外製薬株式会社 FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子
WO2013147153A1 (ja) 2012-03-29 2013-10-03 株式会社未来創薬研究所 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
WO2014097648A1 (ja) 2012-12-21 2014-06-26 中外製薬株式会社 Gpc3標的治療剤療法が有効である患者に投与されるgpc3標的治療剤
WO2014104165A1 (ja) 2012-12-27 2014-07-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
WO2014208482A1 (ja) 2013-06-24 2014-12-31 中外製薬株式会社 ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤
US9017684B2 (en) 2006-10-12 2015-04-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-EREG antibody
WO2015083764A1 (ja) 2013-12-04 2015-06-11 中外製薬株式会社 化合物の濃度に応じて抗原結合能の変化する抗原結合分子及びそのライブラリ
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
WO2015187779A1 (en) 2014-06-03 2015-12-10 Xbiotech, Inc. Compositions and methods for treating and preventing staphylococcus aureus infections
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US9399680B2 (en) 2007-12-05 2016-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding anti-NR10 antibodies
US9403913B2 (en) * 2014-09-16 2016-08-02 Ovascience, Inc. Anti-VASA antibodies, and methods of production and use thereof
WO2016125495A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
WO2017046994A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Il-8-binding antibodies and uses thereof
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
US9688762B2 (en) 2007-09-26 2017-06-27 Chugai Sciyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US9765135B2 (en) 2014-12-19 2017-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-C5 antibodies
US9975966B2 (en) 2014-09-26 2018-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing theraputic agent
US10000560B2 (en) 2014-12-19 2018-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
US10005832B2 (en) 2009-05-29 2018-06-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating a disease originated from receptor activation by EREG and TGFα
US10011656B2 (en) 2008-09-26 2018-07-03 Emory University Human anti-PD-1, PD-L1, and PD-L2 antibodies and uses therefor
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US10118959B2 (en) 2005-10-14 2018-11-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
US10253091B2 (en) 2009-03-19 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
EP3557260A1 (en) 2012-12-21 2019-10-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
US10618965B2 (en) 2011-02-25 2020-04-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
US10662245B2 (en) 2008-09-26 2020-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of reducing IL-6 activity for disease treatment
US10774148B2 (en) 2015-02-27 2020-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating IL-6-related diseases
WO2020189748A1 (ja) 2019-03-19 2020-09-24 中外製薬株式会社 Ｍｔａ依存的に抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子及び当該抗原結合ドメイン取得用ライブラリ
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US11053308B2 (en) 2016-08-05 2021-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating IL-8-related diseases
US11072666B2 (en) 2016-03-14 2021-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
US11124576B2 (en) 2013-09-27 2021-09-21 Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
WO2022045276A1 (ja) 2020-08-28 2022-03-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
US11376326B2 (en) 2015-07-01 2022-07-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting therapeutic agent which is administered to patient for whom the GPC3-targeting therapeutic agent is effective
WO2022270612A1 (ja) 2021-06-25 2022-12-29 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体の使用
WO2022270611A1 (ja) 2021-06-25 2022-12-29 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体
US11649262B2 (en) 2015-12-28 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
US11760807B2 (en) 2014-05-08 2023-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting drug which is administered to patient responsive to GPC3-targeting drug therapy
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
US12122840B2 (en) 2007-09-26 2024-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE602004028249D1 (de) * 2003-06-18 2010-09-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fucosetransporter
UA94019C2 (ru) * 2004-07-09 2011-04-11 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело, которое специфически связывается с глипиканом 3 (gpc3)
US7867734B2 (en) * 2004-10-26 2011-01-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody having modified sugar chain
CA2975228C (en) 2008-05-02 2020-07-21 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
MX2010014319A (es) * 2008-07-08 2011-05-19 Geneuro Sa Uso terapeutico de ligando especifico en enfermedades asociadas con msrv.
US8730018B2 (en) * 2008-09-15 2014-05-20 General Electric Company Management control of household appliances using continuous tone-coded DSM signalling
US8709424B2 (en) 2009-09-03 2014-04-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-GITR antibodies
KR101545914B1 (ko) 2009-09-22 2015-08-20 프로바이오겐 아게 특수화된 글리칸 구조를 함유하는 분자의 생산 방법
DK2608796T3 (en) 2010-08-05 2019-03-18 Seattle Genetics Inc Inhibition of protein fucosylation in vivo using fucose analogues
KR20140124789A (ko) * 2012-01-20 2014-10-27 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 Ｃｈｏ－ｇｍｔ 재조합 단백질 발현
WO2014031875A1 (en) 2012-08-23 2014-02-27 Seattle Genetics, Inc. Treatment of sickle cell disease and inflammatory conditions
CN104436157A (zh) 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
SG10201806481XA (en) * 2014-02-19 2018-09-27 Emergent Biosolutions Canada Inc Marburg monoclonal antibodies
US20160082129A1 (en) * 2014-09-24 2016-03-24 Aerpio Therapeutics, Inc. VE-PTP Extracellular Domain Antibodies Delivered by a Gene Therapy Vector
BR112021003793A2 (pt) * 2018-08-29 2021-05-18 United Biopharma Inc método para produzir uma proteína afucosilada em uma célula hospedeira

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003085118A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
WO2003085102A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellule avec inhibition ou suppression de l'activite de la proteine participant au transport du gdp-fucose

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3164437D1 (en) * 1980-08-25 1984-08-02 Kabivitrum Ab Peptide substrates for determination of protease activity
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JP2651316B2 (ja) * 1992-05-26 1997-09-10 理化学研究所 相同組換え細胞選別法
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
AU690171B2 (en) 1993-12-03 1998-04-23 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
KR100261941B1 (ko) 1994-07-13 2000-07-15 나가야마 오사무 사람의 인터루킨-8에 대한 재구성 사람항체
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
FR2761994B1 (fr) 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires
US7105315B2 (en) * 1999-06-16 2006-09-12 Incyte Genomics, Inc. Transmembrane protein differentially expressed in cancer
EP2275541B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
WO2001009345A1 (fr) * 1999-07-29 2001-02-08 Helix Research Institute Nouveaux genes codant des proteines kinase et des proteines phosphatase
AU6181000A (en) * 1999-07-29 2001-02-19 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Novel genes encoding protein kinase/protein phosphatase
US6908748B2 (en) * 1999-07-29 2005-06-21 Kenji Sobue Genes associated with the maintenance of differentiation of smooth muscle cells
MXPA02003232A (es) * 1999-09-30 2003-09-22 Alexion Pharma Inc Composiciones y metodos para alternar la expresion de genes.
US20020197679A1 (en) * 2000-06-20 2002-12-26 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
WO2002033054A1 (fr) 2000-10-20 2002-04-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANIMAUX KNOCKOUT POLYβ2
AU2003290689A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Transgenic ungulates having reduced prion protein activity and uses thereof
DE602004028249D1 (de) * 2003-06-18 2010-09-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fucosetransporter
EP1666501A4 (en) 2003-08-11 2008-12-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-HM1.24 ANTIBODIES WITH MODIFIED SUGAR CHAIN

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003085118A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
WO2003085102A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellule avec inhibition ou suppression de l'activite de la proteine participant au transport du gdp-fucose

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OKADA H. ET AL.: "Gene targeting", SHIN IDENSHI KOGAKU HANDBOOK, 1996, pages 277 - 283, XP002999548 *
PENNINGTON S.L. ET AL.: "Gene targeting in Chinese hamster ovary cells is conservative", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 88, no. 21, 1991, pages 9498 - 9502, XP002999549 *
See also references of EP1829962A4 *
YAGI T. ET AL.: "Homologous recombination at c-fyn locus of mouse embryonic stem cells with use of diphtheria toxin A-fragment gene in negative selection", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, no. 24, 1990, pages 9918 - 9922, XP002999550 *
YAMANE-OHNUKI N. ET AL.: "Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 87, no. 5, 5 September 2004 (2004-09-05), pages 614 - 622, XP002983758 *

Cited By (145)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11168344B2 (en) 2005-03-31 2021-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US10118959B2 (en) 2005-10-14 2018-11-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US10934344B2 (en) 2006-03-31 2021-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
EP3111955A1 (en) 2006-08-14 2017-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibody
WO2008020586A1 (en) 2006-08-14 2008-02-21 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibody
US9017684B2 (en) 2006-10-12 2015-04-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-EREG antibody
EP3040347A2 (en) 2006-10-20 2016-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
WO2008047925A1 (fr) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Composition pharmaceutique comprenant un anticorps anti-hb-egf comme ingrédient actif
WO2008093688A1 (ja) 2007-01-30 2008-08-07 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. キメラFcγレセプター及び該レセプターを用いたＡＤＣＣ活性測定方法
WO2009001840A1 (ja) 2007-06-25 2008-12-31 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. ADCC活性又はCDC活性を有する抗Prominin-1抗体
US11332533B2 (en) 2007-09-26 2022-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US9688762B2 (en) 2007-09-26 2017-06-27 Chugai Sciyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US12116414B2 (en) 2007-09-26 2024-10-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US9828429B2 (en) 2007-09-26 2017-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US11248053B2 (en) 2007-09-26 2022-02-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US12122840B2 (en) 2007-09-26 2024-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
EP2617736A1 (en) 2007-09-28 2013-07-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody having improved kinetics in plasma
JPWO2009041062A1 (ja) * 2007-09-28 2011-01-20 中外製薬株式会社 血漿中動態が改善されたグリピカン３抗体
EP2584043A2 (en) 2007-09-28 2013-04-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody having improved kinetics in plasma
WO2009041062A1 (ja) 2007-09-28 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 血漿中動態が改善されたグリピカン３抗体
JP4535406B2 (ja) * 2007-09-28 2010-09-01 中外製薬株式会社 血漿中動態が改善されたグリピカン３抗体
US8497355B2 (en) 2007-09-28 2013-07-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody having improved kinetics in plasma
JP2010200768A (ja) * 2007-09-28 2010-09-16 Chugai Pharmaceut Co Ltd 血漿中動態が改善されたグリピカン３抗体
US9399680B2 (en) 2007-12-05 2016-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding anti-NR10 antibodies
WO2009087978A1 (ja) 2008-01-11 2009-07-16 The University Of Tokyo 抗cldn6抗体
EP3064512A2 (en) 2008-01-11 2016-09-07 The University of Tokyo Anti-cldn6 antibody
EP4282428A2 (en) 2008-01-11 2023-11-29 The University of Tokyo Anti-cldn6 antibody
KR101612139B1 (ko) 2008-04-04 2016-04-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 간암 치료제
WO2009122667A1 (ja) * 2008-04-04 2009-10-08 中外製薬株式会社 肝癌治療剤
AU2009233301B2 (en) * 2008-04-04 2014-01-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Liver cancer drug
EP3521311A1 (en) 2008-04-11 2019-08-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US11359194B2 (en) 2008-04-11 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly
WO2009125825A1 (ja) 2008-04-11 2009-10-15 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
US9868948B2 (en) 2008-04-11 2018-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9890377B2 (en) 2008-04-11 2018-02-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
EP2708558A2 (en) 2008-04-11 2014-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
EP3514180A1 (en) 2008-04-11 2019-07-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
EP2708559A2 (en) 2008-04-11 2014-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US11371039B2 (en) 2008-04-11 2022-06-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
EP3056513A1 (en) 2008-04-11 2016-08-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
EP4238993A2 (en) 2008-04-11 2023-09-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US10472623B2 (en) 2008-04-11 2019-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly
US10370448B2 (en) 2008-09-26 2019-08-06 Emory University Human anti-PD-1, PD-L1, and PD-L2 antibodies and uses therefor
US10662245B2 (en) 2008-09-26 2020-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of reducing IL-6 activity for disease treatment
US10011656B2 (en) 2008-09-26 2018-07-03 Emory University Human anti-PD-1, PD-L1, and PD-L2 antibodies and uses therefor
US11261251B2 (en) 2008-09-26 2022-03-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-PD-1, PD-L1, and PD-L2 antibodies and uses therefor
WO2010074192A1 (ja) 2008-12-26 2010-07-01 国立大学法人東京大学 抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10253091B2 (en) 2009-03-19 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10066018B2 (en) 2009-03-19 2018-09-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10005832B2 (en) 2009-05-29 2018-06-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating a disease originated from receptor activation by EREG and TGFα
WO2011021381A1 (ja) 2009-08-17 2011-02-24 株式会社未来創薬研究所 抗hb-egf抗体を有効成分として含む医薬組成物
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
WO2011122011A2 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies with modified affinity to fcrn that promote antigen clearance
EP3181581A1 (en) 2010-03-30 2017-06-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies with modified affinity to fcrn that promote antigen clearance
EP3702368A1 (en) 2010-03-30 2020-09-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules that promote antigen clearance
US10450381B2 (en) 2010-11-17 2019-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treatment that include the administration of bispecific antibodies
EP3318633A1 (en) 2010-11-17 2018-05-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
WO2012067176A1 (ja) 2010-11-17 2012-05-24 中外製薬株式会社 血液凝固第viii因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子
US9334331B2 (en) 2010-11-17 2016-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibodies
EP4231014A2 (en) 2010-11-30 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
US11891434B2 (en) 2010-11-30 2024-02-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
WO2012073992A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
US10618965B2 (en) 2011-02-25 2020-04-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
US11718678B2 (en) 2011-02-25 2023-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
WO2012144208A1 (ja) 2011-04-18 2012-10-26 国立大学法人東京大学 抗itm2a抗体を用いる癌の診断および治療
EP4011913A1 (en) 2011-06-30 2022-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
WO2013002362A1 (ja) 2011-06-30 2013-01-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
EP3549956A2 (en) 2011-09-30 2019-10-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic antigen-binding molecule with a fcrn-binding domain that promotes antigen clearance
US11827699B2 (en) 2011-09-30 2023-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing antibodies promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
EP3680251A1 (en) 2011-09-30 2020-07-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules for promoting elimination of antigens
WO2013046704A2 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha THERAPEUTIC ANTIGEN-BINDING MOLECULE WITH A FcRn-BINDING DOMAIN THAT PROMOTES ANTIGEN CLEARANCE
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
WO2013047752A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 抗原の消失を促進する抗原結合分子
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
EP4324850A2 (en) 2011-09-30 2024-02-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic antigen-binding molecule with a fcrn-binding domain that promotes antigen clearance
US10253100B2 (en) 2011-09-30 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic antigen-binding molecule with a FcRn-binding domain that promotes antigen clearance
WO2013047729A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 標的抗原に対する免疫応答を誘導する抗原結合分子
AU2012361510A8 (en) * 2011-12-28 2018-04-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-Epiregulin antibody, and cancer therapeutic agent comprising said antibody as active ingredient
AU2012361510B8 (en) * 2011-12-28 2018-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-Epiregulin antibody, and cancer therapeutic agent comprising said antibody as active ingredient
AU2012361510B2 (en) * 2011-12-28 2018-04-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-Epiregulin antibody, and cancer therapeutic agent comprising said antibody as active ingredient
AU2012361510B9 (en) * 2011-12-28 2018-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-Epiregulin antibody, and cancer therapeutic agent comprising said antibody as active ingredient
JPWO2013100120A1 (ja) * 2011-12-28 2015-05-11 中外製薬株式会社 ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤
WO2013100120A1 (ja) 2011-12-28 2013-07-04 中外製薬株式会社 ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤
US9556264B2 (en) 2011-12-28 2017-01-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-epiregulin antibody, and cancer therapeutic agent comprising said antibody as active ingredient
CN104136610A (zh) * 2011-12-28 2014-11-05 中外制药株式会社 人源化抗上皮调节蛋白抗体和含有该抗体作为有效成分的癌症治疗药
WO2013118858A1 (ja) 2012-02-09 2013-08-15 中外製薬株式会社 抗体のFc領域改変体
EP3738980A1 (en) 2012-02-24 2020-11-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for promoting disappearance of antigen via fc gamma riib
WO2013125667A1 (ja) 2012-02-24 2013-08-29 中外製薬株式会社 FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子
WO2013147153A1 (ja) 2012-03-29 2013-10-03 株式会社未来創薬研究所 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
EP3795215A1 (en) 2012-05-30 2021-03-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Target tissue-specific antigen-binding molecule
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
EP4310191A2 (en) 2012-06-14 2024-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified fc region
US10782300B2 (en) 2012-12-21 2020-09-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting drug which is administered to patient responsive to GPC3-targeting drug therapy
WO2014097648A1 (ja) 2012-12-21 2014-06-26 中外製薬株式会社 Gpc3標的治療剤療法が有効である患者に投与されるgpc3標的治療剤
US10451627B2 (en) 2012-12-21 2019-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for assaying soluble GPC3 protein
EP3557260A1 (en) 2012-12-21 2019-10-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
EP4119947A1 (en) 2012-12-21 2023-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
WO2014104165A1 (ja) 2012-12-27 2014-07-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
EP3783017A1 (en) 2013-04-02 2021-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
JPWO2014208482A1 (ja) * 2013-06-24 2017-02-23 中外製薬株式会社 ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤
WO2014208482A1 (ja) 2013-06-24 2014-12-31 中外製薬株式会社 ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤
US11124576B2 (en) 2013-09-27 2021-09-21 Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
EP3763813A1 (en) 2013-12-04 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
WO2015083764A1 (ja) 2013-12-04 2015-06-11 中外製薬株式会社 化合物の濃度に応じて抗原結合能の変化する抗原結合分子及びそのライブラリ
US11760807B2 (en) 2014-05-08 2023-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting drug which is administered to patient responsive to GPC3-targeting drug therapy
WO2015187779A1 (en) 2014-06-03 2015-12-10 Xbiotech, Inc. Compositions and methods for treating and preventing staphylococcus aureus infections
EP3970747A2 (en) 2014-06-03 2022-03-23 XBiotech Inc. Compositions and methods for treating and preventing staphylococcus aureus infections
US9403913B2 (en) * 2014-09-16 2016-08-02 Ovascience, Inc. Anti-VASA antibodies, and methods of production and use thereof
US9567404B2 (en) 2014-09-16 2017-02-14 Ovascience, Inc. Anti-vasa antibodies, and methods of production and use thereof
US9975966B2 (en) 2014-09-26 2018-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing theraputic agent
US11001643B2 (en) 2014-09-26 2021-05-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US11597760B2 (en) 2014-12-19 2023-03-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of detecting the presence of complement C5
US10023630B2 (en) 2014-12-19 2018-07-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of neutralizing C5 with anti-C5 antibodies
US9765135B2 (en) 2014-12-19 2017-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-C5 antibodies
US10000560B2 (en) 2014-12-19 2018-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
US10385122B2 (en) 2014-12-19 2019-08-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding anti-C5 antibodies
US10738111B2 (en) 2014-12-19 2020-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
US11454633B2 (en) 2014-12-19 2022-09-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
US10519229B2 (en) 2015-02-05 2019-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding IL-8 antibodies
US9969800B2 (en) 2015-02-05 2018-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha IL-8 antibodies
EP3816179A2 (en) 2015-02-05 2021-05-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant comprising a modified fcrn-binding domain
US11180548B2 (en) 2015-02-05 2021-11-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of neutralizing IL-8 biological activity
WO2016125495A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
US10774148B2 (en) 2015-02-27 2020-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating IL-6-related diseases
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
US11376326B2 (en) 2015-07-01 2022-07-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting therapeutic agent which is administered to patient for whom the GPC3-targeting therapeutic agent is effective
WO2017046994A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Il-8-binding antibodies and uses thereof
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
US11649262B2 (en) 2015-12-28 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
US11072666B2 (en) 2016-03-14 2021-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
US11780912B2 (en) 2016-08-05 2023-10-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for prophylaxis or treatment of IL-8 related diseases
US11053308B2 (en) 2016-08-05 2021-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating IL-8-related diseases
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
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