WO2006046644A1 - アルツハイマー病の検定方法及び診断試薬 - Google Patents

アルツハイマー病の検定方法及び診断試薬 Download PDF

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Shigeo Takayama
Yuji Yamada
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Sanko Junyaku Co., Ltd.
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    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to an Alheimer by measuring the total amount of j8-amyloid 1-42 and j8-amyloid 1-42 fragments possessing j8-amyloid 1-42C terminal in a biological sample, particularly blood.
  • the present invention relates to an assay method and a diagnostic reagent for diseases such as diseases in which ⁇ -amyloid is involved.
  • ⁇ -amyloid (hereinafter referred to as ⁇ ) is a major component of amyloid plaques that are characteristically found in the brains of patients with Algno-Ima disease (AD).
  • APP Protein It is known to be produced by ⁇ -secretase action that cleaves ⁇ -terminal of N-terminal and ⁇ -secretase action of preserinin that cleaves ⁇ P-C-terminal in cell membrane.
  • a j8 The molecular species of A j8 is known to have various molecular weight sizes, among them the most well-known force associated with neurotoxicity is the 40 amino acid force A
  • 8 1-42 has the property of easily fibrotic and is known to deposit from the early stages of AD to form amyloid plaques.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 the concentration of A
  • 8 1–42 present in the plasma of familial AD patients is increased, and plasma ⁇
  • Non-Patent Documents 5 and 6 while there are reports (Non-Patent Documents 7 to 9) that are almost equivalent to the group of healthy individuals, and the behavior is unknown.
  • a ⁇ measurement in biological samples has been mainly performed by the two-antibody sandwich method. Suzuki et al. Have used various peptide fragments of ⁇
  • Non-patent document 18 shows that ⁇
  • a monoclonal antibody specific to A j8 1-42 was prepared that did not react with Aj8 1-40 and A j8 1-43, and the antibody was produced in the fiber amyloid of AD patient brain tissue.
  • Two-antibody ELIS reagent for quantifying A ⁇ concentration in cerebrospinal fluid is commercially available from two companies. Although these quantitative values by ELISA are correlated, each quantitative value is quite different. (Non-patent document 10). The reasons why these quantitative values are different include the clinical specimen to be measured, the antibody used for the measurement, the measurement method, the sensitivity of the measurement method, and the difference in the adjustment method of A
  • a ⁇ in the cerebrospinal fluid can be measured by a general measurement method, for example, a two-antibody sandwich assay using an antibody that specifically binds to ⁇ .
  • Clinical usefulness has also been recognized (Non-Patent Documents 1, 3, 4, 7 and 15-17).
  • cerebrospinal fluid is used as a specimen, and it is not practical to use cerebrospinal fluid as a specimen because the physical burden on the patient at the time of specimen collection and the risk of physical function damage are high.
  • Patent Document 1 W094 / 17197
  • Patent Document 2 W096Z25435
  • Non-patent literature l Tamaoka A, et al., J. Neurol. Sci. 1997; 148: 41-45.
  • Non-Patent Document 2 Andreasen N, et al., Arch. Neurol. 1999; 56: 673-680.
  • Non-Patent Document 3 Galasko D, et al, Arch. Neurol. 1998; 55: 937-945.
  • Non-Patent Document 4 Motter R, et al., Ann Neurol 1995; 38: 643-648.
  • Non-Patent Document 5 Mayeux R, Ann. Neurol. 1999; 46: 412-416.
  • Non-Patent Document 6 Mehta PD, Arch. Neurol. 2000; 57; 100-105.
  • Non-Patent Document 7 Tamaoka A, et al., J. Neurol. Sci. 1996; 141: 65-68.
  • Non-Patent Document 8 Vanderstichele H, et al., Amyloid 2000; 7: 245-258.
  • Non-Patent Document 9 Fukumoto H, et al., Arch. Neurol 2003; 60: 958-964.
  • Non-Patent Document 10 Suzuki N, et al., Science 1994; 264: 1336-1340.
  • Non-Patent Document ll Chan W, et al., Biochemstry 1996; 35: 7123-1230.
  • Non-Patent Document 12 Biere Al, et al., J. Biol. Chem. 1996271; 32916-32922.
  • Non-Patent Document 13 Kuo YM et al., Biocem Biophys Res Commun. 2000, 268; 750-756.
  • Non-Patent Document 14 Namba et al., Sensitive immunology by electrochemiluminescence (ECL) Of clinical measurement, Japan Society for Clinical Automation (JJCLA), 1996, Vol.21 No.5
  • Non-Patent Document 15 Tero T, et al., Neurobiology of Aging 21 (2000) 735-740
  • Non-Patent Document 16 Kanai M, et al., Ann Neurol 1998; 44: 17-26.
  • Non-Patent Document 17 Schro "der J, et al., Mol Psychiatry 1997; 2: 505-7.
  • Non-Patent Document 18 Christopher C.T.Smith et al, Neuroscience Letters, 362 (2004) 48-
  • Non-Patent Document 19 G. Zhu et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 24, 281-290 (2000) Disclosure of the Invention
  • the present invention has been made in view of the above problems, and is to apply to the diagnosis of Alzheimer's disease by devising a method for measuring A ⁇ in the blood of AD patients.
  • Non-patent Document 14 a two-antibody sandwich method that utilizes an electrochemiluminescence method having a high sensitivity and a wide measurement range function, so that the serum in AD patient serum
  • the primary antibody is antibody 21 F12 (manufactured by Inogeneetics) with specificity at the C-terminal part of ⁇
  • the sensitivity was considerably superior to the conventional method, but no significant difference was observed in the amount of ⁇
  • 8 ⁇ the total amount of A
  • the AD assay method by competitive immunoassay which is one of the present invention, does not require the operation of removing substances that interact with A
  • 8 ⁇ -42 can be used for AD diagnosis
  • the method for measuring ⁇ -42 is as described above. Not limited to competitive immunoassays, for example, ⁇
  • the gist of the present invention is to use for AD diagnosis by measuring A
  • the present invention confirms the usefulness of measuring A
  • ⁇ 1- means the total amount of fragments of various ⁇ isotypes that possess the N-terminal part of ⁇
  • monoclonal antibody 3D6 Indogenetics
  • monoclonal antibody 6E10 Cosmetic immunized with A ⁇ ⁇ -17 are used. Measurements were performed using a competitive immunoassay. As a result, there was no significant difference in the measured values of serum from AD patients and healthy subjects. This demonstrates the importance of specifically measuring blood A j8 x-42 fragments in the diagnosis of AD.
  • the present invention accurately reflects the amount of Aj8 1 -42 in blood by measuring A j8 x-42, and further demonstrates clinical usefulness between serum samples of AD patients and healthy subjects. This makes it possible to diagnose AD blood samples. It may also be used to diagnose diseases caused by A
  • the method for assaying Arno-iuma's disease of the present invention is based on the immunoassay using an antibody specific for the C-terminal part of j8-amyloid 1-42, and ⁇ -amyloid 1- It is characterized by measuring the total amount of 42 and
  • 8-amyloid 1-42-fragment is a peptide of the ⁇ -amyloid 1-42-fragment, especially the j8-amyloid 1-42-C-terminal peptide. Yes, preferably having at least 1 amino acid residue, preferably at least 2 amino acid residues, more preferably at least 3 amino acid residues from the terminal portion of j8-amyloid 1-42C
  • 13-amyloid 1-42 has C-terminal part
  • 8 1-42C terminal fragment-containing peptide it may be referred to as A
  • ⁇ amyloid 1-42 and ⁇ 1 42C terminal fragment-containing peptide may be collectively denoted as ⁇ 42.
  • the immunoassay is a competitive immunoassay.
  • This competitive immunoassay method can be carried out by the following two methods using, for example, a solid-phased A
  • a first example of the method of the present invention by competitive immunoassay includes the following steps (a) and (b).
  • a second example of the method of the present invention by competitive immunoassay includes the following steps (a) and (b).
  • 8 1-42C terminal fragment peptide to be labeled can be a synthetic peptide itself Force A
  • a carrier substance means a compound that can label a labeling substance such as a ruthenium complex, such as polylysine (poly-L-Lysine), dextran, ushi serum albumin, a polypeptide having a large amount of free amino groups, and the like. Can be mentioned. As long as the carrier substance does not impair the binding property with the antibody, the force allowed to be applied at any position of the peptide, preferably the N-end, is desirable.
  • the AD diagnostic reagent (kit) measures ⁇ -42 in a biological sample, comprising an antibody that recognizes the C-terminal part of ⁇ 1-42 as an essential component. It is a diagnostic reagent.
  • the composition of the diagnostic reagent varies depending on the immunoassay method used, but in the case of competitive immunoassay, for example, a solid phased A
  • the antibody labeled with a labeling substance is used as a constituent component.
  • the A1-42C terminal part labeled with a labeling substance is used.
  • the possessed peptide is a constituent.
  • a peptide complex to which a carrier substance is bound can also be used as the A 1-42C terminal-carrying peptide to be labeled.
  • carrier substances include polylysine, dextran, ushi serum albumin, and a polypeptide having a large amount of free amino groups. As long as the carrier substance does not impair the binding property with the antibody, the N-terminal portion is preferable, as long as it is allowed at any position of the peptide.
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used as the antibody.
  • the antibody is an antibody that recognizes A
  • the immunogen is the 33-42 amino acid site of ⁇ -amyloid 1 42, and ⁇
  • 2 ⁇ 12 manufactured by Inogenetics
  • Hachi 078P manufactured by Chemicon
  • 8G7 manufactured by Nanotool
  • the biological sample specimen is serum or plasma.
  • labeling substances include fluorescent substances, enzymes, dyes, luminescent substances, etc. Ruthenium complexes are preferred. It is preferable that the support to be fixed is a magnetic bead.
  • the method for measuring 13-amyloid 1-42 of the present invention is carried out by immunoassay using an antibody specific for the C-terminal part of 13-amyloid 1-42, and ⁇ -amyloid 1 42 in a biological sample. And
  • the biological sample specimen is serum or plasma.
  • the present invention relates to AD by measuring A
  • FIG. 1 is a schematic explanatory view showing a first example of the test method for Arnno-Ima disease of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic explanatory diagram showing a second example of the Alzheimer's disease test method of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 6 is a schematic explanatory view showing the concept of metabolism of ⁇ 1 42 in blood.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of Experimental Examples 6 and 7.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of Example 1.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of Example 2.
  • FIG. 10 is a graph showing a calibration curve for the standard product of Example 3.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of Example 3.
  • FIG. 12 is a graph showing a calibration curve for the standard product of Experimental Example 8.
  • FIG. 13 is a photograph showing a result of electrophoresis in Experimental Example 8.
  • FIG. 14 is a chart showing the first result of Experimental Example 9.
  • FIG. 15 is a graph showing the first result of Example 9.
  • FIG. 16 is a graph showing a calibration curve obtained in Experimental Example 9.
  • FIG. 17 is a chart showing the second result of Experimental Example 9.
  • FIG. 18 is a chart showing the results of Experimental Example 10.
  • 10 Support, magnetic beads, 12, 24: A j8 1-42-synthetic peptide, 13: A j8 1-42 synthetic peptide-bonded support, A
  • the method for assaying Arno-Ima disease of the present invention is based on an immunoassay using an antibody specific for the C-terminal part of ⁇ 1 42, and ⁇
  • 8 1-42 fragments are measured to determine the presence of Alzheimer's disease by measuring the total amount of fragments ( ⁇
  • the immunoassay used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a method that can measure ⁇ -42 in a biological sample. It is also possible to use V-shift, such as detection by the Summon resonance method (Non-patent Document 19) and separation and measurement of peptides with A
  • the biological sample specimen is, for example, a force containing serum, plasma, cerebrospinal fluid, bone marrow fluid, tissue and cell extract, cell culture fluid, etc., preferably serum or plasma.
  • both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used as long as they specifically recognize the C-terminal portion of A
  • 81-42 is a commercially available antibody that does not react with A
  • 81-42 has a 33-42 amino acid site as an immunogen.
  • 8 1-42 mouse monoclonal antibody 21F12 (manufactured by Inogenetics), AB5078P (manufactured by Chemicon), 8G7 (manufactured by Nanotool) 2 IF 12 is preferred.
  • 8 1-40 includes an antibody that has weak reactivity but does not substantially affect the measurement of the total amount of A
  • 8 1-43 may be reactive.
  • the antibody used in the present invention can be prepared by a conventional method.
  • Monoclonal antibodies are prepared by using a peptide having the C-terminal part of A1-42 as an antigen, and if necessary, forming a complex with a carrier protein and inoculating it into an animal for immunization.
  • Hybridomas that produce antibody with strong specificity at the C-terminal region of 8
  • the target antibody is an antibody having specificity at the C-terminal part of A1-42.
  • a peptide to be held such as A 33-42, can be appropriately selected.
  • a complex with a carrier protein is used as an antigen, and various condensing agents such as dartal aldehyde, carbodiimide, maleimide active ester and the like are used for the preparation.
  • the carrier protein ushi serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. are used, and a method of coupling at a ratio of 1 to 5 times is usually used.
  • mice and guinea pigs examples include mice and guinea pigs, and the inoculation method is subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal.
  • complete Freund's adjuvant may be mixed with incomplete Freund's adjuvant, and usually administered once every 2 to 5 weeks.
  • the antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph nodes of the immunized animal are fused with myeloma cells and isolated as hyperidoma.
  • myeloma cells those derived from mice, rats, humans and the like are used, and those derived from the same species as the antibody-producing cells are preferred.
  • Manipulation of cell fusion is performed by a known method such as the method of Kohler and Milstein (Nature, 256,
  • fusion promoters include polyethylene glycol and Sendai virus, and usually 20 to 40 using polyethylene glycol (average molecular weight 1000 to 4000) at a concentration of about 20 to 50%. C, preferably 30-37. Under the temperature of C, the ratio of the number of antibody producing cells to the number of myeloma cells is usually about 1: 1 to 10 and about 1 to 10 minutes. Cell fusion can be performed by adapting.
  • a variety of immunochemical methods can be used for screening of hyperidoma that produces an antibody having specificity at the C-terminal part of A ⁇ 1 42.
  • ELISA method Western blot method, competitive method and the like can be mentioned.
  • 8 1-40 peptide it is possible to select antibodies that react with A
  • the selected well force can be further cloned by, for example, a limiting dilution method to obtain a target clone.
  • Hypridoma selection and breeding are usually carried out in a medium for animal cells (eg, RPMI1640) containing 10-20% urine fetal serum with the addition of ⁇ ⁇ ⁇ (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • ⁇ ⁇ ⁇ hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • the clones obtained in this way were transplanted into the peritoneal cavity of BALBZC mice that had been blistered, and after 10-14 days, ascites containing a high concentration of the monoclonal antibody was collected and used as a starting material for antibody purification. can do.
  • the clone can be cultured, and the culture solution can be used as a raw material for antibody purification.
  • Monoclonal antibodies can be recovered by using known methods for immunoglobulin purification, such as ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ethanol fractionation, the use of anion exchangers, and an affinity port. This can be achieved by means such as matography.
  • Polyclonal antibodies can also be prepared by conventional methods.
  • the antigen employs a peptide mainly composed of the C-terminal part of A ⁇ 1-42, and can be prepared by immunizing animals such as rabbits and guinea pigs as a complex by the same method as described above.
  • a polyclonal antibody can be obtained by measuring the antibody titer as appropriate and purifying the antibody with a high-titer serum using the above-described method as a purification source of the antibody.
  • the method of the present invention using a competitive immunoassay will be described.
  • the competitive immunological assay used in the method of the present invention is a method in which biological samples such as blood samples using an antibody specific to the same end of A j81-42 and an Aj8 synthetic peptide are used. This is a competitive immunoassay based on the competitive binding reaction of ⁇ 1 42 peptide and ⁇ synthetic peptide, which possess the A ⁇ 1 42C terminal part of, to the antibody.
  • 8 synthetic peptide used can be any peptide that reacts with an antibody that recognizes the C-terminal part of A
  • 8 1-42 C-terminal possessed peptide should be not only the full length ⁇
  • the peptide can be synthesized according to a conventional method such as solid phase synthesis.
  • a j8 1-42 synthetic peptide is used as ⁇
  • FIG. 1 is a schematic explanatory view showing a first example of the Alzheimer's disease assay method of the present invention.
  • an immunoassay method a peptide having an A1-42C terminal portion was immobilized on a support. This is an example of using a competitive immunoassay.
  • 10 is a support
  • 12 is an A
  • 32 is a reaction vessel (reaction cup)
  • 34 is a reaction solution (for example, a buffer solution).
  • 8 1-42 synthetic peptide 12 is bound to support 10 (solid phase), and A
  • Examples of the material of the support 10 include glass, plastic (for example, polystyrene, polyamide, polyethylene, polypropylene, and the like), metal, and the like.
  • the shape of the support is not particularly limited, such as a cup shape, a flat plate, or a particle.
  • the support 10 is preferably magnetic microbeads (magnetic beads).
  • 8 synthetic peptide on a support may be in accordance with conventional methods.
  • 81 1-42 synthetic peptide in a buffer solution treat the magnetic beads with a blocking agent, and store them under the blocking agent.
  • a blocking agent treat the magnetic beads with a blocking agent, and store them under the blocking agent.
  • an antibody 17 labeled with a labeling substance 16 with an antibody 14 specific for the C-terminal portion of ⁇ 1-42 (hereinafter referred to as a labeled antibody)
  • a labeled antibody 17 and bound competitively [Fig. L (b)].
  • the labeling substance 16 used in the present invention includes enzymes, luminescent substances, fluorescent substances, and isotopes. However, it is preferably a ruthenium complex.
  • the method for preparing the labeled antibody is in accordance with a conventional method. For example, an antibody and a ruthenium complex (IGEN, ORIGEN TAG-NHS ESTER) are reacted in a buffer solution, and then further reacted with 2M glycine. Subsequently, the labeled antibody can be purified by gel filtration column chromatography.
  • a ruthenium complex IGEN, ORIGEN TAG-NHS ESTER
  • reaction solution is sucked and taken, and the magnetic beads are washed to remove substances in the free reaction solution that are not bound to the magnetic beads (BF separation).
  • the method for measuring the labeling substance shall be in accordance with the conventional method.
  • a ruthenium complex when used as a labeling substance, it binds to a magnetic bead as shown in Fig. 1 (c), and the ruthenium complex labeled antibody emits light by capturing electric energy in the presence of tributopyramine.
  • the intensity of the ruthenium complex emission 40 is measured (Non-patent Document 14).
  • a ⁇ -42 in the sample can be quantified by the degree of decrease in the luminescence intensity (expressed as an inhibition rate (%) in the following examples). Since the amount of A
  • FIG. 2 is a schematic explanatory view showing a second example of the Alzheimer's disease assay method of the present invention, and specifically recognizes the C-terminal part of A
  • 20 is a support and 22 is an antibody that specifically recognizes the C-terminal part of A
  • 8 1-42 antibody 22 is bound to a support 20 such as a magnetic bead (solid phase) to prepare an A j8 1-42 antibody binding support 23.
  • the method of immobilizing the antibody on the support may be in accordance with a conventional method.
  • magnetic beads are used as the support will be described as an example.
  • a 1-42 synthetic peptide 24 is labeled 26
  • the labeled A j8 1-42-synthetic peptide labeled with, and a biological sample sample are mixed together, allowed to undergo a competitive reaction, and bind competitively [Fig. 2 (b)].
  • the same operation as in the first example can be performed to measure the labeling substance bound to the magnetic beads [Fig. 2 (c)], and A ⁇ -42 in the sample can be quantified. .
  • the labeled ⁇ 1 42 synthetic peptide can be used as such.
  • a peptide complex in which a carrier substance is bound to a force ⁇ 42 can also be used.
  • Carrier One substance means a compound to which a labeling substance can bind, and examples include polylysine (poly-L-lysine), dextran, ushi serum albumin, and a polypeptide having many free amino groups. Preferably, it is polylysine.
  • poly-L-lysine poly-L-lysine
  • dextran dextran
  • a polypeptide having many free amino groups Preferably, it is polylysine.
  • 81-42 peptide can be increased, and an increase in sensitivity is expected. Therefore, it is preferable to use these peptide conjugates.
  • the labeled peptide complex can be obtained by binding a carrier substance labeled with a labeling substance and an A ⁇ 1-42 synthetic peptide via, for example, a cross-linking agent.
  • a spacer for example, 15 lysine peptides having 15 lysine force may be bound in advance to the end of A j81-42.
  • the peptide complex can be labeled with a labeling substance, and any method can be freely adopted and is not limited.
  • the diagnostic reagent (kit) based on the immunoassay method of the present invention comprises an antibody having specificity at the C-terminal part of 1 ⁇ 1-42 as an essential component, and further has a ⁇ ⁇ 142C-terminal synthetic peptide.
  • a peptide is a constituent.
  • the form of the components of the reagent should be designed as appropriate depending on the immunoassay employed!
  • a support preferably magnetic beads
  • 81-42C terminal portion is immobilized and preferably a labeled antibody are used as components.
  • a support preferably magnetic beads
  • an antibody is immobilized
  • 8 1-42C terminal fragment-containing synthetic peptide is a peptide obtained by binding a carrier substance to the A
  • the composite is preferably used as a constituent component. In addition, it is free to attach a buffer, a measuring instrument, etc. used for the reaction to the reagent.
  • Experimental Examples 1 and 2 are analyzes by electrochemiluminescence two-antibody sandwich assay using two types of antibodies specific to A j8.
  • a primary antibody 21F12 mouse monoclonal antibody (manufactured by Inogeneetics), which is an A ⁇ 1-42 specific reaction antibody prepared by immunizing mice with amino acid 33-42 of A
  • a secondary antibody a ruthenium complex-labeled 3D6 mouse monoclonal antibody (manufactured by Inodienetics) produced by immunizing mice with the 1-5 amino acid site of ⁇
  • the magnetic beads were washed with 10 mL of the aforementioned 4% Block Ace reagent (2 mL of 4% Block Ace Z washes 5 times).
  • the washed 21F12 antibody-bound magnetic beads were mixed with 0.5 mL of the aforementioned 4% Block Ace reagent and stored at 4 ° C until use.
  • 3D6 mouse monoclonal antibody (manufactured by Inogeneetics) was diluted to a lmgZmL antibody concentration with lOmmolZL phosphate buffer (PH7.8). 1 mg ⁇ mL of ruthenium complex (IGEN, ORIGEN TAG-NHS ESTER) was added to 0.5 mL of lmgZmL antibody, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 30 minutes. Then add 2 mol / L glycine to 30 L, 25 ° C, Stir for 30 minutes.
  • IGEN ORIGEN TAG-NHS ESTER
  • reaction cup 500 L polystyrene cup
  • reaction cup 50 mmol / L Tris HCl, 1% BSA, 0.15 mol / L NaCl, 0.01% (W / V) Tween20, lOmmol / L ED
  • sandwich measurement reaction solution 50 mmol / L Tris HCl, 1% BSA, 0.15 mol / L NaCl, 0.01% (W / V) Tween20, lOmmol / L ED Seven samples containing TA2Na, 0.1% normal mouse serum, pH 7.5] (hereinafter referred to as sandwich measurement reaction solution) were prepared, and A
  • 50 L of each sample diluted to 0, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, or 100 pg / mL with the solution for preparation was mixed.
  • the magnetic beads are trapped with a magnet, and the liquid in the reaction cup is withdrawn, and the washing solution [50 mmol / L Tris HCL, 0.01% (W / V) tween20, 0.15 mol / L NaCl, pH 7.5] 350
  • the magnetic beads were washed twice with ⁇ L to remove non-specific binding substances other than the antigen-antibody reaction (BF separation).
  • Blank subtraction value ECL value ECL when sample concentration is 0
  • the electrochemiluminescence two-antibody sandwich assay method shown in Table 1 and Fig. 3 was a measurement system capable of measuring A3 1-42 synthetic peptide up to 0.5 pgZmL. It is a measurement system that can obtain a sensitivity 10 times higher than that of the most sensitive reagent of the A
  • the magnetic beads are trapped with a magnet, and then the liquid in the reaction cup is extracted, and the washing solution [50 mmol / L Tris HCL, 0.01% (W / V) tween20, 0.15 mol / L NaCl, pH 7.5] 350
  • the magnetic beads were washed twice with L to remove non-specific binding substances other than antigen-antibody reaction ( BF separation).
  • the magnetic beads after the reaction are trapped with a magnet, and the liquid in the reaction cup is drawn out.
  • the magnetic beads are washed twice with 350 L of washing solution to remove non-specific binding substances other than the antigen-antibody reaction ( BF separation).
  • Fig. 5 is a graph showing a relative ratio of the rate of change of the measured value over time when the measured value immediately after adding the A ⁇ 1-42 synthetic peptide to serum is 100%.
  • 8 1-42-synthetic peptide clearly shows a decrease in measured values over time. If we were able to suppress this, we got a result. Therefore, it was suggested that in vivo serum, ⁇ 1 42 in vivo was also rapidly fragmented by blood protease.
  • Fig. 5 is a graph showing a relative ratio of the rate of change of the measured value over time when the measured value immediately after adding the A ⁇ 1-42 synthetic peptide to serum is 100%.
  • FIG. 6 is a schematic illustration showing the metabolic concept of ⁇
  • ⁇ ⁇ 1-42 is expressed in the brain and is transferred to the cerebrospinal fluid (CSF). Thereafter, ⁇
  • a 1-42 synthetic peptide was obtained by electrochemiluminescence two-antibody sandwich assay (Experimental Example 4) and competitive immunoassay (Experimental Example 5) in which antigen (A j8 1-42 synthetic peptide) was immobilized. The enzyme degradation product was measured.
  • 10 ⁇ l olZL potassium phosphate buffer was added to 20 ⁇ L of A ⁇ 1-42 synthetic peptide (manufactured by Peptide Institute, Inc.) prepared to 10 gZ mL with lOmmolZL potassium phosphate buffer (pH 7.8).
  • a sample was prepared by adding 5 L of trypsin (SIGMA, 1: 250 trypsin) adjusted to 1 mgZmL with a solution (pH 7.8).
  • a phospholipid polymer reagent manufactured by NOF Corporation, S101E
  • the magnetic beads were washed with the aforementioned 10 mL phospholipid polymer reagent (2 mL phospholipid polymer Z washes 5 times).
  • 1-42 synthetic peptide-bound magnetic beads were mixed with 0.3 mL of the phospholipid polymer reagent described above and stored at 4 ° C until use.
  • 2 IF 12 mouse monoclonal antibody (Inogenes Corporation), an antibody specific for the C-terminal part of ⁇ -42, was diluted with lOmmolZL potassium phosphate buffer (pH 7.8) to an lmgZmL antibody concentration.
  • C stirred for 30 minutes.
  • 30 L of 2 mol / L glycine was added and stirred at 25 ° C. for 30 minutes.
  • the ruthenium complex-labeled antibody solution was applied to gel filtration column chromatography (Amersham Bioscience, sephadex G-25) packed in a glass tube with a diameter of 1 cm and a height of 30 cm, and unlabeled ruthenium complex and ruthenium complex were applied.
  • the labeled antibody was isolated and purified. Elution was performed with 10 mmol / L potassium phosphate buffer (pH 6.0).
  • reaction solution in reaction cup [50 mmol / L Tris HC1, 10% BSA, 0.15 mol / L NaC 1, 0.01% (W / V) Tween20, lOmmol / L EDTA2Na, 0.1% normal mouse serum, pH 7.
  • 50 L each of the enzyme-treated sample and the control sample of ⁇ 1 42 synthetic peptide were mixed there.
  • labeled antibody 200 L of a monoclonal antibody (hereinafter referred to as labeled antibody) was added. Stir at 30 ° C for 26 minutes, and add ⁇ 1 42 and A j8 1-42 fragment in the sample to the magnetic bead-bound A j8 1-42 synthetic peptide. Theme complex labeled 2 IF 12 mouse monoclonal antibody was competitively reacted.
  • the magnetic beads are trapped with a magnet, and the liquid in the reaction cup is extracted, and the washing liquid [50 mmol / L Tris HC1, 0.01% (W / V) tween20, 0.15 mol / L NaCl, pH 7.5
  • the magnetic beads were washed twice with 350 L to remove non-specific binding substances other than the antigen-antibody reaction (BF separation). Thereafter, 300 iL of tryptopinoleamine was added to the reaction cup and mixed with the beads. By applying electric energy in this state, the ruthenium complex emitted light, and the emission intensity was detected with a detector.
  • Picormi 8220 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.
  • Picormi 8220 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.
  • Table 2 shows the measurement results obtained by the electrochemiluminescence two-antibody sandwich measurement method of Experimental Example 4, and Table 3 shows the measurement results of the competitive immunoassay method of Experimental Example 5.
  • ECL value is the measured value of the luminous intensity of the ruthenium complex
  • % is the relative ratio of the measured value when the measured value of the control sample is 100%.
  • the relative ratio of the decrease in the measured value due to the competitive reaction when the value when the competitor is not present in the sample (blank value) is 100% is shown as the inhibition rate.
  • the competitive immunoassay was performed according to the procedure described in Experimental Example 5. The results are shown in FIG.
  • the inhibition rate in the graph of FIG. 7 is a relative ratio of a decrease in the measured value due to a competitive reaction when the value (blank value) when there is no competitor in the sample is 100%.
  • the antibody 21F12 used in the competitive immunoassay of the present invention is an antibody that specifically reacts with ⁇
  • a required amount of a reaction cup containing 50 L of the reaction solution was prepared.
  • 50 ⁇ L each of 25 AD patient sera, 15 healthy subject sera, and a reaction solution (blank) were mixed.
  • 81-42 synthetic peptide-bound magnetic beads diluted to 1.5 mgZmL with the reaction solution was added, and measurement was performed by competitive immunoassay according to the procedure described in Experimental Example 5. The results are shown in FIG.
  • the amount of luminescence intensity for each sample obtained is such that if there is a large amount of ⁇ ⁇ 42 in the sample, the binding amount of the ruthenium complex-labeled antibody to the magnetic bead-binding peptide decreases due to the competition reaction. Luminescence intensity when using a reaction solution as a sample with no competitor In comparison, the emission intensity decreases.
  • the obtained luminescence intensity was converted into an inhibition rate by the following calculation formula.
  • Inhibition rate (%) [1 Luminescence intensity of each specimen ⁇ Luminescence intensity when the reaction solution is used as a specimen (luminescence intensity when there is no competitive reaction)] X 100
  • 8 1-42 instead of the 21F12 antibody AB5078P (Chemicon) was labeled with a ruthenium complex Example except that the ruthenium complex-labeled AB5078P antibody was used Serum samples from 20 AD patients and 18 healthy subjects were measured using the competitive immunoassay method of 1 and the same method. The results are shown in Fig. 9.
  • Example 1 As a result, as in Example 1, it was determined in the t-test that there was a significant difference between the AD group and the healthy group with a probability of 95% or more (p ⁇ 0.002). From this result, it was found that both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies can be used as long as the antibodies are specific to the C-terminal part of A
  • This SPDP-bonded ruthenium complex-labeled polylysine was treated with 55 mmol / L L calorie containing 10 mmol / L potassium phosphate buffer ( PH 7.5) containing ImolZL dithiothreitol and 1 mmol / L disodium ethylenediamine tetraacetate. Then, the 2-pyridyl-disulfide group of SPDP was thiolated by stirring at 25 ° C for 30 minutes while blowing nitrogen gas.
  • ⁇ ⁇ 33—42 synthetic peptide with 15 lysines bonded to the ⁇ terminal side (amino acid sequence: ⁇ KKKKKKKKKKKKGLMVGGWIA ( ⁇ ⁇ IJ number 2), hereinafter referred to as 15L— ⁇ 33-42;) 0.5 mg of It was dissolved in DMSO, and further diluted with lOmmolZL potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.45 mL of ImmolZL disodium ethylenediaminetetraacetate to obtain a 15 L- ⁇ 33-42 peptide solution.
  • the mixture was applied to gel filtration column chromatography (Amersham Biosciences, Sephadex G-25) packed in a glass tube with a diameter of 1 cm and a height of 30 cm, and free SPDP-bound 15L- ⁇ 33-42 peptide and Separation of thiolated SPDP-bound ruthenium complex-labeled polylysine and 15L- ⁇ 33-42 peptide + ruthenium complex-labeled polylysine conjugate (hereinafter referred to as labeled peptide complex) were isolated and purified. Elution was performed with 10 mmol ZL potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing ImmolZL disodium ethylenediamine tetraacetate.
  • 81-42 can be used in the same manner.
  • reaction cup 50 L reaction solution [1 Ommol / L sodium phosphate, 1% Block Ace, 0.15 mol / L NaCl, 0.01% (W / V) Tween20, 1 in a 500 L polystyrene cup (hereinafter referred to as reaction cup)
  • the required amount of Ommol / L EDTA2Na, 0.25% (W / V) trehalose, 0.1% normal mouse serum, pH 7.2] was prepared.
  • Each reaction cup was mixed with 20 L of A j8 1-42 synthetic peptide at a concentration of 0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, lOOOngZmL as a standard for preparing a calibration curve, or measured.
  • the magnetic beads are trapped with a magnet, and the liquid in the reaction cup is extracted, and the washing solution [50 mmol / L Tris HCl, 0.1% (W / V) tween20, 0.15 mol / L NaCl, ⁇ 7.5
  • the magnetic beads were washed twice with 350 ⁇ L to remove non-specific binding substances.
  • Table 4 shows the inhibition rate of the standard A
  • Table 5 and Table 6 and Fig. 11 show the measurement results of serum from AD patients and healthy subjects. The quantitative value was calculated by applying the ECL value of each sample to the calibration curve in FIG. As a result, the total amount of ⁇
  • Inhibition rates in the table are defined as A at each concentration when the measured intensity (ECL value) of ruthenium complex without inhibition (input A
  • the percentage of decrease in the ECL value when ⁇ 1-42 is injected is shown in%.
  • Example 8-1 50 ⁇ L of a healthy human serum sample was prepared, and 500 L of Aj8 1-42 synthetic peptide (Peptide Institute, Inc.) with a concentration of 50 ⁇ gZmL was mixed and stirred well. The sample was incubated at 25 ° C. for 90 hours, and the obtained sample was purified and desalted and concentrated by the following method to prepare a purified desalted sample (30 L).
  • the desalting and concentration method is as follows.
  • the sample was purified with a affiliation gel in which 21F12 antibody (Indogenetics) that recognizes the C-terminus of A ⁇ 1-42 was bound to Sepharose gel (CNBr-activated d sepharose 4B: Pharmacia Bioscience) did.
  • 21F12 antibody affinity gel was filled into Ultrafree-MC (Millipore) and a sample supplemented with A
  • Experimental example 8-2 Sample purified immediately after adding A
  • Experimental example 8-3 Sample purified lmL serum
  • the electrophoresis gel was a 4-12% gradient Nu-PAGE Bis-Tris gel (Invitrogen), and the molecular weight marker was Markl2 (Invitrogen).
  • the purified desalted sample is the sample dilution buffer LDS sample buffer (manufactured by Invitrogen) so that the amount applied to the gel is 50 ng from the quantitative value obtained by the competitive immunoassay. And applied to the gel.
  • 8 1-42 synthetic peptide (Peptide Laboratories) and A ⁇ 34-42 synthetic peptide (SIGMA) can be mixed with LDS sample buffer to form a gel.
  • Fig. 13 shows a gel photograph of the stained electrokinetics.
  • a method using a low molecular weight peptide separation gel filtration column was examined as a method to confirm the presence or absence of the A j8 x- 42 fragment in a molecular weight region of 3.5 KDa or less that cannot be detected by SDS-PAGE.
  • Biogel P-4 gel (manufactured by Biorat), which is a gel filtration column, was packed in a glass column tube (manufactured by Biorat) having a diameter of 1.0 and a height of 120 cm, with a gel volume of 84 mL. 8M Urea / 50 mM Tris (pH 7.5) was used as a mobile phase, and the solution was fed at a flow rate of 0.1 mL / min with an HPLC pump CCPM (manufactured by Toyo Soda).
  • the eluate from the column was measured for absorption at A22 5 nm with an SPD-6AV spectrometer (manufactured by Shimadzu Corporation), and the measurement data was charted with a C-R3A chromatopack (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the SPD-6AV spectrometer was set to range 0.005 and the response was set to STD mode.
  • the peak detection sensitivity SLOPE
  • the minimum peak area setting was set to 10
  • the chart speed was set to ImmZ.
  • Pepsin A molecular weight 35 KDa, Sigma
  • a j8 1-42 molecular weight 4. 514 KDa, peptide research
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Aj8 1-28 molecular weight 3. 2625KDa, manufactured by BACHEM
  • a j8 12-28 Molecular weight 1.
  • the DMSO peak appearance time attached to the sample is 688.8 minutes, which is better than the 676. 567 minute DMSO peak appearance time when creating the calibration curve. It was confirmed.
  • the main peak of the obtained sample was 512.167 minutes.
  • the main peak and the shoulder peak inadequately separated existed in front of the main peak, and the appearance time was about 470 minutes in terms of chart speed and distance force to the shoulder peak.
  • several very small detection peaks detected by the chromatopack peak automatic detection mechanism were also detected.
  • the molecular weight of the dissolved substance was calculated by applying the calibration curve formula in Fig. 19 with the main peak and shoulder peak appearing together, and the main peak had a molecular weight of 0.357KDa, and the shoulder peak had a molecular weight of 0. It was 526KDa.
  • the collected fraction of the affinity column and the healthy human pool serum (same product as purified) that had not been purified were measured by the competitive immunoassay described in Example 3. It was.
  • the measured value of the serum before the affinity purification treatment was 875 ng ZmL.
  • the measured value of the flow-through fraction after passing this serum through the 21F12 column was 293 ng / mL. It had fallen to the extent. Therefore, the remaining 70% (582 ⁇ g) is considered to be bound to the 21F12 affinity column, and the low-molecular peak appearing on the chart of the gel filtration column apparatus is a decrease in the value of the competitive immunoassay. Some 70% (582 ng) is reflected.
  • Val-Ile-Ala (molecular weight 0.333742KDa)
  • the A ⁇ -42 fragment predicted from the shoulder peak is its C-terminal peptide Gly-Val-Val-lie-Ala (0.552964KDa).

Abstract

　血中等、生体試料検体中のβ－アミロイドの測定手法を工夫し、アルツハイマー病の診断に応用することにある。 　β－アミロイド１－４２のＣ末端部分を認識する抗体を用いる免疫測定法によって、生体試料検体中の、β－アミロイド１－４２とβ－アミロイド１－４２のＣ末端部分を保有するβ－アミロイド１－４２断片のトータル量を測定することによりアルツハイマー病の検定を可能とした。前記免疫測定法が、競合的免疫測定法であることが好ましい。

Description

明 細 書
アルツハイマー病の検定方法及び診断試薬
技術分野
[0001] 本発明は、生体試料、特に血液中の j8—アミロイド 1— 42と j8—アミロイド 1— 42C 末端部を保有する j8—アミロイド 1—42断片のトータル量を測定することによる、アル ッハイマー病など β アミロイドが関与する疾患の検定方法及び診断試薬に関する ものである。
背景技術
[0002] β—アミロイド (以下、 Α βと記す）は、アルッノヽイマ一病 (AD)患者脳に特徴的に 認められるアミロイドプラークの主な構成成分であり、 Α |8は、その前駆体タンパク質（ APP) N 末端の β部位を切断する βセクレターゼ作用と、細胞膜内に存在する ΑΡ P— C—末端を切断するプレセリニンの γ—セクレターゼ作用により産生されることが 知られている。
A j8の分子種は、様々な分子量サイズのものが知られている力 それらの中で神経 細胞毒性と関連して最もよく知られているの力 40個のアミノ酸力 なる A |8 (以下、 A β 1 40と記す）と 42個のアミノ酸力もなる Α β (以下、 Α β 1 42と記す)である。 Α |8 1—42は、容易に繊維化する性質を持っており、 ADの早期から沈着しアミロイド プラークを形成することが知られて ヽる。
上記のごとぐ A |8の沈着は、 AD患者脳の特徴的な病理学的特徴であるとともに、 脳脊髄液や血中にも見出されている。脳脊髄液中の A |8 1—42濃度は AD患者にお いて、低下していることが報告されている (非特許文献 1〜4)。また、家族性 AD患者 血漿中に存在する A |8 1—42は増加しており、孤発性 AD患者の血漿中 Α |8 1—40 あるいは A |8 1—42濃度は増加しているという報告 (非特許文献 5、 6)がある一方、 ほとんど健常人群と同等という報告 (非特許文献 7〜9)もあり、その挙動は、不明であ る。
[0003] これまでの生体試料中の A β測定は、主に、二抗体サンドイッチ法が実施されて ヽ る。鈴木らは、 Α |8の各種ペプチドフラグメントを免疫原として、認識部位の異なる複 数のモノクローナル抗体を作製し、それら抗体を組み合わせたサンドイッチ測定法を 報告している（特許文献 1)。その手法により AD患者の脳脊髄液中の A |8を測定し、 A |8 1— 40が主な成分であること、 AD患者脳の蟻酸抽出物においては、 A |8 1—40 Α β 1—42及び A |8 3— 42が主成分であることを開示している。
競合的免疫測定法を採用している報告もある。非特許文献 18は、高脂血漿患者の 血清中の Α |8を、 Α |8 1—40に特異的な兎ポリクローナル抗体を用いる競合的免疫 測定法によって測定し、加齢とともに Α |8 1—40が増加傾向にあることを開示してい る。また、グラノヽムポーノレら ίま、 A j8 1—40及び A j8 1—43に反応せず、 A j8 1—42 に特異的なモノクローナル抗体を作製し、該抗体が AD患者脳組織の線維アミロイド や血管アミロイド等のプラークを免疫組織染色しえることを開示して 、る（特許文献 2)
[0004] 脳脊髄液中の A β濃度を定量する二抗体 ELIS Α試薬は 2社から市販されて ヽるが 、これら ELISAによる定量値は相関しているものの、それぞれの定量値はかなり異な つている（非特許文献 10)。これら定量値が異なる理由としては、測定対象となる臨 床検体、測定に使用している抗体、測定法、測定法の感度、検量線に用いる A |8 1 —42の調整法の違い等が挙げることができる。
さらに、臨床検体が血漿や血清である場合、 A j8分子と相互作用する血漿や血清 中の干渉物質の存在が知られており、これらの物質をあら力じめ除去するか分離する 必要がある（非特許文献 11〜： L3)。し力しながら、血漿や血清を臨床検体に用いた 場合、これらの干渉物質の除去法、除去操作による測定誤差、希釈の影響、使用し て！、る抗体の力価、測定感度等が測定値に大きく影響することは容易に推測するこ とがでさる。
[0005] 脳脊髄液中の A βは、一般的測定手法、たとえば Α βに特異的に結合する抗体を 使用した、二抗体サンドイッチ測定法によって測定でき、特に Α |8 1—42の測定は臨 床的有用性も認められている（非特許文献 1, 3, 4, 7及び 15〜17)。しかし脳脊髄 液を検体とするのは、検体採取時の患者への身体的負担 ·身体機能損傷のリスクが 大きぐ実際上は脳脊髄液を検体として使用することは現実的ではない。
体外診断薬として最も一般的で、且つ身体的負担 'リスクが低い検体として、血液 検体 (血清又は血漿）が考えられる。しかし血清中での A |8測定は、これまで行われ てきた一般的測定手法、たとえば二抗体サンドイッチ測定法では血液中からはほとん ど検出されず、臨床的有用性も見出せな力つた (非特許文献 7)。これは、 A は脳 脊髄液中から、血中へと移行してくる A |8量が極めて微量である力 であると考えら れてきた。
このように AD患者の脳脊髄液中の A |81— 42量は、健常者に比較して低下傾向 にあるが、血中の Aj81— 42量についてはいまだに一定の認識はなされておらず、 ADの病理学的、診断学的研究にぉ 、て大きな課題となって!/、る。
特許文献 1： W094/17197
特許文献 2:W096Z25435
非特許文献 l:Tamaoka A, et al.， J. Neurol. Sci.1997; 148:41-45.
非特許文献 2:Andreasen N, et al.， Arch.Neurol.1999; 56:673-680.
非特許文献 3:Galasko D, et al, Arch. Neurol.1998; 55:937-945.
非特許文献 4:Motter R, et al., Ann Neurol 1995; 38:643-648.
非特許文献 5:Mayeux R, Ann. Neurol.1999; 46:412-416.
非特許文献 6:Mehta PD, Arch. Neurol.2000; 57;100- 105.
非特許文献 7:Tamaoka A, et al., J.Neurol. Sci.1996; 141:65-68.
非特許文献 8:Vanderstichele H, et al., Amyloid 2000; 7:245-258.
非特許文献 9:Fukumoto H, et al., Arch. Neurol 2003; 60:958-964.
非特許文献 10: Suzuki N, et al., Science 1994; 264:1336-1340.
非特許文献 ll:Chan W, et al., Biochemstry 1996; 35:7123-1230.
非特許文献 12:Biere Al,et al., J. Biol.Chem.1996271;32916-32922.
非特許文献 13:Kuo YM et al., Biocem Biophys Res Commun.2000, 268;750- 756. 非特許文献 14:難波 et al.、電気化学発光法（Electrochemiluminescence： ECL)によ る好感度免疫学的測定法の検討、日本臨床自動学会 (JJCLA)、 1996, Vol.21 No.5 非特許文献 15:Tero T, et al., Neurobiology of Aging 21 (2000) 735-740
非特許文献 16:Kanai M, et al., Ann Neurol 1998; 44:17-26. 非特許文献 17 : Schro"der J, et al.， Mol Psychiatry 1997; 2:505-7.
非特許文献 18 : Christopher C.T. Smith et al, Neuroscience Letters, 362(2004) 48-
50
非特許文献 19 : G. Zhu et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 24, 281-290(2000) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、 AD患者血中の A βの測定手法を 工夫することにより、アルツハイマー病の診断に応用することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を行った。本発明者らはまず、 高感度 ·広測定レンジ機能を有する電気化学発光法 (非特許文献 14)を利用する二 抗体サンドイッチ法を用いて、感度よく AD患者血清中 Α |8 1—42が測定できるかど うかを検討した。一次抗体として Α |8 1—42の C末端部分に特異性を有する抗体 21 F12 (イノジエネテイクス社製)を用い、第二抗体として A |8 1—42の 1—5アミノ酸部 位に特異的な抗体を使用して、 AD患者及び健常者血清中の A |8 1—42を測定した 。その結果、感度は従来法に比較してかなり優れていたが、 AD患者と健常者との血 清中の Α |8 1— 42量に有意差は認められなかった（下記実験例 1、 2及び図 4参照）
[0008] そこで本発明者らは、 Α β 1—42合成ペプチドの血清中での安定性を確認するた めに、 Α β 1—42合成ペプチドを血清と共存させたところ、経時的に Α |8 1—42含量 が低下していくことを確認した。また、 Α |8 1—42合成ペプチドを血清と共存させる際 に、血清中にプロテアーゼインヒビターをあら力じめ投入しておくと、時間経過による A |8 1— 42含量低下が起こらないことを確認した（下記実験例 3及び図 5参照)。この 事実は、 A |8が脳脊髄液や血液中などの生体液中で、速やかにプロテアーゼにより 分解 ·断片化していることを意味し、よって A |8は血中への移行量が微量であるから して測定できないのではなぐ血液中などで断片化されることにより全長 A |8 1 -42 の正確な測定は不可能となっていることが示唆された。
[0009] このことは、脳脊髄液力も血液に移行した A |8 1—42が、血中で短時間のうちに分 解されること、更に血清検体の保存中にも A |8 1— 42の分解が進むことを意味するも のであり、正確な測定が不可能であることの大きな原因であることが示唆された。これ すなわち、 Α |8 1— 42は血液中などで断片化するゆえ、二抗体サンドイッチ法では、 正確な Α β 1 42の測定はできな!、ことになる。
しかし、 Α |8 1—42は分解されて含量は低下してくるが、分解された Α |8 1—42断 片は存在することになる。そこで、蛋白分解酵素処理した A |8 1—42サンプルを 2種 の測定法、すなわち、 Α |8 1— 42の C末端部分を認識する抗体を用いた競合的免疫 測定法及び上記の電気化学発光二抗体サンドイッチ法で測定したところ、二抗体サ ンドイッチ法ではほとんど検出されな力つたが（下記実験例 4及び表 2参照）、競合的 免疫測定法では初期の Α β 1 42量に近 、値を示すことが確認された（下記実験例 5及び表 3参照)。すなわち、競合的免疫測定法によって A |8 1— 42と A |8 1— 42の C末端部を保有する A |8 1—42断片のトータル量 (以下このトータル量を、 A |8 χ— 4 2、と記す)を測定することにより、 A |8 1—42含量を正確に測定しえることを初めて見 出したものである。
[0010] 次いで、 AD患者と健常者血清中の A |8 X 42を測定した結果、両者の測定値に 有意差があり、 AD診断に利用しえる可能性があることを確認し、本発明を完成する に至った。
本発明の一つである競合的免疫測定法による ADの検定方法は、血漿や血清中の A |8 1— 42と相互作用する物質の除去操作が不要であり、且つ、 A |8 χ— 42を効率 よく検出できる優れた方法である。これまで、 Α |8 1—40を認識する抗体を用いる競 合的免疫測定法の報告はあるが（非特許文献 18)、本発明の A β 1 42の C末端部 分を認識する抗体を用いる免疫測定法に関する記載及びその効果についての報告 はなぐさらに、本発明の方法力 血中の Α |8 1—42含量を正確に反映するという優 れた効果を奏し、 AD診断に有用であることを、本発明者らが初めて見出したもので ある。
[0011] なお、 A |8 χ— 42を測定することにより AD診断に利用しえることを本発明者らが初 めて見出したものであるから、 Α β χ— 42の測定方法は上記の競合的免疫測定法に 限らず、例えば Α |8 1— 42C末端部に特異的な抗体を使用する表面プラズモン共鳴 法による検出（非特許文献 19)、 A |8 1—42C末端部に特異的な抗体を用いるァフィ 二テイク口マトグラフィにより Α β 1 42C末端部を保有するペプチドを分離して測定 する方法など、いずれも使用することが可能である。本発明の趣旨は A |8 χ— 42を測 定することにより、 AD診断に利用することにある。
[0012] 本発明は、 Α |8 1—42の C末端部位を認識する抗体によって、 A |8 χ— 42の測定 の有用性を確認したものであるが、同様に A |8 l—xを測定することの有用性につい ても確認を行った。 Α β 1ー とは八|8 1—40、 A |8 1— 37等、 Α |8の N末端部を保有 するさまざまな Α βアイソタイプの断片のトータル量を意味する。 Α βの Ν末端部位を 認識する抗体を本発明の競合測定法に使用することで、これら Α アイソタイプに関 して、タイプを限らず一括して測定することが可能である。具体的には、 A |8 1—5を 免疫して作製したモノクローナル抗体 3D6 (イノジエネテイクス社製)又は A β ΐ— 17 を免疫して作製したモノクローナル抗体 6E10 (ケミコン社製)を使用した競合的免疫 測定法で測定をおこなった。その結果、 AD患者と健常者血清の測定値において有 意差は認められなかった。このことは ADの診断における、血中 A j8 x— 42の断片を 特異的に測定することの重要性を示して 、る。
これらのことより、本発明は A j8 x— 42を測定することにより正確に血中 A j8 1 -42 量を反映し、さらに AD患者と健常者の血清検体間での臨床的有用性を証明したこと により、 ADの血液検体での診断を可能にしたものである。また、 A |8が原因の一つと なる疾患の診断にも利用できる可能性がある。
[0013] すなわち本発明のアルッノヽイマ一病の検定方法は、 j8—アミロイド 1—42の C末端 部に特異的な抗体を使用する免疫測定法により、生体試料検体中の、 β アミロイド 1—42と |8—アミロイド 1—42の C末端部を保有する |8—アミロイド 1—42断片のトー タル量を測定し、それによりアルッノ、イマ一病を検定することを特徴とする。
β—アミロイド 1—42の C末端部を保有する |8—アミロイド 1—42断片は、 β—アミ ロイド 1—42断片のうち、特に j8—アミロイド 1—42の C末端部を保有するペプチドで あり、好ましくは j8—アミロイド 1— 42C末端部から 1アミノ酸残基以上、好ましくは 2ァ ミノ酸残基以上、更に好ましくは 3アミノ酸残基以上を保有する |8—アミロイド 1—42 断片である。 13—アミロイド 1—42の C末端部を保有する |8—アミロイド 1—42断片は 、好ましくは、 Α |8 1—42の C末端部に特異的な抗体と結合することが望ましい。以下 では A |8 1—42C末端部保有ペプチドと記す場合があり、また、 β アミロイド 1—42 と Α β 1 42C末端部保有ペプチドを合わせて、 Α β χ 42と記す場合がある。
[0014] 前記免疫測定法が、競合的免疫測定法であることが好ま 、。この競合的免疫測 定法の手法は、例えば固相化した A |8 1— 42C末端部保有ペプチド又は固相化抗 体を使用する下記の 2種の手法により実施することができる。
競合的免疫測定法による本発明方法の第 1の例は、下記 (a)及び (b)の工程を含 むことを特徴とする。
(^A jS l— 42C末端部保有ペプチドを固相化した支持体と生体試料検体及び標識 物質で標識した抗体 (Α |8 1— 42の C末端部を認識する抗体)を反応させる工程、及 び
(b)洗浄後、固相化した A 1— 42C末端部保有ペプチドに結合した標識抗体量を 測定して、 A β χ— 42を定量する工程。
上記工程は、更に
(c)生態試料中の Α β χ— 42定量値を健常人の Α β χ— 42定量値と比較し、ァルツ ノ、イマ一病であるか否かを検定する工程、
を含んでも良い。
[0015] 競合的免疫測定法による本発明方法の第 2の例は、下記 (a)及び (b)の工程を含 むことを特徴とする。
(a) Α |8 1— 42の C末端部を認識する抗体を固相化した支持体と生体試料検体及び 標識物質で標識した Α 1— 42C末端部保有ペプチドを反応させる工程、及び
(b)洗浄後、固相化した抗体に結合した標識 A 1— 42C末端部保有ペプチド量を 測定して、 A β χ— 42を定量する工程。
上記工程は、更に
(c)生態試料中の Α β χ— 42定量値を健常人の Α β χ— 42定量値と比較し、ァルツ ノ、イマ一病であるか否かを検定する工程、
を含んでも良い。
標識する A |8 1—42C末端部保有ペプチドは、合成ペプチドそのものも使用できる 力 A |8 1—42C末端部保有ペプチドにキャリアー物質を結合させた Α |8 1—42C末 端部保有ペプチド複合体 (以下、ペプチド複合体と称す)も使用することができる。キ ャリア一物質とは、ルテニウム錯体などの標識物質を標識しえる化合物を意味し、ポリ リジン (poly-L-Lysine)、デキストラン、ゥシ血清アルブミン、遊離アミノ基を多く保有 するポリペプチド等が挙げられる。キャリアー物質は、前記抗体との結合性を損なわ なければ、前記ペプチドの何処の位置に付けても許される力 好ましくは N端部が望 ましい。
[0016] 本発明の ADの診断試薬 (キット）は、 Α β 1—42の C末端部を認識する抗体を必須 の構成成分とする、生体試料検体中の Α β χ— 42を測定する ADの診断試薬である 。該診断試薬は、採用する免疫測定方法により試薬の構成は異なるが、競合的免疫 測定法の場合、例えば固相化した A |8 1— 42C末端部保有ペプチド又は固相化した 抗体を使用する。固相化した A 1— 42C末端部保有ペプチドを使用する場合は標 識物質で標識した抗体を構成成分とし、固相化した抗体を使用する場合は標識物質 で標識した A 1—42C末端部保有ペプチドを構成成分とする。標識する A 1—4 2C末端部保有ペプチドは、キャリアー物質を結合させたペプチド複合体も使用する ことができる。キャリアー物質としてポリリジン、デキストラン、ゥシ血清アルブミン、遊離 アミノ基を多く保有するポリペプチド等が挙げられる。キャリアー物質は、前記抗体と の結合性を損なわなければ、前記ペプチドの何処の位置に付けても許される力 好 ましくは N端部が望ましい。
[0017] 本発明の検定方法及び試薬において、前記抗体として、ポリクローナル抗体又は モノクローナル抗体を用いることができる。また、前記抗体が、 A |8 1—42は認識する 力 A j8 1—40は認識しない抗体であることが好ましぐ β アミロイド 1 42の 33— 42アミノ酸部位を免疫原とし、 Α |8 1—42の C末端部分に特異性を有するマウスモノ クローナル抗体がより好ましい。具体的には、 2 ^12 (ィノジェネティクス社製）、八 5 078P (ケミコン社製）、 8G7 (ナノツール社製)などが挙げられる。
前記生体試料検体が血清又は血漿であることが好適である。
標識物質として、蛍光物質、酵素、色素、発光物質等挙げられるが、ルテニウム錯 体が好ま 、。固定ィ匕する支持体は磁気ビーズであることが好ま 、。 [0018] 本発明の 13—アミロイド 1—42の測定方法は、 13—アミロイド 1—42の C末端部に 特異的な抗体を使用する免疫測定法により、生体試料検体中の、 β アミロイド 1 42と |8—アミロイド 1—42の C末端部を保有する |8—アミロイド 1—42断片のトータル 量を測定することにより、生体試料検体中の )8—アミロイド 1—42含量を測定すること を特徴とする。前記生体試料検体が血清又は血漿であることが好適である。
発明の効果
[0019] 本発明は、 Α |8 1—42の C末端部分を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法 を用いて、生体試料中の A |8 χ— 42を測定することにより、 ADを診断することを可能 としたものである。本発明によれば、血漿や血清中の A |8 1— 42と相互作用する物質 の除去操作が不要であり、且つ、 A |8 χ— 42を正確に効率よく検出できる。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]本発明のアルッノヽイマ一病の検定方法の第 1の例を示す概略説明図である。
[図 2]本発明のアルツハイマー病の検定方法の第 2の例を示す概略説明図である。
[図 3]実験例 1の結果を示すグラフである。
[図 4]実験例 2の結果を示すグラフである。
[図 5]実験例 3の結果を示すグラフである。
[図 6]血中での Α β 1 42の代謝概念を示す概略説明図である。
[図 7]実験例 6及び 7の結果を示すグラフである。
[図 8]実施例 1の結果を示すグラフである。
[図 9]実施例 2の結果を示すグラフである。
[図 10]実施例 3の標準品による検量線を示すグラフである。
[図 11]実施例 3の結果を示すグラフである。
[図 12]実験例 8の標準品による検量線を示すグラフである。
[図 13]実験例 8の電気泳動の結果を示す写真である。
[図 14]実験例 9の 1回目の結果を示すチャートである。
[図 15]実施例 9の 1回目の結果を示すグラフである。
[図 16]実験例 9で得られた検量線を示すグラフである。
[図 17]実験例 9の 2回目の結果を示すチャートである。 [図 18]実験例 10の結果を示すチャートである。
符号の説明
[0021] 10, 20 :支持体、磁気ビーズ、 12, 24： A j8 1—42合成ペプチド、 13 :A j8 1 42合 成ペプチド結合支持体、 A |8 1— 42合成ペプチド結合磁気ビーズ、 14, 22 :Α |8 1 —42の C末端に特異的な抗体、 16, 26 :標識物質、 17 :標識抗体、 23 :Α β 1—42 抗体結合支持体、 A |8 1— 42抗体結合磁気ビーズ、 27 :標識 Α |8 1— 42合成ぺプ チド、 30：生体試料検体中の A |8 χ— 42、 32 :反応容器、 34 :反応液、 40 :標識物質 の発光。
発明の実施するための最良の形態
[0022] 以下に本発明の実施の形態を説明するが、本発明の技術思想カゝら逸脱しない限り 種々の変形が可能であることは 、うまでもな 、。
[0023] 本発明のアルッノヽイマ一病の検定方法は、 Α β 1 42の C末端部に特異的な抗体 を使用する免疫測定法により、生体試料検体中の、 Α |8 1— 42と Α |8 1— 42の C末 端部を保有する Α |8 1—42断片のトータル量 (Α |8 χ— 42)を測定することにより、ァ ルツハイマー病の罹患の有無を検定するものである。
[0024] 本発明方法に用いられる免疫測定法としては、生体試料中の Α β χ— 42を測定す ることができる方法であれば特に限定されず、例えば、競合的免疫測定法、表面ブラ ズモン共鳴法による検出（非特許文献 19)、ァフィ-テイク口マトグラフィにより A |8 1 42C末端部を保有するペプチドを分離して測定する方法等、 Vヽずれも使用するこ とが可能であるが、競合的免疫測定法を用いることが好ましい。
前記生体試料検体は、例えば、血清、血漿、脳脊髄液、骨髄液、組織及び細胞抽 出物、細胞培養液などが含まれる力 好ましくは血清、血漿である。
[0025] 本発明で用いられる前記抗体は、 A |8 1—42の C末端部分を特異的に認識する抗 体であればモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体いずれも使用することが可能 である。好ましくは、 A |8 1—42に反応する力 A |8 1—40に反応しない抗体が好ま しぐ市販品としては、例えば、 Α |8 1—42の 33— 42アミノ酸部位を免疫原とし、 A |8 1—42の C末端部分に特異性を有するマウスモノクローナル抗体 21F12 (イノジエネ テイクス社製）、 AB5078P (ケミコン社製）、 8G7 (ナノツール社製)などが挙げられ、 好ましくは 2 IF 12である。 A |8 1—40に反応しない抗体とは、弱い反応性があっても A |8 1—42C末端部トータル量の測定に実質的に影響しない抗体も含まれる。また、 A |8 1—43に反応性を有していても差し支えない。
[0026] 本発明に使用する前記抗体は、常法により調製することができる。
モノクローナル抗体の調製は、 A 1—42の C末端部を保有するペプチドを抗原と して、必要に応じてキャリアー蛋白質との複合体を作り、これを動物に接種して免疫 する。上記免疫動物の脾臓ある 、はリンパ節カゝら得られた抗体産生細胞を骨髄腫細 胞と融合し、 Α |8 1—42の C末端部に強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドー マを選択することにより調製される。その操作は従来既知の方法に準ずればよい。
[0027] 免疫抗原は Α |8 1—42も使用できるが、 目的の抗体が A 1—42の C末端部に特 異性を有する抗体であるので、 A |8 1— 42の C末端部を保有するペプチド、例えば、 A 33— 42など適宜選択することができる。通常、キャリアー蛋白質との複合体を抗 原として使用するが、その調製は種々の縮合剤、例えばダルタルアルデヒド、カルボ ジイミド、マレイミド活性エステル等が使用される。キャリアー蛋白質はゥシ血清アルブ ミン、サイログロブリン、へモシァニン等を使用し、通常 1〜5倍量の割合でカップリン グさせる方法が用いられる。
[0028] 免疫される動物としてはマウス、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、筋肉 あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては、完全フロイントアジュバンドゃ不完 全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよぐ投与は通常 2〜5週毎に 1回ずつ 行われる。免疫された動物の脾臓ある 、はリンパ節カゝら得られた抗体産生細胞は骨 髄腫細胞と細胞融合させられ、ハイプリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としては マウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであるこ とが好ま 、が、異種間にお 、ても可能な場合もある。
[0029] 細胞融合の操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Nature, 256,
495-497(1975))に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコールや センダイウィルスなどが挙げられ、通常 20〜50%程度の濃度のポリエチレングリコー ル（平均分子量 1000〜4000)を用いて 20〜40。C、好ましくは 30〜37。Cの温度下 、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常 1： 1〜10程度、約 1〜10分間程度反 応させることにより細胞融合を実施することができる。
[0030] A β 1 42の C末端部に特異性を有する抗体を産生するハイプリドーマのスクリー ユングは、種々の免疫化学的方法が使用できる。例えば、 ELISA法、ウェスタンブロ ット法、競合法等があげられる。また、 Α |8 1— 42ペプチド及び A |8 1— 40ペプチドを 使用することにより、 A |8 1— 42に反応し Α |8 1— 40に反応しない抗体を選択するこ とがでさる。
[0031] このように選択されたゥエル力 更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行 い、目的とするクローンを得ることができる。ハイプリドーマの選択、育種は、通常 ΗΑ Τ (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加して、 10〜20%ゥシ胎児血清を 含む動物細胞用培地（例、 RPMI1640)で行われる。このようにして得られたクロー ンは、あら力じめブリスタンを投与した BALBZCマウスの腹腔内へ移植し、 10〜14 日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とするこ とができる。また、該クローンを培養し、その培養液を抗体精製の原料とすることもで きる。モノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用 いればよぐ例えば、硫安分画法、 PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体 の利用、さらにァフィ二テイク口マトグラフィなどの手段により達成することができる。
[0032] ポリクローナル抗体も常法により調製することができる。抗原は A β 1—42の C末端 部を主な構成とするペプチドを採用し、前記と同様な手法により、複合体としてゥサギ 、モルモットなどの動物に免疫して調製することができる。適宜採決して抗体力価を 測定し、高力価の血清を抗体の精製原料として、前記の手法により精製することによ りポリクローナル抗体を得ることができる。
[0033] 以下に、本発明のアルツハイマー病の検定方法について、免疫測定法として競合 的免疫測定法を用いた場合を例に説明する。
競合的免疫測定法を用いた本発明方法について説明する。本発明方法に用いら れる競合的免疫測定法（competitive immunological assay)は、 A j8 1—42のじ末端 部分に特異的な抗体と A j8合成ペプチドを用いた、血液検体等、生体試料検体中 の A β 1 42C末端部を保有する Α β 1 42ペプチドと Α β合成ペプチドの抗体へ の競合結合反応を反応基盤とする競合的免疫測定法である。 [0034] 本発明方法において、使用する A |8合成ペプチドは、 A |8 1—42の C末端部を認 識する抗体と反応するペプチドであればいずれも使用可能であり、具体的には、 A |8 1—42の C末端部を保有するペプチドを使用することができる。該 Α |8 1— 42C末端 部保有ペプチドとしては、全長 Α |8 1—42のみならず、例えば、 Α |8 33— 42や Α |8 1 7— 42などの合成ペプチドなどを使用することができ、特に限定されない。前記ぺプ チドは、固相合成法など常法に従い合成することができる。以下、 Α |8合成ペプチド として、 A j8 1—42合成ペプチドを使用した場合を例に具体的に説明する。
[0035] 図 1は、本発明のアルツハイマー病の検定方法の第 1の例を示す概略説明図であ り、免疫測定法として、 A 1— 42C末端部保有ペプチドを支持体に固相化した競合 的免疫測定法を用いた場合の例である。
図 1において、 10は支持体、 12は A |8 1— 42合成ペプチド、 32は反応容器 (反応 カップ）、 34は反応液 (例えば、緩衝液等)である。図 1 (a)に示した如ぐ Α |8 1—42 合成ペプチド 12を支持体 10に結合させ（固相化）、 A |8 1—42合成ペプチド結合支 持体 13を調製する。
[0036] 前記支持体 10の材料としては、例えば、ガラス、ブラスティック (例えば、ポリスチレ ン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、金属などが挙げられる。支持体の 形状は、カップ型、平板、粒子など、特に限定されない。前記支持体 10は、好ましく はマグネティックマイクロビーズ (磁気ビーズ)である。
A |8合成ペプチドを支持体に固相化する方法は、常法に準ずればよい。支持体と して磁気ビーズを使用する場合、該ビーズと A |8 1—42合成ペプチドを緩衝液中で 反応させた後、磁気ビーズをブロッキング剤で処理した後、ブロッキング剤下で保存 することが好ましい。以下、支持体として磁気ビーズを用いた場合を例に説明する。
[0037] 前記調製した A β 1—42合成ペプチド結合磁気ビーズ 13に対し、 Α β 1— 42の C 末端部に特異的な抗体 14を標識物質 16で標識した抗体 17 (以下、標識抗体と称す る）と生体試料検体とを共に混合し、磁気ビーズに結合した A 1—42合成ペプチド 12と検体中の A |8 1—42及び A |8 1—42C端部を保有する断片 30とを標識抗体 17 と競合反応させ、競合的に結合させる [図 l (b) ]。
[0038] 本発明に使用する標識物質 16は、酵素、発光物質、蛍光物質、同位元素など特 に限定されず、好ましくはルテニウム錯体である。
標識抗体の調製方法は常法に準ずる。例えば、抗体とルテニウム錯体 (IGEN社製 、 ORIGEN TAG-NHS ESTER)を緩衝液中、反応させた後、 2Mグリシンを加えてさら に反応させる。次いで、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより標識抗体を精製する こと〖こより調製できる。
[0039] 前記競合反応後、反応液を吸 、取り、磁気ビーズを洗浄することで磁気ビーズと結 合していない遊離の反応液中物質を除去する (BF分離)。
次いで、磁気ビーズに結合している標識物質を測定する。標識物質の測定方法は 常法に準ずる。例えば、標識物質としてルテニウム錯体を用いた場合、図 1 (c)に示 した如ぐ磁気ビーズに結合して 、るルテニウム錯体標識抗体をトリブトピルアミン存 在下で電気エネルギーをカ卩えることで発光させ、ルテニウム錯体発光 40の強度を測 定する (非特許文献 14)。
[0040] この際、検体中の A β χ— 42が多ければ、競合反応により標識抗体のビーズ結合 ペプチドへの結合量は低下するので、競合物質の無!、場合の発光強度に比較して 発光強度は低下する。この発光強度の低下度合 、（下記実施例では阻害率 (％)とし て表示）により、検体中の A |8 χ— 42を定量することができる。アルッノヽイマ一病患者 の検体中、特に血中の A |8 X— 42量は健常人の検体に比べて著しく減少しているた め、本発明方法により検体中の A |8 χ— 42を測定することにより、アルツハイマー病 の検定が可能である。
[0041] 図 2は、本発明のアルツハイマー病の検定方法の第 2の例を示す概略説明図であ り、免疫測定法として、 A |8 1— 42の C末端部を特異的に認識する抗体を支持体に 固相化した競合的免疫測定法を用いた場合の例である。
図 2において、 20は支持体、 22は A |8 1— 42の C末端部を特異的に認識する抗体 である。図 2 (a)に示した如ぐ前記 Α |8 1—42抗体 22を磁気ビーズ等の支持体 20 に結合させ（固相化)、 A j8 1— 42抗体結合支持体 23を調製する。抗体の支持体へ の固相化の手法は、常法に準ずればよい。以下、支持体として磁気ビーズを用いた 場合を例に説明する。
[0042] 前記調製した抗体結合磁気ビーズに、 A 1—42合成ペプチド 24を標識物質 26 で標識した標識 A j8 1—42合成ペプチドと生体試料検体とを共に混合し、競合反応 させ、競合的に結合させる [図 2 (b) ]。
競合反応後は、前記第 1の例と同様の操作を行い、磁気ビーズに結合した標識物 質を測定し [図 2 (c) ]、検体中の A β χ— 42を定量することができる。
[0043] 前記標識する Α β 1 42合成ペプチドは、そのものの使用も可能である力 Α β ΐ —42にキャリアー物質を結合させたペプチド複合体を使用することもできる。キャリア 一物質とは、標識物質が結合しえる化合物を意味し、例えば、ポリリジン (poly-L-Lys ine)、デキストラン、ゥシ血清アルブミン、遊離アミノ基を多く保有するポリペプチドな どが挙げられ、好ましくはポリリジンである。キャリアー物質を使用することにより A |8 1 —42ペプチド当たりの標識物質の量を増加させることができ、感度の上昇が期待さ れるのでこれらペプチド複合体を使用することが好ましい。
[0044] 標識したペプチド複合体は、標識物質で標識したキャリアー物質と A β 1—42合成 ペプチドを、例えば架橋剤等を介して結合させることによりできる。この際、必要に応 じて、前もって A j8 1—42の Ν端部にスぺーサ一、例えば 15個のリジン力もなるリジン ペプチドなどを結合させておくことも自由である。また、ペプチド複合体を作製した後 に、標識物質で標識することも可能であり、いずれの手法も自由に採用でき、限定さ れるものではない。
[0045] 本発明の免疫測定法に基づく診断試薬 (キット）は、 Α β 1—42の C末端部分に特 異性を有する抗体を必須の構成成分とし、さらに Α β 1 42C末端部保有合成ぺプ チドを構成成分とする。
採用する免疫測定法により試薬の構成成分の形態は適宜設計すればよ!、。例え ば、競合的免疫測定法においては、前述した如ぐ A |8 1— 42C末端部保有合成べ プチドを固相化した支持体 (好ましくは、磁気ビーズ)と標識抗体を構成成分とするか 、又は抗体を固相化した支持体 (好ましくは、磁気ビーズ)と標識した A |8 1— 42C末 端部保有合成ペプチドを構成成分とすることが好ましい。標識した A |8 1— 42C末端 部保有合成ペプチドは、前記本発明方法の第 2の例の項で記載したように、 A |8 1— 42C末端部保有ペプチドにキャリアー物質を結合させたペプチド複合体を構成成分 とすることが好ましい。 なお、反応に使用する緩衝液、測定器具などを試薬に添付することは自由である。 実施例
[0046] 以下に実施例に基づき本発明を具体的に説明する力 本発明はその要旨を超え な 、限り以下の実施例に限定されるものではな 、。
[0047] (実験例 1及び 2)電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法
実験例 1及び 2は、 A j8に特異的な抗体 2種類を用いた電気化学発光二抗体サン ドイッチ測定法による分析である。一次抗体として A |8 1—42の 33— 42アミノ酸部位 をマウスに免疫して作製した A β 1—42特異反応抗体である 21F12マウスモノクロ一 ナル抗体 (イノジエネテイクス社製)を使用し、二次抗体として Α |8 1—42の 1—5ァミノ 酸部位をマウスに免疫して作製した 3D6マウスモノクローナル抗体 (イノジエネテイク ス社製)をルテニウム錯体標識して使用した。
[0048] 以下に試薬の各構成成分の調製方法について記す。
( 1) 21F12抗体結合磁気ビーズの調製方法
21F12マウスモノクローナル抗体を 10mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7. 8)で lmgZmL抗体濃度に希釈し、この抗体 0. 5mLを、 30mgZmLの磁気ビーズ（DY NAL社製、 DYNABEADS M- 450 Epoxy) 0. 5mLと混合した。混合液を 25°C、 16時 間攪拌し、磁気ビーズと抗体を結合させた。その後、この磁気ビーズ溶液より溶液の みを抜き取ることで、溶液中に残存して 、た磁気ビーズ未結合の遊離抗体を除去し た。次にブロッキング剤として lmLの 4%ブロックエース試薬 (大日本製薬社製)を抗 体結合磁気ビーズに加え、 25°C、 3時間攪拌した。その後、前述の 4%ブロックエー ス試薬 10mLで磁気ビーズを洗浄（2mLの 4%ブロックエース Z5回洗浄）した。洗浄 後の 21F12抗体結合磁気ビーズは前述の 4%ブロックエース試薬 0. 5mLと混合し 、使用時まで 4°Cで保存した。
[0049] (2)ルテニウム錯体標識 3D6抗体の調製方法
3D6マウスモノクローナル抗体 (イノジエネテイクス社製）を lOmmolZLリン酸力リウ ム緩衝液 (PH7. 8)で lmgZmL抗体濃度に希釈した。 lmgZmL抗体 0. 5mLに 1 OmgZmLのルテニウム錯体（IGEN社製、 ORIGEN TAG- NHS ESTER)を 17. 6 μ Lカロえ、 25°C、 30分間攪拌した。その後、 2mol/Lグリシンを 30 L添カ卩し、 25°C、 30分間攪拌した。
次いで、直径 lcm、高さ 30cmのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィ 一（アマシャム'バイオサイエンス社製、 sephadexG-25)にルテニウム錯体標識抗体 液をアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識抗体を単離精製した 。溶出は 10mmol/Lリン酸カリウム緩衝液 (pH6. 0)にて行った。
[0050] (実験例 1) A |8 1— 42合成ペプチドの測定
500 L容ポリスチレンカップ (以下、反応カップと記述）に 150 Lの反応用溶液 [ 50mmol/L Tris HCl, 1%BSA, 0.15mol/L NaCl, 0.01%(W/V) Tween20, lOmmol/L ED TA2Na, 0.1%正常マウス血清， pH7.5] (以下、サンドイッチ測定反応用溶液と記述）を 入れた物を 7つ用意し、その各反応カップに A |8 1— 42合成ペプチドをサンドイッチ 測定反応用溶液で 0、 0. 5、 1、 5、 10、 25、 50又は 100pg/mLに希釈したサンプ ルをそれぞれ 50 Lずつ混合した。そこにサンドイッチ測定反応用溶液で 2mg/m L濃度に希釈した 21F12抗体結合磁気ビーズを 25 Lずつ添カ卩し、 30°Cで 9分間 反応させた (第一反応)。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップしてお 、て力も反応カップ中の液体を抜き取り 、洗浄液 [50mmol/L Tris HCL, 0.01%(W/V) tween20, 0.15mol/L NaCl, pH7.5] 350 μ Lで 2回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ BF分離)。
[0051] 次にサンドイッチ測定反応用溶液で 4 μ gZmL濃度に希釈したルテニウム錯体標 識 3D6抗体を 200 L加えて 30°Cで 9分間反応させた (第二反応)。反応後の磁気 ビーズを磁石でトラップしてお 、て力も反応カップ中の液体を抜き取り、洗浄液 350 μ Lで 2回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ BF分離)。
[0052] その後、反応カップに 300 μ Lのトリプトピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。
この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を 検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定操作以降は、 ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミ 8220 (三光純薬 (株)製)上で行った 。結果を表 1及び図 3に示す。なお、図 3は、ルテニウム錯体発光強度測定値カゝら A ι8 1—42合成ペプチド濃度 0の時の測定値を差引いた値を ECL値として示した。
[0053] [表 1] 実験例 1の測定結果
Figure imgf000020_0001
ECL値：ルテニウム錯体発光強度測定値
ブランク差引値: ECL値 サンプル濃度 0の時の ECL
[0054] 表 1及び図 3に示した如ぐ電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法では、 A3 1— 42合成ペプチドを 0. 5pgZmLまで測定可能な測定系であった。これまでに一般的 に知られている A |8 1— 42サンドイッチ測定試薬の内、もっとも感度の高い部類の試 薬と比較しても 10倍以上の感度が得られる測定系であった。
[0055] (実験例 2) AD患者及び健常人血清の電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法によ る測定
反応カップに 150 a Lのサンドイッチ測定反応用溶液を入れた物を必要量用意し、 その各反応カップに A 0 1—42合成ペプチドをサンドイッチ測定反応用溶液で 0、 0 . 5、 1、 5、 10、 25、 50又は 100pg/mLに希釈したサンプル (検量線作成用標準品 )、 AD患者血清検体 25例、及び健常人血清検体 25例をそれぞれ 50 Lずつ混合 した。そこにサンドイッチ測定反応用溶液で 2mgZmL濃度に希釈した 2 IF 12抗体 結合磁気ビーズを 25 IX Lずつ添加し、 30°Cで 9分間反応させた (第一反応)。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップしてお 、てから反応カップ中の液体を抜き取り 、洗浄液 [50mmol/L Tris HCL, 0.01%(W/V) tween20, 0.15mol/L NaCl, pH7.5] 350 Lで 2回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ BF分離)。
[0056] 次にサンドイッチ測定反応用溶液で 4 μ gZmL濃度に希釈したルテニウム錯体標 識 3D6抗体を 200 μ L加えて 30°Cで 9分間反応させた (第二反応)。
反応後の磁気ビーズを磁石でトラップしておいて力 反応カップ中の液体を抜き取 り、洗浄液 350 Lで 2回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物 質を除去した (BF分離)。
[0057] その後、反応カップに 300 μ Lのトリプトピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。
この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を 検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定操作以降は、 ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミ 8220 (三光純薬 (株)製)上で行った 。標準品 Α |8 1—42合成ペプチドの測定結果より検量線を作成し、該検量線を用い て AD患者及び健常者の Α |8 1—42濃度を算出した。結果を図 4に示す。
[0058] 図 4に示した如ぐ AD患者では 25例中 8例、健常人では 25例中 3例が測定最低 感度である 0. 5pgZmL以上の値であり、残りの検体はいずれも測定感度以下の結 果であった。また、測定可能であった検体の t検定により、 ADと健常人の二群の間に は有意差はないと判定された (p >0. 05)。
[0059] (実験例 3)血清による A β 1 42の断片化実験
lmLの健常人血清を 0. 5mLずつに小分けして、一方にはプロテアーゼ溶液 [プロ テアーゼインヒビターカクテル（Roche社製、 complete mini) 1錠を lmLの緩衝液（10m mol/L Tris HC1, pH7.5)に溶解した溶液]を 10 L混合した（実験例 3— 1)。他方の 血清には対照として緩衝液（10mmol/L Tris HC1, pH7.5)を 10 L混合した（実験例 3— 2)。
それぞれの血清に lOOOngZmLの A β 1 42合成ペプチド（（株）ペプチド研究 所製)を 5 L添加した。各物質を添加した血清は、 20°Cで静置し、経時的に前述の 電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法で、時間経過による添加 A |8 1—42合成べ プチドの測定値変化を測定した。
[0060] 図 5は、血清への A β 1—42合成ペプチド添カ卩直後の測定値を 100%としたときの 、時間経過による測定値の変化率を相対比で表示したグラフである。図 5に示した如 ぐ対照である実験例 3— 2に比べて、実験例 3— 1のプロテアーゼインヒビターを加 えてから Α |8 1— 42合成ペプチドを添加した血清の方が、明らかに時間経過による 測定値の低下を抑えられると 、う結果が得られた。よって血清中にぉ 、て生体内 Α β 1 42も、血中プロテアーゼによって速やかに断片化されていることが示唆された。 図 6は血中での Α |8 1—42の代謝概念図を示す概略説明図であり、（a)は Α |8 1— 42のアミノ酸配列（配列番号 1)を示し、 (b)は血中の A β 1—42の代謝を示す。 Α β 1—42は脳内で発現し、脳髄液 (CSF)に移行する。その後、血中に漏出された Α |8 1—42は、血中のプロテアーゼにて速やかに断片化される。
[0061] (実験例 4及び 5)
電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法 (実験例 4)、及び抗原 (A j8 1— 42合成 ペプチド)を固相化した競合的免疫測定法 (実験例 5)により、 A 1— 42合成べプチ ドの酵素分解物の測定を行った。
(a)各サンプルの調製方法
酵素処理サンプルとして、 lOmmolZLリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 8)で 10 gZ mLに調製した A β 1—42合成ペプチド（ (株)ペプチド研究所製） 20 μ Lに、 10mm olZLリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 8)で lmgZmLに調製したトリプシン（SIGMA社 製、 1 : 250トリプシン)を 5 L添加し、サンプルを調製した。また、対照サンプルとし て、同一濃度の A |8 1—42合成ペプチド（(株)ペプチド研究所製） 20 /z Lに lOmmo 1ZLリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 8)を 5 L添加したサンプルを用意した。さらに、ブ ランクサンプルとして、 A j8 1—42合成ペプチド無添カ卩の lOmmolZLリン酸カリウム 緩衝液 (PH7. 8)を用いた。
[0062] (b)A |8 1 42合成ペプチドの酵素分解物の測定
それぞれのサンプルを 30分保温後、実験例 1と同様の電気化学発光二抗体サンド イッチ測定法 (実験例 4)、および下記に示す競合的免疫測定法 (実験例 5)で測定し た。
実験例 5の競合的免疫測定法の手順を以下に示す。
[0063] (1)試薬の各構成成分の調製方法
(1 1) A 1—42合成ペプチド結合磁気ビーズの調製方法 50ngZmLの A j8 1—42合成ペプチド（（株）ペプチド研究所製） 0. 3mLを、 30m gZmLの磁気ビーズ（DYNAL社製、 DYNABEADS M- 450 Epoxy) 0. 3mLと混合 した。混合液を 25°C、 16時間攪拌し、磁気ビーズと合成ペプチドを結合させた。その 後、この磁気ビーズ溶液より溶液のみを抜き取ることで、溶液中に残存していたビー ズ未結合の遊離合成ペプチドを除去した。次にブロッキング剤として lmLのリン脂質 ポリマー試薬（日本油脂社製、 S101E)をペプチド結合磁気ビーズに加え、 25°C、 3 時間攪拌した。その後、前述の 10mLのリン脂質ポリマー試薬で磁気ビーズを洗浄（ 2mLリン脂質ポリマー Z5回洗浄)した。洗浄後の Α |8 1—42合成ペプチド結合磁気 ビーズは前述のリン脂質ポリマー試薬 0. 3mLと混合し、使用時まで 4°Cで保存した。
[0064] (1 - 2)ルテニウム錯体標識 21F12抗体の調製方法
Α β ΐ— 42の C末端部に特異的な抗体である 2 IF 12マウスモノクローナル抗体 (ィ ノジヱネテイクス社）を lOmmolZLリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 8)で lmgZmL抗体 濃度に希釈した。 lmgZmL抗体 0. 5mLに lOmgZmLのルテニウム錯体（IGEN 社製、 ORIGEN TAG-NHS ESTER)を 17. 6 μ Lカロえ、 25。C、 30分間攪拌した。その 後、 2mol/Lグリシンを 30 L添カロし、 25°C、 30分間攪拌した。
次に、直径 lcm、高さ 30cmのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー (アマシャム'バイオサイエンス社製、 sephadexG-25)にルテニウム錯体標識抗体液を アプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識抗体を単離精製した。溶 出は 10mmol/Lリン酸カリウム緩衝液 (pH6. 0)にて行った。
[0065] (2)サンプル中の A j8 x— 42の測定方法
反応カップに 50 μ Lの反応用溶液 [50mmol/L Tris HC1, 10% BSA, 0.15mol/L NaC 1, 0.01%(W/V) Tween20, lOmmol/L EDTA2Na, 0.1%正常マウス血清， pH7.5]を入れ たものを必要量用意した。そこに Α β 1 42合成ペプチドの酵素処理サンプル及び 対照サンプルをそれぞれ 50 L混合した。そこに反応用溶液で 1. 5mgZmL濃度 に希釈した A |8 1—42合成ペプチド結合磁気ビーズを 25 L添加し、更に反応用溶 液で 0. 1 μ gZmL濃度に希釈したルテニウム錯体標識 21F12マウスモノクローナル 抗体 (以下、標識抗体と記述）を 200 L添加した。 30°Cで 26分攪拌し、サンプル中 の Α β 1 42及び A j8 1— 42断片と、磁気ビーズ結合 A j8 1—42合成ペプチドにル テ-ゥム錯体標識 2 IF 12マウスモノクローナル抗体を競合反応させた。
[0066] その後、磁気ビーズを磁石でトラップしておいて力 反応カップ中の液体を抜き取り 、洗浄液 [50mmol/L Tris HC1, 0.01%(W/V) tween20, 0.15mol/L NaCl, pH7.5] 350 Lで 2回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ BF分離)。その後、反応カップに 300 i Lのトリプトピノレアミンを入れ、ビーズと混合し た。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強 度を検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定操作以降 は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミ 8220 (三光純薬 (株)製)上で行 つ 7こ。
[0067] (c)結果
実験例 4の電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法による測定結果を表 2に示し、 実験例 5の競合的免疫測定法による測定結果を表 3に示す。表中、 "ECL値"はルテ 二ゥム錯体発光強度測定値であり、 "％ "は対照サンプルの測定値を 100%としたとき の測定値の相対比を示したものである。また、表 3において、サンプル中に競合物質 なしの時の値 (ブランク値)を 100%としたときの競合反応による測定値低下の相対比 を阻害率として表示した。
[0068] [表 2] 実験例 4 (電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法） の測定結果
Figure imgf000024_0001
[0069] [表 3] 実験例 5 (競合的免疫測定法） の測定結果
Figure imgf000024_0002
[0070] 表 2に示した如ぐ二抗体サンドイッチ測定法では、トリプシン処理した A 1 合成ペプチドは、トリプシン処理しなかった対照サンプルに対して 1Z10量しか A |8 1 —42を検出できな力つた。しかし、表 3に示した如ぐ同一サンプルを競合的免疫測 定法で測定した結果、トリプシン処理しなかった対照サンプルとほぼ同一の競合反応 が見られ、断片化した A |8 1— 42であっても全長 A |8 1— 42と同様に測定可能であ ることが証明された。すなわち、競合的免疫測定法はサンプル中の断片化した A 1 —42量も正確に反映して 、ることが確認された。
[0071] (実験例 6及び 7)抗体 21F12の特性試験
lOmmolZLリン酸カリウム緩衝液（pH7. 8)でそれぞれ 0 (ブランク）、 10、 100、 1 000又は lOOOOngZmLに調製した A β 1—42合成ペプチド（（株）ペプチド研究所 製）（実験例 6)及び A j8 1— 40合成ペプチド（(株)ペプチド研究所製）（実験例 7)を 競合的免疫測定法で測定した。競合的免疫測定は実験例 5に記載の手順で行った 。結果を図 7に示す。なお、図 7のグラフ中の阻害率は、サンプル中に競合物質なし の時の値 (ブランク値)を 100%としたときの競合反応による測定値低下を相対比で 3¾ ヽ /こ。
[0072] 結果は図 7に示した如ぐ実験例 6の A β 1 42合成ペプチドは濃度の増加に伴つ て競合反応が増加したのに対して、実験例 7の Α |8 1—40合成ペプチドは濃度が増 カロしても競合反応は生じな力つた。したがって、本発明の競合的免疫測定法に使用 した抗体 21F12は、 Α |8 1—42に特異的に反応する抗体であり、 A |8 1—40にはほ ぼ反応しな 、抗体であることが判明した。
[0073] (実施例 1)AD患者及び健常人血清の競合的免疫測定法での測定
反応カップに 50 Lの反応用溶液を入れたものを必要量用意した。そこに検体とし て AD患者血清 25例、健常人血清 15例及び反応用溶液 (ブランク）をそれぞれ 50 μ L混合した。そこに反応用溶液で 1. 5mgZmL濃度に希釈した Α |8 1—42合成ぺプ チド結合磁気ビーズを 25 L添加し、実験例 5に記載の手順に従い競合的免疫測 定法により測定した。結果を図 8に示す。
[0074] 測定の結果、得られた検体ごとの発光強度は、検体中 Α β χ 42が多ければ、競 合反応によりルテニウム錯体標識抗体の磁気ビーズ結合ペプチドへの結合量は低 下するので、競合物質の無い検体として反応用溶液を使用した場合の発光強度に 比較して発光強度は低下する。
得られた発光強度は以下の計算式により阻害率に換算した。
阻害率 (％) = [1 各検体の発光強度 ÷反応用溶液を検体としたときの発光強度 ( 競合反応なしの時の発光強度） ] X 100
その結果は図 8に示した如ぐ t検定において AD患者と健常人の二群の間には 95 %以上の確率で有意差があると判定された (p< 0. 0002)。
[0075] (実施例 2)ポリクローナル抗体を使用する競合的免疫測定
ルテニウム錯体標識 21F12抗体の代わりに A |8 1—42の C末端部分に特異的に 反応するポリクローナル抗体 AB5078P (ケミコン社製)をルテニウム錯体で標識した ルテニウム錯体標識 AB5078P抗体を用いた以外は実施例 1と同手法の競合的免 疫測定法により、 AD患者 20例及び健常人 18例の血清検体を測定した。結果を図 9 に示す。
その結果、実施例 1と同様、 t検定において AD患者と健常人の二群の間には 95% 以上の確率で有意差があると判定された (pく 0. 0002)。この結果から、 A |8 1 -42 の C末端部に特異的な抗体であれば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体 いずれも使用することができることが判明した。
[0076] (実施例 3)抗体を固相化した競合的免疫測定法
(a)試薬の各構成成分の調製方法
(1)ルテニウム錯体標識された A 1—42C末端部保有ペプチドの調製方法
(1— 1)チオール化 SPDP結合ルテニウム錯体標識ポリリジンの調製
2. 5mlのポリリジン（poly-L-Lysine、平均分子量： 38000、シグマ社製）を 2mLリン 酸バッファー（pH7. 8)に溶解させ、そこに 450 μ Lの 10mg/mLルテニウム錯体（I GEN社製、 ORIGEN TAG- NHS ESTER)を加え、 25°Cで 60分間混合させた。混合 物に 200 /z Lの 2molZLグリシンを加え、 25°Cで 30分間混合させた。混合物を直径 2cm、高さ 40cmのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（アマシャム 'バイオサイエンス社、 Sephadex G- 25)にアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテ ユウム錯体標識ポリリジンを単離精製した。溶出は lOmmolZLリン酸カリウム緩衝液 (pH6. 0)にて行った。 [0077] このルテニウム錯体標識ポリリジン 2mgZmLに 20mmolZLのタンパク質架橋剤（ ピアス社製、 SPDP)を 8. 混合させ、窒素ガスを吹きかけながら 25°C、 1時間攪 拌した。攪拌後、直径 2cm、高さ 40cmのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマト グラフィー（アマシャム'バイオサイエンス社製、 Sephadex G- 25)にアプライし、未結合 SPDPと SPDP結合ルテニウム錯体標識ポリリジンを単離精製した。溶出は lmmol /Lのエチレンジァミン四酢酸 2ナトリウムを含む 10mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（ pH7. 5)にて行った。
[0078] この SPDP結合ルテニウム錯体標識ポリリジンに ImolZLのジチオトレイトールと 1 mmol/Lのエチレンジァミン四酢酸 2ナトリウムを含む 10mmol/Lリン酸カリウム緩 衝液 (PH7. 5)を 55 /z Lカロえ、窒素ガスを吹きかけながら 25°C、 30分間攪拌すること で SPDPの 2—ピリジル一ジスルフイド基をチオールィ匕した。攪拌後、直径 lcm、高さ 30cmのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー (バイオラッド社製、 Bio -Gel P-4)にアプライし、ジチオトレイトール及びチオール化の副産物であるピリジン — 2—チオンとチオール化 SPDP結合ルテニウム錯体標識ポリリジンを単離精製した 。溶出は ImmolZLのエチレンジァミン四酢酸 2ナトリウムを含む lOmmolZLリン酸 カリウム緩衝液 (PH7. 5)にて行った。
[0079] (1 2) 3?0?結合151^— β 33—42ペプチドの調製
Ν末端側にリジンが 15個結合した形の Α β 33— 42合成ペプチド (アミノ酸配列： Κ KKKKKKKKKKKKKKGLMVGGWIA (酉己歹 IJ番号 2)、以下 15L— β 33— 42と表記;） 0. 5mgを の DMSOに溶解させ、更に 0. 45mLの ImmolZLのエチレンジ アミン四酢酸 2ナトリウムを含む lOmmolZLリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5)に希釈し 、 15L- β 33—42ペプチド液とした。
この 15L— β 33— 42ペプチド液に 20mmolZLのタンパク質架橋剤（ピアス社製、 SPDP)を 混合させ、窒素ガスを吹きかけながら 25°C、 1時間攪拌した。攪拌 後、直径 lcm、高さ 30cmのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（バ ィォラッド社製、 Bio-Gel P-4)にアプライし、未結合 SPDPと SPDP結合 15L— β 33 —42ペプチドを単離精製した。溶出は ImmolZLのエチレンジァミン四酢酸 2ナトリ ゥムを含む lOmmolZLリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5)にて行った。 [0080] (1 3) 3?0?結合151^— β 33—42ペプチドとチオール化 SPDP結合ルテニウム 錯体標識ポリリジンの結合
0. 2mgの SPDP結合 15L— j8 33—42ペプチドに 0. 3mgのチオール化 SPDP結 合ルテニウム錯体標識ポリリジンを加え、 4°C、 16時間静置することで、 15L— β 33 —42ペプチド結合 SPDPの 2 ピリジルージスルフイド基と、チオール化 SPDP結合 ルテニウム錯体標識ポリリジンのチオール基を介して 15L— β 33— 42ペプチドとル テ-ゥム錯体標識ポリリジンを結合させた。混合物を直径 lcm、高さ 30cmのガラス 管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（アマシャム'バイオサイエンス社製、 S ephadex G- 25)にアプライし、遊離の SPDP結合 15L— β 33—42ペプチド及び遊 離のチオール化 SPDP結合ルテニウム錯体標識ポリリジンと 15L— β 33— 42ぺプ チド +ルテニウム錯体標識ポリリジン結合体 (以下、標識ペプチド複合体と称する。 ) を単離精製した。溶出は ImmolZLのエチレンジァミン四酢酸 2ナトリウムを含む 10 mmolZLリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5)にて行った。
なお、使用するペプチドは上記 15L— β 33— 42ペプチド以外にも A |8 1—42合 成ペプチドや A β 1 42C端部を保有する他の断片ペプチドでも同様の方法でぺプ チドとルテニウム錯体標識ポリリジンの結合体を作製することが可能である。
[0081] (2)Α |8 1— 42の C末端部分に特異的な抗体を結合させた磁気ビーズの調製方法 実験例 1と同様の手順により 21F12抗体結合磁気ビーズを調製した。
なお、 21F12抗体以外にも Α |8 1—42の C末端部分に特異的な抗体であれば同 様に使用することが可能である。
[0082] (b)AD患者及び健常者血清の測定
500 L容ポリスチレンカップ (以下、反応カップと記述）に 50 Lの反応用溶液 [1 Ommol/Lリン酸ナトリウム， 1%ブロックエース， 0.15mol/L NaCl, 0.01%(W/V) Tween20 , 1 Ommol/L EDTA2Na, 0.25%(W/V)トレハロース， 0.1%正常マウス血清， pH7.2]を入 れた物を必要量用意した。その各反応カップに検量線作成用標準品として、 0、 31. 25、 62. 5、 125、 250、 500、 lOOOngZmLの濃度の A j8 1—42合成ペプチドを 2 0 Lずつ混合し、又は測定検体として AD患者 15例及び健常者 15例の血清をそれ ぞれ 20 Lずつ混合した。そこに反応用溶液で 0. 3mgZmL濃度に希釈した 21F1 2抗体結合磁気ビーズを 25 μ Lずつ添加し、更に 1 μ gZmL濃度に反応用溶液で 希釈した標識ペプチド複合体を 200 L加え、 30°Cで 26分間反応させた。
[0083] その後、磁気ビーズを磁石でトラップしておいて力 反応カップ中の液体を抜き取り 、洗浄液 [50mmol/L Tris HCl, 0.1%(W/V) tween20, 0.15mol/L NaCl, ρΗ7.5] 350 μ Lで 2回磁気ビーズを洗浄し、非特異結合物質を除去した。
その後、反応カップに 300 Lのトリブトピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。 この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を 検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定操作以降は、 ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミ 8220 (三光純薬社製)上で行った。
[0084] 表 4に、標準品 A |8 1—42合成ペプチドの競合反応による阻害率を示し、図 10に 検量線 (y=— 3107. 3Ln (x) + 26227 R2=0. 9909)を示した。また、 AD患者 及び健常者の血清の測定結果を表 5、表 6及び図 11に示した。なお、定量値は図 1 0の検量線に各検体の ECL値を当てはめて算出した。この結果、血清中の Α |8 1—4 2C末端部トータル量は、 AD患者は健常者に比較して有意に低下しており、本発明 の手法は ADの診断に使用しえることが確認された。
[0085] [表 4] 実施例 3の標準品の測定結果
Figure imgf000029_0001
*表中の阻害率とは、阻害なし (投入 A |8 1—42ペプチド濃度 0、ブランク）のルテニ ゥム錯体発光強度測定値 (ECL値)を 100%としたときの、各濃度の A β 1—42を投 入した際の ECL値の低下率を％表示したものである。
[表 5] 実施例 3の AD患者血清の測定結果
Figure imgf000030_0001
実施例 3の健常人血清の測定結果
定量値 定量値平均 サンプル番号 ECL値
(ng/mL) (ng/mL)
1 6373.8 595.1
2 9165.9 242.3
3 7037.7 480.6
4 6793.5 519.9
5 6031.1 664.5
6 7804.0 375.6
7 5717.6 735.0
8 6681.6 539.0 570
9 5920.4 688.6
10 6433.4 583.8
11 6152.4 639.1
12 5036.9 915.0
13 7445.8 421.5
14 6910.4 500.7
15 6138.2 642.0 [0088] なお、本手法における検量線は、標識抗原として A β 33—42合成ペプチドを使用 したが、 Α |8 1—42合成ペプチドを標識抗原として使用した場合の検量線も図 10と 同様な結果を示したことを確認している。また、使用した抗体は実施例 1と同じ 21F1 2であるので、 A |8 1—42合成ペプチド及び A |8 33— 42合成ペプチドとは競合反応 を示す力 Α |8 1—40合成ペプチドとは反応しないことを確認している。
[0089] (実験例 8) A |8 1— 42の血清中断片化確認実験
血清に添カ卩した A j8 1—42合成ペプチドの添加後の分子変化について SDS— PA GE電気泳動法を使用しての検討を行った。
1.サンプルの調製
実験例 8— 1では、 50 μ Lの健常人血清検体を用意し、そこに 50 μ gZmL濃度の A j8 1—42合成ペプチド (ペプチド研究所社製)を 500 L混合し、良く攪拌した後、 25°Cで 90時間保温し、得られたサンプルを下記方法にて精製、脱塩濃縮を行い、 精製脱塩サンプル (30 L)を調製した。
実験例 8— 2では、 50 1^の健常人血清検体に50/^7!11し濃度の八|8 1—42合 成ペプチド (ペプチド研究所社製)を 500 ;z L混合し、良く攪拌し、得られたサンプル を直ちに下記方法にて精製、脱塩濃縮を行い、精製脱塩サンプル (30 L)を調製 した。
実験例 8— 3では、血清中での生体内 A |8がどの程度の分子量となっているかを確 認する為に、 lmLの健常人 pool血清を用意し、この血清を下記方法にて精製、脱塩 濃縮を行 ヽ、精製脱塩サンプル (30 L)を調製した。
[0090] サンプルの精製'脱塩濃縮方法は次の通りである。サンプルを A β 1—42の C末端 を認識する 21F12抗体 (イノジエネテイクス社製）をセファロースゲル（CNBr- activate d sepharose4B :フアルマシアバイオサイエンス社製）に結合させたァフィ-ティーゲル により精製した。精製は 0. 2mLの 21F12抗体ァフィ二ティーゲルを Ultrafree- MC (ミ リポア社製）に充填して使用し、 A |8 1—42合成ペプチドを添加したサンプルをアブ ライした。その後、 10mMリン酸ナトリウム Z0. 15M NaCL (pH7. 8)をカラムに流 し、カラムから出てくる排出液の A280nmの吸光度が 0. 000になるまで洗浄を行つ た。その後、 0. 1Mクェン酸 (pH5. 0)をカラムに流し、カラムから出てくる排出液の A 280nmの吸光度が 0. 000になるまで洗浄をおこなった。 21F12カラムに結合した A j8の溶出は 0. 6mLの 4Mグァ-ジンにて行い、溶出液は Zip-Tip C18 (ミリポア社製 )にて脱塩と濃縮を行い 30 Lの精製サンプルが得られた。
[0091] 2.競合的免疫測定法による測定
脱塩濃縮後のサンプルは実施例 3に記載した競合的免疫測定法で測定した。測定 は精製サンプル 2 Lを反応用溶液で 10倍希釈し、この希釈液 20 μ Lを検体として 測定を行った。各精製脱塩サンプルの測定結果を表 8に示す。また、標準品 A 1— 42合成ペプチドの測定結果を表 7に示し、検量線 (y=— 3545. 7Ln(x) + 30507
R2 = 0. 9856)を図 12に示す。
測定の結果、実験例 8— 1では 452ngZmLの定量値が得られた。あら力じめ 10倍 希釈していること力も精製サンプル中 Α |8 χ— 42濃度は 4520ngZmLであり、精製 サンプルが 30 Lであったのでサンプルに含まれる A j8 x— 42の量は 136ngと算出 された。
[0092] [表 7] 実験例 8の標準品の測定結果
Figure imgf000032_0001
[0093] [表 8]
Figure imgf000032_0002
実験例 8 - 1：血清へ A β 1—42合成ペプチドを添加し 90時間経過後に精製した サンプノレ
実験例 8— 2 :血清へ A |8 1—42合成ペプチドを添加後、直ちに精製したサンプル 実験例 8— 3： lmLの血清を精製したサンプル
[0094] 3.電気泳動法
次に、精製脱塩サンプルについて電気泳動を行い、出現バンドの確認を行った。 電気泳動用ゲルには 4ー 12%グラジェントの Nu-PAGE Bis-Trisゲル (インビトロジェ ン社製)を用い、分子量マーカーは Markl2 (インビトロジェン社製)を用いた。精製脱 塩サンプルは競合的免疫測定法にて得られた定量値より、 V、ずれのサンプルもゲル にアプライする量が 50ngになるようにサンプル希釈バッファーである LDS sample buff er (インビトロジェン社製）と混合しゲルにアプライした。同時に A |8 1—42合成べプチ ド (ペプチド研究所社製)及び A β 34— 42合成ペプチド (SIGMA社製）につ 、ても任 意の量を LDS sample bufferと混合してゲルにアプライし、分子量マーカーは 5 μ Lを ゲルにアプライした。泳動は 15mAにて行い、 LDS sample bufferに含まれる青色色 素がゲル下端に達するまで泳動を続けた。泳動後のゲルは銀染色 IIキットヮコー（和 光純薬社製)を用い銀染色法によるタンパク質バンド染色を行った。染色した電気泳 動のゲル写真を図 13に示す。
[0095] 電気泳動の結果、 A |8 1— 42合成ペプチドは分子量マーカーの結果より、分子量 4. 5KDa付近にバンドが得られた。一方、分子量 0. 8581KDaである A j8 34—42 合成ペプチドに関しては、バンドは見られな力つた。分子量マーカーの泳動結果より 、分子量 3. 5KDaまでは検出できているが更に小分子量の A j8 34— 42はゲル下端 まで流れ切ってしまった為、ゲル上にバンドとして検出されな力つたものと考えられた 血清へ Α |8 1—42を添加後、すぐに 21F12抗体ァフィユティーカラムにて精製した サンプル（実験例 8— 2)については、 Α |8 1—42合成ペプチドと同じ移動位置にバ ンドが検出された。尚且つ 4. 5KDa付近以外の分子量領域にはバンドが一切検出 されなかったことから、 21F12抗体ァフィユティーカラムを使用した本精製法により、 添加した A β 1—42は血清中から単一にまで精製可能であることが確認できた。
[0096] 一方、添加して 90時間保温後に 21F12抗体ァフィユティーカラムにて精製したサ ンプル (実験例 8— 1)及び lmL血清を精製して得られたサンプル (実験例 8— 3)に 関しては 4. 5KDa付近にバンドは現れず、それ以外の分子量領域にもバンドは検出 できなかった。いずれのサンプルも競合的測定方法で測定した測定値より、 50ngを ゲルにアプライしていることから、 A |8 1—42合成ペプチドを血清に添加後、血清中 の合成ペプチドは時間経過と共に断片化して低分子化してしまったと考えられ、 A β 34— 42合成ペプチドでバンドが現れなかったことと同様の理由でゲル上のバンドと して検出できなくなつたと考えられた。
[0097] (実験例 9)
SDS— PAGEで検出不可能な 3. 5KDa以下の分子量領域における A j8 x— 42 断片の有無を確認する方法として、低分子ペプチド分離ゲルろ過カラムを使用した 方法を検討した。
ゲルろ過カラムであるバイオゲル P-4ゲル（バイオラット社製）を φ 1. 0、高さ 120cm のガラスカラム管（バイオラット社製）にゲル容積 84mL充填した。 8M Urea/50mM Tri s (pH7.5)を移動相として HPLCポンプ CCPM (東洋ソーダ社製）にて流速 0. lmL/ 分で送液した。カラムからの溶出液は SPD- 6AV分光器（島津製作所社製）にて A22 5nmの吸収を測定し、測定データは C-R3Aクロマトパック（島津製作所社製）にてチ ヤートを作成した。なお SPD-6AV分光器はレンジ 0. 005、レスポンスは STDモードに 設定した。 C-R3Aクロマトパックはピーク検出感度（SLOPE)を 193. 68、最小ピーク 面積設定値を 10、チャートスピードは ImmZ分に設定した。
[0098] このゲルろ過カラム装置にジメチルスルホキシド（以後 DMSOと記す。シグマ社製） に溶解させたペプシン A (分子量 35KDa、シグマ社製）、 A j8 1—42 (分子量 4. 514 KDa、ペプチド研究所社製）、 A j8 1— 28 (分子量 3. 2625KDa、 BACHEM社製）、 A j8 12— 28 (分子量 1. 9552KDa、シグマ社製）、 A j8 1— 11 (分子量 1. 3253KD a、 BACHEM社製）、 A j8 34— 42 (分子量 0. 8581KDa、シグマ社製）、 Sue— D— Asp— MCA (分子量 0. 3903KDa、ペプチド研究所社製）、 E— 64— c (分子量 0. 31438KDa、ペプチド研究所社製）、及び DMSO単品（分子量 0. 0781KDa、シグ マ社製）を順次アプライして行き、溶出液の A225nmの吸収力もクロマトパック上で チャート作製した。このチャートを図 14に示す。また、チャートのピーク出現時間と既 知分子量より作製したグラフを図 15に示す。
[0099] 図 15に示したグラフの直線性よりペプシン A (分子量 35KDa)及び A j8 1— 42 (分 子量 4. 514KDa)に関してはカラムの排除限界値 (Voidボリューム）で溶出している と考えられ、本ゲルろ過カラム装置での分画分子量を 3. 2625KDa (A j8 1 28)〜 0. 0781KDa (DMSO)とし、この分子量範囲内で検量線を作製した。作製した検量 線グラフ（y=— 3545. 7Ln (x) + 30507, R2 = 0. 9856)を図 16に示す。
また装置の再現性を検討する為に、再度 Α |8 1— 28、 Α |8 1— 11、 Sue— D— Asp — MCAをカラムにアプライし、 1度目と 2度目の溶出時間の差を確認したところ、良 好な再現性を得ることが出来た。チャートを図 17に示す。また再現性データを表 9に 示す。
[0100] [表 9] 実験例 9の結果
Figure imgf000035_0001
表 9中、相対比は一回目の測定値を 100としたときの二回目の測定値を％で表記し た。
[0101] (実験例 10)
血清中での生体内 A j8がどの程度の分子量となっているかを確認する為に、 lmL の健常人 pool血清を用意し、 A |8 1—42の C末端を認識する 21F12抗体をセファロ ースゲル（CNBr- activated sepharose4B)に結合させたァフィ-ティーゲルにより精製 した。精製は 0. 2mLの抗体ァフィ二ティーゲルを Ultrafree- MC (ミリポア社製）に充 填して使用し、サンプルをアプライした後、素通り画分は— 20°Cで保存した。その後 、 10mMリン酸ナトリウム /0. 15M NaCL (pH7. 8)をカラムに流し、カラムから出 てくる排出液の A280nmの吸光度が 0. 000になるまで洗浄を行った。その後、 0. 1 Mクェン酸 (pH5. 0)をカラムに流し、カラムから出てくる排出液の A280nmの吸光 度が 0. 000になるまで洗浄をおこなった。 21F12カラム結合画分の溶出は 0. 4mL の 8M Urea/50mM Tris (pH7. 5)にて行った。
精製サンプルは DMSOを カ卩えた後、ゲルろ過カラム装置にアプライし、溶出 液の A225nmの吸収からクロマトパック上でチャート作製した。得られたチャートを図 18に示す。
[0102] サンプルに添カ卩した DMSOピーク出現時間は 678. 8分であり、検量線作成時の DMSOのピーク出現時間である 676. 567分と比較して良好な再現性が得られてい ることを確認した。得られたサンプルのメインピークは 512. 167分であった。またメイ ンピークの前側にメインピークと分離不十分なショルダーピークが存在しており、その 出現時間はチャートスピードとショルダーピークまでの距離力 換算すると約 470分 であった。またそれ以外にも目視上は確認できないものの、クロマトパックのピーク自 動検出機構で検出されるごく微小な検出ピークも複数検出された。メインピーク及び ショルダーピークの出現時間をあら力じめ作製した図 19の検量線の式に当てはめ溶 出物質の分子量を算出したところ、メインピークは分子量 0. 357KDaとなり、ショルダ 一ピークは分子量 0. 526KDaであった。
[0103] また、回収したァフィユティーカラムの素通り画分及び精製処理しな力つた健常人 p ool血清 (精製したものと同一品）を実施例 3に記載した競合的免疫測定法で測定し た。測定の結果、ァフィユティー精製処理前の血清の測定値は 875ngZmLであつ た力 この血清を 21F12カラムに通した後の素通り画分の測定値は 293ng/mLで あり、カラムに通すことにより約 3割程度まで低下していた。よって残りの約 7割（582η g)は 21F12ァフィユティーカラムに結合したと考えられ、ゲルろ過カラム装置のチヤ ートに現れた低分子ピークは競合的免疫測定法での値の低下分である約 7割（582 ng)が反映して 、ると考えられる。
[0104] これらの結果から、メインピークより予測される A β χ— 42断片はその C末端べプチ
Val-Ile-Ala (分子量 0. 33742KDa)、ショルダーピークより予測される A β χ— 42断片はその C末端ペプチド Gly— Val— Val— lie— Ala (0. 52964KDa)となる。 また、クロマトパックの自動ピーク検出で、複数の微小ピークが検出されていること から、血清より 21F12抗体ァフィユティーカラムで精製したサンプル中にはメインピー ク、ショルダーピーク以外にも複数の A |8 X— 42断片が存在している可能性がある。 [0105] 以上、実験例 8の SDS— PAGEによる検討、実験例 9及び 10のゲルろ過カラム装 置による検討及び実験例 3に記載したプロテアーゼインヒビターを使った代謝確認実 験の結果から、 A |8 1—42は血液中で酵素分解され、断片化しているという考えを強 く支持する結果が得られた。この事は血清'血漿等の血液検体で A |8 X— 42断片を 測定する事の有効性を初めて証明した事となり、本発明が開示する競合的測定法の みならず、血清'血漿等の血液検体で A |8断片を測定するすべての方法において本 発明が有効性を持つことを意味するものである。
産業上の利用可能性
[0106] Α β 1—42の C末端部分に特異性を有する抗体を用いる免疫測定法によって、生 体試料中の Α |8 1—42及び A |8 1—42C末端部を保有するペプチド断片のトータル 量 (A |8 X— 42)を測定することにより、アルッノ、イマ一病の診断に利用しえる。

Claims

請求の範囲
[1] β—アミロイド 1—42の C末端部に特異的な抗体を使用する免疫測定法により、生 体試料検体中の、 β—アミロイド 1—42と |8—アミロイド 1—42の C末端部を保有する β アミロイド 1—42断片のトータル量を測定することを特徴とするアルッノヽイマ一病 の検定方法。
[2] 前記免疫測定法が、競合的免疫測定法であることを特徴とする請求項 1記載のァ ルツハイマー病の検定方法。
[3] 前記抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする請 求項 1又は 2記載のアルツハイマー病の検定方法。
[4] 前記モノクローナル抗体が、 β—アミロイド 1—42は認識するが β—アミロイド 1—4
0は認識しない抗体であることを特徴とする請求項 3記載のアルッノヽイマ一病の検定 方法。
[5] 前記抗体が、 j8—アミロイド 1—42の 33— 42アミノ酸部位を免疫原とし、 Α |8 1—4 2の C末端部分に特異性を有するマウスモノクローナル抗体であることを特徴とする 請求項 1〜4のいずれか 1項記載のアルツハイマー病の検定方法。
[6] 前記競合的免疫測定法が下記 (a)及び (b)の工程を含むことを特徴とする請求項 2 記載のアルツハイマー病の検定方法。
(a) β—アミロイド 1—42の C末端部を保有するペプチドを固相化した支持体と生 体試料検体及び標識物質で標識した、 β—アミロイド 1—42の C末端部を認識する 抗体を反応させる工程、及び
(b)洗浄後、固相化した j8—アミロイド 1—42の C末端部を保有するペプチドに結 合した標識抗体量を測定して、 β—アミロイド 1—42と |8—アミロイド 1—42の C末端 部を保有する β—アミロイド 1—42断片のトータル量を測定する工程。
[7] 前記競合的免疫測定法が下記 (a)及び (b)の工程を含むことを特徴とする請求 項 2記載のアルッノ、イマ一病の検定方法。
(a) β—アミロイド 1—42の C末端部を認識する抗体を固相化した支持体と生体試 料検体及び標識物質で標識した、 β—アミロイド 1—42の C末端部を保有するぺプ チドを反応させる工程、及び (b)洗浄後、固相化した抗体に結合した標識 j8—アミロイド 1—42の C末端部を保 有するペプチド量を測定して、 β アミロイド 1—42と |8—アミロイド 1—42の C末端 部を保有する β—アミロイド 1—42断片のトータル量を測定する工程。
[8] 前記標識物質で標識した、 β—アミロイド 1—42の C末端部を保有するペプチドが 、キャリアー物質を結合させたペプチド複合体であることを特徴とする請求項 7記載の アルツハイマー病の検定方法。
[9] 前記キャリアー物質力 ポリリジン、デキストラン、ゥシ血清アルブミン又は遊離アミノ 基を多く保有するポリペプチドであることを特徴とする請求項 8記載のアルッノ、イマ一 病の検定方法。
[10] 前記標識物質がルテニウム錯体であることを特徴とする請求項 6〜9の 、ずれか 1 項記載のアルツハイマー病の検定方法。
[11] 前記支持体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項 6〜 10のいずれ力 1項記 載のアルツハイマー病の検定方法。
[12] 前記生体試料検体が血清又は血漿であることを特徴とする請求項 1〜11の 、ずれ 力 1項記載のアルッノヽイマ一病の検定方法。
[13] β—アミロイド 1—42の C末端部に特異的な抗体を必須の構成成分とし、生体試料 検体中の j8—アミロイド 1—42と |8—アミロイド 1—42の C末端部を保有する |8—アミ ロイド 1—42断片のトータル量を測定することによりアルッノヽイマ一病を検定するため の試薬であることを特徴とするアルッノヽイマ一病の診断試薬。
[14] 固相化した β—アミロイド 1—42の C末端部を保有するペプチドと標識物質で標識 した、 β—アミロイド 1—42の C末端部に特異的な抗体を必須の構成成分とし、競合 的免疫測定法に用いることを特徴とする請求項 13記載のアルツハイマー病の診断 試薬。
[15] 固相化した β—アミロイド 1—42の C末端部に特異的な抗体と標識物質で標識した 、 β—アミロイド 1—42の C末端部を保有するペプチドを必須の構成成分とし、競合 的免疫測定法に用いることを特徴とする請求項 13記載のアルツハイマー病の診断 試薬。
[16] 前記固相化する支持体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項 14又は 15記 載のアルツハイマー病の診断試薬。
[17] 前記標識物質で標識した、 β—アミロイド 1—42の C末端部を保有するペプチドが
、キャリアー物質を結合させたペプチド複合体であることを特徴とする請求項 15記載 のアルツハイマー病の診断試薬。
[18] 前記キャリアー物質力 ポリリジン、デキストラン、ゥシ血清アルブミン又は遊離アミノ 基を保有するポリペプチドであることを特徴とする請求項 17記載のアルツハイマー病 の診断試薬。
[19] 前記標識物質がルテニウム錯体であることを特徴とする請求項 14〜 17のいずれか
1項記載のアルッノヽイマ一病の診断試薬。
[20] 前記抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする請 求項 13〜 19のいずれ力 1項記載のアルツハイマー病の診断試薬。
[21] 前記モノクローナル抗体が β—アミロイド 1—42は認識するが、 β—アミロイド 1—4
0は認識しない抗体であることを特徴とする請求項 20記載のアルッノヽイマ一病の診 断試薬。
[22] 前記抗体が j8 アミロイド 1—42の 33— 42アミノ酸部位を免疫原とし、 Α |8 1—42 の C末端部分に特異性を有するマウスモノクローナル抗体であることを特徴とする請 求項 13〜21のいずれ力 1項記載のアルツハイマー病の診断試薬。
[23] 前記生体試料検体が血清又は血漿であることを特徴とする請求項 13〜22の ヽず れカ 1項記載のアルッノ、イマ一病の診断試薬。
[24] β—アミロイド 1—42の C末端部に特異的な抗体を使用する免疫測定法により、生 体試料検体中の、 β—アミロイド 1—42と |8—アミロイド 1—42の C末端部を保有する β アミロイド 1—42断片のトータル量を測定することにより、生体試料検体中の j8 —アミロイド 1—42含量を測定することを特徴とする β—アミロイド 1—42の測定方法
[25] 前記生体試料検体が血清又は血漿であることを特徴とする請求項 24記載の測定 方法。
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Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007119685A1 (ja) * 2006-04-13 2007-10-25 Sanko Junyaku Co., Ltd. β－アミロイドの血中分解速度測定によるアルツハイマー病の検定方法及び診断試薬
JP2008046082A (ja) * 2006-08-21 2008-02-28 Aisin Seiki Co Ltd 被検物質の免疫測定方法、及び免疫結合親和性解析の制御方法
WO2008104580A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
WO2009016734A1 (ja) * 2007-07-31 2009-02-05 University Of Tsukuba 軽度認知機能障害の検定方法
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
WO2011029920A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Probiodrug Ag Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2011070174A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Araclon Biotech, S.L. Methods and reagents for improved detection of amyloid beta peptides
WO2011092796A1 (ja) * 2010-01-28 2011-08-04 パナソニック株式会社 アミロイドβ測定方法
WO2011107530A2 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2011110613A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2511296A1 (en) 2011-04-12 2012-10-17 Araclón Biotech, S. L. Antibody, kit and method for determination of amyloid peptides
JP2014013190A (ja) * 2012-07-04 2014-01-23 Osaka City Univ アルツハイマー病を検出する方法及びキット
WO2014136443A1 (ja) * 2013-03-08 2014-09-12 パナソニックヘルスケア株式会社 抗Ａβ４２モノクローナル抗体
EP2865670A1 (en) 2007-04-18 2015-04-29 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
WO2017141881A1 (ja) * 2016-02-15 2017-08-24 ノーベルファーマ株式会社 遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定方法及び測定キット
EP3461819A1 (en) 2017-09-29 2019-04-03 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US8691224B2 (en) 2005-11-30 2014-04-08 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 5F7 antibodies
KR20180058863A (ko) 2005-11-30 2018-06-01 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
KR101591223B1 (ko) 2005-12-12 2016-02-04 에이씨 이뮨 에스.에이. 치료적 특성을 갖는 베타 1-42 특이적인 단일클론성 항체
PL2046833T3 (pl) 2006-07-14 2014-01-31 Ac Immune Sa Humanizowane przeciwciało przeciw amyloidowi beta
US8455626B2 (en) * 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US20100311767A1 (en) 2007-02-27 2010-12-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
SG178809A1 (en) * 2007-10-05 2012-03-29 Genentech Inc Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
SI2238166T1 (sl) 2007-10-05 2014-03-31 Genentech, Inc. Uporaba protitelesa proti amiloidu beta pri očesnih bolezni
JP5185946B2 (ja) * 2007-10-29 2013-04-17 Ｔａｏヘルスライフファーマ株式会社 抗体及びその利用
US20110263450A1 (en) * 2008-09-26 2011-10-27 The University Of Melbourne Alzheimer's disease biomarkers
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
MY164579A (en) 2010-07-30 2018-01-15 Ac Immune Sa Safe and functional humanized antibodies
CN103298833B (zh) 2010-08-14 2015-12-16 Abbvie公司 β淀粉样蛋白结合蛋白
US20140302532A1 (en) 2011-04-12 2014-10-09 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patient's recovery from a brain injury
WO2012142300A2 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patient's recovery from a brain injury resulting from a hypoxic event
US9541561B2 (en) 2012-06-14 2017-01-10 Electronics And Telecommunications Research Institute Method for diagnosing Alzheimer's disease using biomaterial
EP3242134A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-08 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG Assay for the diagnosis of a neurological disease
CN113311153B (zh) * 2021-05-12 2023-05-26 华中科技大学 一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03151893A (ja) * 1989-07-05 1991-06-28 Innogenetics Sa:Nv アルツハイマー病に関与するモノクローナル抗体、これらのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ、これらの抗体により認識される抗原、及びそれらの適用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610493B1 (en) * 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
US5786180A (en) * 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
DE50103881D1 (de) * 2001-06-12 2004-11-04 Wiltfang Jens Monoklonaler Antikörper, mbAb 1E8, welcher für die zwei ersten N-terminalen Aminosäuren von Amyloid-beta-Peptiden spezifisch ist und dessen Verwendung zum Nachweis von Amyloid-beta Peptiden und/oder sAPPa
EP1427439A4 (en) * 2001-08-10 2004-11-17 Merck & Co Inc GAMMA-3 PROTEASE
US7494655B2 (en) * 2002-03-05 2009-02-24 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Immunizing composition and method for inducing an immune response against the β-secretase cleavage site of amyloid precursor protein

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03151893A (ja) * 1989-07-05 1991-06-28 Innogenetics Sa:Nv アルツハイマー病に関与するモノクローナル抗体、これらのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ、これらの抗体により認識される抗原、及びそれらの適用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1813947A4 *
TAMAOKA A. ET AL.: "Amyloid beta protein in plasma from patients with sporadic Alzheimer's disease.", JOURNAL OF THE NEUROLOGICAL SCIENCES, vol. 141, 1996, pages 65 - 68, XP002998027 *
VANDERSTICHELE H. ET AL.: "Standarization of measurement of beta-amyloid (1-42) in cerebrospinal fluid and plasma.", AMYLOID, vol. 7, 2000, pages 245 - 258, XP008045907 *

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
US8809010B2 (en) 2003-05-05 2014-08-19 Probiodrug Ag Method for prophylactic treatment of alzheimer's disease using inhibitors of glutaminyl cyclase and glutamate cyclases
WO2007119685A1 (ja) * 2006-04-13 2007-10-25 Sanko Junyaku Co., Ltd. β－アミロイドの血中分解速度測定によるアルツハイマー病の検定方法及び診断試薬
JP2008046082A (ja) * 2006-08-21 2008-02-28 Aisin Seiki Co Ltd 被検物質の免疫測定方法、及び免疫結合親和性解析の制御方法
WO2008104580A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
EP2481408A2 (en) 2007-03-01 2012-08-01 Probiodrug AG New use of glutaminyl cyclase inhibitors
EP2865670A1 (en) 2007-04-18 2015-04-29 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
WO2009016734A1 (ja) * 2007-07-31 2009-02-05 University Of Tsukuba 軽度認知機能障害の検定方法
WO2011029920A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Probiodrug Ag Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2011070174A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Araclon Biotech, S.L. Methods and reagents for improved detection of amyloid beta peptides
WO2011092796A1 (ja) * 2010-01-28 2011-08-04 パナソニック株式会社 アミロイドβ測定方法
WO2011107530A2 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2011110613A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2012140296A1 (es) 2011-04-12 2012-10-18 Araclon Biotech, S.L. Anticuerpo, kit y metodo para la determinacion de peptidos amiloides
EP2511296A1 (en) 2011-04-12 2012-10-17 Araclón Biotech, S. L. Antibody, kit and method for determination of amyloid peptides
US9255932B2 (en) 2011-04-12 2016-02-09 Aracion Biotech, S.L. Antibody, kit and method for determining amyloid peptides
US9863961B2 (en) 2011-04-12 2018-01-09 Araclon Biotech, S.L. Method for determination of amyloid peptides with anti-amyloid antibody
JP2014013190A (ja) * 2012-07-04 2014-01-23 Osaka City Univ アルツハイマー病を検出する方法及びキット
WO2014136443A1 (ja) * 2013-03-08 2014-09-12 パナソニックヘルスケア株式会社 抗Ａβ４２モノクローナル抗体
WO2017141881A1 (ja) * 2016-02-15 2017-08-24 ノーベルファーマ株式会社 遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定方法及び測定キット
EP3461819A1 (en) 2017-09-29 2019-04-03 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase

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