WO2006037834A1 - Plantas transgénicas atpskp2d, su procedimiento de obtención y sus aplicaciones - Google Patents

Plantas transgénicas atpskp2d, su procedimiento de obtención y sus aplicaciones Download PDF

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atpskp2d
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promoter
dna
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Juan Carlos Del Pozo Benito
Crisanto GUTIÉRREZ ARMENMTA
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline

Definitions

  • the invention has an application in the agriculture sector, preferably in the development of transgenic plants.
  • This invention describes a biotechnological tool for modifying the root development of plants, and therefore, their access to nutrients and water according to needs.
  • Plants due to their sessile nature, need to adapt and respond to the different environments in which they grow.
  • the root architecture is directly related to the acquisition of nutrients and water from the soil, and therefore to the adaptation of the plants to the different environments. Therefore, these organisms have developed different root systems, which are determined both by the number and by the length and position of the lateral roots (RLs) developed.
  • RLs lateral roots
  • the availability of certain nutrients such as phosphate, nitrate or sulfur is a limiting parameter for plant growth and development. Therefore, these organisms have developed different systems that allow them to quantify the levels of these nutrients and respond both physiologically and molecularly to obtain these nutrients in case of deficit.
  • a phosphate or sulfur deficiency stimulates the formation of the lateral roots, which increases the search surface of these compounds in the soil surrounding the plant (reviewed by López-Bucio et al. 2003, Current Opinion Plant Biology 6: 280-287).
  • the lateral roots are formed from specific cells in the main root, called pericyclo cells. Drubovsky et al. (Drubovsky et al. 2001, Planta, 214: 30-36) have determined that the cells of the pericycle adjacent to the xylem poles are responsible for the formation of the lateral primordia.
  • the AXR1 gene encodes a protein involved in the posttranslational modification of Culinal with the RUB protein.
  • Culinal is a structural component of the SCF complex. This complex is involved in the modification of target proteins with ubiquitin for subsequent degradation through the proteasome.
  • Another mutant of the auxin response, tir1 also affects the formation of RLs.
  • TIR1 codes for an F-motif protein that is part of an ubiquitin E3 ligase complex that is involved in the recruitment of target proteins for degradation (Gray et al. 2001, Nature, 414: 271-6). Through genetic analysis, TIR1 has been located below the function of AXR1 in the process of lateral root formation. Recently, Xie et al.
  • NAC 1 codes for a transcription factor of the NAM / CUC family (A ⁇ da M, et al. 1997, Plant CeII. 9: 841-57; Xie Q, et al. 2002, Nature, 419: 167-170), which operates downstream of TIR1, as a lateral root formation activator.
  • the activity of NAC 1 is also regulated by selective degradation through the ubiquitin pathway, involving the function of the enzyme E3 ligase SINAT5 (Xie Q, et al. 2002, Nature 419: 167-170).
  • the DFL1 gene belongs to the family of genes modulating the response to GH3 auxins. By analyzing a mutant for this gene, it has been observed that DFL1 works in the development of the stem and lateral roots, since said mutant generates much less RLs without affecting the length of the main root (Nakazawa et al. 2001 , Plant J. 25: 213-221; Patent 2002-010786 Lateral root formation suppressor gene. Miki Nakazawa et al.). In summary, for a good adaptation of plants to the environment, the development of an optimal root system to the soil where they grow is a critical process for their survival.
  • the present invention faces the problem of providing new transgenic plants capable of adapting to environmentally limiting situations, preferably for their ability to develop lateral roots.
  • an object of the present invention constitutes an AtPSKP2D transgenic plant, hereinafter AtPSKP2D transgenic plant of the present invention, which contains an AtPSKP2D DNA sequence that allows the expression of a protein of interest in the cells of said plant, and that it consists of one of the following two possibilities: a) an AtPSKP2D promoter DNA sequence and a protein coding DNA of interest, and b) a promoter DNA sequence and an AtPSKP2D protein coding DNA sequence.
  • Another object of the present invention constitutes a method of obtaining the AtPSPK2D transgenic plant, hereinafter referred to as the Obtaining of AtPSPK2D transgenic plants of the present invention, which consists in the introduction into a plant of the AtPSKP2D DNA sequence that is constituted by one of the following two possibilities: a) an AtPSKP2D promoter DNA sequence and a DNA sequence coding for a protein of interest, and b) a promoter DNA sequence and a DNA sequence encoding an AtPSKP2D protein
  • Another object of the present invention is the use of the AtPSKP2D DNA sequences, AtPSKP2D expression vectors, AtPSKP2D transformed cells, and the AtPSKP2D method of the present invention for obtaining AtPSKP2D transgenic plants of commercial interest, among others, to Illustrative title and without limiting the scope of the present invention: rice, wheat, soy, corn, tomato, potato, tobacco, beans, melon, watermelon, cucumber, strawberry, etc., as well as different fruit species (orange, lemon, pear tree , apple tree, etc).
  • the present invention faces the problem of providing new transgenic plants capable of adapting to environmentally limiting situations, preferably because of their ability to develop lateral roots.
  • the solution provided by this invention is based on the fact that the inventors have observed that it is possible to obtain transgenic plants capable of responding to environmental situations because they contain a new genetic material that allows the control of root development through the specific expression of genes of interest in Ia pericyclo cells forming the lateral roots (RLs). These new transgenic plants are potentially improved plants for growth both in poor nutrient media or in water, and fertilized with a lower concentration of fertilizers, which is why they represent an important innovation in the agri-food sector.
  • the DNA sequence of a new gene is described, the sequence of the AtSKP2D gene (see SEQ ID NO2, between nucleotide 501-2014), which codes for an F-motif protein, homologous to human SKP2 ( Zhang, H., et al. 1995, CeII 82: 915-925), the AtSKP2D protein (SEQ ID NO3) and its promoter.
  • This family of F-motif proteins are part of the E3-ligase complexes of the SCF type that are involved in the proteolysis of proteins through the ubiquitin pathway.
  • AtSKP2D gene is induced in the root of the plant by treatment with the hormones auxin and abyssic acid (ABA) or by saline stress (see Figure 2 and Example 2 ).
  • Said gene is expressed in discrete patches along the main root, and more specifically in the cells of the pericycle (cells from which the RLs are developed) and with greater intensity in the cells close to the xylem, which are what they divide to give rise to a lateral primordium (see Figure 3 and Example 3).
  • Micro-morphological analysis of these AtSKP2D expression points have shown that in many of them no division of the pericyclo cells has yet occurred.
  • transgenic PSKP2D GUS / axr1 plants
  • Figure 4 and Example 4 the invention is directed to develop a promoter DNA sequence that allows gene expression in a plant, but also, preferentially and specifically, in the cells of the pericycle that will lead to the formation of lateral roots in order to thus control the development of root system, that is, in the roots.
  • deletions of the DNA sequence of the AtSKP2D promoter have been carried out to find the domain responsible for the expression in patches along the root, identifying a DNA sequence (PSKP2B549) (SEQ ID NO4) that directs The expression only in the cells of the pericycle of the points along the root and not in other cells of other organs.
  • an object of the present invention constitutes an AtPSKP2D transgenic plant, hereinafter AtPSKP2D transgenic plant of the present invention, which contains an AtPSKP2D DNA sequence that allows the expression of a protein of interest in the cells of said plant, and that It consists of one of the following two possibilities: c) an AtPSKP2D promoter DNA sequence and a protein coding DNA of interest, and d) a promoter DNA sequence and a DNA sequence encoding an AtPSKP2D protein.
  • AdPSPK2D promoter DNA sequence refers to a promoter DNA sequence of the gene expression constituted by one of the DNA sequences belonging to the following group: a) PSKP2D DNA sequence (SEQ ID NO1), b) DNA sequence PSKP2D549 (SEQ ID NO4), c) a fragment of the DNA sequences of a) and b), d) DNA sequence analogous to the sequences of a), b) and c), and ) any DNA sequence that comprises the DNA sequence of a), b), c) or d) and that is capable of maintaining its same regulatory activity of gene expression.
  • DNA sequence encoding a protein of interest refers to: a) a DNA sequence encoding a protein directly involved in the formation and development of lateral roots to manipulate the architecture root, that is, capable of modifying the root architecture of a plant - both the number and the position of the lateral roots - as for example, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, the DNA sequences encoding the proteins belonging to the following group: the sequence AtPSKP2D (SEQ ID NO2 encoding the protein of SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKBI, AtKRPI , AKRP2, AtCDTI, AtCDC6 (Vandepoele, et al. Plant CeII
  • AtAXRI Leyser et al. Nature 1993, 364: 161-164
  • AtECRI del Pozo et al. Science 1998, 280: 1760-1763
  • AtTIRI Ruegger et al. 1998 , Genes Dev. 12: 198-207
  • AtIAAI 4 Feukaki et al. 2002, Plant J. 29: 153-168
  • AtNACI Xie et al. 2000, Gene Dev.
  • Ia caries of proteins for medical use (such as insulin or relaxin), of different types of drugs, antimicrobial and antifungal peptides, and proteins of agri-food interest (such as phytases, lichenses, transglutamines or glycosyltransferases)
  • a promoter DNA sequence refers to any promoter DNA sequence capable of regulating gene expression in plants, for example, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, a strong constitutive promoter, such as the 35S mosaic virus promoter, or a promoter that is expressed in all cells of the pericycle, such as that of cyclin-dependent kinase type A or type B (Vandepoele, et al. Plant CeII 2002, 14: 903-916).
  • a strong constitutive promoter such as the 35S mosaic virus promoter
  • a promoter that is expressed in all cells of the pericycle such as that of cyclin-dependent kinase type A or type B (Vandepoele, et al. Plant CeII 2002, 14: 903-916).
  • DNA sequence encoding an AtPSKP2D protein refers to the DNA sequence of the AtPSKP2D gene (SEQ ID NO2) encoding the AtPSKP2D protein (SEQ ID NO3), as well as any form analogous to this DNA sequence.
  • a particular object of the present invention constitutes an AtPSKP2D transgenic plant of the present invention in which the AtPSPK2D promoter DNA sequence is the PSKP2D DNA sequence (SEQ ID NO1).
  • a particular embodiment of this is the transgenic plant PSKP2D :: GUS, and the plants PSKP2B :: GUS / axr1-12 and PSKP2B :: GUS / axr1-3, generated in the present invention (see Example 1 and 4).
  • Another particular object of the present invention constitutes a transgenic AtPSKP2D plant that contains an AtPSKP2D DNA sequence that allows the expression of a protein of interest specifically in the cells of the pericycle that will give rise to the formation of lateral roots and that it consists of one of the following possibilities: a) PSKP2D549 DNA sequence (SEQ ID NO4), b) a fragment of the DNA sequences of a), c) DNA sequence analogous to the sequences of a) and b), and d ) any DNA sequence that comprises the DNA sequence of a), b), or c) and that is capable of maintaining its same regulatory activity of gene expression.
  • a particular embodiment of the present invention constitutes an AtPSKP2D transgenic plant of the present invention in which the AtPSPK2D promoter DNA sequence is the PSKP2D549 DNA sequence (SEQ ID NO: 1)
  • PSKP2D549 :: GUS, generated in the present invention (see Example 5).
  • Another particular object of the present invention constitutes a transgenic AtPSKP2D plant of the present invention in which the DNA sequence encoding a protein of interest is the DNA sequence encoding the AtPSKP2D protein (SEQ ID NO2).
  • Another object of the present invention constitutes a method of obtaining the AtPSPK2D transgenic plant, hereinafter procedure of obtaining AtPSPK2D transgenic plants of the present invention, which consists in the introduction into a plant of the AtPSKP2D DNA sequence that is constituted by one of the following two possibilities: c) an AtPSKP2D promoter DNA sequence and a DNA sequence encoding a protein of interest, and d) a promoter DNA sequence and a DNA sequence encoding an AtPSKP2D protein.
  • a particular embodiment of the present invention constitutes a method of obtaining AtPSPK2D transgenic plants comprising the following steps: a) obtaining an expression vector containing an AtPSPK2D DNA sequence, b) obtaining microorganisms carrying vector a), and c) transformation of the plants with the vector of a) or with the microorganism of b).
  • the present invention as well as its use for the production of said plants, constitute additional aspects of the present invention.
  • Another object of the present invention constitutes a sequence of
  • DNA AtPSKP2D hereinafter DNA AtPSKP2D sequence of the present invention, which allows the expression of a protein of interest in the plant cells and that is constituted by one of the following possibilities: a) a sequence of AtPSKP2D promoter DNA and a sequence from
  • DNA encoding a protein of interest and b) a promoter DNA sequence and a DNA sequence encoding an AtPSKP2D protein
  • a particular object of the present invention constitutes an AtPSK2D DNA sequence of the invention in which the AtPSKP2D promoter DNA sequence is constituted by one of the DNA sequences belonging to the following group: a) PSKP2D DNA sequence (SEQ ID NO1 ), b) PSKP2D549 DNA sequence (SEQ ID NO4), c) a fragment of the DNA sequences of a) and b), d) DNA sequence analogous to the sequences of a), b) and c), and e) any DNA sequence that comprises a DNA sequence of a), b), c) or d) and that is capable of maintaining its same regulatory activity of gene expression.
  • the AtPSKP2D promoter DNA sequence is constituted by one of the DNA sequences belonging to the following group: a) PSKP2D DNA sequence (SEQ ID NO1 ), b) PSKP2D549 DNA sequence (SEQ ID NO4), c) a fragment of the DNA sequences of a) and b),
  • Another particular object of the present invention constitutes an AtPSK2D DNA sequence of the invention in which the DNA sequence encoding a protein of interest is constituted by one of the following DNA sequences: a) a DNA sequence encoding a protein directly involved in the formation and development of the lateral roots to manipulate the root architecture, that is, capable of modifying the root architecture of a plant - both the number and the position of the lateral roots - as for example, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, the DNA sequences encoding the proteins belonging to the following group: the AtPSKP2D protein (SEQ ID NO2 encoding the protein of SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKBI, AtKRPI, AtKRP2, AtCDTI, AtCDC6 (Vandepoele, et al.
  • SEQ ID NO2 encoding the protein of SEQ ID NO3
  • AtE2Fc encoding the protein of SEQ ID NO3
  • AtAXRI Leyser et al. Nature 1993, 364: 161-164
  • AtECRI del Pozo et a 1. Science 1998, 280: 1760-1763
  • AtTIRI Ruegger et al. 1998, Genes Dev. 12: 198-207
  • AtlAA14 Fukaki et al. 2002, Plant J. 29: 153-168
  • AtNACI Xie et al. 2000, Gene Dev.
  • a DNA sequence encoding a protein of commercial and industrial interest whose expression in the plant, and more preferably in the root, allows its collection and subsequent purification as for example, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention , belonging to the following group: different types of immunoglobulins (such as IgGs against caries), of proteins for medical use (such as insulin or relaxin), of different types of drugs, antimicrobial and antifungal peptides, and proteins of Agrifood interest (such as phytases, lichenses, transglutamines or glycosyltransferases). These proteins of interest as well as the DNA sequences encoding them are known by one skilled in the art and also include all those that are identified in the future.
  • immunoglobulins such as IgGs against caries
  • proteins for medical use such as insulin or relaxin
  • proteins of Agrifood interest such as phytases, lichenses, transglutamines or glycosyltransferases.
  • Another particular object of the present invention constitutes an AtPSK2D DNA sequence of the invention in which the promoter DNA sequence is any promoter DNA sequence capable of regulating gene expression in plants such as, for example, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, a strong constitutive promoter, such as for example the 35S mosaic virus promoter, or a promoter that is expressed in all cells of the pericycle, such as that of type A cyclin dependent kinase (CDKA) ) or type B (Vandepoele, et al. Plant CeII 2002,
  • a strong constitutive promoter such as for example the 35S mosaic virus promoter
  • a promoter that is expressed in all cells of the pericycle such as that of type A cyclin dependent kinase (CDKA) ) or type B (Vandepoele, et al. Plant CeII 2002,
  • Another particular object of the present invention constitutes a DNA sequence AtPSK2D of the invention in which the DNA sequence encoding a protein of interest is the DNA sequence AtPSKP2D
  • SEQ ID NO2 (SEQ ID NO2) coding for the protein of SEQ ID NO3, as well as any analogous form of this DNA sequence.
  • analogous is intended to include any nucleotide sequence that can be isolated or constructed based on the DNA sequences shown in the present invention, for example, by introducing conservative nucleotide substitutions. or non-conservative, including the insertion of one or more nucleotides, the addition of one or more nucleotides at any of the ends of the molecule or the deletion of one or more nucleotides at any end or within the sequence.
  • an analogous DNA sequence is substantially homologous to the nucleotide sequence discussed above.
  • the expression “substantially homologous” means that the nucleotide sequences in question have a degree of identity, at the nucleotide level, of at least 60%, preferably of at least 85% , or more preferably of at least 95%.
  • the promoter DNA sequence AtPSKP2D (SEQ ID NO1) and the AtPSKP2D gene (SEQ ID NO2) of the invention come from Arabidopsis thaliana and they can be found in homologous forms in other species of higher plants of commercial interest, among others, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention: rice, wheat, soy, corn, tomato, tobacco, beans, as well as different species Fruit trees (orange, lemon, etc.), where they can be naturally or otherwise, could also be as a result of a process of gene transformation in which the transformed organism reproduces said DNA molecules.
  • AtPSKP2D promoter DNA sequence SEQ ID NO 1
  • AtPSKP2D gene SEQ ID NO2D gene
  • AtPSKP2D and PSKP2D549 one skilled in the art can easily obtain other deletions or fragments that allow regulating the specific or non-organ gene expression, and preferably other sequences of Promoter DNA specifically for a gene of interest in the root.
  • the AtPSK2D DNA sequence of the invention can be used, in general, in the generation of an expression vector that allows the expression of these proteins in a wide range of host cells.
  • the invention also refers to an expression vector comprising the AtPSKP2D DNA sequence of the invention, hereinafter the AtPSKP2D expression vector of the present invention, and which allows the transformation or transfection of microorganisms and cells and the subsequent Obtaining the AtPSKP2D transgenic plants of the invention.
  • the AtPSKP2D expression vector of the invention vectors pBI101 -PSKP2D (see Example 1) and vector pBI101-PSKP2D549 (see example 5) have been generated.
  • the AtPSKP2D expression vector of the present invention comprises, at least, an AtPSKP2D DNA sequence of the invention and, at least, a promoter that directs the transcription of the gene of interest (the sequence of promoter DNA Ia contains the DNA sequence AtPSKP2D), to which it is operatively linked, and other sequences necessary or appropriate for the transcription of the gene of interest and its appropriate regulation in time and place, for example, start and end signals, sites cutting, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators (enhancers), transcriptional silencers (silencers), etc.
  • appropriate expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each specific case among plant expression plasmids (Rothstein et al.
  • AtPSKP2D cell of the invention which contains the AtPSKP2D DNA sequence or the AtPSKP2D expression vector of the invention.
  • Another object of the present invention is the use of the AtPSKP2D DNA sequences, AtPSKP2D expression vectors, AtPSKP2D transformed cells, and the AtPSKP2D method of the present invention for obtaining AtPSKP2D transgenic plants of commercial interest, among others, to Illustrative title and without limiting the scope of the present invention: rice, wheat, soy, corn, tomato, potato, tobacco, beans, melon, watermelon, cucumber, strawberry, etc, as well as different fruit species (orange, lemon, pear, apple, etc).
  • FIGURE 1 Expression of the GUS gene by means of the AtPSKP2D promoter DNA sequence.
  • the AtPSKP2D promoter DNA sequence was fused to the GUS reporter gene (pSKP2D :: GUS) to analyze the expression pattern of said gene.
  • pSKP2D GUS reporter gene
  • FIG. 2 The AtPSKP2D promoter DNA sequence induces GUS expression by auxins, abyssic acid (ABA), salt and nutritional deficiency.
  • A Control; B, Auxins; C, ABA; D, NaCI; E, + Pl, with phosphate; F, -Pl, without phosphate.
  • FIG. 3 The AtPSKP2D promoter DNA sequence induces GUS expression in the cells of the pericycle.
  • FIG. 4 GUS gene expression induced by the AtPSKP2D promoter DNA sequence is diminished in the roots of axr1 mutants.
  • the pSKP2D :: GUS construct was introduced in axr1-3 and axr1 -12 mutants. Roots of the axr1-3 / pSKP2D :: GUS and axr1-12 / pSKP2D :: GUS plants were stained for GUS activity. As shown in the photographs, the axr1 mutants (axr 1-3 and axri-72) develop fewer GUS expression points along the main root.
  • Figure 5 Gene expression of specific GUS in the root induced by the promoter DNA sequence PSKP2D549.
  • Example 1 Cloning of a DNA sequence that controls the expression of genes in lateral root formation points (PSKP2D) and in the apical and root meristems.
  • the DNA sequence of the AtSKP2D gene was identified by sequence homology to the gene encoding the human SKP2 protein, which is involved in the control of the cell cycle and in the development of various tumors (Zhang, H., et al. 1995, CeII 82: 915-925).
  • the primers of the coding region of the cDNA of said gene were designed from the sequence annotated in the DNA bank of the Arabidopsis genome (http://www.arabidopsis.org).
  • transgenic plants have been generated that carry the DNA sequence of the A ⁇ SKP2D gene promoter cap az to direct the expression of the GUS reporter gene .
  • a 1740 base pair fragment was amplified, which supposedly should contain all of the A ⁇ SKP2D gene expression information, by PCR using the P1 oligonucleotides: ⁇ ' -GAAGATTTGGGGGAAGCTGCCC-S ' ( SEQ ID NO7) and P2: 5 -GCTCCTAGGTACTCACCATCCTTGAAGCGG-3 ' (SEQ ID NO8).
  • Said primers were designed from the annotated sequence of the Arabidopsis genome.
  • the promoter's DNA sequence was sequenced resulting in a 1740 nucleotide DNA sequence (SEQ ID NO1).
  • the amplified DNA sequence, SEQ ID NO1 was cloned into the PCR2.1 vector (Invitrogen) generating the PCR2.1-PSKP2D vector.
  • This vector was digested with the restriction enzymes BamHI and Spel to be subsequently cloned into the vector pBI101 (Clontech), which provides the DNA sequence encoding the GUS gene used as a reporter, generating the vector pBI101-PSKP2D.
  • the vector pBI101-PSKP2D was introduced into the strain of Agrobacter ⁇ um tumefaciens C58C1 by thermal shock (strain Agrobacter ⁇ um tumefaciens PSKP2D).
  • This Agrobacterium was used to transform Arabidopsis thaliana ecotype Columbia plants by infiltration (Bechtold et al. 1993. CR Acad. Sci. Paris Life Sci. 316: 15-18).
  • Transgenic plants carrying the DNA sequence of the promoter of the AtSKP2D gene fused to the reporter gene ⁇ -glucoronidase (GUS) (Jefferson et al., 1987. EMBO J. 6: 3901-3907), transgenic plants PSKP2D :: GUS, are they isolated by resistance to the antibiotic kanamycin, and represent a particular embodiment of the AtPSKP2D transgenic plant of the present invention.
  • transgenic plants were analyzed by histochemical staining of the GUS activity according to the protocol described by del Pozo et al. (2002, Plant CeII, 14: 421-433). 35 different lines were identified and 32 of them showed the same GUS staining pattern, and of these, two independent lines were analyzed in more detail.
  • a histochemical analysis of these transgenic plants has shown that the DNA sequence of the AtSKP2D promoter is capable of directing the expression of the GUS reporter gene along the main root (Figure 1A), in areas of cell division (apical and root meristems) , in vascular tissue and in stomata of the leaves ( Figure 1).
  • Example 2.- Gene expression from the AtSKP2D promoter is controlled by different environmental-hormonal factors.
  • NaCI Various environmental factors
  • auxin induce lateral root formation
  • the nutritional or water deficiency stimulates the development of the root system to increase the search surface for nutrients or water in the soil.
  • 5-day PSKP2D GUS plants were treated with 0.1 ⁇ M 2,4-D (auxin), 1 ⁇ M ABA or 150 mM salt (NaCI) for 16 hours.
  • Example 4 Expression of PSKP2B in mutants deficient in lateral root formation
  • the PSKP2B :: GUS transgene was introduced into the genetic background axr1 (within the weak allele axr1-3 and the strong allele axr1-12).
  • the AXR1 gene codes for an enzyme involved in the modification of AtCULI, a structural component of the SCF complex of the ubiquitin pathway (del Pozo et al. 2002, Plant CeII, 14: 421-433).
  • the axr1-3 and axr1-12 mutant plants have a diminished response to auxins and also the formation of lateral roots is diminished (Lincon et al., 1990 Plant CeII 2: 1071-1080).
  • the PSKP2D GUS transgenic plants were crossed with axr1 mutant plants (alleles 3 and 12) obtaining PSKP2D transgenic plants with axr1 mutations (PSKP2B :: GUS / axr1-12 and PSKP2B :: GUS / axr1-3) plants, that represent a particular embodiment of the AtPSKP2D transgenic plant of the present invention.
  • PSKP2B The 5-day PSKP2B :: GUS and PSKP2B :: GUS / axr1 transgenic plants were stained for GUS activity.
  • the mutation in the AXR1 gene PSKP2B :: GUS / axr1-12 and PSKP2B :: GUS / axr1-3 plants
  • PSKP2B the mutation in the AXR1 gene
  • PSKP2B GUS / axr1-12
  • PSKP2B GUS / axr1-3 plants
  • This result indicates that there is a correlation between the number of expression points induced by the AtSKP2D promoter and the number of lateral roots formed.
  • the isolated AtSKP2D promoter DNA sequence is capable of directing the expression of the GUS sneak gene in different organs as described above ( Figure 1).
  • Figure 1 In order to delimit the region responsible for the expression of AtSKP2D, alone and specifically, in the cells of the pericycle that will lead to the formation of lateral roots - that is, the expression in patches along the root - and Therefore, to control the root development, deletions of this AtSKP2D promoter DNA sequence have been made and the regulatory capacity of the expression of a reporter gene has been analyzed.
  • the generation and the results obtained with the promoter DNA sequence PSKP2D549 are described below.
  • the vector pBI101-PSKP2D was digested with the Hindlll restriction enzyme, eliminating a 5 ' region of 1191 base pairs of the PSKP2B promoter.
  • the vector was released, generating the vector pBI101-PSKP2D549, which contains 549 nucleotides from the promoter region upstream of the ATG of the A ⁇ SKP2D gene (including ATG bases) fused to the GUS reporter gene (SEQ ID NO4).
  • transgenic plants PSKP2D549 were transformed with Agrobacterium tumefaciens C58C1 which had the binary plasmid pBI101-PSKP2D549 (developed as indicated in Example 1 for plasmid pBI101-PSKP2D).
  • the PSKP2D549 :: GUS transgenic plants showed an expression pattern of the GUS gene different from that of the PSKP2D :: GUS transgenic plants, since the GUS activity was only detected at discrete points along the main root ( Figure 5), specifically in pericyl cells, and not in other areas or plant cells.
  • a promoter DNA sequence of 549 base pairs upstream of the ATG (PSKP2D549, SEQ ID NO4) has been identified that directs in a highly specific way the expression of the GUS gene in the cells of the pericycle, in the form of discrete points to Io along the root ( Figure 5) and not in other cells of other organs.
  • this PSKP2D549 promoter DNA sequence (SEQ ID NO 4) does not respond to different external stimuli against which the AtPSKP2D promoter DNA sequence was induced, such as salinity, excess sugars or treatments with auxin hormones and ABA or by exposure to pathogens (the results are negative and the observed pattern is identical to that of the PSKP2D549 :: GUS control plants).
  • external stimuli against which the AtPSKP2D promoter DNA sequence was induced such as salinity, excess sugars or treatments with auxin hormones and ABA or by exposure to pathogens (the results are negative and the observed pattern is identical to that of the PSKP2D549 :: GUS control plants).
  • the above experiments were performed as described above. It should be noted that this specificity is very important to avoid side effects of the expression of regulatory genes under the promoter DNA sequence of the invention.

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Abstract

La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su capacidad de desarrollar raíces laterales Se describen plantas transgénicas AtPSKP2D capaces de responder ante situaciones medioambientales que contienen un nuevo material genético que permite el control del desarrollo radicular mediante Ia expresión de forma específica de genes de interés en Ia células del periciclo formadoras de las raíces laterales (RLs). Estas técnicas pueden aplicarse a plantas de interés comercial de tal forma que estas plantas transgénicas pueden crecer tanto en medios pobres en nutrientes o en agua, como fertilizadas con una menor concentración de fertilizantes, por lo que representan una importante innovación en el sector agroalimentario.

Description

TITULO
PLANTAS TRANSGÉNICAS AÍPSKP2D, SU PROCEDIMIENTO DE
OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES
SECTOR DE LA TÉCNICA
La invención tiene una aplicación en el sector de Ia agricultura, preferentemente en el desarrollo de plantas transgénicas. Esta invención describe una herramienta biotecnológica destinada a modificar el desarrollo radicular de las plantas, y por Io tanto, su acceso a los nutrientes y el agua en función de las necesidades.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las plantas, debido a su carácter sésil, necesitan adaptarse y responder a los diferentes ambientes en los que crecen. La arquitectura radicular está directamente relacionada con Ia adquisición de nutrientes y agua del suelo, y por Io tanto con Ia adaptación de las plantas a los diferentes medioambientes. Por ello, estos organismos han desarrollado diferentes sistemas radiculares, que están determinados tanto por el número como por Ia longitud y Ia posición de las raíces laterales (RLs) desarrolladas. En muchos suelos, Ia disponibilidad de ciertos nutrientes tales como el fosfato, el nitrato o el azufre, es un parámetro limitante para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Por ello, estos organismos han desarrollado diferentes sistemas que les permite cuantificar los niveles de estos nutrientes y responder tanto a nivel fisiológico como molecular para obtener estos nutrientes en caso de déficit. Así, por ejemplo, una deficiencia de fosfato o de azufre estimula Ia formación de las raíces laterales, Io que incrementa Ia superficie de búsqueda de estos compuestos en el suelo circundante a Ia planta (revisado por López-Bucio et al. 2003, Current Opinión Plant Biology 6: 280-287). Las raíces laterales se forman a partir de unas células específicas en Ia raíz principal, llamadas células del periciclo. Drubovsky y colaboradores (Drubovsky et al. 2001 , Planta, 214: 30- 36) han determinado que las células del periciclo adyacentes a los polos del xilema son las responsables de Ia formación de los primordios laterales. En un determinado momento del desarrollo las células del periciclo se paran en Ia fase G1 del ciclo celular, manteniéndose en este estado hasta que se reactiva el proceso de división celular para dar lugar al primordio lateral (Beckman et al., J Exp Bot. 52: 403-11 , 2001 ). La identificación de genes que se expresan en los primordios laterales y de mutantes que tienen alterado el desarrollo de las raíces laterales ha contribuido en gran medida a comenzar a entender las bases genéticas y moleculares que gobiernan este proceso (Casimiro et al. 2003, Trends Plant Science 8: 165-171). Sin embargo, los mecanismos que controlan el patrón espacio-temporal de formación de las raíces laterales, así como los mecanismos desencadenantes que hacen que las células del periciclo paradas en G1 re-entren en proliferación, son desconocidos hasta Ia fecha. Diversos resultados obtenidos del análisis de mutantes afectados en el desarrollo radicular han indicado que Ia hormona auxina y Ia proteólisis selectiva de proteínas a través de Ia ruta de Ia ubiquitina juega un papel crítico en Ia formación de las raíces laterales (Casimiro et al. 2003, Trends Plant Science 8: 165-171 ; Gray et al. 2001 , Nature. 414: 271-6; Xie Q, et al. 2002, Nature 419: 167-170). Uno de los mutantes más severos en Ia respuesta a las auxinas es axr1. El gen AXR1 codifica una proteína implicada en Ia modificación postraduccional de Culinal con Ia proteína RUB. Culinal es un componente estructural del complejo SCF. Este complejo interviene en Ia modificación de proteínas dianas con ubiquitina para su posterior degradación a través del proteosoma. Otro mutante de Ia respuesta a las auxinas, tir1, también tiene afectado Ia formación de RLs. TIR1 codifica para una proteína con motivo-F que forma parte de un complejo ligasa E3 de ubiquitina que está implicada en el reclutamiento de proteínas dianas para su degradación (Gray et al. 2001 , Nature, 414: 271-6). Mediante análisis genético, TIR1 se ha situado por debajo de Ia función de AXR1 en el proceso de formación de raíces laterales. Recientemente, Xie et al. (2002, Nature, 419: 167-170) describieron el gen NAC, que codifica para un factor de trascripción de Ia familia NAM/CUC (Aída M, et a.1997, Plant CeII. 9: 841-57; Xie Q, et al. 2002, Nature, 419: 167- 170), que funciona, aguas abajo de TIR1, como activador de formación de raíces laterales. La actividad de NAC 1 está también regulada mediante degradación selectiva a través de Ia ruta de Ia ubiquitina, implicando Ia función de Ia enzima E3 ligasa SINAT5 (Xie Q, et al. 2002, Nature 419: 167-170). Estos resultados indican que Ia degradación de reguladores a través de Ia ruta de Ia Ub juega un papel crítico en Ia formación de las raíces laterales. Además, estos datos han sugerido que las células del periciclo que van a dar lugar a los primordios laterales pueden estar paradas en G1 por Ia acción de un represor, y que posiblemente se degrade a través de Ia ruta de Ia Ub para permitir Ia re¬ entrada en Ia división celular de estas células. Sin embargo, aunque esta hipótesis es muy atractiva, hasta Ia fecha no existen evidencias experimentales que Ia sustenten.
Como se ha comentado anteriormente, Ia activación de genes implicados en Ia proliferación celular es necesaria para Ia activación y posterior desarrollo de los primordios laterales (Himanen et al. 2002, Plant CeII 14: 2339-2351 ). Diversos genes de proliferación se expresan constitutivamente en las células del periciclo, Io que los ha descartando como posibles candidatos responsables del disparo de Ia división celular en las células del periciclo (Mironov et al. 1997, Prog. CeII Cycle Res. 3: 29-41). Sin embargo, no se debe descartar Ia posibilidad de una modificación postraduccional de las proteínas codificadas por estos genes como el desencadenante de Ia reactivación de las células del periciclo. Debido a Ia parada de estas células del periciclo en G2, se especuló que Ia ciclina mitótica B1;1 pudiera ser el gen regulador del proceso de formación de las LR. Sin embargo, Ia expresión ectópica del gen CYCB1;1 bajo el control del promotor de Ia kinasa dependiente de ciclina CDKyA, que se expresa en las células del periciclo, no incrementa Ia formación de primordios laterales (Doener, et al. 1996, Nature, 380: 520-523). Estos mismos autores han desarrollado una patente para el control del crecimiento de las plantas mediante Ia expresión de Ia ciclina B1 (Methods for increasing growth and yield in plants (CYC1 ). Doerner, Lamb, Patente USA 6,252,139).
El gen DFL1 pertenece a Ia familia de genes moduladores de Ia respuesta a las auxinas GH3. Mediante el análisis de un mutante para este gen, se ha observado que DFL1 funciona en el desarrollo del tallo y de las raíces laterales, ya que dicho mutante genera muchas menos RLs sin afectar a Ia longitud de Ia raíz principal (Nakazawa et al. 2001 , Plant J. 25: 213-221 ; Patente 2002-010786 Lateral root formation supresor gene. Miki Nakazawa et al.). En resumen, para una buena adaptación de las plantas al medio ambiente, el desarrollo de un sistema radicular óptimo al terreno donde crecen es un proceso crítico para su supervivencia. Por ello, Ia manipulación de genes que permita controlar el sistema radicular es de gran interés agronómico, ya que se podrían obtener plantas que se adapten mejor a los diferentes medios ambientes hostiles (secos, pobres en nutrientes, etc). El incremento del sistema radicular hace que las plantas sean más eficientes en Ia captación de nutrientes y del agua, con Io que podría reducir tanto Ia cantidad de fertilizantes como de agua de regadío utilizados en diferentes cultivos. Para poder manipular genéticamente Ia arquitectura radicular es necesario conocer que genes están implicados en el desarrollo de las raíces. Sin embargo, los mecanismos genéticos y moleculares que determinan tanto el número como Ia localización de las RLs son completamente desconocidos. Asimismo, para evitar efectos secundarios en otras partes de las plantas, es muy importante disponer de promotores que permitan expresar de forma muy específica los genes de interés que controlen el desarrollo radicular.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción breve La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su capacidad de desarrollar raíces laterales.
Así, un objeto de Ia presente invención Io constituye una planta transgénica AtPSKP2D, en adelante planta transgénica AtPSKP2D de Ia presente invención, que contiene una secuencia de DNA AtPSKP2D que permite Ia expresión de una proteína de interés en las células de dicha planta, y que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes: a) una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y b) una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye un procedimiento de obtención de Ia planta transgénica AtPSPK2D, en adelante procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de Ia presente invención, que consiste en Ia introducción en una planta de Ia secuencia de DNA AtPSKP2D que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes: a) una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y b) una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D
Las secuencias de DNA, vectores de expresión y células o microorganismos transformados, desarrollados y necesarios para Ia puesta en práctica del procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de Ia presente invención, así como su empleo para Ia producción de dichas plantas, constituyen aspectos adicionales de Ia presente invención.
Finalmente, otro objeto de Ia presente invención es el uso de las secuencias de DNA AtPSKP2D, vectores de expresión AtPSKP2D, células transformadas AtPSKP2D, y del procedimiento AtPSKP2D de Ia presente invención para Ia obtención de plantas transgénicas AtPSKP2D de interés comercial, entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, patata, tabaco, judía, melón, sandia, pepino, fresa, etc, así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero, peral, manzano, etc).
Descripción detallada de Ia invención
La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su capacidad de desarrollar raíces laterales.
La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que es posible obtener plantas transgénicas capaces de responder ante situaciones medioambientales porque contienen un nuevo material genético que permite el control del desarrollo radicular mediante Ia expresión de forma específica de genes de interés en Ia células del periciclo formadoras de las raíces laterales (RLs). Estas nuevas plantas transgénicas son plantas potencialmente mejoradas para su crecimiento tanto en medios pobres en nutrientes o en agua, como fertilizadas con una menor concentración de fertilizantes, por Io que representan una importante innovación en el sector agroalimentario.
En Ia presente invención se describe Ia secuencia de DNA de un nuevo gen, Ia secuencia del gen AtSKP2D (ver SEQ ID NO2, entre el nucleótido 501 - 2014), que codifica para una proteína con motivo-F, homologa a SKP2 de humanos (Zhang, H., et al. 1995, CeII 82: 915-925), Ia proteína AtSKP2D (SEQ ID NO3) y de su promotor. Esta familia de proteínas con motivo-F forman parte de los complejos E3-ligasas del tipo SCF que están implicados en Ia proteólisis de proteínas a través de Ia ruta de Ia ubiquitina. Datos recientes mostraron que estas proteínas con motivo-F, y en concreto AtSKP2A, juegan un papel importante en el control de Ia proliferación celular mediante Ia proteólisis selectiva de reguladores de Ia división celular (del Pozo et al. 2002, Plant CeII. 14: 421-433).
Sin embargo, en Ia presente invención se ha observado por primera vez que Ia expresión del gen AtSKP2D se induce en Ia raíz de Ia planta por tratamiento con las hormonas auxina y ácido abcísico (ABA) o por estrés salino (ver Figura 2 y Ejemplo 2). Dicho gen se expresa en parches discretos a Io largo de Ia raíz principal, y más concretamente en las células del periciclo (células a partir de las cuales se desarrrollan las RLs) y con mayor intensidad en las células próximas al xilema, que son las que se dividen para dar lugar a un primordio lateral (ver Figura 3 y Ejemplo 3 ). Análisis micro-morfológico de estos puntos de expresión de AtSKP2D han mostrado que en muchos de ellos aun no se ha producido ninguna división de las células del periciclo. Esto, junto al hecho de que muchos de estos puntos de expresión estén muy cercanos al meristemo radicular, donde en condiciones normales no se forman primordios laterales, sugiere que estos parches de expresión son futuros puntos de formación de raíces laterales. Esta hipótesis se encuentra soportada igualmente por Io observado en plantas transgénicas PSKP2D::GUS/axr1 (Figura 4 y Ejemplo 4). Además, Ia invención está dirigida a desarrollar una secuencia de DNA promotora que permita Ia expresión génica en una planta, sino también, de forma preferente y específica, en las células del periciclo que van a dar lugar a Ia formación de raíces laterales para poder así controlar el desarrollo del sistema radicular, es decir, en las raíces. Por ello, se han llevado a cabo deleciones de Ia secuencia de DNA del promotor de AtSKP2D para hallar el dominio responsable de Ia expresión en parches a Io largo de Ia raíz, identificándose una secuencia de DNA (PSKP2B549) (SEQ ID NO4) que dirige Ia expresión tan sólo en las células del periciclo de los puntos a Io largo de Ia raíz y no en otras células de otros órganos.
Así, un objeto de Ia presente invención Io constituye una planta transgénica AtPSKP2D, en adelante planta transgénica AtPSKP2D de Ia presente invención, que contiene una secuencia de DNA AtPSKP2D que permite Ia expresión de una proteína de interés en las células de dicha planta, y que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes: c) una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y d) una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "secuencia de DNA promotora AtPSPK2D" se refiere a una secuencia de DNA promotora de Ia expresión génica constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo: a) secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1 ), b) secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4), c) un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b), d) secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y e) cualquier secuencia de DNA que comprenda Ia secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de Ia expresión génica.
El término "secuencia de DNA codificante de una proteína de interés" tal como se utiliza en Ia presente invención se refiere a: a) una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en Ia formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular Ia arquitectura radicular, es decir, capaz de modificar Ia arquitectura radicular de una planta - tanto el número como Ia posición de las raíces laterales - como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, las secuencias de DNA codificantes de las proteínas pertenecientes al siguiente grupo: Ia secuencia AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de Ia proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKBI , AtKRPI , AKRP2, AtCDTI , AtCDC6 (Vandepoele, et al. Plant CeII
2002, 14: 903-916.), AtAXRI (Leyser et al. Nature 1993, 364: 161- 164), AtECRI (del Pozo et al. Science 1998, 280:1760-1763), AtTIRI (Ruegger et al. 1998, Genes Dev. 12: 198-207), AtIAAI 4 (Fukaki et al. 2002, Plant J. 29: 153-168), AtNACI (Xie et al. 2000, Gene Dev. 14: 3024-3036), y b) una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en Ia planta, y más preferentemente en Ia raíz, permita su recogida y purificación posterior, como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, perteneciente al siguiente grupo: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra
Ia caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo Ia insulina o Ia relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifúngicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo, fitasas, liquenasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
El término "una secuencia de DNA promotora" tal como se utiliza en Ia presente invención se refiere a cualquier secuencia de DNA promotora capaz de regular Ia expresión génica en plantas como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, un promotor fuerte constitutivo, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, o un promotor que se exprese en todas las células del periciclo, como por ejemplo el de Ia kinasa dependiente de ciclinas del tipo A o del tipo B (Vandepoele, et al. Plant CeII 2002, 14: 903-916). El término "secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D" tal como se utiliza en Ia presente invención se refiere a Ia secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de Ia proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3), así como cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA. Un objeto particular de Ia presente invención Io constituye una planta transgénica AtPSKP2D de Ia presente invención en Ia que Ia secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es Ia secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1 ). Una realización particular de esta es Ia planta transgénica PSKP2D::GUS, y las plantas PSKP2B::GUS/axr1-12 y PSKP2B::GUS/axr1-3, generadas en Ia presente invención (ver Ejemplo 1 y 4).
Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye una planta transgénica AtPSKP2D que contiene una secuencia de DNA AtPSKP2D que permite Ia expresión de una proteína de interés de manera específica en las células del periciclo que van a dar lugar a Ia formación de raíces laterales y que está constituida por una de las posibilidades siguientes: a) secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4), b) un fragmento de las secuencias de DNA de a), c) secuencia de DNA análoga a las secuencias de a) y b), y d) cualquier secuencia de DNA que comprenda Ia secuencia de DNA de a), b), o c) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de Ia expresión génica.
Una realización particular de Ia presente invención Io constituye una planta transgénica AtPSKP2D de Ia presente invención en Ia que Ia secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es Ia secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID
NO4). Una realización particular de esta es Ia planta transgénica
PSKP2D549::GUS, generada en Ia presente invención (ver Ejemplo 5).
Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye una planta transgénica AtPSKP2D de Ia presente invención en Ia que Ia secuencia de DNA codificante de una proteína de interés es Ia secuencia de DNA codificante de Ia proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO2).
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye un procedimiento de obtención de Ia planta transgénica AtPSPK2D, en adelante procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de Ia presente invención, que consiste en Ia introducción en una planta de Ia secuencia de DNA AtPSKP2D que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes: c) una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y d) una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Una realización particular de Ia presente invención Io constituye un procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D que comprende los siguientes pasos: a) obtención de un vector de expresión que contiene una secuencia de DNA AtPSPK2D, b) obtención de microorganismos portadores del vector a), y c) transformación de las plantas con el vector de a) o con el microorganismo de b).
Las secuencias de DNA, vectores de expresión y células o microorganismos transformados, desarrollados y necesarios para Ia puesta en práctica del procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de
Ia presente invención, así como su empleo para Ia producción de dichas plantas, constituyen aspectos adicionales de Ia presente invención.
Así, otro objeto de Ia presente invención Io constituye una secuencia de
DNA AtPSK2D, en adelante secuencia de DNA AtPSKP2D de Ia presente invención, que permite Ia expresión de una proteína de interés en las células de planta y que está constituida por una de las posibilidades siguientes: a) una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de
DNA codificante de una proteína de interés, y b) una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D
Un objeto particular de Ia presente invención Io constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de Ia invención en Ia que Ia secuencia de DNA promotora AtPSKP2D está constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo: a) secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1 ), b) secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4), c) un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b), d) secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y e) cualquier secuencia de DNA que comprenda una secuencia DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de Ia expresión génica.
Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de Ia invención en Ia que Ia secuencia de DNA codificante de una proteína de interés está constituida por una de las siguientes secuencias de DNA: a) una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en Ia formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular Ia arquitectura radicular, es decir, capaz de modificar Ia arquitectura radicular de una planta - tanto el número como Ia posición de las raíces laterales - como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, las secuencias de DNA codificantes de las proteínas pertenecientes al siguiente grupo: Ia proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de Ia proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKBI , AtKRPI , AtKRP2, AtCDTI , AtCDC6 (Vandepoele, et al. Plant CeII 2002, 14: 903-916.), AtAXRI (Leyser et al. Nature 1993, 364: 161-164), AtECRI (del Pozo et al. Science 1998, 280:1760-1763), AtTIRI (Ruegger et al. 1998, Genes Dev. 12: 198-207), AtlAA14 (Fukaki et al. 2002, Plant J. 29: 153-168) y AtNACI (Xie et al. 2000, Gene Dev. 14: 3024-3036), y b) una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en Ia planta, y más preferentemente en Ia raíz, permita su recogida y purificación posterior, como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, perteneciente al siguiente grupo: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra Ia caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo Ia insulina o Ia relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifúngicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo, fitasas, liquenasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas). Estas proteínas de interés así como las secuencias de DNA codificantes de las mismas son conocidas por un experto en Ia materia e incluyen igualmente todas aquellas que se identifiquen en el futuro.
Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de Ia invención en Ia que Ia secuencia de DNA promotora es cualquier secuencia de DNA promotora capaz de regular Ia expresión génica en plantas como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, un promotor fuerte constitutivo, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, o un promotor que se exprese en todas las células del periciclo, como por ejemplo el de Ia kinasa dependiente de ciclinas del tipo A (CDKA) o del tipo B (Vandepoele, et al. Plant CeII 2002,
14: 903-916)
Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de Ia invención en Ia que Ia secuencia de DNA codificante de una proteína de interés es Ia secuencia de DNA AtPSKP2D
(SEQ ID NO2) codificante de Ia proteína de SEQ ID NO3, así como cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias de DNA mostradas en Ia presente invención, por ejemplo, mediante Ia introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo Ia inserción de uno o más nucleótidos, Ia adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de Ia molécula o Ia deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de Ia secuencia.
En general, una secuencia de ADN análoga es sustancialmente homologa a Ia secuencia de nucleótidos comentadas anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La secuencia de ADN promotora AtPSKP2D (SEQ ID NO1 ) y del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) de Ia invención proceden de Arabidopsis thaliana y pueden encontrarse en formas homologas en otras especies de plantas superiores de interés comercial, entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, tabaco, judía, así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero, etc), donde pueden estar de forma natural o en otro caso, también podrían estar como resultado de un proceso de transformación génica en el que el organismo transformado reproduzca dichas moléculas de ADN. Estas formas homologas de Ia secuencia de ADN promotora AtPSKP2D (SEQ ID NO 1) y del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) de Ia invención pueden ser aisladas, mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier planta que las contengas y mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos, preparados gracias a Ia información de las secuencias de nucleótidos de dichas moléculas de ADN proporcionadas en esta invención, por cualquier experto en Ia materia.
Por otro lado, a partir de las secuencias de DNA promotoras de Ia presente invención, AtPSKP2D y PSKP2D549, un experto en Ia materia puede fácilmente obtener otras deleciones o fragmentos que permitan regular Ia expresión génica específica o no de órgano, y preferentemente otras secuencias de DNA promotoras de forma especifica de un gen de interés en Ia raíz. La secuencia de DNA AtPSK2D de Ia invención puede ser utilizada, en general, en Ia generación de un vector de expresión que permite Ia expresión de estas proteínas en una amplia gama de células huésped.
Por Io tanto, Ia invención también se refiere a un vector de expresión que comprende Ia secuencia de DNA AtPSKP2D de Ia invención, en adelante vector de expresión AtPSKP2D de Ia presente invención, y que permite Ia transformación o transfección de microorganismos y células y Ia posterior obtención de las plantas transgénicas AtPSKP2D de Ia invención. Como realizaciones particulares del vector de expresión AtPSKP2D de Ia invención se han generado los vectores pBI101 -PSKP2D (ver Ejemplo 1 ) y el vector pBI101 - PSKP2D549 (ver ejemplo 5).
En general, el vector de expresión AtPSKP2D de Ia presente invención comprende, al menos, una secuencia de DNA AtPSKP2D de Ia invención y, al menos, un promotor que dirige Ia transcripción del gen de interés (Ia secuencia de DNA promotora Ia contiene Ia secuencia de DNA AtPSKP2D), al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción del gen de interés y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión de plantas (Rothstein et al. (1987) Promoter cassettes, antibiotic- resistance genes, and vectors for plant transformation Gene 53:153-61 ; Potrykus, I. (1991 ). Gene transfer to plants: Assessment of published approaches and results. Annu. Rev. Pl. Physiol. Pl. Mol. Biol. 42, 205-255.), virus ("Plant Virology Protocols" From Virus Isolation to Transgenic Resistance Edited by: Gary D. Foster University of Bristol, Bristol, UKPublished: 1998), que pueden contener, además, un origen bacteriano o de levadura de replicación para que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras, así como un marcador utilizable para seleccionar las células transfectadas diferente al gen o genes de interés. Para Ia transformación de las plantas se pueden utilizar diferentes métodos - vectores plasmidicos, liposomas, electroporación, microinyección, etc - descritos en diversos manuales (ver por ejemplo: (Plant Gene Transfer and Expression Protocols Jones, Heddwyn University of Hertfordshire, Hatfield, UK. Human Press Publishers). La elección del vector dependerá de Ia célula hospedadora y de Ia planta en Ia que se va a introducir posteriormente. Otro objeto de Ia invención Io constituye un microorganismo o célula, en adelante célula AtPSKP2D de Ia invención, que contiene Ia secuencia de DNA AtPSKP2D o el vector de expresión AtPSKP2D de Ia invención.
Finalmente, otro objeto de Ia presente invención es el uso de las secuencias de DNA AtPSKP2D, vectores de expresión AtPSKP2D, células transformadas AtPSKP2D, y del procedimiento AtPSKP2D de Ia presente invención para Ia obtención de plantas transgénicas AtPSKP2D de interés comercial, entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, patata, tabaco, judía, melón, sandia, pepino, fresa, etc, así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero, peral, manzano, etc).
DESCRIPCIÓN DE FIGURAS FIGURA 1 : Expresión del gen GUS mediante Ia secuencia de DNA promotora AtPSKP2D. La secuencia de DNA promotora de AtPSKP2D se fusionó al gen reportador GUS (pSKP2D::GUS) para analizar el patrón de expresión de dicho gen. A) Plántulas transgénicas portadoras de Ia construcción pSKP2D::GUS de 6 días teñidas para actividad GUS. B) Actividad GUS en cotiledones (detalle del tejido vascular y de los estomas). C) Actividad GUS en flores jóvenes. D) Actividad GUS en una flor madura, mostrando tinción en los sépalos, en los pétalos, en los estambres y en el carpelo. Figura 2: La secuencia de DNA promotora AtPSKP2D induce Ia expresión de GUS por auxinas, ácido abcísico (ABA), sal y deficiencia nutricional. A, Control; B, Auxinas; C, ABA; D, NaCI; E, +Pl, con fosfato; F, -Pl, sin fosfato.
Figura 3: La secuencia de DNA promotora AtPSKP2D induce Ia expresión de GUS en las células del periciclo. A) Plántulas transgénicas portadoras de Ia construcción pSKP2D::GUS de 6 días teñidas para actividad GUS. B) Detalle de los puntos de tinción a Io largo de Ia raíz. C) Corte transversal de unos de los puntos mostrados en B, y más cercanos al meristemo radicular, que muestra tinción GUS en las células del periciclo.
Figura 4: La expresión génica de GUS inducida por La secuencia de DNA promotora AtPSKP2D está disminuida en las raíces de los mutantes axr1. La construcción pSKP2D::GUS se introdujo en los mutantes axr1-3 y axr1 -12. Raíces de las plantas axr1-3/pSKP2D::GUS y axr1-12/pSKP2D::GUS se tiñeron para actividad GUS. Como se muestran en las fotografías, los mutantes axr1 (axr 1-3 y axrí-72) desarrollan menos puntos de expresión de GUS a Io largo de Ia raíz principal. Figura 5: Expresión génica de GUS específica en Ia raíz inducida por La secuencia de DNA promotora PSKP2D549. La región promotora que comprende aproximadamente los primeros 549 pares de bases aguas arriba del ATG del gen AtSKP2D se fusionó al gen reportador GUS (pSKP2D549::GUS) para analizar Ia capacidad y el patrón de expresión de dicho fragmento de DNA. Plántulas transgénicas portadoras de Ia construcción pSKP2D::GUS de 6 días teñidas para actividad GUS. A) Parte apical de plántulas pSKP2D::GUS y pSKP2D549::GUS B) Parte distal de las raíces de plántulas pSKP2D::GUS y pSKP2D549::GUS. C) Parte apical de las raíces de plántulas pSKP2D::GUS y pSKP2D549::GUS.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1.- Clonaje de una secuencia de DNA que controla Ia expresión de genes en puntos de formación de las raíces laterales (PSKP2D) y en los meristemos apical y radicular.
La secuencia de DNA del gen AtSKP2D se identificó por homología de secuencia al gen codificante de Ia proteína de humanos SKP2, que está implicada en el control del ciclo celular y en el desarrollo de diversos tumores (Zhang, H., et al. 1995, CeII 82: 915-925). Para aislar esta secuencia de DNA AtSKP2D, se diseñaron a partir de Ia secuencia anotada en el banco de DNA del genoma de Arabidopsis (http://www.arabidopsis.org) los cebadores de Ia región codificante del cDNA de dicho gen (P3: 5' ATGGTGAGTG AAGGAGCAAC AAG 3' (SEQ ID NO5) y P4: 5' TCAATGCGCCGGGTGAGGGTA 3' (SEQ ID NO 6)) y se amplificó mediante PCR, utilizando una genoteca de flores de Arabidopsis thaliana como DNA molde. Dicho cDNA se clonó en el vector PCR2.1 (Invitrogen). De dicho clonaje se secuenciaron varios clones obteniéndose de todos ellos Ia misma secuencia de DNA, que correspondía a Ia secuencia de DNA AtSKP2D (SEQ ID NO2).
Para analizar Ia capacidad reguladora de Ia expresión génica de Ia secuencia de DNA promotora AtSKP2D a Io largo del desarrollo de las plantas se han generado plantas transgénicas que portan Ia secuencia de DNA del promotor del gen AÍSKP2D cap az de dirigir Ia expresión del gen reportador GUS. Para clonar Ia secuencia de DNA del promotor del gen AÍSKP2D se amplificó un fragmento de 1740 pares de bases, que supuestamente debería de contener toda Ia información de expresión del gen AÍSKP2D, mediante PCR utilizando los oligonucleótidos P1 : δ'-GAAGATTTGGGGGAAGCTGCCC-S' (SEQ ID NO7) y P2: 5 -GCTCCTAGGTACTCACCATCCTTGAAGCGG-3' (SEQ ID NO8). Dichos cebadores se diseñaron a partir de Ia secuencia anotada del genoma de Arabidopsis. La secuencia de DNA del promotor se secuenció resultando una secuencia de DNA de 1740 nucleótidos (SEQ ID NO1 ). La secuencia de DNA amplificada, SEQ ID NO1 , se clonó en el vector PCR2.1 (Invitrogen) generando el vector PCR2.1-PSKP2D. Este vector se digirió con las enzimas de restricción BamHI y Spel para clonarlo posteriormente en el vector pBI101 (Clontech), que aporta Ia secuencia de DNA codificante del gen GUS utilizado como reportero, generando el vector pBI101-PSKP2D. El vector pBI101-PSKP2D se introdujo en Ia cepa de Agrobacteríum tumefaciens C58C1 mediante choque térmico (cepa Agrobacteríum tumefaciens PSKP2D). Este Agrobacteríum se utilizó para transformar plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia mediante infiltración (Bechtold et al. 1993. C. R. Acad. Sci. París Life Sci. 316: 15-18). Las plantas transgénicas portadoras de Ia secuencia de DNA del promotor del gen AtSKP2D fusionado al gen reportero β-glucoronidasa (GUS) (Jefferson et al., 1987. EMBO J. 6: 3901 -3907), plantas transgénicas PSKP2D::GUS, se aislaron mediante resistencia al antibiótico kanamicina, y representan una realización particular de Ia planta transgénica AtPSKP2D de Ia presente invención.
Estas plantas transgénicas se analizaron mediante tinción histoquímica de Ia actividad GUS de acuerdo con el protocolo descrito por del Pozo et al. (2002, Plant CeII, 14: 421-433). Se identificaron 35 líneas diferentes y 32 de ellas mostraban el mismo patrón de tinción GUS, y de estas, dos líneas independientes fueron analizadas en más detalle. Un análisis histoquímico de estas plantas transgénicas ha mostrado que Ia secuencia de DNA del promotor AtSKP2D es capaz de dirigir Ia expresión del gen reportador GUS a Io largo de Ia raíz principal (Figura 1A), en zonas de división celular (meristemos apical y radicular), en el tejido vascular y en los estomas de las hojas (Figura 1 ). Ejemplo 2.- La expresión génica a partir del promotor AtSKP2D es controlada por diferentes factores ambientales-hormonales
Diversos factores ambientales (NaCI) u hormonales (auxina, ABA) son capaces de inducir Ia expresión génica a través del promotor AtSKP2D en Ia raíz. La mayoría de estos factores están relacionados con el desarrollo del sistema radicular. Por ejemplo, las auxinas inducen Ia formación de raíces laterales; Ia deficiencia nutricional o de agua (salinidad) estimula el desarrollo del sistema radicular para incrementar Ia superficie de búsqueda de nutrientes o agua en el suelo. Para analizar como diferentes estímulos que afectan a Ia formación de las raíces laterales modifican Ia expresión a través de Ia secuencia de DNA del promotor AtSKP2D, plantas PSKP2D::GUS de 5 días se trataron con 0.1 μM 2,4-D (auxina), 1 μM de ABA ó 150 mM de sal (NaCI) durante 16 horas. Estas plantas se tiñeron posteriormente para Ia actividad GUS tal como se indica en el Ejemplo 1. Como se observa en Ia Figura 2 (A, B, C y D), estos tres estímulos incrementan Ia expresión de GUS a través del promotor del gen AtSKP2D. Además, para analizar el efecto de Ia deficiencia nutricional sobre Ia expresión génica a partir del promotor AtSKP2D, plantas transgénicas PSKP2D::GUS de 5 días se crecieron durante 6 días más en un medio MS con (+Pi) o sin (-Pi) de fosfato. Posteriormente, estas plantas se tiñeron para Ia actividad GUS para analizar Ia expresión génica a partir del promotor AtSKP2D, que como se observa en Ia Figura 2 (E y F), se induce claramente cuando las plantas crecen en un medio deficiente en nutrientes (-Pi, Figura 2F). Ejemplo 3.- La expresión génica a partir del promotor AtSKP2D se produce en las células del periciclo formadoras de las raíces laterales.
El desarrollo de Ia invención se ha centrado en el análisis histoquímico de las plantas transgénicas PSKP2D::GUS, que mostró Ia expresión de este gen GUS en puntos discretos a Io largo de toda Ia raíz (Figura 3A y 3B), que se correlacionan con los puntos de formación de las raíces laterales. Cortes transversales de estos puntos de expresión con actividad GUS han mostrado que el promotor del gen AtSKP2D (PSKP2D) dirige Ia expresión del gen GUS en las células del periciclo, con mayor intensidad en las células próximas al xilema, que son las que se dividen para dar lugar a un primordio lateral (RLs) (Figura 3C).
El análisis micro-morfológico de estos puntos de expresión del gen GUS en estas plantas transgénicas han mostrado que en muchos de ellos aun no se ha producido ninguna división de las células del periciclo. Esto, junto al hecho de que muchos de estos puntos de expresión estén muy cercanos al meristemo radicular, donde en condiciones normales no se forman primordios laterales, sugiere que estos parches de expresión son futuros puntos de formación de raíces laterales.
Ejemplo 4.- Expresión de PSKP2B en mutantes deficientes en Ia formación de raíces laterales Para poder determinar si existe una correlación entre el número de puntos de expresión inducidos por el promotor AtSKP2D a Io largo de Ia raíz y Ia distribución o número de las raíces laterales, el transgén PSKP2B::GUS se introdujo dentro del fondo genético axr1 (dentro del alelo débil axr1-3 y del alelo fuerte axr1-12). El gen AXR1 codifica para una enzima implicada en Ia modificación de AtCULI , un componente estructural del complejo SCF de Ia ruta de Ia ubiquitina (del Pozo et al. 2002, Plant CeII, 14: 421-433). Las plantas mutantes axr1-3 y axr1-12 presentan una respuesta disminuida a las auxinas y además Ia formación de raíces laterales está disminuida (Lincon et al., 1990 Plant CeII 2: 1071-1080). Así, las plantas transgénicas PSKP2D::GUS se cruzaron con plantas mutantes axr1 (alelos 3 y 12) obtenién dose plantas transgénicas PSKP2D con mutaciones axr1 (plantas PSKP2B::GUS/axr1-12 y PSKP2B::GUS/axr1-3), que representan una realización particular de Ia planta transgénica AtPSKP2D de Ia presente invención. Las plantas transgénicas PSKP2B::GUS y PSKP2B::GUS/axr1 de 5 días se tiñeron para actividad GUS. Como se observa en Ia Figura 4, Ia mutación en el gen AXR1 (plantas PSKP2B::GUS/axr1-12 y PSKP2B::GUS/axr1-3) reduce drásticamente tanto el número como Ia posición de los puntos de expresión de GUS a través del promotor AtSKP2D a Io largo de Ia raíz y, también, estas plantas mutadas axr1 desarrollan muy pocas raíces laterales. Este resultado indica que existe una correlación entre el número de puntos de expresión inducidos por el promotor AtSKP2D y el número de raíces laterales formadas.
Estos resultados apoyan Ia hipótesis de que los puntos de Ia raiz donde Ia secuencia de DNA del promotor AÍSKP2D permite Ia expresión son regiones de formación de las raíces laterales. Debido a que AtSKP2D es una proteína implicada en Ia degradación, únicamente como hipótesis científica, es muy posible que el complejo sCFAtsκP2D esté implicado en Ia degradación selectiva de un represor de Ia formación de primordios laterales a través de Ia ruta de Ia UBQ. Además, Ia expresión en parches a Io largo de Ia raíz podría estar marcando donde se deben formar estos primordios laterales. Ejemplo 5: Identificación de una región de DNA que dirige Ia expresión de genes de forma altamente específica a las células del periciclo. La secuencia de DNA promotora AtSKP2D aislada es capaz de dirigir Ia expresión del gen chivato GUS en diferentes órganos como se ha descrito anteriormente (Figura 1 ). Para poder delimitar Ia región responsable de Ia expresión de AtSKP2D, sola y de forma específica, en las células del periciclo que van a dar lugar a Ia formación de raíces laterales - es decir, Ia expresión en parches a Io largo de Ia raíz - y, por tanto así controlar el desarrollo radicular, se han realizado deleciones de esta secuencia de DNA promotora AtSKP2D y analizado Ia capacidad reguladora de Ia expresión de un gen reportero. De las distintas deleciones estudiadas, y como una de las muchas posibles, se describe a continuación Ia generación y los resultados obtenidos con Ia secuencia de DNA promotora PSKP2D549.
Para generar dicha secuencia de DNA del promotor PSKP2D549, el vector pBI101-PSKP2D, descrito en el Ejemplo 1 , se digirió con Ia enzima de restricción Hindlll, eliminando una región 5' de 1191 pares de bases del promotor PSKP2B. El vector se religó, generándose el vector pBI101- PSKP2D549, que contiene 549 nucleótidos de Ia región promotora aguas arriba del ATG del gen AÍSKP2D (incluyendo las bases del ATG) fusionados al gen reportador GUS (SEQ ID NO4). Plantas de Arabidopsis thaliana se transformaron con Agrobacterium tumefaciens C58C1 que tenía el plásmido binario pBI101-PSKP2D549 (desarrollado tal como se indica en el Ejemplo 1 para el plásmido pBI101-PSKP2D). Las plantas transgénicas así obtenidas, plantas transgénicas PSKP2D549::GUS, que representan una realización particular de Ia planta transgénica AtPSKP2D de Ia presente invención, se seleccionaron en medio MS con kanamicina (50 μg/ml) y posteriormente se analizó el patrón de tinción de Ia actividad GUS en plántulas de 6 días como se ha comentado anteriormente. Las plantas transgénicas PSKP2D549::GUS mostraban un patrón de expresión del gen GUS diferente al de las plantas transgénicas PSKP2D::GUS, ya que Ia actividad GUS sólo se detectaba en los puntos discretos a Io largo de Ia raíz principal (Figura 5), concretamente en las células del pericilo, y no en otras áreas o células de las plantas. Así, se ha identificado una secuencia de DNA promotora de 549 pares de bases aguas arriba del ATG (PSKP2D549, SEQ ID NO4) que dirige de forma altamente específica Ia expresión del gen GUS en las células del periciclo, en forma de puntos discretos a Io largo de Ia raíz (Figura 5) y no en otras células de otros órganos.
Además, esta secuencia de DNA promotora PSKP2D549 (SEQ ID NO 4) no responde a diferentes estímulos externos frente a los que Ia secuencia de DNA promotora AtPSKP2D se inducía, tales como salinidad, exceso de azucares o tratamientos con las hormonas auxinas y ABA o por exposición a patógenos (los resultados son negativos y el patrón observado es idéntico al de las plantas PSKP2D549::GUS control). Los anteriores experimentos se realizaron tal como se han descrito anteriormente. Hay que destacar que esta especificidad es muy importante para evitar efectos secundarios de Ia expresión de genes reguladores bajo Ia secuencia de DNA promotora de Ia invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Planta transgénica AtPSKP2D caracterizada porque contiene una secuencia de DNA AtPSKP2D que permite Ia expresión de una proteína de interés en las células de dicha planta y porque dicha secuencia de DNA está constituida por una de las dos posibilidades siguientes: a) una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y b) una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
2.- Planta transgénica AtPSKP2D según Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia secuencia de DNA promotora AtPSPK2D de a) es una secuencia de DNA promotora de Ia expresión génica constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo: a) secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1 ), b) secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4), c) un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b), d) secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y e) cualquier secuencia de DNA que comprenda Ia secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de Ia expresión génica.
3.- Planta transgénica AtPSKP2D según Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es Ia secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1).
4.- Planta transgénica AtPSKP2D según Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia secuencia de DNA codificante de una proteína de interés de a) es una secuencia de DNA perteneciente al siguiente grupo: a) una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en Ia formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular Ia arquitectura radicular, o b) una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en Ia planta, y más preferentemente en Ia raíz, permita su recogida y purificación posterior.
5.- Planta transgénica AtPSKP2D según Ia reivindicación 4 caracterizada porque Ia secuencia de DNA codificante de una proteína de a) es una de las secuencias perteneciente al siguiente grupo: secuencia AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de Ia proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKBI , AtKRPI , AtKRP2, AtCDTI , AtCDC6 , AtAXRI , AtTIRI , AtNACI , así como cualquier forma análoga de estas secuencia de DNA.
6.- P lanta transgénica AtPSKP2D según Ia reivindicación 4 caracterizada porque Ia secuencia de DNA codificante de una proteína de b) pertenece al siguiente grupo de secuencias codificantes de proteínas: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra Ia caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo Ia insulina o Ia relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifungicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo fitasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
7.- Planta transgénica AtPSKP2D según Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D de b) está constituida por Ia secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de Ia proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3), así como cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
8.- Planta transgénica AtPSKP2D según Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia secuencia de DNA promotora de b) es una secuencia de DNA promotora capaz de regular Ia expresión génica en plantas perteneciente al siguiente grupo: a) un promotor fuerte constitutivo, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, y b) un promotor que se exprese en todas las células del periciclo, como por ejemplo el de Ia kinasa dependiente de ciclinas del tipo A o del tipo B.
9.- Planta transgénica AtPSKP2D según Ia reivindicación 1 caracterizada porque contiene una secuencia de DNA AtPSKP2D que permite Ia expresión de una proteína de interés de manera específica en las células del periciclo que van a dar lugar a Ia formación de raíces laterales y que está constituida por una de las posibilidades siguientes: a) secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4), b) un fragmento de las secuencias de DNA de a), c) secuencia de DNA análoga a las secuencias de a) y b), y d) cualquier secuencia de DNA que comprenda Ia secuencia de DNA de a), b), o c) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de Ia expresión génica.
10.- Planta transgénica AtPSKP2D según Ia reivindicación 9 caracterizada porque Ia secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es Ia secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4).
11. - Procedimiento de obtención de una planta transgénica AtPSPK2D según las reivindicaciones 1 a Ia 10 caracterizado porque consiste en Ia introducción en una planta de Ia secuencia de DNA AtPSKP2D que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes: a) una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y b) una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
12.- Procedimiento de obtención según Ia reivindicación 11 caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) obtención de un vector de expresión que contiene una secuencia de
DNA AtPSPK2D, b) obtención de microorganismos portadores del vector a), y c) transformación de las plantas con el vector de a) o con el microorganismo de b).
13.- Secuencia de DNA AtPSK2D caracterizada porque permite Ia expresión de una proteína de interés en las células de una planta y porque está constituida por una de las dos posibilidades siguientes: a) una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de
DNA codificante de una proteína de interés, y b) una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
14.- Se cuencia de DNA AtPSK2D según Ia reivindicación 13 caracterizada porque Ia secuencia de DNA promotora AtPSKP2D de a) está constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo: a) secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1 ), b) secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4), c) un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b), d) secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y e) cualquier secuencia de DNA que comprenda una secuencia DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de Ia expresión génica.
15.- Secuencia de DNA AtPSK2D según Ia reivindicación 14 caracterizada porque Ia secuencia de DNA codificante de una proteína de interés de a) está constituida por una de las siguientes secuencias de DNA: a) una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en Ia formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular Ia arquitectura radicular, o b) una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en Ia planta, y más preferentemente en Ia raíz, permita su recogida y purificación posterior.
16.- Secuencia de DNA AtPSK2D según Ia reivindicación 15 caracterizada porque Ia secuencia DNA codificante de una proteína de a) es una de las secuencias perteneciente al siguiente grupo: secuencia de DNA AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de Ia proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKBI , AtKRPI , AKRP2, AtCDTI , AtCDC6 , AtAXRI , AtTIRI , AtNACI , así como cualquier forma análoga de estas secuencia de DNA.
17.- Secuencia de DNA AtPSK2D según Ia reivindicación 15 caracterizada porque Ia secuencia de DNA codificante de una proteína de a) es Ia secuencia de DNA AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de Ia proteína de SEQ ID NO3, así como cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
18.- Secuencia de DNA AtPSK2D según Ia reivindicación 15 caracterizada porque Ia secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial de b) pertenece al siguiente grupo de secuencias codificantes de proteínas: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra Ia caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo Ia insulina o Ia relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifungicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo fitasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
19.- Secuencia de DNA AtPSK2D según Ia reivindicación 13 caracterizada porque Ia secuencia de DNA promotora es una secuencia de DNA promotora capaz de regular Ia expresión génica en plantas.
20.- Secuencia de DNA AtPSK2D según Ia reivindicación 19 caracterizada porque Ia secuencia promotora pertenece al siguiente grupo: el promotor del virus del mosaico 35S, y el promotor de Ia kinasa dependiente de ciclinas del tipo A (CDKA) o del tipo B.
21.- Vector de expresión caracterizado porque comprende Ia secuencia de DNA AtPSKP2D según las reivindicaciones 13 a Ia 20 y porque permite Ia transformación o transfección de microorganismos y células y Ia posterior obtención de las plantas transgénicas AtPSKP2D según las reivindicaciones 1 a Ia 10.
22.- Microorganismo o célula transformada caracterizada porque contiene Ia secuencia de DNA AtPSKP2D según las reivindicaciones 13 a Ia 20 ó el vector de expresión AtPSKP2D según Ia reivindicación 21
23.- Uso de las secuencias de DNA AtPSKP2D según las reivindicaciones 13 a Ia 20, el vector de expresión AtPSKP2D según Ia reivindicación 21 , Ia célula transformada AtPSKP2D según Ia reivindicación 22, y del procedimiento AtPSKP2D según las reivindicaciones 11 y 12 para Ia obtención de plantas transgénicas AtPSKP2D de interés comercial.
24.- Uso según Ia reivindicación 23 caracterizado porque Ia planta de interés comercial pertenece al siguiente grupo: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, patata, tabaco, judía, melón, sandia, pepino y fresa, y frutales como el naranjo, limonero, peral y manzano.
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