WO2006025580A1 - 抗ヒストンｈ１モノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an anti-histone HI monoclonal antibody and a polypeptide that specifically recognizes the anti-histone HI antibody and the anti-histone HI antibody. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody and a hyperidoma and a polypeptide that produce the antibody, which are useful for suppressing, predicting or diagnosing rejection in organ transplantation.
- immunosuppressive agents In organ transplantation medicine, various immunosuppressive agents have been used in the past to suppress rejection after organ transplantation. Examples of such immunosuppressive agents include takuguchi limus (FK506) and cyclosporin A (Jpn J Pharmacoljl, 89-100, 1996).
- takuguchi limus FK506
- cyclosporin A Jpn J Pharmacoljl, 89-100, 1996.
- problems such as the promotion of cancer cell proliferation, strong side effects such as suppression of bone marrow function, infection, and the necessity of permanent administration (Transplantation, 58, 170—178, 1994).
- recipient PVG rat serum transplanted with DA rat liver (post-OLT serum) is administered once to a transplantation model system in which a rejection reaction occurs. It has been reported that the reaction is suppressed (J. Surg. Res., 80, 58-61, 1998).
- anti-histone HI polyclonal antibodies are administered postoperatively to DA (RTla) and LWIS lath HRT11) heart transplantation systems (in vivo), where rejection always occurs, and thus rejection is suppressed. It is disclosed that the ent survives (Transplantation, 77, 1595-1603, 2 004).
- MLR mixed lymphocyte reaction
- the present inventors have now found an anti-histone HI monoclonal antibody having a significant immunosuppressive activity and usable for suppressing, predicting or diagnosing transplant rejection, and a hyperidoma producing this antibody. Furthermore, the present inventors have found a specific amino acid sequence that is specifically recognized by the anti-histone HI monoclonal antibody. The present invention is based on strong knowledge.
- the present invention aims to provide an anti-histone HI monoclonal antibody that has remarkable immunosuppressive activity and can be used for suppression, prediction or diagnosis of transplant rejection, and a hyperprideoma producing this antibody.
- Another object of the present invention is to provide a polypeptide comprising a specific amino acid sequence that is specifically recognized by the anti-histone HI monoclonal antibody.
- the monoclonal antibody according to the present invention is characterized by recognizing a histone HI-like antigen present on the cell membrane of histone HI or spleen cells.
- the hyperidoma according to the present invention produces the monoclonal antibody.
- polypeptide according to the present invention comprises a specific amino acid sequence recognized by the monoclonal antibody according to the present invention.
- the monoclonal antibody according to the present invention has remarkable immunosuppressive activity and safety, and can be advantageously used as an excellent immunosuppressive agent. Furthermore, the monoclonal antibody according to the present invention has excellent specificity for a mammalian autoantigen protein, which is an index of transplant rejection, and therefore predicts or diagnoses transplant rejection in mammals in organ transplantation. Therefore, it can be advantageously used.
- the polypeptide according to the present invention when used as an antigen, can induce the production of anti-histone HI antibodies in a living body, and therefore can be advantageously used as an immunosuppressant. Furthermore, the polypeptide according to the present invention can be used to measure the amount of anti-histone HI antibody produced in mammals, and thus is advantageous for predicting or diagnosing transplant rejection in organ transplantation. Can be used.
- FIG. 1 shows the results of MLR inhibitory activity evaluation using a culture supernatant containing an anti-histone HI monoclonal antibody.
- Hypridoma 1F5, Hybridoma 3F2, Hybridoma 15F11, Neubridoma 17C2 or Hypridoma 16G9 has an original deposit date of August 19, 2004.
- Country Tsukuba Sakai Higashi Ibaraki Pref. 1— 1— 1 Central No. 6 receipt number ABP—10409, receipt number FERM ABP—10410, receipt number FERM ABP—10411, receipt number FER Deposited under M ABP—10412 or receipt number FERM ABP—10413.
- the monoclonal antibody according to the present invention is characterized by recognizing histone Hl or histone HI-like antigen present in splenocytes.
- the monoclonal antibody according to the present invention preferably recognizes an epitope in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
- the anti-histone HI monoclonal antibody is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8. It recognizes peptides.
- the polypeptide preferably has a power of about 12 to 150 amino acid residues.
- the anti-histone HI monoclonal antibody is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8. It recognizes peptides.
- the anti-histone HI monoclonal antibody is at least one selected from the group force consisting of hyperpridoma 1F5, hybridoma 3F2, hybridoma 15F11, nob, hybridoma 17C2 and hyperpridoma 16G9. Produced by two hyperidomas.
- Histone Hl means a basic protein that exists in a eukaryotic cell and binds to a nucleosome linker DNA to form a nucleosome.
- histone HI examples are those derived from humans and comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and those derived from Ushi and comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Or those derived from mice and comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
- the "histone HI-like antigen" is also recognized on the cell membrane of spleen cells by monoclonal antibodies produced by Hypridoma 1F5, Hypridoma 3F2, Hybridoma 15F11, Hybridoma 17C2, and Hypridoma 16G9. Antigen.
- This histone HI-like antigen preferably constitutes a part of a protein showing a molecular weight of 31 kD on SDS-PAGE. Examples of such histone HI-like antigens include proteins having at least a part of the amino acid sequence of histone HI derived from mammals.
- the monoclonal antibody according to the present invention can be a chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully human antibody, if desired.
- a chimeric antibody (Morrison, S ⁇ ., Oi, VT, “immu noglobulin genes” Academic Press (London), 260-274 (1989) ), A human-type antibody that embeds a complementary determining region (CDR), which is a sequence on the Fv domain directly involved in antigen binding of a mouse monoclonal antibody, in a human antibody frame by CDR grafting technology (Roguska, ML et.AL, Humanization of murine monoclonal an tibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Bci. USA, 91, 969-9 73 (1994)), and as a fully human antibody This is based on Tomizuka, K.
- CDR complementary determining region
- hybridoma 1F5 a hybridoma 3F2, a hybridoma 15F11, a hybridoma 17C2, or a hybridoma 16G9.
- the monoclonal antibody and hybridoma according to the present invention can be produced, for example, as follows. That is, first, the hyperidoma according to the present invention uses a histone HI or histone HI-like antigen or a polypeptide containing these epitopes as a sensitizing antigen, and the characteristics of a mammal immunized with the sensitizing antigen. Cells (immune cells) can be obtained by fusing with myeloma cells of mammals, cloning the resulting hybridomas, and selecting from the hybridomas. The monoclonal antibody according to the present invention can be obtained by culturing the hyperidoma according to the present invention and recovering the antibody produced by the culture.
- Histone HI or histone HI-like antigen used as a sensitizing antigen or a polypeptide containing these epitopes includes, for example, human leukemia bone marrow cells, human cervical cancer HeLa cells, Examples include thymus, thymus liver, and avian red blood cells.
- This sensitizing antigen is prepared in the form of a suspension containing, for example, PBS or physiological saline, and if desired, an adjuvant such as FCA (Freund's complete adjuvant) or KLH (keyhole limpet hemocyanin) and the like. Can be used for processing.
- FCA Red's complete adjuvant
- KLH keyhole limpet hemocyanin
- a general administration method in the art can be used. Specifically, intraperitoneal injection, intrasplenic injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection, Examples include oral administration, transmucosal administration, and transdermal administration, and intraperitoneal injection and intrasplenic injection are preferred.
- the interval between doses of sensitizing antigen can be determined appropriately depending on the dose of sensitizing antigen and the type of mammal, for example, several times a month.
- the mammal to be immunized is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the myeloma cells used for cell fusion, for example, mouse, rat, hamster, etc.
- spleen cells are preferably used as immune cells.
- the myeloma cells used in the present invention include, for example, P3 (P3X63Ag8.653) (J. Immunol., 123, 1548, 1978), p3-Ul (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1—7,1978), NS—1 (Eur. J. Immunol, 6, 511—519, 1976), MPC—11 (Cell, 8, 405-415, 1976), Sp2 / 0—Agl4 (Nature, 276 , 269-270, 1978), FO (J. Immun ol. Meth., 35, 1—21, 1980), S194 (J. Exp. Med., 148, 313—323, 1978), and R2 10 (Nature , 277, 131-133, 1979), etc., preferably P3 or p3-Ul, more preferably P3.
- P3 or p3-Ul more preferably P3.
- Cell fusion between immune cells and myeloma cells can be performed, for example, according to the method of Milstein et al. (Methods Enzymo L, 73, 3-46, 1981). Specifically, cell fusion can be performed, for example, by mixing immune cells and myeloma cells in a medium in the presence of a fusion promoter. In cell fusion, the operation of adding an appropriate medium and centrifuging can be repeated to produce nobridoma.
- Examples of the medium used for cell fusion include RPMI-1640 medium and MEM medium. Examples thereof include media usually used for cell fusion.
- serum supplements such as fetal bovine serum (FBS) can be used in combination as appropriate.
- the cell fusion temperature is preferably 25 to 37 ° C, more preferably 30 to 37 ° C.
- the mixing ratio of myeloma cells and immune cells is preferably about 1: 1 to 1:10.
- Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), and the like, and preferably PEG.
- PEG polyethylene glycol
- HVJ Sendai virus
- the molecular weight of PEG can be appropriately selected.
- the average molecular weight can be about 1,000 to 6,000.
- the concentration of PEG in the medium is preferably about 30 to 60% (WZV).
- an auxiliary such as dimethyl sulfoxide can be appropriately added to the medium.
- the selection of the hyperidoma according to the present invention is carried out by culturing the hyperidoma obtained by cell fusion in a normal selective medium such as HAT medium and using a normal limiting dilution method, for example, an antibody against histone HI. It can be carried out by screening as an index such as value.
- the culture period in the HAT medium is a time sufficient for the cells (unfused cells) other than the target hyperidoma to die, and can usually be several days to several weeks.
- the thus obtained hyperpridoma according to the present invention can be subcultured in a normal medium and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
- the method for recovering the monoclonal antibody according to the present invention includes, for example, a method of culturing a hybridoma according to a conventional method to obtain a culture supernatant strength monoclonal antibody, or a hybridoma compatible with this. Examples thereof include a method for administering an antibody to a mammal and allowing it to proliferate to obtain its ascites monoclonal antibody.
- the former method is preferable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is preferable for producing antibodies in large quantities.
- the monoclonal antibody according to the present invention can be purified with high purity by a method such as salting-out, gel filtration, or affinity chromatography.
- the monoclonal antibody according to the present invention has a remarkable immunosuppressive activity.
- the monoclonal antibody according to the present invention can be used as an immunosuppressant as it is, together with a pharmaceutically acceptable carrier and the like, and can be used as a pharmaceutical composition, particularly as an immunosuppressive composition. Therefore, according to one aspect of the present invention, there is provided an immunosuppressive composition comprising the monoclonal antibody according to the present invention as an active ingredient. According to another aspect of the present invention, there is provided use of a monoclonal antibody according to the present invention in the manufacture of a composition for immunosuppression.
- the immunosuppressive composition according to the present invention is used for the treatment and prevention of rejection by transplantation of organs such as the heart, kidney, liver, bone marrow, and skin, and further for the treatment and prevention of autoimmune diseases and the like.
- organs such as the heart, kidney, liver, bone marrow, and skin
- the immunosuppressive composition according to the present invention can be prepared, for example, by dissolving the monoclonal antibody according to the present invention in physiological saline for injection, distilled water for injection, buffer solution for injection, or the like.
- composition for immunosuppression includes an appropriate solvent, a solubilizer, a preservative, a stabilizer, an emulsifier, a suspension, a soothing agent, an isotonic agent, a buffer, an excipient, Thickeners, colorants, known carriers (various ribosomes, polyamino acid carriers, synthetic polymers, natural polymers, etc.) can be included.
- the immunosuppressive composition according to the present invention can be administered systemically or locally.
- Specific administration methods include infusion, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, and intradermal. Examples include injection, oral administration, transmucosal administration, and transdermal administration.
- a method of treating a mammal in need of immunosuppression comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of a monoclonal antibody according to the present invention. Law is provided.
- the dose of the monoclonal antibody according to the present invention varies depending on the mammal's condition, age, etc. Usually, 0.05 to 40 mgZ body weight kgZ day, preferably 0.1 to 1. OmgZ body weight kgZ day once or several times. Can be administered separately. The administration can be performed only once, but can be repeated, for example, during 4 weeks.
- the monoclonal antibody according to the present invention specifically reacts with a self-antigen protein that serves as an index of transplant rejection during organ transplantation, transplant rejection in mammals can be used for prediction or diagnosis.
- the self-antigen protein is present in mammals and is preferably produced by Hypridoma 1F5, Hypridoma 3F2, Hybridoma 15F11, Hybridoma 17C2 or Hypridoma 16G9.
- a pharmaceutically acceptable carrier can be added to the composition as desired.
- the transplant rejection preferably occurs after organ transplantation, and more preferably occurs after administration of the immunosuppressant is stopped.
- Another aspect of the present invention provides the use of a monoclonal antibody according to the present invention as a predictive or diagnostic agent for transplant rejection in a mammal.
- a method for predicting or diagnosing transplant rejection in a mammal wherein the level of immunoreactivity between a biological sample derived from a mammal and the monoclonal antibody according to the present invention.
- a method is provided comprising measuring.
- the measured immunoreactivity level is a threshold value set in advance with reference to the immunoreactivity level between the biological sample of a mammal in which transplant rejection has occurred and the monoclonal antibody according to the present invention. Higher than that, predict or diagnose that the risk of transplant rejection is high.
- This threshold value is appropriately determined by those skilled in the art according to the species of mammals and donors, sex, type of transplanted organ, measurement method, and the like. According to the prediction or diagnosis method of the present invention, the physical and economic burden on the patient can be reduced by avoiding unnecessary administration of immunosuppressive agents.
- the biological sample is preferably blood, more preferably serum, and the immunosuppressive agent is not particularly limited as long as it is an immunosuppressive agent used for organ transplantation.
- Alkylating agents such as cyclophosphamide, antimetabolites such as azathioprine, methotrexate, mizoribine, inhibitors of T cell activity such as cyclosporine, tacrolimus, predo-zolone, methylpredo-zolone, mofuethyl mycophenolate, azathioprine Steroids such as basiliximab, lymphocyte surface function inhibitors such as basiliximab, muromonab, or combinations thereof.
- Examples of donors for mammals and transplanted organs include humans, pigs, and baboons, with humans being preferred.
- Examples of organs to be transplanted include liver, heart, kidney, and skin.
- Specific examples of the method for measuring the immunoreactivity level are not particularly limited as long as they use an antigen-antibody reaction. For example, fluorescent antibody method, chemical staining method, enzyme antibody method, ELSA method , Radioinometic, immunoprecipitation, western blot, modified Western plot (such as western, southwestern, northwestern, or western), or protein chip method .
- the immunoreactivity level is determined by fluorescent antibody method, chemical staining method, enzyme antibody method, ELISA, radioimmunoassay, immunoprecipitation method, Western plotting method, Measured by modified Western blot or protein chip method.
- kits for predicting or diagnosing transplant rejection in a mammal comprising at least an anti-histone HI monoclonal antibody.
- the transplant rejection preferably occurs after organ transplantation, more preferably after administration of the immunosuppressive agent is stopped.
- polypeptide according to the present invention comprises, in the amino acid sequence thereof, an epitope that recognizes the anti-histone HI monoclonal antibody according to the present invention as described above. And according to the preferable aspect of this invention, polypeptide consists of an amino acid sequence represented by sequence number 4, sequence number 5, sequence number 6, sequence number 7, or sequence number 8.
- one polypeptide is present in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
- the amino acid sequence can be obtained by substitution, deletion or addition of several amino acids.
- the range of “1 or several” means preferably 1 to 3, more preferably about 1 to 2.
- the polypeptide comprises a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8. It will be.
- the partial sequence is preferably a partial sequence represented by Nos. 6 to 9 in SEQ ID No. 4, a partial sequence represented by Nos. 5 to 9 in SEQ ID No. 5, or a second sequence of SEQ ID No. 6
- the polypeptide comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 8, or a partial sequence thereof. It is what.
- this polypeptide preferably has a power of about 3 to 300 amino acid residues, more preferably about 12 to 150 amino acid residues.
- the polypeptide of the present invention has an amino acid sequence determined on the basis of analysis by a phage display peptide library kit using the monoclonal antibody of the present invention.
- the polypeptide according to the present invention can be synthesized by a known peptide synthesizer or the like based on its amino acid sequence.
- the polypeptide according to the present invention can be used for inducing production of an anti-histone HI antibody in a living body as it is or as a derivative by a known method.
- Sarasuko, histone HI or histone HI-like antigen can also be administered to a living body as a sensitizing antigen to produce an anti-histone HI antibody to exert an immunosuppressive action.
- an immunosuppressive composition comprising as an active ingredient a histone Hl, a histone HI-like antigen or a polypeptide according to the present invention.
- use of a histone Hl, a histone HI-like antigen or a polypeptide according to the present invention in the manufacture of a composition for immunosuppression.
- the immunosuppressive composition can be produced into a dosage form according to the administration method together with a pharmaceutically acceptable carrier.
- a pharmaceutically acceptable carrier for example, when the dosage form is a liquid, an appropriate solution is prepared.
- Agents, solubilizers, preservatives, stabilizers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, isotonic and buffering agents, excipients, thickeners, colorants, known carriers (various ribosomes, poly Amino acids, carriers, synthetic polymers, natural polymers), adjuvants, and the like can be appropriately contained.
- the immunosuppressive composition may be administered by a method that can be used in the art, for example, intraarterial injection, infusion, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal. Examples include injection, oral administration, transmucosal administration, and transdermal administration.
- a method for treating a mammal in need of immunosuppression wherein the mammal is treated with a therapeutically effective amount of histone HI, histone HI-like antigen or a polynucleotide according to the present invention.
- a method is provided comprising administering a peptide.
- the therapeutically effective amount varies depending on the severity of the disease state, sex, age, body weight, habits, etc. of the mammal, but for example, the amount of the active ingredient is from 0.005 ⁇ g to 2 gZ body weight kgZ. can do. In addition, by confirming antibody production in mammals, those skilled in the art can appropriately prepare such a dosage plan.
- histone Hl, histone HI-like antigen or the polypeptide according to the present invention specifically reacts with anti-histone HI antibody produced in mammals, it can be used for measurement of the amount of anti-histone HI antibodies in mammals. can do. Therefore, according to another aspect of the present invention, a histone Hl, histone HI-like antigen or a polypeptide according to the present invention is effective for measuring the amount of anti-histone HI antibody in a biological sample derived from a mammal. A composition is provided as an ingredient. Since the anti-histone HI antibody has a function of suppressing transplant rejection as described above, the amount of anti-histone HI antibody in mammals is an index for predicting or diagnosing transplant rejection.
- the yarn and adult can be used for prediction or diagnosis of transplant rejection in mammals.
- a histone Hl, histone HI-like antigen according to the present invention or a polypeptide according to the present invention as a predictive or diagnostic agent for transplant rejection in a mammal.
- the transplant rejection occurs after organ transplantation, more preferably after administration of the immunosuppressant is stopped.
- a method for predicting or diagnosing transplant rejection in a mammal comprising an anti-histone HI antibody in a biological sample in a mammal and histone H1, histone H1-like antigen, or There is provided a method comprising measuring the level of immunoreactivity with a polypeptide according to the invention.
- the measured immunoreactivity level force between the anti-histone HI antibody in the biological sample of the mammal in which transplant rejection occurred, and the histone HI, histone HI-like antigen, or the polypeptide according to the present invention Predict or diagnose that the risk of transplant rejection is low if it is higher than a preset threshold with reference to the immunoreactivity level.
- This threshold value is appropriately determined by those skilled in the art according to the species of mammals and donors, sex, type of transplanted organ, measurement method, and the like. According to the prediction or diagnosis method of the present invention, by avoiding unnecessary administration of immunosuppressive agents, the patient's Physical and economic burden can be reduced.
- the method for measuring the immunoreactivity level are not particularly limited as long as they use an antigen-antibody reaction.
- fluorescent antibody method for example, fluorescent antibody method, chemical staining method, enzyme antibody method, ELSA method , Radioinometics, immunoprecipitation, western blotting, modified Western plots (such as western, southwestern, northwestern, or western), protein chip methods, etc.
- the immunoreactivity level is a fluorescent antibody method, chemical staining method, enzyme antibody method, ELISA, radioimmunoassay, immunoprecipitation method, Western blotting method, Western blot modification method or protein chip method,
- the protein chip method is more preferable.
- the polypeptide of the present invention by carrying the polypeptide of the present invention on a protein chip, transplant rejection in a mammal can be predicted or diagnosed quickly and accurately.
- kits for measuring the amount of anti-histone HI antibody in a biological sample derived from a mammal comprising a histone H1, histone HI-like antigen or
- a kit comprising at least a polypeptide according to the invention.
- the kit is for predicting or diagnosing transplant rejection in a mammal.
- the transplant rejection preferably occurs after organ transplantation, more preferably after administration of the immunosuppressant is stopped.
- the biological samples, immunosuppressive agents, transplanted organs, mammals, and donors of transplanted organs described above can be used for the above-mentioned treatment methods and transplantation rejection prediction using the monoclonal antibody according to the present invention. It is the same as the diagnostic method.
- Untreated PVG rat-derived spleen lymphocytes (responsive cells) and DA rat-derived spleen lymphocytes (stimulatory cells) treated with mitomycin C (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) were used.
- the responding cells were adjusted to 5 ⁇ 10 5 cells ZmL with 10% FCS—RPMI medium, and the stimulating cells were adjusted to 8 ⁇ 10 6 cells ZmL with 10% FCS—RPMI medium.
- MLR Mixed lymphocyte reaction
- the responder cells were adjusted to 5 ⁇ 10 5 cells ZmL with 10% FCS—AIM—V medium, and the stimulator cells were adjusted to 8 ⁇ 10 6 cells / mL with 10% F CS—RPMI medium.
- each of the responsive cell suspension and stimulated cell suspension is seeded in a 96-well round bottom plate (Nunc Brand Products), and anti-histone HI polyclonal IgG (Santa Cruz Biote chonology) Made: 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, or 1.6 / z gZ uel) or Usagi IgG (.normal rabbit IgG: banta Cruz Biotechonology: 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, or 1.6 ⁇ g / well), and cultured for 2.5 days under conditions of 37 ° C, 5% CO / 95% air
- ConA was added to a concentration of 10 gZmL, and it was confirmed that the stimulating cells had stopped proliferating and that the reaction cells caused cell growth by antigen stimulation. Then, each well was treated in the same manner as in Reference Example 1, and brodoxyuridine (BrdU) incorporated into intracellular DNA using BrdU Labeling & Detection Kit III (Roche Diagnostics). The degree of cell proliferation was measured using the amount as an index.
- MLR MLR was suppressed in a concentration-dependent manner by anti-histone polyclonal antibody. On the other hand, MLR was not suppressed by normal rabbit IgG.
- mice 0.2 mL of a solution in which antigen was dissolved in PBS (antigen concentration: 600 to: LOOOmg / mL) was finally administered intraperitoneally to mice.
- blood was collected from the fundus vein and the antibody titer was measured by ELISA.
- whole blood was collected, and the obtained blood was centrifuged (2000 rpm, 20 minutes) to obtain an antiserum, which was used as a control antiserum in the following experiments.
- the spleen was removed from the rat, and the obtained spleen cells were used for the following cell fusion.
- IMDM IMDM
- FCS manufactured by JRH BIOSCIENCES
- UPPLEMENT (X 50), manufactured by SIGMA) is dissolved in 10 mL of serum-free IMDM medium and diluted 50-fold with IMDM medium containing 10% FCS. ) With lOOmL, 37 ° C / 5% CO
- HT medium HT powder (manufactured by HT MEDIA SUPPLEMENT, SIGMA) in 10 mL of serum-free IMDM medium and dilute 50-fold with IMDM medium containing 10% FCS. ), And cultured for 3 days in a 37 ° CZ5% CO incubator. Every 2-3 days thereafter
- the medium (HT medium) was changed. After confirming cell growth with a microscope, the culture supernatant (about 100 mL) was recovered. The culture supernatant was used to screen for hyperidoma by measuring the titer against histone HI shown below.
- histone H 5mg, calf thymus histone Hl, Roche Diagnostics
- Bicarbonate buffer 100 mM NaHCO-NaOH, pH 9.2 to 9.5
- dilution buffer 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.9% (W / V) NaCl, 0.05% (W / V) Tween20
- IgG Biotion-labeled anti-mouse IgG, SIGMA
- the plate was washed 6 times, and a fluorescent substrate buffer (Attophos substrate buffer, manufactured by Roche Diagnostics) was added at 50 mL / well, and the plate was shaded to develop color.
- the fluorescence intensity was measured with CytoFluorll (manufactured by Perceptive).
- Test Example 1 Evaluation test of MLR inhibitory activity using pile supernatant containing HI histone HI monoclonal antibody
- Each hybridoma was cultured using IMDM medium containing 15% FCS 10% HSF (1 ⁇ 10 6 cells / mL). 15 mL of this culture supernatant was centrifuged (2000 g, 2.5 hours) using CENTRIPREP YM-10 (MILLIPORE) to obtain a culture supernatant concentrate containing anti-histone HI monoclonal antibody.
- P VGZPVG represents a mixed culture of PVG lymphocytes that have lost their proliferative ability upon stimulation with mitomycin C and PVG lymphocytes that are reactive cells
- DAZPVG is also a DA lymphocyte that has lost proliferative ability. Represents a mixed culture of PVG lymphocytes as reactive cells.
- Test Example 2 Identification of recognition site of anti-histone H 1 monoclonal antibody 1
- Spleen cells were removed from PVG rats and disrupted according to the method of Weissman (Weissman et al., Science, 239, 10 18-1021, 1988). Splenocytes were collected after centrifuging (1,500 rpm, 5 minutes) with PBS lmL in the spleen cells. The cells were suspended using a syringe and the same amount of 150 mM NaCl was collected. The obtained cell suspension was centrifuged (300 ⁇ g, 10 minutes) to obtain a precipitate and a supernatant. This precipitate was used as an insoluble fraction (containing a nuclear fraction), and the supernatant was used as a soluble fraction containing a cell membrane.
- the insoluble fraction is 5 times the volume (v / v) of the electrophoresis sample.
- Pull up the pull buffer (0.25 M Tris-HCl (pH 6.8) 25 mL, SDS 2. Og, ultrapure water 9 mL, gly cerol 10 mL, BPB 5 mg) and boil for 5 minutes. Kiyoshi was used as a measurement sample.
- EDTA was added to the cell membrane-containing soluble fraction to a final concentration of 5 mM. Of this cell membrane-containing soluble fraction, 100-200 1 ⁇ was recovered. The remaining soluble fraction containing cell membrane was treated by ultracentrifugation (4 ° C, 200000 Xg, 45 minutes).
- the obtained precipitate was used as a cell membrane fraction, and the obtained supernatant was used as a cell membrane-removed soluble fraction.
- 5 times (v / v) sample buffer for electrophoresis was added and boiled for 5 minutes, followed by centrifugation.
- the obtained supernatant was used as a measurement sample.
- HCL solution 1 mM HCL solution is fed to a HiTrap NHS column (HiTrap NHS-activated HP ⁇ Amersham Biosciences AB) at l ⁇ 2mL / min, and then histone HI solution (Histone HI (Roche Diagnostics) 1 0.5 mg, coupling buffer (0.2 M NaHC03, 0.5 M NaCl pH 8.3) ImL was fed at ImL / min, and immediately after feeding, the column was sealed and coupling was performed (15- Half an hour). After coupling, buffer A (0.5 M monoethanolamine, 0.5 M NaCl pH 8.3), nofer B (0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl pH 4.0) and neutral buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0) The inside of the column was washed.
- buffer A 0.5 M monoethanolamine, 0.5 M NaCl pH 8.3
- nofer B 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl pH 4.0
- neutral buffer 1.0 M Tris-HCl, pH 9.0
- the anti-histone HI monoclonal antibody-containing culture supernatant obtained in Test Example 1 was fed into the column at 1 mL / min and circulated (4 ° C, overnight) 0
- Each measurement sample was processed by SDS-PAGE according to the electrophoresis method (Nature, 227, 680-685, 1970) in the Laemmli discontinuous buffer system.
- Histone Hl 5 mg, manufactured by Roche Diagno Status
- the resulting gel was used for the following Coomassie staining or Western blotting.
- the gel after SDS-PAGE was transferred to a PV DF membrane using a semi-dry transfer device (AE-6675, manufactured by ATTO).
- AE-6675 manufactured by ATTO
- the PVDF membrane after transfer was soaked in a blocking solution (5% skim milk 1% BSA in PBST) and shaken (at 4 ° C. overnight or at room temperature for 1 hour).
- the PVDF membrane was mixed with a solution containing purified anti-histone HI monoclonal antibody as a primary antibody (500-fold diluted with blocking solution), shaken at room temperature for 1 hour, and then PBST Washed for 15 min X l times and 5 min X 3 times.
- a secondary antibody HRP-anti-mouse IgG (manufactured by SIGMA)
- HRP-anti-mouse IgG manufactured by SIGMA
- a blocking solution was added to the PVDF membrane and shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the plate was washed with PBST for 15 minutes X I times and 5 minutes X 3 times.
- the ECL Western blotting detection system was used to detect the binding of specific antibodies and applied to the X-ray film RX-U (FUJI PHOTO FILM, Tokyo, Japan).
- PVG rat spleen cells were suspended in PBS solution containing 4% formalin and fixed at room temperature for 20 minutes. Further, the spleen cells were washed 3 times with a staining buffer (Staining buffer: 1% ( ⁇ / ⁇ ) FCS, 0.1% (w / v) Sodium azide-containing PBS solution, 4 ° C), and then stained. A mixture containing 2 ⁇ 10 6 cells in 100 mL of buffer was prepared. A primary antibody (2 mL of piotin-labeled anti-histone HI monoclonal antibody or 5 mL of normal mouse IgG labeled with piotin) was added to this mixture and reacted at 37 ° C for 1 hour.
- Staining buffer 1% ( ⁇ / ⁇ ) FCS, 0.1% (w / v) Sodium azide-containing PBS solution, 4 ° C
- the spleen cells were washed 3 times with a staining buffer (4 ° C), and further, the staining buffer lOOmL was added to the spleen cells, and FITC-labeled streptavidin (BD PharMingen) lmL was collected. The reaction was allowed to proceed for 30 hours at room temperature. After the reaction, the spleen cells were washed 3 times with a staining buffer (4 ° C), and 500 mL of PBS was added to the spleen cells to prepare a suspension. To this suspension, Propidum Iodide (SIGMA) was added to a final concentration of 5 mgZmL and allowed to react at room temperature for 20 minutes. The obtained cells were sealed with a PBS solution containing 50% glycerin and then observed with a fluorescence microscope.
- SIGMA Propidum Iodide
- peripheral (cell membrane) part of the spleen cells was specifically fluorescently stained.
- Test, Test Example 4 Pile histone HI monoclonal pile recognition site identification 3
- TBST 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20. 4 x 10 1 in the original library on the first Panjung. Individual phages were used for the staring jung. Unbound phages were removed by repeated washing with TBTS. The bound phage was eluted with 0.2M Glycine-HC1 (pH 2.2), lmg / ml BSA. The eluted phage was grown in 20 mL E Coli ER2738 culture. Obtained The resulting phages were precipitated using polyethylene glycol and used for the second panning. In addition, a third panning was performed according to the same operating procedure.
- Plaques obtained in the third round of panning were diluted 1: 100 and grown using ER2738 culture. The tubes containing these were incubated at 37 ° C with shaking for 4.5-5 hours. Single-stranded phage DNA was precipitated and purified with Iodide buffer (10 mM Tris-HC1, ImM EDTA, 4M Nal) and ethanol. Phage DNA was dissolved in 20 ⁇ L ⁇ buffer (10 mM Tris—HC1 pH 8.0, ImM EDTA) for DNA sequence analysis.
- 3F2 VTNNQTSPRWEI (SEQ ID NO: 5)
- Each peptide having an amino acid sequence determined from the phage DNA was synthesized by a conventional method. Competition ELISA was performed using the obtained peptide, each purified monoclonal antibody, and histone HI antigen (Roche, catalog # 1004875). At this time, EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation kit (Pierce) was used for the biotinylation of histone HI antigen. ABTS solution (Sigma, A3219) was used as a reagent. Color development was detected at 405 nm using an ELISA measuring device (ThermoLabsyst em, Multiskan Ascent). The measured value was the average of the absorption values measured three times.
Abstract
臓器移植時の拒絶反応の抑制、予測または診断に有用な、抗ヒストンＨ１モノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマならびにポリペプチドが開示されている。
Description
抗ヒストン HIモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ 関連出願の参照
[0001] 本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願 2004— 257 528号（出願日： 2004年 9月 3日）に基づく優先権の主張を伴うものである。これらの 先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。 発明の背景
[0002] 発明の分野
本発明は、抗ヒストン HIモノクローナル抗体およびこれを産生するノ、イブリドーマな らびに抗ヒストン HI抗体が特異的に認識するポリペプチドに関する。さらに詳しくは、 本発明は、臓器移植における拒絶反応の抑制、予測または診断に有用な、モノクロ ーナル抗体およびこれを産生するハイプリドーマならびにポリペプチドに関する。
[0003] 背景枝術
臓器移植医療においては、臓器移植後の拒絶反応を抑制するため、従前種々の 免疫抑制剤が使用されている。このような免疫抑制剤としては、例えば、タク口リムス（ FK506)、シクロスポリン Aなどを挙げることができる (Jpn J Pharmacoljl, 89-100, 199 6)。し力しながら、従前の免疫抑制剤にあっては、ガン細胞の増殖促進、骨髄機能抑 制などの強い副作用、感染症、さらには永続投与の必要性などが問題となっている（ Transplantation, 58, 170—178, 1994)。
[0004] また、一般的に免疫抑制剤の退薬時期を判断することは困難である。例えば、免疫 抑制剤の投与を継続しなくても組織が生着することがある。このような場合に不用意 に免疫抑制剤の投与を継続すれば、患者に対して単に毒性によるダメージを与える おそれがある。一方、免疫抑制剤の投与を中断することにより、生着していた組織が 拒絶に転じる可能性もある。この場合、免疫抑制剤の投与を再開しても拒絶は免れ ない場合が多い。
[0005] 一方、臓器移植に関する種々の研究がなされている。例えば、ラット同所性肝移植
(OLT : orthotopic liver taransplantation)の系において、移植片の生着率が高いドナ
一 DAラット肝（MHC haplotype RTla)をレシピエント PVGラッ KRTlc)に移植した場合 、免疫抑制剤を投与することなしに移植片が生着することが報告されている (Transpl antation, 35, 304—311,1983)。
[0006] また、 DAラット肝を移植したレシピエント PVGラットの血清（post-OLT serum)を、拒 絶反応が生じる組み合わせの移植モデル系に 1回術前投与することにより、移殖片 の拒絶反応が抑制されることが報告されている（J. Surg. Res., 80, 58-61, 1998)。
[0007] また、抗ヒストン HIポリクローナル抗体を、拒絶反応が必ず生じる DA (RTla)および LWISラッ HRT11)の心移植系 (in vivo)に術後投与することにより、拒絶反応が抑制さ れ、レシピエントが生存することが開示されている（Transplantation, 77, 1595-1603, 2 004)。
[0008] また、本発明者らの一部は、 PVGラット由来移植後初期血清を用いることにより混合 リンパ球培養反応（MLR; mixed lymphocyte reaction)が抑制されること、および抗ヒス トン HI抗体が MLR抑制活性を示すことを開示している（特開 2004— 149507号公 報)。
[0009] し力しながら、臓器移植における移植拒絶を抑制することが可能な、安全性および 免疫抑制活性に優れた免疫抑制剤を創出することが依然として求められている。ま た、臓器移植においては、患者の予後管理や免疫抑制剤の不必要な投与の防止の 必要性から、移植拒絶が生じる力否力を予測または診断するための、精度に優れた 薬剤を創出することも必要とされる。
発明の概要
[0010] 本発明者らは、今般、顕著な免疫抑制活性を有し、移植拒絶の抑制、予測または 診断に利用可能な、抗ヒストン HIモノクローナル抗体およびこの抗体を産生するハイ プリドーマを見出した。さらに、本発明者らは、前記抗ヒストン HIモノクローナル抗体 が特異的に認識する、特定のアミノ酸配列を見出した。本発明は力かる知見に基づく ものである。
[0011] したがって、本発明は、顕著な免疫抑制活性を有し、移植拒絶の抑制、予測または 診断に利用可能な、抗ヒストン HIモノクローナル抗体およびこの抗体を産生するハイ プリドーマの提供を目的とする。
また、本発明は、前記抗ヒストン HIモノクローナル抗体が特異的に認識する、特定 のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドの提供をその目的とする。
[0012] そして、本発明によるモノクローナル抗体は、ヒストン HIまたは脾細胞の細胞膜に 存在するヒストン HI様抗原を認識することを特徴とするものである。
[0013] また、本発明によるハイプリドーマは、前記モノクローナル抗体を産生するものであ る。
[0014] また、本発明によるポリペプチドは、本発明によるモノクローナル抗体が認識する、 特定のアミノ酸配列を含んでなるものである。
[0015] 本発明によるモノクローナル抗体は、顕著な免疫抑制活性と安全性とを有するもの であり、優れた免疫抑制剤として有利に利用することができる。さらに、本発明による モノクローナル抗体は、移植拒絶の指標となる、哺乳動物の自己抗原タンパク質に 対する優れた特異性を有するものであり、したがって、臓器移植において、哺乳動物 における移植拒絶を予測または診断するために有利に利用することができる。
[0016] また、本発明によるポリペプチドは、抗原として用いた場合、生体において抗ヒスト ン HI抗体の産生を誘導しうることから、免疫抑制剤として有利に利用することができ る。さらに、本発明によるポリペプチドは、哺乳動物において産生される抗ヒストン HI 抗体量を測定するために利用することが可能であり、したがって、臓器移植において 、移植拒絶の予測または診断のために有利に利用することができる。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]は、抗ヒストン HIモノクローナル抗体含有培養上清を用いた MLR抑制活性評 価の結果を示す。
発明の具体的説明
本発明によるハイプリドーマ 1F5、ハイブリドーマ 3F2、ハイブリドーマ 15F11 、ノヽイブリドーマ 17C2またはハイプリドーマ 16G9は、原寄託日を 2004年 8月 19 日として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (住所：日本 国 茨城県つくば巿東 1— 1— 1 中央第 6)において、受領番号 ABP— 10409、受 領番号 FERM ABP—10410、受領番号FERM ABP— 10411、受領番号 FER
M ABP—10412または受領番号 FERM ABP— 10413のもと寄託されている。
[0019] モノクローナル抗体およびハイプリドーマ
本発明によるモノクローナル抗体は、ヒストン Hl、または脾細胞に存在するヒストン HI様抗原を認識することを一つの特徴とするものである。そして、本発明によるモノ クローナル抗体は、好ましくは配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7また は配列番号 8で表されるアミノ酸配列内のェピトープを認識するものである。また、本 発明の別の好ましい態様によれば、抗ヒストン HIモノクローナル抗体は、配列番号 4 、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミノ酸配列を含 んでなるポリペプチドを認識するものである。ここで、このポリペプチドは、好ましくは 約 12〜150個のアミノ酸残基力もなるものとされる。また、本発明の別の好ましい態 様によれば、抗ヒストン HIモノクローナル抗体は、配列番号 4、配列番号 5、配列番 号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認 識するものである。また、本発明の別の好ましい態様によれば、抗ヒストン HIモノクロ ーナル抗体は、ハイプリドーマ 1F5、ハイブリドーマ 3F2、ハイブリドーマ 15F11 、ノ、イブリドーマ 17C2およびハイプリドーマ 16G9からなる群力も選択される少な くとも一つのハイプリドーマにより産生されるものである。
[0020] 「ヒストン Hl」は、真核細胞中に存在し、ヌクレオソームリンカ一 DNAと結合してヌク レオソームを形成する塩基性タンパクを意味する。このようなヒストン HIとしては、例 えば、ヒト由来であって配列番号 1に示されるアミノ酸配列を含んでなるもの、ゥシ由 来であって配列番号 2に示されるアミノ酸配列を含んでなるもの、またはマウス由来で あって配列番号 3に示されるアミノ酸配列を含んでなるものが挙げられる。
[0021] また、「ヒストン HI様抗原」とは、ハイプリドーマ 1F5、ハイプリドーマ 3F2、ハイブ リドーマ 15F11、ハイブリドーマ 17C2およびハイプリドーマ 16G9により産生さ れるモノクローナル抗体によって、脾細胞の細胞膜にぉ 、て認識される抗原を意味 する。そして、このヒストン HI様抗原は、好ましくは SDS— PAGEにて分子量 31kD を示すタンパク質の一部を構成するものである。このようなヒストン HI様抗原としては 、例えば、哺乳動物由来のヒストン HIのアミノ酸配列の一部を少なくとも有するタンパ ク質が挙げられる。
[0022] また、本発明によるモノクローナル抗体は、所望により、キメラ抗体、ヒト型化抗体、 完全ヒト型抗体とすることができる。より具体的には、ヒト抗体にマウスモノクローナル 抗体の抗原結合ドメイン Fvを入れ替えたキメラ抗体（Morrison,S丄.， Oi, V.T., "immu noglobulin genes" Academic Press(London), 260-274(1989))、マウスモノクローナル 抗体の抗原結合に直接関わる Fvドメイン上の配列である相補性決定領域 (CDR:com plementary determining region)をヒト抗体のフレームに CDRグラフト技術によって埋 め込んだ、ヒト型ィ匕抗体 (Roguska, M.L. et. AL, Humanization of murine monoclonal an tibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. bci. USA, 91, 969—9 73(1994))が挙げられ、さらに、完全ヒト型抗体としては、ヒト抗体遺伝子をマウスに移 植したトフンスクロモマウスによるもの (Tomizuka, K. et.al. Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice, Nature G enet., 16, 133-143(1997》、ヒト抗体ファージライブラリー（Winter, G. et.al, Making a ntibodies by phage display technology, Ann. Rev. Immunol., 12, 433-455(1994), Grif fiths, A.D. et. al" Isolation of high affinity human antibodies directly from large synt hetic repertoires, EMBO. J., 13, 3245—3260(1994) )によるものが挙げられる。
[0023] また、本発明の別態様によれば、ハイプリドーマ 1F5、ハイプリドーマ 3F2、ハイ ブリドーマ 15F11、ハイブリドーマ 17C2またはハイプリドーマ 16G9が提供され る。
[0024] 本発明によるモノクローナル抗体およびハイブリドーマは、例えば、次のようにして 製造することができる。すなわち、まず、本発明によるハイプリドーマは、ヒストン HIま たはヒストン HI様抗原あるいはこれらのェピトープを含むポリペプチドを感作抗原と して使用し、この感作抗原にて免疫した哺乳動物の形質細胞 (免疫細胞）を、哺乳動 物のミエローマ細胞と融合させ、得られるハイプリドーマをクロー-ングし、そのハイブ リドーマ中から選別することによりを得ることができる。そして、本発明によるモノクロ一 ナル抗体は、本発明によるハイプリドーマを培養し、これが産生する抗体を回収する ことにより得ることができる。
[0025] 感作抗原として用いられるヒストン HIまたはヒストン HI様抗原またはこれらのェピト ープを含むポリペプチドは、例えば、ヒト白血病骨髄細胞、ヒト子宮頸癌 HeLa細胞、
ゥシ胸腺、ゥシ肝臓、トリ赤血球由来のものが挙げられる。そして、この感作抗原は、 例えば、 PBSや生理食塩水などをカ卩えて懸濁液とし、所望により FCA(Freund's com plete adjuvant)、 KLH (keyhole limpet hemocyanin)などのアジュバントと共に、哺乳 動物の免疫処理に用いることができる。
[0026] 哺乳動物を免疫する方法としては、当該技術分野における一般的投与法を用いる ことができ、具体的には、腹腔内注射、脾臓内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内 注射、経口投与、経粘膜投与、経皮投与などを挙げることができるが、好ましくは腹 腔内注射、脾臓内注射である。感作抗原の投与間隔は、感作抗原の投与量および 哺乳動物の種類などに応じて適宜決定される力 例えば、 1ヶ月間に数回毎とするこ とがでさる。
[0027] 免疫される哺乳動物は、特に限定されないが、細胞融合に使用するミエローマ細 胞との適合性などを考慮して選択することが好ましぐ例えば、マウス、ラット、ハムス ターなどを挙げることができる力 好ましくはマウスである。
また、免疫細胞としては、好ましくは脾細胞を使用する。
[0028] 本発明に用いるミエローマ細胞としては、例えば、 P3 (P3X63Ag8. 653) (J. Imm unol., 123, 1548, 1978)、 p3— Ul (Current Topics in Micro- biology and Immunolog y, 81, 1— 7,1978)、 NS— 1 (Eur. J. Immunol, 6, 511—519, 1976)、 MPC— 11 (Cell, 8, 405-415, 1976)、 Sp2/0—Agl4 (Nature, 276, 269-270, 1978)、 FO (J. Immun ol. Meth. , 35, 1—21, 1980)、 S194 (J. Exp. Med., 148, 313—323, 1978)、および R2 10 (Nature, 277, 131-133, 1979)などが挙げられるが、好ましくは P3または p3—Ul であり、より好ましくは P3である。
[0029] 免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、例えば、ミルシュタインら（Milstein et. a 1. )の方法（Methods EnzymoL, 73, 3-46, 1981)などに準じて行うことができる。具体 的には、細胞融合は、例えば、融合促進剤の存在下、培地中にて免疫細胞とミエ口 一マ細胞とを混合することにより実施することができる。そして、細胞融合において、 適宜培地を添加して遠心分離する操作を繰り返してノ、イブリドーマを生成することが できる。
[0030] 細胞融合に用いる培地としては、例えば、 RPMI— 1640培地、 MEM培地などの
細胞融合において通常使用される培地が挙げられる。また、牛胎児血清 (FBS)など の血清補液を適宜併用することができる。
また、細胞融合温度は、好ましくは 25〜37°Cであり、より好ましくは 30〜37°Cであ る。
また、ミエローマ細胞と免疫細胞との混合比率は、好ましくは 1： 1〜1： 10程度であ る。
[0031] 融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール (PEG)、センダイウィルス (H VJ)などを挙げることができる力 好ましくは PEGである。 PEGの分子量は適宜選択 することができ、例えば、平均分子量 1, 000-6, 000程度とすることができる。また、 培地中の PEGの濃度は、好ましくは約 30〜60% (WZV)である。
また、所望によりジメチルスルホキシドなどの補助剤を培地に適宜添加することがで きる。
[0032] 本発明によるハイプリドーマの選択は、細胞融合により得られるハイプリドーマを、 例えば、 HAT培地などの通常の選択培地にて培養し、通常の限界希釈法を用い、 例えば、ヒストン HIに対する抗体価など指標としてスクリーニングすることにより実施 することができる。 HAT培地による培養期間は、 目的とするハイプリドーマ以外の細 胞 (未融合細胞）が死滅するのに充分な時間であり、通常、数日〜数週間とすること ができる。このようにして得られる本発明によるハイプリドーマは、通常の培地で継代 培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することができる。
[0033] また、本発明によるモノクローナル抗体を回収する方法としては、例えば、ハイブリド 一マを常法に従って培養してその培養上清力 モノクローナル抗体を得る方法、また はハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水力 モ ノクローナル抗体を得る方法などを挙げることができる。ここで、前者の方法は高純度 の抗体を得るのに好ましぐ一方、後者の方法は抗体を大量に生産にするのに好ま しい。
[0034] さらに、本発明によるモノクローナル抗体は、塩析法、ゲル濾過法、ァフィ-ティーク ロマトフラフィーなどの方法により、高純度に精製することができる。
[0035] 本発明によるモノクローナル抗体は、上述の通り顕著な免疫抑制活性を有している
。本発明によるモノクローナル抗体は、そのまま免疫抑制剤として用いることができる 力 薬学的に許容される担体などとともに、医薬組成物、とりわけ、免疫抑制用組成 物として用いることができる。したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明によ るモノクローナル抗体を有効成分とする、免疫抑制用組成物が提供される。また、本 発明の別の態様によれば、免疫抑制用組成物の製造における、本発明によるモノク ローナル抗体の使用が提供される。
[0036] 本発明による免疫抑制用組成物は、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚などの臓器の 移植による拒絶反応の治療および予防のために、さらには自己免疫疾患などの治療 および予防のために有用である。本発明による免疫抑制用組成物は、例えば、本発 明によるモノクローナル抗体を、注射用生理食塩水、注射用蒸留水、注射用緩衝溶 液などに溶解して調製することができる。さらに、本発明による免疫抑制用組成物に は、適当な溶剤、溶解補助剤、保存剤、安定剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、等張 ィ匕剤、緩衝剤、賦形剤、増粘剤、着色剤、公知のキャリア（各種リボソーム、ポリアミノ 酸キャリア、合成高分子、天然高分子など)などを含有させることができる。
[0037] また、本発明による免疫抑制用組成物は、全身的または局所的に投与することが でき、具体的な投与方法としては、点滴、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮 内注射、経口投与、経粘膜投与、経皮投与などが挙げられる。したがって、本発明の 別の態様によれば、免疫抑制を必要とする哺乳動物の治療方法であって、哺乳動物 に治療上有効量の本発明によるモノクローナル抗体を投与することを含んでなる、方 法が提供される。本発明によるモノクローナル抗体の投与量は、哺乳動物の状態、 年齢などにより異なる力 通常、 0. 05〜40mgZ体重 kgZ日、好ましくは 0. 1〜1. OmgZ体重 kgZ日を 1回または数回に分けて投与することができる。また、投与は、 1回のみとすることもできるが、例えば、 4週間の間に反復投与することもできる。
[0038] また、本発明によるモノクローナル抗体は、臓器移植の際、移植拒絶の指標となる 自己抗原タンパク質と特異的に反応することから、哺乳動物における移植拒絶を予 測または診断のために用いることができる。ここで、自己抗原タンパク質とは、哺乳動 物において存在し、好ましくは、ハイプリドーマ 1F5、ハイプリドーマ 3F2、ハイブリ ドーマ 15F11、ハイブリドーマ 17C2またはハイプリドーマ 16G9により産生され
るモノクローナル抗体によって認識されるタンパク質を意味する。したがって、本発明 の別の態様によれば、本発明モノクローナル抗体を有効成分とする、哺乳動物にお ける移植拒絶の予測または診断用組成物が提供される。上記組成物には、所望によ り薬学上許容される担体を添加することができる。また、上記移植拒絶は、好ましくは 臓器移植後に生ずるものであり、より好ましくは免疫抑制剤の投与を中止した後に生 ずるものである。また、本発明の別の態様によれば、哺乳動物における移植拒絶の 予測または診断薬としての、本発明によるモノクローナル抗体の使用が提供される。 また、本発明の別の態様によれば、哺乳動物における移植拒絶を予測または診断す る方法であって、哺乳動物由来の生物学的試料と、本発明によるモノクローナル抗 体との免疫反応性レベルを測定することを含んでなる、方法が提供される。そして、 上記方法においては、測定された免疫反応性レベルが、移植拒絶の発症した哺乳 動物の生物学的試料と、本発明によるモノクローナル抗体との免疫反応性レベルを 参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、移植拒絶のリスクが高いと予測また は診断する。この閾値は、哺乳動物およびドナーの種、性別、移植臓器の種類およ び測定方法などに応じて当業者によって適宜決定される。本発明による予測または 診断方法によれば、不必要な免疫抑制剤の投与を回避することにより、患者の身体 的および経済的負担を軽減することができる。
[0039] また、上記生物学的試料としては、好ましくは血液であり、より好ましくは血清である 上記免疫抑制剤は、臓器移植に用いられる免疫抑制剤であれば特に限定されな いが、例えば、シクロフォスフアミドなどのアルキル化剤、 ァザチォプリン、メソトレキサ ート、ミゾリビンなどの代謝拮抗剤、シクロスポリン、タクロリムスなどの T細胞活性阻害 剤、プレド-ゾロン、メチルプレド-ゾロン、ミコフエノール酸モフエチル、ァザチォプリ ンなどのステロイド剤、バシリキシマブ、ムロモナブなどのリンパ球表面機能阻害剤ま たはそれらの組み合わせなどが挙げられる。
[0040] 上記哺乳動物および移植臓器のドナーとしては、ヒト、ブタ、ヒヒなどが挙げられるが 、好ましくはヒトである。移植される臓器としては、例えば、肝臓、心臓、腎臓、皮膚な どが挙げられる。
[0041] 上記免疫反応性レベルを測定する方法の具体例としては、抗原抗体反応を利用す る方法であれば特に限定されないが、例えば、蛍光抗体法、化学染色法、酵素抗体 法、 ELSA法，ラジオイノムアツセィ，免疫沈降法、ウェスタンブロット法、またはウェス タンプロット変法（ウェスタン法，サウスウェスタン法，ノースウェスタン法，もしくはゥェ ストウェスタン法など）またはプロテインチップ法などを挙げることができる。したがって 、本発明の別の好ましい態様によれば、前記免疫反応性レベルは、蛍光抗体法、化 学染色法、酵素抗体法、 ELISA、ラジオィムノアツセィ、免疫沈降法、ウェスタンプロ ッティング法、ウェスタンブロット変法またはプロテインチップ方により測定するもので ある。
[0042] また、本発明の別の態様によれば、哺乳動物における移植拒絶を予測または診断 するためのキットであって、抗ヒストン HIモノクローナル抗体を少なくとも含んでなる、 キットが提供される。ここで、上記移植拒絶は、好ましくは臓器移植後に生じるもので あり、より好ましくは免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである。
[0043] ポリペプチド
本発明によるポリペプチドは、上述のような、本発明による抗ヒストン HIモノクロ一 ナル抗体の認識するェピトープをそのアミノ酸配列内に含んでなるものである。そし て、本発明の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号 4、配列番号 5、配列 番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミノ酸配列からなるものである。
[0044] また、本発明の別の好ま 、態様によれば、ポリペプチドは、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1個 または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列力もなるものである。 ここで、「1もしくは数個」の範囲は、好ましくは 1〜3個、より好ましくは 1〜2個程度を 意味する。
[0045] また、本発明の別の好ま 、態様によれば、ポリペプチドは、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミノ酸配列の部分配列から なるものである。そして、上記部分配列としては、好ましくは配列番号 4における第 6 〜9番で表される部分配列、配列番号 5における第 5〜9番で表される部分配列、配 列番号 6における第 2〜5番で表される部分配列、配列番号 7における第 2〜5番で
表される部分配列および配列番号 8における第 7〜9番または第 11〜12番で表され る部分配列が挙げられる。
[0046] また、本発明の別の態様によれば、ポリペプチドは、配列番号 4、配列番号 5、配列 番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミノ酸配列またはその部分配列を 含んでなるものである。また、このポリペプチドは、好ましくは約 3〜300個、より好まし くは約 12〜 150個のアミノ酸残基力もなるものとされる。
[0047] 本発明によるポリペプチドは、本発明によるモノクローナル抗体を用いたファージデ イスプレイペプチドライブラリーキットによる解析に基づき、アミノ酸配列が決定された ものである。本発明によるポリペプチドは、そのアミノ酸配列に基づき、公知のぺプチ ド合成装置などにより合成することができる。
[0048] また、本発明によるポリペプチドは、そのままで、または公知の手法により誘導体ィ匕 して、生体において抗ヒストン HI抗体の産生を誘導するために用いることができる。 さら〖こ、ヒストン HIまたはヒストン HI様抗原もまた、感作抗原として生体に投与して、 抗ヒストン HI抗体を産生させることにより、免疫抑制作用を発揮させることができる。 したがって、本発明の好ましい態様によれば、ヒストン Hl、ヒストン HI様抗原または 本発明によるポリペプチドを有効成分とする免疫抑制用組成物が提供される。また、 本発明の別の態様によれば、免疫抑制用組成物の製造における、ヒストン Hl、ヒスト ン HI様抗原または本発明によるポリペプチドの使用が提供される。
[0049] 上記免疫抑制用組成物は、医薬上許容される担体とともに、その投与方法に応じ た剤型に製造することが可能であり、例えば、その剤型が液剤の場合は、適当な溶 剤、溶解補助剤、保存剤、安定剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、等張化剤および緩 衝剤、賦形剤、増粘剤、着色剤、公知のキャリア（各種リボソーム、ポリアミノ酸、キヤリ ァ、合成高分子、天然高分子）、アジュバントなどを適宜含有させることができる。
[0050] 上記免疫抑制用組成物の投与方法としては、当該技術分野において使用可能な 方法を用いてよぐ例えば、動脈内注射、点滴、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注 射、皮内注射、経口投与、経粘膜投与、経皮投与などが挙げられる。したがって、本 発明の別の態様によれば、免疫抑制を必要とする哺乳動物の治療方法であって、哺 乳動物に治療上有効量のヒストン HI、ヒストン HI様抗原または本発明によるポリべ
プチドを投与することを含んでなる、方法が提供される。また、治療上有効量は、哺 乳動物の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣などによって異なるが、例えば、有 効成分の量として、 0. 005 μ g〜2gZ体重 kgZ日とすることができる。また、その投 薬計画は、哺乳動物における抗体産生を確認することにより、当業者であれば適切 に作成することができる。
また、ヒストン Hl、ヒストン HI様抗原または本発明によるポリペプチドは、哺乳動物 において産生される抗ヒストン HI抗体と特異的に反応することから、哺乳動物におけ る抗ヒストン HI抗体量の測定に利用することができる。したがって、本発明の別の態 様によれば、哺乳動物由来の生物学的試料における抗ヒストン HI抗体量を測定す るための、ヒストン Hl、ヒストン HI様抗原または本発明によるポリべプチを有効成分 とする、組成物が提供される。そして、上記抗ヒストン HI抗体は、上述の通り、移植拒 絶を抑制する機能を有することから、哺乳動物における抗ヒストン HI抗体量は、移植 拒絶の予測または診断の指標となる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれ ば、上記糸且成物は、哺乳動物における移植拒絶の予測または診断に用いることがで きる。また、本発明の別の態様によれば、哺乳動物における移植拒絶の予測または 診断薬としての、本発明によるヒストン Hl、ヒストン HI様抗原または本発明によるポリ ペプチドの使用が提供される。上記移植拒絶は、臓器移植後に生ずるものであり、よ り好ましくは免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである。また、本発明の別 の態様によれば、哺乳動物における移植拒絶を予測または診断する方法であって、 哺乳動物における生物学的試料における抗ヒストン HI抗体と、ヒストン Hl、ヒストン H 1様抗原または本発明によるポリペプチドとの免疫反応性レベルを測定することを含 んでなる、方法が提供される。そして、上記方法においては、測定された免疫反応性 レベル力 移植拒絶の発症した哺乳動物の生物学的試料中の抗ヒストン HI抗体と、 ヒストン HI、ヒストン HI様抗原または本発明によるポリペプチドとの免疫反応性レべ ルを参照して予め設定された閾値よりも高 、場合に、移植拒絶のリスクが低 、と予測 または診断する。この閾値は、哺乳動物およびドナーの種、性別、移植臓器の種類 および測定方法などに応じて当業者によって適宜決定される。本発明による予測ま たは診断方法によれば、不必要な免疫抑制剤の投与を回避することにより、患者の
身体的および経済的負担を軽減することができる。
[0052] 上記免疫反応性レベルを測定する方法の具体例としては、抗原抗体反応を利用す る方法であれば特に限定されないが、例えば、蛍光抗体法、化学染色法、酵素抗体 法、 ELSA法，ラジオイノムアツセィ，免疫沈降法、ウェスタンブロット法、またはウェス タンプロット変法（ウェスタン法，サウスウェスタン法，ノースウェスタン法，もしくはゥェ ストウェスタン法など）、プロテインチップ法などを挙げることができ、好ましくは、前記 免疫反応性レベルは、蛍光抗体法、化学染色法、酵素抗体法、 ELISA、ラジオィム ノアッセィ、免疫沈降法、ウェスタンブロッテイング法、ウェスタンブロット変法またはプ 口ティンチップ法であり、より好ましくはプロテインチップ法である。プロテインチップ法 においては、本発明によるポリペプチドをプロテインチップに担持することにより、哺 乳動物における移植拒絶の予測または診断を迅速かつ的確に行うことができる。
[0053] また、本発明の別の態様によれば、哺乳動物由来の生物学的試料における抗ヒス トン HI抗体量を測定するためのキットであって、ヒストン Hl、ヒストン HI様抗原また は本発明によるポリペプチドを少なくとも含んでなる、キットが提供される。また、本発 明の別の好ましい態様によれば、上記キットは、哺乳動物における移植拒絶を予測 または診断するためのものである。またここで、上記移植拒絶は、好ましくは臓器移 植後に生ずるものであり、より好ましくは免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるも のである。
[0054] 上述の生物学的試料、免疫抑制剤、移植臓器、哺乳動物および移植される臓器の ドナー等は、上述の、本発明によるモノクローナル抗体を用いた、治療方法および移 植拒絶の予測または診断方法と同様とされる。
実施例
[0055] 以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
なお、試薬および抗体は、特記しない限り分析用のものを使用した。また、 DAラット および PVGラット（ォス、 7— 8週齢）は、それぞれ Japan SLC社または Seac Yoshitomi 社より購入した。また、 8 1^/(；マゥス(ォス,5— 6週齢）は日本チャールズ 'リバ一株 式会社より購入した。
[0056] 参考例 1
混合リンパ 反] ^ (MLR)：ラット細朐
無処理の PVGラット由来の脾臓リンパ球 (応答細胞）およびマイトマイシン C (協和 発酵工業株式会社製)処理を行った DAラット由来の脾臓リンパ球 (刺激細胞)を用 いた。応答細胞は 10%FCS—RPMI培地にて 5 X 105細胞 ZmLに調整し、刺激細 胞は 10%FCS— RPMI培地にて 8 X 106細胞 ZmLに調整した。この応答細胞懸濁 液および刺激細胞懸濁液をそれぞれ 100 Lを 96穴丸底プレート（Nunc Brand P roducts社製）に播種した後、混合培養開始時に抗ヒストン HIポリクローナル IgG (Sa nta Cruz Biotechonology社製： 0. 1、 0. 2、 0. 4、 0. 8、もしくは 1. 6 μ gZゥエル）ま たはゥサギ IgG (normal rabbit IgG : Santa Cruz Biotechonology社製： 0. 1、 0. 2、 0. 4、 0. 8、もしく ίま 1. 6 μ g/ウエノレ）を添カロし、 37°C, 5%CO /95% airの条件下に
2
て 3. 5日以上培養した。この際、陽性対照として、タクロリムス (FK506 :藤沢薬品社 製)を添加した。さらに、培養終了 15時間前にプロモデォキシゥリジン (BrdU) 10 Lを添カ卩した。そして、 BrdUラベリング &ディテクシヨンキット III (ロシュ'ダイァグノス テイクス社製)を用いて、細胞内 DNAに取り込まれた BrdU量を指標として細胞増殖 度を測定した。ここで、細胞増殖能が高い程 BrdU取り込み量も多くなる。
[0057] この結果、抗ヒストン HIポリクローナル IgGを添カ卩した場合、 MLRは有意に阻害さ れ、タクロリムスを添加した場合と同などであった。
[0058] 参者例 2
混合リンパ球反 (MLR)：ヒト細朐
リンパ球の調製
ヒト 2人（Aおよび B)より末梢血 10mLを採取し、その血液を遠心分離 (1500rpm、 3 0分)にて処理した後、血漿を除去した。そして、その残渣に、除去した血漿と等量 (3 mL)の PBSを加えて攪拌した。この混合液にフイコール パーク溶液（FicoU- paque 液、 Amersham Biosciences社製） 3mLをカ卩えて密度勾配遠心分離（1500rpm、 30 分）にて処理し、リンパ球を含む中間の白層を得た。この白層に滅菌した PBSをカロえ て総量 12mLの細胞懸濁液とし、遠心分離 (1500rpm、 5分）にて処理した。この操 作を 2回行った後、得られたリンパ球を 10%FCS— AIM— V培地（GIBCO) lmLに
懸濁した。
[0059] MLR
B由来のリンパ球 (応答細胞)およびマイトマイシン C (協和発酵工業株式会社製） 処理を行った A由来のリンパ球 (刺激細胞）を用いて以下の試験を行った。応答細胞 は 10%FCS— AIM— V培地にて 5 X 105細胞 ZmLに調整し、刺激細胞は 10%F CS— RPMI培地にて 8 X 106細胞/ mLに調整した。この応答細胞懸濁液および刺 激細胞懸濁液をそれぞれ 100 μ Lを 96穴丸底プレート（Nunc Brand Products社 製）に播種し、混合培養開始時に抗ヒストン HIポリクローナル IgG (Santa Cruz Biote chonology社製： 0. 1、 0. 2、 0. 4、 0. 8、もしくは 1. 6 /z gZゥエル）またはゥサギ IgG (.normal rabbit IgG： banta Cruz Biotechonology社製： 0. 1、 0. 2、 0. 4、 0. 8、 ¾しく は 1. 6 μ g/ゥエル）を添カ卩し、 37°C, 5 %CO /95 % airの条件下にて 2. 5日培養した
2
。この際、陽性対照として、タクロリムスを添加した。なお、培養中、各ゥエルに終濃度
10 gZmLとなるように ConAを添加し、刺激細胞が増殖能を停止していること、およ び反応細胞が抗原刺激により細胞増殖起こすことを確認した。そして、各ゥエルを参 考例 1と同様に処理し、 BrdUラベリング &ディテクシヨンキット III (ロシュ'ダイァグノス テイクス社製）を用いて、細胞内 DNAに取り込まれたブロモデォキシゥリジン（BrdU) 量を指標として細胞増殖度を測定した。
[0060] B由来の応答細胞およびマイトマイシン C処理を行った A由来の刺激細胞の組合わ せでは MLRによる細胞増殖が確認された。そして、 MLRは抗ヒストンポリクローナル 抗体によって濃度依存的に抑制された。一方、ゥサギ IgG (normal rabbit IgG)では M LRは抑制されなかった。
[0061] 実施例 1
ハイプリドーマの製造
爐
PBS中に抗原（Histone HI Histone Fl Histone KAP、 Roche社製）を溶解させた溶 液 0. 8mL (抗原濃度： 0. 5mgZmL)とフロイトコンプリートアジュバンド（和光純薬 株式会社製) 0. 8mLとを混合し、懸濁液 (抗原濃度: 0. 25mgZmL)を得た。次に 、この懸濁液 0. 2mLを BALB/cマウスに腹腔内投与した。さらに、この懸濁液を 2週
間毎に同量にてマウスに投与した。そして、投与開始から 16週間後、 PBS中抗原を 溶解させた溶液 0. 2mL (抗原濃度： 600〜： LOOOmg/mL)をマウス腹腔内へ最終 投与した。なお、投与の際には、眼底静脈より採血を行って ELISAにより抗体価を測 定した。最終投与の 4日後、全採血を行い、得られた血液を遠心分離（2000rpm、 2 0分)し、抗血清を得て以下の実験のコントロール抗血清として用いた。また、全採血 後、ラットより脾臓を摘出し、得られた脾細胞を以下の細胞融合に用いた。
[0062] 細胞融合
上記の脾細胞およびミエローマ細胞（P3X63-Ag.8.653)を脾細胞：ミエローマ細胞 = 10 : 1〜： LOにて混合して遠心分離（1500rpm, 5分)した。遠心分離した後、ァス ピレーターを用いて上清を除去し、得られた細胞ペレットに 37°Cのポリエチレングリコ ール 4000 (5O%PBS溶液） lmLを 1分間かけて添カ卩して混合液とした。この混合液 を 37°Cにて 1分間静置した後、 37°Cの IMDM培地（計 9mL)を 30秒毎に 1 mLずつ 加えた後、遠心分離（1500rpm、 5分)した。遠心分離後、上清を吸引除去し、 37°C の 15%FCS (JRH BIOSCIENCES製）含有 IMDM (GIBCO製）培地を適量添カ卩した 。得られた懸濁液を 96ゥヱル培養プレートに lOOmLずつ分注を行い、 37°C/5%C Oインキュベータ一にて 1日培養した。さらに HAT培地（HAT粉末（HAT MEDIA S
2
UPPLEMENT ( X 50)、 SIGMA製)を無血清 IMDM培地 10mLに溶かし、 10%FCS 含有 IMDM培地にて 50倍希釈したものである。）を lOOmL添カ卩し、 37°C/5%CO
2 インキュベータ一にて培養した。 HAT培地の交換は 2〜3日毎に行い、 10日後には HT培地（HT粉末（HT MEDIA SUPPLEMENT, SIGMA製)を無血清 IMDM培地 10 mLに溶かし、 10%FCS含有 IMDM培地にて 50倍希釈したものである。 )に切り替 え、 3日間、 37°CZ5%COインキュベータ一にて培養を行った。以後 2〜3日ごとに
2
培地 (HT培地)の交換を行った。細胞増殖を顕微鏡により確認した後、培養上清 (約 100 mL)を回収した。この培養上清を用いて、以下に示されるヒストン HIに対する抗 体価測定によるハイプリドーマのスクリーニングを行った。
[0063] ノヽイブリドーマ細胞のスクリーニング
体麵'
ヒストン HI (5mg、 calf thymus histone Hl、ロシュダイァグノスティックス社製）を含
む緩衝液（Baicarbonate buffer: 100 mM NaHCO - NaOH、 pH9. 2〜9. 5、ヒストン H
3
1濃度： lmg/mL)を 1ゥエル当り 50 Lずつ 96ゥエル平底プレートへ添カ卩し、室温 にて 2時間静置してコーティングした。プレートを洗浄バッファー（PBST)にて 3回洗 浄し、ブロッキングバッファー（3%スキムミルク 1%BSA、 PBS)を 200〜250mL/ゥ エルにてカ卩え、 4°Cにて一昼夜反応させた後、 3回洗浄した。そして、ハイプリドーマ の培養上清を lOOmL/ゥエルにて加え、 37°Cにて 4時間または 4°Cにて一昼夜反応 させた。プレートを 3回洗浄した後、希釈バッファー（10 mM Tris-HCl ( pH 8.0 ), 0.9 % ( W/V ) NaCl、 0.05 % ( W/V ) Tween20)にて 10000倍希釈したピオチン標識抗マ ウス IgG (Biotion- labeled anti-mouse IgG 、 SIGMA)を 50mL/ゥエルにて加え、室温 にて 2時間反応させた。その後 6回洗浄した後、希釈バッファ一にて 1000倍希釈した アルカリフォスファターゼ標識ストレプタリジン（streptarridin)を 50mL/ゥエルにて加 え、室温にて 1〜2時間反応させた。その後 6回洗浄を行い、蛍光基質バッファー (At tophos substrate buffer,ロシュダイァグノスティックス社製）を 50mL/ゥェルカ卩えてプ レートを遮光し発色させた。蛍光強度は CytoFluorll (パーセプティブ社製）にて測定 した。
[0064] ノ、イブリドーマの撰别
上記抗体価測定にて陽性の結果を示したゥエル（1 X 105細胞/ mL)に 15%FCS 10%HCF (Hybridoma cloning factor,オリジン社製）含有 IMDM培地をカ卩えて、約 200細胞 Zゥエルとなるように 96ゥエル培養プレートに分注し、 37°C5%COインキ
2 ュベータ一にて培養を行った。そして、上記と同様に抗体価測定を行い、抗体産生 量の多 ヽハイブリドーマを選択した。
[0065] さらに限界希釈を行い、選択したノヽイブリドーマが 0. 5〜1細胞 Zゥエルになるよう に 15%FCS10%HCF含有 IMDM培地で希釈し、 37°C/5%COインキュベータ
2
一にて約 3〜4日間培養した後、上記と同様に抗体価測定を行い、抗体産生量の多 いハイプリドーマを選択した。さらに限界希釈を繰り返し、 38個の抗 HIモノクローナ ル抗体を産生するハイプリドーマを得た。このうち、コントロール抗血清より抗体価が 高 ヽ 10偶のノヽイブリドーマを選択して 1F5、 3F2、 15A11, 15F11、 16D1、 16G9 、 17C2、 17E2、 21E3、および 22A12と命名した。
[0066] 試験例 1 :杭ヒストン HIモノクローナル抗体含有培着上清による MLR抑制活性評価 試験
杭ヒストン HIモノクローナル杭体含有焙着卜.清の調製
各ハイブリドーマは、 15%FCS 10%HSF含有 IMDM培地を用いて培養した（1 X 106細胞/ mL)。この培養上清 15mLを CENTRIPREP YM- 10 (MILLIPORE)を用い て遠心分離（2000g、 2. 5時間）し、抗ヒストン HIモノクローナル抗体を含有する培 養上清の濃縮液を得た。
[0067] MLR
得られた培養上清の濃縮液（1000倍希釈液)を用いて、参考例 1と同様の方法に したがって MLR抑制活性評価試験を行った。対照として、免疫前ラット血清（1000 倍希釈液）、ゥサギ IgG(Normal rabbit IgG 1.6mg、 Santa Cruz Biotechonology製) 1 . 6 μ gZゥエル、抗ヒストン HIポリクローナル抗体（anti- histone HI polyclonal IgG 2 00 μ gゝ Santa Cruz Biotechonology製） 1. 6 μ gZゥエル、タクロリムス 1. 6 gZゥ エルを用いた。なお、希釈液としては IMDM培地を用いた。
[0068] 結果は図 1に示される通りであった。 1F5、 3F2、 15A11、 15F11、 16D1、 16G9 、 17C2、および 17E2の 8つのハイプリドーマの培養上清は、抗ヒストン HIポリクロー ナル抗体およびタクロリムスと同等の MLR抑制活性を示した。なお、図 1において、 P VGZPVGはマイトマイシン C刺激により増殖能を消失した PVGリンパ球と反応細胞 である PVGリンパ球との混合培養を表し、 DAZPVGは同様にして増殖能を失った D Aリンパ球と反応細胞である PVGリンパ球の混合培養を表す。
[0069] 試験例 2：抗ヒストン H 1モノクローナル抗体の認識部位の特定 1
測定用サンプルの調製
PVGラットより脾細胞摘出し、ワイズマンの方法（Weissman et al.， Science, 239, 10 18-1021 , 1988)にしたがって細胞破砕を行った。脾細胞に PBS lmLをカ卩えて遠心 分離（1 , 500rpm、 5分)した後、脾細胞を回収した。この細胞をシリンジを利用して懸 濁し、同量の 150mM NaClをカ卩えた。得られた細胞懸濁液を遠心分離（300 X g、 1 0分)し、沈殿物および上清を得た。この沈殿物を不溶性画分 (核画分含有)とし、上 清を細胞膜含有可溶性画分とした。不溶性画分には 5倍量 (v/v)の電気泳動用サン
プルバッファー（0.25 M Tris-HCl (pH 6.8) 25mL、 SDS 2. Og、超純水 9mL、 gly cerol 10mL、 BPB 5mg)をカ卩えて 5分間煮沸した後、遠心分離を行い、得られた上 清を測定用サンプルとした。また、細胞膜含有可溶性画分には EDTAを終濃度 5m Mとなるように添カ卩した。この細胞膜含有可溶性画分のうち、 100〜200 1^を回収 した。残りの細胞膜含有可溶性画分を超遠心 (4°C、 200000 X g、 45分）にて処理し た。そして、得られた沈殿を細胞膜画分とし、得られた上清を細胞膜除去可溶性画 分とした。細胞膜画分については、 5倍量 (v/v)の電気泳動用サンプルバッファーを 加えて 5分間煮沸した後、遠心分離を行った。そして、得られた上清を測定用サンプ ノレとした。
[0070] また、試験例 1にて得られた抗ヒストン HIモノクローナル抗体含有培養上清 10mL をバインディングバッファー（20mMリン酸バッファー， ρΗ7. 0)にて希釈し、 50 mL の溶液を得た。この溶液を、 HiTrap Protein Gカラム (HiTrap Protein G HP、 Amersha m Biosciences製)中に 0. 2〜： LmL/minにて送液し、 4°Cにて一昼夜循環させた。そ の後、バインディングバッファー 5 mLを l〜2mL/minにて送液し、カラムを洗浄した 。そして、カラム洗浄後、上記細胞膜含有可溶性画分溶液を 0. 2〜： LmL/minにて送 液し、 4°Cにて一昼夜循環させた。次に、バインディングバッファー 2mLを 1〜2 mL/ minにて送液し、素通りした画分を得た。この素通りした画分は測定用サンプルとした
[0071] 杭ヒストン HIモノクローナル杭体の精製
HiTrap NHSカラム（HiTrap NHS- activated HPゝ Amersham Biosciences AB製)に 1 mM HCL溶液を l〜2mL/minにて送液し、次にヒストン HI溶液（ヒストン HI (ロシュダ ィァグノステイクス社製） 1 0. 5mg、カップリング バッファー（0. 2M NaHC03, 0.5 M NaCl pH 8.3) ) ImLを ImL/minにて送液し、送液後、直ちにカラムを密閉してカツ プリングを行った（15〜30分）。カップリング後、バッファー A( 0.5 M monoethanolami ne, 0.5 M NaCl pH 8.3)、ノ ッファー B (0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl pH 4.0) および中性バッファー（1.0M Tris-HCl, pH 9.0)にてカラム内を洗浄した。次に試験 例 1にて得られた抗ヒストン HIモノクローナル抗体含有培養上清をカラム内へ 1 mL/ minにて送液し、循環させた (4°C, overnight)0次にリン酸バッファー 5mLにて洗浄し
た後、エリユーシヨンバッファーを 0. 2〜： LmL/minにて 5mL送液し、溶出された画 分力も精製抗ヒストン HIモノクローナル抗体を得た。
[0072] SDS -PAGE
Laemmliの不連続緩衝液系における電気泳動法（Nature, 227, 680-685, 1970)に したがって、各測定用サンプルを SDS— PAGEにて処理した。コントロールとしては 、ヒストン Hl (5mg、ロシュダイァグノステイタス社製）を用いた。 SDS— PAGEの後、 得られたゲルは以下のクーマシー染色またはウェスタンブロッテイングに用いた。
[0073] クーマシー染色
SDS— PAGE後のゲルは、染色液（0.25%クーマシーブリリアントブルー R /ェタノ ール：酢酸：蒸留水 = 9 : 2 : 9)に浸し約 1時間振盪した後、脱色液 (エタノール：酢酸： 蒸留水 = 25 : 8 : 65)に浸し約 1時間し脱色した。その後保存液 (メタノール:酢酸:蒸留 水 = 10 : 15 : 175)に浸してバックグラウンドを脱色した。
[0074] ウェスタンブロッテイング
SDS— PAGE後のゲルをセミドライ式転写装置（AE-6675, ATTO製）を用いて PV DF膜に転写した。次に、転写後の PVDF膜をブロッキング溶液（5% skim milk 1% B SAの PBST溶液）に浸して振盪した (4°Cにて一昼夜、または室温にて 1時間）。次に 、 PVDF膜に対して、一次抗体として精製抗ヒストン HIモノクローナル抗体を含む溶 液 (ブロッキング溶液にて 500倍に希釈したものである）をカ卩えて室温にて 1時間振盪 した後、 PBSTにて 15 min X l回， 5 min X 3回洗浄した。洗浄後、 PVDF膜に対して、ブ ロッキング溶液で 20000倍希釈した二次抗体（HRP-anti-mouse IgG (SIGMA製） )溶 液を加えて室温で 1時間振盪した。振盪後、 PBSTにて 15分 X I回， 5分 X 3回洗浄し た。さらに、 ECLウェスタン ブロッテイング ディテクシヨン システム（ECL Plus West en blotting detection system^ Amersnam Biosciences AB)を用 ヽ飞特異抗体の結合 を検出し、 X線フィルム RX- U(FUJI PHOTO FILM,Tokyo,Japan)にて露光後現像した
[0075] ウェスタンブロッテイングの結果、細胞膜分画の 3 lkDの位置に特異的なバンドが 検出された。そして、このバンドはクマシ一染色においてヒストン HIと同じ位置に検 出された。
[0076] 試験例 3：抗ヒストン HIモノクローナル抗体の認識部位の特定 2
PVGラットの脾細胞を 4%ホルマリン含有 PBS溶液に懸濁し、室温にて 20分間固 定化した。さらに、脾細胞を染色用バッファー（Staining buffer: 1%(ν/ν) FCS、 0. 1% (w/v)Sodium azide含有 PBS溶液、 4°C)にて 3回洗浄した後、染色用バッファー 100 mL中細胞数を 2 X 106個含む混合液を調整した。この混合液に一次抗体 (ピオチン 標識した抗ヒストン HIモノクローナル抗体 2mLまたはピオチン標識したノーマルマ ウス IgG 5mL)をカ卩えて 37°Cにて 1時間反応させた。この反応の後、脾細胞を染色 用バッファー (4°C)にて 3回洗浄し、さらに脾細胞に染色用バッファー lOOmLをカロ え、 FITC標識ストレプトアビジン (BD PharMingen製） lmLをカ卩えて、室温にて 30時 間反応させた。反応後、脾細胞を染色用バッファー (4°C)にて 3回洗浄し、脾細胞に P BS 500mL中をカ卩えて懸濁液とした。また、この懸濁液にプロビジゥム ィォジド（Pro pidum Iodide, SIGMA)を終濃度 5mgZmLとなるように添カ卩して室温にて 20分反応さ せた。得られた細胞を 50%グリセリン含有 PBS溶液にて封入した後、蛍光顕微鏡にて 観祭した。
この結果、脾細胞の周囲 (細胞膜)部分のみが特異的に蛍光染色された。
[0077] 試,験例 4：杭ヒストン HIモノクローナル杭体の認識部位の特定 3
ファージディスプレイ
ノヽイブリドーマ 1F5、 3F2、 15F11、 17C2または 16G9から産生される抗ヒストン HI抗体に関し、 Ph.D.- 12ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（New Engla nd BioLabs, In から購入)を用いて、パンユング実験を行った。精製した各モノクロ ーナル抗体を 0.1M NaHCO (pH 8.6)に溶解し、直接マイクロタイタープレート (Nunc,
3
catalog #430341)にコートして 4°Cでー晚インキュベートした。各ゥエルにブロッキング バッファー (0.1M NaHCO , 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN )を加え、少なくとも 1時間 4°C
3 3
でインキュベートした後、 TBST (50mM Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)で洗浄し た。 1回目のパンユングでオリジナルライブラリーの中の 4 x 101。個のファージをスタリ 一ユングに用いた。結合しな力つたファージを TBTSによる洗浄を繰り返すことによつ て除去した。結合したファージを 0.2M Glycine- HC1 (pH 2.2), lmg/ml BSAによって 溶出した。溶出したファージを 20mL E Coli ER2738 cultureによって増殖させた。得ら
れたファージを、ポリエチレングリコールを用いて沈殿させて、 2回目のパンユングに 用いた。さらに、同様の操作手順にしたがって、 3回目のパンユングを行った。 3回目 のパン-ングにおいて得られたプラークを 1:100にて希釈し、 ER2738 cultureを用いて 増殖させた。これらを内容物とするチューブを 4.5〜5時間振とうしながら 37°Cにてイン キュペートした。 1本鎖ファージ DNAをィォジド バッファー (Iodide buffer : 10mM Tris- HC1, ImM EDTA, 4M Nal)とエタノールで沈殿、精製した。 DNAシークェンス解析の ためにファージ DNAを 20 μ L ΤΕバッファー (10 mM Tris— HC1 pH 8.0, ImM EDTA)に 溶解させた。
[0078] DNAシークェンス解析
得られた精製ファージ DNAにつ!/、て、上記 Ph.D.-12ファージディスプレイペプチド ライブラリーキット添付のプライマー DNAおよび DYEnamic™ ET Terminator Cycle Se quencing Premix Kit (Amersham Biosciences社製)を用いて、シークェンシング PCR 反応を行った (PCR反応条件： 95°C (30秒）、次 、で 50°C (15秒）、次 、で 60°C (1分) 3 0サイクル）。 PCR産物を AutoSeq™ G-50 (Amersham Biosciences)を用いて精製した 。そして、 ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (PE Biosystems)を用いてファージぺプ チドの DNAシークェンスを決定した。決定された DNAシークェンスに基づくアミノ酸配 列は以下に示される通りであった。
[0079] ハイプリドーマ株 アミノ酸配列
1F5 ： NYQTYTPRPPHS (配列番号 4)
3F2 ： VTNNQTSPRWEI (配列番号 5)
15F11 ： WKPVSLTLHTHP (配列番号 6)
17C2 ： HATGTHGLSLSH (配列番号 7)
16G9 ： SSVLYGGPPSAA (配列番号 8)
[0080] 競合 ELISA(Competition ELISA)
上記ファージ DNAから決定されたアミノ酸配列を有する、各ペプチドを常法にした 力 て合成した。得られたペプチド、精製した各モノクローナル抗体およびヒストン HI 抗原 (Roche, catalog # 1004875)を用い、競合 ELISAを行った。この際、ヒストン HI抗 原のビォチュル化には EZ- Link Sulfo- NHS- Biotinylation kit (Pierce製)を用い、発色
試薬として ABTS溶液 (Sigma, A3219)を用いた。発色は ELISA測定器 (ThermoLabsyst em, Multiskan Ascent)を用いて 405 nmで検出した。測定値は 3回測定した吸収値の 平均とした。
この結果、合成した上記ペプチドが、精製した各モノクローナル抗体とヒストン HI抗 原との結合を阻害することが確認された。
Claims
請求の範囲
[I] ヒストン HIまたは脾細胞の細胞膜に存在するヒストン HI様抗原を認識することを特 徴とする、モノクローナル抗体。
[2] 配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミ ノ酸配列内に位置するェピトープを認識することを特徴とする、請求項 1に記載のモ ノクローナル抗体。
[3] ノヽイブリドーマ 1F5、ハイプリドーマ 3F2、ハイブリドーマ 15F11、ハイブリドー マ 17C2およびハイプリドーマ 16G9からなる群から選択される少なくとも一つのハ イブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
[4] 請求項 1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を有効成分とする、免疫 抑制用組成物。
[5] 請求項 1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を有効成分とする、哺乳 動物における移植拒絶の予測または診断用組成物。
[6] 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである、請求項 5に 記載の組成物。
[7] 哺乳動物における移植拒絶を予測または診断するためのキットであって、請求項 1 〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を少なくとも含んでなる、キット。
[8] 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである、請求項 7に 記載のキット。
[9] ヒストン HIまたは脾細胞の細胞膜に存在するヒストン HI様抗原を認識することを特 徴とするモノクローナル抗体を産生する、ハイプリドーマ。
[10] 前記モノクローナル抗体が、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7また は配列番号 8で表されるアミノ酸配列内に位置するェピトープを認識することを特徴 とする、請求項 9に記載のハイプリドーマ。
[II] ノヽイブリドーマ 1F5、ハイプリドーマ 3F2、ハイブリドーマ 15F11、ハイブリドー マ 17C2またはハイプリドーマ 16G9。
[12] 配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミ ノ酸配列からなる、ポリペプチド。
[13] 配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミ ノ酸配列において、 1個または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸 配列からなる、ポリペプチド。
[14] 配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミ ノ酸配列の部分配列力もなる、ポリペプチド。
[15] 配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7または配列番号 8で表されるアミ ノ酸配列またはその部分配列を含んでなる、ポリペプチド。
[16] ヒストン Hl、ヒストン HI様抗原または請求項 12〜15のいずれか一項に記載のポリ ペプチドを有効成分とする、免疫抑制用組成物。
[17] 哺乳動物由来の生物学的試料における抗ヒストン HI抗体量を測定するための、ヒ ストン Hl、ヒストン HI様抗原または請求項 12〜15のいずれか一項に記載のポリべ プチドを有効成分とする、組成物。
[18] 前記哺乳動物における移植拒絶の予測または診断のための、請求項 17に記載の 組成物。
[19] 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである、請求項 18 に記載の組成物。
[20] 哺乳動物由来の生物学的試料における抗ヒストン HI抗体量を測定するためのキッ トであって、ヒストン Hl、ヒストン HI様抗原または請求項 12〜15のいずれか一項に 記載のポリペプチドを少なくとも含んでなる、キット。
[21] 前記哺乳動物における移植拒絶を予測または診断するための、請求項 20に記載 のキット。
[22] 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである、請求項 21 に記載のキット。
[23] 免疫抑制を必要とする哺乳動物の治療方法であって、前記哺乳動物に治療上有 効量の請求項 1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を投与することを 含んでなる、方法。
[24] 哺乳動物における移植拒絶を予測または診断する方法であって、前記哺乳動物由 来の生物学的試料と、請求項 1〜3に記載のモノクローナル抗体との免疫反応性レ
ベルを測定することを含んでなる、方法。
[25] 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずる、請求項 24に記載の移 植拒絶を予測または診断する方法。
[26] 免疫抑制を必要とする哺乳動物の治療方法であって、前記哺乳動物に治療上有 効量のヒストン H 1、ヒストン H 1様抗原または請求項 12〜 15の!、ずれか一項に記載 のポリペプチドを投与することを含んでなる、方法。
[27] 哺乳動物における移植拒絶を予測または診断する方法であって、前記哺乳動物由 来の生物学的試料における抗ヒストン HI抗体と、ヒストン Hl、ヒストン HI様抗原また は請求項 12〜 15のいずれか一項に記載のポリペプチドとの免疫反応性レベルを測 定することを含んでなる、方法。
[28] 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずる、請求項 27に記載の移 植拒絶を予測または診断する方法。
[29] 免疫抑制用組成物の製造における、請求項 1〜3のいずれか一項に記載のモノク ローナル抗体の使用。
[30] 哺乳動物における移植拒絶の予測または診断薬としての、請求項 1〜3のいずれ か一項に記載のモノクローナル抗体の使用。
[31] 免疫抑制用組成物の製造における、ヒストン Hl、ヒストン HI様抗原または請求項 1
2〜 15のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
[32] 哺乳動物における移植拒絶の予測または診断薬としての、ヒストン Hl、ヒストン HI 様抗原または請求項 12〜 15のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
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