WO2006019155A1 - 遺伝子多型のタイピング方法 - Google Patents

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Yoshihide Hayashizaki
Toshizo Hayashi
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for typing a gene polymorphism such as SNP (-base polymorphism). More specifically, the present invention provides a method capable of typing a gene polymorphism that is more accurate, quicker and more specific than conventional methods.
  • Nucleotide sequences that carry genetic information are known to have many different sites among individuals! A state in which two or more alleles at a certain locus exist in the same population is called a polymorphism or mutation, and generally a polymorphism occurs when a certain base change occurs at a frequency of 1% or more, 1% The case of less than is called mutation.
  • Such polymorphisms or mutations include SNP (—Nucleotide polymorphism: Single Nucleotide Polymorphism) ⁇ ⁇ ⁇ with 1 to several tens of bases deleted or inserted, 2 to several tens of bases There are known differences in the number of repeats (VNTR or microsatellite polymorphism) with a repeat unit of 1 unit.
  • SNPs are not only useful as polymorphic markers, but also useful tools for searching genes related to diseases, but they also have a great deal of potential for morbidity, responsiveness to drugs, and possible side effects on drugs. Can provide useful information. There is a need to discriminate SNP site bases, that is, to perform SNP typing more accurately, easily and quickly.
  • SNP typing methods include TaqMan PCR method, Invader method, MalDI-TOF ZMS method, RCA method, DNA chip method and the like. Even with these methods, there are problems such as 1) time-consuming detection, 2) complicated detection process, 3) low accuracy, SNP typing of large-scale samples and on-site inspection of crops. It was difficult to put it to practical use in cases where quickness and simplicity were required.
  • Non-patent literature 1 Tsugunon Notomi et.al. (2000): Loop-mediated isothermal amplificati on of DNA.Nucleic Acids Research, Vol.28, No.12: e63
  • Non-Patent Document 2 Kentaro Ngamine and Tesu Hase, Tsugunori Notomi: Accelerated rea ction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.Molecular and Cellular Probes Vol.16, No.3, 223-229, 2002.
  • An object of the present invention is to provide a typing method capable of easily, quickly and accurately typing genetic polymorphisms, particularly SNP sites, using a relatively small amount of genomic DNA. .
  • the present inventors have developed a novel typing method for gene polymorphism. That is, the present invention relates to a method for typing a gene polymorphism, comprising: (1) preparing an open single-stranded nucleic acid comprising one or a plurality of single-stranded nucleic acids; and Since the nucleic acids have a sequence complementary to each other, they can take a stem-loop structure, and in the state having the stem-loop structure, the opened single-stranded nucleic acid has one or more loop portions.
  • the open portion of the single-stranded nucleic acid is located at a site other than the stem portion of the stem-loop structure, and has a sequence complementary to the polymorphic site of the allele at the 5 ′ or 3 ′ end, In a region including the circular part, and complementary to the sequence including the polymorphic site, (2) the sample and the single open ring in the state where the open single-stranded nucleic acid has a stem-loop structure. Incubating the strand nucleic acid; (3) one of the stem loop structures A gene polymorphism typing method comprising the step of further incubating one or two or more primers complementary to a part of one or two or more loop portions with the sample after the incubation.
  • the incubation step (3) in addition to the primer complementary to a part of the loop part, one kind or two having the same sequence as the part of the loop part of the stem loop structure. Incubate with more than one type of primer. As a result, the nucleic acid amplified with the single-stranded nucleic acid as a saddle type is further amplified as a saddle type, and the detection sensitivity of polymorphism typing is increased.
  • complementation at the polymorphic site of an allele is performed.
  • the specific sequence may be located either on the 5 ′ side or 3 ′ side of the open circular single-stranded nucleic acid, but is preferably located on the 3 ′ end.
  • the present invention is an open circular single-stranded nucleic acid for typing a gene polymorphism, and has a stem-loop structure because it has complementary sequences to each other, and has a stem-loop structure.
  • the open single-stranded nucleic acid has one or two or more loop portions, the open portion of the single-stranded nucleic acid is located at a site other than the stem portion of the stem-loop structure, and the allele of the allele
  • a single open ring characterized by having a sequence complementary to the polymorphic site at the 5 ′ or 3 ′ end and complementary to the sequence containing the polymorphic site in the region including the ring opening.
  • a strand nucleic acid is provided.
  • the open circle single-stranded nucleic acid of the present invention can be used for typing of various types of polymorphisms, and can also be typed for SNP (-base polymorphism).
  • the complementary sequence in the polymorphic site of the allele may be located on the 5 ′ side or the 3, side of the open single-stranded nucleic acid, It should be located at the 3 'end.
  • the present invention provides the above open single-stranded nucleic acid, one or more primers complementary to a part of one or two or more loop portions of the stem-loop structure, DNA,
  • the present invention relates to a kit for typing a gene polymorphism, which comprises a polymerase.
  • the kit can further include one or more primers having the same sequence as part of the loop portion of the stem loop structure. This kit makes it easier, faster and more accurate to type gene polymorphisms.
  • an open single-stranded nucleic acid can be closed to take a circular structure.
  • One or two or more primers complementary to a part of the loop portion of the stem-loop structure of a single-stranded nucleic acid with a circular structure can be used to amplify a closed circular single-stranded nucleic acid in a bowl shape and rolling circle type amplification. This is done to synthesize single-stranded DNA. In this way, it is possible to type SNPs that differ in terms of the ability to perform genetic polymorphism typing.
  • the single-stranded nucleic acid generated by amplification is used as a saddle-shaped target.
  • a single-stranded nucleic acid containing the sequence is synthesized, so that amplification efficiency is increased and detection sensitivity is increased.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a comparison between the conventional typing method and the present typing method.
  • FIG. 3 is a graph showing the Tem-W amplification results of Examples.
  • FIG. 4 is a graph showing the Tem-M amplification results of the examples.
  • the open single-stranded nucleic acid is closed and rolling circle type nucleic acid amplification is performed. Done.
  • the open circular single-stranded nucleic acid used in the present invention one satisfying the following conditions is used. (1) Since it has a sequence complementary to each other, it can take a stem-loop structure. (2) In the state having a stem-loop structure, the open single-stranded nucleic acid has one or more loop portions.
  • the open-ended part of the single-stranded nucleic acid is located at a position other than the stem part of the stem-loop structure, and (4) a sequence complementary to the polymorphic site of the allele 5 ′ or 3 ′ It is complementary to the sequence containing the polymorphic site in the region (5) including the ring opening at the end.
  • a single-molecule open circular single-stranded nucleic acid is composed of a single molecule or plural molecules of single-stranded nucleic acid.
  • an open single-stranded nucleic acid composed of a single molecule of single-stranded nucleic acid has a reverse repeat sequence in the strand and has one open portion.
  • An open single-stranded nucleic acid composed of two molecules of single-stranded nucleic acid has two open portions.
  • an open single-stranded nucleic acid with two open portions with a sequence complementary to the wild-type allele at the 5 'or 3' end of one of the two open portions and complementary to the mutant allele
  • An open single-stranded nucleic acid having a simple sequence at the 5 ′ or 3 ′ end of the remaining open portion can be used.
  • An open single-stranded nucleic acid has a sequence complementary to the polymorphic site of a specific allele at the 5 'or 3' end. Have. Therefore, when a specific allele is contained in a sample, the allele anneals without causing a mismatch in the loop portion of the open circular single-stranded nucleic acid. Only when annealed without causing a mismatch, the 5'-end and 3'-end basic forces S-ligation of the ring-opening part form a closed single-stranded ring structure.
  • Nucleic acid amplification does not occur in single-stranded nucleic acid in an open circle structure, but when a circular structure is formed by ligation, in the subsequent nucleic acid amplification step, extension occurs starting from the primer annealed to the loop part, A single-ring circular nucleic acid is used as a cage, and a single-ring circle nucleic acid amplification occurs. By examining the presence or absence of nucleic acid amplification, gene polymorphism is typed. The method of amplifying a ligated single-stranded circular nucleic acid with a stem-loop structure is called the SURCAS method (Super Rolling Circle Amplification System).
  • the genetic polymorphism typing method of the present invention will be described with reference to FIG. 1, taking the case of detecting SNP as an example.
  • the open circular single-stranded nucleic acid in FIG. 1 can take a structure called a dumbbell structure having one loop at each end of the double-stranded part.
  • This open single-stranded nucleic acid has an open part in one of two loop parts, and has a base complementary to the SNP site at the 3 ′ end.
  • This base at the 3 ′ end is a base complementary to the wild type allele and can be annealed without causing a nucleic acid force S mismatch to be typed at the loop portion.
  • a ligation occurs between the 5′-end base and the 3′-end base of the single-stranded nucleic acid, and the nuclei are closed to form a single-stranded circular nucleic acid.
  • the mixture is incubated with one or more primers having a sequence complementary to a part of the loop portion of the single-stranded nucleic acid.
  • a single-stranded circular nucleic acid that has been closed by ligation has a force that causes a rolling circle amplification from a primer annealed to the loop portion.
  • a rolling circle nucleic acid Amplification does not occur.
  • a nucleic acid can be extracted from a biological sample such as blood, tissue, organ, cultured cell, or neuropsy sample, and typing can be performed.
  • nucleic acids include genomic DNA, cDNA, and mitochondrial DNA.
  • genomic DNA from which leukocyte power has also been extracted can be used.
  • a sequence containing the target polymorphic site can be amplified in advance by PCR or the like before performing the typing method of the present invention.
  • a part of the loop part of the stem-loop structure of the single-stranded nucleic acid Samples can be incubated with primers having the same sequence as As a result, nucleic acid amplification occurs when a specific allele is included in the sample. However, amplification of the amplified nucleic acid in a cage shape occurs, so that the detection sensitivity of polymorphic typing increases.
  • Primers have the ability to use a primer having the same sequence as that of an arbitrary portion of a single-stranded nucleic acid.
  • a primer having the same sequence as the loop portion of the stem loop structure is preferable.
  • the number of bases of the primer is not particularly limited as long as it anneals to a single-stranded nucleic acid that is in a cage shape.
  • One or more types of primers that anneal to a single-stranded nucleic acid can be used, and multiple types of primers that respectively anneal to multiple sites of a single-stranded nucleic acid can be used.
  • the open-loop single-stranded nucleic acid is not limited to the dumbbell structure as shown in FIG. 1, but may have only one stem-loop structure or three or more stem-loop structures.
  • the ring-opening portion is other than the stem portion, it may be the loop portion of the stem loop structure or other than the stem loop structure.
  • a plurality of primers having the same sequence as a part of the loop portion may be used for each of the plurality of loops or for one or more of the plurality of loops. it can.
  • the DNA polymerase used in the gene polymorphism typing method according to the present invention may have any of room temperature, medium temperature, and heat resistance, as long as it has strand displacement activity (strand displacement ability). Can also be suitably used.
  • This DNA polymer The case may be a natural body or a mutant with artificial mutations. Furthermore, it is preferable that this DNA polymerase has substantially no 5 ⁇ 3 exonuclease activity.
  • An example of such a DNA polymerase is ⁇ 29 phage DNA polymerase.
  • Other examples include thermophilic Bacillus bacteria such as Bacillus stearothermophilus (hereinafter referred to as “B. stj”) and Bacillus caldotenax (hereinafter referred to as “B. ca”).
  • Examples thereof include mutants lacking 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity of DNA polymerase derived from DNA, E. coli) -derived DNA polymerase I talenau fragment, and the like.
  • Examples include turbo DNA polymerase, KOD DNA polymerase, 9oNm DNA polymerase, and Therminater DNA polymerase. Trehalose or the like can be added to make it more heat resistant, or Glycerol can be added to make the enzyme more stable.
  • RNA reverse transcriptase activity
  • Bca (exo ) DNA polymerase If the reverse transcriptase activity is weak, these enzymes have reverse transcriptase activity. It is desirable to use a combination of M—MuL V Reverse Transcriptase.
  • Any ligase can be used as the DNA ligase used in the present invention.
  • Ampligase Thermostable DNA ligase or T4 DNA ligaze can be used.
  • the reaction of the sample with an open-loop single-stranded nucleic acid the reaction of ligating the open-loop single-stranded nucleic acid when the target gene polymorphism is contained in the sample, and the temperature of a rolling-circular nucleic acid amplification reaction, Conditions such as time and buffer composition vary depending on the selected ligase, polymerase, the length of the nucleic acid sequence to be typed, etc., but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the ligation reaction can be carried out for 15 seconds at 94 ° C for 30 seconds and 37 ° C for 5 minutes, and for nucleic acid amplification at 25 to 35 ° C for 1.5 to 4 hours. Whether or not a specific allele is included!
  • nucleic acid amplification can be determined by whether or not the nucleic acid amplification was performed using a single-stranded circular nucleic acid as a cage.
  • the presence or absence of nucleic acid amplification is determined by methods known to those skilled in the art, for example, The detection can be carried out by electrophoresis or fluorescence.
  • the open-chain single-stranded structure is formed so that different single bases (SNP sites) to be detected are located in the loop portion that is formed when hybridizing between complementary sequences to form a dumbbell structure.
  • Designed detection probe In this embodiment, a base complementary to the SNP site is located at the 3 ′ end of the open-ended single-stranded nucleic acid that is a detection probe.
  • the 5 'end and 3' end of the detection probe are ligated and closed single-stranded to anneal the sample DNA in the detection probe loop without causing a mismatch.
  • An annular structure can be taken. If the sample has a variant base, when the sample DNA anneals to the loop part of the detection probe, a mismatch occurs at the position of the 3 'terminal base of the detection probe. I can't. Therefore, only when the sample has a wild-type base, the detection probe has a circular structure, and amplification occurs with the detection probe as a saddle type.
  • oligonucleotides to be detected having the following sequences Tem-W and Tem-M were synthesized by DNA synthesizer type 394 of ABI (Applied Biosystem Inc.).
  • This oligonucleotide is an amino acid-modified oligonucleotide so that no extension reaction occurs at the 3 ′ end.
  • the two oligonucleotides have different bases (shown in bold).
  • a 0.3 M solution of each oligonucleotide was prepared as a sample solution.
  • Loopl-W and Loopl-M are open single-stranded nucleic acids that serve as detection probes of the present invention.
  • Bold sequences are sequences that are complementary to each other and form a stem loop within the strand.
  • Loop 2-W and Loop 2-M were established.
  • Loop2 to W : Loop2—Mi is a conventional probe that does not have mutually complementary base sequences in the chain, that is, does not form a stem loop part (comparative example).
  • the shaded area is the area that hybridizes with the target sequence.
  • the underlined sequence indicates the priming region of the amplification reaction primer described below.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram comparing the detection with the probe of the present invention and the detection with the conventional probe.
  • Loop2-M 5- TTTATCCACGATCACGAGCCTAGCGtAGTAG3 ⁇ 4Tft3 ⁇ 4-3
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • Oligonucleotides having the following sequences were synthesized as amplification primers by the same method as in 2).
  • PGAL1 5-TACCTCTATACTTTAACGTC-3
  • An amplification reaction solution with the following composition was prepared, and 0.1 ⁇ 1 of the solution after the ligation reaction of 3) was added, and an amplification reaction was performed at 30 ° C. for 3 hours.
  • the amplification reaction was detected by STRATAGENE, Mx3000P.
  • FIG 3 shows the Tem-W amplification results
  • Figure 4 shows the Tem-M results.
  • Both Loopl type and Loop2 type are capable of detecting different single bases in the sample. Compared with Loop2, Loopl clearly has better amplification efficiency and shortens the detection time by 1 hour. I was able to.
  • Loopl-W or Loopl-M is used, the amplification product forms a stem loop as shown in Fig. 11, and the primer is easy to anneal. Therefore, amplification efficiency is better than that of conventional primers. it is conceivable that. From these results, it was shown that the method of the present invention is effective in detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) because it can specifically amplify sequences having different single nucleotides.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms

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Abstract

　一又は複数の一本鎖核酸からなる開環一本鎖核酸を準備するステップと、前記開環一本鎖核酸がステムループ構造を有する状態において、サンプルと前記開環一本鎖核酸をインキュベートするステップと、前記ステムループ構造の一つ又は二つ以上のループ部分の一部に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーを、前記インキュベート後のサンプルとさらにインキュベートするステップとを含む方法により、遺伝子多型をタイピングする。本発明の方法により、容易、迅速かつ正確なタイピングを行うことのできる遺伝子多型タイピング方法が提供される。

Description

明 細 書
遺伝子多型のタイピング方法
技術分野
[0001] 本発明は、 SNP (—塩基多型）のような遺伝子多型のタイピング方法に関する。より 詳しくは、本発明は、従来の方法と比較して、精度が高く迅速かつ特異性の高い、遺 伝子多型をタイピングすることができる方法を提供する。
背景技術
[0002] 遺伝情報を担う塩基配列は、個体間で多くの部位が異なって 、ることが知られて!/、 る。同一集団内において、ある遺伝子座におけるアレルが 2種以上存在する状態を 多型または変異と呼び、一般的には、ある塩基の変化が 1%以上の頻度で存在する 場合を多型、 1%未満の場合を変異と呼んでいる。
このような多型又は変異には、 1個の塩基の違いによる SNP (—塩基多型； Single Nucleotide Polymorphism)ゝ 1〜数十塩基が欠失や挿入されたもの、 2塩基か ら数十塩基を 1単位とする反復配列の反復数の相違 (VNTR又はマイクロサテライト 多型）などが知られている。
特に SNPは、多型マーカーとして、疾患に関係する遺伝子を探索するための有用 なツールとして役立つのみならず、特定の疾患に対する罹患可能性、薬剤に対する 応答性、薬剤に対する副作用の可能性について、非常に有用な情報を提供すること ができる。 SNP部位の塩基を判別、すなわち、 SNPのタイピングをより正確、容易、 迅速に行なうことが求められている。
[0003] SNPのタイピング法としては、 TaqManPCR法、インベーダー法、 MalDI— TOF ZMS法、 RCA法、 DNAチップ法等を挙げることができる。これらの方法によっても 、 1)検出に時間が掛かる、 2)検出の工程が煩雑である、 3)精度が低いなどの問題 があり、大規模なサンプルの SNPタイピングや、農作物の現場での検査など迅速性 、簡便性が求められるケースには実用化が難し力つた。
非特干文献 1 : Tsugunon Notomi et. al. (2000) : Loop- mediated isothermal amplificati on of DNA. Nucleic Acids Research, Vol.28, No.12: e63 非特許文献 2 : Kentaro Ngamine and Tesu Hase、 Tsugunori Notomi:Accelerated rea ction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and C ellular Probes Vol.16、 No.3、 223-229、 2002.
発明の開示
[0004] 今回の発明の目的は、比較的少量のゲノム DNAを用いて遺伝子多型、特に SNP 部位について、容易、迅速かつ正確なタイピングを行うことのできるタイピング方法を 提供することを目的とする。
[0005] 本発明者らは、上記目的達成のため、遺伝子多型の新規タイピング方法を開発し た。すなわち、本発明は、遺伝子多型のタイピング方法であって、（1)一又は複数の 一本鎖核酸からなる開環一本鎖核酸を準備するステップと、ここで、前記開環一本鎖 核酸は、互いに相補的な配列を持っためステムループ構造をとることができ、ステム ループ構造を有する状態において、前記開環一本鎖核酸は一つ又は二つ以上のル ープ部分を有し、前記ステムループ構造のステム部分以外の部位に前記一本鎖核 酸の開環部が位置し、アレルの前記多型部位に相補的な配列を 5 '又は 3 '末端にも ち、前記開環部を含めた領域において前記多型部位を含む配列に相補的であり、 ( 2)前記開環一本鎖核酸がステムループ構造を有する状態にぉ 、て、サンプルと前 記開環一本鎖核酸をインキュベートするステップと、 (3)前記ステムループ構造の一 つ又は二つ以上のループ部分の一部に相補的な 1種類又は 2種類以上のプライマ 一を、前記インキュベート後のサンプルとさらにインキュベートするステップとを含む遺 伝子多型のタイピング方法である。
[0006] 前記（3)のインキュベートステップにお 、て、ループ部分の一部に相補的な前記プ ライマーに加えて、さらにステムループ構造のループ部分の一部と同じ配列をもつ 1 種類又は 2種類以上のプライマーとインキュベートすることができる。これにより、一本 鎖核酸を铸型として増幅された核酸を、さらに铸型として増幅がおこるため、多型の タイピングの検出感度が上がる。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法では、さまざまな種類の多型をタイピングで き、 SNP (—塩基多型）のタイピングも可能である。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法では、アレルの前記多型部位における相補 的な配列が、開環一本鎖核酸の 5'側又は 3'側のいずれに位置してもよいが、 3 '末 端に位置するのが望ましい。
[0007] さらに本発明は、遺伝子多型をタイピングするための開環一本鎖核酸であって、互 いに相補的な配列を持っためステムループ構造をとることができ、ステムループ構造 を有する状態において、前記開環一本鎖核酸は一つ又は二つ以上のループ部分を 有し、前記ステムループ構造のステム部分以外の部位に前記一本鎖核酸の開環部 が位置し、アレルの前記多型部位に相補的な配列を 5'又は 3'末端にもち、前記開 環部を含めた領域において前記多型部位を含む配列に相補的であることを特徴とす る開環一本鎖核酸を提供する。
[0008] 本発明の開環一本鎖核酸は、さまざまな種類の多型のタイピングに使用することが でき、 SNP (—塩基多型）のタイピングも可能である。
本発明の開環一本鎖核酸は、アレルの前記多型部位における相補的な配列が、 開環一本鎖核酸の 5 '側又は 3，側の 、ずれに位置してもよ 、が、 3 '末端に位置する のが望ましい。
[0009] さらに、本発明は、上記開環一本鎖核酸と、前記ステムループ構造の一つ又は二 つ以上のループ部分の一部に相補的な 1種類又は 2種類以上のプライマーと、 DNA ポリメラーゼとを含む、遺伝子多型をタイピングするためのキットに関する。このキット には、ステムループ構造のループ部分の一部と同じ配列をもつ 1種類又は 2種類以 上のプライマーをさらに含ませることが可能である。このキットにより、より容易、迅速、 正確な遺伝子多型のタイピングを行なうことができる。
[0010] 本発明では、特定のアレルを含む場合にのみ、開環一本鎖核酸が閉環して、環状 構造をとることができる。環状構造をとつた一本鎖核酸のステムループ構造のループ 部分の一部に相補的な 1種類又は 2種類以上のプライマーにより、閉環した一本鎖 環状核酸を铸型にローリングサークル型の増幅が行なわれ、一本鎖 DNAが合成さ れる。これにより、遺伝子多型のタイピングを行なうことができる力 一塩基について 相違する SNPについてもタイピングが可能である。
特に、一本鎖核酸のループの一部と同じ配列を持つ 1種類又は 2種類以上の第二 のプライマーをさらに用いると、増幅されて生じた一本鎖核酸を铸型として、 目的とす る配列を含む一本鎖核酸が合成されるため、増幅効率が高まり、検出感度が上がる 図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は、本発明の一実施態様を示す模式図である。
[図 2]図 2は、従来のタイピング法と本願のタイピング法との比較を示す模式図である
[図 3]図 3は、実施例の Tem—Wの増幅結果を示すグラフである。
[図 4]図 4は、実施例の Tem - Mの増幅結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明では、特定のアレルが開環一本鎖核酸の開環部分にミスマッチすることなく アニーリングした場合のみ、開環一本鎖核酸が閉環して、ローリングサークル型の核 酸増幅が行なわれる。本発明で用いる開環一本鎖核酸には、次の条件を満たしたも のを用いる。（1)互いに相補的な配列を持っためステムループ構造をとることができ る、（2)ステムループ構造を有する状態において、前記開環一本鎖核酸は一つ又は 二つ以上のループ部分を有する、 (3)前記ステムループ構造のステム部分以外の部 位に前記一本鎖核酸の開環部が位置する、（4)アレルの前記多型部位に相補的な 配列を 5'又は 3'末端にもつ、（5)開環部を含めた領域において前記多型部位を含 む配列に相補的である。
一分子の開環一本鎖核酸は、一分子又は複数分子の一本鎖核酸から構成される 。例えば、一分子の一本鎖核酸から構成される開環一本鎖核酸は、鎖内で逆向き反 復配列を持ち、 1つの開環部をもつ。二分子の一本鎖核酸から構成される開環一本 鎖核酸は、 2つの開環部をもつ。例えば、サンプルが 2以上のアレルを含むかどうか（ 例えば、野生型アレルと変異型アレルをへテロで持つか否力）について判別するた めに、二分子の一本鎖核酸力 構成され、二つの開環部分を持つ開環一本鎖核酸 であって、野生型アレルに相補的な配列を 2つの開環部分のうち一つの 5'又は 3'末 端にもち、変異型アレルに相補的な配列を残りの開環部分の 5'又は 3'末端にもつ 開環一本鎖核酸を用いることができる。
[0013] 開環一本鎖核酸は、特定のアレルの多型部位に相補的な配列を 5'又は 3'末端に もつ。そのため、サンプルに特定のアレルが含まれる場合に、開環一本鎖核酸のル ープ部分に当該アレルがミスマッチを生じることなくアニーリングする。ミスマッチを生 じることなくアニーリングした場合に限り、開環部の 5'末端と 3'末端の塩基力 Sライゲー シヨンして閉環一本鎖環状構造が形成される。
開環構造の一本鎖核酸には、核酸の増幅が起こらないが、ライゲーシヨンにより環 状構造が形成されたときには、その後の核酸増幅ステップにおいて、ループ部分に アニーリングしたプライマーを起点に伸長が起こり、一本鎖環状核酸を铸型として口 一リングサークル型の核酸増幅が起こる。核酸の増幅の有無を調べることによって、 遺伝子多型がタイピングされる。ステムループ構造を持つライゲーシヨンされた一本 鎖環状核酸を増幅させる方法を、 SURCAS法（Super Rolling Circle Amplifi cation System)と呼ふ。
[0014] 本発明の遺伝子多型のタイピング方法を、 SNPを検出する場合を例にして、図 1を 元に説明する。図 1の開環一本鎖核酸は、二本鎖部分の両端にそれぞれ 1つずっル ープをもつダンベル構造と呼ばれる構造をとることができる。この開環一本鎖核酸は 、開環部を二つのループ部分のうちの一つにもち、 3'末端に SNP部位に相補的な 塩基を有する。この 3'末端の塩基は、野生型アレルに相補的な塩基であり、ループ 部分においてタイピング対象の核酸力 Sミスマッチを生じることなくアニーリングすること ができる。これにより、一本鎖核酸の 5'末端塩基と 3'末端塩基との間でライゲーショ ンを起こし、閉環して、一本鎖環状核酸が形成される。
一方、変異型アレルがループ部分にアニーリングした場合には、開環一本鎖核酸 の 3'末端の塩基と、 SNP部位との間でミスマッチが生じる。そのため、一本鎖核酸の 5'末端塩基と 3'末端塩基との間でライゲーシヨンは起きず、開環構造のままである。
[0015] その後、一本鎖核酸のループ部分の一部に相補的な配列を有する 1種又は 2種以 上のプライマーと共にインキュベートする。このとき、ライゲーシヨンにより、閉環構造と なった一本鎖環状核酸には、ループ部分にアニーリングしたプライマーからローリン グサークル型の増幅が起こる力 開環一本鎖核酸の場合には、ローリングサークル 型の核酸増幅が起こらない。核酸増幅の有無を調べることにより、野生型アレルと変 異型アレルとを判別できる。 [0016] 遺伝子多型のタイピングを行なうサンプルは、任意の核酸を対象とすることができる 。例えば、血液、組織、器官、培養細胞、ノィォプシ一試料等の生物学的試料由来 のものから核酸を抽出してタイピングを行なうことができる。また、核酸としては、例え ばゲノム DNA、 cDNA、ミトコンドリア DNAを例示できる。好ましくは、ヒトの場合、白 血球力も抽出されたゲノム DNAを用いることができる。 目的とする多型部位を含む配 列を、本発明のタイピング方法を行なう前に予め PCR等で増幅しておくこともできる。 一方、血液、組織、器官、培養細胞、バイオプシー試料等の生物学的試料から、核 酸を抽出することなく遺伝子多型のタイピングを行なうことも可能である。
[0017] 本発明の遺伝子多型のタイピング方法において、一本鎖核酸のループ部分の一 部に相補的な配列を有するプライマーのほかに、一本鎖核酸のステムループ構造の ループ部分の一部と同じ配列をもつプライマーと共に、サンプルをインキュベートす ることができる。これにより、特定のアレルがサンプル中に含まれていた場合に、核酸 の増幅が起こるが、この増幅された核酸を铸型にした増幅が起こるため、多型のタイ ビングの検出感度が上がる。プライマーは、一本鎖核酸の任意の個所と同じ配列を 持つものを使用できる力 増幅効率の点力 ステムループ構造のループ部分と同じ 配列を持つものが好ましい。プライマーの塩基数は、铸型となる一本鎖核酸にァニー リングする限り、特に限定されない。一本鎖核酸にアニーリングするプライマーは、 1 種類以上用いることができ、一本鎖核酸の複数の部位にそれぞれアニーリングする 複数種のプライマーを用いることができる。
なお、開環一本鎖核酸は、図 1に示すようなダンベル構造に限らず、ステムループ 構造を 1つだけ有するものや、 3つ以上のステムループ構造を有するものであっても よい。開環部は、ステム部分以外であれば、ステムループ構造のループ部分であつ ても、ステムループ構造以外にあってもよい。複数のステムループ構造を有する場合 には、複数のループのそれぞれ、又は、複数のループのうちの 1以上のループにつ いて、ループ部分の一部と同じ配列をもつ複数のプライマーを用いることができる。
[0018] 本発明による遺伝子多型のタイピング法において使用する DNAポリメラーゼは、鎖 置換 (strand displacement)活性 (鎖置換能）を有するものであればよぐ常温性、 中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、この DNAポリメラ ーゼは、天然体もしくは人工的に変異をカ卩えた変異体のいずれであってもよい。さら に、この DNAポリメラーゼは、実質的に 5，→3，ェキソヌクレアーゼ活性を有しないも のであることが好ましい。このような DNAポリメラーゼとしては、 Φ 29ファージ DNAポ リメラーゼを例示できる。また、他の例として、バチルス'ステア口サーモフィルス（Baci llus stearothermophilusゝ以下「B. stjという）、バチノレス ·カノレドテナックス（Bacil luscaldotenax,以下「B. ca」という）等の好熱性バチルス属細菌由来 DNAポリメラ ーゼの 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌 . coli)由来 DN Aポリメラーゼ Iのタレノウフラグメント等が挙げられる。さらには、 Vent DNAポリメラ ーゼ、 Vent (Exo— ) DNAポリメラーゼ、 Deep Vent DNAポリメラーゼ、 DeepVen t (Exo— ) DNAポリメラーゼ、 MS— 2ファージ DNAポリメラーゼ、 Z— Taq DNAポリ メラーゼ、 Pfu DNAポリメラーゼ、 Pfu turbo DNAポリメラーゼ、 KOD DNAポ リメラーゼ、 9oNm DNAポリメラーゼ、 Therminater DNAポリメラーゼなどが挙げ られる。より耐熱性にさせるためにトレハロースなどを添加したり、より酵素を安定化さ せるために Glycerolなどを添カ卩したりする事も可能である。さらに、 目的核酸が RNA の場合、逆転写酵素活性が強 、Bca (exo") DNAポリメラーゼを用いる事が好ま Uヽ 。逆転写酵素活性が弱い場合は、これらの酵素と逆転写酵素活性のある M— MuL V Reverse Transcriptase等を組み合わせて使用することが望ましい。
本発明において使用する DNAリガーゼは、任意のリガーゼを用いることができ、例 えば、 Ampligase Thermostable DNA ligaseや T4 DNA ligazeなどを用い ることがでさる。
サンプルと開環一本鎖核酸とを反応させて、 目的とする遺伝子多型がサンプルに 含まれる場合に開環一本鎖核酸をライゲーシヨンさせる反応、及びローリングサーク ル型の核酸増幅反応の温度、時間、緩衝液組成等の条件は、選択したリガーゼ、ポ リメラーゼ、タイピング対象の核酸配列の長さ等に応じて異なるが、当業者が適宜選 択することができる。例えば、ライゲーシヨン反応には、 94°C30秒、 37°C5分を 15サ イタルさせ、核酸増幅には 25〜35°Cで 1. 5〜4時間程度行なうことができる。特定の アレルが含まれて!/、たかどうかは、一本鎖環状核酸を铸型とした核酸増幅が行なわ れた力どうかで判断できる。核酸増幅の有無は、当業者に公知の方法、例えば、電 気泳動、蛍光による検出により行なうことができる。
[0020] 上記で本発明を一般的に説明したが、さらに下記では、本発明を実施例により具 体的に説明する。しかし、この実施例は説明することを目的とするものであり、本発明 の範囲をこれら実施例に限定することを意図するものではない。
実施例 1
[0021] 1)原理
サンプル中に含まれる SNPのタイピング実験を行った。図 1に示すように、相補的 な配列間でハイブリダィズしてダンベル構造を形成したときに生じるループ部分に、 検出したい異なる一塩基 (SNP部位)が位置するように、開環一本鎖構造をもつ検出 プローブをデザインした。この実施例では、検出プローブである開環一本鎖核酸の 3 '末端に SNP部位に相補的な塩基が位置して 、る。
サンプルが野生型の塩基をもつ場合には、検出プローブのループ部分にサンプル DNAがミスマッチを生じることなくアニーリングするために、検出プローブの 5 '末端と 3'末端とがライゲーシヨンして閉環一本鎖環状構造をとることができる。サンプルが変 異型の塩基を持つ場合には、検出プローブのループ部分にサンプル DNAがァニー リングするときに、検出プローブの 3'末端塩基の位置でミスマッチを生じるため、ライ ゲーシヨンして環状構造をとることができない。したがって、サンプルが野生型の塩基 をもつ場合のみ、検出プローブが環状構造となるため、検出プローブを铸型として増 幅が起こる。
[0022] 2)検出対象となる核酸の調整
下記の配列 Tem— Wおよび Tem— Mを持つ 2種類の検出対象となるオリゴヌタレ ォチドを、 ABI社 (Applied Biosystem Inc.)の DNAシンセサイザー 394型により 合成した。このオリゴヌクレオチドは、 3'末端に伸長反応が起こらないようにアミノ酸 修飾したオリゴヌクレオチドである。 2つのオリゴヌクレオチドは、一塩基異なる配列に なっている（太字で示す)。それぞれのオリゴヌクレオチドの 0. 3 M溶液を調整し、 サンプル溶液とした。
[0023] [化 1] Tem-W： 3 -GTCATGAATCCTGCAATTTC- 5
Tem-M： 3-GTCATGAATTCTGCAATTTC- 5
[0024] Loopl— W、 Loopl— Mは、本発明の検出プローブとなる開環一本鎖核酸である 。太字の配列は、互いに相補的であり、鎖内でステムループを形成する配列である。 また、本発明による Loop 1—Wおよび Loop 1 - Mの増幅効率と比較検討するため に、： Loop2— W、： Loop 2— Mを开成した。 Loop2~W,： Loop2— Miま、鎖内に互!ヽ に相補的な塩基配列を持たず、すなわち、ステムループ部を形成しない従来型のプ ローブである（比較例）。 Looplタイプ、 Loop2タイプにおいて、網掛けされた領域が 標的配列とハイブリダィゼーシヨンする領域である。下線部分の配列は、下記に記載 した増幅反応用プライマーのプライミング領域を示す。また、図 2に、本発明のプロ一 ブによる検出と従来用 、られて 、たプローブを用 、た場合の検出にっ 、て比較した 模式図を示す。
[0025] [化 2]
<本発明の検出シグナル増幅ループ配列 >
Loopl - W： 5 - iSAGGT A GTATAGAGGTAT C CGCATCGACGGCAT AT GCCATAGCAT T TTTATCCACGATCACCCGTCGATGCGA¾ ¾¾T¾G- 3
Loopl— M： 5-GAeGTTASAGTATAGAGGTATCCGCATCGACGGCATATGCCATAGCATT TTTATCCACGATCACCCGTCGATGCi|¾Gt¾TT¾A-3
[0026] [化 3] く従来の検出シグナル増幅ループ配列 >
Loop2-W : 5
TTTATCCACGATCACGAGCCTAGCGPAGTIGTTSG-3
Loop2-M : 5- TTTATCCACGATCACGAGCCTAGCGtAGTAG¾Tft¾-3
[0027] 3)プローブのライゲーシヨン
プローブとサンプル DNAのアニーリングおよびライゲーシヨンは、 Xiaoquen Qi et. a 1 (Nucleic Acid Research Vol. 29, el 16)の方法により行った。 [0028] [表 1]
< ligation mixture >
15 mM MgCl2
1. 5 mM nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)
2U of Ampligase Thermostable DNA ligasc (Epicentre Technologies)
0. 6 μΜ各プローブ
[0029] 5 μ 1の ligation mixtureを 2)で調整した各サンプル溶液 10 μ 1にカロえ、 94°C30秒、
37°C 5分のサイクルを 15回繰り返した。
[0030] 4)プライマーの調整
増幅反応用プライマーとして下記配列のオリゴヌクレオチドを 2)と同様の方法により 合成した。
[0031] [化 4]
PGAL1： 5-TACCTCTATACTTTAACGTC- 3
pBADF : 5-ATGCCATAGCATTTTTATCC-3
[0032] 5)ローリングサークル増幅反応
下記の組成で増幅反応液を調整し、 3)のライゲーシヨン反応後の溶液を 0. 1 μ 1カロ え、 30°Cで 3時間増幅反応を行った。増幅反応は STRATAGENE社、 Mx3000P により検出した。
[0033] [表 2] ぐ増幅試薬組成 >
Figure imgf000013_0001
Tem— Wの増幅結果を図 3に、 Tem— Mの結果を図 4に示す。 Looplタイプ、 Lo op2タイプのどちらも、サンプル中の異なる一塩基を検出することができる力 Loop2 と比較して、明らかに Looplの方が増幅の効率がよく、検出時間を 1時間短縮するこ とができた。 Loopl— W、 Loopl— Mを用いた場合には、増幅産物が図 11に示すよ うなステムループを形成するため、プライマーがアニーリングしやすいため、従来のプ ライマーと比較して増幅効率がよいものと考えられる。この結果から、本発明の方法 は、一塩基が異なる配列を特異的に増幅することができるため、一塩基多型 (SNP) の検出を行なう場合に効果的であることが示された。

Claims

請求の範囲 [1] 遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)一又は複数の一本鎖核酸力 なる開環一本鎖核酸を準備するステップと、ここで
、前記開環一本鎖核酸は、
互いに相補的な配列を持っためステムループ構造をとることができ、
ステムループ構造を有する状態において、前記開環一本鎖核酸は一つ又は二つ 以上のループ部分を有し、
前記ステムループ構造のステム部分以外の部位に前記一本鎖核酸の開環部が位 置し、
アレルの前記多型部位に相補的な配列を 5 '又は 3 '末端にもち、
前記開環部を含めた領域において前記多型部位を含む配列に相補的であり、
(2)前記開環一本鎖核酸がステムループ構造を有する状態にぉ 、て、サンプルと前 記開環一本鎖核酸をインキュベートするステップと、
(3)前記ステムループ構造の一つ又は二つ以上のループ部分の一部に相補的な 1 種類又は 2種類以上のプライマーを、前記インキュベート後のサンプルとさらにインキ ュペートするステップと
を含む遺伝子多型のタイピング方法。
[2] 前記（3)のインキュベートステップにお 、て、ループ部分の一部に相補的な前記プ ライマーに加えて、さらにステムループ構造のループ部分の一部と同じ配列をもつ 1 種類又は 2種類以上のプライマーとインキュベートすることを特徴とする請求項 1に記 載の方法。
[3] 遺伝子多型が、 SNP (一塩基多型)である請求項 1に記載の方法。
[4] アレルの前記多型部位における相補的な配列が 3'末端に位置する請求項 1〜3の いずれか 1項に記載の方法。
[5] 遺伝子多型をタイピングするための開環一本鎖核酸であって、
互いに相補的な配列を持っためステムループ構造をとることができ、
ステムループ構造を有する状態において、前記開環一本鎖核酸は一つ又は二つ 以上のループ部分を有し、 前記ステムループ構造のステム部分以外の部位に前記一本鎖核酸の開環部が位 置し
アレルの前記多型部位に相補的な配列を 5 '又は 3 '末端にもち、
前記開環部を含めた領域において前記多型部位を含む配列に相補的であることを 特徴とする開環一本鎖核酸。
[6] SNP (一塩基多型）をタイピングするための請求項 5に記載の開環一本鎖核酸。
[7] アレルの前記多型部位における相補的な配列力 3 '末端に位置する請求項 5又は
6に記載の開環一本鎖核酸。
[8] 請求項 5〜7のいずれか 1項に記載の開環一本鎖核酸と、前記ステムループ構造 の一つ又は二つ以上のループ部分の一部に相補的な 1種類又は 2種類以上のブラ イマ一と、 DNAポリメラーゼとを含む、遺伝子多型をタイピングするためのキット。
[9] ステムループ構造のループ部分の一部と同じ配列をもつ 1種類又は 2種類以上の プライマーをさらに含む請求項 8に記載のキット。
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