WO2005121181A1

WO2005121181A1 - Polyethyleneglycol-oligopeptides de type branchement d'arbre multipoint et leurs derives actifs et composes

Info

Publication number: WO2005121181A1
Application number: PCT/CN2005/000834
Authority: WO
Inventors: Shishan Ji; Dequan Zhu
Original assignee: Beijing Jenkem Technology Co., Ltd.
Priority date: 2004-06-11
Filing date: 2005-06-10
Publication date: 2005-12-22
Also published as: CN100475837C; CN1706865A

Description

多叉分支的聚乙二醇-氨基酸寡肽及其活性衍生物和药物结合物技术领域本发明涉及一种新型的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽、其活性衍生物、其与药物分子的结合物、包含该结合物的药物组合物、以及它们的制备办法、以及它们的生物医药用途、尤其是在制备药物中的用途。背景技术天然药物活性成分中的蛋白质、多肽、萜类、甾体、生物碱、黄酮、蒽醌、苯丙素酚类等在生理活性上都表现出各种有效的性能，在医药中得到了广泛的应用。它们的甙类、核苷类、多肽类衍生物也有相当的应用。作为天然活性成分，它们具有生物降解快，基本无残留，毒副作用小等优点。但同时也有相应的问题存在，例如生物利用率低、生理半衰期短、水溶性差、引发机体免疫等不利之处。为解决此问题，已广泛地使用聚乙二醇衍生物，使其与蛋白质、肽或其他治疗药物的结合，以延长药物的生理半衰期、降低其免疫原性和毒性。在临床使角中， PEG及其衍生物作为制作药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用，而将 PEG 键合到药物分子的尝试在最近十年里也得到了长足的发展，在许多批准药品中被广泛使用，如 PEG-intron®和 PEGasys®, α—干扰素与聚乙二醇的键合物就表现出了更长的循环半衰期和更好的治疗效果。紫杉醇与聚乙二醇的键合物也相应的降低了毒性和延长了生物活性。聚乙二醇在人体内的代谢过程已相当清楚，是一种安全的、无副作用的药物改性剂。在与药物结合时，常用到一种被称为聚乙二醇化（PEGylation) 的工艺，即聚乙二醇的端基被化学活化后具有一适当的官能团，此官能团对要结合的药物中的至少一个官能团具有活性，能与之形成稳定的键。有报道表明聚乙二醇可以用于和很多药物连接。第 5824701和 5840900号美国专利以及中国专利 CN1283643报道了此类衍生物和紫杉醇键合的前药，在该药物模型中聚乙二醇两端都只键合了一个紫杉醇分子。聚乙二醇为一种线性聚合物，通常仅在其端基位置修饰以用于键合药物分子。为了提高对药物分子的负载率，第 6153655号美国专利披露了一种链端分支聚乙二醇结构，该结构在聚乙二醇的南端通过氨基连接生成了两个功能基团。但是引进非生物的支链小分子引进了药物的不确定性。第 5977163和 6262107 号美国专利以及中国专利 CN1164533公开了一种聚谷氨酸支载的紫杉醇前药，此药物模型中紫杉醇沿聚谷氨酸骨架链随机的连接到谷氨酸的活性羧基上，较宽的聚合率分布以及对聚谷氨酸毒性的不可确知性限制了该发明的使用。在本实验室前期的工作中，一种线性聚乙二醇一氨基酸寡肽 (WO03/074586)被成功的合成以用于多种药物分子。因此，本发明的目的在于提供一个新型的、能够负载更多药物的聚乙二醇化合物，以及这种聚乙二醇化合物与药物分子形成的结合物。本发明的另一个目的在于提供这种新型聚乙二醇化合物在制备凝胶方面的应用。本发明提供的这种新型的聚乙二醇化合物为多叉分支的聚乙二醇化合物，它含有多于两个的端基。和已有的线性的 PEG相比，通过改造后能够负载更多的药物分子。基于此类多叉分支结构的聚乙二醇，本发明提供一种新型的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽和其活性衍生物，它将能够明显提高对药物分子的负载率。这种多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽活性衍生物还能在适当的条件下形成凝胶。发明内容本发明的一个方面是提供一种通式 I的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽及其活性衍生物化合物：

(I) 其中：

选自多羟基结构、多氨基结构或多羧基结构；

N是 3— 2000的一个整数；

m是 2— 12中的一个整数；

i是 3_30中的一个整数；

R₂是氨基酸的侧链基团，可以相同或不同；

X是连接基团，选自于但不限于： 0(CH₂)_kCO、 0(CH₂)kOCO、 0(CH₂)_kNHCO、 NR (CH₂)_kOCO、 NR(CH₂)_k HCO、 N (CH₂)_kCO组成的组的基团，且 k为 0—10的整数；

Y是选自由羟基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物活性基团组成的组。优选地，本发明提供一种通式 II的聚乙二醇一氨基酸寡肽:

(Π)

其中：

Ri是一个中心分子，含有多个端基活性基团，通过这些基团衍生出的线性聚乙二醇最终形成多叉分支的聚乙二醇， Ri可以是多羟基分子、多氨基分子、多羧基分子； n为任何整数，表征其聚合度，选自 3— 2000;

m是 2— 12中的一个整数；

i是 3— 30中的一个整数，表征分叉数；

R₂是相关氨基酸的侧链基团，可以相同，可以不同；

X是连接基团，连接多叉分支的聚乙二醇的端基与氨基酸寡肽的氨基，选自于但不限于： 0(CH₂)_kCO、 0(C¾)_kOCO、 0(CH₂)_kNHCO、 NR(CH₂)_kOCO、 NR(CH₂)_kNHCO、 NR(CH₂)_kCO, k为 0—10的整数。 ' 更优选地，提供一种通式 Ila和通式 lib的化合物:

Ri • OCH₂CH₂

(Ha)

(lib) 是一个中心分子，含有多个端基活性基团，通过这些基团衍生出的线性聚乙二醇最终形成多叉分支的聚乙二醇，可以是多羟基分子、多氨基分子、多羧基分子； n为任何整数，表征其聚合度，选自 3— 2000;

m是 2— 12中的一个整数；

j是 1一 4中的一个整数； .

i是 3— 30中的一个整数，表征分叉数；

R为选自于以下组中的基团： H、 C卜 ₁₂烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基、和取代

X是连接基团，连接多叉分支的聚乙二醇的端基与氨基酸寡肽的氨基，选自于但不限于： 0(C¾)_kCO、 0(C¾)_kOCO、 0(C¾)_kNHCO、 NR(CH₂)_kOCO、 NR(CH₂)_kNHCO NR(CH₂)_kCO, k为 0—10的整数。在本发明的实施方案中，所述的氨基酸为天然氮基酸和合成氨基酸，优选为谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、胱氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、酪氨酸或丝氨酸。在本发明的实施方案中，所述的中心分子为季戊四醇或甘油。通过季戊四醇衍生出的多叉分支的聚乙二醇为四叉分支的聚乙二醇，通过甘油衍生出的多叉分支的聚乙二醇为三叉分支的聚乙二醇。优选地，本发明提供一种通式 III的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽活性衍生物：

(ΠΙ)

其中:

是一个中心分子，含有多个活性基团，通过这些華团衍生出的线性聚乙二醇最终形成多叉分支的聚乙二醇，可以是多羟基分子、多氨基分子、多羧基分子；

n为任何整数，表征其聚合度，选自 3— 2000;

m是 2— 12中的一个整数；

i是 3— 30中的一个整数，表征分叉数；

是相关氨基酸的侧链基团，可以相同，可以不同；

X是连接基团，连接多叉分支的聚乙二醇的端基与氨基酸寡肽的氨基，选自于但不限于： 0(CH₂)_kCO、 0(CH₂)_kOCO、 0(CH₂)_kNHCO、 NR(CH₂)_kOCO、 NR(CH₂)_kNHCO、 NR(CH₂)_kCO， k为 0—10的整数；

z 是活性基团，选自于但不限于以下组中：酯基、碳酸酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物。在优选的实施方案中，所述的氨基酸为天然氨基酸和合成氨基酸，优选为谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、胱氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、酪胺酸或丝氨酸。在本发明的实施方案中，所述的 Ri为季戊四醇或甘油。通过季戊四醇衍生出的多叉分支的聚乙二醇为四叉分支的聚乙二醇，通过甘油衍生出的多叉分支的聚乙二醇为三叉分支的聚乙二醇。本发明的另一个方面是提供一种通式 IV的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽及其活性衍生物与药物分子的结合物-

P-{-TA ) ..

\ ¹ 11

(IV)

其中-

P是上述的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽或其活性衍生物；

ii是 1一 30中的一个整数；

TA为药物分子；

TA与 P通过一个易水解的键或者一个稳定的键相联接。上述多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽与药物分子的结合物中，氨基酸侧链基团 ¾同样可以参与连接药物分子 TA。优选地，所述的药物分子选自由氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、体及其甙类、生物碱组成的组，或者，选自由华蟾酥毒基、甘草次酸、黄杨宁、灯盏乙素和东莨菪内酯组成的组。优选地，所述药物分子是选自由紫杉醇（包括多烯紫杉醇和脱乙酰紫杉醇）、喜树碱（包括依立替康和拓扑替康）、依托泊苷、斑蝥胺、雷公藤甲素以及它们的衍生物组成的组的抗肿瘤剂。本发明的再一个方面是提供一种包含上述的结合物和药物学可接受的载体或赋形剂的药物组合物，所述的药物组合物为片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂的剂型。根据本发明'的结合物可改善药物吸收，延长作用时间，增强疗效，降低给药剂量及避免某些毒副作用。本发明的又一个方面是提供一种由上述的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽及其衍生物与通式 V的化合物 -(Ζι (V) 形成的凝胶，其中，

Ζι是活性基团，可以和基团 Y反应形成共价连接或者非共价键连接；

/是 2— 20中的一个整数；

R₃为一类含有多个 (2-20)ΖΓ活性基团的分子； R₃可以是一个聚合物或者小分子< 其中以共价键连接形成的凝胶可以下式表征:

+ R₃十;

^ 产物凝胶优选地，所述的选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉、聚氨基酸、它们的共聚物以及它们的衍生物；更优选地，所述的选自聚赖氨酸或聚谷氨酸，更进一步地，所述的 R₃选自赖氨酸寡肽或胱氨酸寡肽。本发明的再一个方面是提供所述的凝胶在生物医药中的用途，包括包含上述凝胶的手术阻粘连剂、外科手术密封材料或药物载体。本发明的凝胶可以用作药物载体，改善药物吸收，延长作用时间，增强疗效，降低给药剂量及避免某些毒副作用。具体实施方式聚乙二醇（PEG) , 其结构通式如下所示：

其中-

R为 H或 — ₁₂烷基，

n为任何整数，表征其聚合度。当 R为低级烷基时， R可以是含有 1一 6个碳原子的任何低级垸基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基或正己基。当 R为环烷基时， R优选为含 3 一 7个碳原子的环烷基，如环丙基、环丁基和环己基。优选的环烷基为环己基。其典型的化合物是甲氧基聚乙二醇（mPEG)。其他聚乙二醇类似物或聚乙二醇共聚物也可用于此发明应用，如聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉等。对聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，只要使形成结合物的聚乙二醇的分子量为 300〜60000道尔顿，这相当于 n为大约 6〜1300。更优选的是， n为 28、 112和 450，这分别相应于分子量为 1325、 5000和 20000。由于通常由其平均分子量而非自重复单元限定的起始？EG化合物的潜在不均一性，优选用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整数 n表示 PEG聚合物中的自重复单元。本发明中所用的多叉分支的聚乙二醇其结构通式如下所示-

R^OCHsCHz) ~ OH

其中是为一中心分子，含有多个端基基团，通过这些基团衍生出的线性聚乙二醇最终形成多叉分支的聚乙二醇， n为任何整数，表征其聚合度， i表征分叉数，是 3 一 30中的一个整数。

Ri可以是一个多羟基分子，与线性聚乙二醇通过醚键，酯键连接。在本发明的实施方案中，所述的为多羟基季戊四醇或甘油。通过季戊四醇衍生出的多叉分支的聚乙二醇为通过醚键连接的四叉分支的聚乙二醇，通过甘油衍生出的多叉分支的聚乙二醇为三叉分支的聚乙二醇。

Ri也可以是一个多氨基分子，与线性聚乙二醇通过氨键，酰胺键连接。

R 也可以是一个多羧基分子，与线性聚乙二醇通过酯键，酰胺键连接。在本发明的结合物中所用的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽将氨基酸寡肽、特别是谷氨酸寡肽结合到该聚合物的母体上，使该聚合物能够提供与药物分子的连接点，由此与蛋白质、多肽或者其他天然药物活性成分中的游离氨基、羟基等连接在一起。特别是对小分子的天然药物活性成分，可以在一个多叉分支的聚乙二醇一谷氨酸寡肽中连接更多个药物分子，以保证更高的药物负载率。与聚谷氨酸不同之处在于，谷氨酸寡肽在每条寡肽链中具有确定数目的活性羧基。因此，当结合药物如紫杉醇分子时，药物分子的负载率将很容易确认和重复。本发明的一个优点是除了保留有亲水性聚乙二醇或其衍生物通常的溶解性、非免疫原性和无毒等特征外，寡肽基团将提供对药物分子的负载点。氨基酸寡肽，其结构通式如下所示:

0

H+NH— CH—— C+OH

R I₂ ^m 其中- m为 2— 12中的一个整数，表征其聚合度；

是相关氨基酸的侧链基团。例如，对赖氨酸寡肽， R₂是 ~CH₂C¾CH₂NH_2; 对丝氨酸寡肽， R₂是 - CH₂OH; 对谷氨酸寡肽， R₂是一 CH₂CH₂COOH。寡肽中的氨基酸可以相同 (同多肽)，可以不同 (异多肽）。本发明中使用的氨基酸包括所有天然氨基酸和合成氨基酸。特别优选是谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸和丝氨酸。寡肽合成可参照通用的合成办法，使用保护氨基酸，在脱水^的作用下可得到很好产率的氨基酸聚合物。当然，如使用的寡肽为同多肽，不存在有结构顺序问题，因此可以采用更简便的办法制备，如混合酸酐法、活化酯法、 N—羧基内酸酐（NCA) 法等。以 N—羧基内酸酐（NCA) 法为例 -

,

该反应具有如下优点：反应速度快，合成周期短；合成结束后，所得到的氨基游离的肽可以不用分离而直接用于第二轮的肽合成。侧链可以较少保护，除 NCA的侧链需要保护以外，氨基组分只有赖氨酸和半胱氨酸必须保护。谷氨酸寡肽化合物可以通过本领域中的已知方法制备或者可以从商业来源得到。本发明的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽是通过由多叉分支的聚乙二醇和氨基酸寡肽反应行成的。在实际应用中，需要对多叉分支的聚乙二醇的端基部分予以活化，以保证其能够和寡肽的氨基或者羧基发生反应而将二者结合。针对需要实现的用途，可以釆用以下几种方法对端基官能团进行改性： a. 氨基化，氨基化后的亲水性聚合物，由反应活性较大的氨基取代了羟基，在与一个含羧酸基的分子进行反应形成键合物中尤其重要。 b. 羧基化，亲水性聚合物羧基化后，可提高其反应性，使之可以和另一含氨基或羟基的分子反应形成键合物。 c 其他如羧基酯、碳酸酯、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物等改性方式也可适当采用。这几种方法均可使亲水性聚合物和寡肽上的官能团以化学键的方式连接，以使二者的优良性能各自得到很好的发挥。在目前使用许多药物、尤其是天然药物成分中都含有氨基、羧基、羟基等官能团，它们在生物体内通常都与单糖、多糖、核苷、多聚核苷、磷酰基等成分结合，以形成在生物体中有活性的药理结构。因此，多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽可以通过相同的方式和这些药物分子结合，以替代生物有机分子，并克服药物分子在生物体内生理半衰期短的，药效持续时间短的缺陷。本发明的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽与药物分子的结合物可以下式表示：

P-(-TA ) ..

\ ¹ 11

其中：

P是多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽；

ii是 1一 30中的一个整数，表征聚乙二醇一氨基酸寡肽上的药物分子数；

TA为药物分子；

连接药物分子 TA的键可以是一个易水解的键 (如酯键)或者一个稳定的键。多叉分支的聚乙二醇一谷氨基酸寡肽与药物分子可例如通过反应形成酯键而结合在一起，该过程可简单地如下所示:

酯键是一个易水解的键，在生物体中可以降解而释放出活性成分。其他易水解的键包括：碳酸酯，碳酰胺键等。在本发明的结合物中可使用合适的药物分子构成其中的药物部分，其包括氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱等。在本发明的结合物中，药物分子部分优选是由天然植物中分离的药物活性成分，如华蟾酥毒基、甘草次酸、黄杨宁、灯盏乙素和东莨菪内酯。该药物分子部分特别优选是用于治疗肿瘤的天然药物成分，例如紫杉醇、喜树碱、依托泊苷、斑蝥胺、雷公藤甲素以及它们的衍生物等。其中，喜树碱的衍生物，包括依立替康和拓扑替康；紫杉醇的衍生物，包括多烯紫杉醇和脱乙酰紫杉醇（泰索第， ta_Xotere)。本发明的结合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物进行给药，可采用任何可接受的给药方式或用于类似的用途的试剂进行。因此，采用的给药方式可选择通过口、鼻内、非肠道、局部、透皮或直肠方式，其形式为固体、半固体、冻干粉或液体药剂形式给药，例如，片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂等，优选釆用适用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式。组合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分（一种或多种）的本发明的结合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。通常，根据所需给药方式，药学上可接受的组合物将包含约 1至约 99重量％的本发明结合物、以及 99至 1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约 5至 75重量 %的本发明结合物，其余为适宜的药用赋形剂。可采用液体形式给药的药物组合物例如可通过溶解、分散等手段将本发明的结合物 (约 0.5至约 20% )和选择性存在的药用辅剂溶解、分散于载体中，载体的实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。如果需要的话，本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、 _PH缓冲剂、抗氧化剂等，例如：柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。该类剂型的实际制备方法是本领域的技术人员公知的或者显而易见的，例,如可参见

Remington's Pharmaceutical Sciences, 第 18版， (Mack Publishing Compan^, Easton, Pennsylvania, 1990)。无论如何，按照本发明的技术，所使用的组合物将含有治疗有效量的本发明结合物，以用于治疗相应的疾病。本发明还提供一种以多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽在适当的条件下形成的凝胶。该凝胶通过多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽或其活性衍生物与其他分子（包括另一类的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽，聚乙二醇活性衍生物以及其他小分子）反应形成。凝胶可以是通过共价键或者非共价键连接形成。根据本发明，以共价键连接形成的凝胶可以下式表征：

其中- 是活性基团，可以和基团 z反应形成共价连接；

1是 2—20中的一个整数；

为一类含有多个 (2-20)ΖΓ活性基团的分子； R₃ 可以是一个聚合物或者小分子。下面结合实例描述本发明的结合物及其制备方法，它不限制本发明。本发明的实施方式并不局限于上述说明，在不背离本发明意图的基础上所进行的改迸和变化也应视为本发明的保护范围。实施例实施例 1

四叉分支聚乙二醇一谷氨酸二肽 (la)的制备

10克四叉分支聚乙二醇（分子量为 10000)和 2克1^， N'—二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶于 100毫升乙睛中，再加入 1毫升无水吡啶。反应混合物在氮气保护下室温搅拌过夜。多余溶剂通过旋转蒸发除去，产物真空干燥。固体产物加入 40毫升无水二氯甲垸中，不溶物通过过滤除去，有机相用醋酸钠缓冲溶液（0.1M， pH 5.5)洗涤一次。再用无水硫酸钠干燥，浓缩。产物用乙醚转移，过滤真空干燥。产率： 9.5 克 (95 %)。 HNMR (DMSO): 3.5 (br m, PEG中的氢)， 3.24 (s， 3个氢)， 4.45 (t, 2个氢)， 2.82 (s， 4个氢)。

0.6克谷氨酸二肽 (Glu-Glu)溶于 20毫升二甲基甲酰胺（DMF)，在溶液中添加 4 克上步反应制备的四叉分支聚乙二醇一琥珀酰亚胺基碳酸酯（分子量为 10000)。溶液室温下搅拌 6小时，过滤除去浑浊物。残余物用 100毫升异丙醇沉淀，过滤，产物真空干燥。产物可通过离子交换色谱纯化。得到四叉分支聚乙二醇一谷氨酸二肽 (la)。产率： 2.5克。 HNMR (DMSO): 3.5 (br m, PEG中的氢)， 4.41 (t, 2个氢)， 2.37 (s, 2个氢)， 2.32 (t, 2个氢)。实施例 2

三叉分支聚乙二醇一谷氨酸二肽 (lb)的制备

10克三叉分支聚乙二醇（分子量为 15000)和 1克 Ν,Ν'—二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶于 100毫升乙腈中，再加入 0.8毫升无水吡啶。反应混合物在氮气保护下室温搅拌过夜。多余溶剂通过旋转蒸发除去，产物真空干燥。固体产物加入 40毫升无水二氯甲烷中，不溶物通过过滤除去，有机相用醋酸钠缓冲溶液（0.1M, ρΗ 5.5)洗涤一次。再用无水硫酸钠干燥，浓缩。产物用乙醚转移，过滤真空干燥。产率： 9.5 克 (95 %)。 HNMR (DMSO): 3.5 (br m, PEG中的氢)， 3.24 (s, 3个氢)， 4.45 (t, 2个氢)， 2.82 (s, 4个氢)。

0.4克谷氨酸二肽（Glu-Glu)溶于 20毫升二甲基甲酰胺（DMF)，在溶液中添加 4 克上步反应制备的三叉分支聚乙二醇一琥珀酰亚胺基碳酸酯（分子量为 10000)。溶液室温下搅拌 6小时，过滤除去浑浊物。残余物用 100毫升异丙醇沉淀，过滤，产物真空千燥。产物可通过离子交换色谱纯化。得到三叉分支聚乙二醇一谷氨酸二肽 (lb)。产率- 2.5克。 HNMR (DMSO): 3.5 (br m, PEG中的氢)， 4.41 (t， 2个氢)， 2.37 (s, 2个氢)， 2.32 (t， 2个氢)。实施例 3

四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽 (2a)的制备

(2)

0.3克甘氨酸二肽（Glu-Glu)溶于 20毫升二甲基甲酰胺（DMF)，在溶液中添加 3 克实施例 1制备的四叉分支聚乙二醇一琥珀酰亚胺基碳酸酯（分子量为 10000)。溶液室温下搅拌 6小时，过滤除去浑浊物。残余物用 100毫升异丙醇沉淀，过滤，产物真空千燥。产物可通过离子交换色谱纯化。得到四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽 (2a)。产率： 2.5克。 HNMR (DMSO): 3.5 (br m, PEG中的氢)， 4.54 (t， 2个氢)， 4.91 (s， 2个氣)。实施例 4

三叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽 (2b)的制备

0.2克甘氨酸二肽（Ghi-Glu)溶于 20毫升二甲基甲酰胺（DMF), 在溶液中添加 3 克实施例 2制备的三叉分支聚乙二醇一琥珀酰亚胺基碳酸酯（分子量为 15000)。溶液室温下搅拌 6小时，过滤除去浑浊物。残余物用 100毫升异丙醇沉淀，过滤，产物真空干燥。产物可通过离子交换色谱纯化。得到三叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽 (2b)。产率： 2.5克。 HNMR (DMSO)_: 3.5 (br m, PEG中的氢)， 4.54 (t， 2个氢)， 4.91 (s， 2个氢)。

实施例 5

四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽与紫杉醇的结合物的制备

1.35克由实施例 3制得的四叉分支聚乙二醇 -甘氨酸二肽（分子量为 10000)、 0.5克紫杉醇、 0.1克 4-二甲基氨基吡啶（DMAP)溶于 15毫升无水二氯甲垸中，再添加 0.2 克二环己基碳二亚胺（DCC)。溶液在氮气保护下，室温过夜搅拌反应。多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加 8毫升 1， 4-二氧六环溶解。过滤除去沉淀，溶液浓缩，残佘物添加 30毫升异丙醇（IPA)，过滤，产物真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽-紫杉醇酯 (3)。产率： 1.3克。熔点： 59_62Ό。实施例 6

四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽和喜树碱衍生物的结合物的制备

0.7克喜树碱（Camptothecin)和 ' 0.5克 N-叔丁氧羰基甘氨酸（BOC-gly), 溶解在 10毫升无水二氯甲垸中，加入 0.62克二环己基碳二亚胺（DCC)和 0.36克 4-二甲基氨基吡啶（DMAP), 室温下搅拌过夜。过滤除去反应产生的固体，减压浓缩溶液，加入 50毫升乙醚。过滤收集沉淀真空干燥。

0.5克喜树碱 N-叔丁氧羰基甘氨酸酯（由上步制得）溶解在 10毫升氯仿中，添加 10毫升三氟乙酸，室温下搅拌 5小时。减压浓缩溶液，加入 50毫升乙醚。过滤，收集沉淀，真空干燥，制得喜树碱衍生物。

0.5克由实施例 1制得的四叉分支聚乙二醇谷氨酸二肽（分子量为 10000)、 0.3克喜树碱衍生物（由上一步制备）、 32毫克的 4-二甲基氨基吡啶（DMAP)溶于 30毫升无水二氯甲烷中，再添加 0.2克二环己基碳二亚胺（DCC)。溶液在氮气保护下，室温过夜搅拌反应。多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加 50毫升异丙醇（IPA)，过滤，产物真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇 -谷氨酸二肽 -甘氨酸-喜树碱酯 (4)。产率： 0.5 克。熔点： 60—63。C。实施例 7

四叉分支聚乙二醇 -谷氨酸二肽和华蟾酥毒基 (Cinobufagin)结合物的制备

0.5克四叉分支聚乙二醇谷氨酸二肽（由实施例 1制得，分子量为 10000) 溶解在 10毫升二氯甲垸中。添加 300毫克华蟾酥毒基， 32毫克 4-二甲基氨基吡啶（DMAP) 和 200毫克二环己基碳工亚胺（DCC)。溶液在氮气保护下，室温过夜搅拌反应。多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加 20毫升 1， 4-二氧六环溶解。过滤除去沉淀，溶液浓缩, 残余物添加 100毫升异丙醇（IPA)，过滤，产物真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽-华蟾酥毒基酯 (5)。产率： 0.5克。熔点： 58— 60Ό。实施例 8

四叉分支聚乙二醇 -谷氨酸二肽和东莨菪内酯 (Scopoletin)结合物的制备

1克四叉分支聚乙二醇谷氨酸二肽（由实施例 1制得，分子量为 10000)溶在 25毫升二氯甲烷中，再加入 0.30克的东莨菪内酯， 0.1克的 4-二甲基氨基吡啶（DMAP)和 0.4克的二环己基碳二亚胺 (DCC)。此溶液在室温下氮气保护搅拌 12小时。溶液减压蒸除，残余物添加 100毫升异丙醇（IPA)。过滤收集沉淀再用乙醚洗漆后抽干。合并沉淀物，真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇 -谷氨酸二肽 -东莨菪内酯 (6)。产率： 1克。熔点： 58—61。C。实施例 9

四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽活性衍生物的制备

(7)

2克四叉分支聚乙二醇 -甘氨酸寡肽（分子量为 10000，由实施例 3制备），溶在 25 毫升二氯甲垸中，再加入 90毫克的 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS) 和 0.2毫克的二环己基碳二亚胺 (DCC)。此溶液在室温下氮气保护搅拌 12小时。溶液减压蒸除，残余物添加 100毫升异丙醇（IPA)。过滤收集沉淀，再用乙醚洗涤后抽干。真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽一 N-羟基琥珀酰亚胺酯 (7)。产率： 1,8克。熔点： 55— 57°C。

实施例 10

四叉分支聚乙二醇一赖氨酸四

0

+ Ri -{-OCHj C~)~0H

、 ^z ' Λ

0.3克 N-9-芴甲氧羰基 -赖氨酸四肽（Fmoc-Lys-Fmoc-Lys-Fmoc-Lys-Fmoc-Lys)溶于 20毫升二甲基甲酰胺（DMF)，在溶液中添加 3克四叉分支聚乙二醇一二琥珀酰亚胺基碳酸酯（分子量为 10000，由实施例 1制备）。溶液室温下搅拌 6小时，过滤除去浑浊物。溶液用 100毫升异丙醇，沉淀，过滤。滤液添加 100毫升乙醚沉淀。合并沉淀物，溶解在 20毫升氯仿中，添加 5毫升哌啶，室温下搅拌 3小时。减压浓缩溶液，加入 50毫升异丙醇。过滤，收集沉淀，产物真空干燥。得到四叉分支聚乙二醇一赖氨酸四肽 (8)。产率： 2.0克。熔点： 55— 57。C。实施例 11

由四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽活性衍生物和聚乙二醇二胺制备凝胶

200毫克四叉分支聚乙二醇-甘氨酸寡肽活性衍生物（分子量为 10000，由实施例 9 制备），溶解在 2毫升的乙酸盐缓冲溶液（10 mM， pH 5.0)中，加入 2毫升磷酸盐缓冲溶液（0.1M， ρΗ 7.4)，其中含 200亳克聚乙二醇二胺（分子量为 5000)，溶液轻轻震摇直至形成凝胶。实施例 12

由四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽活性衍生物和小分子胺（赖氨酸二肽）制备凝胶

凝胶

200毫克四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽活性衍生物（分子量为 10000，由实施例 9 制备），溶解在 1毫升的乙酸盐缓冲溶液（10 mM， pH 5.0) 中，加入 1毫升磷酸盐缓冲溶液（0.1M, pH 7.4), 其中含 20毫克赖氨酸二肽，溶液轻轻震摇直至形成凝胶。实施例 13

由四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽活性衍生物和另一四叉分支聚乙二醇一赖氨酸四肽制备凝胶

200毫克四叉分支聚乙二醇-甘氨酸二肽活性衍生物（分子量为 10000，由实施例 9 制备），溶解在 2毫升的乙酸盐缓冲溶液（10 mM， pH 5.0) 中，加入 2毫升磷酸盐缓冲溶液（0.1M， ρΗ 7.4)，其中含 100毫克四叉分支聚乙二醇 -赖氨酸四肽（分子量为 10000，由实施例 10制备），溶液轻轻震摇直至形成凝胶。实施例 14

由四叉分支聚乙二醇一赖氨酸四肽和聚谷氨酸制备凝胶

凝胶

200毫克四叉分支聚乙二醇 -赖氨酸四肽（分子量为 10000，由实施例 10制备），溶解在 1毫升的磷酸盐缓冲溶液（0.1M, pH 7.4)中，加入 1毫升磷酸盐缓冲溶液（0.1M, pH 7.4)，其中含 50毫克聚谷氨酸（分子量为 10000)，溶液轻轻震摇直至形成凝胶。

实施例 15

药物组合物本实施例说明代表性非胃肠道给药的药物组合物的制备过程，所述组合物包含本发明的结合物。

成分

实施例 5的结合物 2克

0.9%盐水溶液至 100毫升将实施例 5的结合物溶解于 0.9%盐水溶液，得到 100毫升的静脉注射用溶液，将其通过 0.2μηι的膜过滤材料过滤，在无菌条件下包装。

Claims

权利要求

1、通式 I的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽及其活性衍生物化合物：

-OCH₂CH

(I)

其中:

选自多羟基结构、多氨基结构或多羧基结构；

N是 3— 2000的一个整数；

m是 2— 12中的一个整数；

i是 3—30中的一个整数；

是氨基酸的侧链基团，可以相同或不同；

X是连接基团，选自由 0(CH₂)_kCO、 0(CH₂)_kOCO、 0(CH₂)_kNHCO、 NR (C¾)_kOCO、 NR(C¾)_kNHCO、 NR(CH₂)_kCO组成的组的基团，且 k为 0—10的整数；

Y是选自由羟基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物活性基团组成的组。

2、如权利要求 1所述的化合物，所述的化合物为通式 II的聚乙二醇一氨基酸寡肽：

OH

(Π)

3、如权利要求 2所述的化合物，其中，所述的化合物为通式 Ila的化合物:

-OCH₂CH₂

OH

(Ha) 其中， R为选自由11、 C^ ₁₂浣基、取代芳基、芳垸基、杂烷基、和取代烷基组成的组的基团。

4、如权利要求 2所述的化合物，其中，所述的化合物为通式 lib的化合物：

(lib) 其中， R为选自由 ₁₂垸基、取代芳基、芳烷基、杂垸基、和取代垸基组成的组的基团。

5、如权利要求 1所述的化合物，其中，所述的氨基酸为天然氨基酸和合成氨基酸。

6、如权利要求 5所述的化合物，其中，所述的氨基酸为谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、胱氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、酪氨酸或丝氨酸。

7、如权利要求 1所述的化合物，其中，所述的为季戊四醇、甲基葡萄糖甙、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油或聚甘油结构。

8、如权利要求 2所述的化合物，其中，所述的聚乙二醇一氨基酸寡肽为

四叉分支聚乙二醇 -谷氨酸二肽 (la);

三叉分支聚乙二醇 -谷氨酸二肽 (lb)

四叉分支聚乙二醇 -甘氨酸二肽 (2a)

三叉分支聚乙二醇 -甘氨酸二肽 (2b)

四叉分支聚乙二醇 -赖氨酸四肽 (8)。

9、如权利要求 1所述的化合物，其中，所述的化合物为通式 III的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽活性衍生物：

(ΠΙ) 其中：

z是选自由酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物活性基团组成的组。

10、如权利要求 9所述的化合物，其中，所述的 Z为 N-羟基琥珀酰亚胺酯基。 .

11、如权利要求 9所述的化合物，其中，所述的氨基酸为天然氨基酸和合成氨基酸。

12、如权利要求 9所述的化合物，其中，所述的氨基酸为谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、胱氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、酪胺酸或丝氨酸。

13、如权利要求 9所述的化合物，其中，所述的 Ri为季戊四醇、甲基葡萄糖甙、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油或聚甘油结构

14、如权利要求 9所述的化合物，其中，所述的衍生物为四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽一 N-羟基琥珀酰亚胺酯 (7)。

15、通式 IV的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽及其活性衍生物与药物分子的结合物-

Ρ-{-ΤΑ) ..

\ ' 11

(IV)

其中：

Ρ是如权利要求 1-13之一的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽或其活性衍生物； ii是 1一 30中的一个整数；

TA为药物分子；

TA与 P通过一个易水解的键或者一个稳定的键相联接。

16、如权利要求 15所述的结合物，其中，所述的药物分子选自由氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、 ·苯丙素酚类、体及其甙类、生物碱组成的组。

17、如权利要求 15所述的结合物，其中，所述的药物分子选自由华蟾酥毒基、甘草次酸、黄杨宁、灯盏乙素和东莨菪内酯组成的组。

18、如权利要求 15所述的结合物，其中，所述药物分子是选自由紫杉醇、喜树碱、依托泊苷、斑蝥胺、雷公藤甲素以及它们的衍生物组成的组的抗肿瘤剂。

19、如权利要求 18所述的结合物，其中，所述的喜树碱衍生物选自依立替康和拓扑替康。

20、如权利要求 18所述的结合物，其中，所述的紫杉醇的衍生物选自多烯紫杉醇和脱乙酰紫杉醇。

21、如权利要求 14所述的结合物，其中，所述的结合物为：

四叉分支聚乙二醇一甘氨酸二肽-紫杉醇酯 (3)；

四叉分支聚乙二醇 -谷氨酸二肽 -甘氨酸-喜树碱酯 (4);

四叉分支聚乙二醇-谷氨酸二肽-华蟾酥毒基酯 (5); 或

四叉分支聚乙二醇 -谷氨酸二肽 -东莨菪内酯 (6)。

22、包含如权利要求 14-21之任一项所述的结合物以及药物学可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

23、如权利要求 22所述的组合物，所述的药物组合物为片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂的剂型。

24、一种由如权利要求 1-14之一的多叉分支的聚乙二醇一氨基酸寡肽及其衍生物与通式 V的化合物

形成的凝胶，其中，

是活性基团，可以和基团 Y或 Z反应形成共价连接或者非共价键连接； /是 2— 20中的一个整数；

活性基团的分子； R₃ 可以是一个聚合物或者小分子。

25、如权利要求 24所述的凝胶，其中，所述的选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉、聚氨基酸、它们的共聚物以及它们的衍生物。

26、如权利要求 24所述的凝胶，其中，所述的 R₃选自聚赖氨酸或聚谷氨酸。

27、如权利要求 24所述的凝胶，其中，所述的 R₃选自赖氨酸寡肽或胱氨酸寡肽。

28、包含如权利要求 24-27之一所述凝胶的手术阻粘连剂、外科手术密封材料或药物载体。