WO2005115364A1

WO2005115364A1 - 抗腫瘍剤

Info

Publication number: WO2005115364A1
Application number: PCT/JP2005/009895
Authority: WO
Inventors: Takashi Kawai; Shigetoshi Mizutani; Tatsuji Enoki; Hiroaki Sagawa; Takeshi Sakai; Kazuo Shimanaka; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2004-05-31
Filing date: 2005-05-30
Publication date: 2005-12-08
Also published as: KR20070055429A; JPWO2005115364A1; EP1754473A4; US20080038289A1; EP1754473A1

Abstract

　本発明により、安価な食用担子菌に含まれる化合物若しくは食用担子菌由来の組成物を含有する、経口でも効果を有する抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤、及び当該化合物若しくは組成物を含有する抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品を得ることができる。よって、本発明は特に医薬や健康食品分野において特に有用である。

Description

明細書

抗腫瘍剤

技術分野

[0001] 本発明は、きのこ由来の生理活性成分を有効成分とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤、及びそれを含有する食品に関するものである。

背景技術

[0002] シィタケ、マイタケ、エノキタケ等の種々の食用担子菌が抗腫瘍性を有することは広く知られており、これらの子実体又は菌糸体よりこれまでに様々な抗腫瘍性組成物が調製されてきた。また、食用担子菌の一つであるブナシメジが抗腫瘍性を有することも明らかにされてきており、例えば蛋白質含量 3〜20%、糖含量 20〜50%を有する子実体熱水抽出物、及びその精製多糖体が（例えば、特許文献 1)、さらには水又は親水性溶媒に懸濁後、加熱処理により得られる分子量 6, 000〜60, 000の生理活性物質 EEM— Sが抗腫瘍活性を有することが明らかにされている (例えば、特許文献 2)。

[0003] 悪性腫瘍が形成され増殖すると血管新生が誘導されることが知られている。血管新生が誘導されると、腫瘍に栄養が運ばれるようになり急速に腫瘍細胞が増殖して悪性ィ匕したり、血管に腫瘍細胞が侵入して種々の組織に移動し、転移が起こりやすくなる。すなわち、血管新生を抑制すれば腫瘍細胞の増殖、悪性化や転移を抑制できると考えられる。このような発想から医薬品の開発も進められてきたが、いまだ商品化されたものはない。

[0004] 一方、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する物質につ!ヽての報告は、数多く存在する。し力しながら、アポトーシス誘発物質は、増殖能力が高い新生血管の内皮細胞もタ一ゲットになり得る。このような観点力も開発された腫瘍を抑制する物質の報告もある (例えば、非特許文献 2)。このような物質は、腫瘍細胞そのものに対してはアポトーシスを起こすような作用は弱いが、腫瘍細胞が誘導する血管新生を抑制して、いわゆる兵糧攻めにする効果を有することから、副作用も少な!/、ことが想定される。

[0005] きのこ由来の成分でも血管新生を抑制する作用があることが報告されている。たとえば、姫マツタケ（Agaricus blazei Murill)由来のエルゴステロールである（非特許文献 3)。

[0006] テルペンィ匕合物 (テルぺノイド）は、多くの植物に存在する有機化合物であり、炭素数が 5の倍数で、 n個のイソプレンあるいはイソペンタン力構成される前駆物質に由来する。 n= 2のものは、モノテルペン、 n= 3はセスキテルペン、 n=4はジテルペン、 n= 5はセスタテルペン、 n= 6はトリテルペン、 n= 8はテトラテルペン、それ以上はポリテルペンと称される。テルペンィ匕合物にはアポトーシスを誘発する作用も知られており、たとえば、トリテルペンのアポトーシス誘発作用の報告など、数多く存在する。

[0007] ブナシメジ由来の生理活性成分としては、 SBSという物質が血小板凝集抑制作用および抗発ガンプロモーター作用を有していることが知られている（特許文献 3)。また、ブナシメジには苦味成分である種々のポリテルペンが含まれていることが知られている（例えば、非特許文献 1)。

[0008] 特許文献 1 :特開平 5— 306233号

特許文献 2 :国際公開第 01Z51070号パンフレット

特許文献 3 :特開平 4- 104795号

非特許文献 1： Sawabe A.他 3名， Journal of Mass Spectrometry, 1996年 , Vol. 31, P921 - 925

非特許文献 2 : Schwarz R. E. 他 1名， J. Surg. Res. , 2004年， vol. 120, No . 1, P64- 72

非特許文献 3 :Takaku T. 他 2名， Nutr. , 2001年， vol. 131, No. 5, P140 9- 1413

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 各種食用担子菌の子実体が抗腫瘍性を有することは明らかとなっているが、効果を得るためには一定量を日常的に食すことが必要である。しかしながら、食用担子菌といえども味に癖があり、料理に工夫をしても日常的に一定量食すことは難しい。一方、ある種の担子菌から得られる抗腫瘍性、免疫賦活活性等を有する有効成分を配合した健康食品が広く市場に流通しているが、原料の担子菌が希少のため、生産される健康食品も非常に高価なものとならざるを得ない。

本発明の課題は、安価な食用担子菌由来の抗腫瘍活性を有する化合物を利用した、経口でも効果を示す医薬又は食品を提供することである。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、ブナシメジの子実体由来のポリテルペンが抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性および血管新生抑制活性を有することを見出し、本発明を完成した。

[0011] すなわち本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は、下記一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1つを有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤に関する。

[0012] [化 1]

[0013] (式中、 mは 1〜9の整数、 nは 1〜7の整数を示す。ただし、 m+n= 5〜： L 1である。また Rは水素原子又は水酸基を示す。 )

[0014] 本発明の第 2の発明は、一般式（1)で表される化合物が下記式 (2)〜（11)で表される少なくとも 1つの化合物である第 1の発明の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤に関する。

[0015] [化 2]

[0016] [化 3] [8^ ] [Ϊ200]

[0200]

剛 [ ΐΟΟ]

S68600/S00Zdf/X3d ャ l79CSll/S00Z OAV

[0025] 本発明の第 3の発明は、一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩力なる群より選択される少なくとも 1つを含有することを特徴とする抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品に関する。

[0026] 本発明の第 4の発明は、一般式（1)で表される化合物が式 (2)〜（11)で表される少なくとも 1つの化合物である第 3の発明の食品に関する。

[0027] 本発明の第 5の発明は、式 (2)〜（11)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩力なる群より選択される少なくとも 1つを含有するブナシメジ由来組成物を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤に関する。

[0028] 本発明の第 6の発明は、ブナシメジ由来組成物が、ブナシメジの酢酸ェチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られる組成物であることを特徴とする第 5の発明の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤に関する。

[0029] 本発明の第 7の発明は、式 (2)〜（11)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩力なる群より選択される少なくとも 1つを含有するブナシメジ由来組成物を含有することを特徴とする抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品に関する。

[0030] 本発明の第 8の発明は、ブナシメジ由来組成物が、ブナシメジの酢酸ェチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られる組成物であることを特徴とする第 7の発明の食品に関する。

[0031] 本発明の第 9の発明は、式 (2)〜（11)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩力なる群より選択される少なくとも 1つを含有するブナシメジ由来組成物であって、ブナシメジの酢酸ェチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られるブナシメジ由来組成物に関する。

[0032] 本発明の第 10の発明は、抗腫瘍作用、アポトーシス誘発作用又は血管新生抑制作用を必要とする疾患を有する被験体に、有効量の上記一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1つを投与することを含む、該疾患の治療方法に関する。

[0033] 本発明の第 11の発明は、抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤の製造のための、上記一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩力なる群より選択される少なくとも 1つの使用に関する。

発明の効果

[0034] 本発明により、安価な食用担子菌に含まれる化合物若しくは食用担子菌由来の組成物を含有する、経口でも効果を有する抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤、及び当該化合物若しくは組成物を含有する抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品を得ることができる。図面の簡単な説明

[0035] [図 l]HL—60細胞を FCS無添加 RPMI—1640培地で 37°C、 6時間培養した際のアセトン溶出画分のアポトーシス誘発作用を示す図である。図中、 Vehicleは 1%ェタノール水溶液を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0036] ブナシメジは自然界にお!/、ては秋期に種々の広葉樹の枯れ木に叢生ある!、は離生しており、他のきのこと比較して形や歯切れのよい肉質のため、美味なきのことして採食されてきた。また、近年ではォガタズに米糠やその他の栄養源を配合した培養基を用いて、ビン又は箱で栽培を行う菌床人工栽培法が確立され、季節に関係なく一年を通じて安定してきのこを収穫できるようになつている。すなわち、本発明の有効成分の原料となるブナシメジは安価に入手でき、医薬や健康食品原料としても適している。

[0037] 原料として使用されるブナシメジは天然のものでも人工栽培品でもよいが、好適には Lyophyllum ulmarium M— 8171 (FERM BP— 1415、寄託日： 1986年 8 月 23日）、又は Lyophyllum ulmarium K— 0259 (FERM P— 12981、寄託日： 1992年 6月 2日）が例示される（これらの菌株は、ずれも、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒 305— 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に寄託されている)。また、これらの菌株は、商品名「やまびこほんしめじ (登録商標）」もしくは「Superやまびこしめじ (登録商標）」として巿場に流通している。子実体は生のものでも加熱乾燥、天日乾燥、凍結乾燥等で乾燥された子実体乾燥物でもよ、。また子実体は株のままでも粉砕したものでも原料として使用することができる。また、原料としてブナシメジの菌糸体やその凍結乾燥物を使用することちでさる。

[0038] 本発明者らは、ブナシメジ由来の抗腫瘍活性を有する物質の探索を行った結果、一般式（1)で表されるポリテルペンに、経口でも効果が見られる強力な抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性及び血管新生抑制活性を有することを見出した。

[0039] 本発明において使用される一般式（1)で表される化合物としては、式（2)〜（11)で表される化合物が例示され、特に好適にはブナシメジ子実体中の含有量が多ぐ製造しやす!/、と、う観点から、式 (3)で表される化合物が使用される。

[0040] なお、本発明の有効成分の一部である式（3)で表される化合物は特開平 4— 1047 95号に記載の新規物質 SBSと同一化合物であり（以下、式（3)で表される化合物を SBSと称すること力ある。）、当該特許には SBSはェプシユタイン一バールウィルス活性ィ匕の抑制作用を有することから当該化合物に抗発ガンプロモーター作用を有することが記載されている。し力しながら、当該公報には本発明のような経口投与で抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性及び血管新生抑制活性を示すことは開示されてヽない。すなわち、特開平 4— 104795号は腫瘍の発生に対して予防的な活性を見出したものであるのに対し、本発明は後述の実施例 1にも示すとおり、 SBSが経口投与で癌の治療や進行、転移を抑える効果を有することを見出したものであり、 SBSの新規な用途に関する発明である。また、 SBSの化学構造については、本発明者らが後述の実施例により解析したところ、沢辺らの文献（Sawabe A.他 3名， Journal of M ass Spectrometry, 1996年， Vol. 31, P921— 925)【こ記載されて!ヽる、 hypsizi prenol Aと同一物質であった。

9

[0041] 本発明に使用される式（1)で表される化合物の製造方法としては、特に限定されるものではなぐ化学合成や天然物 (例えば、前述のブナシメジ)力の抽出等の公知の方法により製造することができ、例えば SBSを製造する場合は、特開平 4— 104795 号に記載の方法を適用することができ、また、式 (2)〜（11)で表される化合物を製造する場合は上記の沢辺らの文献の方法に準じて製造することもできる。また、下記調製例 1に記載の方法によって、得られる抽出物を元に各種クロマトグラフィーにより式 (2)〜（11)で表される化合物を生成することもできる。

[0042] 本発明で使用される一般式（1)で表される化合物の誘導体としては、例えばエステルなど、体内で容易に加水分解し、所望の効果を発揮し得る誘導体 (プロドラッグ)が挙げられる。また、本発明の化合物をほ乳動物に投与して代謝されてできた誘導体も本発明の誘導体に包含される。力かるプロドラッグの調製は公知の方法に従えばよい。なお、力かる誘導体は、それらの塩であってもよい。

[0043] また、一般式（1)で表される化合物又はその誘導体の塩としては薬理学的に許容される塩が用いられる。また、プロドラッグとして機能し得る当該化合物の誘導体であつてもよい。また、本発明に使用される化合物の光学異性体、ケトーエノール互変異性体、幾何異性体などの各種異性体、各異性体の単離されたものであっても、抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する限り、全て本発明において使用することができる。

[0044] 一般式（1)で表される化合物の薬理学的に許容される塩としては、例えば、アル力リ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基との塩などが例示される。なお、本発明にぉ、て使用される薬理学的に許容される塩とは生物に対して実質的に無毒であって、かつ抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性、又は血管新生抑制活性を有する化合物の塩を意味する。当該塩としては、たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシゥム、アンモ -ゥムまたはプロトン化されたベンザチン（N, N' —ジ一ベンジルェチレンジァミン）、コリン、エタノールァミン、ジエタノールァミン、エチレンジァミン、メグラミン（N—メチルダルカミン）、ベネタミン（N—ベンジルフエネチルァミン）、ピぺラジンもしくはトロメタミン（2—アミノー 2—ハイドロキシメチルー 1, 3—プロパンジオール）等の塩が挙げられる。力かる塩の調製もまた、公知の方法に従えばよい。

[0045] また、本発明の第 5〜8の発明において、前記の式 (ィ匕 2)〜(化 11)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1つを含有するブナシメジ由来組成物が使用される。当該組成物としては、特に限定は無、が、例えばブナシメジの酢酸ェチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、適当な溶出溶媒により溶出させることにより得ることができる組成物が例示される。

[0046] 前述のブナシメジの酢酸ェチル抽出物を得るための抽出操作としては、たとえばブナシメジの生鮮子実体を使用する場合は生鮮子実体 1重量部に対して好適には 1〜 10重量部、より好適には 1〜5重量部の酢酸ェチルを使用でき、また子実体乾燥物を使用する場合は、乾燥物 1重量部に対して好適には 5〜50重量部、より好適には 1 0〜25重量部の酢酸ェチルを使用することができる。酢酸ェチルは沸点が低ぐしかも食品の抽出溶媒として使用されており、安全面においても優れている。抽出温度は、特に限定はないが、例えば 5°C〜酢酸ェチルの沸点付近の温度（77. 1°C)、好ましくは 10〜70°C、さらに好ましくは 15〜65°Cが例示される。抽出時間も特に限定はなぐ例えば 30分〜 24時間、好ましくは 1〜20時間、さらに好ましくは 2〜10時間が例示される。抽出処理は静置して行なっても、攪拌下に行なっても良い。

[0047] このようにして得られた酢酸ェチル抽出物力の不溶物の除去は通常の方法で行なえばよぐ例えばろ過または遠心分離により不溶物を除去することができる。ここで、不溶物とは、ろ過の場合、巿販のろ紙 (例えば、アドバンテック社製 No. 2フィルタ一）によりろ別される抽出物中の不溶性の成分を、遠心分離の場合、少なくとも 5000 X gの遠心力により沈降し得る抽出物中の不溶性の成分を、う。

[0048] シリカゲルカラムとしては特に限定はないが、例えばポアサイズ 0. 063-0. 200m mのシリカゲルを充填したカラムが使用できる。ここに上記の酢酸ェチル抽出物を供し、その後必要に応じて酢酸ェチルで洗浄した後、各種溶媒にて溶出することができる。溶出溶媒としては、特に限定はないが、例えばアセトンが使用できる。

[0049] 得られた溶出液はそのまま本発明の組成物として使用することもできる力たとえば当該溶出液を減圧乾固した後、エタノールで再溶解し、さらに減圧乾固することにより本発明の組成物とすることができる。該組成物中における式（2)〜（11)で表される化合物の含有量としては、特に制限は無いが、好ましくは 0. 001〜： L00重量％、より好ましくは 0. 01〜10重量％である。力かる濃度に式（2)〜（11)で表される化合物を調整するためには、特に限定はないが、デキストリン等の賦形剤を添加してもよい。中でも、該組成物中における式（3)で表される化合物の含有量が 0. 0001〜： L0重量％であることが好ましぐ 0. 001〜1重量％であればより好ましい。

[0050] なお、本発明の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤において使用される一般式（1)で表される化合物、その誘導体、薬理学的に許容されるそれらの塩、又は上記のブナシメジ由来組成物を、本発明の有効成分と称し、本発明の有効成分を含有する抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤を本発明の医薬と称することがある。

[0051] 本発明の有効成分には、後述するように特に毒性は認められない。また、副作用の発生の心配もない。それゆえ、安全かつ適切に抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性および血管新生抑制活性を発現することができる。

[0052] また、本発明において、抗腫瘍剤の対象となる疾患としては、治療に抗腫瘍作用を要する疾患であれば特に限定はないが、例えば、悪性腫瘍全般、例えば胃がん、大腸がん、食道がん、皮膚がん、子宮がん、前立腺がん、膀胱がん、肺がん等が前記の疾患として例示される。さらに白血病のような造血器官の悪性腫瘍も本願発明の抗腫瘍剤の対象疾患とすることができる。尚、抗腫瘍活性は、培養がん細胞に薬剤を添加して所定の時間培養した後、がん細胞の生存率を測定したり、マウス等の実験動物にがん細胞を移植し、薬剤を一定期間投与した後、実験動物体内に生じた固形腫瘍の大きさや重量を測定すること等により測定することができる。

[0053] また、本発明にお、て、アポトーシス誘発剤の対象となる疾患としては、治療にアポトーシス誘発作用を要する疾患であれば特に限定はないが、例えば、前記悪性腫瘍全般の他、シーダレン症候群のような自己免疫疾患等が例示される。さらに白血病のような造血器官の悪性腫瘍も本願発明のアポトーシス誘発剤の対象疾患とすることができる。本発明におけるアポトーシス誘発活性は、マウス正常細胞を用いた場合には確認されなヽことから、カゝかる活性を有する本発明のアポトーシス誘発剤は前記の疾患に対して極めて有用性の高いものである。尚、アポトーシス誘発活性は、培養細胞に薬剤を添加して所定の時間培養後、ヨウ化プロビジゥム等で核染色を行った後、顕微鏡下で観察するか、フローサイトメーター等を用いて測定することができる。

[0054] また、本発明において、血管新生抑制剤の対象となる疾患としては、治療に血管新生抑制作用を要する疾患であれば特に限定はないが、例えば、前記悪性腫瘍全般の他、リウマチ様関節炎、乾癬、変形性関節症、加齢性黄班変性症、血管腫、肥大性の瘢痕、歯周病、強皮症等が例示される。尚、血管新生抑制活性は、血管新生を誘発する繊維芽細胞増殖因子等を添加したマトリゲル (細胞外基質)をマウスの皮下に移植するモデルにおいて、マトリゲル内に浸潤してくる赤血球のヘモグロビン量を、吸光度計を用いて測定する方法により評価することができる。

[0055] 本発明の医薬としては、本発明に係る前記有効成分を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。本発明の医薬には、有効成分としての塩は薬理学的に許容され得る塩を用いる。また、本発明の医薬としては、前記有効成分を当該有効成分と同じ用途に使用可能な他の成分、例えば、公知の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤、又は血管新生抑制剤と配合したり、併用したりすることができる。 [0056] 本発明の医薬の製造は、通常、前記有効成分を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添カ卩によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることちでさる。

[0057] 医薬用担体は、本発明の医薬の投与形態および剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが担体として利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ハイドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよ!ヽ。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添カロしてもよい。なお、本発明の有効成分は経口投与によっても十分な効果を発揮することから、その投与の簡便性の観点力経口投与用の医薬とするの力好適な形態である。

[0058] 一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。

[0059] 外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内)投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、口ーシヨン剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、ノップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。

[0060] 以上の各種製剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、力かる製剤における有効成分の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該有効成分を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。本発明の医薬中の有効成分の含有量としては、 0. 1〜： LOO重量％程度である。

[0061] 本発明の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなぐ内用、外用および注射によることができる。注射剤は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用剤では、たとえば、座剤をその適する投与方法により投与すればよい。

[0062] 本発明の医薬の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、有効成分として一般式 (1)で表される化合物を使用する場合、製剤中に含有される前記有効成分の投与量で、例えば成人 1日当り 0. 1 μ g〜500mgZkg体重、好適【こ ίま 0. 5 μ g〜400mg/kg体重、さら【こ好適【こ ίま 1 μ g〜300mg/kg体重である。また、有効成分として、上記ブナシメジ由来組成物 (減圧乾固したもの）を使用する場合は、例えば成人 1日当り 0. 1 μ g〜lgZkg体重、好適には 0. 5 /z g〜 750mgZkg体重、さらに好適には: g〜500mgZkg体重である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、 1日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。また、本発明の医薬はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して曰常的〖こ摂取させることちできる。

[0063] 本発明の食品は一般式（1)で表される化合物、その誘導体、薬理学的に許容されるそれらの塩、及び Z又は前述のブナシメジ由来組成物を含有する抗腫瘍活性、ァポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品であり、本発明の食品を摂取、喫食することにより生体の恒常性が維持されることにおいて特に有用である。なお、当該食品としては、例えば抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性、又は血管新生抑制活性による所望の効果の発現のために用いられるものである旨の表示を付した健康食品 (特定保健用食品）とすることもできる。

[0064] 本発明の食品の製造法に特に限定はな!/、。たとえば、配合、調理、力！]ェなどは一般の食品のものに従えばよぐそれらの製造法により製造することができ、得られた食品に本発明に係る前記有効成分が含有されて！ヽれば良!ヽ。

[0065] なお、本発明の食品において「含有」とは、含有、添加および Zまたは希釈を意味する。ここで、「含有」とは食品中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、「添加」とは食品の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、「希釈」とは本発明で使用される有効成分に、食品の原料を添加するという態様をいうものである。

[0066] 本発明の食品は、特に限定するものではな、が、例えば、穀物加工品（例、小麦粉加工品、デンプン類カ卩ェ品、プレミックス加工品、麵類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（例、可塑性油脂、てんぶら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（例、豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（例、ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（例、冷凍すりみ、力まぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等)、乳製品 (例、原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜 '果実カロェ品 (例、ペースト類、ジャム類、漬物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等)、菓子類 (例、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等)、アルコール類 (例、日本酒、中国酒、ワイン、ウィスキー、焼酎、ウォッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料 (例、緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等)、調味料 (例、しょうゆ、ソース、酢、みりん等)、缶詰 '瓶詰'袋詰食品 (例、牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済食品等）、半乾燥または濃縮食品（例、レバーペースト、その他のスプレッド、そば'うどんの汁、濃縮スープ類等)、乾燥食品 (例、即席麵類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済食品、調理済飲料、調理済スープ等)、冷凍食品 (例、すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シユウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品

、液体食品（例、スープ等）、香辛料類等の農産'林産加工品、畜産加工品、水産カロェ品等が挙げられる。

[0067] 本発明の食品は、前記有効成分が単独もしくは複数含有、添加および Zまたは希釈されており、その含有量が抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を発現するための必要量に相当するものであれば特にその形状に限定はなぐタブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。また、前記有効成分にグリセリン等を添加して、有効成分が濃縮された健康食品とすることちでさる。

[0068] 本発明の食品中の前記有効成分の含有量は特に限定されず、その官能と活性発現の観点力も適宜選択できるが、例えば一般式（1)で表される化合物を使用する場合、食品中、好ましくは 0. 00001重量⁰ /₀以上、より好ましくは 0. 0001〜10重量⁰ /₀、更に好ましくは 0. 0006〜6重量％である。また、上記ブナシメジ由来組成物（減圧乾固したもの）を使用する場合は、食品中、好ましくは 1重量％以上、より好ましくは 5 〜95重量％、更に好ましくは 10〜90重量％である。また本発明の食品は、好ましくは、それらに含有される上記成分が、例えば一般式（1)で表される化合物を使用する場合、成人 1日当たり 0. 1 μ g〜500mgZkg体重、好ましくは 0. 5 μ g〜400mg Zkg体重、さらに好ましくは 1 μ g〜300mgZkg体重となるように摂取すればよい。また、上記ブナシメジ由来組成物 (減圧乾固したもの）を使用する場合は、例えば成人 1日当り 0. 1 μ g〜lgZkg体重、好適には 0. 5 g〜750mgZkg体重、さらに好適には: L g〜500mgZkg体重である。

[0069] 本発明の第 10の発明はまた、抗腫瘍作用、アポトーシス誘発作用又は血管新生抑制作用を必要とする疾患を有する被験体に、有効量の上記一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1つを投与することを含む、該疾患の治療方法を提供する。

[0070] 本明細書中において被験体は、好ましくはヒトである力これに限定されず、例えば、養殖動物、ペット動物などでもよい。養殖動物としてはゥマ、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ラタダ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ゥサギなどの実験動物、 -ヮトリ、ァヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽が例示される。ペット動物としてはィヌ、ネコなどが例示される。

[0071] また、本明細書中において有効量とは、一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1つを (有効成分)を上記被験体に投与した場合に、該有効成分を投与して!/、な!、被験体と比較して、抗腫瘍作用、アポトーシス誘発作用または血管新生抑制作用を生じる該成分の量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的および被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではないが、好ましくは、上記の医薬と同様に、前記有効成分の量で、ヒト（例えば成人） 1日当り 0. 01 μ g〜500 mgZkg体重である。

[0072] 本発明の治療方法においては、有効量の一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1つをそのまま上記被験体に投与してもよぐまた、上記のような医薬又は食品として投与してもよい。また、投与方法にも限定はなぐ例えば、上記の医薬と同様に、経口投与や注射等により投与すればよい。

[0073] 本発明の治療方法によれば、前記の本発明の医薬又は食品の対象となる疾患を治療することができ、例えば、癌の治療や進行、転移を抑える効果が発揮され得る。

[0074] 本発明で有効成分として使用される SBSを 25mgZマウス Z日で経口投与しても毒性は認められない。

実施例

[0075] 以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。尚、実施例の記載において、用語「腫瘍抑制活性」は、抗腫瘍活性と同義の用語として用いられる。

[0076] 調製例 1

ブナシメジ Lyophyllum ulmarium M— 8171 (FERM BP— 1415)の子実体乾燥粉末 250gに酢酸ェチル 5Lを加え、室温で 3時間攪拌後、ろ過（アドバンテック社製 No. 2フィルター）し、残さを除去することにより 5Lのろ液を得た。シリカゲル 60 (0. 063-0. 200mm) (メルク社製） 150gを約 800mlの酢酸ェチルで洗浄し、直径 5cmのガラス製カラムに充填して得られたシリカゲルカラムに、上記のろ液を静かに注ぎ入れた後、 3Lの酢酸ェチルで洗浄することにより非吸着物質を除去した。次に 3Lのアセトンで溶出させることにより、溶出液 3Lを得た。該溶出液を減圧乾固した後、 100%エタノール 100mlを添カ卩し再び減圧乾固することにより、アセトンが除去されたアセトン溶出画分 3. 6gを得た。

NMR及び LC MSの分析の結果、該画分には式（2)〜（11)で表される化合物が含有されており、その主要構成成分は式（3)で表される化合物（SBS)であることを確認した。

[0077] 調製例 2

ブナシメジが Lyophyllum ulmarium K 0259 (FERM P— 12981)である以外は調製例 1と同様の方法によりアセトン溶出画分 1. lgを得た。 NMR及び LC— M Sの分析の結果、該画分には式（2)〜（11)で表される化合物が含有されて!ヽることを確認した。

[0078] 実施例 1

ICRマウス（日本エスエルシー社）は、 5週齢の雌を購入し 6週齢で使用した。 Sarc oma— 180(以下 S— 180)腫瘍細胞は、 ICRマウスの腹腔に移植して腹水をつくり、 7日毎に別のマウスに移植して継代した。継代して 7日目の腹水を採取し、リン酸緩衝液で遠心洗浄後、同緩衝液に懸濁して細胞数カウント後、 5 X 10⁷個 ZmLとなるように調整した。この細胞懸濁液 0. lmLを ICRマウスの右側腹部皮下に移植し、 7 日後の固形腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさの平均が各群で均等になり、 1群 10匹となるようにマウスを群分けした。ブナシメジ由来のアセトン溶出画分は、調製例 1で調製したものを 100%エタノールに溶解させた後、通常の粉末飼料 CE— 2に混ぜてマウスに与えた。投与量はブナシメジ粉末に換算して、粉末試料 CE— 2に対して体積比で 10%混ぜて与えた場合と同等になるように用いた。実際の投与量 (ァセトン溶出画分）は、約 250mgZkgZ日となる。コントロール群には CE— 2のみを与えた。腫瘍の大きさは、 S— 180移植後 4週目に測定した。また、腫瘍の大きさは長径と短径を測定し、以下の計算式にしたがって体積を算出して比較した。

腫瘍体積 (mm³) = (長径） X m V 2

腫瘍抑制活性は、以下の計算式にしたがって算出した。

腫瘍抑制活性 (％) = (コントロール群の腫瘍体積アセトン溶出画分投与群の腫瘍体積) Zコントロール群の腫瘍体積 X 100

[0079] [表 1] 表 1

実験番号マウス腫瘍体積腫瘍抑制活性

(平均土標準誤差） (%)

1 C E - 2 (コントロール） 1 8 6 2 ± 5 42

アセトン溶出画分 1 1 7 1 ± 2 7 0 3 7. 1

(約 2 5 Omg/k g)

2 C E - 2 (コントロール） 1 4 3 7 ± 3 2 1

ァセトン溶出画分 6 1 9 ± 1 3 2 5 6. 9

(約 2 5 Omg/k g)

[0080] 2回の実験を行った結果を表 1に示した。いずれの実験においてもコントロール群に比べて、ブナシメジ由来アセトン溶出画分を投与した群において S— 180固形腫瘍増殖の抑制がみられた。

[0081] 実施例 2

CDFマウス（日本エスエルシー社）は、 6週齢の雌を購入し 7週齢で使用した。 IM C carcinoma (以下 IMC)腫瘍細胞は、 CDFマウスの腹腔に移植して腹水をつくり、 7日毎に別のマウスに移植して継代した。継代して 7日目の腹水を採取し、リン酸緩衝液で遠心洗浄後、同緩衝液に懸濁して細胞数カウント後、 5X10⁷個 ZmLとなるように調整した。この細胞懸濁液 0. lmLを CDFマウスの右側腹部皮下に移植し、 7 日後の固形腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさの平均が各群で均等になり、 1群 10匹となるようにマウスを群分けした。ブナシメジ由来のアセトン溶出画分は、調製例 1で調製したものを 100%エタノールに溶解させた後、通常の粉末飼料 CE— 2に混ぜてマウスに与えた。投与量はブナシメジ粉末に換算して、粉末試料 CE— 2に対して体積比で 10%混ぜて与えた場合と同等になるように用いた。実際の投与量は、約 250mgZkgZ日となる。コントロール群には CE— 2のみを与えた。腫瘍の大きさは、 IMC移植後 4週目に測定した。また、腫瘍の大きさは長径と短径を測定し、実施例 1 と同様に体積と腫瘍抑制活性を算出して比較した。結果を表 2に示す。

[0082] [表 2] 表 2

マウス腫癟体積腫瘍抑制活性

(平均土標準誤差） (%)

C E 2 (コントロール） 308 1 ± 724

アセトン溶出画分（約 250 mgZk g) 1 505 ± 246 5 1. 2

[0083] コントロール群に比べて、ブナシメジ由来アセトン溶出画分を投与した群において I MC固形腫瘍増殖の抑制がみられた。 IMC carcinomaは、 CDFマウスに対して同系であり、このような同系腫瘍に対してもブナシメジ由来アセトン溶出画分は、増殖を抑制することが明ら力となった。

[0084] 実施例 3

HL— 60細胞は、 10%牛胎仔血清と Gentamycinを終濃度 g/mlで添カ卩した RPMI— 1640培地を用いて 1週間に 2回、継代したものを用いた。細胞を血清を添加しない RPMI— 1640培地で 2回洗浄し、同培地に懸濁して細胞数をカウントした。細胞を 2X10⁶/mLとなるように希釈し、 24穴培養プレートに lmLずつ分注した。調製例 1で調製したアセトン溶出画分を 0.2/ζΜ、 2 Μあるいは Μとなるように添加し、 37°Cインキュベータで 6時間培養した。ネガティブコントロールには、 vehicl e (1%エタノール水溶液）を、また、ポジティブコントロールには、 Actinomycin Dの Ι/zgZmLを用いた。 6時間培養後に遠心分離にて細胞を回収した。アポトーシス細胞の検出は以下のように行った。細胞を 4%パラホルムアルデヒド (pH7.4)室温で 1 5分固定したのち、 70%エタノールに懸濁して 20°Cでー晚、静置した。これをリン酸緩衝液 (PBS (―))で洗浄後、リボヌクレアーゼ A溶液を加えて 37°Cで約 20分インキュペートした。遠心分離で細胞を回収後、ヨウ化プロビジゥム溶液を加えて染色して、フローサイトメーター（ベックマン'コールター社製）を用いてアポトーシス細胞の比率を測定した。また、一部をスライドガラスにとり、蛍光顕微鏡下でアポトーシスが起こっていることを確認した。結果を図 1に示す。

[0085] 実施例 4

C57BLZ6マウス（日本エスエルシー社）は、 6週齢の雌を購入し 7週齢で使用した。 Matrigelを用いた血管新生の評価は、 Passanitiら（Lab. Invest. 67 : 519— 52 8, 1992)の方法に従って行った。すなわち、ァシディック'フイブロブラスト'グロス'フアクター（aFGF) 1 μ g m へパリンを 64UZmLとなるように添カ卩した Matrigel ( Becton Dickinson社製）に、調製例 1で調製したアセトン溶出画分を表 3に示す濃度となるように添加し、この 0. 5mLをマウスの右側腹部皮下に移植した。コントロールには、アセトン溶出画分の溶解に用いた vehicle (1%エタノール水溶液）をァセトン溶出画分の代わりに添加した。 5日後に Matrigelを摘出した。血管新生の度合は、摘出した Matrigelをホモゲナイズし、ヘモグロビン量を測定することで比較した。へモグロビン量の測定は、ヘモグロビン B—テストヮコー（和光純薬社製）を用いた。結果を表 3に示す。

[0086] [表 3] 表 3

サンプルマウスヘモグロビン濃度

(匹数） ( g /m L )

コント口一ル 5 1 6 4 1 ァセトン溶出画分 2 0 μ Μ 4 6 4 2

[0087] 以上のように、アセトン溶出画分を作用させることにより、ヘモグロビン濃度が抑制された。すなわち、 Matrigelへの血管新生が抑制されたために、 Matrigel内に侵入する血液量が抑えられた結果である。

[0088] 実施例 5

C57BLZ6マウス（日本エスエルシー社）は、 6週齢の雌を購入し 7週齢で使用した。 Matrigelを用いた血管新生の評価は、実施例 4と同様に行った。すなわち、 aFGF とへパリンを添カ卩した Matrigelをマウスの皮下に注射し、 5日後に摘出してへモグロビン量を測定した。ブナシメジ由来のアセトン溶出画分は、調製例 1で調製したものを凍結乾燥後、通常の粉末飼料 CE— 2に混ぜてマウスに与えた。投与量はブナシメジ粉末に換算して、粉末試料 CE— 2に対して体積比で 10%混ぜて与えた場合と同等になるように用いた。実際の投与量は、約 220mgZkgZ日となる。コントロール群には CE— 2のみを与えた。結果を表 4に示す。

[0089] [表 4] 表 4

サンプルマウスへ乇グロビン濃度

(匹数） ( g /m L )

コントロ一ル 5 1 6 4 1

アセトン溶出画分と混餌投与 3 5 2 7

[0090] アセトン溶出画分を餌に混ぜて投与した場合にも Matrigelに対する血管新生を抑制した。これによりアセトン溶出画分による血管新生抑制作用が示された。また、ァセトン溶出画分混餌投与した際にみられる腫瘍増殖抑制作用は、腫瘍の血管新生を抑制することにより生じた作用である可能性も示唆された。

[0091] 実施例 6

U937細胞（ヒトリンパ腫細胞）を、 10%牛胎仔血清を添カ卩した RPMI— 1640培地に懸濁し、細胞数をカウントして 5 X 10⁴個 ZmLとなるように調整した。これを 2mLずつ細胞培養用プレートに分注した。調製例 1で調製したアセトン溶出画分を 1または 2mMとなるようにエタノールで希釈し、 20 /z Lずつ添カ卩して、それぞれ終濃度 10または 20 Mとした。コントロールにはエタノールのみを添カ卩した。 37°C、 5%CO条

2 件下でインキュベートし、 6時間後、 24時間後、 48時間後あるいは 72時間後に細胞を回収し、 0. 3重量％トリパンブルーで染色して全細胞数と死細胞数をカウントした。生細胞数のみをカウントした結果を表 5に示す。また、以下の計算式により算出した細胞の生存率の結果を表 6に示す。実験は N=4で行い、結果は平均値を示した。また、生存率は下記式のとおり算出した。

[0092] 生存率（％) = (生細胞数 Z全細胞数） X 100

[0093] [表 5] 表 5 U 9 3 7生細胞数 (開始時は、 1 0 . 0 X 1 0 ⁴個）

サンプル添加量 ( β Μ、生細胞数（X 1 0 ⁴10)

培養時間（時間）

6 2 4 4 8 7 2 コントロール 1 2 . 2 1 8 . 3 3 7 . 5 8 6 . 3

1 0 9 - 6 6 . 2 4 . 6 3 . 8

2 0 1 0 . 2 0 . 5 0 0

[0094] [表 6] 表 6 U 9 3 7に対する細胞傷害活性（開始時の生存率 1 0 0 %)

サンプル添加量（ M) 生存率 (%)

培養時間 (時間）

6 2 4 4 8 7 2 コントロール 9 7 . 5 9 6. 7 9 7 . 0 9 7. 8

1 0 9 7 . 4 5 5. 5 3 3 . 6 3 0. 9

2 0 9 6 . 0 6. 0 0 0

[0095] 以上のように、アセトン溶出画分は、ヒトリンパ腫細胞に対して抗腫瘍活性の一種である細胞傷害活性を示すことがあきらかになった。

[0096] 実施例 7

MKN45細胞（ヒト胃癌細胞）を、 10%牛胎仔血清を添カ卩した RPMI— 1640培地に懸濁し、細胞数をカウントして 5 X 10⁴個 ZmLとなるように調整した。これを 2mLずつ細胞培養用プレートに分注し、 37°C、 5%CO条件下で一晩培養後、培地を除き

2

、新たに lmLの培地を入れた。調製例 1で調製したアセトン溶出画分を 2または 4m Mとなるようにエタノールで希釈し、 10 Lずつ添加して、それぞれ終濃度 20または 40/zMとした。コントロールにはエタノールのみを添カ卩した。 37°C、 5%CO条件下

2 でインキュベートし、 6時間後、 24時間後、 48時間後あるいは 72時間後にトリプシン —EDTA処理にて細胞を回収し、 0.3重量％トリパンブルーで染色して全細胞数と死細胞数をカウントし、実施例 6と同様に生存率を算出した。生細胞数のみをカウントした結果を表 7に示す。また、生存率の結果を表 8に示す。なお、実験は N=4で行い、結果は平均値を示した。

[0097] [表 7] 表 7 MKN 4 5生細胞数（開始時は、 1 0. 0 X 1 0⁴個)

サンプル添加量 (j M) 生細胞数（X 1 0⁴個）

培養時間（時間）

6 2 4 4 8 7 2 コントロール 1 1 . 8 2 0. 7 4 3. 6 7 1. 5

2 0 7 . 5 8. 2 6. 3 4. 6

4 0 6 . 2 1. 8 0. 2 0. 1

[0098] [表 8] K N 4 5に対する細胞傷害活性（開始時の生存率 1 0 0 % ) サンプル添加量（Zi M ) 生存率 ( % )

培養時間 (時間）

6 2 4 4 8 7 2 コントロール 9 6 . 6 9 8 . 0 9 7 . 6 9 7 . 4

2 0 9 5 . 4 9 0 . 0 8 1 . 6 6 3 . 5

4 0 8 2 . 2 3 5 . 4 2 . 3 1 . 0

[0099] 以上のように、アセトン溶出画分は、ヒト胃癌細胞に対しても抗腫瘍活性の一種である細胞傷害活性を示すことがあきらかになった。

[0100] 実施例 8

S— 180細胞（マウス癌細胞）あるいは IMC細胞（マウス癌細胞）は、それぞれ ICR マウスあるいは CDFマウスを用いて腹水継代されているものを、移植継代後、 7日目に腹水を採取して用いた。リン酸緩衝液で遠心、洗浄した後、 10%牛胎仔血清を添加した RPMI— 1640に懸濁し、細胞数をカウントして 1 X 10⁶個 ZmLとなるように調整した。これを lmLずつシャーレに分注した。調製例 1で調製したアセトン溶出画分を 1、 2あるいは 4mMとなるようにエタノールで希釈し、 10 Lずつ添加してそれぞれ終濃度 10、 20、 40 Mとした。コントロールにはエタノールのみを添カ卩した。 37°C、 5%CO条件下でインキュベートし、 6時間後、 24時間後、 48時間後あるいは 72時

2

間後に細胞を回収し、 0. 2%トリパンブルーで染色して全細胞数と死細胞数をカウントし、実施例 6と同様に生存率を算出した (表 9および表 10)。

[0101] [表 9] 表 9 S— 1 8 0に対する細胞傷害活性（開始時の生存率 9 8 . 5 % ) サンプル添加量（ M ) 生存率（％)

培養時間（時間）

6 2 4 4 8 7 2 コントロール 9 9 . 2 9 7 - 5 9 4 . 6 9 2 . 8

1 0 9 9 . 7 9 4 . 4 8 - 1 1 8 . 1

2 0 9 9 . 7 2 5 . 4 0 . 0 0 . 0

4 0 7 . 0 0 . 0 0 . 0 0 . 0

[0102] [表 10] 表 1 0 I M Cに対する細胞傷害活性（開始時の生存率 9 8 . 2 % ) サンプル添加量（ Μ ) 生存率（％)

培養時間（時間）

6 2 4 4 8 7 2 コントロール 9 9 . 0 9 8 . . 7 9 5 . 3 7 8 . 5

1 0 1 0 0 9 6 . . 7 7 1 . 7 9 . 3

2 0 9 2 . 0 1 8 , . 3 2 . 1 0 . 9

4 0 4 4 . 6 2 , . 3 1 . 1 1 . 8

[0103] 以上のように、アセトン溶出画分は、マウス癌細胞に対しても抗腫瘍活性の一種である細胞傷害活性を示すことがあきらかになった。

[0104] 調製例 3

ブナシメジ（Lyophyllum ulmarium M-8171)子実体粉末 300gに酢酸ェチルをカロえ、全量を 5Lとし、室温で 3時間撹拌して酢酸ェチル可溶性成分を抽出した。吸引ろ過により不溶物を除去し酢酸ェチル可溶画分とした。これを Silicagel60カラム（300 mL容）にかけ、 3Lの酢酸ェチルを流して非吸着画分を溶出させた後、アセトン 3Lを流してアセトン溶出画分を回収した。減圧濃縮後、エタノールを加えて、再度減圧濃縮乾固し重量を測定した。この操作を 10回行い、最終的に 3kgのブナシメジ子実体粉末より、アセトン溶出画分を 35. 2g得た。この 500mgを、 Silicagel60カラムにかけ、酢酸ェチル：アセトン（50 : 50)より、（0 : 100)までグラジェントをかけて主要成分を回収した。減圧濃縮で溶剤を除去した後、メタノール：エタノール：水（3： 4： 4)の混合溶媒に溶解し、 ODSカラム (CAPCELLPAK C UG120

18 A 5 m φ 20x250mm)を用いた高速液体クロマトグラフィーにより、流速 10ml/min、検出波長 210nmの条件で SBS を分取した。溶出溶媒には SBSを溶解した溶媒を用いた。分取した SBSを濃縮乾固して、 260mgの精製 SBSを得た。

[0105] 実施例 9

HL—60細胞（ヒト白血病細胞）を、 10%牛胎仔血清を添カ卩した RPMI— 1640に懸濁し、細胞数をカウントして 5 X 10⁵個 ZmLとなるように調整した。これを 2mLずつシャーレに分注した。調製例 3で調製した SBSを 2mMとなるようにジメチルスルホキシドで希釈し、 20 Lずつ添カ卩して終濃度 20 Mとした。コントロールにはジメチルスルホキシドのみを添カ卩した。 37°C、 5%CO条件下で 6時間インキュベートした後、細胞を回収しリン酸緩衝液 (PBS)で遠心、洗浄した。細胞に 4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で 30分間静置することにより固定した。遠心後、上清を除き、 PBSを加えて遠心、洗浄し、 200 Lの PBSに細胞を懸濁した。 0. 05mgZmLのヨウ化プ口ビジゥムを 500 μ L添加し、 4°Cで 10分間インキュベートした後、全細胞数と、アポト一シスを起こした細胞数を測定し、下記式に従ってアポトーシスを誘発した割合を算出した (表 11)。

[0106] アポトーシス誘発率（％) = (アポトーシスを誘発して、る細胞数 Z全細胞数） X 100 [0107] [表 11] 表 1 1

サンプルアポト一シス誘発率（％)

コントロール 9 . 3

S B S ( 2 0 /X M ) 3 0 . 1

[0108] 以上のように、精製された SBSも癌細胞にアポトーシスを誘発させることがあきらかになった。

[0109] 実施例 10

CDFマウス（日本エスエルシー社）は、 6週齢の雌を購入し 7週齢で使用した。 IM C carcinoma (以下 IMC)腫瘍細胞は、 CDFマウスの腹腔に移植して腹水をつくり、 7日毎に別のマウスに移植して継代した。移植継代して 7日後の腹水を採取し、リン酸緩衝液で懸濁後遠心分離し、沈澱を同緩衝液に懸濁して細胞数をカウントした。その細胞数が 5 X 10⁷個 ZmLとなるように調整し、この 0. lmLを CDFマウスの右側腹部皮下に移植した。移植 7日目に腫瘍の生着を確認し、固形腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさの平均が各群で均等になり、 1群 12あるいは 11匹となるようにマウスを群分けした。 SBSは、調製例 3で調製したものをエタノールに溶解し、エタノール濃度が 10%となるように落花生油で希釈してマウスに経口投与した。実際の投与量は、約 15. 6mgZkgZ日となる。コントロール群は、エタノール 10%を含む落花生油を投与した。 IMC腫瘍移植後 3週目に腫瘍の長径と短径を測定し、実施例 1と同様に腫瘍体積と腫瘍抑制活性を算出して比較した。結果を表 12に示す。 [0110] [表 12] 表 1 2

投与サンプル腫瘍体積 (平均土標準誤差）腫瘍抑制活性（： ¾)

C E - 2 (コン卜ロ- -ル） 9 9 2. 9土 1 7 9. 6 一

S B S 1 5. 6 (E g k g ) 5 3 4. 5士 9 2. 3 4 6. 2

[0111] 以上のように SBSを経口投与した動物群においては、コントロール群に比べて、有意な腫瘍増殖抑制が見られた。

産業上の利用可能性

[0112] 本発明により、安価な食用担子菌力単離されたポリテルペン又はブナシメジ由来組成物を有効成分として含有する抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤、又は血管新生抑制剤、および抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品を得ることができる。よって、本発明は特に医薬や健康食品分野において特に有用である。

Claims

請求の範囲下記一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩力なる群より選択される少なくとも 1つを有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤。

[化 1]

(式中、 mは 1〜9の整数、 nは 1〜7の整数を示す。ただし、 m+n= 5〜： L 1である。また Rは水素原子又は水酸基を示す。 )

一般式（1)で表される化合物が下記式 (2)〜（11)で表される少なくとも 1つの化合物である請求項 1記載の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤。

[化 2]

[化 10]

[3] 一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩カゝらなる群より選択される少なくとも 1つを含有することを特徴とする抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品。

[4] 一般式（1)で表される化合物が式 (2)〜（11)で表される少なくとも 1つの化合物である請求項 3記載の食品。

[5] 式 (2)〜（11)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1つを含有するブナシメジ由来組成物を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤。

[6] ブナシメジ由来組成物が、ブナシメジの酢酸ェチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られる組成物であることを特徴とする請求項 5記載の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤。

[7] 式 (2)〜（11)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1つを含有するブナシメジ由来組成物を含有することを特徴とする抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品。

[8] ブナシメジ由来組成物が、ブナシメジの酢酸ェチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られる組成物であることを特徴とする請求項 7記載の食品。

[9] 式 (2)〜（11)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩力なる群より選択される少なくとも 1つを含有するブナシメジ由来組成物であって、ブナシメジの酢酸ェチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られるブナシメジ由来組成物。

[10] 抗腫瘍作用、アポトーシス誘発作用又は血管新生抑制作用を必要とする疾患を有する被験体に、有効量の上記一般式（1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩力なる群より選択される少なくとも 1つを投与することを含む、該疾患の治療方法。

[11] 抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤の製造のための、上記一般式

(1)で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩力なる群より選択される少なくとも 1つの使用。