WO2007018095A1

WO2007018095A1 - ブナシメジ由来抽出物の製造方法

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Publication number: WO2007018095A1
Application number: PCT/JP2006/315311
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Endo; Hitoshi Sakakibara; Yasushi Hattori; Kumi Sasaki; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2005-08-09
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2007-02-15
Also published as: CN101384608A; US20100150955A1; JPWO2007018095A1; KR20080043816A; JP5084505B2

Abstract

　ブナシメジ子実体又は菌糸体よりブナシメジ由来抽出物を製造する方法であって、抽出溶媒としてアルカリ性の水性溶媒を用いる、ブナシメジ由来抽出物の製造方法、該製造方法により得られるブナシメジ由来抽出物、ならびに該抽出物を含有する食品及び医薬。

Description

明細書

ブナシメジ由来抽出物の製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、ブナシメジ由来抽出物の製造方法、該製造方法によって得られるブナシメジ由来抽出物、該抽出物を含む食品、及び該抽出物を含む医薬に関する。更には、ブナシメジ由来のテルペンィ匕合物の製造方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、担子菌類からの生理活性物質検索が盛んであり、様々な報告がなされている。ブナシメジ由来の生理活性成分としては、 SBSという物質が血小板凝集抑制作用および抗発ガンプロモーター作用を有していることが知られている（例えば、特許文献 1)。この SBSは、苦味成分であるテルペンィ匕合物 (テルぺノイド)の一種であり、ブナシメジには他にも種々のテルペンィ匕合物が含まれていることが知られている（例えば、非特許文献 1)。

[0003] テルペン化合物は、多くの植物に存在する有機化合物であり、炭素数が 5の倍数で、 n個のイソプレンあるいはイソペンタン力も構成される前駆物質に由来する。 n= 2 のものはモノテルペン、 n= 3はセスキテルペン、 n=4はジテルペン、 n= 5はセスタテルペン、 n= 6はトリテルペン、 n= 8はテトラテルペン、それ以上はポリテルペンと称される。テルペン化合物にはアポトーシスを誘発する作用も知られており、たとえば、トリテルペンのアポトーシス誘発作用の報告など、数多く存在する。

[0004] ブナシメジ由来のテルペンィ匕合物は水に難溶性であることが知られており（例えば、特許文献 1)、該テルペン化合物を抽出する方法としては、ブナシメジ子実体より酢酸ェチル等の有機溶媒で抽出する方法 (例えば、特許文献 1)や、熱処理したブナシメジ子実体を 70%エタノールで抽出する方法 (例えば、非特許文献 1)が知られている。

特許文献 1：特開平 4— 104795号公報

非特許文献 2： Sawabe A.他 3名， Journal of Mass Spectrometry, 1996年 , Vol. 31, P921 - 925 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 上記のような従来の方法でブナシメジよりテルペンィ匕合物を抽出する場合、大量の有機溶媒、例えばエタノール、酢酸ェチルを使用する必要がある。ところが、エタノールゃ酢酸ェチルは危険物として取り扱われるものであり、工業ィ匕にあたっては安全性の観点から、その取り扱いや保管、管理、使用などには十分な注意を要する。また、それらの保管、管理の為の設備も必要となる。これらが相まって、テルペン化合物を豊富に含むブナシメジ由来抽出物の製造原価を押し上げる要因となっており、工業ィ匕に際して大きな課題となっている。

[0006] また、上記のような従来の方法で得られたブナシメジ由来抽出物を食品に用いる場合、有機溶剤の抽出物中への残留が食品の風味を損ねるという問題や、有機溶剤が毒性物質である場合には人体へ悪影響を及ぼす恐れがある。たとえこれらの問題を回避するために残留有機溶媒を除去する工程を加えたとしても、完全に残留有機溶剤を除去する事は困難である。また、有機溶剤を除去する工程を加える事により、製造原価がさらに上昇する事となる。

[0007] 従って、本発明の目的は、有機溶剤を用いる事なくブナシメジよりテルペンィ匕合物を効率よく抽出し、テルペンィ匕合物を多く含むブナシメジ由来抽出物を低コストにて提供する事である。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは、ブナシメジをアルカリ性の抽出溶媒で処理する事により、有機溶剤を用いることなぐテルペンィ匕合物を豊富に含むブナシメジ由来抽出物を製造できる事を見出し、本発明を完成させた。

[0009] 即ち、本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は、ブナシメジ子実体又は菌糸体よりブナシメジ由来抽出物を製造する方法であって、抽出溶媒としてアルカリ性の水性溶媒を用いる、ブナシメジ由来抽出物の製造方法に関する。第 1の発明においては、得られた抽出物を酸により中和する工程をさらに含んでも良い。また、第 1の発明にお、ては、さらに乳化剤を添加する工程を含んでヽても良、。

第 1の発明に使用されるアルカリ性の水性溶媒としては、炭酸ナトリウム水溶液、水酸ィ匕ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換榭脂懸濁液が例示される。

第 1の発明において、抽出溶媒での抽出としては、 40〜120°Cの温度で行われる抽出が例示される。

[0010] 本発明の第 2の発明は、第 1の発明の製造方法によって得られうる、ブナシメジ由来抽出物に関する。第 2の発明のブナシメジ抽出物としては、テルペンィ匕合物を乾固物換算で 0. 4重量％以上含むものが例示される。

[0011] 本発明の第 3の発明は、第 2の発明のブナシメジ由来抽出物を含有する食品に関する。

[0012] 本発明の第 4の発明は、第 2の発明のブナシメジ由来抽出物を含有する医薬に関する。

[0013] 本発明の第 5の発明は、テルペン化合物の製造方法に関し、

(a)ブナシメジ子実体又は菌糸体をアルカリ性の抽出溶媒で処理し、ブナシメジ由来抽出物を得る工程、及び

(b)工程 (a)により得られた抽出物からテルペンィ匕合物を精製する工程、を含む製造方法に関する。

第 5の発明に使用されるアルカリ性の水性溶媒としては、炭酸ナトリウム水溶液、水酸ィ匕ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換榭脂懸濁液が例示される。

第 5の発明において、アルカリ性の水性溶媒での処理としては、 40〜120°Cの温度で行われる処理が例示される。

発明の効果

[0014] 本発明により、テルペンィ匕合物を豊富に含むブナシメジ由来抽出物の製造方法が提供される。該製造方法は、製造に有機溶剤を必要としないため、食品に適した抽出物を製造する事ができる。更には、従来の製造方法に比べて製造原価を低減する事ができる。また、該製造方法により、テルペンィ匕合物を豊富に含む、食品に適したブナシメジ由来抽出物が提供される。また、本発明により、該ブナシメジ由来抽出物を含有する食品及び医薬が提供される。更には、安価なテルペン化合物の製造方法が提供される。

発明を実施するための最良の形態 [0015] ブナシメジは自然界においては秋期に種々の広葉樹の枯れ木に叢生あるいは離生しており、他のきのこと比較して形がよぐ歯切れのよい肉質のため、美味なきのことして採食されてきた。また、近年ではォガタズに米糠やその他の栄養源を配合した培養基を用いて、ビン又は箱で栽培を行う菌床人工栽培法が確立され、季節に関係なく一年を通じて安定してきのこを収穫できるようになつている。すなわち、本発明の抽出物の原料となるブナシメジは安価に入手でき、医薬や健康食品原料としても適している。

[0016] 原料として使用されるブナシメジは天然のものでも人工栽培品でもよいが、好適には Lyophyllum ulmarium M— 8171 (FERM BP— 1415、寄託日： 1986年 8 月 23日）、又は Lyophyllum ulmarium K— 0259 (FERM P— 12981、寄託日： 1992年 6月 2日）が例示される（これらの菌株は、ずれも、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒 305— 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に寄託されている)。また、これらの菌株は、商品名「やまびこほんしめじ (登録商標）」もしくは「Superやまびこしめじ (登録商標）」として巿場に流通されている。ブナシメジとして人工栽培品を使用する場合は、製造されるブナシメジ由来抽出物中のテルペンィ匕合物の含有量を向上させるという物質、例えばマメカヮを含有する培地で栽培されたブナシメジの子実体が好適に使用される。子実体は株のままでも粉砕したものでも原料として使用することができ、生のものでも加熱乾燥、天日乾燥、凍結乾燥等で乾燥された子実体乾燥物であっても原料として使用できる。また、原料としてブナシメジの菌糸体やその凍結乾燥物を使用することもできる。また、上記の子実体又は菌糸体を熱水により洗浄したものも、原料として使用することがでさる。

[0017] 本発明者らは、抽出溶媒としてアルカリ性の水性溶媒を用いる事により、有機溶剤を用いる事無ぐ水に難溶性のテルペンィ匕合物を豊富に含むブナシメジ由来抽出物を製造する事に成功した。なお、本発明において、テルペンィ匕合物としては前述の非特許文献 1に記載されて、るようなブナシメジ由来のポリテルペンが例示される。

[0018] 本発明のブナシメジ由来抽出物の製造方法に用いる抽出溶媒としては、有機溶剤を含まないアルカリ性の水性溶媒であれば特に限定はなぐ例えば、無機塩基 (例えば、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウムなどのアルカリ金属の水酸ィ匕物；水酸ィ匕マグネシゥム、水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸ィ匕物;炭酸ナトリウム、炭酸力リウムなどのアルカリ金属の炭酸塩;炭酸マグネシウム、炭酸バリウムなどのアルカリ土類金属の炭酸塩;炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属の炭酸水素塩；炭酸アンモ-ゥム；アンモニアなど)を含むアルカリ性水溶液、有機塩基（例えば、酢酸ナトリウム、プロピオン酸カリウムなどのアルカリ金属の有機酸塩;ギ酸マグネシゥム、酢酸マグネシウムなどのアルカリ土類金属の有機酸塩；トリメチルァミン、ェチルァミン、ジェチルァミン、トリエチルァミン、プロピルァミン、ブチルァミン、ピペリジンなどのアミン類;ピリジンなどの含窒素複素環化合物など）を含むアルカリ性水溶液、及び陰イオン交換榭脂を含むアルカリ性の懸濁液を用いることができ、そのうち、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換榭脂懸濁液を好適に用いることができる。

[0019] 更には、抽出物を中和した場合に抽出物由来の沈殿物を生じにくぐ中和後の抽出液が発泡しにくいという事から、陰イオン交換榭脂懸濁液をより好適に用いることができる。

[0020] 抽出溶媒中の無機塩基、有機塩基又は陰イオン交換樹脂の含有量は、特に制限はなぐ抽出溶媒の pHが後述の範囲内になるよう、調整することができる。

[0021] また、抽出溶媒の pHはアルカリ性であれば特に限定されないが、好ましくは 8〜12 であり、より好ましくは 9〜 12である。

[0022] 抽出溶媒での処理温度は、テルペンィ匕合物を所望の量抽出できる温度であれば特に限定はなぐ例えば 4〜120°Cで処理する事ができる力短時間でより多くのテルペン化合物を抽出する事ができるという点で、高温で処理を行う事が好ましい。この様な処理温度としては、好ましくは 40〜120°Cであり、より好ましくは 80〜110°C であり、更に好ましくは 85〜105°Cであり、最も好ましくは、 90〜100°Cである。

[0023] 抽出溶媒での処理時間は、処理温度により異なる力例えば 4〜60°Cの処理温度の場合は、 16〜24時間、 90〜105°Cの処理温度の場合は 0. 5〜5時間が好適である。

[0024] 上記製造方法によって得られた抽出物を、酸により中和する工程を更に含むブナシメジ由来抽出物の製造方法も、本発明のブナシメジ由来抽出物の製造方法に包含される。中和に用いる酸としては、抽出物を食品に用いる場合には、食品添加物として用いられる酸が好ましい。食品添加物として用いられる酸としては、例えば、アジピン酸、クェン酸、ダルコン酸、コハク酸、酢酸及び酒石酸が挙げられる。そのうち、クェン酸が最も好適である。

[0025] また、上記の製造方法においては、さらに適当な乳化剤を添加する工程を含む事が好ましい。乳化剤による安定ィ匕により、水に難溶性のテルペン化合物の沈殿を抑える事ができ、また、製造工程における機械器具、副材料への吸着も抑えることができる。乳化剤の添加時期は、アルカリ性の水性溶媒による抽出前、抽出後、または抽出中のいずれのタイミングでもよぐ例えば、後述の実施例 4に記載の通り、抽出後に添加することが好ましい。また、乳化剤の添加後に上記の中和工程を施す事が好ましい。本発明に使用される乳化剤としては、特に限定はないが、例えばポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ステアロイル乳酸カルシウム、大豆由来レシチン、卵黄由来レシチン等が使用できる

[0026] 乳化剤の添加量は、特に制限はないが、例えば、抽出物 100重量部に対して、 0.

1〜3重量部であることが好ましい。

[0027] 上記製造方法によって得られた抽出物より、さらに抽出残渣を取り除く事により、本発明のブナシメジ由来抽出物が得られうる。抽出残渣を取り除く工程としては、遠心分離、濾過、限外濾過が例示されるが、大規模生産に適した濾過法をより好適に使用できる。濾過に際しては濾過助剤を用いる事ができ、濾過助剤としては Celite # 5 45が例示される。

[0028] 本発明において抽出物とは、抽出溶媒を用いて抽出操作を行う工程により得られる物質のことを言う。また、該物質にさらに濾過、遠心分離、濃縮、限外濾過、分子ふるい、中和等の処理を施して得られる物質も本発明の抽出物に包含される。また、上記物質を公知の方法で分画することによって得られる画分や、分画操作を複数回繰り返すことによって得られる画分も、本発明の抽出物に包含される。上記の分画手段としては、抽出、分別沈殿、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等が挙げられる。

[0029] 本発明において、本発明の抽出物の形状は特に限定はないが、粉状、固形状、液状のいずれの形状であっても良い。粉状とする場合、特に限定はないが、原料よりァルカリ性の水性溶媒により抽出された抽出物を濃縮し、さらにデキストリン、ショ糖脂肪酸エステル、乳糖等の賦形剤を添加し、乾燥、粉砕する事により、本発明の抽出物を得ることが出来る。また、当該抽出物を公知の方法で造粒して得た粒状の固形物を、本発明の抽出物として使用することもできる。造粒方法としては、特に限定はないが、転動造粒、攪拌造粒、流動層造粒、気流造粒、押出し造粒、圧縮成型造粒、解砕造粒、噴射造粒又は噴霧造粒等が例示される。また、液状の抽出物としては、前記抽出物の製造方法により得られた液体そのもの、その濃縮物や希釈物の他、前記の粉状の抽出物を液体、例えば水やアルコール等に溶解して液状としたものが例示される。

[0030] 本発明のブナシメジ由来抽出物は、ブナシメジ由来の生理活性成分である SBS等のテルペン化合物を多く含む事を特徴とし、例えば、乾固物換算で 0. 4重量％以上のテルペンィ匕合物を含む抽出物であり、より具体的には、乾固物換算で 0. 4重量％〜1. 0重量％のテルペン化合物を含む抽出物である。乾固物換算での重量％とは、液体をエバポレーター等で乾燥させた場合に得られる乾燥物全体の重量に占める、目的とする成分の重量を百分率で示した値のことを言う。

[0031] 本発明の食品は、上記のブナシメジ由来抽出物を含有する。本発明の食品は SBS 等のブナシメジ由来のテルペン化合物を多く含むため、血小板凝集抑制作用、抗発ガンプロモーター作用、及び抗癌作用を有することが期待できる。当該食品としては、例えば血小板凝集抑制作用、抗発ガンプロモーター作用、又は抗癌作用による所望の効果の発現のために用いられるものである旨の表示を付した健康食品（特定保健用食品）とすることもできる。

[0032] 本発明の食品の製造方法に特に限定はな!/、。たとえば、配合、調理、加工などは一般の食品のものに従えばよぐそれらの製造方法により製造することができ、得られた食品に本発明に係る前記抽出物が含有されていれば良い。また、本発明のブナシメジ由来抽出物そのものを食品としたものであっても良い。 [0033] なお、本発明の食品において「含有」とは、含有、添加および Zまたは希釈を意味する。ここで、「含有」とは食品中に本発明で使用される抽出物が含まれるという態様を、「添加」とは食品の原料に、本発明で使用される抽出物を添加するという態様を、「希釈」とは本発明で使用される抽出物に、食品の原料を添加するという態様をいうものである。

[0034] 本発明の食品は、特に限定するものではないが、例えば、穀物加工品（例、小麦粉加工品、デンプン類カ卩ェ品、プレミックス加工品、麵類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（例、可塑性油脂、てんぶら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（例、豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（例、ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（例、冷凍すりみ、力まぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等)、乳製品 (例、原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜 '果実カロェ品 (例、ペースト類、ジャム類、漬物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等)、菓子類 (例、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等)、アルコール類 (例、日本酒、中国酒、ワイン、ウィスキー、焼酎、ウォッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料 (例、緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、健康飲料、清涼飲料、乳酸飲料等)、調味料 (例、しょうゆ、ソース、酢、みりん等)、缶詰 '瓶詰'袋詰食品、半乾燥または濃縮食品 (例、レバーペースト、その他のスプレッド、そば.うどんの汁、濃縮スープ類等）、乾燥食品

(例、即席麵類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済食品、調理済飲料、調理済スープ等)、冷凍食品等が挙げられる。

[0035] 本発明の食品は、前記抽出物が含有されるものであれば特にその形状に限定はなぐタブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。また、前記抽出物にグリセリン等を添加して、前記抽出物が濃縮された健康食品とすることちでさる。

[0036] 本発明の食品中の前記抽出物の含有量は特に限定はなぐその官能と活性発現の観点力適宜設定できるが、例えば食品中における前記抽出物の乾燥重量で、 0 [0037] 本発明の食品は、ブナシメジ由来抽出物の苦味を押さえ、味をまろやかにできる事から、前述の抽出物の製造方法において、乳化剤を添加して得られたブナシメジ由来抽出物を使用することが好ましい。

[0038] なお、本発明の食品としては、テルペン化合物の体内への吸収が良いという点で、実施例 4に記載のような飲料が特に好適である

[0039] 本発明の医薬は、前記のブナシメジ由来抽出物を含有する。本発明の医薬としては、本発明に係る前記抽出物を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。

[0040] 本発明の医薬は、通常、前記抽出物を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより製造され、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カブセル剤等の固形剤や通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添カ卩によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることちでさる。

[0041] 医薬用担体は、本発明の医薬の投与形態および剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが担体として利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ハイドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよ!ヽ。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添カロしてもよい。なお、本発明の抽出物は経口投与によっても十分な効果を発揮することから、その投与の簡便性の観点力経口投与用の医薬とするの力好適な形態である

[0042] 一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記抽出物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。

[0043] 外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内)投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、口ーシヨン剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、ノップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。

[0044] 以上の各種製剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、力かる製剤における抽出物の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該抽出物を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。本発明の医薬中の前記抽出物の含有量としては、乾燥重量で 0. 1〜： LOO重量％程度である。

[0045] 本発明の医薬の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される前記抽出物量を乾燥重量で表した場合の投与量で、例えば成人 1日当り 1 g〜100mgZkg体重、好適には 5 μ g〜50mgZkg体重、さらに好適には g〜： LOmgZkg体重である。もちろん投与量は、種々の条件によつて変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、 1日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。また、本発明の医薬はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることちでさる。 [0046] 本発明のテルペン化合物の製造方法は、（a)ブナシメジ子実体又は菌糸体をアルカリ性の水性溶媒で処理し、ブナシメジ由来抽出物を得る工程、及び (b)工程 (a)により得られた抽出物カゝらテルペンィ匕合物を精製する工程を含む、テルペン化合物の製造方法である。当該製造方法において、（a)工程により得られた抽出物としては、前述の本発明のブナシメジ由来抽出物が例示される。また、当該テルペン化合物の製造方法においては、本発明のブナシメジ由来抽出物の製造方法と同様に、アル力リ性の水性溶媒としては、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰ィオン交換榭脂懸濁液を好適に用いることができ、抽出溶媒での処理温度は、テルべン化合物を所望の量抽出できる温度であれば特に限定はなぐ例えば 4〜120°Cで処理する事ができる。本発明のブナシメジ由来本発明のテルペンィ匕合物の製造方法は、ブナシメジ子実体又は菌糸体よりテルペンィ匕合物を豊富に含む抽出物を抽出する工程において有機溶媒を必要としない為、テルペンィ匕合物を安価に製造する事ができる。

[0047] 本発明のテルペン化合物の製造方法により製造され得るブナシメジ由来のテルべン化合物としては、特開平 4— 104795号に記載の物質 SBSが挙げられる。なお、この物質は沢辺らの文献（Sawabe A.他 3名， Journal of Mass Spectrometry , 1996年， Vol. 31, P921— 925)に記載されて!ヽる、 hvpsiziprenol Aと同一物

9 質である。また、 SBS以外の本発明のテルペンィ匕合物の製造方法により製造され得るテルペン化合物としては、前記沢辺らの文献に記載の、 hypsiziprenol A、 A 、

8 10

A 、A 、A 、A 、B、B、B 、： B 、C等のブナシメジ由来テルペン化合物が例

11 12 13 14 8 9 10 12 9

示される。

[0048] ブナシメジをアルカリ性の水性溶媒で処理する事により得られる抽出物よりテルべン化合物を精製する方法としては、公知の方法を用いる事ができ、抽出、分別沈殿、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、及びこれらの方法の組み合わせが挙げられる。カラムクロマトグラフィーとしては、高速液体クロマトグラフィーが例示され、本発明においては、逆相高速液体クロマトグラフィーを好適に用いる事ができる。実施例

[0049] 以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

[0050] 調製例 1 標準物質の調製

特開平 4— 104795号の実施例 1に記載の方法に従い、ブナシメジ由来抽出物の抽出、シリカゲルカラムによる精製、及び逆相高速液体クロマトグラフィーによる分画操作を行った。得られた画分のうち、画分 G、及び SBSを含む画分を HPLC,MS 法を用いて解析し、これら 2つの画分の精製物が、それぞれ異なる構造を持つテルペン化合物である事を確認した。なお、画分 Gは、沢辺らの文献（Sawabe A.他 3 名， Journal of Mass Spectrometry, 1996年， Vol. 31, P921— 925)に記載されている、 hypsiziprenol Aと同一物質であった。また、 SBSは、上記沢辺らの

8

文献に記載されている、 hypsiziprenol Aと同一物質であった。こうして得られた画

9

分 G、及び SBSの精製物を、それぞれブナシメジ由来テルペン化合物の標準物質 h vpsiziprenol A、及び SBSとした。

8

[0051] 実施例 1 アルカリ性溶媒による抽出 1

ブナシメジ（Lyophyllum ulmarium M— 8171)の子実体を Constant Temp erature Oven (Yamato社製）で十分乾燥させた後、乾燥物をクッキングミル（NA TIONAL社製）により粉砕し、ブナシメジ乾燥粉砕物を得た。次に該ブナシメジ乾燥粉砕物 5gに l%Na CO水溶液 (pHl l. 93) 0. 1Lをカ卩え、 95°Cで 3時間熱処理を

2 3

行った。熱処理後、 10, OOOr/min, 10分の遠心分離操作 (遠心分離装置 (TOM Y社製) )で不溶物を除き、得られた抽出物を逆相高速液体クロマトグラフィー (カラム = μ Bondapak C18 ΦΟ. 39 X 300mm (Waters社製）、溶媒 =メタノール：エタノール：水 = 3 :4 :4 (容量比）、流速 =0. 7mL/min,カラムオーブン温度 =40°C、検出波長 = 210nm)に付し、該抽出物に含まれるテルペン化合物量を定量した。定量には、前述の調製例で調製した 2種類のテルペンィ匕合物を標準物質として用いた。逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトパターンを図 1 Aに示す。図 1Aの縦軸は、吸光度（210nm)を、横軸は、溶出時間（分)を示す。

[0052] 比較例 1 蒸留水による抽出

l%Na CO水溶液に換えて蒸留水 (_PH6. 78)を用いる点を除いて、実施例 1と

2 3

同様の方法で抽出物を調製し、抽出物中のテルペン化合物量を定量した。逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトパターンを図 IBに示す。図 1Bの縦軸は、吸光度（210nm)、横軸は、溶出時間（分)を示す。

[0053] 比較例 2 KC1水溶液による抽出

l%Na CO水溶液に換えて 0. 15M KC1水溶液 (pH6.54)を用いる点を除い

2 3

て、実施例 1と同様の方法で抽出物を調製し、抽出物中のテルペンィ匕合物量を定量した。逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトパターンを図 1Cに示す。図 1Cの縦軸は、吸光度（210nm)、横軸は、溶出時間（分)を示す。

[0054] 比較例 3 酸性溶媒による抽出

l%Na CO水溶液に換えて 1%クェン酸水溶液 (pH2.46)を用いる点を除いて、

2 3

実施例 1と同様の方法で抽出物を調製し、抽出物中のテルペンィ匕合物量を定量した。逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られたクロマトパターンを図 1Dに示す。図 1Dの縦軸は、吸光度（210nm)、横軸は、溶出時間（分)を示す。

[0055] 実施例 1および比較例 1〜3のテルペン化合物量の定量結果を合わせて表 1に示す。

[0056] [表 1] 実施例 1 比較例 1 比較例 2 比較例 3

(抽出溶媒） ( 1 %Na₂C0₃) (蒸留水） (0.15M KCI) (1 %クェン酸） hy p s i z i p r e n o

25 定量限界以下定量暇界以下定量限界以下 1 A ₈ (n g/mL)

S B S (w g/mL) 1 17 定量限界以下定量限界以下定量限界以下テルペン化合物合計

142 定量限界以下定量限界以下定量限界以下 (. g/mL)

* hyp s i z i p r e n o l A₈ の定量下限は 5 /ι g/mL、 S B Sの定量下限は 5 i g /mLである。

[0057] 表 1の通り、蒸留水、 0.15M KC1、 1%クェン酸水溶液を抽出溶媒として用いた場合の抽出物（比較例 1〜3)は、テルペンィ匕合物含有量が定量限界以下であったのに対して、実施例 1の l%Na CO水溶液を抽出溶媒として用いた場合の抽出物

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は、 142 g/mLのテルペン化合物を含有していた。

[0058] 実施例 2 種々のアルカリ性溶媒による抽出と抽出物の中和

[0059] 実施例 2—1 Na CO水溶液による抽出実施例 1と同じ方法で抽出物を調製し、抽出物中の SBS量を定量した。続いて、該抽出物を食品又は飲料に用いるため、クェン酸粉末を加えて該抽出物を中和した。該中和後の抽出物にっ、て、デジタル糖度計 Palette (ATAGO社製)を用いて糖度を測定した。また、色調、発泡の有無及び沈殿の有無についても、目視で確認を行った。なお、色調については目視での確認の他に、分光光度計 UV—160A (島津製作所 (株)製)による測定も行った。

[0060] 実施例 2— 2 NaOH水溶液による抽出

0. IN NaOH水溶液 (pHll.52)を l%Na CO水溶液に換えて用いる点以外

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は実施例 1と同様の方法で抽出物を調製し、実施例 2—1と同様の方法で SBS含有量測定、中和、及び糖度測定を行い、色調、発泡、沈殿についても観察した。

[0061] 実施例 2— 3 陰イオン交換榭脂による抽出

5%イオン交換榭脂ダイヤイオン SA10AOH (日本鍊水社製)懸濁水 (ρΗΙΟ.54) を l%Na CO水溶液に換えて用いる点以外は実施例 1と同様の方法で抽出物を調

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製し、実施例 2— 1と同様の方法で SBS含有量測定、中和、及び糖度測定を行い、色調、発泡、沈殿についても観察した。実施例 2— 1〜実施例 2— 3の結果を合わせて表 2に示す。

[0062] [表 2] 実施例 2— 1 実施例 2 - 2 実施例 2— 3

(抽出溶媒） ( 1 %Na₂C0₃) (0. IN aOH) (陰イオン交換樹脂）色調赤褐色赤褐色黄褐色

(OD₄₂₀) (3. 30) (3. 56) (2. 43)

S B S濃度（μ g/mL) 1 27. 6 1 33. 9 1 1 0. 3 中和後の糖度（B r i x%) 4. 9 4. 4 2. 9

H (中和前） 1 0. 24 1 1. 5 2 1 0. 54 pH (中和後） 6. 54 6. 40 6. 52 発泡（中和後）ありなしなし沈殿（中和後）なしありなし

[0063] 表 2に示したとおり、いずれのアルカリ性抽出溶媒を用いた場合においても、 SBS を多く含む抽出物を得ることが出来た。また、抽出に陰イオン交換榭脂を用いた場合には、他のアルカリを用いた場合に比べて抽出物の糖含有量が少なぐ純度の比較的高い SBSを得ることが出来た。さらに、抽出に陰イオン交換榭脂を用いた場合には、抽出物を中和した後に発泡や沈殿が発生しな力つた。これは、抽出物の濃縮等、その後の取り扱!/、が容易であると!/、う点にお!、て、有利である。

[0064] 実施例 3 冷アルカリによる抽出

5%イオン交換榭脂ダイヤイオン SA10AOH (日本鍊水社製)懸濁水を用いて低温条件下（5°C、 24時間）で抽出した抽出物について、 5°C、 24時間処理を行う点以外は、実施例 2— 3と同様の方法で調製し、 SBS含有量の測定を行った。結果を表 3 に示す。

[0065] [表 3] 実施例 3 実施例 2— 3

(抽出溶媒） ( 5 2 4時間） ( 9 5 3時間）

S B S濃度（ /m L ) 6 1 . 6 1 1 0 . 3

[0066] その結果、 5°C、 24時間の抽出条件でも SBSを多量に含む抽出物を得られることが明らかとなったが、その SBS含有量は 95°C、 3時間処理を行った場合に比べて少ないものであった。

[0067] 実施例 4 テルペン化合物含有飲料の製造

ブナシメジの子実体を Constant Temperature Oven (Yamato社製）で十分乾燥させた後、乾燥物をクッキングミル (NATIONAL社製）により粉砕した。蒸留水 1リットルにブナシメジ粉砕物 50g及び熱水洗浄済みイオン交換榭脂ダイヤイオン SA10 AOH (日本鍊水社製） 50gを混合した。オートクレープを用い、設定温度 95°Cで 1時間ごとに撹拌を続け 3時間保温した。次いで冷却し、冷却物 1. 1リットルを得た。次いで 50メッシュ篩（目の開き 300 m)を用い、冷却物よりイオン交換榭脂を除去し、約 1リットルの上清液を調製した。上清液に大豆由来レシチンを 2g添加し、 30分室温で撹拌を行った。

[0068] 次いで、クェン酸を用いて pHを 10. 25力ら 6. 85に調整した。該 pH調整液より抽出残渣を取り除く為、上記 pH調整液 1リットルに 60グラムの濾過助剤 Celite # 545 を添カ卩した後、濾過助剤 Celite # 545を 3グラムでプレコートしたヌッチェで吸引濾過を行った。こうして得られた濾過液 850ミリリットルのブナシメジ由来抽出物を、テルべン化合物含有飲料とした。該飲料は、実施例 1〜3の抽出物と比べて、苦味の感じ方が軽減され、飲みやすい飲料であった。

[0069] 実施例 5 アルカリ性溶媒による抽出 2

実施例 1と同様の方法で、ブナシメジ乾燥粉砕物を得た。次に該ブナシメジ乾燥粉砕物 500gに蒸留水 10Lをカ卩え、熱水洗浄を 95°Cで 1時間行った。熱洗浄後、 4, 5 OOr/min, 30分の遠心分離操作 (遠心分離装置 (HITACHI社製)）により上清を除き、ブナシメジ子実体熱水洗浄物を得た。次に、ブナシメジ子実体熱水洗浄物に蒸留水 10Lおよび熱水洗浄済みイオン交換榭脂ダイヤイオン SA10AOH (日本鍊水社製） 500gを加え、 95°Cで 3時間熱処理を行った。熱処理後、 50メッシュ篩（目の開き 300 /z m)を用い、冷却物よりイオン交換榭脂を除去し、約 10リットルの上清液を調製した。上清液に大豆由来レシチンを 20g添加し、 30分室温で撹拌を行った。次ヽで、クェン酸を用、て pHを 9. 75力ら 6. 44に調整した。この pH調整液を 4, 500r Zmin、 20分の遠心分離操作 (遠心分離装置 (HITACHI社製) )で不溶物を除!、た。得られた pH調整液の上清 10リットルに 100グラムの濾過助剤 Silika # 600Sを添カロした後、濾過助剤 Silika # 600Sを 100グラムでプレコートしたヌッチェで吸引濾過を行った。こうして得られた濾過液 9500ミリリットルをロータリーエバポレーターで濃縮 ·凍結乾燥したものを、ブナシメジ由来抽出物とした。

[0070] 実施例 6 ブナシメジ由来抽出物の腫瘍増殖抑制活性

CDF1マウス (日本エスエルシー社）は、 6週齢の雌を購入して使用した。 IMC ca rcinoma (以下 IMC)腫瘍細胞は、 CDF1マウスの腹腔に移植して腹水をつくり、 7 日毎に別のマウスに移植して継代した。継代して 7日目の腹水を採取し、 PHOSPH ATE BUFFERED SALTS (タカラバイオ社)緩衝液で遠心洗浄後、同緩衝液に懸濁して細胞数カウント後、 5 X 10⁷個 ZmLとなるように調整した。この 0. lmLを CD F1マウスの右側腹部皮下に移植し、 7日後の固形腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさの平均が各群で均等になるように、 1群 10匹となるようにマウスを群分けした。

[0071] 次に、実施例 5のブナシメジ由来抽出物を重量比で 1. 4%となるよう、通常の粉末飼料 CE— 2に対して混ぜてマウスに与えた。また、比較対照として、ァガリタス由来抽出物 (仙生露エキスゴールド (サンドリー社)）を重量比で 2. 4%となるよう、粉末 C E— 2飼料に対して混ぜ、これを乾燥させてマウスに与えた。投与量は表 4のとおりである。コントロール群には CE 2のみを与えた。腫瘍の大きさは、 IMC細胞移植後 4 週目に測定した。また、腫瘍の大きさは長径と短径を測定し、以下の計算式にしたがつて体積を算出して比較した。 2回の実験を行った結果を表 4に示す。

[0072] 腫瘍体積 (mm³) = (長径） X (短径) ²/2

また、腫瘍抑制活性は、以下の計算式にしたがって算出した。

腫瘍抑制活性 (％) = (コントロール群の腫瘍体積抽出物投与群の腫瘍体積) Zコントロール群の腫瘍体積 X 100

[0073] [表 4] マウス腫瘍体積（an³) 腫瘍抑制活性実験番号

(投与群、投与量) (平均土標準誤差） (%)

1 CE— 2 (コントロール） 1 642 ± 1 93

ァガリクス由来抽出物、 3. 3 g/k g 1 352 + 2 54 1 7. 7 ブナシメジ由来抽出物、 2. 0 g/k g 944 ± 1 1 2 42. 5

2 CE- 2 (コントロ一ル） 1 239 + 228

アガリクス由来抽出物、 3. 3 g/k g 146 3 ± 3 53 - 1 8. 1 プナシメジ由来抽出物、 0. 2 g/k g 870 ± 1 6 9 29. 8 ブナシメジ由来抽出物、 2. 0 g/k g 6 1 8 ± 1 1 5 50. 1

[0074] その結果、比較対照のァガリタス由来抽出物を投与した群では、 IMC固形腫瘍増殖の抑制がほとんどみられな力つた。これに対して、ブナシメジ由来抽出物を投与した群では、いずれの実験においても IMC固形腫瘍増殖の抑制がみられた。

産業上の利用可能性

[0075] 本発明により、テルペンィ匕合物を豊富に含む、食品、医薬に適したブナシメジ由来抽出物を安価に製造する事ができる。また、本発明により、テルペンィ匕合物を安価に製造する事ができる。よって、本発明は食品や医薬分野において特に有用である。図面の簡単な説明

[0076] [図 1]図 1は、ブナシメジ由来抽出物の逆相クロマトグラフィーの結果を示す図である。図中 A、 B、 Cおよび Dは、それぞれアルカリ性溶媒による抽出、蒸留水による抽出、 KC1水溶液による抽出および酸性溶媒による抽出の結果を示す。

Claims

請求の範囲

[I] ブナシメジ子実体又は菌糸体よりブナシメジ由来抽出物を製造する方法であって、抽出溶媒としてアルカリ性の水性溶媒を用ヽる、ブナシメジ由来抽出物の製造方法

[2] 得られた抽出物を酸により中和する工程を含む、請求項 1記載の製造方法。

[3] さらに乳化剤を添加する工程を含む、請求項 1記載の製造方法。

[4] アルカリ性の水性溶媒力炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換榭脂懸濁液である、請求項 1記載の製造方法。

[5] 抽出溶媒での抽出が、 40〜120°Cの温度で行われる、請求項 1記載の製造方法。

[6] 請求項 1記載の製造方法で得られうる、ブナシメジ由来抽出物。

[7] テルペン化合物を乾固物換算で 0. 4重量％以上含む、請求項 6記載のブナシメジ由来抽出物。

[8] 請求項 6又は 7記載のブナシメジ由来抽出物を含有する食品。

[9] 請求項 6又は 7記載のブナシメジ由来抽出物を含有する医薬。

[10] 下記 (a)及び (b)の各工程を含む、テルペン化合物の製造方法

(a)ブナシメジ子実体又は菌糸体をアルカリ性の水性溶媒で処理し、ブナシメジ由来抽出物を得る工程；

(b)工程 (a)により得られた抽出物からテルペンィ匕合物を精製する工程。

[II] アルカリ性の水性溶媒力炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換榭脂懸濁液である、請求項 10記載の製造方法。

[12] アルカリ性の水性溶媒での処理が、 40〜120°Cの温度で行われる、請求項 10又は 11記載の製造方法。