WO2005108587A1 - Secuencia reguladora de la expresión de un gen en meristemos axilares de plantas y sus aplicaciones - Google Patents

Secuencia reguladora de la expresión de un gen en meristemos axilares de plantas y sus aplicaciones Download PDF

Info

Publication number
WO2005108587A1
WO2005108587A1 PCT/ES2005/070057 ES2005070057W WO2005108587A1 WO 2005108587 A1 WO2005108587 A1 WO 2005108587A1 ES 2005070057 W ES2005070057 W ES 2005070057W WO 2005108587 A1 WO2005108587 A1 WO 2005108587A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
plant
axillary
nucleotide sequence
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2005/070057
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Pilar CUBAS DOMÍNGUEZ
José Miguel MARTÍNEZ ZAPATER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Publication of WO2005108587A1 publication Critical patent/WO2005108587A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8229—Meristem-specific, e.g. nodal, apical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the invention relates, in general, to the genetic control of plant architecture, and, in particular, to a nucleic acid sequence that specifically regulates the expression of a gene of interest in axillary meristems and their Applications.
  • One of the objectives of genetic engineering is to obtain plants with improved characteristics. These characteristics depend, among other things, on the applications of the plants, and include, among others, the control of fruit ripening, improvements in the nutritional characteristics of the edible parts of the fruit, resistance to pests and plant diseases, etc. ., as well as the possibility of voluntarily manipulating the development of axillary meristems by promoting or inhibiting their growth so that the desired plant structures are generated.
  • axillary growth By inhibiting axillary growth, the growth of a plant on a single axis is promoted, which favors the generation of long stems with few knots as is desirable, for example, in woody species that are exploited for wood production , or in species that are grown at high density, such as certain grasses.
  • the "eyes" whose sprouting is harmful if the tuber is to be used as food, are axillary meristems.
  • the stems that sprout in onions and garlic, which reduce the quality of these products, also come from axillary meristems whose growth would be desirable to be able to inhibit.
  • axillary meristem formation is also important in vegetative propagation and in vitro culture.
  • a large part of the plant micropropagation industry is based on the ability of cytokinins to relax apical dominance, so that axillary meristems of plants of interest grow producing a large number of stems for cultivation.
  • axillary buds In certain woody species the control of the sprouting of axillary buds (whose physiological and hormonal regulation is comparable to that of herbaceous) is of great economic importance. In vines, cherry trees, apple trees and other woody, axillary buds require exposure to cold for days or weeks to sprout. These species have begun to be cultivated in warm countries (for example, Brazil or Thailand) where low temperatures are not usually reached, so that farmers are forced to use, to sprout the yolks, very toxic chemical treatments ( hydrocyanic acid, dinitro-orthocresol), or expensive hormonal treatments that are rapidly degraded and produce unwanted effects.
  • very toxic chemical treatments hydrocyanic acid, dinitro-orthocresol
  • Promoters with axillary expression have been described, which also have apical expression (for example SHOOT MERISTEMLESS ⁇ STM) and TERMINAL FLOWER (TFL)) or in floral meristems (for example, REVOLUTA (REV) or LATERAL SUPPRESSOR (LAS)). Promoters of this type of genes are not useful for manipulating branching patterns because, by altering the axillary development program, the apical or floral development is altered, thereby compromising the indeterminate growth of the plant or your fertility / reproductive development.
  • the invention aims to provide a regulatory sequence for the expression of a gene capable of specifically directing the expression of a gene of interest in axillary meristems but not in apical meristems.
  • a regulatory region of a gene of interest in axillary meristems but not in apical meristems.
  • Arabidopsis thaliana capable of controlling gene expression exclusively in axillary meristems and in the primordia of young leaves derived from them.
  • said A. thaliana regulatory region has a nucleotide sequence comprising the promoter of the A. thaliana BRANCHED 1 gene, and its counterparts from other species, and is capable of specifically targeting axillary but non-apical expression of A gene of interest.
  • Example 1 illustrates the axillary, but not apical, expression of GUS and GFP in A. thaliana, potatoes and tomato plants.
  • a promoter such as that provided by this invention allows genetically manipulating plants and obtaining plants with improved characteristics, such as plants with axillary but not apical expression of a gene of interest.
  • the use of said promoter allows manipulating the plant architecture by altering the growth or development of its axillary meristems.
  • the use of said promoter allows manipulating the development of axillary meristems by promoting or inhibiting their growth and / or causing the manipulated plant to generate structures different from those of the original plants (native or wild type) such as, for example , replace branches with flowers.
  • one of the advantages of having a promoter such as that provided by this invention is that it allows circumscribing the expression of the gene of interest to which it is expressed so that it is expressed only in the desired place (axillary meristem) to obtain the expected effect.
  • one aspect of this invention relates to a nucleotide sequence such as that shown in SEQ. ID. NO: 1, or a fragment thereof such as SEQ ID NO 4, or a nucleotide sequence substantially analogous to said sequences.
  • Said nucleotide sequence is capable of specifically directing the expression of a gene of interest in axillary meristems, without apical expression, which allows modifying the plant architecture of plants.
  • a further aspect of this invention relates to a nucleic acid construct comprising all or part of said nucleotide sequence and a gene of interest, as well as a recombinant vector containing said nucleotide sequence or said nucleic acid construct and a cell transformed with said recombinant vector.
  • Another additional aspect of this invention relates to the use of said nucleotide sequence in the production of transgenic cells and plants that have a modified plant architecture. The resulting transgenic cells and plants constitute another additional aspect of this invention.
  • Another additional aspect of this invention relates to a method for modifying the plant architecture (phenotype) of a plant that comprises transforming a plant with said nucleic acid or recombinant vector construct.
  • Another additional aspect of this invention relates to a method for inhibiting axillary growth of a plant that comprises transforming said plant with said nucleic acid construct or with said recombinant vector, wherein said gene of interest contained in said nucleic acid construct or in said recombinant vector it is a gene that codes for a peptide or protein useful for inhibiting axillary growth.
  • Another additional aspect of this invention relates to a method for promoting axillary growth of a plant comprising transforming said plant with said nucleic acid construct or with said recombinant vector, wherein said gene of interest contained in said nucleic acid construct or in said recombinant vector is a gene that codes for a peptide or protein useful for promoting axillary growth.
  • Another additional aspect of this invention relates to a method for stimulating the production of flowers instead of branches in a plant comprising transforming said plant with said nucleic acid construct or with said recombinant vector, wherein said gene of interest contained in said Nucleic acid construct or in said recombinant vector is a gene that encodes a peptide or protein useful for stimulating the formation of flowers instead of branches.
  • FIGURES Figure 1 schematically shows the BRC1 :: GUS ( Figure 1A) construction carried by the transgenic plants shown in Figures 3, 4 and 5, and the BRC1 :: GFP ( Figure IB) [BRC1-P , sequence of 1,736 bases of the promoter of the BRANCHED 1 gene of A. thaliana (SEQ. ID.
  • Figure 2 illustrates the wild expression of the A. thaliana BRANCHED 1 gene revealed by in situ hybridization.
  • Figure 2 A shows the cross section of a rosette of A.
  • FIG. 1 illustrates the GUS expression of the BRC1 :: GUS construct in axillary buds of A. thaliana.
  • Figure 3A shows a rosette of a flowering plant [the rosette leaves have been removed in order to observe the axillary (max) buds stained with GUS (note that the floral meristems (me) do not express the reporter gene (GUS))] .
  • Figure 3B shows the base of the rosette to which the main shaft has been removed.
  • Figure 3C shows an inflorescence of the same rosette in which the absence of expression of the GUS gene in floral meristems and apical meristem can be seen.
  • Figures 3D, 3E and 3F show axillary buds of different ages expressing GUS (note the absence of GUS expression on the sheet that supports them).
  • Figure 4 illustrates the GUS expression of the BRC1 :: GUS construct in axillary tomato buds.
  • Figures 4A, 4B, 4C and 4D illustrate progressively more advanced stages of an axillary tomato bud; Note that GUS accumulates in young buds that have not begun to elongar (A, and arrows in B, C and D) but not in buds that begin to elongar (asterisks in B, C, and D).
  • Figure 5 illustrates the GUS expression of the BRC1 :: GUS construct in axillary potato yolks.
  • Figure 5A shows an axillary stem bud.
  • Figure 5B shows a tuber.
  • Figure 5C shows a detail of the tuber shown in magnified 5B to visualize GUS expression.
  • nucleotide sequence hereinafter nucleotide sequence of the invention, selected from: a) a nucleotide sequence comprising the nucleotide sequence shown in SEQ. ID. NO: 1; b) a nucleotide sequence comprising the nucleotide sequence shown in SEQ. ID. NO: 4; c) a fragment of said SEQ. ID.
  • the nucleotide sequence of the invention is capable of directing the expression of a nucleic acid sequence of interest in axillary meristems in order to modify the plant architecture of a plant.
  • the nucleotide sequence of the invention comprises or is composed of the sequence shown in SEQ. ID. NO: 1, which corresponds to the nucleotide sequence of the promoter of the BRANCHED 1 gene of A. thaliana, specific to axillary meristems that allows axillary but non-apical expression of a gene of interest. Tests carried out by the inventors have shown that said sequence is capable of directing the expression of the GUS and GFP genes in axillary meristems of A.
  • nucleotide sequence of the invention is a fragment of said SEQ. ID. NO: 1, which maintains the ability to direct the expression of a gene of interest in axillary meristems.
  • said fragment has a size between 1 and 1.4 kb and retains the functionality and specificity of axillary expression of the promoter of the BRANCHED 1 gene of A. thaliana. It has been proven that SEQ ID NO 4 of 1,371 base pairs retains activity while with 1.0 kb it loses early expression so it will no longer work as well as the other ..
  • the nucleotide sequence of the invention is a nucleotide sequence that is substantially analogous to the nucleotide sequence defined in the Sections a) or b) or c) or d) previously defined.
  • analogous is intended to include any nucleotide sequence that has at least the ability to direct the expression of a nucleic acid sequence of interest in axillary meristems in order to modify the architecture of a plant.
  • said analog nucleotide sequence can be isolated from any organism producing said analog sequence based on the nucleotide sequence shown in SEQ. ID. NO: 1, or SEQ. ID. NO: 4 or is constructed based on the nucleotide sequence shown in the SEQ. ID. NO: 1 or SEQ. ID.
  • the analogous nucleotide sequence may be a fragment or sub-sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ. ID. NO: 1 or SEQ. ID. NO: 4.
  • said nucleotide sequence analogous may be a nucleotide sequence corresponding to a gene homologous to the BRANCHED 1 gene of A. thaliana in other plant species.
  • said analogous nucleotide sequence is substantially homologous to the nucleotide sequence identified as SEQ. ID. NO: 1 or a fragment thereof such as SEQ. ID. NO: 4.
  • the term "substantially homologous” means that the nucleotide sequences in question have a degree of identity, at the nucleotide level, of at least 60%, preferably of, at less than 75%, more preferably of at least 90%, and even more preferably of at least 95%.
  • the nucleotide sequence of the invention can be derived from any organism that contains it natively or from a host organism transformed with said nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequence of the invention can be isolated, by conventional techniques, from nucleic acid of any species that contains it by employing oligonucleotides or probes prepared from the information on the nucleotide sequence of the invention. Isolation and identification of a 1,736 base fragment of A. thaliana containing the nucleotide sequence of the invention, in particular SEQ. ID. NO: 1, was performed by cloning from a genomic clone of A. thaliana, as indicated in Example 1 (section 1.1 Materials and Methods).
  • the nucleotide sequence of the invention can act as a sequence capable of directing the expression of a gene of interest in axillary meristems in order to modify the plant architecture of a plant.
  • said plant is a plant of agronomic interest.
  • plant of agronomic interest refers to a plant that is grown to obtain a product of interest, for example, for human or animal consumption, or for its industrial, energy, etc. use. ..
  • said plant of agronomic interest includes own horticultural plants, such as garlic, potatoes, peppers, tomatoes, etc .; ornamental plants, such as roses, carnations, etc .; plants for upholstery of te ⁇ enos, such as herbs, grasses, etc .; plants for industrial applications, such as paper, wood, etc., for example, eucalyptus, oak, chestnut, etc .; plants for energy applications, for example, sorghum, sunflower, poplars, etc.
  • own horticultural plants such as garlic, potatoes, peppers, tomatoes, etc .
  • ornamental plants such as roses, carnations, etc .
  • plants for upholstery of te ⁇ enos such as herbs, grasses, etc .
  • plants for industrial applications such as paper, wood, etc., for example, eucalyptus, oak, chestnut, etc .
  • plants for energy applications for example, sorghum, sunflower, poplars, etc.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used in the development of a nucleic acid construct that also includes a gene of interest useful for controlling the architecture of a plant by its expression in the axillary meristems of a plant.
  • Said nucleic acid construct in turn, can be integrated into a recombinant vector, such as an expression vector.
  • a recombinant vector such as an expression vector.
  • nucleic acid constructs provided by this invention may also contain other elements that regulate the expression of said gene of interest depending, for example, on the recombinant vector used, etc.
  • Said nucleic acid constructs which contain the nucleotide sequence as a common denominator of the invention, as well as the use thereof for the transformation of plants form part of the present invention. Therefore, the invention provides a nucleic acid construct comprising the nucleotide sequence of the invention operably linked to a gene of interest useful for controlling the plant architecture of a plant.
  • the expression "gene of useful interest to control the plant architecture of a plant” refers to any gene that allows to control or modify the plant architecture of a plant as a result of its expression in the apical meristems of plants, such as genes encoding peptides or proteins useful for inhibiting axillary growth, or genes encoding peptides or proteins useful for promoting axillary growth, or genes encoding peptides or proteins useful for stimulating formation or generation of flowers instead of branches.
  • said gene of interest useful for controlling the plant architecture of a plant is a gene that codes for a peptide or protein useful for inhibiting axillary growth, for example, the gene that codes for the A chain of diphtheria toxin or the gene that codes for barnase, both very effective products in cellular ablations in plants.
  • the gene that codes for the A chain of diphtheria toxin could be used, for example, in ornamental plants with flowers in which longer stems and with fewer branches are desirable (eg, roses and carnations), while barnose, a RNasa is more recommended for use in species for consumption.
  • axillary growth is inhibited, promoting the growth of a plant on a single axis, which favors the generation of long stems with few knots as is desirable, for example, in woody species that are they explode to produce wood, or in species that are grown at high density, such as certain grasses, as well as in certain species grown for food purposes, such as potatoes, where the sprouting of "eyes" is minimized or eliminated; garlic and onions, where the sprouting of stems is minimized or eliminated, which reduce the quality of these products; tomatoes, where the formation of branches during flowering and fruit formation is minimized or reduced, which allows the concentration of nutrient intake during tomato development; etc.
  • said gene of interest useful for controlling the plant architecture of a plant is a gene encoding a useful peptide or protein.
  • a useful peptide or protein to promote axillary growth, for example, the gene that codes for isopentenyl synthase, a key gene in the synthesis of cytokinins in Agrobacterium whose overexpression increases cytokinin levels in plants, the gene that codes for cyclin D3 that exerts the same effect on meristems, etc.
  • a sense-antisense construction of the endogenous BRANCHED 1 gene of the coresponding species would direct the degradation of said gene by promoting the development of branches. Cytokinins are hormones involved, among other processes, in the formation of meristems.
  • axillary buds require exposure to cold days or weeks to sprout.
  • Using a nucleic acid construct provided by this invention in these cases it is possible to sprout the yolks and cultivate these species in countries warm (which do not usually reach low temperatures) without resorting to conventional chemical treatments (very toxic, based on the use of hydrocyanic acid or dinitro-orthocresol), or hormonal (very expensive, rapidly degrading and producing unwanted effects ).
  • said gene of interest useful for controlling the plant architecture of a plant is a gene that encodes a peptide or protein useful for stimulating the formation or generation of flowers instead of branches, for example, the LEAFY gene (LFY ) or the APÉTALA 1 (API) gene that allows the branches to be replaced by flowers without preventing the indeterminate growth of the plant (when expressed in axillary positions and does not do so in a generalized way or in apical meristem).
  • the LFY gene and, to some extent the API gene are necessary and sufficient to determine the identity of floral meristems [Yanofsky, M. Floral meristems to floral organs: genes controlling early events in Arabidopsis flower development. Annu Rev.
  • a nucleic acid construct comprising the GUS gene (BRC1 :: GUS) or the gene encoding the GFP (BRC1 :: GFP) has been prepared under the control of the nucleotide sequence of the invention for evaluate the specificity of the expression of said gene in axillary meristems (Example 1).
  • the nucleic acid construct provided by this invention may also contain, operably linked, expression regulating elements. functional in plants, for example, a sequence of transcription termination, etc.
  • the nucleotide sequence of the invention, or the nucleic acid construct provided by this invention can be inserted into an appropriate vector.
  • the invention also relates to a recombinant vector, such as an expression vector, comprising said nucleotide sequence of the invention, or said nucleic acid construct.
  • a recombinant vector such as an expression vector
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the recombinant vector where said nucleotide sequence of the invention is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of said cell and replicated together with the chromosome (or chromosomes) in which (or in which) it has been integrated.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrook et al., 1989, cited supra].
  • the invention also provides a host cell, such as a transformed cell, comprising a nucleotide sequence of the invention, or a nucleic acid construct containing said nucleotide sequence or said recombinant vector mentioned above.
  • the host cells that can be transformed with the nucleotide sequence of the invention can be prokaryotic cells or, preferably, eukaryotic cells, such as plant tissue cells.
  • the transformation of plant tissue cells can also be carried out by conventional methods.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used to transform plants of agronomic interest and obtain transformed plants that have a modified architecture.
  • the transformation of plants is widely described in the state of the art.
  • multiple systems can be used, for example, plasmid vectors, liposomes, electroporation, microinjection, particle bombardment (gene gun), calcium phosphate coprecipitation, use of viral vectors, etc.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used to direct the expression of a nucleic acid sequence of interest in axillary meristems in order to modify the architecture of the plant.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used to manipulate plants in order to introduce in them some characteristic of agronomic interest, such as, for example, a modified plant architecture.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used to inhibit or promote axillary growth or to stimulate the generation of flowers instead of branches.
  • the invention relates to a transgenic cell comprising, inserted in its genome, a nucleotide sequence of the invention, as well as a transgenic plant comprising at least one of said transgenic cells.
  • Said transgenic plants, which constitute a further object of the invention can be obtained by using conventional techniques, for example, using binary vectors or other vectors available for the different currently existing plant transformation techniques.
  • the invention provides a method for producing a transgenic plant comprising transforming said plant with a nucleic acid construct provided by this invention, said nucleic acid construct comprising a gene of interest useful for controlling the plant architecture of plants. , under the control of the nucleotide sequence of the invention, so that the expression of said gene of interest makes it possible to control or modify the plant architecture of plants, such modification constitutes an improved characteristic in said plant.
  • the resulting plant can be used for the production of new plants that retain these improved characteristics.
  • Non-limiting examples of plants to be transformed include all types of plants of agronomic interest, for example, horticultural plants, ornamental plants, plants for upholstery of plants, plants for industrial applications, plants for energy applications, etc.
  • the invention also provides a method for modifying the plant architecture (phenotype) of a plant comprising transforming said plant with a nucleic acid construct provided by this invention, or with a recombinant vector provided by this invention, said nucleic acid construct or said vector comprising a gene of interest useful for controlling the plant architecture of plants, under the control of the nucleotide sequence of the invention, so that the expression of said gene of interest in axillary meristems allows controlling or modifying the phenotype (plant architecture) of said transformed plant.
  • the invention in another aspect, relates to a method for inhibiting axillary growth of a plant comprising transforming said plant with a nucleic acid construct provided by this invention or with a recombinant vector provided by this invention, wherein said gene of interest contained in said nucleic acid construct or in said recombinant vector, under the control of the nucleotide sequence of the invention, is a gene that encodes a peptide or protein useful for inhibiting axillary growth, such as the barnase gene or the chain A gene of the diphtheria toxin, so that the expression of said gene of interest in axillary meristems allows to inhibit the axillary growth of said transformed plant.
  • the invention relates to a method for promoting axillary growth of a plant comprising transforming said plant with a nucleic acid construct provided by this invention or with a recombinant vector provided by this invention, wherein said gene of interest contained in said nucleic acid construct or in said recombinant vector, under the control of the nucleotide sequence of the invention, is a gene that encodes a peptide or protein useful for promoting axillary growth, such as the isopentenyl synthase gene or the gene that codes for cyclin D3, so that the expression of said gene of interest in axillary meristems allows to promote the axillary growth of said transformed plant.
  • the invention relates to a method for stimulating the production or generation of flowers instead of branches in a plant comprising transforming said plant with a nucleic acid construct provided by this invention or with a recombinant vector provided by this invention.
  • said gene of interest contained in said nucleic acid construct or in said recombinant vector, under the control of the nucleotide sequence of the invention is a gene that encodes a peptide or protein useful for stimulating the production or generation of flowers instead of branches in a plant, such as the LFY gene or the API gene, so that the expression of said gene of interest in axillary meristems allows to stimulate the production or generation of flowers instead of branches in said transformed plant.
  • the advantages associated with this method have been mentioned previously when dealing with the gene of useful interest to control the plant architecture of a plant, in particular the gene that codes for a peptide or protein useful for stimulating the production or generation of flowers instead of branches in a plant.
  • the following examples illustrate the invention and should not be considered as limiting its scope.
  • a genomic DNA fragment containing the promoter of the BRANCHED 1 gene from A. thaliana constructs containing the GUS and GFP reporter genes under the control of said fragment; and transformation of plants with said constructs 1.1 Materials and Methods
  • a polymerase chain reaction PCR was performed with the enzyme Pwo (Roche Diagnostics) on TAC DNA K24M9 [Transformation-competent bacterial Artificial Chromosome, vector containing a region of 45,292 base pairs of DNAg of chromosome 3 of A.
  • thaliana that includes the coding area and the promoter of the BRANCHED gene 1] (Nottingham Stock Center) using initiators A and B, identified respectively as SEQ. ID. NO: 2 and SEQ. ID. NO: 3, following the recommendations of Roche Diagnostics.
  • the PCR reaction was carried out under the following conditions: (i) Denaturation at 94 degrees for 2 minutes; (ii) 35 cycles of: Denaturation a 94 ° C for 15 seconds, Hybridization at 57 ° C for 30 seconds, and Elongation at 72 ° C for 2 minutes; and (iii) Termination at 72 ° C for 10 minutes.
  • primers contain in position 5 'attBl and attB2 sites, respectively, which allow the fragment to be used in Gateway technology [Gateway TM Cloning Technology (Life Technologies, Invitrogen Corporation)].
  • This technology uses the specific recombination of att sequences from the lambda phage to transfer DNA fragments from one cloning vector to another (http: //www.invitrogen.eom/Content/Online%20Seminars/gateway/2.htm).
  • the PCR product was purified by a Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) column and recombined, by a BP reaction (specific recombination between attB and attP sites mediated by the enzymatic mixture "Gateway BP clone") with the plasmid pDONR207 which It has attP recombination sites (all details of this plasmid can be found in "http://www.lifetech.com” TECH-ONLINE TM section).
  • a Qiaquick PCR purification kit Qiagen
  • thaliana BRANCHED 1 gene the cloned fragment (ABI System, Perkin Elmer) was sequenced and the sequence was found to be identical to that described in the Arabidopsis genome database. Once sequenced, the resulting plasmid was recombined by an LR reaction (specific recombination between attL and attR sites mediated by the "LR clonase" enzymatic mixture of Gateway TM Cloning Technology) with plasmids pGWB3 and pGWB4 provided by Tsuyoshi Nakagawa (Shimane University , Japan) [Plant Biology 2003: Friday, July 25 - Wednesday July 30, 2003 - Honolulu, Hawaii, United States, organized by The American Society of Plants Biologists, Abstract # 935 "Gateway Binary Vectors (pGWBs) - Application and improved pGWBs ", Tsuyoshi Nakagawa et al.].
  • LR reaction specific recombination between attL
  • Said plasmids pGWB3 and pGWB4 contain attR sequences that allowed recombining the approximately 1.7 kb fragment to the beta glucuronidase (GUS) and green fluorescent protein (GFP) reporter genes, respectively.
  • the resulting plasmids contain the BRANCHED 1 gene promoter fused to GUS and GFP respectively (BRC1 :: GUS and BRC1 :: GFP constructs).
  • transgenic potato and tomato plants were obtained by known methods: (http://www.potatogenome.org/nsf3/protocols/potato_traiisl.php): to obtain transgenic potato plants; and (http://www.potatogenome.org/nsf3/protocols/microtom__trans.php): to obtain transgenic tomato (microtom) plants.
  • a region of 1,736 bases has been defined in the 5 'region of the A. thaliana BRANCHED 1 gene that faithfully reproduces the expression of BRANCHED 1 in axillary meristems and leaf primordia formed by these meristems. Said fragment has the nucleotide sequence shown in SEQ. ID. NO: 1. To verify that said fragment reproduces the expression of the BRANCHED 1 gene, fusions of a 1,736 base fragment located at the 5'-ATG position of the A. thaliana BRANCHED 1 gene were performed with the GUS and GFP gene ( Figure 1 ) and it was verified that said expressions controlled by that fragment are comparable to the wild expression pattern of BRANCHED 1 in A.
  • a regulatory region of A. thaliana has been defined, capable of controlling gene expression exclusively in axillary meristems and in the primordia of young leaves derived from them.
  • the characterization of a specific promoter of axillary meristems is of great importance as it allows the manipulation of plant architecture by altering the growth or development of its axillary meristems.
  • the axillary expression promoters described to date also have apical expression (eg, STM, TFL), that is, they are genes that are expressed in all meristems.
  • the promoter provided by this invention which distinguishes axillary positions, therefore allows expressing genes of interest in this position without affecting the subsequent development of the plant.
  • BRANCHED 1 of A. thaliana constructs containing the GUS and GFP reporter genes under the control of said fragment; and transformation of plants with said constructs
  • This product was purified in the same way by means of a Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) column and recombined, by means of a BP reaction (specific recombination between attB and attP sites mediated by the enzymatic mixture "Gateway BP clone") with the plasmid pDONR207 which has attP recombination sites (all the details of this plasmid can be found in "http://www.lifetech.com” TECH-ONLINE TM section).
  • Qiaquick PCR purification kit Qiagen
  • thaliana BRANCHED 1 gene the cloned fragment (ABI System, Perkin Elmer) was sequenced and the sequence was found to be identical to the described in the Arabidopsis genome database. Once sequenced, the resulting plasmid was recombined by an LR reaction (specific recombination between attL and attR sites mediated by the "LR clonase" enzymatic mixture of Gateway TM Cloning Technology) with plasmids pGWB3 and pGWB4 provided by Tsuyoshi Nakagawa (Shimane University , Japan) [Plant Biology 2003: Friday, July 25 - Wednesday July 30, 2003 - Honolulu, Hawaii, United States, organized by The American Society of Plants Biologists, Abstract # 935 "Gateway Binary Vectors (pGWBs) - Application and improved pGWBs" , Tsuyoshi Nakagawa et al.].
  • LR reaction specific recombination between att
  • Said plasmids pGWB3 and pGWB4 contain attR sequences that allowed recombining the approximately 1.7 kb fragment to the beta glucuronidase (GUS) and green fluorescent protein (GFP) reporter genes, respectively.
  • the resulting plasmids contain the BRANCHED 1 gene promoter fused to GUS and GFP respectively (BRC2 :: GUS and BRC2 :: GFP constructs). These constructions were introduced in A. thaliana plants using the "floral dip" method (Clough and Bent (1998) Plant Journal 16: 735-743) to generate transgenic plants.
  • transgenic potato and tomato plants were obtained by known methods: (http://www.polalogenome.org/ns ⁇ /protocols/potato_transl.php): to obtain transgenic potato plants; and (http://www.potatogenome.org/nsf3/protocols/microtom__trans.php): to obtain transgenic tomato (microtom) plants.
  • a region of 1,371 bases has been defined in the 5 'region of the A. thaliana BRANCHED 1 gene that faithfully reproduces the expression of BRANCHED 1 in axillary meristems and leaf primordia formed by these meristems.
  • Said fragment has the nucleotide sequence shown in SEQ. ID. NO: 4.
  • fusions of a 1,371 base fragment located at the 5'del position of the A. thaliana BRANCHED 1 gene were performed with the GUS and GFP gene in the same way that in example 1 ( Figure 1) and it was verified that said expressions controlled by that fragment are comparable to the wild pattern of expression of BRANCHED 1 in A.
  • axillary expression promoters described to date also have apical expression (eg, STM, TFL), that is, they are genes that are expressed in all meristems.
  • STM, TFL apical expression
  • the promoter provided by this invention which distinguishes axillary positions, therefore allows expressing genes of interest in this position without affecting the subsequent development of the plant.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Se ha identificado una secuencia de aproximadamente 1,7 kilobases que comprende el promotor del gen BRANCHED 1 de Arabidopsis thaliana capaz de dirigir específicamente la expresión axilar pero no apical de un gen de interés. El empleo de dicha secuencia permite manipular genéticamente las plantas y obtener plantas con arquitectura vegetal modificada debido a una alteración en el crecimiento o desarrollo de sus meristemos axilares, por ejemplo, promoviendo o inhibiendo el desarrollo de los meristemos axilares y/o reemplazando ramas por flores.

Description

TÍTULO
SECUENCIA REGULADORA DE LA EXPRESIÓN DE UN GEN EN MERISTEMOS AXILARES DE PLANTAS Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona, en general, con el control genético de la arquitectura de las plantas, y, en particular, con una secuencia de ácido nucleico que regula específicamente la expresión de un gen de interés en meristemos axilares y con sus aplicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Uno de los objetivos de la ingeniería genética es el de obtener plantas con características mejoradas. Estas características dependen, entre otras cosas, de las aplicaciones de las plantas, e incluyen, entre otras, el control de la maduración del fruto, mejoras en las características nutricionales de las partes comestibles del fruto, resistencia a plagas y enfermedades de plantas, etc., así como la posibilidad de manipular voluntariamente el desarrollo de los meristemos axilares promoviendo o inhibiendo su crecimiento de manera que se generen las estructuras vegetales deseadas. Mediante la inhibición del crecimiento axilar se promueve el crecimiento de una planta en un único eje, con lo que se favorece la generación de tallos largos y con pocos nudos tal como es deseable, por ejemplo, en especies leñosas que se explotan para producción de madera, o en especies que se cultivan a alta densidad, tales como ciertas gramíneas. En patata, los "ojos" cuya brotación es perjudicial si el tubérculo se va a emplear como alimento, son meristemos axilares. Los tallos que brotan en cebollas y ajos, que reducen la calidad de estos productos, también proceden de meristemos axilares cuyo crecimiento sería deseable poder inhibir. En tomate, durante la floración y formación de los frutos, las ramas que se forman por brotación de meristemos axilares, son cortadas a mano para concentrar el aporte de nutrientes durante el desarrollo del tomate. Asimismo, favoreciendo el crecimiento de los meristemos axilares se promueve el crecimiento axilar y se pueden generar arquitecturas arbustivas y aumentar, además, la producción de hojas y flores, elementos apreciados en especies ornamentales o en aquellas especies en las que las hojas o los frutos son los productos de consumo. El incremento de la formación de retoños tiene, además, gran interés en especies que se utilizan para el tapizado de terrenos, en las que se valora el crecimiento compacto, por ejemplo, las gramíneas de césped o pasto. También tiene un gran valor ecológico poder fomentar el crecimiento intercalar en especies rastreras adaptadas a terrenos áridos amenazados por la erosión en los que la hierba resulta costosa de mantener. El control de la formación de meristemos axilares también tiene importancia en la propagación vegetativa y el cultivo in vitro. A modo ilustrativo, una gran parte de la industria de micropropagación de plantas está basada en la capacidad de las citoquininas para relajar la dominancia apical, de forma que los meristemos axilares de las plantas de interés crecen produciendo un gran número de tallos para su cultivo. Estos tratamientos sistémicos tienen efectos indeseados tales como la supresión de formación y crecimiento de raíces, que se podrían evitar induciendo genes con efecto local sobre el crecimiento axilar. En ciertas especies de leñosas el control de la brotación de las yemas axilares (cuya regulación fisiológica y hormonal es comparable a la de herbáceas) tiene gran importancia económica. En vides, cerezos, manzanos y otras leñosas, las yemas axilares requieren una exposición al frío de días o semanas para brotar. Estas especies se han empezado a cultivar en países cálidos (por ejemplo, Brasil o Tailandia) en los que no se suelen alcanzar temperaturas bajas, por lo que los agricultores se ven obligados a emplear, para hacer brotar las yemas, tratamientos químicos muy tóxicos (ácido cianhídrico, dinitro-ortocresol), o costosos tratamientos hormonales de rápida degradación y que producen efectos no deseados. El problema suscita tanto interés y moviliza tal cantidad de recursos económicos que, anualmente, en el Congreso Internacional de Ciencias Agrícolas (ISHS) se celebra un symposium para el estudio del bud break o brotación de yemas (http://www.actahort.org/books/395/395_15.htm). Para manipular y controlar de forma estable una determinada característica de una planta se requiere, por una parte, identificar y aislar el gen o genes que codifican o regulan dicha característica particular, y, además, identificar y aislar los elementos genéticos esenciales para la expresión y/o control del gen o genes aislados para que la planta manifieste dicha característica de forma controlada o controlable. Entre dichos elementos genéticos esenciales se encuentran los elementos de control de la transcripción conocidos como promotores. Se han descrito promotores con expresión axilar, que también tienen expresión apical (por ejemplo SHOOT MERISTEMLESS {STM) y TERMINAL FLOWER (TFL)) o en meristemos florales (por ejemplo, REVOLUTA (REV) o LATERAL SUPPRESSOR (LAS)). Los promotores de este tipo de genes no tienen utilidad para manipular los patrones de ramificación porque, al alterar el programa de desarrollo axilar, se altera, a su vez, el del desarrollo apical o floral comprometiendo de esta forma el crecimiento indeterminado de la planta o su fertilidad/desarrollo reproductivo. La identificación de promotores específicos de expresión axilar pero no apical es crítica para la introducción de las características específicas previamente mencionadas en las plantas, en particular, para manipular el desarrollo de los meristemos axilares promoviendo o inhibiendo su crecimiento de manera que se generen las estructuras vegetales deseadas. Existe, por tanto, la necesidad de identificar promotores que distingan las posiciones axilares vegetativas y permitan expresar específicamente en meristemos axilares, sin expresión en meristemos apicales o axilares florales, genes de interés sin alterar el posterior desarrollo de la planta. La caracterización de un promotor específico de meristemos axilares vegetativos es de gran importancia aplicada ya que permite expresar en posición axilar, pero no apical, genes de interés sin afectar con ello el crecimiento apical o la fertilidad de la planta.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención tiene por objeto proporcionar una secuencia reguladora de la expresión de un gen capaz de dirigir específicamente la expresión de un gen de interés en meristemos axilares pero no en meristemos apicales. Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, una región reguladora de
Arabidopsis thaliana capaz de controlar la expresión de genes exclusivamente en meristemos axilares y en los primordios de hojas jóvenes derivados de ellos. En una realización particular, dicha región reguladora de A. thaliana tiene una secuencia de nucleótidos que comprende el promotor del gen BRANCHED 1 de A. thaliana, y sus homólogos de otras especies, y es capaz de dirigir específicamente la expresión axilar pero no apical de un gen de interés. El Ejemplo 1 ilustra la expresión axilar, pero no apical, de GUS y GFP en A. thaliana, patatas y plantas de tomate. El empleo de un promotor como el proporcionado por esta invención permite manipular genéticamente las plantas y obtener plantas con características mejoradas, tales como plantas con expresión axilar pero no apical de un gen de interés. De hecho, el empleo de dicho promotor permite manipular la arquitectura vegetal alterando el crecimiento o desarrollo de sus meristemos axilares. A modo ilustrativo, el empleo de dicho promotor permite manipular el desarrollo de los meristemos axilares promoviendo o inhibiendo su crecimiento y/o hacer que la planta manipulada genere estructuras distintas a las de las plantas originales (nativas o tipo silvestre) tal como, por ejemplo, reemplazar ramas por flores. Una de las ventajas de disponer de un promotor como el proporcionado por esta invención radica en que permite circunscribir la expresión del gen de interés al que antecede para que éste se exprese sólo en el lugar deseado (meristemo axilar) para obtener el efecto esperado. Por consiguiente, un aspecto de esta invención se relaciona con una secuencia de nucleótidos tal como la mostrada en la SEQ. ID. NO: 1, o un fragmento de la misma como la SEQ ID NO 4, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente análoga a dichas secuencias. Dicha secuencia de nucleótidos es capaz de dirigir específicamente la expresión de un gen de interés en meristemos axilares, sin expresión apical, lo que permite modificar la arquitectura vegetal de las plantas. El empleo de dicha secuencia de nucleótidos para obtener células y plantas transgénicas constituye un aspecto adicional de esta invención. Un aspecto adicional de esta invención se relaciona con una construcción de ácido nucleico que comprende la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos y un gen de interés, así como un vector recombinante que contiene dicha secuencia de nucleótidos o dicha construcción de ácido nucleico y una célula transformada con dicho vector recombinante. Otro aspecto adicional de esta invención se relaciona con el empleo de dicha secuencia de nucleótidos en la producción de células y plantas transgénicas que presentan una arquitectura vegetal modificada. Las células y plantas transgénicas resultantes constituyen otro aspecto adicional de esta invención. Otro aspecto adicional de esta invención se relaciona con un método para modificar la arquitectura vegetal (fenotipo) de una planta que comprende transformar una planta con dicha construcción de ácido nucleico o vector recombinante. Otro aspecto adicional de esta invención se relaciona con un método para inhibir el crecimiento axilar de una planta que comprende transformar dicha planta con dicha construcción de ácido nucleico o con dicho vector recombinante, en donde dicho gen de interés contenido en dicha construcción de ácido nucleico o en dicho vector recombinante es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para inhibir el crecimiento axilar. Otro aspecto adicional de esta invención se relaciona con un método para promover el crecimiento axilar de una planta que comprende transformar dicha planta con dicha construcción de ácido nucleico o con dicho vector recombinante, en donde dicho gen de interés contenido en dicha construcción de ácido nucleico o en dicho vector recombinante es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para promover el crecimiento axilar. Otro aspecto adicional de esta invención se relaciona con un método para estimular la producción de flores en lugar de ramas en una planta que comprende transformar dicha planta con dicha construcción de ácido nucleico o con dicho vector recombinante, en donde dicho gen de interés contenido en dicha construcción de ácido nucleico o en dicho vector recombinante es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para estimular la formación de flores en lugar de ramas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra esquemáticamente la construcción BRC1::GUS (Figura 1A) que portan las plantas transgénicas mostradas en las Figuras 3, 4 y 5, y la construcción BRC1::GFP (Figura IB) [BRC1-P, secuencia de 1.736 bases del promotor del gen BRANCHED 1 de A. thaliana (SEQ. ID. NO: 1); HPT, gen de resistencia a higromicina; NPTII, gen de resistencia a kanamicina; Nos-P, promotor del gen de la nopalina sintasa; Nos-T, terminador del gen de la nopalina sintasa; 35S, promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV); GUS, gen de la beta-glucuronidasa; GFP, gen de la proteína verde fluorescente (Green Fluorescent Protein); L, brazo izquierdo (left border); R, brazo derecho (right border); se indican, además, los sitios únicos de restricción HindIII y Sacl]. La Figura 2 ilustra la expresión silvestre del gen BRANCHED 1 de A. thaliana revelado mediante hibridación in situ. La Figura 2 A muestra la sección transversal de una roseta de A. thaliana poco después de la transición floral; el mRNA del gen BRANCHED 1 se visualiza en un color pardo en meristemos axilares vegetativos (flechas negras) pero no en meristemos florales o en meristemo apical (flecha sin relleno). La Figura 2B muestra un detalle de dos meristemos vegetativos jóvenes que acumulan altos niveles de mRNA del gen BRANCHED 1. La Figura 2C muestra un detalle de un meristemo que ya ha producido un par de primordios de hoja donde también se expresa el gen BRANCHED 1. La Figura 3 ilustra la expresión GUS de la construcción BRC1::GUS en yemas axilares de A. thaliana. La Figura 3A muestra una roseta de una planta en floración [las hojas de roseta han sido retiradas para poder observar las yemas axilares (max) teñidas con GUS (nótese que los meristemos florales (mí) no expresan el gen delator (GUS))]. La Figura 3B muestra la base de la roseta a la que se le ha retirado el eje principal. La Figura 3C muestra una inflorescencia de la misma roseta en la que se aprecia la ausencia de expresión del gen GUS en los meristemos florales y meristemo apical. Las Figuras 3D, 3E y 3F muestran yemas axilares de distintas edades expresando GUS (nótese la ausencia de expresión GUS en la hoja que los sustenta). La Figura 4 ilustra la expresión de GUS de la construcción BRC1::GUS en yemas axilares de tomate. Las Figuras 4A, 4B, 4C y 4D ilustran estadios progresivamente más avanzados de una yema axilar de tomate; nótese que se acumula GUS en las yemas jóvenes que no han empezado a elongar (A, y flechas en B, C y D) pero no en yemas que comienzan a elongar (asteriscos en B, C, y D). La Figura 5 ilustra la expresión de GUS de la construcción BRC1::GUS en yemas axilares de patata. La Figura 5A muestra una yema axilar del tallo. La Figura 5B muestra un tubérculo. La Figura 5C muestra un detalle del tubérculo mostrado en 5B magnificado para visualizar la expresión de GUS.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Tal como se ha mencionado previamente, se ha identificado una secuencia reguladora de la expresión de un gen capaz de dirigir específicamente la expresión de un gen de interés en meristemos axilares pero no en meristemos apicales, útil para modificar la arquitectura vegetal de una planta. Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una secuencia de nucleótidos, en adelante secuencia de nucleótidos de la invención, seleccionada entre: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1; b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 4; c) un fragmento de dicha SEQ. ID. NO: 1 que mantiene la capacidad de dirigir la expresión de un gen de interés en meristemos axilares; y d) un fragmento de dicha SEQ. ID. NO: 4 que mantiene la capacidad de dirigir la expresión de un gen de interés en meristemos axilares; e) una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente análoga a la secuencia de nucleótidos definida en a) o en b) o en c) o en d).
La secuencia de nucleótidos de la invención es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en meristemos axilares con el fin de modificar la arquitectura vegetal de una planta. En una realización particular, la secuencia de nucleótidos de la invención comprende o está compuesta por la secuencia mostrada en la SEQ. ID. NO: 1, que coπesponde a la secuencia de nucleótidos del promotor del gen BRANCHED 1 de A. thaliana, específico de meristemos axilares que permite la expresión axilar pero no apical de un gen de interés. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que dicha secuencia es capaz de dirigir la expresión de los genes GUS y GFP en meristemos axilares de A. thaliana, plantas de tomate y patata (Ejemplo 1) por lo que dicha secuencia es capaz de dirigir la expresión de un gen de interés en meristemos axilares con el fin de modificar la arquitectura de una planta, por ejemplo, inhibiendo o promoviendo el desarrollo o crecimiento axilar o generando plantas transformadas o transgénicas con estructuras vegetales diferentes a las plantas silvestres por ejemplo, promoviendo la formación de flores en lugar de ramas con el fin de reemplazar ramas por flores en una planta. En otra realización particular, la secuencia de nucleótidos de la invención es un fragmento de dicha SEQ. ID. NO: 1, que mantiene la capacidad de dirigir la expresión de un gen de interés en meristemos axilares. En una realización particular, dicho fragmento tiene un tamaño comprendido entre 1 y 1,4 kb y conserva la funcionalidad y especificidad de expresión axilar del promotor del gen BRANCHED 1 de A. thaliana. Se ha comprobado que la SEQ ID NO 4 de 1.371 pares de bases conserva la actividad mientras que con 1.0 kb pierde la expresión temprana asi que ya no funcionará tan bien como el otro.. En otra realización particular, la secuencia de nucleótidos de la invención es una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente análoga a la secuencia de nucleótidos definida en los apartados a) o b) o c) o d) previamente definidos. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de nucleótidos que posee, al menos, la capacidad de dirigir la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en meristemos axilares con el fin de modificar la arquitectura de una planta. Típicamente, dicha secuencia de nucleótidos análoga se puede aislar de cualquier organismo productor de dicha secuencia análoga en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1, o SEQ. ID. NO: 4 o bien se construye en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1 o SEQ. ID. NO: 4 mediante la sustitución de uno o más nucleótidos, la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos análoga puede ser un fragmento o sub-secuencia de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1 o SEQ. ID. NO: 4. Alternativamente, dicha secuencia de nucleótidos análoga puede ser una secuencia de nucleótidos coπespondiente a un gen homólogo al gen BRANCHED 1 de A. thaliana en otras especies vegetales. En general, dicha secuencia de nucleótidos análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos identificada como la SEQ. ID. NO: 1 o a un fragmento de la misma como por ejemplo SEQ. ID. NO: 4. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 75%, más preferentemente de, al menos, un 90%, y aún más preferentemente de, al menos un 95%. La secuencia de nucleótidos de la invención puede proceder de cualquier organismo que la contiene de forma nativa o bien de un organismo hospedador transformado con dicha secuencia de nucleótidos. A modo ilustrativo, la secuencia de nucleótidos de la invención, puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a partir de ácido nucleico de cualquier especie que la contiene mediante el empleo de oligonucleótidos o sondas preparadas a partir de la información sobre la secuencia de nucleótidos de la invención. El aislamiento e identificación de un fragmento de 1.736 bases de A. thaliana que contiene la secuencia de nucleótidos de la invención, en particular de la SEQ. ID. NO: 1, se ha realizado mediante su clonación a partir de un clon genómico de A. thaliana, tal como se indica en el Ejemplo 1 (apartado 1.1 Materiales y Métodos). La secuencia de nucleótidos de la invención puede actuar como secuencia capaz de dirigir la expresión de un gen de interés en meristemos axilares con el fin de modificar la arquitectura vegetal de una planta. En una realización particular, dicha planta es una planta de interés agronómico. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "planta de interés agronómico" se refiere a una planta que se cultiva para obtener un producto de interés, por ejemplo, para consumo humano o animal, o bien para su aprovechamiento industrial, energético, etc.. A modo ilustrativo, dicha planta de interés agronómico incluye plantas propias de horticultura, tales como ajos, patatas, pimientos, tomates, etc.; plantas ornamentales, tales como rosas, claveles, etc.; plantas para tapizado de teπenos, tales como hierbas, gramíneas, etc.; plantas para aplicaciones industriales, tales como producción de papel, madera, etc., por ejemplo, eucalipto, roble, castaño, etc.; plantas para aplicaciones energéticas, por ejemplo, sorgo, girasol, chopos, etc. La secuencia de nucleótidos de la invención puede utilizarse en el desarrollo de una construcción de ácido nucleico que incluya, además, un gen de interés útil para controlar la arquitectura de una planta mediante su expresión en los meristemos axilares de una planta. Dicha construcción de ácido nucleico, a su vez, puede integrarse en un vector recombinante, tal como un vector de expresión. Para ello, se pueden utilizar distintas técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3] algunas de las cuales se muestran en la presente invención. Estos vectores recombinantes permiten la expresión de distintos genes de interés en los meristemos apicales de plantas con el fin de controlar su arquitectura vegetal. Las construcciones de ácido nucleico proporcionadas por esta invención pueden contener, además, otros elementos reguladores de la expresión de de dicho gen de interés dependiendo, por ejemplo, del vector recombinante utilizado, etc. Dichas construcciones de ácido nucleico, que contienen como denominador común la secuencia de nucleótidos de la invención, así como el uso de las mismas para la transformación de plantas forman parte de la presente invención. Por tanto, la invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención operativamente unida a un gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de una planta. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de una planta" se refiere a cualquier gen que permite controlar o modificar la arquitectura vegetal de una planta como consecuencia de su expresión en los meristemos apicales de las plantas, tales como genes que codifican para péptidos o proteínas útiles para inhibir el crecimiento axilar, o genes que codifican para péptidos o proteínas útiles para promover el crecimiento axilar, o bien genes que codifican para péptidos o proteínas útiles para estimular la formación o generación de flores en lugar de ramas. En una realización particular, dicho gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de una planta es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para inhibir el crecimiento axilar, por ejemplo, el gen que codifica para la cadena A de la toxina diftérica o el gen que codifica para la barnasa, ambos productos muy eficaces en ablaciones celulares en plantas. El gen que codifica para la cadena A de la toxina diftérica podría ser utilizado, por ejemplo, en plantas ornamentales con flores en las que tallos más largos y con menos ramas son deseables (e.g., rosas y claveles), mientras que la barnasa, una RNasa, es más recomendable para usar en especies para consumo. Mediante el empleo de este tipo de genes se inhibe el crecimiento axilar, promoviéndose el crecimiento de una planta en un único eje, lo que favorece la generación de tallos largos y con pocos nudos tal como es deseable, por ejemplo, en especies leñosas que se explotan para producir madera, o en especies que se cultivan a alta densidad, tales como ciertas gramíneas, así como en ciertas especies cultivadas con fines alimenticios, tales como, patatas, en donde se minimiza o elimina la brotación de "ojos"; ajos y cebollas, en donde se minimiza o elimina la brotación de tallos, que reducen la calidad de dichos productos; tomates, en donde se minimiza o reduce la formación de ramas durante la floración y formación de los frutos lo que permite la concentración del aporte de nutrientes durante el desarrollo del tomate; etc. En otra realización particular, dicho gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de una planta es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para promover el crecimiento axilar, por ejemplo, el gen que codifica para la isopentenil sintasa, un gen clave en la síntesis de citoquininas en Agrobacterium cuya sobreexpresión aumenta los niveles de citoquininas en plantas, el gen que codifica para la ciclina D3 que ejerce el mismo efecto sobre los meristemos, etc. Asimismo, una contrucción sense-antisense del gen BRANCHED 1 endógeno de la especie coπespondiente dirigiría la degradación de dicho gen promoviendo el desarrollo de ramas. Las citoquininas son hormonas implicadas, entre otros procesos, en la formación de meristemos. La sobreexpresión de isopentenil sintasa o de ciclina D3 en posición axilar parece ser suficiente para romper el reposo de los meristemos axilares de la roseta y estimular su crecimiento. Mediante el empleo de este tipo de genes se favorece el crecimiento de los meristemos axilares, promoviéndose el crecimiento axilar, con lo que (i) se pueden generar arquitecturas arbustivas y aumentar, además, la producción de hojas y flores, elementos apreciados en especies ornamentales o en especies en las que las hojas o los frutos son los productos de consumo; (ii) se puede incrementar la formación de retoños, lo que tiene gran interés en especies que se utilizan para el tapizado de terrenos, en las que se valora el crecimiento compacto, por ejemplo, las gramíneas de césped o pasto; y también tiene un gran valor ecológico poder fomentar el crecimiento intercalar en especies rastreras adaptadas a terrenos áridos amenazados por la erosión en los que la hierba resulta costosa de mantener; y (iii) se minimizan o eliminan problemas relacionados con la propagación vegetativa y el cultivo in vitro; utilizando una construcción de ácido nucleico proporcionada por esta invención en la micropropagación de plantas basada en la capacidad de las citoquininas para relajar la dominancia apical se evitan o minimizan los efectos indeseados relacionados con la supresión de formación y crecimiento de raíces, debido a la inducción de genes con efecto local sobre el crecimiento axilar. Adicionalmente, en ciertas especies de leñosas el control de la brotación de las yemas axilares tiene gran importancia económica. En vides, cerezos, manzanos, y otras leñosas, las yemas axilares requieren una exposición al frío de días o semanas para brotar. Utilizando una construcción de ácido nucleico proporcionada por esta invención en estos casos es posible hacer brotar las yemas y cultivar dichas especies en países cálidos (que no suelen alcanzar temperaturas bajas) sin necesidad de recurrir a los tratamientos convencionales químicos (muy tóxicos, basados en el empleo de ácido cianhídrico o dinitro-ortocresol), u hormonales (muy costosos, de rápida degradación y productores de efectos no deseados). En otra realización particular, dicho gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de una planta es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para estimular la formación o generación de flores en lugar de ramas, por ejemplo, el gen LEAFY(LFY) o el gen APÉTALA 1 (API) que permite sustituir las ramas por flores sin impedir el crecimiento indeterminado de la planta (cuando se expresan en posiciones axilares y no lo hace de forma generalizada o en meristemo apical). El gen LFY y, en cierta medida el gen API, son necesarios y suficientes para determinar la identidad de los meristemos florales [Yanofsky, M. Floral meristems to floral organs: genes controlling early events in Arabidopsis flower development. Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 46, 167-188 (1995)]. Sus mutaciones causan la formación de ramas en posiciones donde deberían formarse flores. Además, cuando se expresan bajo el control de un promotor constitutivo tal como el promotor 35S CaMV, son suficientes para promover la formación de flores en el meristemo apical y axilares en Arabidopsis, tabaco, aspen híbrido y arroz [ Weigel, D. & Nilsson, O. A developmental switch sufficient for flower initiation in diverse plants. Nature 311, 495-500 (1995); Mandel, M.A. & Yanofsky, M. A gene triggering flower formation in Arabidopsis. Nature 377, 522-524 (1995); Nilsson, O. & Weigel, D. Modulating the time of flowering. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 195-199 (1997), He, Z. et al. Transformation of rice with the Arabidopsis floral regulator LEAFY causes early heading. Transgenic Res. 9, 223-227 (2000)]. Las ventajas de sustituir ramas por flores radican, sobre todo, en generar plantas ornamentales en las que las flores se dispongan de una forma más compacta a lo largo de un solo eje. En una realización particular, se ha preparado una construcción de ácido nucleico que comprende el gen GUS (BRC1::GUS) o el gen que codifica para la GFP (BRC1 ::GFP) bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención para evaluar la especificidad de la expresión de dicho gen en meristemos axilares (Ejemplo 1). La construcción de ácido nucleido proporcionada por esta invención también puede contener, operativamente unidos, unos elementos reguladores de la expresión funcionales en plantas, por ejemplo, una secuencia de terminación de la transcripción, etc. La secuencia de nucleótidos de la invención, o la construcción de ácido nucleico proporcionada por esta invención, puede ser insertada en un vector apropiado. Por tanto, la invención también se refiere a un vector recombinante, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia de nucleótidos de la invención, o dicha construcción de ácido nucleico. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector recombinante donde se introduce dicha secuencia de nucleótidos de la invención puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha integrado. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrook et al., 1989, citado supra]. La invención también proporciona una célula hospedadora, tal como una célula transformada, que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención, o una construcción de ácido nucleico que contiene dicha secuencia de nucleótidos o dicho vector recombinante mencionado más arriba. Las células hospedadoras que se pueden transformar con la secuencia de nucleótidos de la invención pueden ser células procarióticas o, preferentemente, células eucarióticas, tales como células de tejidos vegetales. La transformación de células de tejidos vegetales también puede realizarse por métodos convencionales. Para una revisión de la transferencia génica a plantas, incluyendo vectores, métodos de transferencia de ADN, etc., véase, por ejemplo, el libro titulado "Ingeniería genética y transferencia génica", de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999), en particular, el capítulo 9, titulado "Transferencia génica a plantas", páginas 283-316. La secuencia de nucleótidos de la invención puede ser utilizada para transformar plantas de interés agronómico y obtener plantas transformadas que presentan una arquitectura modificada. La transformación de plantas está ampliamente descrita en el estado de la técnica. Como es bien conocido, pueden utilizarse múltiples sistemas, por ejemplo, vectores plasmídicos, liposomas, electroporación, microinyección, bombardeo de partículas (gene gun), coprecipitación con fosfato de calcio, empleo de vectores virales, etc. La secuencia de nucleótidos de la invención puede utilizarse para dirigir la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en meristemos axilares con el fin de modificar la arquitectura de la planta. En este sentido, la secuencia de nucleótidos de la invención puede utilizarse para manipular plantas con el fin de introducir en ellas alguna característica de interés agronómico, tal como, por ejemplo, una arquitectura vegetal modificada. A modo ilustrativo, la secuencia de nucleótidos de la invención puede utilizarse para inhibir o promover el crecimiento axilar o para estimular la generación de flores en lugar de ramas. En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula transgénica que comprende, insertada en su genoma, una secuencia de nucleótidos de la invención, así como una planta transgénica que comprende, al menos, una de dichas células transgénicas. Dichas plantas transgénicas, que constituyen un objeto adicional de la invención, se pueden obtener mediante el empleo de técnicas convencionales, por ejemplo, utilizando vectores binarios u otros vectores disponibles para las diferentes técnicas de transformación de plantas existentes en la actualidad. En una realización particular, la invención proporciona un procedimiento para producir una planta transgénica que comprende transformar dicha planta con una construcción de ácido nucleico proporcionada por esta invención, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico un gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de las plantas, bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención, de manera que la expresión de dicho gen de interés permite controlar o modificar la arquitectura vegetal de las plantas constituyendo tal modificación una característica mejorada en dicha planta. La planta resultante puede ser utilizada para la producción de nuevas plantas que conservan dichas características mejoradas. Ejemplos no limitativos de plantas a transformar incluyen todo tipo de planta de interés agronómico, por ejemplo, plantas hortícolas, plantas ornamentales, plantas para tapizado de teπenos, plantas para aplicaciones industriales, plantas para aplicaciones energéticas, etc. Asimismo, ejemplos no limitativos de dichas características mejoradas incluyen la inhibición del crecimiento axilar, la promoción del crecimiento axilar, la estimulación de la generación de flores en lugar de ramas, etc. Por tanto, la invención también proporciona un método para modificar la arquitectura vegetal (fenotipo) de una planta que comprende transformar dicha planta con una construcción de ácido nucleico proporcionada por esta invención, o con un vector recombinante proporcionado por esta invención, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico o dicho vector un gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de las plantas, bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención, de manera que la expresión de dicho gen de interés en meristemos axilares permite controlar o modificar el fenotipo (arquitectura vegetal) de dicha planta transformada. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para inhibir el crecimiento axilar de una planta que comprende transformar dicha planta con una construcción de ácido nucleico proporcionada por esta invención o con un vector recombinante proporcionado por esta invención, en donde dicho gen de interés contenido en dicha construcción de ácido nucleico o en dicho vector recombinante, bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención, es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para inhibir el crecimiento axilar, tal como el gen de la barnasa o el gen de la cadena A de la toxina diftérica, de manera que la expresión de dicho gen de interés en meristemos axilares permite inhibir el crecimiento axilar de dicha planta transformada. Las ventajas asociadas con este método han sido mencionadas previamente al tratar lo relativo al gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de una planta, en concreto al gen que codifica para un péptido o proteína útil para inhibir el crecimiento axilar. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para promover el crecimiento axilar de una planta que comprende transformar dicha planta con una construcción de ácido nucleico proporcionada por esta invención o con un vector recombinante proporcionado por esta invención, en donde dicho gen de interés contenido en dicha construcción de ácido nucleico o en dicho vector recombinante, bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención, es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para promover el crecimiento axilar, tal como el gen de la isopentenil sintasa o el gen que codifica para la ciclina D3, de manera que la expresión de dicho gen de interés en meristemos axilares permite promover el crecimiento axilar de dicha planta transformada. Las ventajas asociadas con este método han sido mencionadas previamente al tratar lo relativo al gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de una planta, en concreto al gen que codifica para un péptido o proteína útil para promover el crecimiento axilar. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para estimular la producción o generación de flores en lugar de ramas en una planta que comprende transformar dicha planta con una construcción de ácido nucleico proporcionada por esta invención o con un vector recombinante proporcionado por esta invención, en donde dicho gen de interés contenido en dicha construcción de ácido nucleico o en dicho vector recombinante, bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención, es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para estimular la producción o generación de flores en lugar de ramas en una planta, tal como el gen LFYo el gen API, de manera que la expresión de dicho gen de interés en meristemos axilares permite estimular la producción o generación de flores en lugar de ramas en dicha planta transformada. Las ventajas asociadas con este método han sido mencionadas previamente al tratar lo relativo al gen de interés útil para controlar la arquitectura vegetal de una planta, en concreto al gen que codifica para un péptido o proteína útil para estimular la producción o generación de flores en lugar de ramas en una planta. Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Obtención de un fragmento de ADN genómico que contiene el promotor del gen BRANCHED 1 de A. thaliana; construcciones que contienen los genes delatores GUS y GFP bajo el control de dicho fragmento; y transformación de plantas con dichas construcciones 1.1 Materiales y Métodos Para aislar el fragmento de ADN genómico (ADNg) de 1.736 bases que contiene el promotor del gen BRANCHED 1 de A. thaliana, se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el enzima Pwo (Roche Diagnostics) sobre ADN del TAC K24M9 [Transformation-competent bacterial Artificial Chromosome, vector que contiene una región de 45.292 pares de bases de ADNg del cromosoma 3 de A. thaliana que incluye la zona codificante y el promotor del gen BRANCHED 1] (Nottingham Stock Center) utilizando los iniciadores A y B, identificados respectivamente como SEQ. ID. NO: 2 y SEQ. ID. NO: 3, siguiendo las recomendaciones de Roche Diagnostics. La reacccion de PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones: (i) Desnaturalización a 94 grados durante 2 minutos; (ii) 35 ciclos de: Desnaturalización a 94°C durante 15 segundos, Hibridación a 57°C durante 30 segundos, y Elongación a 72°C durante 2 minutos; y (iii) Terminación a 72°C durante 10 minutos. Dichos iniciadores contienen en posición 5' sitios attBl y attB2, respectivamente, que permiten utilizar el fragmento en tecnología Gateway [Gateway™ Cloning Technology (Life Technologies, Invitrogen Corporation)]. Esta tecnología utiliza la recombinación específica de secuencias att del fago lambda para transferir fragmentos de ADN de un vector de clonación a otro (http://www.invitrogen.eom/Content/Online%20Seminars/gateway/2.htm). El producto de PCR fue purificado mediante una columna de Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) y recombinado, mediante una reacción BP (recombinacion especifica entre sitios attB y attP mediada por la mezcla enzimatica "BP clonasa" de Gateway™) con el plásmido pDONR207 que tiene sitios de recombinacion attP (todos los detalles de este plásmido se pueden encontrar en "http://www.lifetech.com" sección TECH-ONLINE™). Para corroborar que la secuencia amplificada y clonada correspondía a la región genómica de aproximadamente 1,7 kilobases (kb) del gen BRANCHED 1 de A. thaliana se secuenció el fragmento clonado (ABI System, Perkin Elmer) y se comprobó que la secuencia era idéntica a la descrita en la base de datos del genoma de Arabidopsis. Una vez secuenciado, el plásmido resultante fue recombinado mediante una reacción LR (recombinación específica entre sitios attL y attR mediada por la mezcla enzimática "LR clonasa" de Gateway™ Cloning Technology) con los plásmidos pGWB3 y pGWB4 proporcionados por Tsuyoshi Nakagawa (Universidad de Shimane, Japón) [Plant Biology 2003: Friday, July 25 - Wednesday July 30, 2003 - Honolulú, Hawai, Estados Unidos, organizado por The American Society of Plants Biologists, Abstract #935 "Gateway Binary Vectors (pGWBs) - Application and improved pGWBs", Tsuyoshi Nakagawa et al.]. Dichos plásmidos pGWB3 y pGWB4 contienen secuencias attR que permitieron recombinar el fragmento de 1,7 kb aproximadamente a los genes delatores beta glucuronidasa (GUS) y proteína verde fluorescente (GFP), respectivamente. Los plásmidos resultantes contienen el promotor del gen BRANCHED 1 fusionado a GUS y a GFP respectivamente (construcciones BRC1::GUS y BRC1::GFP). Dichas construcciones se introdujeron en plantas de A. thaliana mediante el método del "floral dip" (Clough and Bent (1998) Plant Journal 16:735-743) para generar plantas transgénicas. Se obtuvieron líneas con una única inserción y se comprobó que ese fragmento reproduce la expresión silvestre de BRANCHED 1 en meristemos axilares y que la expresión de GUS y GFP controlada por ese fragmento era comparable al patrón de expresión de BRANCHED 1 caracterizado mediante hibridaciones in situ llevadas a cabo según metodología previamente descrita (Coen et al. (1990) Cell 63:1311-1322). Asimismo, utilizando dichas construcciones, se obtuvieron plantas de patata y de tomate transgénicas mediante métodos conocidos: (http://www.potatogenome.org/nsf3/protocols/potato_traiisl.php): para obtener plantas de patata transgénicas; y (http://www.potatogenome.org/nsf3/protocols/microtom__trans.php): para obtener plantas de tomate (microtom) transgénicas.
1.2 Resultados Se ha definido una región de 1.736 bases en la región 5' del gen BRANCHED 1 de A. thaliana que reproduce fielmente la expresión de BRANCHED 1 en meristemos axilares y en los primordios de hoja formados por estos meristemos. Dicho fragmento tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1. Para comprobar que dicho fragmento reproduce la expresión del gen BRANCHED 1 se realizaron fusiones de un fragmento de 1.736 bases localizado en la posición 5'del ATG del gen BRANCHED 1 de A. thaliana con el gen GUS y GFP (Figura 1) y se comprobó que dichas expresiones controladas por ese fragmento son comparables al patrón silvestre de expresión de BRANCHED 1 en A. thaliana caracterizado mediante hibridación in situ (Figura 2, compárese con la Figura 3). En conclusión, esta región genómica es suficiente para controlar la expresión de BRANCHED 1, GUS, GFP o cualquier otro gen que se fusione a esa región en meristemos axilares de Arabidopsis. Asimismo las mismas construcciones fueron introducidas en patata y tomate para generar líneas transgénicas y se observó que el patrón de expresión también estaba finamente controlado y restringido a posiciones axilares (Figuras 4 y 5). En el caso de la patata, esta expresión GUS también se detectaba en los "ojos" del tubérculo que son meristemos axilares (Figura 5C).
1.3 Discusión Se ha definido una región reguladora de A. thaliana capaz de controlar la expresión de genes exclusivamente en meristemos axilares y en los primordios de hojas jóvenes derivados de ellos. La caracterización de un promotor específico de meristemos axilares es de gran importancia aplicada ya que permite manipular la arquitectura vegetal alterando el crecimiento o desarrollo de sus meristemos axilares. Los promotores con expresión axilar descritos hasta la fecha también tienen expresión apical (e.g., STM, TFL), es decir, son genes que se expresan en todos los meristemos. El promotor proporcionado por esta invención, que distingue las posiciones axilares permite, por tanto, expresar en esta posición genes de interés sin afectar con ello el posterior desarrollo de la planta.
EJEMPLO 1
Obtención de un fragmento de SEQ ID 1 contiene el promotor del gen
BRANCHED 1 de A. thaliana; construcciones que contienen los genes delatores GUS y GFP bajo el control de dicho fragmento; y transformación de plantas con dichas construcciones Un fragmento de ADN genómico (ADNg) de 1.371 bases SEQ ID NO 4 de SEQ ID 1 indicado en el ejemplo 1 que contiene el promotor del gen BRANCHED 1 de A. tΛα/tí77Zíϊ,mantiene la expresión del gen. Este producto fue purificado del mismo modo mediante una columna de Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) y recombinado, mediante una reacción BP (recombinacion especifica entre sitios attB y attP mediada por la mezcla enzimatica "BP clonasa" de Gateway™) con el plásmido pDONR207 que tiene sitios de recombinacion attP (todos los detalles de este plásmido se pueden encontrar en "http://www.lifetech.com" sección TECH-ONLINE™). Para corroborar que la secuencia amplificada y clonada coπespondía a la región genómica de aproximadamente 1,371 kilobases (kb) del gen BRANCHED 1 de A. thaliana se secuenció el fragmento clonado (ABI System, Perkin Elmer) y se comprobó que la secuencia era idéntica a la descrita en la base de datos del genoma de Arabidopsis. Una vez secuenciado, el plásmido resultante fue recombinado mediante una reacción LR (recombinación específica entre sitios attL y attR mediada por la mezcla enzimática "LR clonasa" de Gateway™ Cloning Technology) con los plásmidos pGWB3 y pGWB4 proporcionados por Tsuyoshi Nakagawa (Universidad de Shimane, Japón) [Plant Biology 2003: Friday, July 25 - Wednesday July 30, 2003 - Honolulú, Hawai, Estados Unidos, organizado por The American Society of Plants Biologists, Abstract #935 "Gateway Binary Vectors (pGWBs) - Application and improved pGWBs", Tsuyoshi Nakagawa et al.]. Dichos plásmidos pGWB3 y pGWB4 contienen secuencias attR que permitieron recombinar el fragmento de 1,7 kb aproximadamente a los genes delatores beta glucuronidasa (GUS) y proteína verde fluorescente (GFP), respectivamente. Los plásmidos resultantes contienen el promotor del gen BRANCHED 1 fusionado a GUS y a GFP respectivamente (construcciones BRC2::GUS y BRC2::GFP). Dichas construcciones se introdujeron en plantas de A. thaliana mediante el método del "floral dip" (Clough and Bent (1998) Plant Journal 16:735-743) para generar plantas transgénicas. Se obtuvieron líneas con una única inserción y se comprobó que ese fragmento reproduce la expresión silvestre de BRANCHED 1 en meristemos axilares y que la expresión de GUS y GFP controlada por ese fragmento era comparable al patrón de expresión de BRANCHED 1 caracterizado mediante hibridaciones in situ llevadas a cabo según metodología previamente descrita (Coen et al. (1990) Cell 63:1311-1322). Asimismo, utilizando dichas construcciones, se obtuvieron plantas de patata y de tomate transgénicas mediante métodos conocidos: (http://www.polalogenome.org/nsβ/protocols/potato_transl.php): para obtener plantas de patata transgénicas; y (http://www.potatogenome.org/nsf3/protocols/microtom__trans.php): para obtener plantas de tomate (microtom) transgénicas.
Se ha definido una región de 1.371 bases en la región 5' del gen BRANCHED 1 de A. thaliana que reproduce fielmente la expresión de BRANCHED 1 en meristemos axilares y en los primordios de hoja formados por estos meristemos. Dicho fragmento tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 4. Para comprobar que dicho fragmento reproduce la expresión del gen BRANCHED 1 se realizaron fusiones de un fragmento de 1.371 bases localizado en la posición 5'del ATG del gen BRANCHED 1 de A. thaliana con el gen GUS y GFP del mismo modo que en el ejemplo 1 (Figura 1) y se comprobó que dichas expresiones controladas por ese fragmento son comparables al patrón silvestre de expresión de BRANCHED 1 en A. thaliana caracterizado mediante hibridación in situ. En conclusión, esta región genómica es suficiente para controlar la expresión de BRANCHED 1, GUS, GFP o cualquier otro gen que se fusione a esa región en meristemos axilares de Arabidopsis. Asimismo las mismas construcciones fueron introducidas en patata y tomate para generar líneas transgénicas y se observó que el patrón de expresión también estaba finamente controlado y restringido a posiciones axilares. En el caso de la patata, esta expresión GUS también se detectaba en los "ojos" del tubérculo que son meristemos axilares (Figura 5C). Se ha definido una región reguladora más pequeña que en el ejemplo 1 de A. thaliana capaz de controlar la expresión de genes exclusivamente en meristemos axilares y en los primordios de hojas jóvenes derivados de ellos. La caracterización de un promotor específico de meristemos axilares es de gran importancia aplicada ya que permite manipular la arquitectura vegetal alterando el crecimiento o desarrollo de sus meristemos axilares. Los promotores con expresión axilar descritos hasta la fecha también tienen expresión apical (e.g., STM, TFL), es decir, son genes que se expresan en todos los meristemos. El promotor proporcionado por esta invención, que distingue las posiciones axilares permite, por tanto, expresar en esta posición genes de interés sin afectar con ello el posterior desarrollo de la planta.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1; b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 4; c) un fragmento de dicha SEQ. ID. NO: 1 que mantiene la capacidad de dirigir la expresión de un gen de interés en meristemos axilares; y d) un fragmento de dicha SEQ. ID. NO: 4 que mantiene la capacidad de dirigir la expresión de un gen de interés en meristemos axilares; y e) una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente análoga a la secuencia de nucleótidos definida en a) o en b) o en c) o en d).
2. Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, operativamente unida a un gen de interés.
3. Un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, o una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 3.
4. Una célula transformada que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, o una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 2, o un vector recombinante según la reivindicación 3.
5. Una célula transgénica que comprende, insertada en su genoma, una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, o una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 2.
6. Una planta transgénica que comprende, al menos, una célula transgénica según la reivindicación 5.
7. Un método para modificar la arquitectura vegetal de una planta que comprende transformar dicha planta con una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 2 o con un vector recombinante según la reivindicación 3.
8. Un método para inhibir el crecimiento axilar de una planta que comprende transformar dicha planta con una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 2 o con un vector recombinante según la reivindicación 3, en donde dicho gen de interés contenido en dicha construcción de ácido nucleico o en dicho vector recombinante, es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para inhibir el crecimiento axilar, de manera que la expresión de dicho gen de interés permite inhibir el crecimiento axilar de dicha planta transformada.
9. Método según la reivindicación 8, en el que dicho gen que codifica para un péptido o proteína útil para inhibir el crecimiento axilar es el gen de la barnasa o el gen de la cadena A de la toxina diftérica.
10. Un método para promover el crecimiento axilar de una planta que comprende transformar dicha planta con una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 2 o con un vector recombinante según la reivindicación 3, en donde dicho gen de interés contenido en dicha construcción de ácido nucleico o en dicho vector recombinante, es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para promover el crecimiento axilar, de manera que la expresión de dicho gen de interés permite promover el crecimiento axilar de dicha planta transformada.
11. Método según la reivindicación 10, en el que dicho gen que codifica para un péptido o proteína útil para promover el crecimiento axilar es el gen de la isopentenil sintasa o el gen que codifica para la ciclina D3.
12. Un método para estimular la producción o generación de flores en lugar de ramas en una planta que comprende transformar dicha planta con una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 2 o con un vector recombinante según la reivindicación 3, en donde dicho gen de interés contenido en dicha construcción de ácido nucleico o en dicho vector recombinante, es un gen que codifica para un péptido o proteína útil para estimular la producción o generación de flores en lugar de ramas en una planta, de manera que la expresión de dicho gen de interés permite estimular la producción o generación de flores en lugar de ramas en dicha planta transformada.
13. Método según la reivindicación 12, en el que dicho gen que codifica para estimular la producción o generación de flores en lugar de ramas es el gen LFYo el gen API.
PCT/ES2005/070057 2004-05-07 2005-05-06 Secuencia reguladora de la expresión de un gen en meristemos axilares de plantas y sus aplicaciones Ceased WO2005108587A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200401102A ES2249982B1 (es) 2004-05-07 2004-05-07 Secuencia reguladora de la expresion de un gen en meristemos axilares de plantas y sus aplicaciones.
ESP200401102 2004-05-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005108587A1 true WO2005108587A1 (es) 2005-11-17

Family

ID=35320240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2005/070057 Ceased WO2005108587A1 (es) 2004-05-07 2005-05-06 Secuencia reguladora de la expresión de un gen en meristemos axilares de plantas y sus aplicaciones

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2249982B1 (es)
WO (1) WO2005108587A1 (es)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1669456A3 (en) * 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
US7345216B2 (en) 2004-12-11 2008-03-18 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
CN102348801A (zh) * 2009-01-13 2012-02-08 最高科研理事会 调控植物分枝的基因、启动子、含有其的遗传构建物及其应用
WO2020028632A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Altria Client Services Llc Optimized tissue-preferred promoter and uses thereof
WO2021108337A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Syngenta Crop Protection Ag Methods of transformation
WO2021108336A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Syngenta Crop Protection Ag Methods of in planta transformation using axillary meristem

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2371316B8 (es) * 2010-06-14 2013-05-08 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Gen regulador de la ramificación de plantas, promotores, construcciones genéticas que lo contienen y usos.

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CUBAS P ET AL: "The TCP domain: a motif found in proteins regulating plant growth and development.", PLANT J., vol. 18, no. 2, April 1999 (1999-04-01), pages 215 - 222, XP002419545, DOI: doi:10.1046/j.1365-313X.1999.00444.x *
DOEBLEY J ET AL: "teosinte branched1 and the origin of maize: evidence for epistasis and the evolution of dominance.", GENETICS., vol. 141, no. 1, September 1995 (1995-09-01), pages 333 - 346, XP001070580 *
DOEBLEY J ET AL: "The evolution of epical dominance in maize.", NATURE., vol. 386, no. 6624, 3 April 1997 (1997-04-03), pages 485 - 488 *
HUBBARD L ET AL: "Expression patterns and mutant phenotype of teosinte branched1 correlate with growth suppression in maize and teosinte.", GENETICS., vol. 162, no. 4, December 2002 (2002-12-01), pages 1927 - 1935 *
LUKENS L ET AL: "Molecular evolution of the teosinte branched gene among maize and related grasses.", MOL BIOL EVOL., vol. 18, no. 4, 18 April 2001 (2001-04-18), pages 627 - 638 *
NAKAMURA Y ET AL: "Structural analysis of Arabidopsis thaliana chromosome 3. II. Sequence features of the regions of 4,251,695 bp covered by ninety P1, TAC and BAC clones.", DNA RES., vol. 7, 2000, pages 217 - 221 *
TAKEDA ET AL: "The OsTB1 gene negatively regulates lateral branching in rice.", PLANT J., vol. 33, no. 3, February 2003 (2003-02-01), pages 513 - 520 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1669456A3 (en) * 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
US7345216B2 (en) 2004-12-11 2008-03-18 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
CN102348801A (zh) * 2009-01-13 2012-02-08 最高科研理事会 调控植物分枝的基因、启动子、含有其的遗传构建物及其应用
CN102348801B (zh) * 2009-01-13 2013-12-25 最高科研理事会 调控植物分枝的基因、启动子、含有其的遗传构建物及其应用
WO2020028632A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Altria Client Services Llc Optimized tissue-preferred promoter and uses thereof
CN112714792A (zh) * 2018-08-02 2021-04-27 奥驰亚客户服务有限公司 经优化的组织优选性启动子和其用途
JP2021532790A (ja) * 2018-08-02 2021-12-02 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 最適化された組織優先的プロモーターおよびその使用
US11293030B2 (en) 2018-08-02 2022-04-05 Altria Client Services Llc Optimized tissue-preferred promoter and uses thereof
US11767535B2 (en) 2018-08-02 2023-09-26 Altria Client Services Llc Optimized tissue-preferred promoter and uses thereof
JP7416761B2 (ja) 2018-08-02 2024-01-17 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 最適化された組織優先的プロモーターおよびその使用
WO2021108337A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Syngenta Crop Protection Ag Methods of transformation
WO2021108336A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Syngenta Crop Protection Ag Methods of in planta transformation using axillary meristem

Also Published As

Publication number Publication date
ES2249982B1 (es) 2007-05-16
ES2249982A1 (es) 2006-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPWO2018037986A1 (ja) 植物形質調節方法
IE913359A1 (en) A process for the gene manipulation of plant cells,¹recombinant plasmids, recombinant bacteria, plants
Kang et al. Virus‐induced systemic and heritable gene editing in pepper (Capsicum annuum L.)
ES2249982B1 (es) Secuencia reguladora de la expresion de un gen en meristemos axilares de plantas y sus aplicaciones.
CN104293808B (zh) 一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用
WO2022090224A1 (en) Use of enhanced pol theta activity for eukaryotic genome engineering
KR20140056294A (ko) 웅성 감수분열 모세포의 세포내 프로세스에 체계적으로 영향을 가하는 방법
WO2012140230A1 (en) Novel methods of modifying plant phenotype
CN103703131B (zh) 诱导根的伸长或增加生物质的量的新基因及其应用
JP7453657B2 (ja) 受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導する核酸分子及びベクター、並びに受精を介さず胚乳を発生しうる組換え種子植物及びその作製方法
JP7691735B2 (ja) 花の老化が遅延されたユリ植物及びその製造方法
CN102586250A (zh) 一种姜花萜类花香基因Hctps1启动子及其应用
US20210388038A1 (en) Isolated transcription factors of carica papaya and their application to obtain extreme temperature tolerating plants
KR20250093214A (ko) Tobacco rattle virus 기반 벡터를 이용한 고추 유전자 편집 방법
KR101341932B1 (ko) 동해 및 가뭄 저항성 고추 전사인자 ＣａＷＲＫＹ1 유전자 및 이의 용도
CN108570471A (zh) 佛甲草耐盐基因sleipp及其应用
CN114277014B (zh) 拟南芥at5g10290基因在调控植物生长中的应用
CN105255914A (zh) 枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶及增强植物耐盐碱应用
CN105039344A (zh) 一种百合花花部特异和伤害诱导的dxr启动子及其应用
CN104011205B (zh) 双生病毒复制抑制剂
JP7208614B2 (ja) 形質転換植物及びその作出方法
JP7566331B2 (ja) ユリの花の老化遅延法
KR100859988B1 (ko) 지상부 특이적 프로모터 및 이를 이용한 목적 단백질의지상부 특이적 발현 방법
KR101437606B1 (ko) 배추 유래 프로모터 및 상기 프로모터로 형질 전환된 식물
KR20200112957A (ko) 바이러스 저항성 식물 및 그의 작출 방법

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase