KR20200112957A

KR20200112957A - 바이러스 저항성 식물 및 그의 작출 방법

Info

Publication number: KR20200112957A
Application number: KR1020207024902A
Authority: KR
Inventors: 히로키 아타라시; 겐지 나카하라; 데츠야 야마다; 치카라 마스타
Original assignee: 기꼬만 가부시키가이샤; 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2020-10-05
Also published as: US20210123071A1; EP3760037A4; EP3760037A1; KR102517095B1; CN111683523B; CN111683523A; JP7264832B2; CL2020001982A1; WO2019151417A1; JPWO2019151417A1; US11814639B2

Abstract

본 발명은 오이 모자이크 바이러스(CMV) 저항성의 가지과 식물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자를 갖는 CMV 저항성 가지과 식물을 제공한다. 또한, 가지과 식물의 eIF4E 유전자를 변이시키는 공정을 포함하는 CMV 저항성 식물의 작출 방법이며, 상기 변이가 CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자로의 변이인 방법을 제공한다.

Description

바이러스 저항성 식물 및 그의 작출 방법

본 발명은 식물 바이러스 저항성 식물에 관한 것으로서, 특히 가지과의 오이 모자이크 바이러스(CMV) 저항성 식물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 그러한 바이러스 저항성 식물의 작출 방법에 관한 것이기도 하다.

오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus, 이하 CMV)는 토마토(Solanumlycopersicum) 등의 가지과 작물이나 오이(Cucumis sativas L.) 등 많은 작물에 있어서 중대한 병을 야기하는 식물 바이러스의 하나이다. CMV는 주로 진딧물에 의해 전파되어 1000종 이상의 식물, 작물에 감염되어, 전세계의 온대, 아열대 및 열대 지역의 중요한 농작물에 경제적인 피해를 초래하고 있다. 이 바이러스가 작물에 감염되면, 감염 부위에서 증식한 후 유관속, 특히 체관을 통하여 전신에 퍼져서 모자이크, 황화, 실잎, 왜화, 괴저 등의 증상을 야기하여, 과실이나 잎의 품질 및 수량이 저하된다. 예를 들어, 1987년 이탈리아나 스페인의 주요 토마토 산지에 있어서 CMV가 돌연 발생하여, 착과된 토마토 과실의 대부분이 피해를 입어 괴멸적인 상황에 빠진 것이 보고되어 있다. 또한, 인도네시아나 한국에서도 고추나 피망에 있어서 CMV의 엄청난 피해가 보고되어 있다. 또한 일본에서도 방제의 틈새를 비집고 발생하는 경우가 있다.

이렇게 다종다양한 작물에 감염되어 경제적 피해를 끼치는 CMV의 감염으로부터 작물을 지키는 방법은 그다지 많지 않다. 대부분의 식물 바이러스에 대하여 살균제 등은 무효력이다. 또한, CMV를 포함하여 일반적인 많은 식물 바이러스의 방제 방법으로서, 진딧물과 같은 매개 곤충을 방충 네트 등으로 침입 저지하는 방법, 농약 등으로 살충하는 방법을 들 수 있지만, 바이러스병을 완전히 방제하는 것은 어렵다.

식물 바이러스의 감염에는 숙주의 유전자도 관여하고 있어, 유전학적으로 우성의 바이러스 저항성(담배로부터 단리된, 담배 모자이크 바이러스의 감염 확대를 저지하는 N 유전자 등)뿐만 아니라, 열성 유전하는 바이러스 저항성도 또한 발견되어 있다. 이 현상의 대표적인 것으로서, 포티바이러스과의 바이러스와 그것에 대응하는 저항성 유전자로서의 eIF4E 패밀리(eIF4E, eIF(iso)4E 등)의 관계를 들 수 있다. 포티바이러스과의 바이러스는 매우 많아, 여러가지 식물에 감염되는 포티바이러스가 분화되어 존재하고 있다. 또한, eIF4E는 진행 번역 개시 인자(eukaryotic translation initiation factor)의 하나로, 숙주의 번역 개시 인자이다. 예를 들어, 포티바이러스과의 순무 모자이크 바이러스(Turnip mosaic virus)는 자체를 카피하기 위한 RNA 의존 RNA 폴리메라아제 등 여러가지 바이러스의 단백질을 번역하기 위해서, 식물 리보좀을 바이러스 RNA에 결합시킬 목적으로 숙주 식물의 번역 개시 인자를 이용한다. 또한, 바이러스의 복제나 세포간 이행에도 eIF4E가 필요한 것도 알려져 있다. 따라서, 이 숙주 번역 유전자의 결함이 바이러스 저항성을 부여할 수 있다.

지금까지, 모델 식물인 애기장대, 가지과의 담배속, 토마토, 고추 등에서 실제로 eIF4E 패밀리 유전자의 변이에 의해 포티바이러스과의 바이러스에 대한 저항성이 획득된 것이 나타나 있다(비특허문헌 1 및 2 등). 그러나, CMV에 대한 저항성은 애기장대에서만 확인되어 있는 것에 그치고, 토마토를 포함하는 다른 식물에서는 아직 발견하지 못하고 있다. 특히, 비특허문헌 1은 토마토에 있어서의 포티바이러스 감염과 eIF4E1 및 eIF4E2의 녹다운에 관한 것인데, eIF4E 또는 eIF(iso)4E를 침묵화한 트랜스제닉주에 있어서 CMV 등 포티바이러스과 이외의 바이러스 감염이 약해지지 않은 것으로부터, 바이러스 감염 사이클에 있어서의 eIF4E의 관여는 포티바이러스과에 한정된다고 생각되는 것이 기재되어 있다(비특허문헌 1, 4 페이지 좌측 란 12 내지 15행 등). 또한, 오이에 eIF4E의 기능을 완전히 상실하는 변이를 도입한 경우, CVYV(Cucumber vein yellowing virus; 오이 잎맥 황화 바이러스), ZYMV(Zucchini yellow mosaic virus; 호박 황화 모자이크 바이러스), PRSV(Papaya ring spot mosaic virus; 파파야 원형 반점 모자이크 바이러스)에 대한 저항성은 부여되었지만, CMV에 대한 저항성은 부여되지 않은 것도 보고되어 있다(비특허문헌 3, 특히 표 2).

Mazier et al.(2011) PLOS ONE 6: e29595 Sato et al.(2005) FEBS Lett. 579(5): 1167-1171. J. Chandrasekaran et al., (2016) Molecular Plant Pathology, 17(7): 1140-1153

eIF4E 패밀리 유전자의 억제가 부여한다고 생각되고 있는 바이러스 저항성은 당해 유전자의 상동체마다 다르고, 숙주 식물에 따라서도 다르다. 또한, 그의 대부분은 포티바이러스과의 식물 바이러스에 대한 것이며, 토마토에서 발견된 것도 감자 바이러스 Y(Potato virus Y)(PVY), 고추 모틀 바이러스(Pepper mottle virus)(PepMoV), 담배 식각 바이러스(Tobacco etch virus)(TEV) 등에 대한 저항성에 그친다. 한편, 다른 과의 바이러스인 CMV에 대한 저항성은 확인되어 있지 않다. CMV는 RNA 바이러스라는 점에 있어서 포티바이러스과의 바이러스와 공통되지만, 그의 유전자 구성은 크게 다르고, 게놈 RNA도 포티바이러스와는 형태가 다르다. 포티바이러스과의 바이러스가 1분절의 게놈인 데 반해, CMV는 3분절 게놈으로 구성되어 있으며 각각 바이러스 입자를 형성하고, 모든 입자, 분절이 모여서 감염 증식한다. CMV에 의한 병해는 심한 증상을 나타내는 중요 병해임에도 불구하고, 번역 개시 인자로 한정하지 않더라도 지금까지 작물에서는 거의 저항성 유전자가 발견되지 않았고, 가지과에 있어서는 전무하다. 그 때문에 CMV의 방제는 매개충 진딧물의 방제에만 의지하고 있어, 육종 현장에서는 저항성 품종의 작출이 요망되어 왔다.

이상과 같은 배경 하, 본 발명은 CMV 저항성 가지과 식물 및 그의 작출 방법, CMV 저항성 가지과 식물을 작출하기 위한 변이 유전자 및 이들의 이용을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 가지과 식물인 토마토의 eIF4E의 특정한 상동체의 소정의 개소에 변이를 갖는 개체를 작출하고, 이 개체에 CMV를 접종한 바, 장기에 걸쳐서 CMV 저항성을 가짐을 확인하고 본 발명을 완성시켰다. 이러한 CMV 저항성 식물은 가지과에서는 최초의 보고이다.

즉, 본 발명은 이하의 것에 관한 것이다.

[1]

오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자를 갖는, CMV 저항성 가지과 식물.

[2]

가지속의 식물인, [1]에 기재된 CMV 저항성 가지과 식물.

[3]

상기 식물이 토마토이며, 상기 변이 eIF4E 유전자가 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자인, [1] 또는 [2]에 기재된 CMV 저항성 식물.

[4]

상기 변이 eIF4E 유전자가 엑손 2의 염기 서열에, 이하 중 어느 하나 이상의 변이:

(a) 프레임시프트 변이

(b) 넌센스 변이

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1 내지 7)의 결손

(d) 하나 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입

을 갖는, [1] 내지 [3] 중 어느 것에 기재된 CMV 저항성 식물.

[5]

상기 식물이 토마토이며, 상기 변이 eIF4E 유전자가 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자의 엑손 2의 염기 서열(서열 번호 2)에 있어서: 1 염기 삽입; 3 염기 결손; 및 9 염기 결손으로 이루어지는 군에서 선택되는 변이를 갖는, [1] 내지 [4] 중 어느 것에 기재된 CMV 저항성 식물.

[6]

상기 식물이 토마토이며, 상기 변이 eIF4E 유전자가 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자의 엑손 2 중의 염기 서열 AGGGTAAATCTGATACCAGC(서열 번호 3)에 있어서: 15번째와 16번째의 염기 사이로의 1 염기 삽입; 16 내지 18번째의 3 염기 결손; 8 내지 18번째 중 어느 9 염기의 결손으로 이루어지는 군에서 선택되는 변이를 갖는, [1] 내지 [4] 중 어느 것에 기재된 CMV 저항성 식물.

[7]

가지과 식물의 eIF4E 유전자를 변이시키는 공정을 포함하는, 오이 모자이크 바이러스(CMV) 저항성 식물의 작출 방법이며, 상기 변이가 CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자로의 변이인, 방법.

[8]

상기 식물이 토마토이며, 상기 변이 공정이 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자를 변이시키는 공정인, [7]에 기재된 CMV 저항성 식물의 작출 방법.

[9]

상기 변이 공정이 eIF4E 유전자의 엑손 2의 염기 서열에, 이하 중 어느 하나 이상의 변이:

(a) 프레임시프트 변이

(b) 넌센스 변이

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1 내지 7)의 결손

(d) 하나 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입

을 도입하는 공정인, [7] 또는 [8]에 기재된 CMV 저항성 식물의 작출 방법.

본 발명은 또한, 이하의 것에 관한 것이기도 하다.

[10]

[1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 CMV 저항성 식물의 가공품.

[11]

가지과 식물의 eIF4E 유전자를 변이시키는 공정을 포함하는, 오이 모자이크 바이러스(CMV) 저항성 식물의 가공품의 제조 방법이며, 상기 변이가 CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자로의 변이인, 방법.

[12]

상기 식물이 토마토이며, 상기 변이 공정이 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자를 변이시키는 공정인, [11]에 기재된 가공품의 제조 방법.

[13]

(a) 프레임시프트 변이

(b) 넌센스 변이

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1 내지 7)의 결손

(d) 하나 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입

을 도입하는 공정인, [11] 또는 [12]에 기재된 가공품의 제조 방법.

본 발명은 또한, 이하의 것에 관한 것이기도 하다.

[14]

오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자.

[15]

가지과 식물 유래인, [14]에 기재된 변이 eIF4E 유전자.

[16]

토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자 유래인, [14] 또는 [15]에 기재된 변이 eIF4E 유전자.

[17]

엑손 2의 염기 서열에, 이하 중 어느 하나 이상의 변이:

(a) 프레임시프트 변이

(b) 넌센스 변이

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1 내지 7)의 결손

(d) 하나 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입

을 갖는, [14] 내지 [16] 중 어느 것에 기재된 상기 변이 eIF4E 유전자.

[18]

토마토 유래이며, 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자의 엑손 2의 염기 서열(서열 번호 2)에 있어서: 1 염기 삽입; 3 염기 결손; 및 9 염기 결손으로 이루어지는 군에서 선택되는 변이를 갖는, [14] 내지 [17] 중 어느 것에 기재된 변이 eIF4E 유전자.

[19]

토마토 유래이며, 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자의 엑손 2 중의 염기 서열 AGGGTAAATCTGATACCAGC(서열 번호 3)에 있어서: 15번째와 16번째의 염기 사이로의 1 염기 삽입; 16 내지 18번째의 3 염기 결손; 8 내지 18번째 중 어느 9 염기의 결손으로 이루어지는 군에서 선택되는 변이를 갖는, [14] 내지 [18] 중 어느 것에 기재된 변이 eIF4E 유전자.

[20]

CMV 저항성 가지과 식물의 작출에 있어서의, [14] 내지 [19] 중 어느 것에 기재된 변이 eIF4E 유전자의 용도.

[21]

가지과 식물의 가공품의 제조에 있어서의, [1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 CMV 저항성 가지과 식물의 용도.

[22]

[14] 내지 [19] 중 어느 것에 기재된 변이 eIF4E 유전자를 갖는, 가지과 식물의 식물 세포.

[23]

[1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 CMV 저항성 가지과 식물의 식물 세포의 작출 방법.

[24]

[1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 CMV 저항성 가지과 식물의 종자의 작출 방법.

[25]

CMV 저항성 가지과 식물의 종자의 작출에 있어서의, [14] 내지 [19] 중 어느 것에 기재된 변이 eIF4E 유전자의 용도.

[26]

[14] 내지 [19] 중 어느 것에 기재된 변이 eIF4E 유전자를 포함하는, 벡터, 프로모터 또는 키트.

[27]

CMV 저항성 가지과 식물, 그의 식물 세포, 그 식물의 종자 또는 그의 자손의 작출에 있어서의, [26]에 기재된 벡터, 프로모터 또는 키트의 용도.

본 발명에 따르면, CMV 저항성 가지과 식물 및 그의 작출 방법, CMV 저항성 가지과 식물을 작출하기 위한 변이 유전자 및 이들의 이용을 제공할 수 있다.

도 1은 야생주의 토마토의 3번 염색체에 존재하는 eIF4E의 mRNA 서열에 대응하는 염기 서열을 나타낸다(서열 번호 1). 실제의 RNA는 도면 중의 T(티민)가 U(우라실)이다. 파선으로 나타낸 개소(166 염기)가 엑손 2의 염기 서열이며(서열 번호 2), 망점부가 편집 표적 부위(서열 번호 3)이다. 도면 중 사각 프레임 내의 TGG(PAM 서열)의 3 염기 전에 존재하는 염기(A)부터 상류가 편집된다.
도 2는 A127 계통 6개체, B95 계통 4개체, B100 계통 5개체(모두 T1 개체)의 CMV 접종 26일 후의 바이러스 축적량을 나타내는 그래프이다. A127-1은 4군데에서 취득한 샘플, 그 이외에는 2군데에서 취득한 샘플에 대해서, 항CMV 항체를 사용하여 ELISA값(흡광값)을 측정하여, A127-1 및 A127-8의 CMV 저항성이 확인되었다.
도 3은 A127 계통 18개체(모두 T1 개체)의 CMV 접종 20일 후의 바이러스 축적량을 나타내는 그래프이다. 항CMV 항체를 사용하여 ELISA값(흡광값)을 측정하여, A127-14, A127-21 및 A127-24의 CMV 저항성이 확인되었다.
도 4는 A132 계통 5개체, A143 계통 4개체(모두 T1 개체)의 CMV 접종 30일 후의 바이러스 축적량을 나타내는 그래프이다. 항CMV 항체를 사용한 ELISA값(흡광값)을 측정하여, A132-1 및 A132-5의 CMV 저항성이 확인되었다.
도 5는 A127 계통 T1 개체의 CMV 접종 23일 후의 증상을 나타내는 사진이다. 도 5a: 무증상의 A127-8. 도 5b: 모자이크, 황화 및 축엽이 보이는 A127-2.
도 6a는, A127-14, A127-21 및 A127-24의 T1 개체의 3번 염색체에 존재하는 eIF4E 유전자 중의 편집 부위 부근의 시퀀스 해석 결과를 나타낸다. 각 서열군의 맨위가 야생형(WT)의 서열이다. 도면 중 상부에 선을 그은 개소가 편집 표적 부위이며, 사각으로 둘러싼 염기가 야생형으로부터의 변이를 나타낸다.
도 6b는, A132-1 및 A132-5의 T1 개체의 3번 염색체에 존재하는 eIF4E 유전자 중의 편집 부위 부근의 시퀀스 해석 결과를 나타낸다. 각 서열군의 맨위가 야생형(WT)의 서열이다. 도면 중 상부에 선을 그은 개소가 편집 표적 부위이며, 사각으로 둘러싼 염기가 야생형으로부터의 변이를 나타낸다.
도 7은 A132 계통 4개체 및 A143 계통 3개체(모두 T1 개체)의 PVY 접종 24일 후의 바이러스 축적량을 나타내는 그래프이다. 항PVY 항체를 사용한 ELISA값(흡광값)을 측정하여, 모든 개체에서 PVY 저항성이 확인되었다.
도 8은 실시예 5에 있어서, 각 T2 세대의 CMV 저항성을 확인한 그래프이다. 시각적 관찰에 의한 발병률과, ELISA(바이러스 축적도) 검정에 의한 감염율을 바탕으로 이병률을 확인하였다. 때문에 이병률이란 발병률과 감염율을 종합한 것을 나타낸다. 괄호 내의 숫자는 시험에 제공한 주수를 나타낸다.
도 9a는 실시예 6에 있어서, A132-5 및 A127-24로부터의 T2 세대의 시각적 관찰 및 ELISA에 의한 이병률을 야생형 대조와 비교한 그래프이다. 또한, 발병이 확인된 주는 모두 ELISA 양성이었기 때문에, 발병률과 바이러스 감염율이 동률이었을 경우, 발병률만으로 나타냈다.
도 9b는 실시예 6에 있어서, 몇 가지의 주에 대하여 T2 세대의 바이러스 축적도를 ELISA에 의해 측정한 결과를 각 주에 대하여 나타낸다.
도 10은 실시예 7에 있어서 진딧물 충매 CMV 접종 시험을 행하고, T2 세대의 CMV 저항성을 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용(이하, 「본 실시 형태」라고도 한다)에 대해서 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은 이하의 본 실시 형태 및 도면으로 한정되는 것은 아니며, 그 요지의 범위 내에서 여러가지 변형되어서 실시할 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 실시 형태는 CMV 저항성 가지과 식물에 관한 것이다. 본 실시 형태에 있어서 CMV 저항성 식물이란, 감염 후의 CMV의 증식을 억제하는 성질 및/또는 CMV의 감염 증상의 발현을 억제하는 성질을 갖는 식물이다.

RNA 바이러스인 CMV는 3분절 게놈으로 구성되어 있고, 각각 바이러스 입자를 형성하고, 모든 입자 및 분절이 모여 식물에 감염되고, 증식한다. CMV가 식물에 감염될 때에는 숙주인 식물의 게놈 번역 개시 인자 eIF4E를 이용하여, CMV의 RNA 말단의 캡 구조가 eIF4E에 결합함으로써 바이러스 이행 단백질의 번역이 개시된다. 또한, CMV는 바이러스 게놈 RNA의 5' 말단에 동식물의 mRNA와 동일하게 캡 구조를 갖는다는 점에서, 바이러스 게놈 RNA의 5' 말단에 VPg라고 하는 단백질이 결합한 포티바이러스 등과는 구조가 크게 다르다. VPg를 갖는 바이러스는 VPg와 식물의 eIF4E가 높은 친화성을 가져, VPg가 식물의 eIF4E와 강하게 결합하여 바이러스 유전자가 식물의 번역계를 이용하는데, CMV는 이러한 VPg를 갖는 바이러스와는 감염 기구가 다르다고 생각된다.

어떤 식물이 CMV 저항성인지의 여부는, 예를 들어 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이 통상의 방법에 의해 식물에 CMV를 감염시키고, 식물체 중의 CMV의 축적을 ELISA법, PCR 등 공지된 방법으로 확인함으로써 판단할 수 있다. 또한, CMV를 감염시킨 식물의 CMV 감염 증상(모자이크, 황화, 실잎, 왜화, 괴저 등)의 유무를 확인함으로써도 판단할 수 있다. CMV에는 CMV-Y 계통, CMV-O 계통, CMV-Fny 계통, CMV-Nt9 계통 등의 복수의 계통이 알려져 있고, 각 계통의 감염에 대한 식물의 CMV 감염 증상은 다를 수 있는 것이 알려져 있기 때문에, 감염시키는 CMV 계통에 따라 증상의 유무를 확인할 수 있다. 일 양태에 있어서 본 실시 형태의 CMV 저항성 식물은, 후술하는 변이 eIF4E 유전자를 갖지 않는 식물과 비교하여 식물체 중의 CMV의 축적이 저감되고 있는 식물 및/또는 CMV를 감염시킨 경우의 CMV 감염 증상이 저감된 식물이다. 일 양태에 있어서 본 실시 형태의 CMV 저항성 식물은, CMV 감염 후 20일 이상 지나도 식물체 중의 CMV의 축적이 CMV 비접종주와 동일 정도인 식물 및/또는 CMV 감염 증상이 확인되지 않는 식물이다.

본 실시 형태에 있어서의 CMV 저항성 식물은 CMV에 저항성을 나타내는 한, 다른 바이러스나 세균, 예를 들어 가지과에 감염되는 모든 포티바이러스(PVY 등), PVY와 마찬가지로 VPg를 바이러스 게놈의 5' 말단에 갖고, 번역 개시 인자의 변이에 의한 저항성이 보고되어 있는 바이모바이러스(Bymovirus) 및 소베모바이러스(Sobemovirus)속에 속하는 바이러스, 번역 개시 인자의 변이에 의한 저항성이 보고되어 있는 카모바이러스(Carmovirus)속에 속하는 바이러스, 지금까지 번역 개시 인자의 변이에 의한 저항성은 보고되어 있지 않지만, 토마토를 포함하는 작물 생산에서 막대한 피해를 미치고 있는 제미니바이러스과의 바이러스(토마토 황화 잎말림 바이러스(TYLCV) 등) 등에 대한 저항성을 나타내는 복합 저항성 식물이어도 된다.

본 실시 형태에 있어서 CMV 저항성 식물은 가지과의 식물이며, 솔라나세아에(Solanaceae)과에 속하는 식물이면 특별히 한정되지 않고, 가지속(Solanum속), 니코티아나(Nicotiana)속, 캅시쿰(Capsicum)속 등에 속하는 식물을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 토마토, 가지, 담배, 고추, 감자 등을 들 수 있다. 일 양태에 있어서, 바람직하게는 본 실시 형태의 CMV 저항성 식물은 가지속의 식물이며, 보다 바람직하게는 토마토, 가지, 감자이며, 특히 바람직하게는 토마토이다.

일 양태에 있어서, 본 실시 형태는 상기 CMV 저항성 식물의 일부여도 되고, 보다 구체적으로는 과실, 새순, 줄기, 뿌리, 어린가지, 꽃밥과 같은 기관, 식물의 조직, 화분, 종자 등을 들 수 있다. 일 양태에 있어서, 본 실시 형태는 이러한 식물 또는 그 일부의 작출 방법, 이러한 식물 또는 그 일부의 작출에 있어서의 본 실시 형태의 변이 eIF4E 유전자의 용도에 관한 것이기도 하다.

일 양태에 있어서 본 실시 형태에 있어서의 상기 CMV 저항성 식물은, 예를 들어 식용 등의 가공품으로 할 수도 있다. 즉, 본 실시 형태는 CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자를 갖는 CMV 저항성 가지과 식물의 가공품에 관한 것이기도 하다. 또한, 본 실시 형태는 가지과 식물의 eIF4E 유전자를 변이시키는 공정을 포함하는, CMV 저항성 식물의 가공품의 제조 방법이며, 상기 변이가 CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자로의 변이인 방법에 관한 것이기도 하다.

가공품은 특별히 제한되지 않고, 식물의 종류에 따른 식용, 의료용 등의 가공품으로 할 수 있다. 예를 들어 CMV 저항성 식물이 토마토인 경우, 토마토의 식용 가공품으로서는 통조림 토마토, 토마토 페이스트, 케첩, 토마토 소스, 토마토 수프, 건조 토마토, 토마토 쥬스, 토마토 파우더, 토마토 농축물, 토마토를 원료로 하는 영양 보조 식품(서플리먼트) 등을 들 수 있다. 가공품의 제조는 CMV 저항성 식물을 원료로 하여, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있다.

본 실시 형태에 있어서의 CMV 저항성 식물은 CMV 저항성을 나타내는 식물인 한, 접목에 이용하는 접순, 대목 등이어도 된다. 또한, 일 양태에 있어서, 본 실시 형태는 상술한 CMV 저항성 식물을 재생할 수 있는 식물 세포(캘러스를 포함한다) 등에 관한 것이기도 하고, 이러한 식물 세포는 본 실시 형태에 있어서의 CMV 저항성 식물과 마찬가지로, CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자를 갖는다. 본 실시 형태에 있어서의 CMV 저항성 식물은 이러한 식물 세포로부터 얻어진 식물도 포함한다. 일 양태에 있어서, 본 실시 형태는 이러한 식물 세포의 작출 방법 및 이러한 식물 세포의 작출에 있어서의 본 실시 형태의 변이 eIF4E 유전자의 용도에 관한 것이기도 하다.

본 실시 형태에 있어서의 CMV 저항성 식물은, CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자(이하, 「CMV 저항성 유전자」라고도 한다)를 갖는다. 일 양태에 있어서, 본 실시 형태는 이러한 변이 eIF4E 유전자, 이러한 변이 eIF4E 유전자를 포함하는, 벡터, 프로모터 또는 키트, 그리고 CMV 저항성 가지과 식물, 그의 식물 세포, 그 식물의 일부(종자 등) 또는 그의 자손의 작출에 있어서의, 이러한 벡터, 프로모터 또는 키트의 용도에 관한 것이기도 하다.

eIF4E는 진핵생물에 있어서의 번역 개시 인자의 일종이며, 단백질 합성의 개시에 있어서 중요한 역할을 갖는다. eIF4E는 eIF(iso)4E와 함께 eIF4E 패밀리를 구성하고 있고, 또한 가지과 식물은 복수의 eIF4E의 이소형을 갖는다고 생각된다. 예를 들어, 토마토에 있어서 eIF4E는 2종의 이소형을 포함하고, 2번 염색체 및 3번 염색체 상에 존재하는 것이 알려져 있다. 또한, eIF(iso)4E는 토마토에 있어서 1종 존재하고, 9번 염색체 상에 존재하는 것이 알려져 있다. 고추에도 토마토의 eIF4E와 상동인 유전자로서 4번 염색체에 있는 pvr1 및 pvr2의 존재가 알려져 있고(pvr1과 pvr2는 대립 유전자의 관계에 있다), 토마토의 eIF(iso)4E와 상동인 유전자로서 3번 염색체에 있는 pvr6이 알려져 있다. 이들 유전자 중, eIF4E 또는 이것과 상동인 단백질을 코딩하는 유전자가 CMV에 대하여 비기능적인 것이 바람직하다.

본 실시 형태에 있어서 CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질이란, CMV가 식물에 감염되어 증식할 때에 이용할 수 없거나, CMV의 감염 및 증식이 저감되는 eIF4E 단백질을 가리키고, 일 양태에 있어서 CMV 저항성 유전자는 단백질을 코딩하지 않도록 변이된 것이어도 된다. 이론에 속박되는 것은 아니지만, CMV가 식물에 감염될 때에는 가지과 식물에 존재하는 복수의 이소형 중 특정한 eIF4E를 사용하는 바, 이 특정한 이소형(CMV에 대하여 기능적인 eIF4E)을 코딩하는 유전자가 변이되고, CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하게 되면, 바이러스 게놈 상에 코딩되는, 감염 증식에 필요한 단백질의 번역이 진행되지 않기 때문에, 혹은 eIF4E와의 상호 작용을 필요로 하는 CMV 단백질이 기능을 달성할 수 없기 때문에, CMV 감염, CMV 증식 및 CMV 감염 증상의 발현 중 어느 하나 이상이 저해되어 CMV 저항성 식물이 된다고 생각된다. 한편, 가지과 식물에 존재하는 복수의 eIF4E 상동체 중 하나가 변이해도, 식물 자체는 다른 상동체를 이용 가능하기 때문에, 혹은 식물 자체는 CMV에 비기능적인 eIF4E 단백질을 이용 가능한 경우도 있기 때문에, 숙주인 가지과 식물의 생육에는 영향 없이 CMV 저항성을 부여 가능하다고 생각된다.

일 양태에 있어서 본 실시 형태에 있어서의 CMV 저항성 식물은, CMV에 대하여 기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 유전자가 모두 변이되었다. 예를 들어, 복2배체 등의 배수체 식물의 경우, 복수 존재하는, CMV에 대하여 기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 유전자가 모두 CMV 저항성 유전자로 변이되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 CMV 저항성 식물은 CMV에 대하여 기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 유전자가 변이되어 있는 한, 다른 정상 eIF4E 유전자를 갖는 것이어도 된다. 또한, 외래의 CMV 저항성 유전자를 도입하고, 내생의 CMV에 대하여 기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 유전자를 모두 결실, 파괴하거나 한 것이어도 된다.

일 양태에 있어서, 본 실시 형태에 있어서의 CMV 저항성 유전자는 가지과 식물의 CMV에 대하여 기능적인 eIF4E 유전자의 염기 서열에 변이를 갖는 유전자이며, 바람직하게는 상기 eIF4E 유전자의 엑손 2의 염기 서열에 변이를 갖는 유전자이다. 보다 구체적으로는 가지과 식물이 토마토일 경우, 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자에 변이를 갖고, 바람직하게는 그 엑손 2의 염기 서열(서열 번호 2)에 변이를 갖고, 보다 바람직하게는 상기 엑손 2 중의 염기 서열 AGGGTAAATCTGATACCAGC(서열 번호 3)에 변이를 갖는다.

일 양태에 있어서, 본 실시 형태의 CMV 저항성 유전자는 eIF4E 유전자의 엑손 2의 염기 서열에, 이하 중 어느 하나 이상의 변이를 갖는다:

(a) 프레임시프트 변이

(b) 넌센스 변이

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1 내지 7)의 결손

(d) 하나 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입.

(a) 프레임시프트 변이는 염기의 결실 또는 삽입에 의해 코돈의 해독틀이 어긋나고, 다른 아미노산 서열을 코드하게 되는 변이이며, 이에 의해 CMV 저항성 유전자가 된다.

(b) 넌센스 변이는 원래 아미노산을 코드하고 있었던 코돈이 종지 코돈으로 변하는 변이이며, 이에 의해 CMV 저항성 유전자가 된다.

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1 내지 7, 바람직하게는 n=1 내지 3, 예를 들어 3, 6 또는 9 염기, 보다 바람직하게는 n=3, 예를 들어 9 염기)의 결손에 의해, 당해 결손 영역 이하의 염기에 의해 코딩되는 아미노산이 미묘하게 변화하고, 이에 의해 CMV 저항성 유전자가 된다.

(d) 하나 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의해, 변이 영역 이하의 염기가 코딩하는 아미노산의 해독틀이 변화한다. 이에 의해, eIF4E 단백질이 붕괴되거나 구조가 변화하는 등에 의해 CMV 저항성 유전자가 된다. 일 양태에 있어서, 바람직하게는 이 변이는 코돈의 3번째 이외의 염기의 변이이다. 본 실시 형태에 있어서 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되는 염기의 개수는 CMV 저항성 유전자가 얻어지는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1 내지 5개, 1 내지 3개, 1 내지 2개 또는 1개로 할 수 있다.

상기 (a) 내지 (d)의 변이는 택일적인 것은 아니고, 예를 들어 (c)나 (d)의 변이의 결과로서 (a)나 (b)의 변이가 일어날 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 실시 형태의 CMV 저항성 유전자는 연속 또는 비연속의 9 염기의 결손, 연속 또는 비연속의 3 염기의 결손, 1 염기 삽입에 의한 프레임시프트 변이 중 어느 하나 이상을 갖는 것이 바람직하다.

일 양태에 있어서, 상기 변이 eIF4E 유전자는 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자의 엑손 2 중의 염기 서열(서열 번호 2), 바람직하게는, 엑손 2 중의 염기 서열 AGGGTAAATCTGATACCAGC(서열 번호 3)에 있어서: 1 염기 삽입; 3 염기 결손; 및 9 염기 결손으로 이루어지는 군에서 선택되는 변이를 갖고, 상기 변이 이외의 변이(예를 들어, 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 3의 염기 서열에 있어서의 하나 또는 복수의 염기의 치환 등)를 갖고 있어도 된다. 또한, 일 양태에 있어서 상기 변이 eIF4E 유전자는, 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자의 엑손 2 중의 염기 서열 AGGGTAAATCTGATACCAGC(서열 번호 3)에 있어서: 15번째와 16번째의 염기 사이로의 1 염기 삽입(일 양태에 있어서, C(시토신)의 삽입); 16 내지 18번째의 3 염기 결손; 8 내지 18번째 중 어느 9 염기의 결손(바람직하게는, 10번째 및 13번째 이외의 9 염기의 결손)으로 이루어지는 군에서 선택되는 변이를 갖고, 상기 변이 이외의 변이를 갖고 있어도 된다. 서열 번호 3의 염기 서열은 토마토의 엑손 2의 염기 서열(서열 번호 2)의 135 내지 154번째의 염기에 대응한다.

일 양태에 있어서, 바람직하게는 상기 변이 eIF4E 유전자는, 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자의 엑손 2 중의 염기 서열 AGGGTAAATCTGATACCAGC(서열 번호 3)가 서열 번호 4 내지 9 중 어느 것으로 변이된 것이다.

상술한 바와 같이, 본 실시 형태의 CMV 저항성 유전자는 원하는 CMV 저항성을 나타내는 한 상기 이외의 변이를 갖는 것이어도 되고, 일 양태에 있어서 예를 들어 eIF4E 유전자의 염기 서열과 85％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 특히 바람직하게는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 염기 서열에 있어서, 상기 중 어느 변이를 갖는 것이어도 된다.

본 실시 형태는 또한 가지과 식물에 CMV 저항성을 부여하기 위한 상기 변이 eIF4E 유전자의 용도 및 CMV 저항성 유전자인 상기 변이 eIF4E 유전자 자체에 관한 것이기도 하다.

상기 CMV 저항성 유전자를 갖는 CMV 저항성 식물은 한정되는 것은 아니지만, 크게 구별하면 이하에 예시하는 2가지의 방법으로 얻을 수 있다.

(1) 직접 게놈 편집: CMV에 대하여 기능적인 eIF4E를 갖는 식물의 직접 게놈 편집에 의해, 목적으로 하는 개소에 핀포인트로 변이를 도입하여 CMV 저항성 유전자를 갖는 식물을 작출한다.

(2) 변이 유전자 도입: 하기 (A)와 (B)를 조합한 방법이다. (A): CMV 저항성 유전자를 제작하고, 적당한 프로모터를 사용하여 식물에 도입한다. (B): 식물이 갖는 내생 eIF4E 중 CMV에 대하여 기능적인 eIF4E를 CMV에 대하여 비기능적인 것으로 한다.

이하, 각각의 방법에 대하여 설명한다.

상기 (1)의 방법은 CRISPR, TALEN 등 부위 특이적 뉴클레아제를 사용한 공지된 게놈 편집 기술을 사용하여 실시할 수 있다. 게놈의 특정 부위를 절단 가능한 제한 효소를 사용하여 이중쇄 절단을 도입하면, 이것이 수복되는 때에 수복 에러에 의해 각종 변이가 도입되어, CMV에 대하여 기능적인 eIF4E를 코딩하는 유전자가 CMV 저항성 유전자로 변이된다.

특히 높은 특이성 및 고효율로 변이를 도입하기 위해서, 바람직하게는 CRISPR 시스템을 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용할 수 있다. 이 시스템에서는, 표적 유전자와 상보적인 20 염기 길이 정도의 서열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)가 표적을 인식하고, Cas9 단백질이 이중쇄를 절단하고, 이것이 비상동성 말단 결합(NHEJ) 수복 경로에 의해 수복되는 때에 수복 에러에 의해 표적 부위에 변이가 도입된다.

식물에 대한 Cas 단백질 및 sgRNA의 송달은 그들을 코딩하는 벡터를 통하여 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 아그로박테리움법, 표준적인 트랜스펙션법, 일렉트로포레이션법, 입자 충격법 등을 사용하여 행할 수 있다.

간편하게는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이 Cas 유전자 및 sgRNA를 조립한 바이너리 벡터를 구축하고, 이것을 사용하여 아그로박테리움을 형질 전환한 후, 이 아그로박테리움을 사용하여 식물을 형질 전환함으로써 식물에 대한 Cas 단백질 및 sgRNA의 송달을 행할 수 있다(Friedrich Fauser et.al. The Plant Journal(2014) 79, 348-359, 오사와 료, 에즈라 히로시(2013) 새로운 식물 육종 기술을 이해하자, 고쿠사이 분켄사 등 참조).

아그로박테리움에 의해 형질 전환되는 식물의 형태는 식물체를 재생할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 현탁 배양 세포, 프로토플래스트, 잎의 절편, 캘러스 등을 들 수 있다. 아그로박테리움의 제균 후, 사용한 벡터에 따른 약제 중에서 배양하고, 약제 내성을 지표로 목적 유전자가 조립된 절편의 선별 배양을 할 수 있다.

고효율로 표적 부위로의 변이 도입이 가능하게 되도록 가이드 RNA를 설계할 수 있다.

CRISPR 시스템에서는, PAM 서열이라고 불리는 3 염기의 서열(가장 일반적인 S.pyogenes 유래 Cas9를 사용하는 경우, NGG)의 3 염기 전이 기본적으로 절단된다. 표적 서열의 직후에 PAM 서열이 존재할 필요가 있기 때문에, PAM 서열의 상류를 표적 서열로 하여 가이드 RNA를 설계할 수 있다. 예를 들어, 토마토의 3번 염색체에 존재하는 eIF4E 유전자의 mRNA에 대응하는 서열(서열 번호 1)을 나타내는 도 1 중, 엑손 2(도 1 중 파선부. 서열 번호 2)에 존재하는 사각으로 나타낸 개소를 PAM 서열로 하고, 이 3 염기로부터 상류의 통상 20 염기(서열 번호 3)를 표적으로서 가이드 RNA를 설계할 수 있다. 가지과의 다른 식물에 대하여 직접 게놈 편집을 행하는 경우에도, 토마토의 경우와 마찬가지로 CMV에 대하여 기능적인 eIF4E 코딩하는 유전자의 엑손 2 중에서 PAM 서열을 선택하여 가이드 RNA를 설계하고, 이 표적 부위에 변이를 도입하여 CMV 저항성 유전자를 갖는 식물을 작출할 수 있다.

가이드 RNA의 염기 서열에 있어서의 GC 함유율이 높을수록 절단 효율이 높아지기 때문에, GC 함유율을 고려하여 가이드 RNA를 설계할 수 있다. 또한, 오프 타깃 효과에 의한 비특이적인 절단을 최대한 줄이도록 설계할 수 있다. 일 양태에 있어서 식물이 토마토일 경우, 가이드 RNA는 3번 염색체의 엑손 2 중의 특정한 서열(서열 번호 3)을 표적으로 하는 염기 서열을 갖도록 설계할 수 있다.

CRISPR 시스템에 의해 1군데의 이중쇄 절단을 도입하면, 20 염기 정도가 수복되어 수복 에러에 의해 변이가 도입된다고 생각된다. 따라서, 일 양태에 있어서 본 실시 형태의 CMV 저항성 유전자가 갖는 변이는 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1 내지 7, 바람직하게는 1 내지 3)의 변이이다.

이어서, 상기 (2)의 방법에 대하여 설명한다. 이 방법은 하기 (A)와 (B)의 공정을 조합한 방법이다. (A)와 (B)를 실시하는 순서는 식물이 죽음에 이르지 않는 한, (B)를 먼저 실시해도 된다. 또한, (B)만을 특정한 부위에 있어서 실시하는 방법이 상기 (1)의 방법이다.

(A) CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 유전자를 제작하고, 적당한 프로모터를 사용하여 식물에 도입하는 공정.

(A)의 변이 유전자의 제작은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있고, 예를 들어 원하는 변이를 갖는 염기 서열을 합성하고, 이것을 PCR 등으로 증폭하여 얻을 수 있다. 제작한 변이 유전자의 식물로의 도입도 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 간편하게는 변이 유전자를 탑재한 벡터를 사용하여, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜법, 일렉트로포레이션법, 아그로박테리움법, 입자총법 등을 사용하여 실시할 수 있다. 가지과 식물 유래의 eIF4E 유전자를 변이시킨 CMV 저항성 유전자이면, 별종의 식물의 CMV 저항성 유전자를 도입해도 된다.

(B) 식물이 갖는 내생 eIF4E 중 CMV에 대하여 기능적인 eIF4E를 CMV에 대하여 비기능적인 것으로 하는 공정.

(B)의 실시에는, 식물에 변이를 도입하는 방법으로서 공지된 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 이온빔, EMS 등의 변이원 처리를 사용할 수 있다. 상술한 CRISPR이나 TALEN 등의 게놈 편집 기술 등에 의해서도 실시할 수 있다. 내생 eIF4E 중 CMV에 대하여 기능적인 eIF4E를 모두 CMV에 대하여 비기능적인 것으로 하는 것이 바람직하다.

CMV 저항성 유전자를 갖는 식물 세포로부터의 식물체의 재생은 식물의 종류에 따라 당업자에게 공지인 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 토마토에 대해서는 Sun HJ et al., Plant CellPhysiol. 47:426, 2006, 담배에 대해서는 Jefferson RA et al., EMBO J. 6:3901, 1987 등을 참조하여 행할 수 있다.

식물이 CMV 저항성 유전자를 갖는 것의 확인은 상술한 바와 같이, 통상의 방법에 의해 CMV를 접종하고, 식물체 중의 CMV의 축적을 ELISA법, PCR 등으로 확인함으로써, 또한 식물체의 CMV 감염 증상을 관찰함으로써 확인할 수 있다.

CMV 저항성 유전자를 갖는 CMV 저항성 식물이 일단 얻어지면, 당해 식물의 자손이나 클론을 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다. 따라서, 본 실시 형태의 CMV 저항성 식물에는 이들의 자손 및 클론도 포함된다.

본 실시 형태는 또한, 가지과 식물의 eIF4E 유전자를 변이시키는 공정을 포함하는, CMV 저항성 식물의 작출 방법에 관한 것이기도 하다. 당해 방법은 CMV 저항성 식물에 관한 상기 기재를 참조하여 실시할 수 있다. 일 양태에 있어서, 상기 작출 방법은 또한, 본 실시 형태의 CMV 저항성 식물을 자가 수분 또는 타가 수분시켜서 후대를 얻는 공정을 포함한다. 식물의 자가 수분 또는 타가 수분은 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다.

본 실시 형태는 또한, 상기 CMV 저항성 식물을 작출하기 위한 가이드 RNA 및 가이드 RNA를 포함하는 벡터에 관한 것이기도 하다. 가이드 RNA가 갖는 서열은 상술한 바와 같다. 본 실시 형태는 또한, 상기 가이드 RNA를 포함하는 키트에 관한 것이기도 하다. 당해 키트는, CRISPR 시스템에 의한 게놈 편집을 실시하기 위하여 필요한 부위 특이적 뉴클레아제 등을 포함할 수 있고, CMV 저항성 식물을 작출하기 위하여 사용할 수 있다.

실시예

[실시예 1] 3번 염색체 상의 eIF4 유전자에 변이를 도입한 토마토의 작출

먼저, 토마토의 염색체 3번에 존재한다고 되어 있는 eIF4E 유전자(Solyc03g 005870)의 2번째의 엑손(서열 번호 2) 내에 sgRNA가 인식하는 부위를 임의로 설정하고, 이 20 염기 길이(AGGGTAAATCTGATACCAGC(서열 번호 3))의 이중쇄 DNA를 벡터 pUC19_AtU6oligo(고쿠리츠 겐큐 가이하츠 호진 노교 세이부츠 시겐 겐큐쇼로부터 입수) 내의 제한 효소 BbsI 사이트에 구축하였다. 또한, 야생주의 토마토의 3번 염색체에 존재하는 eIF4E의 mRNA 서열에 대응하는 염기 서열을 도 1에 나타낸다(서열 번호 1). 실제의 RNA는 도면 중의 T(티민)가 U(우라실)이다.

이 벡터로부터 sgRNA 서열 영역을 포함하는 카세트 부위를 잘라내고, 바이너리 벡터 pZD_OsU3gYSA_HolgerCas9_NPTII 내의 제한 효소 I-SceI 사이트에 구축하였다. 또한 이 바이너리 벡터를 사용하여 아그로박테리움 LBA4404(다카라 바이오사제)를 형질 전환하였다.

또한, 토마토의 염색체 9번에 존재하는 eIF(iso)4E 유전자(Solyc09g090580)에 대해서도 마찬가지의 방법으로 2번째의 엑손 내의 인식 부위(GGCCACCGAAGCACCGGTAG(서열 번호 10))를 바이너리 벡터에 구축하고, 아그로박테리움을 형질 전환하였다.

형질 전환하는 토마토의 품종은 머니메이커와 자사 품종 S를 사용하였다. 아그로박테리움을 사용한 토마토의 형질 전환은 일반적인 서적 등에 인용되어 있는 방법을 기준으로 했다(형질 전환 프로토콜(가가꾸 도진사)). 즉, 토마토의 종자를 무균 배지에서 파종시킨 자엽편, 또는 통상 파종한 자엽편 혹은 본엽편을 살균한 것을, 전술한 재조합 아그로박테리움 배양액(탁도 0.1 내지 1.0)에 10분 정도 침지하여 아그로박테리움을 감염시켰다.

3일 후 아그로박테리움을 제균하고, 엽편을 카르베니실린(100 내지 500mg/ml), 또는 메로펜(20 내지 50mg/ml)과 카나마이신(30 내지 100mg/ml)을 첨가한 무라시게 스쿠그 배지(MS 배지; MS 기본, 3％ 자당, 1.5mg/L 제아틴, 1％ 한천) 상에 옮기고, 25℃ 조명 하(16시간 조명/8시간 암흑)에서 선발 배양하였다. 그 후, 약 10일 내지 2주일마다 이식 계대로 배지를 교환함으로써, 엽편으로부터 캘러스 형성을 촉진시키고, 계속하여 계대 배양을 반복함으로써 부정아를 유도하였다.

부정아가 몇센티 정도로 커지면, 발근 배지(MS 기본, 1.5％ 자당, 1％ 한천, 50 내지 250mg/ml 카르베니실린, 20 내지 100mg/ml 카나마이신, 경우에 따라 나프탈렌아세트산(NAA) 첨가)에 이식하고, 1개월마다 계대하면서 1 내지 3개월 배양하였다.

발근 배지 배양까지는 모두 무균 배양이다. 발근해 온 개체는 무균 배지로부터 취출하고, 시판하고 있는 흑토나 적옥토 등을 혼합한 포트 배토에 이식하여 생육시켰다.

재생한 개체(트랜스제닉 당대; 이하 T0)가 재조합 및 편집(염기의 결손, 삽입 또는 치환)되어 있는지를 확인하기 위해서, 임의의 프라이머, 예를 들어 Solyc03g005870 내의 영역에 대해서는 프라이머 1(ATCCATCACCCAAGCAAGTTAATT(서열 번호 11)) 및 프라이머 2(GTCCACAAAGCTATTTTTTCTCCC(서열 번호 12)), Solyc09g090580 내의 영역에 대해서는 프라이머3(CCGTCGTGAAAAAGCTATACAAAAGGAG(서열 번호 13)) 및 프라이머4(GCTTTTCGAAGAGAACTTCCCC(서열 번호 14)) 등을 사용하여 PCR(KODPlus Neo/도요보 사)로 증폭하고, 증폭 단편의 편집 부위에 있는 제한 효소 사이트가 제한 효소에 의해 절단되는지를 확인했다(데이터 비제시).

그 결과, 몇 가지의 재생 개체에서 eIF4E의 서열이 편집되어 있는 것이 확인되어, 편집 계통이 선발되었다(표 1).

[실시예 2] 변이 토마토의 CMV 저항성 확인 시험

이어서, 편집 계통의 개체(T0)를 격리 온실 내에서 생육하고, 자가 수분시켜서 종자를 회수하였다. 트랜스제닉 후대(T1)가 되는 이들 종자를 파종하고, 실생묘에 CMV-Y 계통을 기계적 접종하였다. 그 결과, eIF4E의 편집 계통 A127 및 A132의 T1 개체 A127-8, A127-14, A127-21, A127-24, A132-1, A132-5는 접종 20일 이상에서도 증상이 보이지 않았다(도 5). 또한, 항CMV 항체(일본 쇼쿠부츠 보에키 교카이에서 입수)를 사용하여, CMV 접종 20일 이후 바이러스 축적도를 측정하는 ELISA 검정을 행한 바, 비접종주와 동일 정도의 바이러스 축적도이며 CMV의 감염은 확인할 수 없었다(도 2 내지 4). 또한, 당해 개체는 접종 후 60일 이상 지나도 병증이 보이지 않고, CMV 저항성을 나타내고 있었다(표 2).

한편, eIF(iso)4E의 변이 계통인 B95이나 B100의 T1의 실생묘에 CMV를 접종한 것은 모두 접종 20일 후에 증상이 발현되고, 저항성을 나타내지 않았다(데이터 비제시).

[실시예 3] CMV 저항성 유전자의 시퀀싱

전술한 프라이머 1 및 2를 사용하여 CMV 저항성 T1 개체의 eIF4E 편집 부위 부근, 즉 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자 중 엑손 2의 서열(서열 번호 2)의 14번째 부근으로부터 3'측의 영역을 PCR(T100 서멀 사이클러, Bio-Rad사제)로 증폭하고, 증폭 단편을 클로닝하여 염기 서열을 확인하였다.

그 결과, 동 영역에 몇 염기의 결손, 삽입, 혹은 몇 염기의 치환이 확인되었다(도 6a, 6b). 서열 번호 3에 대응하는 영역에 이하의 변이를 갖는 개체가 확인되었다. 밑줄이 변이 개소, 「·」은 염기가 존재하지 않는 개소를 나타낸다.

[실시예 4] PVY 저항성의 확인 시험

A132 및 A143의 T1 종자를 별도로 파종하고, 그들 실생묘에 PVY-N 계통을 접종한 바, 모든 개체에서 접종으로부터 21일 이상 지나도 증상이나 바이러스의 축적이 보이지 않아 PVY 저항성이 확인되었다(도 7).

[실시예 5] 변이 토마토의 CMV 저항성 확인 시험(T2 세대) 1

실시예 2에서 얻어진 T1 개체, A127-24, A132-1 및 A132-5에 대해서, 실시예 2와 마찬가지로 격리 온실 내에서 생육하고, 자가 수분에 의해 T2 종자를 회수하였다.

T2 세대가 되는 이들 종자를 파종하고, 각 T2 세대에 대해서, 도 8 중 우측 란의 괄호 내에 나타내는 주수의 실생묘에 CMV-Y 계통을 기계적 접종하였다. 염기 서열을 확인한 바, A127-24로부터의 T2 세대 16주는 모두 1 염기 삽입 호모(1삽입 호모)였다. A132-1로부터의 T2 세대 30주는 9 염기 결손 호모 4주(9결손 호모), 9 염기 결손/3 염기 결손 16주(9결손/3결손) 및 3 염기 결손 호모 10주(3결손 호모)의 편집 패턴을 포함하고 있었다. A132-5로부터의 T2 세대 27주는 모두 3결손 호모였다. 즉, 도 8중 「9결손 호모」 및 「9결손/3결손」은 A132-1로부터의 T2 세대, 「3결손 호모」는 A132-1 및 A132-5로부터의 T2 세대, 「1삽입 호모」는 A127-24로부터의 T2 세대이다.

접종 20일 후, 실시예 2와 마찬가지의 방법에 의해 CMV 저항성을 확인하였다. 즉, 감염 증상의 관찰과 바이러스 축적도를 측정하는 ELISA 검정에 의해, 바이러스의 이병률을 확인하였다. 결과를 도 8에 나타냈다. 도 8 중, 저항성률이란 ELISA 검정 음성의 주의 비율이다.

[실시예 6] 변이 토마토의 CMV 저항성 확인 시험(T2 세대) 2

또한 3 염기 결손 호모라고 생각되는 A132-5와, 1 염기 삽입 호모라고 생각되는 A127-24의 T2 세대의 실생묘를 사용하여, 실시예 5와 마찬가지로 CMV-Y를 기계적 접종하여 저항성을 확인하였다. 도 9a 중 괄호 내에 나타내는 숫자는 공시(供試) 주수이다. 대조에는, 비편집(비재조합)의 야생주(야생형 품종 S)를 사용하였다. 접종 20일 후, 감염 증상의 관찰에 의해 발병률을 ELISA에 의한 검정에 의해 바이러스 감염율을 조사하고, 종합하여 이병률로서 CMV 저항성을 확인하였다. 도 9b는 몇 가지의 주에 대해서, 바이러스 감염을 ELISA 검정으로 측정한 결과를 나타낸다. 양성 대조로서 야생주(야생형 품종 S)에 CMV 접종한 것을 사용하고, 음성 대조로서 CMV 접종을 하고 있지 않은 야생주를 사용하였다. 그 결과, 도 9a에 나타내는 바와 같이, 도 8 중 1삽입 호모에 해당하는 A127-24로부터의 T2 세대를 포함하고, 어느 주로부터의 T2 세대든 대조에 비해 바이러스 저항성이 높았다.

실시예 5 및 6의 결과로부터, eIF4E 변이는 어느 변이 패턴이든 CMV 저항성을 갖는 것이 T2 세대에서도 확인되었다.

[실시예 7] 진딧물에 의한 충매 접종 시험

오이 모자이크 바이러스(CMV)는 실제 포장에서는 주로 진딧물에 의해 전파 감염되는 것 이외에, 종자 전염, 접촉 전염한다. 그 때문에, 기계적 접종 시험에 더하여, 진딧물 충매 접종 시험을 행하고, 대조와의 저항성의 비교를 행하였다.

먼저, CMV-O 계통을 감염시킨 담배로부터 흡즙시킴으로써, 복숭아혹 진딧물에 CMV를 획득시켰다.

실시예 5에서 얻어진 A132-1로부터의 T2 세대 중, 9 염기 결손 호모주(A132-1-13)의 종자를 파종하고, 본엽 1 내지 2장 사이즈의 실생묘에 CMV를 획득시킨 복숭아혹 진딧물을 1주당 10마리씩 방사하여 충매 접종을 행하였다.

대조에는 야생형 S의 실생묘를 사용하여, 마찬가지의 조건에서 실시하였다. 접종 후 21일에서 26일에 걸쳐서, 증상 조사와 RT-PCR에 의해 이병률을 산출하였다. 즉, 시각적 관찰에 의한 발병률과, RT-PCR에 의한 감염율을 종합한 것이 이병률이다.

RT-PCR에는 프라이머 5 및 6을 사용하여, 효소(역전사 효소 AMV 리버스 트랜스크립타아제(프로메가사제)와 EXTaq 폴리메라아제(다카라 바이오사제))로 행하였다. 그 결과, 편집 계통은 대조에 비해 현저하게 이병률이 낮아져서 CMV 저항성이 있는 것이 확인되었다.

프라이머 5: GTACAGAGTTCAGGGTTGAGCG(서열 번호 15)

프라이머 6: AGCAATACTGCCAACTCAGCTCC(서열 번호 16)

본 발명에 따르면, CMV 저항성의 가지과 식물, CMV 저항성 식물의 작출 방법을 제공하는 것이 가능해진다. 본 발명은 주로 농업 분야에 있어서 산업상 이용 가능성을 갖는다.

SEQUENCE LISTING <110> Kikkoman Corporation National University Corporation Hokkaido University <120> Virus resistant plant and preparation method thereof <130> K0770AJP0007 <150> JP2018-017542 <151> 2018-02-02 <150> 2018-236352 <151> 2018-12-18 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 916 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 1 agtgctccac agtccacaga gcagcaaaaa tggcagcagc tgaaatggag agaacgatgt 60 cgtttgatgc agctgagaag ttgaaggccg ccgatggagg aggaggagag gtagacgatg 120 aacttgaaga aggtgaaatt gttgaagaat caaatgatac ggcatcgtat ttagggaaag 180 aaatcacagt gaagcatcca ttggagcatt catggacttt ttggtttgat aaccctacca 240 ctaaatctcg acaaactgct tggggaagct cacttcgaaa tgtctacact ttctccactg 300 ttgaagattt ttggggtgct tacaataata tccatcaccc aagcaagtta attatgggag 360 cagactttca ttgttttaag cacaaaattg agccaaagtg ggaagatcct gtatgtgcca 420 atggagggac gtggaaaatg agtttttcga agggtaaatc tgataccagc tggctgtata 480 cgctgctggc aatgattgga catcaattcg atcatggaga tgaaatttgt ggagcagttg 540 ttagtgtccg ggctaaggga gaaaaaatag ctttgtggac caagaatgct gcaaatgaaa 600 cagctcaggt tagcattggt aagcaatgga agcagtttct agattacagt gattcggttg 660 gcttcatatt tcacgacgat gcaaagaggc tcgacagaaa tgccaagaat cgttacaccg 720 tatagttctt gatgcagtgt gggattgcaa gaaacacaat tcgtactgga aaggttggta 780 ggtactagtt tagtttctca tttgataagc ttctggtttg agtaactcgt gtgttggtgt 840 ttacactttc taatcgtgga aaattgtttg atttgaatcc atgcctctat gtttcgtcac 900 ataacaaaac acaaat 916 <210> 2 <211> 166 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 2 tgcttacaat aatatccatc acccaagcaa gttaattatg ggagcagact ttcattgttt 60 taagcacaaa attgagccaa agtgggaaga tcctgtatgt gccaatggag ggacgtggaa 120 aatgagtttt tcgaagggta aatctgatac cagctggctg tatacg 166 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 3 agggtaaatc tgataccagc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> variant <400> 4 agggtaaatc tgatacccag c 21 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> variant <400> 5 agggtaaatc tgatagc 17 <210> 6 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> variant <400> 6 agggtaacag c 11 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> variant <400> 7 agggtaaatg tgatagc 17 <210> 8 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> variant <400> 8 agtgtaacag c 11 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> variant <400> 9 agggtaaatg taacagc 17 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 10 ggccaccgaa gcaccggtag 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 1 <400> 11 atccatcacc caagcaagtt aatt 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 2 <400> 12 gtccacaaag ctattttttc tccc 24 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 3 <400> 13 ccgtcgtgaa aaagctatac aaaaggag 28 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 4 <400> 14 gcttttcgaa gagaacttcc cc 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 5 <400> 15 gtacagagtt cagggttgag cg 22 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 6 <400> 16 agcaatactg ccaactcagc tcc 23

Claims

오이 모자이크 바이러스(CMV)에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자를 갖는, CMV 저항성 가지과 식물.
제1항에 있어서, 가지속의 식물인, CMV 저항성 가지과 식물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 식물이 토마토이며, 상기 변이 eIF4E 유전자가 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자인, CMV 저항성 식물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이 eIF4E 유전자가 엑손 2의 염기 서열에, 이하 중 어느 하나 이상의 변이:
(a) 프레임시프트 변이
(b) 넌센스 변이
(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1 내지 7)의 결손
(d) 하나 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입
을 갖는, CMV 저항성 식물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 토마토이며, 상기 변이 eIF4E 유전자가 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자의 엑손 2 중의 염기 서열(서열 번호 2)에 있어서: 1 염기 삽입; 3 염기 결손; 및 9 염기 결손으로 이루어지는 군에서 선택되는 변이를 갖는, CMV 저항성 식물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 토마토이며, 상기 변이 eIF4E 유전자가 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자의 엑손 2 중의 염기 서열 AGGGTAAATCTGATACCAGC(서열 번호 3)에 있어서: 15번째와 16번째의 염기 사이로의 1 염기 삽입; 16 내지 18번째의 3 염기 결손; 8 내지 18번째 중 어느 9 염기의 결손으로 이루어지는 군에서 선택되는 변이를 갖는, CMV 저항성 식물.
가지과 식물의 eIF4E 유전자를 변이시키는 공정을 포함하는, 오이 모자이크 바이러스(CMV) 저항성 식물의 작출 방법이며, 상기 변이가 CMV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코딩하는 변이 eIF4E 유전자로의 변이인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 식물이 토마토이며, 상기 변이 공정이 토마토의 3번 염색체 상의 eIF4E 유전자를 변이시키는 공정인, CMV 저항성 식물의 작출 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 변이 공정이 eIF4E 유전자의 엑손 2의 염기 서열에, 이하 중 어느 하나 이상의 변이:
(a) 프레임시프트 변이
(b) 넌센스 변이
(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1 내지 7)의 결손
(d) 하나 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입
을 도입하는 공정인, CMV 저항성 식물의 작출 방법.