JP7416761B2 - 最適化された組織優先的プロモーターおよびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条に基づいて2018年8月2日に出願された米国仮特許出願第62/713,819号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
本開示は、植物における吸枝の減少または排除に有用な核酸およびタンパク質の発現を改善するための方法および組成物を提供する。
「P34633WO00_SL.TXT」という名称のファイルに含まれる配列表は、733,397バイトであり(MS-Windows(登録商標)で計測)、2019年8月1日に作成され、本明細書に添えて電子的に提出されるものであり、参照によりその全体が援用される。
[本発明1001]
腋芽組織において活性を有するプロモーターを含む核酸分子であって、前記プロモーターが、
(a)配列番号113と少なくとも75%の同一性を有する配列を含み、ここで前記同一性は、前記配列と配列番号113との間のアライメント可能な領域全体に基づきかつ限定され、
(b)配列番号113と比較して少なくとも50個の連続するヌクレオチドの欠失を含み、かつ
(c)異種核酸分子に作動可能に連結されている、
核酸分子。
[本発明1002]
前記プロモーターが、50ヌクレオチド~2450ヌクレオチドを含む、本発明1001の核酸分子。
[本発明1003]
前記欠失が、
(a)少なくとも1つの糖抑制エレメント、
(b)腋芽up2エレメント、
(c)少なくとも1つの芽休眠エレメント、または
(d)(a)、(b)、および(c)の任意の組み合わせ
の欠失を含む、本発明1001の核酸分子。
[本発明1004]
前記プロモーターが、配列番号257と少なくとも85%同一の核酸配列を含む、本発明1001の核酸分子。
[本発明1005]
前記異種核酸分子が、少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物をコードする、本発明1001の核酸分子。
[本発明1006]
前記少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物が、低分子RNAおよびポリペプチドからなる群より選択される、本発明1005の核酸分子。
[本発明1007]
前記ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161~185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、および255からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一または類似のアミノ酸配列を含む、本発明1006の核酸分子。
[本発明1008]
前記低分子RNAが、配列番号83~101からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一または相補的な少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む、本発明1006の核酸分子。
[本発明1009]
プロモーターを含む核酸分子を含むタバコ植物であって、前記プロモーターが、
(a)配列番号113と少なくとも75%の同一性を有する配列を含み、ここで前記同一性は、前記配列と配列番号113との間のアライメント可能な領域全体に基づきかつ限定され、
(b)配列番号113と比較して少なくとも50個の連続するヌクレオチドの欠失を含み、かつ
(c)異種核酸分子に作動可能に連結されており、
前記タバコ植物が、同等の条件下で成長した場合の同じ品種の対照タバコ植物と比較して、摘心後に吸枝を含まないかまたは減少した吸枝を含む、タバコ植物。
[本発明1010]
前記プロモーターが、50ヌクレオチド~2450ヌクレオチドを含む、本発明1009のタバコ植物。
[本発明1011]
前記欠失が、
(a)少なくとも1つの糖抑制エレメント、
(b)腋芽up2エレメント、
(c)少なくとも1つの芽休眠エレメント、または
(d)(a)、(b)、および(c)の任意の組み合わせ
の欠失を含む、本発明1009のタバコ植物。
[本発明1012]
前記プロモーターが、配列番号257と少なくとも85%同一の核酸配列を含む、本発明1009のタバコ植物。
[本発明1013]
前記プロモーターが、前記摘心の少なくとも7日後に腋生分裂組織において活性を有する、本発明1009のタバコ植物。
[本発明1014]
前記プロモーターが、
(a)タバコ苗植物、
(b)茎頂分裂組織、または
(c)(a)および(b)の両方
において活性を有さない、本発明1009のタバコ植物。
[本発明1015]
前記吸枝の減少が、前記吸枝の乾燥生物量の低減、前記吸枝の新鮮重量の低減、前記吸枝の長さの低減、前記吸枝の直径の低減、総吸枝数の減少、またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明1009のタバコ植物。
[本発明1016]
熱風乾燥種タバコ植物、明色種タバコ植物、バーレー種タバコ植物、バージニア種タバコ植物、メリーランド種タバコ植物、ガルパオ種タバコ植物、暗色種タバコ植物、オリエンタル種タバコ植物、およびトルコ種タバコ植物からなる群より選択される、本発明1009のタバコ植物。
[本発明1017]
前記異種核酸分子が、少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物をコードする、本発明1009のタバコ植物。
[本発明1018]
前記少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物が、低分子RNAおよびポリペプチドからなる群より選択される、本発明1017のタバコ植物。
[本発明1019]
前記ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161~185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、および255からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一または類似のアミノ酸配列を含む、本発明1018のタバコ植物。
[本発明1020]
前記低分子RNAが、配列番号83~101からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一または相補的な少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む、本発明1018のタバコ植物。
[本発明1021]
本発明1009のタバコ植物に由来する乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
[本発明1022]
紙巻タバコ(cigarette)、クレテック(kretek)、ビディシガレット(bidi cigarette)、葉巻(cigar)、シガリロ(cigarillo)、非通気式紙巻タバコ(non-ventilated cigarette)、通気式リセスフィルター紙巻タバコ(vented recess filter cigarette)、パイプタバコ(pipe tobacco)、嗅ぎタバコ(snuff)、噛みタバコ(chewing tobacco)、湿性無煙タバコ(moist smokeless tobacco)、ファインカット噛みタバコ(fine cut chewing tobacco)、ロングカット噛みタバコ(long cut chewing tobacco)、およびポーチ噛みタバコ(pouched chewing tobacco)製品からなる群より選択される、本発明1021のタバコ製品。
[本発明1023]
ガム(gum)、タブレット(tablet)、ロゼンジ(lozenge)、および溶解性ストリップ(dissolving strip)からなる群より選択される、本発明1021のタバコ製品。
[本発明1024]
前記乾燥タバコ材料が、空気乾燥(air-cured)タバコ材料、火力乾燥(fire-cured)タバコ材料、日干乾燥(sun-cured)タバコ材料、および熱風乾燥(flue-cured)タバコ材料からなる群より選択される、本発明1021のタバコ製品。
配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83~160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225~228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、および257~260は、核酸配列である。
特に定義しない限り、使用される全ての技術用語および科学用語は、本明細書が属する技術分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。用語が単数形で提供される場合、発明者らはまた、その用語の複数形によって説明される本開示の態様を企図する。参照により援用される参照文献で使用される用語および定義に相違がある場合、本出願で使用される用語は、本明細書に与えられる定義を有するものとする。使用される他の技術用語は、様々な技術分野に特化した辞書、例えば、「The American Heritage(登録商標)Science Dictionary」(Editors of the American Heritage Dictionaries,2011,Houghton Mifflin Harcourt,Boston and New York)、「McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms」(6th edition,2002,McGraw-Hill,New York)、または「Oxford Dictionary of Biology」(6th edition,2008,Oxford University Press,Oxford and New York)によって例示されるように、それらが使用される技術分野においてそれらの通常の意味を有する。
1.腋芽組織において活性を有するプロモーターを含む核酸分子であって、前記プロモーターが、
(a)配列番号113と少なくとも75%の同一性を有する配列を含み、ここで前記同一性は、前記配列と配列番号113との間のアライメント可能な領域全体に基づきかつ限定され、
(b)配列番号113と比較して少なくとも50個の連続するヌクレオチドの欠失を含み、
(c)異種核酸分子に作動可能に連結されている、
核酸分子。
2.前記プロモーターが、50ヌクレオチド~2450ヌクレオチドを含む、実施形態1に記載の核酸分子。
3.前記プロモーターが、少なくとも50ヌクレオチドを含む、実施形態1に記載の核酸分子。
4.前記プロモーターが、少なくとも500ヌクレオチドを含む、実施形態1に記載の核酸分子。
5.前記プロモーターが、少なくとも1000ヌクレオチドを含む、実施形態1に記載の核酸分子。
6.前記プロモーターが、少なくとも2000ヌクレオチドを含む、実施形態1に記載の核酸分子。
7.前記プロモーターが、2つ以下の糖抑制エレメントを含む、実施形態1~6のいずれか1つに記載の核酸分子。
8.前記欠失が、少なくとも1つの糖抑制エレメントの欠失を含む、実施形態1~6のいずれか1つに記載の核酸分子。
9.前記欠失が、少なくとも2つの糖抑制エレメントの欠失を含む、実施形態1~6のいずれか1つに記載の核酸分子。
10.前記欠失が、腋芽up2エレメントの欠失を含む、実施形態1~9のいずれか1つに記載の核酸分子。
11.前記欠失が、少なくとも1つの糖抑制エレメントおよび少なくとも1つの腋芽up2エレメントの欠失を含む、実施形態1~10のいずれか1つに記載の核酸分子。
12.前記欠失が、少なくとも1つの芽休眠エレメントの欠失を含む、実施形態1~11のいずれか1つに記載の核酸分子。
13.前記欠失が、配列番号113と比較して、少なくとも75個の連続するヌクレオチドの欠失を含む、実施形態1~12のいずれか1つに記載の核酸分子。
14.前記欠失が、配列番号113と比較して、少なくとも100個の連続するヌクレオチドの欠失を含む、実施形態1~13のいずれか1つに記載の核酸分子。
15.前記欠失が、配列番号113と比較して、少なくとも200個の連続するヌクレオチドの欠失を含む、実施形態1~14のいずれか1つに記載の核酸分子。
16.前記欠失が、配列番号113と比較して、少なくとも500個の連続するヌクレオチドの欠失を含む、実施形態1~15のいずれか1つに記載の核酸分子。
17.前記プロモーターが、配列番号257と少なくとも85%同一の核酸配列を含む、実施形態1~16のいずれか1つに記載の核酸分子。
18.前記異種核酸分子が、少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物をコードする、実施形態1~17のいずれか1つに記載の核酸分子。
19.前記少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物が、低分子RNAおよびポリペプチドからなる群より選択される、実施形態18に記載の核酸分子。
20.前記ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161~185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、および255からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一または類似のアミノ酸配列を含む、実施形態19に記載の核酸分子。
21.前記低分子RNAが、配列番号83~101からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一または相補的な少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態19に記載の核酸分子。
22.腋芽組織において活性を有するプロモーターを含む核酸分子を含むタバコ植物であって、前記プロモーターが、
(a)配列番号113と少なくとも75%の同一性を有する配列を含み、前記同一性は、前記配列と配列番号113との間のアライメント可能な領域全体に基づきかつ限定され、
(b)配列番号113と比較して少なくとも50個の連続するヌクレオチドの欠失を含み、かつ
(c)異種核酸分子に作動可能に連結されており、
前記タバコ植物が、同等の条件下で成長した場合の同じ品種の対照タバコ植物と比較して、摘心後に吸枝を含まないかまたは減少した吸枝を含む、タバコ植物。
23.前記プロモーターが、50ヌクレオチド~2450ヌクレオチドを含む、実施形態22に記載のタバコ植物。
24.前記プロモーターが、少なくとも50ヌクレオチドを含む、実施形態22に記載のタバコ植物。
25.前記プロモーターが、少なくとも500ヌクレオチドを含む、実施形態22に記載のタバコ植物。
26.前記プロモーターが、少なくとも1000ヌクレオチドを含む、実施形態22に記載のタバコ植物。
27.前記プロモーターが、少なくとも2000ヌクレオチドを含む、実施形態22に記載のタバコ植物。
28.前記プロモーターが、2つ以下の糖抑制エレメントを含む、実施形態22~27のいずれか1つに記載のタバコ植物。
29.前記欠失が、少なくとも1つの糖抑制エレメントの欠失を含む、実施形態22~27のいずれか1つに記載のタバコ植物。
30.前記欠失が、少なくとも2つの糖抑制エレメントの欠失を含む、実施形態22~27のいずれか1つに記載のタバコ植物。
31.前記欠失が、腋芽up2エレメントの欠失を含む、実施形態22~30のいずれか1つに記載のタバコ植物。
32.前記欠失が、少なくとも1つの糖抑制エレメントおよび少なくとも1つの腋芽up2エレメントの欠失を含む、実施形態22~31のいずれか1つに記載のタバコ植物。
33.前記欠失が、少なくとも1つの芽休眠エレメントの欠失を含む、実施形態22~32のいずれか1つに記載のタバコ植物。
34.前記欠失が、配列番号113と比較して、少なくとも75個の連続するヌクレオチドの欠失を含む、実施形態22~33のいずれか1つに記載のタバコ植物。
35.前記欠失が、配列番号113と比較して、少なくとも100個の連続するヌクレオチドの欠失を含む、実施形態22~34のいずれか1つに記載のタバコ植物。
36.前記欠失が、配列番号113と比較して、少なくとも200個の連続するヌクレオチドの欠失を含む、実施形態22~35のいずれか1つに記載のタバコ植物。
37.前記欠失が、配列番号113と比較して、少なくとも500個の連続するヌクレオチドの欠失を含む、実施形態22~36のいずれか1つに記載のタバコ植物。
38.前記プロモーターが、配列番号257と少なくとも85%同一の核酸配列を含む、実施形態22~37のいずれか1つに記載のタバコ植物。
39.前記プロモーターが、腋生分裂組織において活性を有する、実施形態22~38のいずれか1つに記載のタバコ植物。
40.前記プロモーターが、前記摘心の少なくとも7日後に、腋生分裂組織において活性を有する、実施形態22~39のいずれか1つに記載のタバコ植物。
41.前記プロモーターが、タバコ苗植物において活性を有さない、実施形態22~40のいずれか1つに記載のタバコ植物。
42.前記プロモーターが、茎頂分裂組織において活性を有さない、実施形態22~41のいずれか1つに記載のタバコ植物。
43.前記摘心の1週間後に測定される前記吸枝がないかまたは減少している、実施形態22~42のいずれか1つに記載のタバコ植物。
44.前記摘心の4週間後に測定される前記吸枝がないかまたは減少している、実施形態22~43のいずれか1つに記載のタバコ植物。
45.前記減少した吸枝が、少なくとも10%少ない吸枝を含む、実施形態22~44のいずれか1つに記載のタバコ植物。
46.前記吸枝の減少が、吸枝の乾燥生物量の低減、吸枝の新鮮重量の低減、吸枝の長さの低減、吸枝の直径の低減、総吸枝数の減少、またはこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態22~45のいずれか1つに記載のタバコ植物。
47.前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比較して、より高い葉収量を含む、実施形態22~46のいずれか1つに記載のタバコ植物。
48.前記タバコ植物が、前記対照植物の高さと等しいかまたはより高い高さを含む、実施形態22~47のいずれか1つに記載のタバコ植物。
49.前記タバコ植物が、BU64植物、CC101植物、CC200植物、CC13植物、CC27植物、CC33植物、CC35植物、CC37植物、CC65植物、CC67植物、CC301植物、CC400植物、CC500植物、CC600植物、CC700植物、CC800植物、CC900植物、CC1063植物、Coker176植物、Coker319植物、Coker371Gold植物、Coker48植物、CU263植物、DF911植物、Galpao植物、GL26H植物、GL338植物、GL350植物、GL395植物、GL600植物、GL737植物、GL939植物、GL973植物、GF157植物、GF318植物、RJR901植物、HB04P植物、K149植物、K326植物、K346植物、K358植物、K394植物、K399植物、K730植物、NC196植物、NC37NF植物、NC471植物、NC55植物、NC92植物、NC2326植物、NC95植物、NC925植物、PVH1118植物、PVH1452植物、PVH2110植物、PVH2254植物、PVH2275植物、VA116植物、VA119植物、KDH959植物、KT200植物、KT204LC植物、KY10植物、KY14植物、KY160植物、KY17植物、KY171植物、KY907植物、KY907LC植物、KTY14xL8 LC植物、Little Crittenden植物、McNair373植物、McNair944植物、雄性不稔KY14xL8植物、Narrow Leaf Madole植物、MS KY171植物、Narrow Leaf Madole(phph)植物、MS Narrow Leaf Madole植物、MS TND950植物、PD7302LC植物、PD7305LC植物、PD7309LC植物、PD7312LC植物、PD7318LC植物、PD7319LC植物、MSTKS2002植物、TKF2002植物、TKF6400植物、TKF4028植物、TKF4024植物、KT206LC植物、KT209LC植物、KT210LC植物、KT212LC植物、NC100植物、NC102植物、NC2000植物、NC291植物、NC297植物、NC299植物、NC3植物、NC4植物、NC5植物、NC6植物、NC7植物、NC606植物、NC71植物、NC72植物、NC810植物、NC BH129植物、NC2002植物、Neal Smith Madole植物、OXFORD207植物、‘Perique’植物、PVH03植物、PVH09植物、PVH19植物、PVH50植物、PVH51植物、R610植物、R630植物、R7-11植物、R7-12植物、RG17植物、RG81植物、RGH51植物、RGH4植物、RGH51植物、RS1410植物、Speight168植物、Speight172植物、Speight179植物、Speight210植物、Speight220植物、Speight225植物、Speight227植物、Speight234植物、Speight G-28植物、Speight G-70植物、Speight H-6植物、Speight H20植物、Speight NF3植物、TI1406植物、TI1269植物、TN86植物、TN86LC植物、TN90植物、TN90LC植物、TN97植物、TN97LC植物、TND94植物、TND950植物、TR(Tom Rosson)Madole植物、VA309植物、およびVA359植物からなる群より選択される、実施形態22~48のいずれか1つに記載のタバコ植物。
50.熱風乾燥種タバコ植物、明色種タバコ植物、バーレー種タバコ植物、バージニア種タバコ植物、メリーランド種タバコ植物、ガルパオ種タバコ植物、暗色種タバコ植物、オリエンタル種タバコ植物、およびトルコ種タバコ植物からなる群より選択される、実施形態22~49のいずれか1つに記載のタバコ植物。
51.前記タバコ植物が、ハイブリッドタバコ植物である、実施形態22~50のいずれか1つに記載のタバコ植物。
52.前記タバコ植物が、雌性不稔タバコ植物である、実施形態22~51のいずれか1つに記載のタバコ植物。
53.前記タバコ植物が、雄性不稔タバコ植物である、実施形態22~52のいずれか1つに記載のタバコ植物。
54.前記雄性不稔タバコ植物が、細胞質雄性不稔タバコ植物である、実施形態53に記載のタバコ植物。
55.前記異種核酸分子が、少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物をコードする、実施形態22~54のいずれか1つに記載のタバコ植物。
56.前記少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物が、低分子RNAおよびポリペプチドからなる群より選択される、実施形態55に記載のタバコ植物。
57.前記ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161~185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、および255からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一または類似のアミノ酸配列を含む、実施形態56に記載のタバコ植物。
58.前記低分子RNAが、配列番号83~101からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一または相補的な少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態56に記載のタバコ植物。
59.実施形態22~58のいずれか1つに記載のタバコ植物のタバコ葉。
60.実施形態22~58のいずれか1つに記載のタバコ植物に由来する乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
61.請求項22に記載のタバコ植物またはその部分から抽出されたアルカロイドを含む、タバコ製品。
62.前記アルカロイドが、ニコチン、ノルニコチン、アナタビン、およびアナバシンからなる群より選択される、請求項60または61に記載のタバコ製品。
63.紙巻タバコ(cigarette)、クレテック(kretek)、ビディシガレット(bidi cigarette)、葉巻(cigar)、シガリロ(cigarillo)、非通気式紙巻タバコ(non-ventilated cigarette)、通気式リセスフィルター紙巻タバコ(vented recess filter cigarette)、パイプタバコ(pipe tobacco)、嗅ぎタバコ(snuff)、噛みタバコ(chewing tobacco)、湿性無煙タバコ(moist smokeless tobacco)、ファインカット噛みタバコ(fine cut chewing tobacco)、ロングカット噛みタバコ(long cut chewing tobacco)、およびポーチ噛みタバコ(pouched chewing tobacco)製品からなる群より選択される、実施形態60に記載のタバコ製品。
64.前記タバコ製品が、ガム(gum)、タブレット(tablet)、ロゼンジ(lozenge)、および溶解性ストリップ(dissolving strip)からなる群より選択される、実施形態60に記載のタバコ製品。
65.無煙タバコ製品(smokeless tobacco product)である、実施形態60~64のいずれか1つに記載のタバコ製品。
66.電子タバコ、電子喫煙物品、エアロゾル化ベイパー製品、および加熱タバコ製品からなる群より選択される、請求項61または62に記載のタバコ製品。
67.前記乾燥タバコ材料が、空気乾燥タバコ材料、火力乾燥タバコ材料、日干乾燥タバコ材料、および熱風乾燥タバコ材料からなる群より選択される、実施形態60または62~66のいずれか1つに記載のタバコ製品。
68.核酸分子を含む植物または種子であって、前記核酸分子が、腋芽組織において活性を有するプロモーターを含み、前記プロモーターが、
(a)配列番号113と少なくとも75%の同一性を有する配列を含み、前記同一性は、前記配列と配列番号113との間のアライメント可能な領域全体に基づきかつ限定され、
(b)配列番号113と比較して少なくとも50個の連続するヌクレオチドの欠失を含み、
(c)腋芽成長抑制生成物をコードする異種核酸分子に作動可能に連結されている、
植物または種子。
69.前記プロモーターが、50ヌクレオチド~2450ヌクレオチドを含む、実施形態68に記載の植物または種子。
70.前記プロモーターが、少なくとも50ヌクレオチドを含む、実施形態68に記載の植物または種子。
71.前記プロモーターが、少なくとも500ヌクレオチドを含む、実施形態68に記載の植物または種子。
72.前記プロモーターが、少なくとも1000ヌクレオチドを含む、実施形態68に記載の植物または種子。
73.前記プロモーターが、少なくとも2000ヌクレオチドを含む、実施形態68に記載の植物または種子。
74.前記プロモーターが、配列番号257と少なくとも85%同一の核酸配列を含む、実施形態68~73のいずれか1つに記載の植物または種子。
75.タバコ植物またはタバコ種子である、実施形態68~73のいずれか1つに記載の植物または種子。
76.同等の条件下で成長した場合の対照植物と比較して、吸枝を含まないかまたは減少した吸枝を含む、実施形態68~74のいずれか1つに記載の植物。
77.前記腋芽成長抑制生成物が、低分子RNAおよびポリペプチドからなる群より選択される、実施形態68~75のいずれか1つに記載の植物または種子。
78.前記ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161~185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、および255からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一または類似のアミノ酸配列を含む、実施形態77に記載のタバコ植物または種子。
79.前記低分子RNAが、配列番号83~101からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一または相補的な少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態77に記載の植物または種子。
80.タバコ植物において摘心により誘導される吸枝を制御する方法であって、
(a)タバコ細胞に核酸分子を導入する工程であって、前記核酸分子が、腋芽組織において活性を有するプロモーターを含み、前記プロモーターが、
(i)配列番号113と少なくとも75%の同一性を有する配列を含み、ここで前記同一性は、前記配列と配列番号113との間のアライメント可能な領域全体に基づきかつ限定され、
(ii)配列番号113と比較して少なくとも50個の連続するヌクレオチドの欠失を含み、
(iii)腋芽成長抑制生成物をコードする異種核酸分子に作動可能に連結されている、
工程と、
(b)前記タバコ細胞からタバコ植物を再生する工程であって、前記タバコ植物が、同等の条件下で成長した対照タバコ植物と比較して、摘心により誘導される吸枝を含まないかまたは減少した吸枝を含む、工程と
を含む、方法。
81.前記導入が、アグロバクテリウム媒介形質転換を含む、実施形態80に記載の方法。
82.前記導入が、エレクトロポレーションを含む、実施形態80に記載の方法。
83.前記導入が、前記核酸分子の遺伝子銃送達を含む、実施形態80に記載の方法。
84.前記タバコ細胞が、プロトプラスト細胞である、実施形態80~83のいずれか1つに記載の方法。
85.前記タバコ細胞が、カルス細胞である、実施形態80~83のいずれか1つに記載の方法。
86.前記タバコ細胞が、種子細胞、果実細胞、葉細胞、子葉細胞、胚軸細胞、分裂組織細胞、胚細胞、胚乳細胞、根細胞、シュート細胞、幹細胞、花細胞、花序細胞、柄細胞、小花柄細胞、花柱細胞、柱頭細胞、花床細胞、花弁細胞、萼片細胞、花粉細胞、葯細胞、花糸細胞、子房細胞、胚珠細胞、果皮細胞、および篩部細胞からなる群より選択される、実施形態80~83のいずれか1つに記載の方法。
87.核酸分子を含むタバコ種子を栽植する工程を含む、タバコ植物を成長させる方法であって、前記核酸分子が、腋芽組織において活性を有するプロモーターを含み、前記プロモーターが、
(a)配列番号113と少なくとも75%の同一性を有する配列を含み、ここで前記同一性は、前記配列と配列番号113との間のアライメント可能な領域全体に基づきかつ限定され、
(b)配列番号113と比較して少なくとも50個の連続するヌクレオチドの欠失を含み、かつ
(c)腋芽成長抑制生成物をコードする異種核酸分子に作動可能に連結されており、
前記タバコ種子が発芽して、同等の条件下で成長した対照タバコ植物と比較して、摘心により誘導される吸枝を含まないかまたは減少した吸枝を含む、タバコ植物になる、方法。
88.前記プロモーターが、50ヌクレオチド~2450ヌクレオチドを含む、実施形態80~87のいずれか1つに記載の方法。
89.前記プロモーターが、少なくとも50ヌクレオチドを含む、実施形態80~87のいずれか1つに記載の方法。
90.前記プロモーターが、少なくとも500ヌクレオチドを含む、実施形態80~87のいずれか1つに記載の方法。
91.前記プロモーターが、少なくとも1000ヌクレオチドを含む、実施形態80~87のいずれか1つに記載の方法。
92.前記プロモーターが、少なくとも2000ヌクレオチドを含む、実施形態80~87のいずれか1つに記載の方法。
93.前記プロモーターが、配列番号257と少なくとも85%同一の核酸配列を含む、実施形態80~92のいずれか1つに記載の方法。
94.前記タバコ植物が、BU64植物、CC101植物、CC200植物、CC13植物、CC27植物、CC33植物、CC35植物、CC37植物、CC65植物、CC67植物、CC301植物、CC400植物、CC500植物、CC600植物、CC700植物、CC800植物、CC900植物、CC1063植物、Coker176植物、Coker319植物、Coker371Gold植物、Coker48植物、CU263植物、DF911植物、Galpao植物、GL26H植物、GL338植物、GL350植物、GL395植物、GL600植物、GL737植物、GL939植物、GL973植物、GF157植物、GF318植物、RJR901植物、HB04P植物、K149植物、K326植物、K346植物、K358植物、K394植物、K399植物、K730植物、NC196植物、NC37NF植物、NC471植物、NC55植物、NC92植物、NC2326植物、NC95植物、NC925植物、PVH1118植物、PVH1452植物、PVH2110植物、PVH2254植物、PVH2275植物、VA116植物、VA119植物、KDH959植物、KT200植物、KT204LC植物、KY10植物、KY14植物、KY160植物、KY17植物、KY171植物、KY907植物、KY907LC植物、KTY14xL8 LC植物、Little Crittenden植物、McNair373植物、McNair944植物、雄性不稔KY14xL8植物、Narrow Leaf Madole植物、MS KY171植物、Narrow Leaf Madole(phph)植物、MS Narrow Leaf Madole植物、MS TND950植物、PD7302LC植物、PD7305LC植物、PD7309LC植物、PD7312LC植物、PD7318LC植物、PD7319LC植物、MSTKS2002植物、TKF2002植物、TKF6400植物、TKF4028植物、TKF4024植物、KT206LC植物、KT209LC植物、KT210LC植物、KT212LC植物、NC100植物、NC102植物、NC2000植物、NC291植物、NC297植物、NC299植物、NC3植物、NC4植物、NC5植物、NC6植物、NC7植物、NC606植物、NC71植物、NC72植物、NC810植物、NC BH129植物、NC2002植物、Neal Smith Madole植物、OXFORD207植物、‘Perique’植物、PVH03植物、PVH09植物、PVH19植物、PVH50植物、PVH51植物、R610植物、R630植物、R7-11植物、R7-12植物、RG17植物、RG81植物、RGH51植物、RGH4植物、RGH51植物、RS1410植物、Speight168植物、Speight172植物、Speight179植物、Speight210植物、Speight220植物、Speight225植物、Speight227植物、Speight234植物、Speight G-28植物、Speight G-70植物、Speight H-6植物、Speight H20植物、Speight NF3植物、TI1406植物、TI1269植物、TN86植物、TN86LC植物、TN90植物、TN90LC植物、TN97植物、TN97LC植物、TND94植物、TND950植物、TR(Tom Rosson)Madole植物、VA309植物、およびVA359植物からなる群より選択される、実施形態80~93のいずれか1つに記載の方法。
95.前記タバコ植物が、熱風乾燥種タバコ植物、明色種タバコ植物、バーレー種タバコ植物、バージニア種タバコ植物、メリーランド種タバコ植物、ガルパオ種タバコ植物、暗色種タバコ植物、オリエンタル種タバコ植物、およびトルコ種タバコ植物からなる群より選択される、実施形態80~93のいずれか1つに記載の方法。
96.前記タバコ植物が、ハイブリッドタバコ植物である、実施形態80~95のいずれか1つに記載の方法。
97.前記タバコ植物が、雌性不稔タバコ植物である、実施形態80~95のいずれか1つに記載の方法。
98.前記タバコ植物が、雄性不稔タバコ植物である、実施形態80~97のいずれか1つに記載の方法。
99.前記雄性不稔タバコ植物が、細胞質雄性不稔タバコ植物である、実施形態95に記載の方法。
100.前記腋芽成長抑制生成物が、低分子RNAおよびポリペプチドからなる群より選択される、実施形態80~99のいずれか1つに記載の方法。
101.前記ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161~185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、および255からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一または類似のアミノ酸配列を含む、実施形態100に記載の方法。
102.前記低分子RNAが、配列番号83~101からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一または相補的な少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態100に記載の方法。
発現ベクター、p45-2-7(配列番号112、図1)を骨格として使用して、複数の形質転換ベクターを生成する。p45-2-7は、CsVMVプロモーター、NOSターミネーター、およびActin2プロモーターおよびNOSターミネーターに作動可能に連結されたカナマイシン選択マーカー(NPTII)を含むカセットを含有する。目的の導入遺伝子を含む核酸ベクターを、アグロバクテリウム形質転換を介してタバコの葉ディスク(leaf disc)に導入する。例えば、Mayo et al.,2006,Nat Protoc.1:1105-11 and Horsch et al.,1985,Science 227:1229-1231を参照されたい。
米国特許出願公開第2017/0260535号(参照により本明細書に援用される)に記載されているように、腋芽成長抑制生成物が組織依存的な様式で発現する場合(例えば、腋芽においてのみ)、腋芽成長抑制生成物の発現をより良く利用して、改変植物における吸枝の伸長を低減または排除することができる。配列番号113は、腋芽優先的発現を有するプロモーターとして以前に同定された。US2017/0260535も参照されたい。プロモーターP1の配列(配列番号113)は、3つの糖抑制エレメント、1つの腋芽up2エレメント、および3つの芽休眠エレメントを含むいくつかのシス制御エレメントを含む。図2および表2を参照されたい。配列番号257は、1つの糖抑制エレメントの欠失を含む配列の5’末端からの100ヌクレオチド欠失を除いて、配列番号113と同一である。表2を参照されたい。
実施例1および2に記載されるように、配列番号113または配列番号257のいずれかを用いて、バルナーゼ(配列番号79)の発現を駆動する2つの構築物を作製した。実施例1に記載されるように、タバコ植物を生成した。
Claims (22)
- 腋芽組織において活性を有するプロモーターを含む核酸分子であって、前記プロモーターが、
(a)配列番号257を含み、かつ
(b)異種核酸分子に作動可能に連結されている、
核酸分子。 - 前記異種核酸分子が、少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物をコードする、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物が、低分子RNAおよびポリペプチドからなる群より選択される、請求項2に記載の核酸分子。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161~185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、および255からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の核酸分子。
- 前記低分子RNAが、配列番号83~101からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一または相補的な少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む、請求項3に記載の核酸分子。
- プロモーターを含む核酸分子を含むタバコ植物であって、前記プロモーターが、
(a)配列番号257を含み、かつ
(b)異種核酸分子に作動可能に連結されており、
前記タバコ植物が、同等の条件下で成長した場合の同じ品種の対照タバコ植物と比較して、摘心後に吸枝を含まないかまたは減少した吸枝を含み、
前記対照タバコ植物が、前記異種核酸分子に作動可能に連結されている前記プロモーターを欠いている、タバコ植物。 - 前記プロモーターが、前記摘心の少なくとも7日後に腋生分裂組織において活性を有する、請求項6に記載のタバコ植物。
- 前記プロモーターが、
(a)タバコ苗植物、
(b)茎頂分裂組織、または
(c)(a)および(b)の両方
において活性を有さない、請求項6に記載のタバコ植物。 - 前記吸枝の減少が、前記吸枝の乾燥生物量の低減、前記吸枝の新鮮重量の低減、前記吸枝の長さの低減、前記吸枝の直径の低減、総吸枝数の減少、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項6に記載のタバコ植物。
- 熱風乾燥種タバコ植物、明色種タバコ植物、バーレー種タバコ植物、バージニア種タバコ植物、メリーランド種タバコ植物、ガルパオ種タバコ植物、暗色種タバコ植物、オリエンタル種タバコ植物、およびトルコ種タバコ植物からなる群より選択される、請求項6に記載のタバコ植物。
- 前記異種核酸分子が、少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物をコードする、請求項6に記載のタバコ植物。
- 前記少なくとも1つの腋芽成長抑制生成物が、低分子RNAおよびポリペプチドからなる群より選択される、請求項11に記載のタバコ植物。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161~185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、および255からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載のタバコ植物。
- 前記低分子RNAが、配列番号83~101からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一または相補的な少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む、請求項12に記載のタバコ植物。
- 請求項6~14のいずれか一項に記載のタバコ植物に由来する乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
- 紙巻タバコ(cigarette)、クレテック(kretek)、ビディシガレット(bidi cigarette)、葉巻(cigar)、シガリロ(cigarillo)、非通気式紙巻タバコ(non-ventilated cigarette)、通気式リセスフィルター紙巻タバコ(vented recess filter cigarette)、パイプタバコ(pipe tobacco)、嗅ぎタバコ(snuff)、噛みタバコ(chewing tobacco)、湿性無煙タバコ(moist smokeless tobacco)、ファインカット噛みタバコ(fine cut chewing tobacco)、ロングカット噛みタバコ(long cut chewing tobacco)、およびポーチ噛みタバコ(pouched chewing tobacco)製品からなる群より選択される、請求項15に記載のタバコ製品。
- ガム(gum)、タブレット(tablet)、ロゼンジ(lozenge)、および溶解性ストリップ(dissolving strip)からなる群より選択される、請求項15に記載のタバコ製品。
- 前記乾燥タバコ材料が、空気乾燥(air-cured)タバコ材料、火力乾燥(fire-cured)タバコ材料、日干乾燥(sun-cured)タバコ材料、および熱風乾燥(flue-cured)タバコ材料からなる群より選択される、請求項15に記載のタバコ製品。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、タバコの葉。
- 請求項19に記載のタバコの葉を含む乾燥タバコ材料であって、空気乾燥タバコ材料、火力乾燥タバコ材料、日干乾燥タバコ材料、および熱風乾燥タバコからなる群より選択される、前記乾燥タバコ材料。
- バーレータバコ(Burley tobacco)、メリーランドタバコ(Maryland tobacco)、明色タバコ(bright tobacco)、バージニアタバコ(Virginia tobacco)、オリエンタルタバコ(Oriental tobacco)、トルコタバコ(Turkish tobacco)、およびガルパオタバコ(Galpao tobacco)からなる群より選択されるタバコのタイプに由来する、請求項20に記載の乾燥タバコ材料。
- 請求項20に記載の乾燥タバコ材料を含む、乾燥タバコ葉の俵(bale)。
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