CN117561274A - 增加毛状体密度和改善植物毛状体中代谢物的运输 - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本公开涉及与毛状体密度的改变和代谢物的运输相关的组合物和方法及其在包括烟草的植物中的用途。所提供的转录因子能够增加植物中毛状体的密度。
Description
相关申请的交叉引用和序列表的并入
本申请要求2021年2月3日提交的美国临时专利申请号63/145,259；2021年2月3日提交的美国临时专利申请号63/145,262；以及2021年2月3日提交的美国临时专利申请号63/145,263的权益，所有这些的全部内容通过引用并入本文。本申请还含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表通过援引以其全文特此并入。所述ASCII副本于2022年1月25日创建，名为P335029WO00_SL.txt，在Microsoft 中测量大小为141,791字节。
技术领域
本公开涉及增强植物组织表面上的毛状体起始和发育，以及改善特化代谢物向毛状体中的运输、特化代谢物从毛状体的渗出以及其改变植物(包括烟草)的化学组成的应用。
背景技术
腺毛状体是植物的表皮生长物，其是代谢化合物合成和储存的位点。它们在茎、叶和花组织上的存在为植物提供了抵御各种生物和非生物胁迫的保护。腺毛状体还在特化或次级代谢物的生物合成、储存和分泌中发挥作用。
腺毛状体产生和分泌的代谢物通常是疏水性的(例如，脂肪酸衍生物、类黄酮、萜类化合物)。萜类化合物构成最大且最多样化的一类植物代谢物。萜类化合物的烯类主链由多个五碳(C)异戊二烯单元组成，主要基团为单萜(10C)、倍半萜(15C)和二萜(20C)。这些萜类化合物是通过五碳异戊二烯单元(二甲基烯丙基二磷酸[DMAPP]和异戊烯基二磷酸[IPP])的缩合产生的，最通常是通过将DMAPP依次从头到尾添加到IPP上。
产生的次级代谢物的量通常与植物表皮上存在的腺毛状体密度紧密相关(Chalvin et al.,Cell,25:477-487(2020))。增加植物中次级代谢产物产生的量的一种方法是增加植物表皮上存在的毛状体的密度。毛状体起始的转录调控已被证明涉及转录因子的MYB和C2H2锌指家族的成员。青蒿(Artemisia annua)MYB1(AaMYB1)的转基因过表达已被证明增加毛状体密度和随后的青蒿素的产量(Matias-Hernandez et al.,Plant Journal,90:520-534(2017))。
脂质转移蛋白(LTP)在腺毛状体中特化代谢物的运输中是重要的。研究表明，LTP的过度表达导致植物腺毛状体中渗出物的增加(Choi et al.,Plant Journal,70:480-491(2012))。
由于腺毛状体在萜类化合物的生物合成和分泌中的重要作用，因此需要更好地了解植物中参与控制毛状体起始和发育的基因、调节因子和信号传导机制。了解这些特化代谢物分泌到毛状体角质层中的方式也很重要。在本公开中，提供了可用于改变植物中毛状体密度的候选基因。毛状体密度的改变也将改善腺毛状体中特化代谢物的运输。
发明内容
在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
在一个方面，本公开提供了来自包含重组核酸分子的经修饰的烟草植物或烟草植物部分的熟化(cured)烟草材料，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
在一个方面，本公开提供了一种包含来自经修饰的烟草植物、烟草种子或烟草植物部分的材料的烟草产品，该经修饰的烟草植物、烟草种子或烟草植物部分包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)获得包含重组核酸分子的至少一个植物，该重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子；(b)将所述至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子；(c)选择步骤(b)中产生的所述至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中所述至少一个后代种子或由其萌发的植物包含所述重组核酸分子。
在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将重组核酸分子引入至少一个植物细胞，该重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子；(b)选择来自步骤(a)的至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。
在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中所述经修饰的烟草植物或其部分包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子，至至少一个植物细胞/。
在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子，至至少一个植物细胞。
在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。
序列简述
SEQ ID NO:1至12是可用于克隆本文所述的核酸序列以在转基因植物中表达的引物。
SEQ ID NO:13至17是对应于本文所述的目的烟草基因，特别是NtMYB86、NtGIS、NbGIS和NtLTP1，的编码序列的核酸序列。
SEQ ID NO:18至22是对应于SEQ ID NO:13至17的核酸序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23至27是对应于本文所述的目的烟草基因，特别是NtMYB86、NtGIS、NbGIS和NtLTP1，的基因组序列的核酸序列。
SEQ ID NO:28至30是对应于本文所述的目的基因，特别是MYB61、GIS3和非特异性脂质转移蛋白质1样，的编码序列的核酸序列。
SEQ ID NO:31至33是对应于SEQ ID NO:28至30的核酸序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34至36是对应于本文所述的目的基因，特别是MYB61、GIS3和非特异性脂质转移蛋白质1样，的基因组序列的核酸序列。
SEQ ID NO:37是对应于青蒿(Artemisia annua)，特别是MYB转录因子的编码序列的核酸序列。
SEQ ID NO:38是对应于SEQ ID NO:37的核酸序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39至43是对应于本文所述的目的烟草基因，特别是MFS、NMD、CBTS2a(HM)、GGPPS2和顺式冷杉醇合酶(ABS)，的编码序列的核酸序列。
SEQ ID NO:44至48是对应于本文所述的目的烟草基因，特别是MFS、NMD、CBTS2a(HM)、GGPPS2和顺式冷杉醇合酶(ABS)，的基因组序列的核酸序列。
SEQ ID NO:49至53是对应于SEQ ID NO:39至43的核酸序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:54至62和63至71分别是烟草LTP基因的对应于编码序列的核酸序列和基因组序列。
SEQ ID NO:72至80是对应于SEQ ID NO:54至62的核酸序列的氨基酸序列。SEQ IDNO:81是共有LTP氨基酸序列。如图9所示，SEQ ID NO:82至91是SEQ ID NO:21和72至80的子序列。SEQ ID NO:92是图9中所示的共有氨基酸序列。
表1提供了本公开中使用的核酸序列和氨基酸序列。
表1.本公开中使用的序列
附图说明
图1包括图面A、B和C。图面A描绘了本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中的腺毛状体。图面B描绘了普通烟草(Nicotiana tabacum)品种“TN90”中的腺毛状体，图面C描绘了普通烟草品种“Izmir Ego”中的腺毛状体。
图2描绘了用于烟草转化的表达载体。
图3包括图面图3A和图3B。图3A描绘了烟草植物中MYB转录因子家族的DNA结合结构域的系统发育分析(N＝319)。图3B描绘了烟草MYB86基因(SEQ ID NO:18，XP_016450602.1)和青蒿(Artemisia annua)MYB(SEQ ID NO:38，AGR40501.1)的蛋白质序列成对比对，特别地突出显示了R2和R3 DNA结合结构域(包含在方框内)。实心圆指示进化分枝图上的MYB86。图3A中的比例尺代表用于推断系统发育树的进化距离。
图4描绘了烟草植物中C2H2转录因子的无毛花序茎(glabrous inflorescencestems)(GIS)家族的系统发育分析(N＝247)。实心圆指示进化分枝图上的NtGIS基因(SEQID NO:19)。比例尺代表用于推断系统发育树的进化距离。
图5包括图面A、B、C和D。图面A描绘了野生型(WT)TN90的远轴叶中脉中的腺毛状体密度。图面B描绘了在CaMV 35S启动子控制下过表达NtMYB86(SEQ ID NO:13)的TN90的远轴中脉中的腺毛状体密度，证明了与野生型TN90相比腺毛状体密度的增加。野生型(WT)本氏烟草叶蒂的远轴视图显示在图面C中。图面D描绘了与野生型(图面C)相比，在CaMV 35S启动子控制下过表达NtMYB86的本氏烟草中腺毛状体密度的增加。图像是在10x放大倍率下显示的光学显微照片。
图6包括图面A和图面B。图面A描绘野生型(WT)本氏烟草的主营养茎中的腺毛状体密度。图面B描绘了过表达NtMYB86(SEQ ID NO:18)的本氏烟草的主营养茎中的腺毛状体密度。图像是在160x放大倍率下显示的光学显微照片。
图7包括图面图7A和图7B。图7A描绘了与野生型普通烟草品种Izmir Ego(a)相比，在Izmir Ego背景中过表达NtMYB86(SEQ ID NO:18)(b)、NtGIS(SEQ ID NO:19)(c)和NbGIS(SEQ ID NO:20)(c)的烟叶腺毛状体密度的光学显微照片。图像在70x放大倍率下显示，比例尺代表1毫米。图7B描绘了过表达NtMYB86(SEQ ID NO:18)、NtGIS(SEQ ID NO:19)和NbGIS(SEQ ID NO:20)的Izmir Ego WT、Izmir Ego T0转基因品系的叶毛状体计数。
图8包括图面图8A和图8B。图8A描绘了LTP基因家族的系统发育分析，且NtLTP1基因的位置用实心圆标记。图8B描绘了烟草植物中两种NtLTP1亚型(按出现顺序分别为SEQID NO:21、22和93)的序列比对和基因结构比较。
图9描绘了按照ClustalW多序列比对算法在烟草基因组中鉴定的76的代表性数量的NtLTP的保守基序。六个保守的半胱氨酸残基(包含在方框内)在≥90％的已鉴定NtLTP中显著保守。
图10描绘了T0代中九个独立的Izmir Ego转基因品系中NtMYB86(SEQ ID NO:14)的相对基因表达。按照2(-ΔΔC(t))方法对相对基因表达进行定量。有关2(-ΔΔC(t))方法的信息，参见Livak和Schmittgen,Methods,25:402-408(2001)。NtMYB86在野生型对照Izmir Ego植物中的表达用作基线(例如，野生型表达设置为1)，并且未显示。
图11描绘了T0代中八个独立的Izmir Ego转基因品系中NtGIS(SEQ ID NO:16)的相对基因表达。按照2-ΔΔCT方法对相对基因表达进行定量。NtGIS在野生型对照Izmir Ego植物中的表达用作基线(例如，野生型表达设置为1)，并且未显示。
图12描绘了过表达NbGIS(SEQ ID NO:20)、NtGIS(SEQ ID NO:19)、NtMFS(SEQ IDNO:39)、NtNMD(29837；SEQ ID NO:40)、林烟草(Nicotiana sylvestris)西柏三烯醇合酶2a(HM；SEQ ID NO:41)、香叶基香叶基二磷酸合酶(GQ；SEQ ID NO:42)和顺式冷杉醇合酶(AAB；SEQ ID NO:43)的T0 Izmir Ego转基因品系的叶中杜法三烯二醇的相对丰度。
图13描绘了过表达NbGIS(SEQ ID NO:20)、NtGIS(SEQ ID NO:19)、NtMFS(SEQ IDNO:39)、NtNMD(29837；SEQ ID NO:40)、林烟草西柏三烯醇合酶2a(HM；SEQ ID NO:41)、香叶基香叶基二磷酸合酶(GQ；SEQ ID NO:42)和顺式冷杉醇合酶(AAB；SEQ ID NO:43)的T0Izmir Ego转基因品系的叶中新植二烯的相对丰度。
图14描绘了过表达NbGIS(SEQ ID NO:20)、NtGIS(SEQ ID NO:19)、NtMFS(SEQ IDNO:39)、NtNMD(29837；SEQ ID NO:40)、林烟草西柏三烯醇合酶2a(HM；SEQ ID NO:41)、香叶基香叶基二磷酸合酶(GQ；SEQ ID NO:42)和顺式冷杉醇合酶(AAB；SEQ ID NO:43)的T0Izmir Ego转基因品系的叶中2,4-二甲基-1-庚烯的相对丰度。
图15描绘了过表达NbGIS(SEQ ID NO:20)、NtGIS(SEQ ID NO:19)、NtMFS(SEQ IDNO:39)、NtNMD(29837；SEQ ID NO:40)、林烟草西柏三烯醇合酶2a(HM；SEQ ID NO:41)、香叶基香叶基二磷酸合酶(GQ；SEQ ID NO:42)和顺式冷杉醇合酶(AAB；SEQ ID NO:43)的T0Izmir Ego转基因品系的叶中顺式冷杉醇的相对丰度。
图16描述了在Izmir Ego品种的T1转基因烟草品系中在CaMV 35S启动子控制下的NtMYB86(SEQ ID NO:13)的相对基因表达水平。
图16描述了在Izmir Ego品种的T1转基因烟草品系中在CaMV 35S启动子控制下的NbGIS(SEQ ID NO:15)的相对基因表达水平。
具体实施方式
除非另外定义，否则所用的全部技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在术语以单数形式提供的情况下，发明人还考虑了由该术语的复数形式描述的本公开的方面。当通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异时，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其他技术术语具有它们所使用的领域中的普通含义，如各种领域特定的词典示例的，例如“The AmericanScience Dictionary”(美国传统词典编辑，2011，Houghton MifflinHarcourt，波士顿和纽约)、“McGraw-Hill Dictionary of Scientific and TechnicalTerms”(第6版，2002年，McGraw-Hill，纽约)或“Oxford Dictionary of Biology”(第6版，2008，牛津大学出版社，牛津和纽约)。
本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利、公开的专利申请和非专利出版物，均通过引用以其全文并入本文。
当提出一组备选方案时，具体设想了构成该组备选方案的成员的任何和所有组合。例如，如果从由A、B、C和D组成的组中选择一个项，发明人特别地单独设想每个备选方案(例如，单独的A、单独的B等)，以及诸如A、B和D；A和C；B和C；等的组合。术语“和/或”，当用于两个或更多个项的列表中时，是指任何一个列出的项本身或与任何一个或多个其他列出的项组合。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B中的任一者或两者—即，单独的A、单独的B或A和B的组合。表述“A、B和/或C”意指单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合或者A、B和C的组合。
当本文提供数字范围时，该范围被理解为包括该范围的边界以及该范围的限定边界之间的任何数字。例如，“1与10之间”包括1与10之间的任何数字，以及数字1和数字10。
当术语“约”用于指代数字时，被理解为意指±10％。例如，“约100”将包括90至110。
如本文所用，单数形式“一”、“一个”以及“该”包括复数引用，除非上下文中另外明确指明。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
本文提供的任何烟草植物或其部分被特别设想与本文提供的任何方法一起使用。类似地，任何经修饰的烟草植物或其部分被特别设想与本文提供的任何方法一起使用。本文提供的任何核酸序列、氨基酸序列或其他组合物被特别设想与本文提供的任何方法一起使用。
一般来说，毛状体是覆盖大多数气生植物组织的毛样表皮生长物。毛状体往往是多细胞的，但单细胞毛状体也是已知的。在单个植物上可以发现多种类型的毛状体，并且毛状体的形状、大小和细胞组织是变化的。单个毛状体可以分为腺毛状体或非腺毛状体。
腺毛状体(参见图1)的特征是存在由可以分泌或储存大量特化代谢物(例如，萜烯)的细胞组成的头部。在腺毛的组中，毛状体可进一步表征为盾状或头状的。头状腺毛状体通常具有长度超过头部高度两倍的柄，并且毛状体中的细胞数量变化很大。盾状毛状体是一种短柄毛状体，具有由排列成一个或两个同心圆的4至18个细胞组成的大头部。
在一个方面，毛状体是腺毛状体。在一个方面，腺毛状体是头状腺毛状体。在一个方面，腺毛状体是盾状腺毛状体。在一个方面，腺毛状体选自由头状腺毛状体和盾状腺毛状体组成的组。
在一个方面，腺毛状体的起始和发育受到多种转录因子的调节，包括但不限于属于MYB和C2H2转录因子基因家族的基因。
在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含可操作地连接至异源启动子的编码多肽的核酸序列，用于毛状体的起始和发育以提高其密度。在另一方面，本公开提供了经修饰的植物、种子或植物部分，其包含可操作地连接至异源启动子的编码多肽的核酸序列，用于改善代谢物向毛状体表皮的分泌。在进一步的方面，经修饰的植物、种子或植物部分是烟草(Nicotiana)属的植物、种子或植物部分。
毛状体起始的转录因子调控
转录因子是植物生长和发育中涉及的各种生物过程的已知调控因子。几种转录因子已被确定为腺毛起始的调控因子。这些包括但不限于转录因子基因家族R2R3-MYB、HD-ZIP IV、MYC和C2H2(Chavlin et al.,2020)。青蒿中MYB1(AaMYB1)的过表达显著增加倍半萜内酯，青蒿素的产量，以及增加的毛状体密度(Matias-Hernandez et al.，2017)。另一种调控毛状体发育及萜烯生物合成的转录因子是MYC1，碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)。番茄中MYC1(SlMYC1)的敲减导致单萜显著减少以及低密度的较小VI型腺毛状体的异位发育(Xuet al.,Plant Cell,30:2988-3005(2018))。属于C2H2基因家族的转录因子也参与烟草中毛状体发育的调控。本氏烟草中GIS(NbGIS)的过表达导致转基因品系中腺毛状体密度的增加(Liu et al.,Plant Molecular Biology,98:153-167(2018))。
腺毛状体中代谢物的储存和运输
腺毛状体产生大量代谢物，其可占叶片干重的高达20％(Tissier et al.,Trendsin Plant Science,22:930-938(2017))。毛状体发展出使得能够储存次级代谢物的形态特征。这些形态特征的类型、形状和大小取决于腺毛状体的类型。非挥发性化合物(包括二萜类)通常由头状腺毛状体产生，并直接从毛状体尖端分泌，而产生挥发性化合物的腺毛状体具有用于分泌和储存的专门结构(Tissier et al.,2017)。毛状体中疏水性分子的运输需要转运体和脂质转移蛋白(LTP)，其促进挥发性有机化合物跨亲水性细胞壁的运动并防止VOC重新分配到质膜中(Tissier et al.,2017)。LTP是小的(约10kDa)可溶性蛋白质，其特征是高度保守的富半胱氨酸的基序(Salminen et al.,Planta,244:971-997(2016))。参见图10。LTP参与植物生长和发育期间中的各种功能，包括但不限于角质层蜡积累、花粉和种子发育以及细胞扩增(Salminen etal.,2016)。据报道，毛状体特异性NtLTP1在过表达时增加烟草植物中毛状体分泌物的分泌，也增加抵御害虫的保护(Choi et al.,2012)。
植物
在一个方面，本文提供的植物是经修饰的植物。在一个方面，本文提供的种子是经修饰的种子。在一个方面，本文提供的植物部分是经修饰的植物部分。如本文所用，在植物、种子或植物部分的上下文中，“经修饰的”是指包含出于某些目的而引入且超出天然多态性的遗传改变的植物、种子或植物部分。非限制性地，经修饰的植物、种子或植物部分包含重组核酸分子。在另一个方面，经修饰的植物、种子或植物部分包含遗传修饰。在一个方面，经修饰的植物、种子或植物部分是转基因植物、种子或植物部分。
在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少85％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少90％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少95％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少96％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少97％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少98％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ IDNO:18-22和31-33的氨基酸序列至少99％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少99.9％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列100％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:72-81的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少85％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少90％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少95％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少96％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少97％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少98％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少99％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少99.9％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列100％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
在一个方面，本公开提供了包含重组核酸分子的经修饰的植物、种子或植物部分，该重组核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:54-71组成的组的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99％或100％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
在一个方面，与在可比条件下生长的对照植物的叶相比，经修饰的植物的至少一片叶包含更大的平均毛状体密度。在一个方面，与在可比条件下生长的对照植物的叶的远轴侧相比，经修饰的植物的至少一片叶在叶的远轴侧上包含更大的平均毛状体密度。在一个方面，与在可比条件下生长的对照植物的叶的近轴侧相比，经修饰的植物的至少一片叶在叶的近轴侧上包含更大的平均毛状体密度。
在一个方面，与在可比条件下生长的对照植物的两片叶相比，经修饰的植物的至少两片叶包含更大的平均毛状体密度。在一个方面，与在可比条件下生长的对照植物的相同数量的叶相比，经修饰的植物的大部分叶包含更大的平均毛状体密度。在一个方面，与在可比条件下生长的对照植物的所有叶相比，经修饰的植物的所有叶包含更大的平均毛状体密度。
在一个方面，与在可比条件下生长的对照植物的茎相比，经修饰的植物的至少一个茎包含更大的平均毛状体密度。在一个方面，与在可比条件下生长的对照植物的花相比，经修饰的植物的至少一朵花包含更大的平均毛状体密度。在一个方面，与在可比条件下生长的对照植物的根相比，经修饰的植物的至少一条根包含更大的平均毛状体密度。
在一个方面，与对照植物相比，经修饰的植物包含更大的腺毛状体平均密度。在一个方面，与对照植物相比，经修饰的植物包含更大的非腺毛状体平均密度。
在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含至少每平方厘米70个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含至少每平方厘米75个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少80个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少85个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少90个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少95个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少100个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少105个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少110个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少115个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少120个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少125个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少130个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少140个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米至少150个毛状体。
在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至200个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至190个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至180个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至170个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至160个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至150个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至140个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至130个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至120个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至110个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至100个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至90个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至80个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米60至70个毛状体。
在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米80至130个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米80至120个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米80至100个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米75至140个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米75至130个毛状体。在一个方面，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米75至125个毛状体。
在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少1％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少5％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少10％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少15％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少20％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少25％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少30％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少40％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少50％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少60％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少70％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少80％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少90％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少100％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少110％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少125％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少150％的毛状体。在一个方面，与在可比的条件下生长的相同叶龄的对照叶相比，经修饰的烟草植物的叶包含每平方厘米多至少200％的毛状体。
应当理解，除非另有说明，在经修饰的叶和来自生长在可比条件下的对照植物的叶之间的比较必须使用在经修饰的和对照植物上相同叶号(leaf number)的叶(例如，经修饰的V5叶必须与对照V5叶进行比较)。
在一个方面，植物是烟草(tobacco)植物。在一个方面，植物是烟草属(Nicotiana)植物。在一个方面，烟草植物是普通烟草(Nicotiana tabacum)植物。
在一个方面，烟草属植物、种子或植物部分选自由以下组成的组：普通烟草(Nicotiana tabacum)、Nicotiana amplexicaulis PI 271989；本氏烟草(Nicotianabenthamiana)PI 555478；毕基劳氏烟草(Nicotiana bigelovii)PI 555485；迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)；高烟草(Nicotiana excelsior)PI 224063；心叶烟(Nicotianaglutinosa)PI 555507；Nicotiana goodspeedii PI 241012；野生烟草(Nicotianagossei)PI 230953；Nicotiana hesperis PI 271991；奈达烟草(Nicotiana knightiana)PI 555527；海滨烟草(Nicotiana maritima)PI 555535；巨大烟草(Nicotianamegalosiphon)PI 555536；裸茎烟草(Nicotiana nudicaulis)PI 555540；圆锥烟草(Nicotiana paniculata)PI 555545；皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)PI 555548；残波烟草(Nicotiana repanda)PI 555552；黄花烟草(Nicotiana rustica)；香甜烟草(Nicotiana suaveolens)PI 230960；林烟草(Nicotiana sylvestris)PI 555569；绒毛烟草(Nicotiana tomentosa)PI 266379；茸毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)；和三棱烟草(Nicotiana trigonophylla)PI 555572。
在一个方面，种子是烟草种子。在一个方面，种子是烟草属种子。在一个方面，烟草种子是普通烟草或本氏烟草种子。
在一个方面，植物部分是烟草植物部分。在一个方面，植物部分是烟草属植物部分。在一个方面，烟草植物部分是普通烟草植物部分或本氏烟草植物部分。
在一个方面，所提供的植物部分包括但不限于叶、茎、根、毛状体、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、荚果、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、芽、细胞和原生质体。在一个方面，植物部分不包括种子。在一个方面，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的自然繁殖的植物细胞、组织和器官。在另一个方面，本公开还提供了作为繁殖材料并且介导植物自然繁殖的植物细胞、组织和器官。在另一个方面，本公开提供了不能通过光合作用维持自身的植物细胞、组织和器官。在另一个方面，本公开提供了植物体细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、芽、茎、毛状体、荚果、花、花序、杆、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部、维管组织。在另一个方面，本公开提供了植物叶绿体。在进一步的方面，本公开提供了表皮细胞、气孔细胞、叶或根毛、贮藏根或块茎。在另一个方面，本公开提供了烟草原生质体。
熟练的技术人员知道烟草植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养性繁殖。在一个方面，本公开提供了植物胚乳。
本公开提供了来自本文提供的植物的细胞。
如本文所用，“后代植物”或“后代种子”可以来自任何子代，例如，F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7等。
在一个方面，烟草植物、种子或植物部分为选自下组的烟草品种：烤烟品种(flue-cured variety)、淡色烟品种(bright variety)、白肋烟品种(Burley variety)、弗吉尼亚烟品种(Virginia variety)、马里兰烟品种(Maryland variety)、深色烟品种(darkvariety)、烟品种、东方烟品种(Oriental variety)和土耳其烟品种(Turkishvariety)。
在一个方面，烟草细胞为选自下组的烟草品种：烤烟品种(flue-cured variety)、淡色烟品种(bright variety)、白肋烟品种(Burley variety)、弗吉尼亚烟品种(Virginiavariety)、马里兰烟品种(Maryland variety)、深色烟品种(dark variety)、烟品种、东方烟品种(Oriental variety)和土耳其烟品种(Turkish variety)。
在一个方面，烟叶为选自下组的烟草品种：烤烟品种(flue-cured variety)、淡色烟品种(bright variety)、白肋烟品种(Burley variety)、弗吉尼亚烟品种(Virginiavariety)、马里兰烟品种(Maryland variety)、深色烟品种(dark variety)、烟品种、东方烟品种(Oriental variety)和土耳其烟品种(Turkish variety)。
在一个方面，熟化烟叶或植物部分为选自下组的烟草品种：烤烟品种(flue-curedvariety)、淡色烟品种(bright variety)、白肋烟品种(Burley variety)、弗吉尼亚烟品种(Virginia variety)、马里兰烟品种(Maryland variety)、深色烟品种(dark variety)、烟品种、东方烟品种(Oriental variety)和土耳其烟品种(Turkish variety)。熟练的技术人员进一步了解，熟化烟草并不构成活的有机体，并且不能生长或繁殖。
烤烟(flue-cured tobaccos)(也称为“弗吉尼亚”或“淡色”烟草)约占世界烟草产量的40％。烤烟通常也被称为“淡色烟草”，因为在熟化过程中它呈现金黄至深橙的颜色。烤烟具有清淡、明晰的香气和味道。烤烟一般含糖高、含油低。主要烤烟种植国是阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美利坚合众国。在一个方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分为选自由表2中列出的品种和基本上源自任何一种前述品种的任何品种组成的组的烤烟品种。参见WO 2004/041006 A1。在进一步的方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分是选自由K326、K346和NC196组成的组的烤烟品种。
表2.烤烟品种
晾烟(air-cured tobaccos)包括“白肋”、“马里兰”和“深色”烟草。与晾烟关联的共同因素是，熟化主要在没有人工热源和湿度的情况下进行。白肋烟草呈浅至深棕的颜色，含油高，含糖低。白肋烟草通常在谷仓中空气熟化。主要白肋烟草种植国包括阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美利坚合众国。
马里兰烟草极其蓬松，具有良好的燃烧性能、低尼古丁和中性香气。主要马里兰烟草种植国包括美利坚合众国和意大利。
在一个方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分为白肋烟品种，其选自由表3中列出的品种和基本上源自任何一种前述品种的任何品种组成的组。在进一步的方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分是选自由TN 90、KT 209、KT 206、KT212和HB 4488组成的组的白肋烟品种。
表3.白肋烟草品种
在另一个方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分为选自由表4中列出的品种和基本上源自任何一种前述品种的任何品种组成的组的马里兰烟品种。
表4.马里兰烟草品种
| 马里兰10(TC 498) |
| 马里兰14 D2(TC 499) |
| 马里兰201(TC 503) |
| 马里兰21(TC 500) |
| 马里兰341(TC 504) |
| 马里兰40 |
| 马里兰402 |
| 马里兰59(TC 501) |
| 马里兰601 |
| 马里兰609(TC 505) |
| 马里兰64(TC 502) |
| 马里兰872(TC 506) |
| 马里兰Mammoth(TC 507) |
深色晾烟与其他烟草类型的区别主要在于其熟化过程，其使深色晾烟呈现中棕至深棕的颜色和独特的香气。深色晾烟主要用于生产嚼烟和鼻烟。在一个方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分为深色晾烟品种，其选自由以下组成的组：苏门答腊(Sumatra)、东爪哇(Jatim)、多米尼加古巴(Dominican Cubano)、贝苏基(Besuki)、One sucker、绿河(Green River)、弗吉尼亚晒烟(Virginia sun-cured)和Paraguan Passado，以及基本上源自前述任何一个品种的任何品种。
深色明火烤烟(fire-cured tobaccos)通常在封闭熟化晾房的地板上用低燃烧木火进行熟化。深色明火烤烟通常用于制作烟斗混合物、卷烟、嚼烟、鼻烟和浓味雪茄。深色明火烤烟的主要种植区是美利坚合众国的田纳西州、肯塔基州和弗吉尼亚州。在一个方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分为选自由表5中列出的品种和基本上源自任何一种前述品种的任何品种组成的组的深色明火烤烟品种。
表5.深色明火烤烟品种
东方烟草也被称为希腊烟草、芳香烟草和土耳其烟草，因为它们通常生长在东地中海地区，如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马尼亚。东方烟草品种的小植株尺寸、小叶片尺寸和独特的香气特性是它们适应其生长的贫瘠土壤和高压力气候条件的结果。在一个方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分为选自由表6中列出的品种和基本上源自任何一种前述品种的任何品种组成的组的东方烟草品种。
表6.东方烟草品种
在一个方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分为选自由表7中列出的品种和基本上源自任何一种前述品种的任何品种组成的组的雪茄烟草品种。
表7.雪茄烟草品种
在一个方面，本文提供的烟草植物、种子或植物部分为选自由表8中列出的品种和基本上源自任何一种前述品种的任何品种组成的组的烟草品种。
表8.其他烟草品种
| Chocoa(TI 319) |
| Hoja Parada(TI 1089) |
| Hoja Parado(Galpoa)(TI 1068) |
| Perique(St.James Parrish) |
| Perique(TC 556) |
| Perique(TI 1374) |
| Sylvestris(TI 984) |
| TI 179 |
在一个方面，烟草植物或植物部分来自选自由表2、表3、表4、表5、表6、表7和表8中列出的烟草品种组成的组的品种。在另一个方面，烟草植物或植物部分来自表2中列出的品种。在另一个方面，烟草植物或植物部分来自表3中列出的品种。在另一个方面，烟草植物或植物部分来自表4中列出的品种。在另一个方面，烟草植物或植物部分来自表5中列出的品种。在另一个方面，烟草植物或植物部分来自表6中列出的品种。在另一个方面，烟草植物或植物部分来自表7中列出的品种。在另一个方面，烟草植物或植物部分来自表8中列出的品种。
在一个方面，烟草种子来自选自由表2、表3、表4、表5、表6、表7和表8中列出的烟草品种组成的组的品种。在另一个方面，烟草种子来自表2中列出的品种。在另一个方面，烟草种子来自表3中列出的品种。在另一个方面，烟草种子来自表4中列出的品种。在另一个方面，烟草种子来自表5中列出的品种。在另一个方面，烟草种子来自表6中列出的品种。在另一个方面，烟草种子来自表7中列出的品种。在另一个方面，烟草种子来自表8中列出的品种。
在一个方面，烟草细胞来自选自由表2、表3、表4、表5、表6、表7和表8中列出的烟草品种组成的组的品种。在另一个方面，烟草细胞来自表2中列出的品种。在另一个方面，烟草细胞来自表3中列出的品种。在另一个方面，烟草细胞来自表4中列出的品种。在另一个方面，烟草细胞来自表5中列出的品种。在另一个方面，烟草细胞来自表6中列出的品种。在另一个方面，烟草细胞来自表7中列出的品种。在另一个方面，烟草细胞来自表8中列出的品种。
所有前述提到的烤烟、深色晾烟、白肋、马里兰、深色明火熟化、雪茄或东方类型的具体品种仅出于示例性目的而列出。本申请还考虑了任何另外的烤烟、深色晾烟、白肋烟、马里兰烟、深色明火熟化烟、雪茄烟或东方烟品种。
在一个方面，本文提供的植物或品种是近交植物或品种。如本文所用，“近交”品种是为了遗传同质性而培育的品种。
如本文所用，“杂种”是通过将来自不同品种或物种的两种植物杂交而产生的，使得后代包含来自每个亲本的遗传物质。熟练的技术人员认识到也可以产生更高阶的杂种。例如，第一杂种可通过品种C与品种D杂交制得以产生C x D杂种，第二杂种可通过品种E与品种F杂交制得以产生E x F杂种。第一和第二杂种可以进一步杂交以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的更高阶的杂种(C x D)x(E x F)。在一个方面，本文提供的植物或种子是杂种植物或种子。
在一个方面，本文提供的烟草植物是近交烟草植物。在一个方面，本文提供的烟草种子是近交烟草种子。在一个方面，本文提供的烟草植物是杂交烟草植物。在另一个方面，本文提供的烟草种子是杂交烟草种子。
除非另有说明，与对照植物的所有比较需要被比较的两种植物具有相似的生长条件或可比的生长条件。如本文所用，“在可比的条件下生长”、“相似的生长条件”或“可比的生长条件”是指用于生长并在两种或更多种植物基因型之间进行有意义的比较的相似的环境条件和/或农艺实践，使得环境条件和农艺实践都不导致或解释该两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。环境条件包括例如光、温度、水(湿度)和营养(例如，氮和磷)。农艺实践包括例如播种、修剪、根切、移栽、打顶和剔枝(suckering)。参见Tobacco,Production,Chemistry and Technology的4B和4C章,Davis&Nielsen,eds.,BlackwellPublishing,Oxford(1999),pp 70-103。
如本文所用，“对照植物”是指除了被引入经修饰的植物中的本文提供的重组核酸分子之外，与所比较的经修饰的植物具有相同或几乎相同的基因组成的植物。
在一个方面，本文提供的植物或品种是雄性不育的。在另一个方面，本文提供的植物或品种是细胞质雄性不育(CMS)。雄性不育植物可以通过本领域已知的任何方法产生。生产雄性不育烟草的方法描述于Wernsman,E.A.和Rufty,R.C.1987.ChapterSeventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillan Publishing Co.,Inc.,New York,N.Y.761pp。
在另一个方面，本文提供的植物或品种是雌性不育的。作为非限制性实例，可以通过突变STIG1基因来制备雌性不育植物。参见例如，Goldman et al.1994,EMBO Journal13:2976-2984。
在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少80％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少85％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少90％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少92.5％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少95％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少96％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少97％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少98％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少99％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段至少99.9％相同；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列是选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列或其功能片段；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。
在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQ ID NO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段至少80％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQ ID NO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段至少85％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQ IDNO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段至少90％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQ ID NO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段至少95％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQ ID NO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段至少96％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQ ID NO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段至少97％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQ ID NO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段至少98％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQIDNO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段至少99％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQ ID NO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段至少99.9％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。在一个方面，本公开提供了一种用于产生植物的方法，该方法包括：(a)将第一品种的至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子，其中该第一品种的至少一个植物包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自由SEQ ID NO:18-22和31-33组成的组的氨基酸序列或其功能片段100％相同或相似的氨基酸序列；以及(b)选择步骤(a)中产生的至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中该至少一个后代种子或由其萌发的植物包含该重组核酸分子。
在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少80％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少85％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少90％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少95％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少96％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少97％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少98％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少99％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列至少99.9％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36组成的组的核酸序列100％相同的核酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。
在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少85％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与SEQ ID NO:18-22和31-33下组的氨基酸序列至少90％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少92.5％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少95％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少96％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少97％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少98％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少99％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少99.9％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。在一个方面，本公开提供了一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列100％相同或相似的氨基酸序列；(b)从步骤(a)中的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。
在一个方面，第一植物品种和第二植物品种是相同品种。在一个方面，第一植物品种和第二植物品种是两个不同的品种。在一个方面，第二植物品种包含重组核酸分子。
在一个方面，第一植物品种对于重组核酸分子是杂合的。在一个方面，第一植物品种对于重组核酸分子是半合的。在一个方面，第一植物品种对于重组核酸分子是纯合的。在一个方面，第二植物品种对于重组核酸分子是杂合的。在一个方面，第二植物品种对于重组核酸分子是半合的。在一个方面，第二植物品种对于重组核酸分子是纯合的。在一个方面，后代种子或由其萌发的植物对于重组核酸分子是杂合的。在一个方面，后代种子或由其萌发的植物对于重组核酸分子是半合的。在一个方面，后代种子或由其萌发的植物对于重组核酸分子是纯合的。
在一个方面，第一植物品种是烟草植物品种。在一个方面，第二植物品种是烟草植物品种。
如本文所用，术语“杂交”是指两种植物的有意交配。在一个方面，杂交包括第一植物通过第二植物的授粉和/或受精。杂交的两种植物可以是远缘、近缘或相同的。在一个方面，杂交的两种植物都是经修饰的植物。在一个方面，杂交的两种植物属于相同品种。在一个方面，杂交的两种植物属于两种不同的品种。在一个方面，杂交的两种植物之一是雄性不育的。在一个方面，杂交的两种植物之一是雌性不育的。在一个方面，杂交的两种植物中的至少一种是杂交烟草植物。在一个方面，杂交的两种植物中的至少一种是经修饰的植物。
在一个方面，第一品种的植物是杂交步骤中的父本。在一个方面，第一品种的植物是杂交步骤中的母本。在一个方面，第二品种的植物是杂交步骤中的父本。在一个方面，第二品种的植物是杂交步骤中的母本。
核酸和氨基酸
如本文所用，“异源”指源自外来物种的序列(核酸或氨基酸)，或者，如果来自同一物种，通过有意的人为干预在组成和/或基因组座中从其原始形式实质性修饰的序列。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也称为“多核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体意指来源于外来物种的构建体，或者，如果来自同一物种，通过有意的人为干预在组成和/或基因组座中从其原始形式实质性修饰的构建体。异源核酸构建体包括但不限于重组核苷酸构建体，其已被引入植物或其植物部分中，例如，通过转化方法或随后将转基因植物与另一目的植物进行育种。应当理解，如果内源启动子和内源基因不是天然可操作连接的(例如，需要人为干预以使它们处于可操作的连接)，那么内源启动子可以被认为与可操作连接的内源基因是异源的。如本文所用，“内源”核酸序列是指天然存在于生物体基因组中的核酸序列。
在一个方面，异源多核苷酸包含基因。在一个方面，异源多核苷酸编码小RNA分子或其前体。在一个方面，异源多核苷酸编码多肽。
如本文所用，“基因”是指可产生功能性单元(例如但不限于例如多肽或小RNA分子)的多核苷酸。基因可包含启动子、增强子序列、前导序列、转录起始位点、转录终止位点、聚腺苷酸化位点、一个或多个外显子、一个或多个内含子、5’-UTR、3’-UTR或其任意组合。“基因序列”可包含编码以下的多核苷酸序列：启动子、增强子序列、前导序列、转录起始位点、转录终止位点、聚腺苷酸化位点、一个或多个外显子、一个或多个内含子、5’-UTR、3’-UTR或其任意组合。在一个方面，基因编码小RNA分子或其前体。在另一个方面，基因编码多肽。
在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少80％相同的核酸序列：SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少85％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少90％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少92.5％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少95％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少96％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少97％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少98％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少99％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列至少99.5％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，基因包含与选自下组的核酸序列100％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。
在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少80％相同的核酸序列：SEQID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少85％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少90％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少92.5％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少95％相同的核酸序列：SEQID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少96％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少97％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少98％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少99％相同的核酸序列：SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列至少99.5％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了与选自下组的核酸序列100％相同的核酸序列：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。
在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少85％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ IDNO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少92.5％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少95％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少96％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少97％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少98％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少99％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少99.9％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，基因包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列100％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。
在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少85％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少92.5％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少95％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少96％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少97％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少98％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少99％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少99.9％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ IDNO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列100％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。
在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少85％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％相同或相似的氨基酸序列：SEQ IDNO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少92.5％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少95％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少96％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少97％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少98％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少99％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少99.9％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列100％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。
本文所用的关于两个或更多个核苷酸或氨基酸序列的术语“百分同一性”或“百分相同”通过以下方式计算：(i)在比较窗口(“可比对的”一个或多个区域)上比较两个最佳比对的序列(核苷酸或氨基酸)，(ii)确定相同的核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质和多肽)在两个序列中出现的位置的数目，以产生匹配位置的数目，(iii)将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，然后(iv)将该商乘以100％以得到百分同一性。如果“百分同一性”是相对于参考序列计算的，而没有指定特定的比较窗口，那么通过将比对区域上匹配位置的数目除以参考序列的总长度来确定百分同一性。因此，出于本申请的目的，当两个序列(查询序列和主题序列)最佳比对时(允许它们的比对中有空位)，对于查询序列的“百分同一性”等于两个序列之间相同位置的数目除以查询序列在其长度(或比较窗口)上的位置总数，然后乘以100％。
当序列同一性的百分比用于提及氨基酸时，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，且因此不会改变分子的功能特性。当序列不同在于保守置换时，可以向上调整百分序列同一性以针对置换的保守性质校正。不同在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。
为了序列进行最佳比对以计算其百分同一性，各种成对或多序列比对算法和程序是本领域已知的，例如ClustalW或Basic Local Alignment Search(BLASTTM)等，其可用于比较两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的序列同一性或相似性。尽管其他比对和比较方法是本领域已知的，但是两个序列之间的比对和百分同一性(包括上述百分同一性范围)可以通过ClustalW算法确定，参见例如，Chenna et al.,“Multiple sequencealignment with the Clustal series of programs,”Nucleic Acids Research 31:3497-3500(2003)；Thompson et al.,“Clustal W:Improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”Nucleic Acids Research 22:4673-4680(1994)；Larkin MA et al.,“Clustal W and Clustal X version 2.0,”Bioinformatics 23:2947-48(2007)；和Altschul et al."Basic local alignmentsearch tool."J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，其全部内容和公开通过引用并入本文。
如本文在提及两个核苷酸序列时所用的术语“百分互补性”或“百分互补”与百分比同一性的概念类似，但是指当查询序列和主题序列线性地排列并最佳碱基配对而无二级折叠结构(例如，环、茎或发夹)时，与主题序列的核苷酸最佳碱基配对或杂交的查询序列的核苷酸的百分比。这种百分互补性可以是两条DNA链、两条RNA链或DNA链和RNA链之间的百分互补性。“百分互补性”可以通过以下方式计算：(i)在比较窗口上使两个核苷酸序列以线性和完全展开的排列(即，无折叠或二级结构)最佳碱基配对或杂交，(ii)在比较窗口上确定两个序列之间的碱基配对的位置的数目以产生互补位置的数目，(iii)用互补位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，并且(iv)将该商乘以100％以产生两个序列的百分互补性。两个序列的最佳碱基配对可以基于核苷酸碱基(例如，G-C、A-T和A-U)通过氢键键合的已知配对来确定。如果在没有指定特定的比较窗口的情况下计算相对于参考序列的“百分互补性”，那么百分同一性通过用两个线性序列之间的互补位置的数目除以参考序列的总长度来确定。因此，出于本申请的目的，当两个序列(查询序列和主题序列)最佳碱基配对(允许错配或非碱基配对的核苷酸)时，查询序列的“百分互补”等于两个序列之间碱基配对位置的数目除以查询序列在其长度上的位置总数，然后乘以100％。
术语“多核苷酸”或“核酸分子”的使用并不旨在将本公开限制于包含脱氧核糖核酸(DNA)的多核苷酸。例如，还设想了核糖核酸(RNA)分子。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸和核酸分子可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物二者。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。在一个方面，本文提供的核酸分子是DNA分子。在另一个方面，本文提供的核酸分子是RNA分子。在一个方面，本文提供的核酸分子是单链的。另一个方面，本文提供的核酸分子是双链的。核酸分子可以编码多肽或小RNA。
如本文所用，“重组核酸分子”是指通过基因重组的实验室方法(例如但不限于分子克隆)形成的核酸分子。类似地，“重组DNA构建体”是指通过基因重组的实验室方法形成的DNA分子。
在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少80％相同：SEQID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少85％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少90％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少92.5％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少95％相同：SEQID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少96％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少97％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少98％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少99％相同：SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少99.9％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本公开提供了重组核酸分子，其包含可操作地连接至异源多核苷酸的启动子，其中核酸序列与选自下组的序列或其功能片段100％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。
在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列至少85％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列至少90％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列至少95％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列至少96％相同或相似的氨基酸序列：SEQ IDNO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列至少97％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列至少98％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列至少99％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列至少99.9％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本公开提供了包含与异源多核苷酸可操作地连接的启动子的重组核酸分子，其中该多核苷酸编码与选自下组的氨基酸序列100％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。
可以使用本领域常规的技术分离核酸。例如，可以使用任何方法分离核酸，包括但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链式反应(PCR)。一般PCR技术描述于例如，PCR Primer:ALaboratory Manual,Dieffenbach&Dveksler,Eds.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1995。重组核酸技术包括例如限制酶消化和连接，其可用于分离核酸。分离的核酸也可以作为单一核酸分子或作为一系列寡核苷酸被化学合成。可以通过已知方法(例如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析)从天然来源(例如，生物样品)纯化多肽。还可以例如通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。另外，纯化的多肽可以通过化学合成获得。多肽的纯度程度可以使用任何适当的方法来测量，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
在一个方面，本公开提供了检测植物细胞中重组核酸和多肽的方法。不受限制地，还可以使用杂交来检测核酸。核酸之间的杂交详细地论述于Sambrook et al.(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文所用，术语“多肽”是指至少两个共价连接的氨基酸的链。多肽可以由本文提供的多核苷酸编码。本文提供的蛋白质可以由本文提供的核酸分子编码。蛋白质可包含本文提供的多肽。如本文所用，“蛋白质”是指能够向细胞提供结构或酶活性的氨基酸残基链。
可以使用抗体来检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用本领域熟知的方法产生对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可以使用本领域已知的方法将本文提供的抗体附接至固体支持物例如微量滴定板。
检测(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽的检测)可以使用可检测标记来完成。术语“标记”旨在涵盖直接标记以及间接标记的使用。可检测的标记包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
在一个方面，本公开提供了启动子。在一个方面，启动子与可操作连接的核酸序列异源。如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调控序列(例如，启动子)之间的可操作的连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。
相对于生物体的其他组织，在生物体的某些组织中驱动增强的表达的启动子被称为“组织偏好的”启动子。因此，“组织偏好的”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优先的表达，但在植物的其他组织中表达水平较低。在一个方面，启动子是组织偏好的启动子。在一个方面，组织偏好的启动子是叶组织偏好的启动子。在一个方面，组织偏好的启动子是花组织偏好的启动子，例如编码花青素合酶(NtANS1)的基因的启动子(Lim et al.,Plant Cell Tissue Organ Cult 114(3):373–383(2013))。在一个方面，组织偏好的启动子是根组织偏好的启动子，例如延伸样蛋白(NtREL1)的启动子(Zhang et al.Plant CellRep 35,757–769(2016))。在一个方面，启动子是表皮组织偏好的启动子，例如编码根表皮中脂质转移蛋白(Ntltp1)的基因的启动子(Canevascini et al.,Plant Physiol 112(2)513-524(1996))。
在植物的所有或大多数组织中驱动表达的启动子被称为“组成型”启动子。在一个方面，启动子是组成型启动子。在一个方面，组成型启动子选自由花椰菜花叶病毒35S启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、冠瘿碱启动子和醇脱氢酶启动子组成的组。
“诱导型”启动子是响应于环境刺激(例如热、冷、干旱、光)或其他刺激(例如伤品或化学品应用)启动转录的启动子。在一个方面，启动子是诱导型启动子。
在一个方面，启动子可在植物细胞中表达。
萜烯
萜烯是一类由植物和一些昆虫产生的芳香族有机化合物。萜烯是碳氢化合物分子，通常被植物用来直接阻止草食动物或吸引植食性昆虫的捕食者或寄生虫。萜烯的非限制性实例包括柠檬醛、薄荷醇、樟脑、salvinorin A和姜黄素。
在一个方面，萜烯是萜类化合物(terpenoid)。萜类化合物(也称为类异戊二烯)是含有额外官能团(其可包括氧)的改性萜烯。萜类化合物(其可以是环状的或非环状的)大小从五碳半萜到含有数千个异戊二烯单元的长复杂分子。萜类化合物是通过五碳异戊二烯单元(例如二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)和异戊烯基二磷酸(IPP))的缩合产生的，最常见的是通过将DMAPP依次从头到尾添加到IPP中。初始环化过程由不同的萜烯合酶催化，且酶的变化导致单萜烯结构的变化。
萜类化合物根据构成母体萜烯的异戊二烯单元的数量进行分类。半萜类化合物包含一个异戊二烯单元。单萜类化合物包含两个异戊二烯单元。倍半萜类化合物包含三个异戊二烯单元。二萜类化合物包含四个异戊二烯单元。二倍半萜类化合物包含五个异戊二烯单元。三萜类化合物包含六个异戊二烯单元。四萜类化合物包含八个异戊二烯单元。多萜类化合物包含超过八个异戊二烯单元。
在一个方面，萜烯是薄荷醇。在一个方面，萜烯是薄荷醇或相关化合物。在一个方面，萜烯是劳丹诺类化合物(labdanoid)。在一个方面，萜烯是西柏三烯二醇。在一个方面，萜烯是左旋海松酸。在一个方面，萜烯是L-亮氨酸。在一个方面，萜烯是新植二烯。在一个方面，劳丹诺类化合物是顺式冷杉醇。在一个方面，萜烯选自由薄荷醇或相关化合物、劳丹诺类化合物、西柏三烯二醇、左旋海松酸和L-亮氨酸组成的组。在一个方面，萜烯选自由薄荷醇或相关化合物、劳丹诺类化合物、西柏三烯二醇、左旋海松酸、L-亮氨酸和新植二烯组成的组。在一个方面，萜烯选自由薄荷醇、劳丹诺类化合物、西柏三烯二醇、左旋海松酸和L-亮氨酸组成的组。在一个方面，萜烯选自由薄荷醇、劳丹诺类化合物、西柏三烯二醇、左旋海松酸、L-亮氨酸和新植二烯组成的组。
本文所用的“薄荷醇”是指具有化学式C10H20O和国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)名称5-甲基-2-(丙-2-基)环己-1-醇的有机化合物。薄荷醇也称为“(-)-薄荷醇”。薄荷醇的相关化合物包括但不限于(+)-薄荷醇、(+)-异薄荷醇、(+)-新薄荷醇、(+)-新异薄荷醇、(-)-异薄荷醇、(-)-新薄荷醇和(-)-新异薄荷醇。在一个方面，薄荷醇的相关化合物选自由以下组成的组：(+)-薄荷醇、(+)-异薄荷醇、(+)-新薄荷醇、(+)-新异薄荷醇、(-)-异薄荷醇、(-)-新薄荷醇和(-)-新异薄荷醇。
本文所用的“新植二烯”是指具有化学式C20H38和IUPAC名称7,11,15-三甲基-3-亚甲基十六-1-烯的有机化合物。
如本文所用，“西柏三烯二醇”是指具有化学式C20H34O2和IUPAC名称(1R,3R,4Z,8Z,12S,13Z)-1,5,9-三甲基-12-丙-2-基环十四-4,8,13-三烯-1,3-二醇的有机化合物。西柏三烯二醇也称为“β-西柏三烯二醇”。
如本文所用，“左旋海松酸”是指具有化学式C20H30O2和IUPAC名称(1R,4aR,4bS,10aR)-1,4a-二甲基-7-丙-2-基-2,3,4,4b,5,9,10,10a-八氢菲-1-甲酸的有机化合物。左旋海松酸也称为“L-海松酸”。
如本文所用，“L-亮氨酸”是指具有化学式C6H12NO2和IUPAC名称(2S)-2-氨基-4-甲基戊酸的氨基酸。
如本文所用，“劳丹诺类化合物”是指基本母体劳丹烷(一种二萜烯)的萜类衍生物。劳丹烷具有化学式C20H38和IUPAC名称(1S,2S,4aS,8aR)-2,5,5,8a-四甲基-1-[(3R)-3-甲基戊基]-1,2,3,4,4a,6,7,8-八氢萘。
劳丹诺类化合物的非限制性实例是顺式冷杉醇。本文所用的“顺式冷杉醇”是指具有化学式C20H34O和IUPAC名称(1R,2R,4aS,8aS)-2,5,5,8a-四甲基-1-[(2Z)-3-甲基戊-2,4,-二烯基]-3,4,4a,6,7,8-六氢-1H-萘-2-醇的有机化合物。
在一个方面，与在可比的条件下生长时缺乏重组核酸分子的对照植物、种子或植物部分相比，包含本文提供的重组核酸的经修饰的植物、种子或植物部分包含增加量的至少一种萜烯。在一个方面，与在可比的条件下生长时缺乏重组核酸分子的对照烟草植物、烟草种子或烟草植物部分相比，包含本文提供的重组核酸的经修饰的烟草植物、烟草种子或烟草植物部分包含增加量的至少一种萜烯。
在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少0.5％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少1％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少2％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少3％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少4％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少5％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少10％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少12.5％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少15％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少17.5％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少20％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少25％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少30％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少40％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少50％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少60％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少70％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少80％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少90％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少100％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少150％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少200％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少250％的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括至少500％的增加。
在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括0.5％至500％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括0.5％至250％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括0.5％至100％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括0.5％至75％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括0.5％至50％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括0.5％至25％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括0.5％至10％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括0.5％至5％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括0.5％至500％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括5％至250％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括5％至100％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括5％至50％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括25％至500％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括25％至250％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括50％至100％之间的增加。在一个方面，至少一种萜烯的增加量包括100％至500％之间的增加。
植物中萜烯的量可以使用本领域已知的任何方法来测量，包括但不限于气相色谱质谱(GC-MS)、核磁共振谱和液相色谱联用质谱。参见The Handbook of PlantMetabolomics，由Weckwerth和Kahl编辑，(Wiley-Blackwell)(2013年5月28日)。在一个方面，至少一种萜烯的量是指取样组织中该至少一种萜烯的浓度。
产品
在一个方面，本公开提供了来自本文提供的任何植物或植物部分的熟化植物材料。在一个方面，本公开提供了来自本文提供的任何烟草或烟草部分的熟化烟草材料。
在一个方面，熟化植物材料通过选自由烟熏熟化、空气熟化、明火熟化和太阳熟化组成的组的熟化工艺来制备。在一个方面，熟化烟草材料通过选自由烟熏熟化、空气熟化、明火熟化和太阳熟化组成的组的熟化工艺来制备。
“熟化”是老化过程，其减少水分并引起叶绿素的破坏而使烟叶呈金色，并淀粉通过该过程转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，熟化烟草具有更高的还原糖含量和更低的淀粉含量。在一个方面，本文提供的烟草植物或植物组分可以使用常规方式进行熟化(例如，烟熏熟化、烤房熟化、明火熟化、空气熟化或太阳熟化)。参见，例如，Tso(1999,Chapter 1inTobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,BlackwellPublishing,Oxford)对不同类型熟化方法的描述。熟化的烟草通常在压缩条件下在木桶(例如，大桶)或纸板箱中老化数年(例如，两至五年)，含水量范围从10％至约25％。参见，美国专利号4,516,590和5,372,149。然后可以进一步加工熟化和老化的烟草。进一步的加工包括在引入或不引入在不同温度下的蒸汽的情况下在真空下调制烟草、巴氏灭菌和发酵。
有关白肋烟草和深色烟草品种采收的信息可以在由肯塔基大学、田纳西大学、弗吉尼亚理工大学和北卡罗来纳州立大学出版的2019-2020 Burley and Dark TobaccoProduction Guide(2018年12月)中找到，其全部内容通过引用并入本文。
在一个方面，熟化的烟草材料包括选自熟化的叶材料、熟化的茎材料、熟化的芽材料、熟化的花材料和熟化的根材料的组的烟草材料。在一个方面，熟化的烟草材料包括熟化的叶材料、熟化的茎材料或两者。在一个方面，熟化的烟草材料包括熟化的叶材料。在一个方面，熟化的烟草材料包括熟化的茎材料。
在一个方面，熟化的烟草材料包括烟熏熟化的烟草材料。在一个方面，熟化的烟草材料包括空气熟化的烟草材料。在一个方面，熟化的烟草材料包括明火熟化的烟草材料。在一个方面，熟化的烟草材料包括太阳熟化的烟草材料。在一个方面，本文提供的熟化的烟草材料选自由空气熟化的烟草材料、明火熟化的烟草材料、太阳熟化的烟草材料和烟熏熟化的烟草材料组成的组。在一个方面，熟化烟草材料来自选自下组的烟草品种：烤烟品种、淡色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
在一个方面，本文提供的熟化的烟草材料选自由空气熟化的烟叶、明火熟化的烟叶、太阳熟化的烟叶和烟熏熟化的烟叶组成的组。在一个方面，熟化烟叶来自选自下组的烟草品种：烤烟品种、淡色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
发酵通常特征是初始高水分含量、产生热以及干重损失10％至20％。参见，例如，美国专利号4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国公开号2005/0178398；和Tso(1999,Chapter 1 in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。熟化、老化和发酵的烟草可以进一步加工(例如，切割、切丝、膨化或混合)。参见，例如，美国专利号4,528,993；4,660,577；和4,987,907。在一个方面，本公开提供了来自本文提供的任何烟草植物或其部分的发酵烟草材料。在另一个方面，本公开提供了来自本文提供的任何经修饰的烟草植物或其部分的发酵烟草材料。
从本公开的烟草品系、品种或杂交种获得的烟草材料可用于制造烟草产品。如本文所用，“烟草产品”被定义为旨在供人类使用或消费的由烟草制成或衍生的任何产品。在一个方面，本公开提供了包含来自本文提供的烟草植物的植物材料的烟草产品。在另一个方面，本公开提供了包含来自本文提供的经修饰的烟草植物的植物材料的烟草产品。在另一个方面，本公开提供了包含熟化烟草材料的烟草产品。在另一个方面，本公开提供了包含发酵烟草材料的烟草产品。在另一个方面，本公开提供了包含烟草混合物的烟草产品。
烟草产品包括但不限于卷烟产品(例如，香烟和比迪烟)、雪茄产品(例如，雪茄包装烟草和小雪茄)、烟斗烟草产品、烟草衍生产品、烟草衍生尼古丁产品、无烟烟草产品(例如，湿鼻烟、干鼻烟和咀嚼烟草)、薄膜、咀嚼片、片剂、成型件、凝胶、消耗品、不溶性基质、空心形状、再造烟草、膨化烟草等。参见，例如，美国专利公开号US2006/0191548。
如本文所用，“卷烟”是指具有“杆”和“填充物”的烟草产品。卷烟“杆”包括卷烟纸、滤嘴、滤棒包装纸(用于容纳过滤材料)、将卷烟纸(包括填充物)固定到滤嘴上的接装纸以及将这些组件固定在一起的所有胶水。“填充物”包括(1)所有烟草，包括但不限于再造和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可能伴随烟草卷在卷烟纸内的其他香味料)，(3)外壳、(4)香料和(5)所有其他添加剂(其混合到烟草和替代品中并卷入卷烟中)。
在一个方面，烟草产品包括再造烟草。在另一个方面，本公开提供了包含熟化烟草材料的再造烟草。如本文所用，“再造烟草”是指由烟草末和其他烟草废料制成，加工成片状并切成条状以类似于烟草的烟草填料的一部分。除了节省成本之外，再造烟草还非常重要，因为它利用氨和糖之间的反应进行加工风味开发而对卷烟口味做出了贡献。
在一个方面，烟草产品包括膨化烟草。如本文所用，“膨化烟草”是指通过合适气体的膨胀而加工的烟草填充物的一部分，使得烟草被“膨化”，从而导致密度降低和填充容量更大。它减少了卷烟中使用的烟草的重量。
源自本公开的植物的烟草产品还包括卷烟和其他吸烟制品，特别是包括过滤元件的那些吸烟制品，其中可抽吸材料的杆包括烟草混合物内的熟化的烟草。在一个方面，本公开的烟草产品选自由以下组成的组：丁香烟、比迪烟、小雪茄、不通气凹过滤嘴香烟、通气凹过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、卷烟烟草、咀嚼烟草、叶烟草、水烟烟草、烟丝和切烟。
在一个方面，本公开的烟草产品选自由以下组成的组：卷烟、加热烟草产品、丁香烟、比迪烟、雪茄、小雪茄、不通气香烟、通气凹过滤嘴香烟、烟斗烟草、鼻烟、口含烟、咀嚼烟草、湿润无烟烟草、细切咀嚼烟草、长切咀嚼烟草、袋装咀嚼烟草产品、口香糖、片剂、锭剂和溶解条。
在一个方面，本公开的烟草产品是无烟烟草产品。在一个方面，无烟烟草产品选自由散叶咀嚼烟草、栓状咀嚼烟草、湿鼻烟、鼻烟、干鼻烟和口含烟组成的组。
无烟烟草产品不燃烧，且包括但不限于咀嚼烟草、湿无烟烟草、口含烟和干鼻烟。咀嚼烟草是粗分的烟叶，其通常包装在大袋状包装中，并以塞子或捻子的形式使用。湿无烟烟草是一种湿润的、更细分的烟草，其以散装形式或袋装形式提供，且通常包装在圆形罐中并用作放置在成年烟草消费者的脸颊和牙龈之间的捏夹或小袋。口含烟是一种经过热处理的无烟烟草。干鼻烟是精细研磨的烟草，其放入口中或鼻腔使用。
在又一个方面，本公开的烟草产品选自由电加热香烟、电子香烟、电子蒸发装置组成的组。
在一个方面，本公开的烟草产品可以是混合烟草产品。
在另一个方面，本公开提供了包含熟化烟草材料的烟草混合物。烟草混合物可包含熟化烟草、未熟化烟草、发酵烟草、未发酵烟草、膨化烟草和再造烟草的任意组合。
在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少5％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少10％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少15％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少20％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少25％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少30％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少35％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少40％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少45％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少50％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少55％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少60％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少65％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少70％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少75％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少80％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少85％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少90％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按重量计至少95％的熟化烟草。
在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少5％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少10％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少15％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少20％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少25％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少30％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少35％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少40％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少45％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少50％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少55％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少60％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少65％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少70％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少75％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少80％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少85％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少90％的熟化烟草。在一个方面，烟草混合物包含按体积计至少95％的熟化烟草。
在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少80％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少85％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少90％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少92.5％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少95％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少96％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少97％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少98％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少99％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少99.9％相同。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源多核苷酸可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段。
在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少80％相同或类似的氨基酸序列，。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少85％相同或类似的氨基酸序列，。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少90％相同或类似的氨基酸序列。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ IDNO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少92.5％相同或类似的氨基酸序列。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少95％相同或类似的氨基酸序列。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少96％相同或类似的氨基酸序列。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少97％相同或类似的氨基酸序列。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少98％相同或类似的氨基酸序列。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少99％相同或类似的氨基酸序列。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段至少99.9％相同或类似的氨基酸序列。在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含含有与异源核酸序列可操作连接的启动子的重组核酸分子，其中该核酸序列编码选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列或其功能片段。
转化
在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少80％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少85％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少90％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少92.5％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少95％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少96％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少97％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少98％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少99％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列或其功能片段至少99.9％相同；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36或其功能片段；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。
在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少80％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少85％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少90％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少92.5％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少95％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少96％相同：SEQID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少97％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少98％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少99％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少99.9％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源多核苷酸的启动子，其中该核酸序列与选自由以下组成的组的序列或其功能片段100％相同：SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。
在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少80％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少85％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少90％相同或相似的氨基酸序列：SEQID NO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少92.5％相同或相似的氨基酸序列：SEQ IDNO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少95％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少96％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少97％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少98％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少99％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少99.9％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。在一个方面，本公开提供了一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：(a)将包含与异源核酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中该核酸序列编码选自由以下组成的组的蛋白：SEQ IDNO:18-22和31-33，或其功能片段；(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中所述至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。
在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少80％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少85％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少90％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少92.5％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少95％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少96％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少97％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少98％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少99％相同或相似的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码与选自由以下组成的组的序列或其功能片段至少99.9％相同或相似的氨基酸序列：SEQID NO:18-22和31-33。在一个方面，本文提供的方法包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子，其中该核酸序列编码选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:18-22和31-33，或其功能片段。
用于将重组核酸分子“引入”植物细胞的多种方法是本领域已知的，其可以根据本申请的方法使用以产生经修饰的植物细胞、植物、种子或植物部分。如本文所使用的，术语“引入”和“转化”可以互换使用。根据本发明的方法可以使用本领域已知的用于转化植物细胞的任何合适的方法或技术。用于转化植物的有效方法包括细菌介导的转化如农杆菌介导的或根瘤菌介导的转化，和微弹轰击介导的转化。本领域已知多种方法用于用转化载体通过细菌介导的转化或微弹轰击转化外植体和随后培养等这些外植体以再生或培育转基因植物。用于植物转化的其他方法，例如显微注射、电穿孔、真空渗透、压力、超声处理、碳化硅纤维搅拌、聚乙二醇(PEG)介导的转化等也是本领域已知的。通过这些转化方法产生的经修饰的植物对于转化事件可以是嵌合的或非嵌合的，这取决于所使用的方法和外植体。
转化植物细胞的方法是本领域普通技术人员众所周知的。例如，通过用重组DNA包被的颗粒进行微弹轰击转化植物细胞的具体说明(例如基因枪转化)可见于美国专利号5,550,318；5,538,880 6,160,208；6,399,861；和6,153,812，并且农杆菌介导的转化描述于美国专利号5,159,135；5,824,877；5,591,616；6,384,301；5,750,871；5,463,174；和5,188,958，所有这些都通过引用并入本文。用于转化植物的其他方法可以在例如Compendiumof Transgenic Crop Plants(2009)Blackwell Publishing中找到。本领域技术人员已知的任何适当方法可用于用本文提供的任何核酸分子转化植物细胞(例如，烟草细胞)。
在一个方面，将重组核酸分子引入植物细胞的方法包括农杆菌介导的转化。在另一个方面，将重组核酸分子引入植物细胞的方法包括PEG介导的转化。在另一个方面，将重组核酸分子引入植物细胞的方法包括基因枪转化。在另一个方面，将重组核酸分子引入植物细胞的方法包括脂质体介导的转染(脂转染)。在另一个方面，将重组核酸分子引入植物细胞的方法包括慢病毒转染。
脂转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787；和4,897,355并且脂转染试剂是商业销售的(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适合多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括WO 91/17424和WO 91/16024中的那些。递送可以是至细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
可以再生可育植物的任何植物细胞都被认为是用于实践本公开的有用的受体细胞。
在一个方面，将重组核酸分子引入烟草细胞。在一个方面，将重组核酸分子引入烟草原生质体细胞。另一个方面，将重组核酸分子引入烟草愈伤组织细胞。在一个方面，将重组核酸分子引入选自下组的烟草细胞：种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、芽细胞、茎细胞、花细胞、花序细胞、杆细胞、花梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、花丝细胞、子房细胞、胚珠细胞、果皮细胞和韧皮部细胞。
愈伤组织可以从各种组织来源起始，包括但不限于未成熟胚或胚的部分、幼苗顶端分生组织、花粉粒等。能够作为愈伤组织增殖的那些细胞可以用作转化的受体细胞。用于制备本公开的转基因植物的实用转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化以及可育转基因植物的随后再生)公开于例如美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请公开2004/0216189中，所有这些均通过引用并入本文。
实施方案
设想以下非限制性实施方案的实例：
1.一种经修饰的植物、种子或植物部分，其包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
2.如实施方案1所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述核酸序列包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少90％相同或相似的序列。
3.如实施方案1或2所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少95％相同的核酸序列。
4.如实施方案1-3中任一项所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少90％相同或相似的蛋白质。
5.如实施方案1-4中任一项所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36。
6.如实施方案1-5中任一项所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:18-22和31-33。
7.如实施方案1-6中任一项所述的经修饰的植物、种子或其部分，其中所述经修饰的植物、种子或植物部分是烟草植物、烟草种子或烟草植物部分。
8.如实施方案7所述的经修饰的植物、种子或其部分，其中该烟草植物、烟草种子或植物部分属于选自下组的烟草品种：烤烟品种、淡色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
9.如实施方案1-8中任一项所述的经修饰的植物、种子或其部分，其中该植物是雄性不育的或细胞质雄性不育的。
10.如实施方案1-9中任一项所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述植物或植物部分包含的至少一种萜烯的量与缺乏所述重组核酸分子的对照植物相比增加至少5％。
11.如实施方案1-10中任一项所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中该异源启动子选自组成型启动子、诱导型启动子和组织偏好的或组织特异性启动子。
12.如实施方案1-11中任一项所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中与在可比条件下生长的对照植物的叶相比，经修饰的植物的至少一片叶包含更大的平均毛状体密度。
13.如实施方案1-11中任一项所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中与在可比条件下生长的对照植物的叶的远轴侧相比，经修饰的植物的至少一片叶在叶的远轴侧上包含更大的平均毛状体密度。
14.如实施方案1-11中任一项所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中与在可比条件下生长的对照植物的叶的近轴侧相比，经修饰的植物的至少一片叶在叶的近轴侧上包含更大的平均毛状体密度。
15.来自经修饰的烟草植物或烟草植物部分的熟化烟草材料，其包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
16.如实施方案15所述的熟化烟草材料，其中该熟化烟草材料选自由烤烟材料、晾烟材料、明火烤烟材料和晒烟材料组成的组。
17.一种烟草产品，其包含如实施方案15所述的熟化烟草材料。
18.如实施方案17或22所述的烟草产品，其中该烟草产品选自由以下组成的组：丁香烟、比迪烟、小雪茄、不通气凹过滤嘴香烟、通气凹过滤嘴香烟、雪茄、烟斗烟草、雪茄烟草、卷烟烟草、咀嚼烟草、湿鼻烟、鼻烟、干鼻烟、口含烟、叶烟、水烟、烟丝和切烟。
19.如实施方案18所述的烟草产品，其中该烟草产品是无烟烟草产品。
20.如实施方案19所述的烟草产品，其中该无烟烟草产品选自由散叶咀嚼烟草、栓状咀嚼烟草、湿鼻烟、鼻烟、干鼻烟和口含烟组成的组。
21.一种再造烟草，其包含如实施方案15所述的熟化烟草材料。
22.一种烟草产品，其包含来自经修饰的烟草植物、烟草种子或烟草植物部分的材料，该经修饰的烟草植物、烟草种子或烟草植物部分包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
23.一种重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
24.如实施方案23所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列编码与选自SEQ IDNO:18-22和31-33的序列至少90％相同或相似的蛋白质。
25.如实施方案23或24所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列与选自SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36的序列至少90％相同。
26.如实施方案23-25中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少95％相同或相似的蛋白质。
27.如实施方案23-26中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列选自SEQID NO:13-17、23-30和34-36。
28.如实施方案23-27中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列编码选自SEQ ID NO:18-22和31-33的蛋白质。
29.一种产生植物的方法，该方法包括：
(a)获得包含重组核酸分子的至少一个植物，该重组核酸分子包含与选自SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子；
(b)将所述至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子；和
(c)选择步骤(b)中产生的所述至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中所述至少一个后代种子或由其萌发的植物包含所述重组核酸分子。
30.如实施方案29所述的方法，其进一步包括
(d)从由所述至少一个后代种子萌发的植物收获植物材料；和
(e)产生包含或衍生自所述收获的植物材料的产品。
31.如实施方案29或30所述的方法，其中与缺乏所述重组核酸分子的对照植物相比，由所述至少一个后代种子生长的植物进一步包含增加至少5％的量的至少一种萜烯。
32.如实施方案29-31中任一项所述的方法，其中与缺乏所述重组核酸分子的对照植物相比，由所述至少一个后代种子生长的植物进一步包含增加至少10％的量的至少一种萜烯。
33.如实施方案29-32中任一项所述的方法，其中所述至少一个植物来自烟草属(Nicotiana)。
34.如实施方案29-33中任一项所述的方法，其中所述至少一个植物来自烟草(tobacco)的属。
35.如实施方案29-34中任一项所述的方法，其中所述重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少80％相同或相似的蛋白质的核酸序列。
36.如实施方案29-35中任一项所述的方法，其中所述重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-27和34-36的序列至少90％相同的核酸序列。
37.如实施方案29-36中任一项所述的方法，其中所述重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少90％相同或相似的蛋白质的核酸序列。
38.如实施方案29-37中任一项所述的方法，其中所述重组核酸分子包含选自SEQID NO:13-27和34-36的核酸序列。
39.如实施方案29-38中任一项所述的方法，其中所述重组核酸分子包含编码选自SEQ ID NO:18-22和31-33的蛋白质的核酸序列。
40.一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：
(a)将包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列的重组核酸分子引入至少一个植物细胞，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子；
(b)从步骤(a)选择至少一个植物细胞，其中该至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；和
(c)从步骤(b)中选择的至少一个植物细胞再生经修饰的植物。
41.一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子，至至少一个植物细胞。
42.一种方法，其包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子，至至少一个植物细胞。
43.一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：
(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列；和
(b)从步骤(a)的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶上包含增加的毛状体密度。
尽管现在已经一般性地描述了本公开，通过参考以说明的方式提供的以下实施例将更容易理解本公开，且除非特别说明，不旨在限制本公开。
实施例
实施例1.用于毛状体密度修饰的候选转录因子的鉴定
在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库的搜索中，参与毛状体起始和发育调控的转录因子被用作查询。类似的方法用于鉴定烟草中的脂质转移蛋白。然后从第二内部数据库中提取所得序列。该方法鉴定了转录因子家族MYB(图3A和3B)和C2H2(图4)的成员。从这些家族中，选择了三个候选转录因子来改变植物中的毛状体密度。该方法还鉴定了烟草中脂质转移蛋白(LTP)家族的86个成员，并随后导致鉴定了LTP1的两种变体亚型，亚型2(SEQ ID NO:27)与亚型1(SEQ ID NO:26)相比具有5'延伸。参见图8A和8B。这种方法允许整理毛状体特异性的和参与代谢物转运的候选基因的列表(SEQ ID NO:13-27和34-36)。参见表1。
实施例2.载体的构建
实施例1中鉴定的候选基因(例如，SEQ ID NO:13-27和34-36)使用采用GATEWAY技术的PCR克隆系统(ThermoFisher Scientific，目录号12535029)进行克隆。随后将克隆的基因亚克隆到GATEWAY表达载体中，其中亚克隆的基因与可操作地连接到CaMV 35S启动子的绿色荧光蛋白(G3GFP)融合。参见图2。
实施例3.经修饰的烟草植物的转化和再生
在单独的实验中将实施例2中产生的每个载体构建体独立地转化到烟草细胞中。简而言之，通过农杆菌转化将载体引入烟草叶盘中。参见，例如，Mayo et al.,Nat.Protoc.,1:1105-1111(2006)；和Horsch et al.,Science,227:1229-1231(1985)。
转化烟草植物(品种“TN90”和“Izmir Ego”)和本氏烟草在MagentaTMGA-7盒子中生长，切割叶盘并放入培养皿中。通过将20mL细胞悬浮液在50mL离心管中以3500RPM离心10分钟，收集包含转化载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。除去上清液，并将根癌农杆菌细胞沉淀重悬于40mL液体重悬培养基中。用#15刀片将烟叶(避开中脉)切成八个0.6厘米的盘，并倒置放在培养皿中。将薄层的含B5维生素的Murashige&Skoog(MS)液体重悬浮培养基添加到培养皿中，并用细尖针均匀地戳叶盘。将约25mL的根癌农杆菌悬浮液添加到培养皿中，并将叶盘在悬浮液中孵育10分钟。
将叶盘转移到共培养培养皿(1/2MS培养基)中，将盘倒置，与覆盖在共培养TOM培养基(含30g/L蔗糖；0.1mg/L 1-萘乙酸(NAA)；和1mg/L6-苄基氨基嘌呤(BAP)的MS培养基)上的滤纸接触。将培养皿用封口膜密封并在黑暗中孵育两天。
孵育后，将叶盘转移至再生/选择TOM K培养基培养皿(TOM培养基加200mg/L头孢噻肟和50mg/L潮霉素)。由叶盘形成的愈伤组织每两周在昏暗的光线(60至80mE/ms之间)下以18小时光照6小时黑暗的光周期在24℃下分培养到新鲜的TOM-Hyg培养基中，直至芽(小植物)成为可割取的。用镊子取出由愈伤组织形成的小植物，并分培养至MS生根培养基(含有3g/L蔗糖、7g/L葡萄糖与200mg/L头孢噻肟和50mg/L潮霉素的MS培养基)。将含有50mg/L潮霉素的MS基础培养基上的芽在相同的光照(约60-80mE/ms)以18小时光照6小时黑暗的光周期在24℃下孵育以诱导生根。
当包含芽和根的小植物长得足够大时(例如，超过MagentaTMGA-7盒高度的一半)，它们被转移到Jiffy泥炭颗粒中，以便在生长室中适应环境。一旦建立，苗就会被转移到温室中进行进一步的生长、育种和分析。
实施例4.确认经修饰的烟草植物中候选基因的表达
在生长的营养阶段期间，从实施例3中产生的经修饰的烟草植物的幼叶以及从在可比条件下生长的缺乏重组核酸构建体的对照烟草植物提取RNA。提取的RNA用于生成cDNA。使用定量实时PCR(qRT-PCR)对T0转基因植物中NtMYB和NtGIS的基因表达进行定量(参见图10和11)。为了确认构建体正在表达重组核酸，将经修饰的植物中NtMYB和NtGIS的表达与对照烟草植物进行比较。
NtMYB和NbGIS的基因表达也在T1转基因植物中进行定量。分别参见图16和图17。
实施例5.确认经修饰的烟草植物中毛状体密度的改变
在营养生长阶段期间，在立体显微镜(型号/类型)下检查来自各种不同烟草背景的NtMYB86、NtGIS和NbGIS转基因品系的样品以鉴定与对照植物相比在各种不同植物部分中毛状体密度的变化。结果表明，包含NtMYB86、NtGIS或NbGIS的转基因植物显示叶和茎组织中每单位面积的腺毛状体数量的增加(即增加的毛状体密度)。(参见图5-7)
实施例6.测量经修饰的烟草植物中的萜烯水平
在生长的营养阶段期间，从实施例3、4和5的经修饰的烟草植物以及从在可比条件下生长的缺乏重组核酸构建体的对照烟草植物收获幼叶，用于根据Jiang等人(CurrProtoc Plant Biol.2016；1:345-358)概述的方案进行定性代谢谱分析。将叶样品在液氮中研磨，然后将样品与60:40己烷:乙酸乙酯(v/v)混合，补充十七醇(内标)，并伴随振荡孵育过夜。
溶剂提取物在冷藏的SpeedVacTM(ThermoFisher Scientific)中浓缩，然后放入硅胶柱中。用己烷洗涤该柱并使其流入收集管中。样品从收集管中等分，并用于代谢物的气相色谱-质谱(GC-MS)分析。
为了鉴定叶毛状体分泌的次级代谢物，将来自转基因品系的1克叶样品切成小段，并浸泡在补充有十七醇(内标)的己烷中，并伴随振荡孵育过夜。过滤提取物并用于气相色谱-质谱(GC-MS)中的代谢谱分析。参见图12-15。
Claims (43)
1.一种经修饰的植物、种子或植物部分，其包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
2.如权利要求1所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述核酸序列包含与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少90％相同或相似的序列。
3.如权利要求1所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述核酸序列与选自SEQID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少95％相同。
4.如权利要求1所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少90％相同或相似的蛋白质。
5.如权利要求1所述的经饰的植物、种子或植物部分，其中所述核酸序列选自SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36。
6.如权利要求1所述的经饰的植物、种子或植物部分，其中所述氨基酸序列选自SEQ IDNO:18-22和31-33。
7.如权利要求1中任一项所述的经修饰的植物、种子或其部分，其中所述经修饰的植物、种子或植物部分是烟草植物、烟草种子或烟草植物部分。
8.如权利要求7所述的经修饰的植物、种子或其部分，其中所述烟草植物、烟草种子或植物部分是选自下组的烟草品种：烤烟品种、淡色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、烟品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
9.如权利要求1所述的经修饰的植物、种子或其部分，其中所述植物是雄性不育的或细胞质雄性不育的。
10.如权利要求1所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述植物或植物部分包含与缺乏所述重组核酸分子的对照植物相比增加至少5％的量的至少一种萜烯。
11.如权利要求1所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中所述异源启动子选自组成型启动子、诱导型启动子和组织偏好的或组织特异性启动子。
12.如权利要求1所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中与在可比条件下生长的对照植物的叶相比，所述经修饰的植物的至少一片叶子包含更大的平均毛状体密度。
13.如权利要求1所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中与在可比条件下生长的对照植物的叶的远轴侧相比，所述经修饰的植物的至少一片叶子在该叶的远轴侧上包含更大的平均毛状体密度。
14.如权利要求1所述的经修饰的植物、种子或植物部分，其中与在可比条件下生长的对照植物的叶的近轴侧相比，所述经修饰的植物的至少一片叶子在该叶的近轴侧上包含更大的平均毛状体密度。
15.来自经修饰的烟草植物或烟草植物部分的熟化烟草材料，该经修饰的烟草植物或烟草植物部分包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
16.如权利要求15所述的熟化烟草材料，其中该所述熟化烟草材料选自由烤烟材料、晾烟材料、明火烤烟材料和晒烟材料组成的组。
17.一种烟草产品，其包含如权利要求15所述的熟化烟草材料。
18.如权利要求17所述的烟草产品，其中所述烟草产品选自由以下组成的组：丁香烟、比迪烟、小雪茄、不通气凹过滤嘴香烟、通气凹过滤嘴香烟、雪茄、烟斗烟草、雪茄烟草、卷烟烟草、咀嚼烟草、湿鼻烟、鼻烟、干鼻烟、口含烟、叶烟、水烟、烟丝和切烟。
19.如权利要求18所述的烟草产品，其中所述烟草产品是无烟烟草产品。
20.如权利要求19所述的烟草产品，其中所述无烟烟草产品选自由散叶咀嚼烟草、口嚼烟、湿鼻烟、鼻烟、干鼻烟和口含烟组成的组。
21.一种再造烟草，其包含如权利要求15所述的熟化烟草材料。
22.一种烟草产品，其包含来自经修饰的烟草植物、烟草种子或烟草植物部分的材料，该经修饰的烟草植物、烟草种子或烟草植物部分包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
23.一种重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子。
24.如权利要求23所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少90％相同或相似的蛋白质。
25.如权利要求23所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少90％相同。
26.如权利要求23所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少95％相同或相似的蛋白质。
27.如权利要求23所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQID NO:13-17、23-30和34-36。
28.如权利要求23所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列编码选自SEQ ID NO:18-22和31-33的蛋白质。
29.一种产生植物的方法，该方法包括：
(a)获得包含重组核酸分子的至少一个植物，该重组核酸分子包含与选自由SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子；
(b)将所述至少一个植物与第二品种的至少一个植物杂交以产生至少一个后代种子；和
(c)选择步骤(b)中产生的所述至少一个后代种子或由其萌发的植物，其中所述至少一个后代种子或由其萌发的植物包含所述重组核酸分子。
30.如权利要求29所述的方法，其进一步包括：
(f)从由所述至少一个后代种子萌发的植物收获植物材料；和
(g)产生包含所述收获的植物材料或衍生自所述收获的植物材料的产品。
31.如权利要求29所述的方法，其中由所述至少一个后代种子生长的植物进一步包含与缺乏所述重组核酸分子的对照植物相比增加至少5％的量的至少一种萜烯。
32.如权利要求29所述的方法，其中由所述至少一个后代种子生长的植物进一步包含与缺乏所述重组核酸分子的对照植物相比增加至少10％的量的至少一种萜烯。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述至少一个植物来自烟草属(Nicotiana)。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述至少一个植物来自烟草的属。
35.如权利要求29所述的方法，其中所述重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少80％相同或相似的蛋白质的核酸序列。
36.如权利要求29所述的方法，其中所述重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-27和34-36的序列至少90％相同的核酸序列。
37.如权利要求29所述的方法，其中所述重组核酸分子包含编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的序列至少90％相同或相似的蛋白质的核酸序列。
38.如权利要求29所述的方法，其中所述重组核酸分子包含选自SEQ ID NO:13-27和34-36的核酸序列。
39.如权利要求29所述的方法，其中所述重组核酸分子包含编码选自SEQ ID NO:18-22和31-33的蛋白质的核酸序列。
40.一种产生经修饰的植物的方法，该方法包括：
(a)将重组核酸分子引入至少一个植物细胞，该重组核酸分子包含与选自由SEQ IDNO:13-17、23-30和34-36组成的组的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子；
(b)选择来自步骤(a)的至少一个植物细胞，其中该至少一个植物细胞包含该重组核酸分子；和
(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个植物细胞再生修饰的植物。
41.一种方法，其包括使用来自经修饰的烟草植物或其部分的熟化烟草材料制备烟草产品，其中该经修饰的烟草植物或其部分包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子，至至少一个植物细胞。
42.一种方法，其包括用重组核酸分子转化植物细胞，其中该重组核酸分子包含与选自SEQ ID NO:13-17、23-30和34-36的序列至少80％相同的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至异源启动子，至至少一个植物细胞。
43.一种用于产生具有增加的毛状体密度的植物的方法，该方法包括：
(a)向至少一个植物细胞提供包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子的重组核酸，其中该多核苷酸编码与选自SEQ ID NO:18-22和31-33的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列；以及
(b)从来自步骤(a)的至少一个植物细胞再生经修饰的植物，其中与在可比条件下生长时缺乏该重组核酸的对照植物的叶相比，该经修饰的植物在至少一片叶子上包含增加的毛状体密度。
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