WO2005108572A1 - Verbindungen und verfahren zur immunsuppression - Google Patents

Verbindungen und verfahren zur immunsuppression Download PDF

Info

Publication number
WO2005108572A1
WO2005108572A1 PCT/DE2004/000956 DE2004000956W WO2005108572A1 WO 2005108572 A1 WO2005108572 A1 WO 2005108572A1 DE 2004000956 W DE2004000956 W DE 2004000956W WO 2005108572 A1 WO2005108572 A1 WO 2005108572A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hla
nucleic acid
seq
expression
acid according
Prior art date
Application number
PCT/DE2004/000956
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rainer Blasczyk
Constanca Sofia Ferreira De Figueiredo
Axel Seltsam
Original Assignee
Medizinische Hochschule Hannover
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medizinische Hochschule Hannover filed Critical Medizinische Hochschule Hannover
Priority to PCT/DE2004/000956 priority Critical patent/WO2005108572A1/de
Priority to DE112004002914T priority patent/DE112004002914A5/de
Publication of WO2005108572A1 publication Critical patent/WO2005108572A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed

Definitions

  • the present invention relates to influencing the immune system or the rejection reaction mediated by the immune system between a transplant and a recipient, as well as in autoimmune diseases.
  • HLA molecules human leukocyte antigens
  • the HLA molecules play a central role in the adaptive immune defense, since they present antigens in the form of small peptides to other cells of the immune system, which represents a step of interaction to trigger the immune defense.
  • HLA I The HLA molecules of class I (HLA I) are present on the surface of all cells and present peptides from proteins synthesized within the cell, which have been degraded to fragments of approx. 9 to 11 amino acids. HLA I interact with CD8 + cytotoxic T cells (T-killer cells).
  • the peptides presented by HLA I can, for example, originate from natural cell proteins, or from viral proteins which have been synthesized following a viral infection.
  • the CD8 + cytotoxic T cells usually recognize as foreign those peptides presented by HLA I that do not originate from the cell's own genome, and on the other hand also recognize an HLA I that is foreign to the organism, without the need for a presented foreign peptide.
  • HLA I The specificity of HLA I towards the presented antigens is based on the interaction of their peptide-binding region, which is formed from parts of the ⁇ 1 and ⁇ 2 domains. These peptide-binding ⁇ 1 and ⁇ 2 domains are characterized in particular in the region of the peptide-binding region by a pronounced polymorphism of their amino acid sequence.
  • This high degree of polymorphism means that a large number of HLA I with different specificity for peptides that are recognized as antigen is achieved within a population, so that different HLA I alleles recognize different areas, for example of a pathogen, as antigen.
  • This polymorphism within a population is used or reinforced for each individual by the fact that, for example, in humans each individual expresses an allele for HLA I from every parent on the surfaces of his cells (heterozygosity).
  • the HLA I molecules have a heavy variable ⁇ chain, which contains the peptide-binding, highly polymorphic regions ⁇ 1 and ⁇ 2, as well as a domain ⁇ 3, and a light, invariable ⁇ chain.
  • the ability of the cytotoxic T cells to recognize foreign HLA I molecules as a foreign antigen leads to the HLA I being recognized as foreign by the recipient's immune system in the case of transplantation of foreign tissue and triggering the immune response of the cytotoxic T cells. causing cell transplant death. If, on the other hand, stem cells of the hemopoietic system are transplanted into a recipient, the transplanted CD8 + cytotoxic T cells recognize the recipient's HLA I molecules as foreign and attack them.
  • the HLA II molecule has an ⁇ and a ⁇ chain, the peptide bond is mediated by the domains ⁇ 1 and ⁇ 1.
  • HLA II is present on the surface of professionally antigen-presenting cells, for example macrophages, dendritic cells, B- Lymphocytes, as well as on activated T cells.
  • HLA II presents extra-cellular antigens with a size of approx. 15 to 24 amino acids compared to CD4 + T cells or T helper cells as well as CD8 + T cells for their stimulation. The interaction with CD4 + T cells or T helper cells then leads to the production of antibodies by B cells.
  • HLA I and HLA II means that there is only a low probability that within a population two individuals have HLA I and / or HLA II that are similar or identical in such a way that they do not have a different immune system in the event of a transplant be recognized as foreign. As a consequence of this lack of agreement, an immunological reaction is most likely triggered by HLA I and / or HLA II alone.
  • the rejection mediated by HLA is further complicated by the fact that in the case of a transplant, both the paternal and the maternal alleles of the transplant and recipient must be coordinated with one another in order to avoid an immunological reaction which is against the HLA I and / or which is recognized as foreign HLA II is directed.
  • T helper cells also support CD8 + T cells for further development.
  • the HLA phenotypes of the graft and recipient are analyzed and preferably assigned to each other in the case of phenotypic agreement , so that a transplant can then take place. It should be noted that due to the high polymorphism of HLA I and HLA II, which are also present in two alleles, there is little chance of being able to select a complete phenotypic match between the transplant and the recipient. This is especially true if the limited number of available grafts is taken into account.
  • immunosuppressive agents have been used so far which reduce the activity of the immune system of a transplant recipient to such an extent that an immune reaction against the transplant to be recognized as foreign is suppressed. In this way, rejection of the transplant can be delayed or prevented on the one hand, but on the other hand the susceptibility to infections or the occurrence of tumors is increased.
  • the cellular and humoral immune response of the recipient's immune system leads to rejection or loss of function of the transplant in HvG.
  • the cellular and / or humoral immune response of the transplant is directed against all cells of the recipient (GvH), since these have HLA I and / or HLA II, which the transplanted immune cells recognize as a foreign antigen become.
  • the therapy used hitherto consists of inactivating the immune system to such an extent that the immunological reaction against the body's own cells is sufficiently suppressed.
  • an organ involved in the immune reaction can also be operated on are removed, however, additional immunosuppressive therapy remains required.
  • the object of the present invention is to reduce, preferably to completely suppress, the undesired immunological reactions in transplantations, for example in the direction of GvH or HvG, and of autoimmune diseases, the disadvantages of the known methods being avoided should.
  • the present invention provides means which reduce these undesired rejection reactions between the graft and recipient, up to their complete suppression.
  • the invention relates to the reduction or suppression of the expression of HLA I and / or HLA II of the person concerned, preferably only those alleles of HLA I and / or HLA II that are reduced or suppressed are involved in mediating the immunological response.
  • the expression of HLA I and / or HLA II is reduced, preferably until their complete suppression.
  • the aim of the invention is to reduce the expression of HLA I and / or HLA II, for example in the transplant, so that rejection is reduced or prevented in the case of a functional immune reaction.
  • Transplants can be solid organs, tissues or cells, for example heart, lungs, liver, kidney, skin or cells of the pancreas, including any stem cells, for example hemopoietic stem cells or stem cells of the pancreas.
  • the expression of the HLA I and / or HLA II of the cells of the recipient organism is reduced, preferably completely suppressed, if the transplant comprises cells of the immune system.
  • the transplant comprises cells of the immune system.
  • hemopoietic stem cell transplantation serves to improve the graft versus host Reduce the response caused by T cells contained in the bone marrow transplant.
  • nucleic acids are used which, through specific interaction with the gene coding for HLA or the corresponding mRNA, reduce, preferably completely suppress, the expression of HLA.
  • This interaction of the nucleic acid used can relate to regions of the relevant MHC gene or the mRNA which code for amino acids (exons), or to non-translated regions, for example regulatory gene segments or introns.
  • the transcription of the MHC genes can be reduced by inactivating the genomic copy of the MHC gene in question, for example by inserting into regions and / or deleting regions of the regulatory and / or structural gene segments.
  • This can be done, for example, by recombination with transfected or transduced nucleic acids which are homologous to the MHC gene in some areas, but which contain a deletion, insertion or any other mutation, the introduction of which results in the genomic copy of the MHC gene by changing the regulatory areas or disrupting the Structural gene is inactivated or leads to a non-functional HLA.
  • HLA I and / or HLA II are preferably achieved by the direct introduction or the production of inhibitory RNAs. These are preferably siRNA or antisenseRNA. In this way, the further expression of those HLA I and / or HLA II is reduced to complete suppression, which are recognized as foreign by the immune system.
  • the translation of the mRNA encoding HLA I and / or HLA II can alternatively be reduced by transfection or transduction of enzymatically active RNA, so-called ribozymes, which degrade one or more specific mRNAs which code for HLA.
  • enzymatically active RNA is also referred to as inhibitory RNA in the context of this invention and can be in the form of a plasmid or DNA construct Cell are introduced, for example by transfection or by transduction of an expression cassette on a vector, preferably a lentiviral vector, from which the enzymatically active RNA is then transcribed in the cell.
  • synthetic derivatives of RNA can be transfected into cells, for example phosphothioates, which, in the manner of an antisenseRNA, lead to the inactivation of the mRNA which codes for the specific HLA.
  • the decrease in expression of HLA I and / or HLA II can be class-specific, i.e. completely reduce the expression of HLA I and / or HLA II, be specific for the locus, i.e. HLA I-A or HLA I-B or HLA I-C etc. reduce their expression, group-specific, i.e. in HLA I be specific for, for example, group 68, 07 or 08, and / or be allele-specific, i.e. to reduce only a specific allele of a heterozygous carrier of HLA I and / or HLA II in its expression.
  • a person skilled in the art can select the specific nucleic acids to be used for reducing the expression of HLA I and / or HLA II by identifying specific homologous gene segments for the class, the locus, the group and / or the allele, which have essentially no homology to other genes, or in the case of inhibitory RNAs essentially no homology to other mRNAs synthesized within the target cells.
  • the expression of the molecules involved in the formation of the HLA can be reduced. Analogously to the method according to the invention, this can be achieved by using inhibitory RNAs which are specific for these molecules involved in the formation of the HLA.
  • the expression of the gene encoding a molecule involved in the formation of HLA can also be reduced by recombination with specific homologous DNA which carries a mutation which leads to the inactivation of the gene.
  • HLA I and / or HLA II The reduction in the expression of HLA I and / or HLA II according to the invention is, in addition to medical use for preventing rejection or for treating autoimmune diseases, also suitable for compounds and methods for experimental investigations in vivo or in vitro for the function of HLA I and / or to provide HLA II or their specific interaction partners.
  • only the expression of those alleles of HLA I and / or HLA II is reduced, preferably completely suppressed, which are involved in mediating the immunological reaction. In this way, the recognition mechanism of the immune system is not completely eliminated, since those alleles of HLA I and / or HLA II which are not involved in mediating the undesired immunological reaction can still exercise their natural antigen-presenting function.
  • the invention relates to the organ-specific or cell-type-specific reduction or suppression of the expression of HLA I and / or HLA II.
  • the present invention relates, in addition to reducing the expression of HLA I and / or HLA II, to the expression of HLA-G or a functional variant of HLA-G which prevents recognition by NK cells (natural killer cells).
  • a functional variant in the sense of the invention is a protein which is arranged on the cell surface and has those structural properties of HLA I, HLA II or HLA-G which protect against the attack of NK cells.
  • An example of such a functional variant of HLA-G is an HLA molecule that is tolerated by the immune system.
  • an HLA tolerated by the immune system can be produced as a fusion protein with an autologous peptide (preferably 8 to 15, more preferably 9 amino acids long) in the immunologically attacked cells, in which the autologous peptide Fills the peptide binding site of the functional variant permanently.
  • an autologous peptide preferably 8 to 15, more preferably 9 amino acids long
  • HLA-G or its functional variant is provided in particular in the event that the expression of both alleles of HLA I and / or HLA II is greatly reduced or completely suppressed.
  • the expression of HLA-G serves in particular to protect those cells which do not express HLA I against an attack by NK cells.
  • HLA-G in cells whose expression of HLA I and / or HLA II is reduced, as well as the introduction of the nucleic acid according to the invention Reduction of the immune response, in which at least one HLA is involved, can be achieved by known genetic engineering means and methods.
  • Preferred is the transfection of nucleic acid, for example by means of lipofection, electroporation or CaPO 4 method, or the transduction of these cells with a vector within a viral particle, which contains an expression cassette, of which HLA-G or its functional variant can be produced , It is particularly preferred to use a promoter for regulating the expression of HLA-G or its functional variant which is constitutive, inducible or repressible.
  • This promoter particularly preferably has similar or identical properties to the promoter which controls the expression of inhibitory RNAs.
  • the expression cassette for HLA-G can be present on a common nucleic acid construct with the expression cassette which encodes the inhibitory RNAs, preferably on a viral, for example lentiviral vector.
  • the invention provides a method for reducing the expression of HLA I and / or HLA II, preferably until they are completely suppressed.
  • This can be a whole organism, e.g. affect a human or an animal and its MHC gene products, but alternatively also an extracorporeal organ that is used as a transplant in a recipient.
  • the invention represents a method for transfection or transduction of an extracorporeal organ, the cells of which at least partially absorb inhibitory RNA directly or in the form of an expression cassette coding for inhibitory RNA.
  • the cells of the extracorporeal graft have the inhibitory RNA or an expression cassette which codes for inhibitory RNA.
  • Such a graft can then be inserted into a recipient so that the viral particles used for transduction or for nucleic acid constructs used for the transformation essentially no longer emerge from the graft and can pass to the cells of the recipient.
  • Expression cassette encoding HLA-G can be used to create a graft that can be used in a recipient regardless of compatibility with a recipient's immune system. In this way, the problem of immunological rejection is avoided, which, according to the prior art, required either the most complete possible match of HLA I and / or HLA II and usually a constant suppression of the activity of the entire immune system of the recipient.
  • grafts for example of stem cells such as those of the blood system, possibly with the exception of those of the immune system, grafts can be provided in this way which do not have incompatible HLA I and / or HLA II and which can also be divided or cultivated in vitro.
  • HLA I and / or HLA II can be carried out by several methods known per se, of which the use of siRNA or antisenseRNA, which are referred to as inhibitory RNA, is preferred.
  • siRNA or antisenseRNA or of ribozyme into intended target cells can be carried out in vitro or in vivo by transfection of synthetically produced RNA or an RNA derivative (for example as a phosphothioate compound) or by transfection or transduction of a DNA construct, which contains an expression cassette for transcription, from which the siRNA, ribozyme or antisenseRNA is synthesized.
  • synthetically produced RNA or an RNA derivative for example as a phosphothioate compound
  • such an expression cassette encodes the complementary strands of the siRNA, with a first section encoding the sense strand (or antisense strand) of the siRNA following the promoter, and a second section encoding the complementary antisense strand (or sense strand). is encoded and a hinge area (loop) is encoded between them.
  • the first and second sections are preferably complementary to one another over preferably 19 to 29 nt and additionally have non-complementary regions, namely preferably the first section in FIG. 5 ', the second section in FIG. 3' with a length of 1 to 8, preferably 2 to 3 nucleotides.
  • the hinge area preferably has a length of 4 to 11 nucleotides.
  • the RNA assumes a hairpin structure (hybrid hair) by hybridizing the complementary first and second sections, the non-complementary areas of the first and second sections being single-stranded and in which the hinge area forms the bend.
  • the shRNA is processed in the cell to the functional siRNA (Castanotto et al., RNA 8, 1454-60 (2002)).
  • Viral particles which lead to transient, preferably permanent, production of the inhibiting RNA are particularly suitable for introducing inhibitory RNA in vivo.
  • Such viral vectors contain one or more expression cassettes from which the inhibitory RNA is transcribed.
  • suitable promoters By selecting suitable promoters, the transcription of the inhibitory RNA can be constitutive, alternatively also induced by an external inducer or repressed by an external repressor.
  • the expression cassette is contained in a lentiviral vector which is stably integrated into the genome of target cells, so that the expression cassette is permanently available in the target cells and e.g. in the case of constitutive transcription of the siRNA or antisenseRNA, the expression of HLA I and / or HLA II is continuously reduced, up to the complete suppression of the expression.
  • the cell type-specific or organ-specific transduction of cells of a transplant with a viral particle which has an expression cassette which codes for the inhibiting RNA according to the invention is further preferred.
  • the expression of HLA I and / or HLA II can be reduced allele-specifically in the transplant, preferably up to the complete suppression of the expression, without significantly influencing other cell types.
  • the cell type-specific or organ-specific infection with a viral vector which is contained in a viral particle and contains an expression cassette of the siRNA or antisenseRNA according to the invention can be achieved in that the viral particle has a receptor specific for the target cells.
  • Such viral receptors can be incorporated into the virus envelope during the generation of recombinant viral particles so as to pseudotype the recombinant viral particles.
  • An example of a non-specific receptor of a viral particle is the glycoprotein from the vesicular stomatitis virus, VSV-G.
  • the preferably cell-type-specific reduction in the expression of HLA I and / or HLA II can be achieved in that, alternatively or in addition to the cell-type-specific transduction, the sequences coding for the siRNA or antisenseRNA are transcribed by a cell-type-specific promoter, so that another cell type for which the promoter used is not specific, the siRNA or antisenseRNA according to the invention can not transcribe.
  • both the siRNA and antisenseRNA reduce the expression of HLA I and / or HLA II by interacting with the mRNA of the corresponding HLA and preventing their translation.
  • This can be class, location, group or allele specific.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the antisense strand of the double-stranded siRNA leads the activated nuclease complex to the target mRNA, whereupon it is degraded (Chiu et al., J. Immunol 169, 5754-60 (2002), Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6047-52 (2002)).
  • inhibitory RNAs e.g. siRNA or antisenseRNA
  • siRNA or antisenseRNA can be derived from the sequence of the HLA alleles, the expression of which is to be reduced.
  • the expression of HLA alleles can be reduced with respect to the entire locus, the entire class (I and / or II), a specific group of alleles or allele-specific.
  • HLA I ⁇ -chains ⁇ 2-microglobulin
  • an inhibitory RNA specifically interacting with the variable region of its mRNA, for example with a Region for ⁇ 1 and / or ⁇ 2, so that only the expression of this allele is reduced.
  • the reduction in the expression of HLA II can be achieved in a class-specific manner by interaction with a nucleic acid, for example an inhibitory RNA, which interacts with a region of the conserved region of the HLA II mRNA.
  • a nucleic acid for example an inhibitory RNA, which interacts with a region of the conserved region of the HLA II mRNA.
  • These can be the regions which code the ⁇ chain, the regions of which code for ⁇ 1, ⁇ 2, TM and / or CP, and regions which code the ⁇ chain, for example ⁇ 1, ⁇ 2, TM and / or CP .
  • nucleic acids are suitable which are specific for the ß chains of the HLA, for example for DRB1, DQB1.
  • inhibiting RNAs are suitable, which interact with the variable region of the HLA II-encoding mRNA, for example with domains ⁇ 1 and / or ⁇ 1 responsible for peptide binding.
  • all areas of the genes for HLA I or HLA II, including the introns, are suitable for interaction with inhibiting RNAs.
  • Figure 1 shows a schematic representation of the gene regions of HLA I
  • Figure 2 shows a schematic representation of the gene regions of HLA II
  • Figure 3 shows a schematic representation of an expression cassette for inhibitory RNA.
  • FIGS. 1 and 2 show gene regions which are suitable for inhibition by inhibitory RNAs.
  • the interaction of inhibitory RNAs with conserved regions will reduce the expression of the HLA in question in a class-specific manner, while the interaction with variable regions will be type-specific or allele-specific.
  • HLA I the total size of the gene is 3.5 kb, the peptide has 341 amino acids.
  • HLA II the total size of the gene is 14.5 kb, the peptide has 238 amino acids.
  • Example 1 In vitro inhibition of the expression of ⁇ 2m or HLA-A by siRNA in the transcription / translation reaction
  • siRNAs were tested in the eukaryotic in vitro transcription / translation system (Promega). The sequences of the siRNAs were either designed manually taking into account the sequence deviations of the HLA-A heavy chain or using computer-aided algorithms. The sequences of the siRNAs tested are given in Tables 1 and 2. For the experiments, both strands of the siRNA were synthesized and used as double-stranded siRNA.
  • the transcription of a vector was provided which contained the complete sequence of the cDNA of ß2m (test of the siRNA sequences from Table 1) or HLA-A (test of the siRNA sequences from Table 2) between a T7 promoter and a poly A signal.
  • the in vitro transcription / translation was carried out with 1 ⁇ g synthetic siRNA and 500 ng expression vector. Non-specific siRNAs were used as controls. The reaction was incubated for 1 h at 30 ° C, the expression of ⁇ 2m or the HLA-A heavy chain was analyzed by specific ELISAs.
  • siRNAs from Table 1 which are specific for ß2m in the in vitro transcription / translation test are SEQ ID Nos. 14 and 15, which are directed against the target sequence SEQ ID NO. 13 and Seq. -ID Nos. 23 and 24, which are directed against the target sequence SEQ ID No. 22.
  • the presence of these siRNAs resulted in a 40% decrease in expression.
  • the structural gene encoded by the expression vector was produced up to a concentration of 35.8 ng / mL.
  • the siRNA sequences given in Table 2 have the specificity indicated in each case and all have proven to be effective in reducing the translation of HLA-A.
  • Example 2 In vitro inhibition of the expression of ⁇ 2-microglobulin in cells by transfection with synthetic siRNA
  • HLA-A * 68 HeLa cells and B-LCL
  • B-LCL and K 562 cells 4 ⁇ 10 4 each
  • 1 ⁇ 10 5 HeLa cells were plated out one day before the transfection.
  • the group-specific siRNA sequence tested here was directed against group A28 and was tested in a heterozygous cell line (HLA A * 24.68) B-LCL and caused a reduction in the expression of HLA A * 68 (group A28) by 70%, while no effect on the expression of HLA A * 24 (group A9) was observed. This shows that an allele-specific reduction in expression is possible through group-specific inhibitory RNA.
  • Example 3 In vitro inhibition of the expression of ⁇ 2-microglobulin in cells by transcribed siRNA
  • siRNAs their sequences were cloned into an expression cassette. These expression cassettes were transfected in the form of double-stranded, linearized DNA in B-LCL and HeLa cells using siPORT XP-1 (Ambion).
  • the expression cassette is shown in FIG. 3 and is suitable for transfection or, if it is cloned into a suitable viral vector, which contains at least LTR sequences (Long Terminal Repeat, preferably SIN, soap-inactivating) and a packaging signal, for transduction. Shown are the human U6 (U6 polymerase III) and the Hl promoter with the terminator for U6 polymerase III.
  • the shRNA is a short hairpin RNA that is processed into siRNA in vivo. Examples of the sequences cloned into expression cassettes which code for shRNA are given in Example 4.
  • Example 4 In vivo inhibition of HLA expression in cells by transduction
  • Plasmids and lentiviral expression vectors were used to stably reduce the expression of HLA in B-LCL and HeLa cells.
  • the siRNA sequences used are shown in Table 3 and were cloned in the form of DNA oligonucleotides into an expression cassette according to Example 3.
  • the sequences of the oligonucleotides in Table 3 encode a shRNA.
  • the expression cassette had been cloned into a bacterial vector according to the manufacturer's instructions.
  • the promoter U6 was more efficient in reducing the expression of HLA than the promoter Hl.
  • the lentiviral expression vector pLenti ⁇ / BLOCK-iT DEST (Invitrogen) was used to construct a lentiviral vector which encoded the shRNA sequences.
  • the expression cassettes were taken from the vectors used in Example 4 according to the manufacturer's instructions (gateway technology).
  • Example 7 Production of lentiviral particles
  • HEK293 FT cells were cultured in DMEM (Cambrex, Verviers, Belgium), supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 1% penicillin / streptomycin and 500 ⁇ g / mL G 418.
  • ViraPower mixture provided by the manufacturer (Invitrogen), which distributes a gag / pol fusion protein (pLPl), a viral reverse transcriptase (pLP2) and, on a third plasmid (pLP / VSV G), the VSV- G protein-encoded and 3 ⁇ g of the lentiviral vector produced according to Example 6, which codes for the specific shRNA, were used to transfect 6 ⁇ 10 6 HEK293 cells using Lipofectamine 2000 according to the manufacturer's instructions. Viral particles were harvested from the supernatant after 48 h, centrifuged and filtered to remove cell debris.
  • sequences Seq ID Nos. 1 to 63 given here are contained in the 5 '-3' direction in the appendix as sequences 1 to 63.
  • Seq. ID numbers 58 and 59, 60 and 61, and 62 and 63 each form a double-stranded DNA fragment which can be cloned behind a promoter to transcribe a shRNA in order to form functional siRNA in the form of an RNA duplex after cell-internal processing.
  • SiRNAs with a length of 21 nucleotides with 3 'overhangs are particularly preferred. Such siRNA sequences can effectively bind the target mRNA and lead to its degradation without activating the interferon system (Elbashir et al., Nature 411, 494-98 (2001), McManus et al., J. Immunol. 169, 5754-60 (2002)).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Beeinflussung des Immunsystems bzw. der durch das Immunsystem vermittelten Abstoßungsreaktion zwischen einem Transplantat und einem Empfänger, sowie Autoimmunkrankheiten. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, die Expression von HLA I und/oder HLA II zu vermindern, vorzugsweise bis zu deren vollständiger Unterdrückung. Dabei zielt die Erfindung auf die Verminderung der Expression an HLA I und/oder HLA II innerhalb des Transplantats bei funktionierendem Immunsystem des Empfängers. Die Expression von HLA I und/oder HLA II wird vorzugsweise durch die direkte Einbringung oder die Produktion von hemmenden RNAs in Zellen des Transplantats erreicht. Auf diese Weise wird die weitere Expression derjenigen HLA I und/oder HLA II bis hin zur vollständigen Unterdrückung vermindert, die vom Immunsystem als fremd erkannt werden.

Description

Verbindungen und Verfahren zur Immunsuppression
Die vorliegende Erfindung betrifft die Beeinflussung des Immunsystems bzw. der durch das Immunsystem vermittelten Abstoßungsreaktion zwischen einem Transplantat und einem Empfänger, sowie bei Autoimmunkrankheiten.
Wesentliche Reaktionen des Immunsystems werden durch die in der Zellmembran verankerten HLA - Moleküle (humane Leukozyten- Antigene), die durch den humanen MHC kodiert werden, vermittelt. Die HLA-Moleküle spielen innerhalb der adaptiven Immunabwehr eine zentrale Rolle, da sie Antigene in Form kleiner Peptide gegenüber anderen Zellen des Immunsystems präsentieren, was einen Schritt der Wechselwirkung zur Auslösung der Immunabwehr darstellt.
Die HLA-Moleküle der Klasse I (HLA I) sind auf der Oberfläche aller Zellen vorhanden und präsentieren Peptide aus zellintern synthetisierten Proteinen, die zu Bruchstücken von ca. 9 bis 11 Aminosäuren degradiert wurden. HLA I treten in Wechselwirkung mit CD8+ zytotoxischen T-Zellen (T-Killerzellen). Die Peptide, die von HLA I präsentiert werden, können beispielsweise aus natürlichen Zellproteinen stammen, oder aus viralen Proteinen, die im Anschluss an eine Nirusinfektion synthetisiert worden sind. Die CD8+ zytotoxischen T- Zellen erkennen einerseits üblicherweise diejenigen von HLA I präsentierten Peptide als fremd, die nicht aus dem eigenen Genom der Zelle selbst stammen, andererseits auch ein dem Organismus fremdes HLA I, ohne dass zusätzlich ein präsentiertes fremdes Peptid erforderlich wäre.
Die Spezifität von HLA I gegenüber den präsentierten Antigenen beruht auf der Wechselwirkung ihrer Peptid-bindenden Region, die aus Teilen der α 1- und α 2- Domäne gebildet wird. Diese Peptid-bindenden α 1- und α 2- Domänen sind insbesondere im Bereich der Peptid-bindenden Region durch einen ausgeprägten Polymorphismus ihrer Aminosäuresequenz gekennzeichnet. Dieser hochgradige Polymorphismus fuhrt dazu, dass innerhalb einer Population eine große Anzahl von HLA I mit verschiedener Spezifität für Peptide, die als Antigen erkannt werden, erreicht wird, sodass verschiedene HLA I - Allele unterschiedliche Bereiche, beispielsweise eines Krankheitserregers, als Antigen erkennen. Dieser Polymorphismus innerhalb einer Population wird dadurch für jedes Individuum , genutzt bzw. verstärkt, dass beispielsweise beim Menschen jedes Individuum ein Allel für HLA I von jedem Elter auf den Oberflächen seiner Zellen exprimiert (Heterozygotie).
Die HLA I-Moleküle weisen eine schwere variable α-Kette auf, die die Peptid-bindenden, hoch polymorphen Regionen α 1 und α 2, sowie eine Domäne α 3 enthält, sowie eine leichte, invariable ß-Kette.
Die Fähigkeit der zytotoxischen T-Zellen, fremde HLA I-Moleküle als fremdes Antigen zu erkennen, fuhrt dazu, dass im Falle der Transplantation fremden Gewebes dessen HLA I vom Immunsystem des Empfängers als fremd erkannt wird und die Immunantwort der zytotoxischen T-Zellen auslöst, die den Zelltod des Transplantats verursacht. Werden andererseits Stammzellen des hämopoetischen Systems in einen Empfänger transplantiert, so erkennen die mittransplantierten CD8+ zytotoxischen T-Zellen die HLA I-Moleküle des Empfängers als fremd und greifen diese an.
Das HLA II - Molekül weist eine α- und eine ß-Kette auf, die Peptidbindung wird durch die Domänen α 1 und ß 1 vermittelt. HLA II ist auf der Oberfläche professionell Antigen präsentierender Zellen vorhanden, beispielsweise Makrophagen, dendritischen Zellen, B- Lymphozyten, sowie auf aktivierten T-Zellen. HLA II präsentiert extra-zelluläre aufgenommene Antigene mit einer Größe von ca. 15 bis 24 Aminosäuren gegenüber CD4+ T- Zellen oder T-Helferzellen sowie gegenüber CD8+ T-Zellen zu deren Stimulation. Die Wechselwirkung mit CD4+ T-Zellen oder T-Helferzellen führt dann zur Produktion von Antikörpern durch B-Zellen.
Der Polymorphismus von HLA I und HLA II fuhrt dazu, dass nur eine geringe Wahrscheinlichkeit dafür besteht, dass innerhalb einer Population zwei Individuen derart ähnliche bzw. gleiche HLA I und/oder HLA II aufweisen, dass sie im Falle einer Transplantation nicht vom jeweils anderen Immunsystem als fremd erkannt werden. Als Konsequenz dieser mangelnden Übereinstimmung wird mit hoher Wahrscheinlichkeit eine immunologische Reaktion durch HLA I und/oder HLA II alleine ausgelöst. Die durch HLA vermittelte Abstoßung wird noch dadurch kompliziert, dass im Falle einer Transplantation sowohl die väterlichen als auch die mütterlichen Allele von Transplantat und Empfänger aufeinander abgestimmt sein müssen, um eine immunologische Reaktion zu vermeiden, die gegen das als fremd erkannte HLA I und/oder HLA II gerichtet ist.
Mit Blick auf unerwünschte Immun-Reaktionen bei Transplantationen führt nach bisherigem Kenntnisstand insbesondere eine mangelnde Übereinstimmung der Struktur der ß-Ketten, insbesondere hinsichtlich der von den Genorten DRB1 und DQB1 kodierten Regionen, nämlich HLA-DR und -DQ der ß-Ketten, zu gegenseitigen Abstoßungsreaktionen.
Im Falle von Autoimmun-Erkrankungen wird vermutet, dass die Präsentation körpereigener Peptide, die normalerweise keine Immunantwort auslösen sollten, dennoch zu einer Immunreaktion führt. Dies kann einerseits durch Präsentation von Antigenen, die aus körpereigenen Proteinen entstanden sind, durch HLA I vonstatten gehen. Die anschließende Wechselwirkung mit CD8+ zytotoxischen T-Zellen löst in unerwünschter Weise deren Immunantwort aus, die dann gegen körpereigene Zellen gerichtet ist.
Als weiterer Wirkmechanismus von Autoimmun-Erkankungen wird angenommen, dass auch die Präsentation körpereigener Proteine durch HLA II gegenüber CD4+ T-Zellen oder T- Helferzellen die Aktivierung der Antikörper-Produktion durch B-Zellen auslöst, was ebenfalls zu einer unerwünschten Immun-Reaktion führt, die gegen körpereigene Proteine gerichtet ist. Weiterhin unterstützen die T-Helferzellen CD8+ T-Zellen zur weiteren Entwicklung. Stand der Technik
Zur Vermeidung einer Abstoßung des Empfängers gegen das Transplantat (Richtung Host versus Graft, HvG) oder des Transplantats gegen den Empfänger (Richtung Graft versus Host, GvH) werden die HLA-Phänotypen von Transplantat und Empfänger analysiert und vorzugsweise im Falle der phänotypischen Übereinstimmung einander zugeordnet, sodass dann eine Transplantation erfolgen kann. Dabei ist zu berücksichtigen, dass aufgrund des hohen Polymorphismus der HLA I und HLA II, die überdies in jeweils zwei Allelen vorliegen, nur eine geringe Wahrscheinlichkeit dafür besteht, eine völlige phänotypische Übereinstimmung zwischen Transplantat und Empfänger auswählen zu können. Dies trifft insbesondere dann zu, wenn die begrenzte Anzahl der zur Nerfügung stehenden Transplantate berücksichtigt wird.
Zur Vermeidung unerwünschter Abstoßungsreaktionen werden bisher immunsupprimierende Mittel verwendet, die die Aktivität des Immunsystems eines Empfängers eines Transplantats soweit reduziert, dass eine Immunreaktion gegen das als fremd zu erkennende Transplantat unterdrückt wird. Auf diese Weise läßt sich zwar einerseits eine Abstoßung des Transplantats verzögern bzw. verhindern, andererseits wird jedoch die Anfälligkeit gegenüber Infekten oder dem Auftreten von Tumoren erhöht.
Die Abstoßung entsteht einerseits aus der durch HLA I vermittelten immunologischen Aktivität der CD 8+ zytotoxischen T-Zellen, andererseits konnte auch gezeigt werden, dass anti-HLA- Antikörper gebildet werden, die auf eine Vermittlung durch HLA II zurückgehen. In der Folge führt bei HvG die zelluläre und humorale Immunantwort des Immunsystems des Empfängers zur Abstoßung bzw. zum Funktionsverlust des Transplantats. Für den Fall der Transplantation von Zellen des Immunsystems richtet sich die zelluläre und/oder humorale Immunantwort des Transplantats gegen alle Zellen des Empfängers (GvH), da diese einen HLA I und/oder HLA II aufweisen, die von den transplantierten Immunzellen als fremdes Antigen erkannt werden.
Mit Bezug auf Autoimmunkrankheiten besteht die bisher angewendete Therapie darin, ebenfalls das Immunsystem soweit zu inaktivieren, dass die immunologische Reaktion gegen körpereigene Zellen in ausreichendem Maße unterdrückt wird. In Einzelfällen, beispielsweise bei Myasthenia gravis, kann auch ein an der Immunreaktion beteiligtes Organ operativ entfernt werden, wobei jedoch zusätzlich eine immunsupprimierende Therapie erforderlich bleibt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Gegenüber dem bekannten Stand der Technik stellt sich der vorliegenden Erfindung die Aufgabe, die unerwünschten immunologischen Reaktionen bei Transplantationen, beispielsweise in der Richtung GvH oder HvG, sowie von Autoimmun-Erkrankungen zu vermindern, vorzugsweise vollständig zu unterdrücken, wobei die Nachteile der bekannten Verfahren vermieden werden sollen.
Die vorliegende Erfindung stellt in einer ersten Ausführungsform Mittel bereit, die diese unerwünschten Abstoßungsreaktionen zwischen Transplantat und Empfänger vermindern, bis hin zu deren vollständiger Unterdrückung.
In einer weiteren Ausführungsform mit Bezug auf Autoimmunkrankheiten betrifft die Erfindung die Verminderung bzw. Unterdrückung die Expression von HLA I und/oder HLA II des betroffenen Menschen, wobei vorzugsweise nur diejenigen Allele von HLA I und/oder HLA II vermindert bzw. unterdrückt werden, die an der Vermittlung der immunologischen Reaktion beteiligt sind.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, die Expression von HLA I und/oder HLA II zu vermindern, vorzugsweise bis zu deren vollständiger Unterdrückung. Dabei zielt die Erfindung auf die Verminderung der Expression von HLA I und/oder HLA II, beispielsweise im Transplantat, sodass bei funkionierender Immunreaktion die Abstoßung vermindert oder verhindert wird. Transplantate können dabei solide Organe, Gewebe oder Zellen, beispielsweise Herz, Lunge, Leber, Niere, Haut oder Zellen des Pankreas, einschließlich jedweder Stammzellen, beispielsweise hämopoetische Stammzellen oder Stammzellen des Pankreas sein.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Expression der HLA I und/oder HLA II der Zellen des Empfängerorganismus vermindert, vorzugsweise vollständig unterdrückt, wenn das Transplantat Zellen des Immunsystems umfasst. Dies dient beispielsweise bei der hämopoetischen Stammzelltransplantation dazu, die Graft versus Host- Reaktion zu vermindern, die durch im Knochenmarktransplantat enthaltene T-Zellen verursacht wird.
Zur Verminderung der Expression von HLA I und/oder HLA II ist vorgesehen, die Transkription der entsprechenden MHC-Gene zu reduzieren und/oder die Translation der mRNA zu vermindern, die für HLA I und/oder HLA II kodiert. Dabei sieht die Erfindung vor, dass Nukleinsäuren verwendet werden, die durch spezifische Wechselwirkung mit dem für HLA kodierenden Gen oder der entsprechenden mRNA die Expression von HLA vermindern, vorzugsweise vollständig unterdrücken. Diese Wechselwirkung der eingesetzten Nukleinsäure kann Bereiche des betreffenden MHC-Gens oder der mRNA betreffen, die für Aminosäuren kodieren (Exons), oder nicht-translatierte Bereiche, beispielsweise regulatorische Genabschnitte oder Introns.
Erfindungsgemäß kann die Verminderung der Transkription der MHC-Gene dadurch erreicht werden, dass die genomische Kopie des betreffenden MHC-Gens inaktiviert wird, beispielsweise durch Insertion in Bereiche und/oder Deletion von Bereichen der regulatorischen und/oder strukturellen Genabschnitte. Dies kann beispielsweise durch Rekombination mit transfizierten oder transduzierten Nukleinsäuren erfolgen, die bereichsweise homolog zum MHC-Gen sind, jedoch eine Deletion, Insertion oder sonstige beliebige Mutation enthalten, bei deren Einführung die genomische Kopie des MHC-Gens durch Veränderung der regulatorischen Bereiche oder Störung des Strukturgens inaktiviert wird bzw. zu einem nicht-fünktionellen HLA führt.
Die Expression von HLA I und/oder HLA II wird vorzugsweise durch die direkte Einbringung oder die Produktion von hemmenden RNAs erreicht. Dies sind vorzugsweise siRNA oder antisenseRNA. Auf diese Weise wird die weitere Expression derjenigen HLA I und/oder HLA II bis hin zur vollständigen Unterdrückung vermindert, die vom Immunsystem als fremd erkannt werden.
Die Verminderung der Translation der mRNA, die HLA I und/oder HLA II kodieren, kann alternativ durch Transfektion oder Transduktion enzymatisch aktiver RNA, sogenannter Ribozyme erfolgen, die eine oder mehrere spezifische mRNAs degradieren, die für HLA kodieren. Eine solche enzymatisch aktive RNA wird im Rahmen dieser Erfindung auch als hemmende RNA bezeichnet und kann in Form eines Plasmids oder DNA-Konstrukts in die Zelle eingeführt werden, zum Beispiel durch Transfektion oder durch Transduktion einer Expressionskassette auf einem Vektor, vorzugsweise einem lentiviralen Vektor, von dem die enzymatisch aktive RNA dann in der Zelle transkribiert wird. Alternativ können synthetische Derivate von RNA in Zellen transfiziert werden, beispielsweise Phosphothioate, die nach Art einer antisenseRNA zur Inaktivierung der mRNA fuhren, die für das spezifische HLA kodiert.
Die Verminderung der Expression von HLA I und/oder HLA II kann klassenspezifisch sein, d.h. die Expression von HLA I und/oder HLA II komplett vermindern, für den Genort spezifisch sein, d.h. HLA I-A oder HLA I-B oder HLA I-C usw. jeweils in ihrer Expression vermindern, gruppenspezifisch, d.h. bei HLA I für beispielsweise die Gruppe 68, 07 oder 08 spezifisch sein, und/oder allelspezifisch sein, d.h. nur ein spezifisches Allel eines heterozygoten Trägers von HLA I und/oder HLA II in seiner Expression zu vermindern.
Die Auswahl der für die Verminderung der Expression von HLA I und/oder HLA II zu verwendenden spezifischen Nukleinsäuren kann von einem Fachmann dadurch vorgenommen werden, dass jeweils für die Klasse, den Genort, die Gruppe und/oder das Allel spezifische homologe Genabschnitte identifiziert werden, die im wesentlichen keine Homologie zu anderen Genen aufweisen, bzw. im Falle hemmender RNAs im wesentlichen keine Homologie zu anderen, innerhalb der Zielzellen synthetisierten mRNAs aufweisen.
Alternativ zur direkten Beeinflussung der MHC-Gene bzw. der Transkription und/oder Translation, die zur Bildung von HLA führt, kann die Expression der an der Bildung der HLA beteiligten Moleküle, beispielsweise Tapasin, TAP etc. vermindert werden. Dies kann analog zum erfindungsgemäßen Verfahren durch den Einsatz hemmender RNAs, die für diese an der Bildung der HLA beteiligten Moleküle spezifisch sind, erzielt werden. In analoger Weise kann auch die Expression des Gens, das ein an der Bildung von HLA beteiligtes Molekül kodiert, durch Rekombination mit spezifischer homologer DNA vermindert werden, die eine zur Inaktivierung des Gens führende Mutation trägt.
Die erfindungsgemäße Verminderung der Expression von HLA I und/oder HLA II ist neben der medizinischen Anwendung zur Verhinderung der Abstoßung oder zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten auch dazu geeignet, Verbindungen und Verfahren für experimentelle Untersuchungen in vivo oder in viti'o zur Funktion von HLA I und/oder HLA II bzw. von deren spezifischen Wechselwirkungspartnern bereitzustellen. In bevorzugter Ausführungsform wird nur die Expression derjenigen Allele von HLA I und/oder HLA II vermindert, vorzugsweise vollständig unterdrückt, die an der Vermittlung der immunologischen Reaktion beteiligt sind. Auf diese Weise wird der Erkennungsmechanismus des Immunsystems nicht vollständig eliminiert, da diejenigen Allele von HLA I und/oder HLA II, die nicht an der Vermittlung der unerwünschten immunologischen Reaktion beteiligt sind, noch ihre natürliche Antigen präsentierende Funktion ausüben können.
In weiter bevorzugter Ausführung betrifft die Erfindung die organspezifische bzw. zelltypspezifische Verminderung bzw. Unterdrückung der Expression von HLA I und/oder HLA II.
In weiter bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung zusätzlich zur Verminderung der Expression von HLA I und/oder HLA II die Expression von HLA-G oder einer funktionellen Variante von HLA-G, die eine Erkennung durch NK-Zellen (natürliche Killerzellen) verhindert. Eine solche fünktionelle Variante im Sinne der Erfindung ist ein an der Zelloberfläche angeordnetes Protein, das diejenigen strukturellen Eigenschaften von HLA I, HLA II oder HLA-G aufweist, die gegen den Angriff von NK-Zellen schützen. Ein Beispiel für eine solche funktioneile Variante von HLA-G ist ein HLA-Molekül, das vom Immunsystem toleriert wird, also z. B. ein HLA des Empfängers im Falle der HvG, im Falle der GvH ein HLA des Transplantats. In weiterer Ausgestaltung der funktionellen Variante von HLA-G ist vorgesehen, ein vom Immunsystem toleriertes HLA als Fusionsprotein mit einem autologen Peptid (vorzugsweise 8 bis 15, bevorzugter 9 Aminosäuren lang) in den immunologisch angegriffenen Zellen herstellen zu lassen, bei dem das autologe Peptid die Peptidbindungsstelle der funktionellen Variante dauerhaft ausfüllt.
Die Expression von HLA-G oder dessen funktioneller Variante ist insbesondere für den Fall vorgesehen, dass die Expression beider Allele von HLA I und/oder HLA II stark vermindert bzw. vollständig unterdrückt wird. Dabei dient die Expression von HLA-G insbesondere dem Schutz solcher Zellen, die kein HLA I exprimieren, gegenüber einem Angriff durch NK- Zellen.
Die Expression von HLA-G in Zellen, deren Expression von HLA I und/oder HLA II vermindert ist, kann ebenso wie die Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verminderung der Immunreaktion, an der mindestens ein HLA beteiligt ist, durch bekannte gentechnische Mittel und Verfahren erreicht werden. Bevorzugt ist die Transfektion von Nukleinsäure, beispielsweise mittels der Lipofektion, Elektroporation oder CaPO4-Methode, oder die Transduktion dieser Zellen mit einem Vektor innerhalb eines viralen Partikel s, der eine Expressionskassette enthält, von der HLA-G oder dessen funktioneile Variante produziert werden kann. Besonders bevorzugt ist dabei, einen Promotor zu Regelung der Expression von HLA-G bzw. dessen fünktioneller Variante zu verwenden, der konstitutiv, induzierbar oder reprimierbar ist. Besonders bevorzugt hat dieser Promotor ähnliche oder identische Eigenschaften wie der Promotor, der die Expression hemmender RNAs steuert. Überdies kann die Expressionskassette für HLA-G auf einem gemeinsamen Nukleinsäurekonstrukt mit der Expressionskassette vorliegen, die die hemmenden RNAs kodiert, vorzugsweise auf einem viralen, beispielsweise lentiviralen Vektor.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, um die Expression von HLA I und/oder HLA II zu vermindern, vorzugsweise bis zu deren vollständiger Unterdrückung. Dies kann einen vollständigen Organismus, z.B. einen Menschen oder ein Tier und dessen MHC-Genprodukte betreffen, alternativ jedoch auch ein extrakorporales Organ, das als Transplantat in einen Empfänger eingesetzt wird. In letzterem Falle stellt die Erfindung ein Verfahren zur Transfektion oder Transduktion eines extrakorporalen Organs dar, dessen Zellen zumindest teilweise hemmende RNA unmittelbar oder in Form einer für hemmende RNA kodierenden Expressionskassette aufnehmen. In der Folge weist zumindest ein Teil der Zellen des extrakorporalen Transplantats die hemmende RNA oder eine Expressionskassette auf, die für hemmende RNA kodiert. Ein solches Transplantat kann anschließend in einen Empfänger eingesetzt werden, sodass die zur Transduktion verwendeten viralen Partikel bzw. zu Transformation verwendeten Nukleinsäurekonstrukte im wesentlichen nicht mehr aus dem Transplantat austreten und auf die Zellen des Empfängers übergehen können.
Weiterhin wird auf diese Weise einer Immunreaktion des Empfangers gegen das Transplantat vorgebeugt, das nun eine verminderte Anzahl bzw. keine HLA-Moleküle aufweist, die vom Immunsystem des Empfängers als fremd erkannt werden.
Insbesondere in Verbindung mit der gleichzeitigen oder zeitlich versetzten Transduktion oder Transfektion zumindest eines Teils der Zellen eines Transplantats mit einer Expressionskassette, die für HLA-G kodiert, kann ein Transplantat erzeugt werden, dass unabhängig von einer Kompatibilität mit dem Immunsystem eines Empfängers in diesen eingesetzt werden kann. Auf diese Weise wird das Problem der immunologischen Abstoßung umgangen, das nach dem Stand der Technik entweder eine möglichst vollständige Übereinstimmung der HLA I und/oder HLA II erforderte und üblicherweise eine ständige Unterdrückung der Aktivität des gesamten Immunsystems des Empfängers. Im Falle zellulärer Transplantate, beispielsweise von Stammzellen, wie denjenigen des Blutsystems, gegebenenfalls mit Ausnahme solcher des Immunsystems, können auf diese Weise Transplantate bereitgestellt werden, die keine inkompatiblen HLA I und/oder HLA II aufweisen und überdies teilbar bzw. in vitro kultivierbar sind.
Die erfindungsgemäße Verminderung der Expression von HLA I und/oder HLA II kann durch mehrere an sich bekannte Verfahren erfolgen, von denen die Verwendung von siRNA oder antisenseRNA, die als hemmende RNA in Bezug genommen werden, bevorzugt ist.
Die Einbringung bzw. Produktion von siRNA oder antisenseRNA bzw. von Ribozym in beabsichtigte Zielzellen kann in vitro oder in vivo durch Transfektion synthetisch hergestellter RNA oder eines RNA-Derivats (beispielsweise als Phosphothioat- Verbindung) erfolgen oder durch Transfektion oder Transduktion eines DNA-Konstrukts, das eine Expressionskassette zur Transkription enthält, von welcher die siRNA, Ribozym oder antisenseRNA synthetisiert wird.
Zur Synthese von siRNA kodiert eine solche Expressionskassette die komplementären Stränge der siRNA wobei im Anschluß an den Promotor ein erster Abschnitt den sense- Strang (oder antisense-Strang) der siRNA kodiert, ein zweiter Abschnitt den komplementären antisense-Strang (oder sense-Strang) kodiert und zwischen diesen ein Scharnierbereich (Loop) kodiert wird. Erster und zweiter Abschnitt sind über vorzugsweise 19 bis 29 nt vollständig komplementär zueinander und weisen zusätzlich nicht-komplementäre Bereiche auf, nämlich vorzugsweise der erste Abschnitt in 5', der zweite Abschnitt in 3' mit einer Länge von 1 bis 8, bevorzugt 2 bis 3 Nukleotiden. Der Scharnierbereich hat bevorzugt eine Länge von 4 bis 11 Nukleotiden. Im Anschluß an die Transkription nimmt die RNA durch Hybridisieren des komplementären ersten und zweiten Abschnitts eine Haarnadelstruktur (short hairpin) ein, wobei die nicht-komplementären Bereiche von erstem und zweitem Abschnitt einzelsträngig vorliegen und bei der der Scharnierbereich die Biegung bildet. Durch partielle Hydrolyse des Scharnierbereichs wird die shRNA in der Zelle zur funktionellen siRNA prozessiert (Castanotto et al., RNA 8, 1454-60 (2002)).
Zur Einbringung von hemmender RNA in vivo sind insbesondere virale Partikel geeignet, die zur transienten, bevorzugt dauerhaften Produktion der hemmenden RNA führen. Derartige virale Vektoren enthalten eine oder mehrere Expressionskassetten, von denen die hemmende RNA transkribiert wird. Durch Wahl geeigneter Promotoren kann die Transkription der hemmenden RNA konstitutiv sein, alternativ auch durch einen externen Induktor induziert oder durch einen externen Repressor reprimiert werden.
In bevorzugter Ausführungsform ist die Expressionskassette in einem lentiviralen Vektor enthalten, der stabil in das Genom von Zielzellen integriert, sodass die Expressionskassette in den Zielzellen dauerhaft zur Verfügung steht und z.B. bei konstitutiver Transkription der siRNA oder antisenseRNA kontinuierlich die Expression von HLA I und/oder HLA II vermindert, bis hin zur vollständigen Unterdrückung der Expression.
Weiter bevorzugt ist die zelltypspezifische bzw. organspezifische Transduktion von Zellen eines Transplantats mit einem viralen Partikel, das eine Expressionskassette aufweist, die für die erfindungsgemäße hemmende RNA kodiert. Auf diese Weise kann die Expression von HLA I und/oder HLA II allelspezifisch in dem Transplantat vermindert werden, vorzugsweise bis hin zur vollständigen Unterdrückung der Expression, ohne andere Zelltypen wesentlich zu beeinflussen. Die zelltypspezifische bzw. organspezifische Infektion mit einem viralen Vektor, der in einem viralen Partikel enthalten ist und eine Expressionskassette der erfindungsgemäßen siRNA oder antisenseRNA enthält, kann dadurch erreicht werden, dass der virale Partikel einen für die Zielzellen spezifischen Rezeptor aufweist. Derartige virale Rezeptoren können während der Erzeugung rekombinanter viraler Partikel in die Virushülle eingebaut werden, um so den rekombinanten viralen Partikel zu pseudotypisieren. Als Beispiel für einen unspezifischen Rezeptor eines viralen Partikels kann das Glycoprotein vom Virus der vesikulären Stomatitis, VSV-G, genannt werden.
Die bevorzugterweise zelltypspezifische Verminderung der Expression von HLA I und/oder HLA II kann dadurch erreicht werden, dass alternativ oder zusätzlich zur zeiltyp spezifischen Transduktion die für die siRNA oder antisenseRNA kodierenden Sequenzen von einem zelltypspezifischen Promotor transkribiert werden, sodass ein anderer Zelltyp, für den der verwendete Promotor nicht spezifisch ist, die erfindungsgemäße siRNA oder antisenseRNA nicht transkribieren kann.
Sowohl die siRNA als auch antisenseRNA vermindern erfindungsgemäß die Expression von HLA I und/oder HLA II dadurch, dass sie mit der mRNA der entsprechenden HLA in Wechselwirkung treten und deren Translation verhindern. Dies kann klassen-, genort-, gruppen- oder allelspezifisch erfolgen. Im Falle von siRNA wird ein spezifischer Nukleasekomplex (RISC, RNA-induzierter Silencing Komplex) unter Vermittlung einer DNA-Helikase gebildet. Dabei führt der antisense-Strang der doppelsträngigen siRNA den aktivierten Nukleasekomplex zur Ziel-mRNA, woraufhin diese degradiert wird (Chiu et al., J. Immunol 169, 5754-60 (2002), Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 99, 6047-52 (2002)).
Die Spezifität oder Selektivität hemmender RNAs, z.B. siRNA oder antisenseRNA, kann aus der Sequenz der HLA- Allele abgeleitet werden, deren Expression vermindert werden soll. Durch Auswahl geeigneter Zielsequenzen kann die Expression von HLA- Allelen hinsichtlich des gesamten Genorts, der gesamten Klasse (I und/oder II), einer bestimmten Gruppe von Allelen oder allelspezifisch vermindert werden. Als ein Beispiel führt die Verminderung der Expression der ß-Ketten von HLA I (ß2-Mikroglobulin) durch Wechselwirkung zumindest eines Bereiches der mRNA für die konservierte Region der ß-Ketten von HLA I mit einer hemmenden RNA zur Verminderung der Expression aller HLA I - Moleküle, unabhängig von deren Peptid-bindender Region α 1 bzw. α 2. Im Unterschied dazu kann die Expression eines spezifischen Alleis von HLA I dadurch vermindert werden, dass eine hemmende RNA spezifisch mit der variablen Region seiner mRNA in Wechselwirkung tritt, beispielsweise mit einer Region für α 1 und/oder α 2, sodass nur die Expression dieses Allels vermindert wird.
Die Verminderung der Expression von HLA II kann klassenspezifisch durch Interaktion mit einer Nukleinsäure, beispielsweise einer hemmenden RNA erzielt werden, die mit einem Bereich der konservierten Region der mRNA von HLA II in Wechselwirkung tritt. Dies können die Bereiche sein, die die α-Kette, deren Bereiche für α 1, α 2, TM und/oder CP kodieren, sowie Bereiche, die die ß-Kette, z.B. ß 1, ß 2, TM und/oder CP kodieren. Für eine genortspezifische Verminderung der HLA II sind beispielsweise Nukleinsäuren geeignet, die für die ß-Ketten der HLA-spezifisch sind, z.B. für DRB1, DQB1. Für eine allelspezifische Verminderung der Expression von HLA II sind hemmende RNAs geeignet, die mit der variablen Region der HLA II kodierenden mRNA in Wechselwirkung treten, beispielsweise mit den für die Peptidbindung verantwortlichen Domänen α 1 und/oder ß 1. Grundsätzlich eignen sich zur Wechselwirkung mit hemmenden RNAs alle Bereiche der Gene für HLA I oder HLA II, einschließlich der Introns.
Zur Verdeutlichung wird nachfolgend auf die Figuren Bezug genommen, in denen
Figur 1 eine schematische Darstellung der Genbereiche von HLA I zeigt, Figur 2 eine schematische Darstellung der Genbereiche von HLA II zeigt und Figur 3 eine schematische Darstellung einer Expressionskassette für hemmende RNA zeigt.
In den Figuren 1 und 2 sind Genbereiche angegeben, die zur Hemmung durch hemmende RNAs geeignet sind. Dabei wird die Wechselwirkung hemmender RNAs mit konservierten Regionen die Expression des betreffenden HLA klassenspezifisch vermindern, die Wechselwirkung mit variablen Regionen hingegen typ- oder allelspezifisch. Für HLA I beträgt die Gesamtgröße des Gens 3,5 kb, das Peptid weist 341 Aminosäuren auf. Für HLA II beträgt die Gesamtgröße des Gens 14,5 kb, das Peptid weist 238 Aminosäuren auf.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen genauer beschrieben:
Beispiel 1 : In vitro Hemmung der Expression von ß2m oder HLA-A durch siRNA in der Transkription- / Translationsreaktion
Zur Identifizierung geeigneter siRNA-Sequenzen zur spezifischen Verminderung der Expression von HLA wurden verschiedene siRNAs im eukaryotischen in vitro Transkriptions-/Translationssystem (Promega) getestet. Die Sequenzen der siRNAs wurden entweder manuell unter Berücksichtigung der Sequenzabweichungen der HLA-A schweren Kette oder mit Hilfe von computergestützten Algorithmen entworfen. Die Sequenzen der getesteten siRNAs sind in Tabellen 1 und 2 angegeben. Für die Experimente wurden beide Stränge der siRNA synthetisiert und als doppelsträngige siRNA eingesetzt. Als Testsystem für die zu vermindernde Expression von HLA wurde die Transkription von einem Vektor bereitgestellt, der die vollständige Sequenz der cDNA von ß2m (Test der siRNA-Sequenzen von Tabelle 1) oder HLA-A (Test der siRNA-Sequenzen von Tabelle 2) zwischen einem T7- Promotor und einem poly A-Signal aufwies. Die in vitro Transkription/Translation wurde mit 1 μg synthetischer siRNA und 500 ng Expressionsvektor durchgeführt. Nicht spezifische siRNAs wurden als Kontrollen eingesetzt. Die Reaktion wurde für 1 h bei 30 °C inkubiert, die Expression von ß2m oder der schweren Kette von HLA-A wurde durch spezifische ELISAs analysiert.
Die im in vitro Transkriptions-/Translationstest wirksamsten siRNAs aus Tabelle 1, die für ß2m spezifisch sind, sind die Seq.-ID Nrn. 14 und 15, die gegen die Zielsequenz Seq.-ID Nr. 13 gelichtet sind, bzw. Seq.-ID Nrn. 23 und 24, die gegen die Zielsequenz Seq.-ID Nr. 22 gerichtet sind. Die Anwesenheit dieser siRNAs führte zu einer Verminderung der Expression um 40%. Ohne Zusatz von siRNA wurde das vom Expressionsvektor kodierte Strukturgen bis zu einer Konzentration von 35,8 ng/mL produziert. Die in Tabelle 2 angegebenen siRNA- Sequenzen haben die jeweils angegebenen Spezifität und erwiesen sich alle als wirksam, die Translation von HLA-A zu vermindern.
Beispiel 2: In vitro Hemmung der Expression von ß2-Mikroglobulin in Zellen durch Transfektion mit synthetischer siRNA
SiRNAs, die die Expression von HLA in Beispiel 1 wirksam vermindern konnten, wurden in HeLa-, B-LCL und K 562- Zellen hinsichtlich transkribierten ß2-Mikroglobulins getestet. Zur Prüfung der Wirkung verschiedener synthetischer siRNA-Sequenzen, die gegen die schwere Kette von HLA-A gerichtet waren, wurden HLA-A* 68 (HeLa-Zellen und B-LCL) homozygote Zelllinien und eine heterozygote Zelllinie B-LCL (HLA-A* 24,68) verwendet. B-LCL und K 562- Zellen (jeweils 4 x 104) oder 1 x 105 HeLa-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion ausplattiert. 1 μg chemisch synthetisierter doppelsträngiger siRNA (Tabellen 1 und 2) wurde in einem Gesamtvolumen von 400 μL unter Verwendung des Transfektionsreagenzes RNAiFect (Qiagen, Hilden, Deutschland) transfiziert. Die Effizienz der Transfektion wurde durch Lichtmikroskopie nach 3 Stunden Inkubation mit gemischten FITC-markierten siRNA-Duplexmolekülen bestimmt. Wiederholte Transfektionen wurden alle 48 Stunden durchgeführt. Die Zellen wurden für maximal 6 Tage inkubiert. Die Analyse der Proteinexpression wurde in B-LCL- und HeLa-Zellen durch Nachweis von Antigenen auf der Zelloberfläche bzw. in K 562-Zellen durch intrazelluläre Anfärbung unter Verwendung der Durchflußzytometrie nachgewiesen. Die Transfektion von B-LCL- und K 562-Zellen mit synthetischen siRNAs, die für ß2- Mikroglobulin spezifisch waren, führte nach 5 Tagen zu einer Verminderung der Expression von 60%. Die gen- und gruppenspezifischen siRNAs, die für die mRNA der schweren Kette von HLA spezifisch waren, bewirkten im Anschluss an die Kultur der Zellen für 6 Tage eine Verminderung der Expression von HLA von bis zu 70% in B-LCL- und HeLa- Zellen.
Die gruppenspezifische siRNA-Sequenz, die hier getestet wurde, war gegen die Gruppe A28 gerichtet und wurde in einer heterozygoten Zelllinie (HLA A* 24,68) B-LCL getestet und bewirkte eine Verminderung der Expression von HLA A* 68 (Gruppe A28) um 70%, während keine Wirkung auf die Expression von HLA A* 24 (Gruppe A9) beobachtet wurde. Dies zeigt, dass eine allelspezifische Verminderung der Expression durch gruppenspezifisch hemmende RNA möglich ist.
Beispiel 3 : In vitro Hemmung der Expression von ß2-Mikroglobulin in Zellen durch transkribierte siRNA
Zur Expression von siRNAs wurden deren Sequenzen in eine Expressionskassette kloniert. Diese Expressionskassetten wurden in Form doppelsträngiger, linearisierter DNA in B-LCL- und HeLa-Zellen unter Verwendung von siPORT XP-1 (Ambion) transfiziert.
Die Expressionskassette ist in Figur 3 gezeigt und eignet sich zur Transfektion oder, wenn sie in einen geeigneten viralen Vektor kloniert ist, der zumindest LTR-Sequenzen (Long Terminal Repeat, bevorzugt SIN, seif inactivating) und ein Verpackungssignal enthält, zur Transduktion. Gezeigte sind der menschliche U6- (U6 Polymerase III) bzw. der Hl -Promotor mit dem Terminator zur U6 Polymerase III. Die shRNA ist eine short hairpin RNA, die in vivo zu siRNA prozessiert wird. Beispiele für die in Expressionskassetten einklonierten Sequenzen, die shRNA kodieren, sind in Beispiel 4 angegeben.
Beispiel 4: In vivo Hemmung der Expression von HLA in Zellen durch Transduktion
Zur stabilen Verminderung der Expression von HLA in B-LCL- und HeLa-Zellen wurden Plasmide und lentivirale Expressionsvektoren verwendet. Die verwendeten siRNA-Sequenzen sind in Tabelle 3 gezeigt und wurden in Form von DNA-Oligonukleotiden in eine Expressionskassette nach Beispiel 3 kloniert. Die Sequenzen der Oligonukleotide in Tabelle 3 kodieren eine shRNA. Die Expressionskassette war in einen bakteriellen Vektor gemäß den Anweisungen des Herstellers einkloniert worden.
Beispiel 5: Transfektion von B-LCL- und HeLa-Zellen mit Vektoren, die shRNA kodieren
6 x 106 B-LCL- oder HeLa-Zellen wurde in RPMI (Cambrex, Verviers, Belgien) resuspendiert (1 x 106 / mL), mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 1% Penicillin und Streptomycin supplementiert und mit 12 μg Plasmid, das für die shRNA kodiert, unter Verwendung von 36 μL Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) transfiziert. Die Lipidkomplexe wurden in einem Volumen von 3 mL Serum reduziertem Medium (Invitrogen) zusammengefügt und vor Zugabe zu den Zellen in 5 mL RPMI verdünnt. Nach Inkubieren der Zellen über Nacht wurden sie gewaschen und in normalem Medium kultiviert. Die Ergebnisse wurden am 4. Tag durch FACS-Analyse bestimmt.
Bei der Transfektion von HeLA- und B-LCL- Zellen mit siRNA- Expressionskassetten war der Promotor U6 effizienter bei der Verminderung der Expression von HLA als der Promotor Hl.
Nach der Transfektion von sowohl HeLa- als auch B-LCL- Zellen mit dem Vektor pENTR/U6 wurde 6 Tage nach der Transfektion des Vektors, der eine shRNA mit Spezifität für die schwere Kette von HLA-A kodierte, eine Verminderung der Expression um 40% beobachtet.
Beispiel 6: Lentiviraler Expressionsvektor
Zur Konstruktion eines lentiviralen Vektors, der die shRNA-Sequenzen kodierte, wurde der lentivirale Expressionsvektor pLentiό / BLOCK-iT DEST (Invitrogen) verwendet. Die Expressionskassetten wurden von den in Beispiel 4 verwendeten Vektoren gemäß den Anweisungen des Herstellers (Gateway Technologie) übernommen. Beispiel 7: Produktion lentiviraler Partikel
HEK293 FT-Zellen wurden in DMEM (Cambrex, Verviers, Belgien), mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 2 mM Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1% Penicillin/Streptomycin und 500 μg/mL G 418 supplementiert, kultiviert.
9 μg der vom Hersteller (Invitrogen) bereitgestellten Mischung ViraPower, die verteilt auf drei Plasmide ein gag/pol-Fusionsprotein (pLPl), eine virale reverse Transkriptase (pLP2) und, auf einem dritten Plasmid, (pLP/ VSV G) das VSV-G- Protein kodiert, sowie 3 μg des gemäß Beispiel 6 hergestellten lentiviralen Vektors, der für die spezifische shRNA kodiert, wurden zur Transfektion von 6 x 106 HEK293 -Zellen unter Verwendung von Lipofectamin 2000 gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Virale Partikel wurden aus dem Überstand nach 48 h geerntet, zentrifügiert und zur Entfernung von Zellresten filtriert.
Beispiel 8: Transduktion von B-LCL- und HeLa-Zellen
4 x 104 B-LCL- oder HeLa-Zellen wurde in 2 mL Überstand viraler Partikel resuspendiert und in einer 6 - Napf-Platte ausplattiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (900 upm) für 2 Stunden bei 32 °C in Gegenwart von 6 μg/mL Polybrene transduziert. Die Zellen wurden dann über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen gewaschen und in frischem Kulturmedium kultiviert. Am dritten Tag wurden die Zellen in selektives Medium mit 3μg/mL (HeLa) bzw. 6 μg/mL (B-LCL) Blasticidin (Invitrogen) überfuhrt. Die Expression von HLA wurde durch FACS am 6., 15. und 30. Tag analysiert. Zur Kontrolle wurde die Expression von Lamin A/C durch Analyse im Westernblot am 6. und 30. Tag bestimmt.
6 Tage nach Transduktion von HeLa- und B-LCL- Zellen mit einem lentiviralen Partikel, der eine für HLA-A spezifische shRNA kodierte, wurde eine Verminderung der Expression um 60% bzw. 50% beobachtet. Nach 30 Tagen wurde eine Verminderung der Expression von HLA-A um 70% in beiden Zelllinien beobachtet. Die HeLa- und B-LCL-Zellen, die zur Kontrolle mit einem lentiviralen Vektor transduziert waren, der eine für Lamin spezifische siRNA kodierte, zeigte eine Verminderung der Expression von Lamin, jedoch eine unveränderte Expression von HLA. Tabelle 1 : Sequenzen der siRNA. die spezifisch gegen ß2-Mikroglobulin gerichtet sind
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Tabelle 2: Sequenzen der siRNAs. die spezifisch gegen die schwere Kette von HLA-A gerichtet sind
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
Tabelle 3 : Sequenzen der shRNAs-, die in die Expressionskassette kloniert wurden
Figure imgf000023_0001
Die hier angegebenen Sequenzen Seq ID Nrn. 1 bis 63 sind in 5 '-3 'Richtung im Anhang als Sequenzen 1 bis 63 enthalten.
Die Seq. ID Nrn 58 und 59, 60 und 61, bzw. 62 und 63 bilden jeweils ein doppelsträngiges DNA-Fragment, das zur Transkription einer shRNA hinter einen Promotor kloniert werden kann, um nach zellinterner Prozessierung funktioneile siRNA in Form eines RNA-Duplex zu bilden.
Besonders bevorzugt sind siRNAs mit einer Länge von 21 Nukleotiden mit 3'- Überhängen. Denn derartige siRNA-Sequenzen können die Ziel-mRNA wirksam binden und zu deren Abbau führen, ohne dass es zu einer Aktivierung des Interferon- Systems kommt (Elbashir et al., Nature 411, 494-98 (2001), McManus et al., J. Immunol. 169, 5754-60 (2002)).

Claims

Ansprüche
1. Nukleinsäure zur Verminderung einer Immunreaktion, an der zumindest ein HLA- Molekül beteiligt ist, wobei die Nukleinsäure die Expression zumindest eines HLA vermindert.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure DNA ist, die das HLA-Gen durch Rekombination inaktiviert.
3. Nukleinsäure nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA zumindest eine Mutation in regulatorische und/oder strukturelle Bereiche des HLA-Gens einführt.
4. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine hemmende RNA ist, die die Expression des HLA-Gens durch Wechselwirkung mit dessen mRNA vermindert.
5. Nukleinsäure nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Phophothioat- Verbindung, eine siRNA oder eine antisenseRNA oder eine enzymatisch aktive RNA, die mRNA degradiert, ist.
6. Nukleinsäure nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine siRNA ist, die von den Seq ID Nrn. 14 und 15, Seq ID Nrn. 23 und 24, Seq ID Nrn. 29 und 30, Seq ID Nrn. 32 und 33, Seq ID Nrn. 35 und 36, Seq ID Nrn. 38 und 39, Seq ID Nrn. 41 und 42, Seq ID Nrn. 44 und 45, Seq ID Nrn. 47 und 48, Seq ID Nrn. 50 und 51, Seq ID Nrn. 53 und 54, Seq ID Nrn. 56 und 57, Seq ID Nrn. 58 und 59, Seq ID Nrn. 60 und 61 und/oder Seq ID Nrn. 62 und 63 kodiert wird.
7. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA von einer Expressionskassette kodiert wird, von der sie transkribiert werden kann.
8. Nukleinsäure nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionskassette in einem viralen, vorzugsweise in einem lentiviralen Vektor enthalten ist.
9. Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese weiterhin eine Expressionskassette umfasst, von der HLA-G oder eine funktioneile Variante dessen exprimiert werden kann.
10. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen gewebsspezifischen konstitutiven, induzierbaren oder reprimierbaren Promotor zur Steuerung der Transkription der hemmenden RNA aufweist.
11. Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen gewebsspezifisch konstitutiven, induzierbaren oder reprimierbaren Promotor zur Steuerung der Transkription des Gens aufweist, dass für HLA-G oder eine funktioneile Variante dessen kodiert.
12. Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen.
13. Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese spezifisch mit der α-Kette einer Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, die für HLA I kodiert.
14. Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese spezifisch mit der Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, die für die ß-Kette von HLA I kodiert.
15. Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure spezifisch mit der Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, die für mindestens eine der Regionen α 1 oder α 2 von HLA I kodiert.
16. Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese spezifisch mit mindestens einer der Nukleinsäuren in Wechselwirkung tritt, die für die α-Kette oder ß-Kette von HLA II kodiert.
17. Nukleinsäure nach Anspruch 16, dadurch kennzeichnet, dass diese spezifisch mit der Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, die für mindestens eine der Regionen α 1 oder ß 1 von HLA II kodiert.
18. Viraler Partikel, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche umfasst.
19. Viraler Partikel nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der virale Partikel einen Rezeptor zur zelltypspezifischen oder organspezifischen Wechselwirkung mit Zellen des Transplantats oder des Empfangers aufweist.
20. Nukleinsäure einem der Ansprüche 1 bis 17 oder viraler Partikel nach Anspruch 18 oder 19 zur Behandlung der Immunreaktion zwischen einem Transplantat und einem Empfänger.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterdrückung der immunvermittelten Abstoßungsreaktion oder einer Autoimmun-Erkrankung, die eine Nukleinsäure einem der Ansprüche 1 bis 17 oder einen viralen Partikel nach Anspruch 18 oder 19 aufweist.
22. Transplantat, das eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 17 aufweist.
23. Verfahren zur Beeinflussung der Immunreaktion, die unter Beteiligung von HLA I und/oder HLA II abläuft, in vitro, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder eines viralen Partikels nach einem der Ansprüche 17 oder 18.
24. Verfahren zur Verminderung der Immunreaktion bei einer Transplantation, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder eines viralen Partikels nach einem der Ansprüche 17 oder 18.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass ein Transplantat extrakorporal vor der Einsetzung in den Empfanger mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder einem viralen Partikel nach einem Ansprüche 18 oder 19 behandelt wird.
26. Organ, dass durch ein Verfahren nach Anspruch 25 erhältlich ist.
PCT/DE2004/000956 2004-05-06 2004-05-06 Verbindungen und verfahren zur immunsuppression WO2005108572A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/DE2004/000956 WO2005108572A1 (de) 2004-05-06 2004-05-06 Verbindungen und verfahren zur immunsuppression
DE112004002914T DE112004002914A5 (de) 2004-05-06 2004-05-06 Verbindungen und Verfahren zur Immunsuppression

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/DE2004/000956 WO2005108572A1 (de) 2004-05-06 2004-05-06 Verbindungen und verfahren zur immunsuppression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005108572A1 true WO2005108572A1 (de) 2005-11-17

Family

ID=34957771

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2004/000956 WO2005108572A1 (de) 2004-05-06 2004-05-06 Verbindungen und verfahren zur immunsuppression

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE112004002914A5 (de)
WO (1) WO2005108572A1 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007064846A2 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 Intradigm Corporation COMPOSITIONS AND METHODS OF USING siRNA TO KNOCKDOWN GENE EXPRESSION AND TO IMPROVE SOLID ORGAN AND CELL TRANSPLANTATION
US9677087B2 (en) 2004-05-18 2017-06-13 National Institute Of Transplantation Foundation Vectors and methods for long-term immune evasion to prolong tranplant viability
EP3406139A1 (de) 2017-05-26 2018-11-28 Medizinische Hochschule Hannover Procédé de modification génétique d'un tissu vascularisé
EP3441461A1 (de) * 2017-08-11 2019-02-13 Baylor College of Medicine Cd1d-restringierte nkt-zellen als plattform für gebrauchsfertige krebsimmuntherapie
WO2021216978A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 Aztherapies, Inc. Cellular ablation of hla-class i mhc

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0601585A2 (de) * 1992-12-09 1994-06-15 Enzo Therapeutics, Inc. Nukleinsäure Konstrukt zur Hemmung oder Regulierung der Funktionen eines Immunoantwortgens, dessen Verwendung in einem Verfahren und immunokompatibles System, das dieses Konstrukt enthalt
WO1995006718A2 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 Viagene, Inc. Methods of suppressing autoimmune response
WO2003062394A2 (en) * 2002-01-22 2003-07-31 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for rna interference
WO2003070744A1 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF INTERLEUKIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003104456A1 (en) * 2002-06-10 2003-12-18 London Health Sciences Centre Research Inc. Immunomodulation using altered dendritic cells
WO2004085654A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 Axordia Limited Modulation of cell phenotype by inhibitory rna

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0601585A2 (de) * 1992-12-09 1994-06-15 Enzo Therapeutics, Inc. Nukleinsäure Konstrukt zur Hemmung oder Regulierung der Funktionen eines Immunoantwortgens, dessen Verwendung in einem Verfahren und immunokompatibles System, das dieses Konstrukt enthalt
WO1995006718A2 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 Viagene, Inc. Methods of suppressing autoimmune response
WO2003062394A2 (en) * 2002-01-22 2003-07-31 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for rna interference
WO2003070744A1 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF INTERLEUKIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003104456A1 (en) * 2002-06-10 2003-12-18 London Health Sciences Centre Research Inc. Immunomodulation using altered dendritic cells
WO2004085654A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 Axordia Limited Modulation of cell phenotype by inhibitory rna

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOM DANIEL ET AL: "A glycosylated type I membrane protein becomes cytosolic when peptide: N-glycanase is compromised.", EMBO (EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY ORGANIZATION) JOURNAL, vol. 23, no. 3, 11 February 2004 (2004-02-11), pages 650 - 658, XP002303932, ISSN: 0261-4189 *
FIGUEIREDO CONSTANCA ET AL: "HLa silencing by RNAi-mediated transcript targeting", GENES AND IMMUNITY, vol. 5, no. Suppl. 1, May 2004 (2004-05-01), & 18TH EUROPEAN HISTOCOMPATIBILITY CONFERENCE; SOFIA, BULGARIA; MAY 08-11, 2004, pages S6, XP009039365, ISSN: 1466-4879 *
TIJSTERMAN M ET AL: "THE GENETICS OF RNA SILENCING", ANNUAL REVIEW OF GENETICS, ANNUAL REVIEWS INC., PALO ALTO, CA, US, vol. 36, 2002, pages 489 - 519, XP009013370, ISSN: 0066-4197 *
WENGENMAYER TOBIAS ET AL: "Inhibition of HLA-G production in JEG-3 choriocarcinoma cells by RNA interference.", AMERICAN JOURNAL OF REPRODUCTIVE IMMUNOLOGY (NEW YORK, N.Y. : 1989) MAR 2004, vol. 51, no. 3, March 2004 (2004-03-01), pages 189 - 191, XP009039366, ISSN: 1046-7408 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9677087B2 (en) 2004-05-18 2017-06-13 National Institute Of Transplantation Foundation Vectors and methods for long-term immune evasion to prolong tranplant viability
WO2007064846A2 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 Intradigm Corporation COMPOSITIONS AND METHODS OF USING siRNA TO KNOCKDOWN GENE EXPRESSION AND TO IMPROVE SOLID ORGAN AND CELL TRANSPLANTATION
WO2007064846A3 (en) * 2005-11-30 2008-02-28 Intradigm Corp COMPOSITIONS AND METHODS OF USING siRNA TO KNOCKDOWN GENE EXPRESSION AND TO IMPROVE SOLID ORGAN AND CELL TRANSPLANTATION
EP3406139A1 (de) 2017-05-26 2018-11-28 Medizinische Hochschule Hannover Procédé de modification génétique d'un tissu vascularisé
WO2018215571A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Medizinische Hochschule Hannover Method for genetically modifying a vascularised tissue
US11812740B2 (en) 2017-05-26 2023-11-14 Medizinische Hochschule Hannover Method for genetically modifying a vascularised tissue
EP3441461A1 (de) * 2017-08-11 2019-02-13 Baylor College of Medicine Cd1d-restringierte nkt-zellen als plattform für gebrauchsfertige krebsimmuntherapie
EP3664619A4 (de) * 2017-08-11 2021-07-21 Baylor College of Medicine Cd1d-restringierte nkt-zellen als plattform für gebrauchsfertige krebsimmuntherapie
WO2021216978A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 Aztherapies, Inc. Cellular ablation of hla-class i mhc

Also Published As

Publication number Publication date
DE112004002914A5 (de) 2007-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69636937T3 (de) Durch trans-spaltung erhaltene therapeutische molekule
DE112014006656B4 (de) Nukleinsäure zur Kodierung eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins und T-Lymphozyt zur Expression eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins
CN110785489A (zh) 使用CRISPR/Cpf1在T细胞中进行基因编辑的组合物和方法
EP2195430B1 (de) Herabregulation der genexpression mittels nukleinsäure-beladener virusähnlicher partikel
EP4086346A1 (de) Verfahren zur behandlung des usher-syndroms und zusammensetzung dafür
EP1432452A2 (de) Inhibition von stat-1
WO2021197391A1 (zh) 一种制备经修饰的免疫细胞的方法
EP2220214A2 (de) Verfahren zur erhöhung der immunreaktivität
CN114127083A (zh) 使用人工微rna修饰哺乳动物细胞以改变其特性及其产品的组成
WO2003062423A2 (de) Verfahren zur hemmung der expression eines durch eine chromosomen-aberration entstandenen zielgens
DE60038555T2 (de) Verpackungszelle
DE69433978T2 (de) Methode der spezifischen abschaltung von genen durch dna-methylierung
EP1325122A2 (de) Modulation der transkription pro-inflammatorischer genprodukte
WO2005108572A1 (de) Verbindungen und verfahren zur immunsuppression
DE69921609T2 (de) Ribozymale nukleinsäure die ccr5 oder cxcr4 schneiden
DE10257421A1 (de) Regulatorische Elemente im 5'-Bereich des VR1-Gens
US20220290157A1 (en) Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
CN113056560A (zh) 能够实现反馈的合成基因、靶点种子匹配盒及其应用
DE602004006509T2 (de) Zu einem für den menschlichen cd40-rezeptor codierenden cdna-bereich homologe oligoribonukleotidsequenz sowie damit zusammenhängende duplex-oligoribonukleotide, vektoren, pharmazeutische zusammensetzungen und verwendungen
EP1607482A1 (de) RNAi-basierte Verfahren zur Selektion von transfizierten eukaryontischen Zellen
DE19822115B4 (de) Retrovirale Gentransfervektoren
WO2003031459A2 (de) Modulation der expression stat-1-abhängiger gene
EP1428886B1 (de) Verbesserte retrovirale Vektoren für die Gentherapie
CN113652449B (zh) 基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体、试剂盒、方法及应用
EP4370676A2 (de) Zusammensetzungen und verfahren zum targeting, editieren oder modifizieren menschlicher gene

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1120040029147

Country of ref document: DE

REF Corresponds to

Ref document number: 112004002914

Country of ref document: DE

Date of ref document: 20070524

Kind code of ref document: P

122 Ep: pct application non-entry in european phase