WO2005108429A1 - 新規可溶性ｃｄ１４抗原 - Google Patents

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WO2005108429A1
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fragment
soluble
antigen
seq
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PCT/JP2005/008635
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Shoji Furusako
Kamon Shirakawa
Jiro Hirose
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Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Definitions

  • the present invention relates to a novel in vivo antigen that can be a diagnostic marker for sepsis.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing sepsis, which comprises measuring the antigen, a kit for measuring the antigen using a specific antibody, and a method for measuring the same. Further, the present invention relates to a recombinant soluble fragment useful as a standard substance of the measurement kit, an antibody binding to the fragment, a method for producing the fragment, and a method for screening an antibody using the fragment.
  • the CD14 molecule was named at the 3rd Leukocyte Typing Conference in 1986 as a protein identified by a group of antibodies that recognize glycoproteins expressed on the membrane surface of mononuclear cells. 1990, revealed that Wright et al is a receptor of LPS is the CD14 molecule force endotoxin ( "Science (Science)” (the United States), 1990, 249 Certificates, p.l431 - 1433) 0 this CD14 Analysis of the cDNA revealed that the molecule is a glycoprotein with a molecular weight of 53-55 kDa and that the mRNA is approximately 1.4 kb in size and consists of 356 amino acids ("Nucleic Acids Research” (UK) ), 1988, Vol. 16, p.4173) 0
  • Human CD14 molecules include soluble CD14 in addition to membrane-bound CD14, and it has been reported that there are multiple soluble CD14s having different molecular weights in blood (“Yoguchi Bian”). Journal of Immunology (Germany), 1993, Vol. 23, pp. 2144-2151). Landmann et al. Performed Western blot analysis of soluble CD14 in the serum of patients with sepsis, and found that soluble CD14 of approximately 55 kDa was high in patients with septic death and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH).
  • PNH paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
  • soluble CD14-ELISA kit power BL-Hamburg released by Medgenix, R & D Systems, has been used to measure soluble CD14 in many diseases including sepsis ("Tali-Cal Immunology and Immunopathology ( Clinical Immunology And Immunopathology) ”(USA), 1996, Vol. 80, pp. 307-310;“ Clinical Testing ”, 1994, Vol. 38, pp. 341-344).
  • the soluble CD14 containing about 55 kDa and 49 kDa described above according to the degree of disease progression (reported, its molecular weight is different, so it is not limited to about 55 kDa and 49 ka.
  • concentration increased and it became clear that soluble CD14 was not a marker specific to sepsis (“Infection and Immunity” (USA), 1999, Vol. 67). , P.417-420; “Clinical and Experimental Immunology” (UK), 2000, Vol. 120, p.483-487; “Tally and Experimental Immunology” Clinical Experimental Immunology) "(UK), 1994, Vol. 96, p.15-19).
  • soluble CD14 does not show any correlation with severe septic shock, which was expected as a marker for the severity of sepsis (“Pediatric allergy and immunology” (Denmark)). 1997, Vol. 8, p. 194-199), because there is no correlation with the systemic inflammatory response syndrome (SIRS) ("Joichi Bian Journal of Cry-Rinore Investigation ( European Journal of Clinical Investigation) "(UK), 1998, Vol. 28, p.672-678), a powerful diagnostic agent for sepsis.
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • the amount of low-molecular-weight CD14 in blood is indirectly obtained by subtracting the amount of high-molecular-weight CD14 in blood from the total amount of soluble CD14 in blood ( International Publication No. WO01Z22085).
  • kits and a method for measuring the antigen using a specific antibody are desired.
  • a method for screening an antibody useful for measuring the antigen is desired.
  • a recombinant soluble fragment having a similar immunological function to the antigen and a method for producing the fragment are desired.
  • the present invention has invented a recombinant soluble fragment having immunologically similar properties to the antigen, a method for producing the fragment, and an antibody which specifically binds to the fragment.
  • an antibody that specifically binds to a peptide consisting of a specific amino acid sequence of human full-length soluble CD14 or a fragment of the antibody;
  • Invented are a kit and a method for measuring the antigen, which comprise, as a component, an antibody produced as a fragment or a fragment of the antibody, or an antibody that specifically binds to the fragment or a fragment of the antibody. did.
  • soluble CD14 antigen can be referred to as “soluble CD14 protein”.
  • fragment is used to mean that "recombinant soluble CD14 fragment” has a partial sequence of human full-length soluble CD14 that can be called “recombinant soluble CD14 protein”.
  • “Fragment” is a general term I can do it. Also in the present invention, it is a part of the protein that also has partial sequence power of the amino acid sequence of the target protein, and the difference between the three-dimensional structure of the protein and the attached protein such as sugar chains or lipids is different from that of the target protein. Is not particularly questionable.
  • the present invention provides the following (1) to (13).
  • a method for measuring the soluble CD14 antigen of (1) contained in a specimen which comprises an antibody or a fragment of the antibody that specifically binds to at least one soluble CD14 antigen of (1) above
  • a kit for measuring soluble CD14 antigen
  • An antibody or a fragment thereof which specifically binds to at least one of the soluble CD14 antigens of the above (1) is specifically bound to the soluble CD14 antigen of the above (1).
  • the antibody specifically bound to the fragment prepared in 2) is A step of selecting as an antibody useful for measuring the soluble CD14 antigen.
  • a method for producing the recombinant soluble CD14 fragment of the above (2) which comprises the following steps: 1) A method for producing a recombinant soluble CD14 fragment having the following sequence of 1) to 4) About
  • the C-terminus is any of positions 134 to 356 of SEQ ID NO: 3,
  • the present invention provides the following novel soluble CD14 antigen, recombinant soluble CD14 fragment, and a novel method for diagnosing or detecting sepsis.
  • a novel soluble CD14 antigen represented by the following (11) or (12):
  • step (1) a recombinant soluble CD14 fragment having the following sequences (4) to (7) is prepared:
  • N-terminus is a deviation from positions 1 to 17 of SEQ ID NO: 3
  • the C-terminus is any of positions 134 to 356 of SEQ ID NO: 3, and
  • step 7) of ⁇ 1> the predetermined protease is ProScission Protease, and the sequence of the cleavage site is Leu, Glu, Val, Leu, Phe, Gin, Gly, Pro.
  • step 7) of step 1) the predetermined proteolytic enzyme is Thrombin and the sequence power of the cleavage site is SLeu, Val, Pro, Arg, Gly, Ser. Recombinant soluble CD14 fragment.
  • step 5 of ⁇ 1>, the N-terminal is any one of positions 1 to 6 of SEQ ID NO: 3
  • step 5 of ⁇ 1>! /,
  • the N-terminus is the first position of SEQ ID NO: 3 (2-2) to (2-4)! , Some recombinant soluble CD14 fragments.
  • step 7) of step 1) the sequence strength of the cleavage site of the predetermined protease is substituted or inserted after any of the positions 59 to 80 in SEQ ID NO: 3. Yes (2—
  • step 7) of step 1) the sequence strength of the cleavage site of the predetermined protease is substituted or inserted after any of positions 64 to 75 of SEQ ID NO: 3 (2 —
  • step 7) of step 1) the sequence strength of the cleavage site of the predetermined protease is substituted or inserted after position 64 of SEQ ID NO: 3!
  • step 5) of ⁇ 1> the N-terminus is position 1 of SEQ ID NO: 3, and in 7) the sequence of the cleavage site of the specified protease is after position 64 of SEQ ID NO: 3.
  • the C-terminus is any of positions 59 to 90 of SEQ ID NO: 3.
  • the N-terminus is at position 1 to position 17 of SEQ ID NO: 3, and
  • (4-1) A method for diagnosing or detecting sepsis, which comprises measuring the soluble CD14 antigen of the above (1).
  • the present invention provides the following novel soluble CD14 antigen assay kit and assay method.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of (2) or (3) is prepared as an antigen.
  • the soluble CD14 antigen of the above (1) is measured by a sandwich immunoassay shown in any one of the following (5-6-1) to (5-6-19).
  • a kit for measuring the soluble CD14 antigen which is an antibody or a fragment of the antibody (5-6-2).
  • the second specific binding substance that forms the second specific binding substance or the partner of the second specific binding substance binds to the insoluble carrier, and (5-6-11) to (5-6)
  • the second specific binding substance that forms the second specific binding substance or the partner of the second specific binding substance is labeled (5-6-11) to (5-6-15). 6-13) !, a kit for measuring soluble CD14 antigen.
  • (5-6-16) Contains a labeled soluble CD14 antigen of the above (1) or a labeled analog of the soluble CD14 antigen of the above (1), which is measured by a sandwich immunoassay by a competitive method (5-6-1)
  • the label is a label with at least one of an enzyme, a dye, colloidal gold, colored latex, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, or an isotope (5-6-9), (5-6 6-10), (5-6-15) or (5-6-16) !, a kit for measuring soluble CD14 antigen.
  • the labeled analogous substance of the soluble CD14 antigen of the above (1) is the labeled recombinant soluble CD14 fragment of the above (2). Measurement kit.
  • the antibody of any of the above a) to c) or a fragment of the antibody is bound to an insoluble carrier, and the second binding substance is the antibody of the above d) or the antibody of the antibody.
  • (6-1) at least one antibody or a fragment thereof which specifically binds to the soluble CD14 antigen of the above (1) is specifically bound to the soluble CD14 antigen of the above (1).
  • the immunological method for measuring the soluble CD14 antigen according to the above (1) is specifically measured.
  • An antibody that specifically binds to the soluble CD14 antigen of the above (1) or a fragment of the antibody may be any one of the following a) to d) or a fragment of the antibody: (6-1) an immunological assay method for the soluble CD14 antigen,
  • the present invention provides a novel antibody and a method for screening an antibody useful for measuring the soluble CD14 antigen of the above (1).
  • (9-1) An antibody that specifically binds to the recombinant soluble CD14 fragment of (3) above. (9-1) The antibody of (9-1), which does not substantially bind to the full-length soluble CD14 protein in human blood, but binds to the recombinant soluble CD14 fragment of (3).
  • the antibody prepared in the above step 1) is selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 in which the N-terminal amino acid sequence power from 1 to 314 is also selected.
  • (10-1) The screening method according to (10-1), wherein the antibody is an antibody that specifically binds to a peptide having amino acid residues.
  • the antibody prepared in the above step 1) is an antibody prepared using a peptide consisting of consecutive 8 to 30 amino acid residues selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as an antigen.
  • (10-1) The screening method according to (1), wherein
  • the screening method according to (10-1), wherein the liquid to be measured prepared in the step 2) is a normal human body fluid or a sample of human high molecular weight CD14.
  • a labeled antibody for the antibody prepared in 1) is further prepared, and the antigen immobilization method composed in the step 3) is performed by binding the liquid to be measured to an insoluble carrier in 2). And (4) the screening method according to (10-6), wherein the antibody prepared in 1) and the labeled antibody are sequentially reacted with the measurement system based on the antigen immobilization method constituted in 3).
  • the step of evaluating and selecting in 5) above is characterized by evaluating that the antibody prepared in 1) does not specifically bind to high molecular weight CD14 and selecting. (10-6) or the screening method of (10-7).
  • the liquids to be measured prepared in the step 2) are a body fluid of a normal person and a body fluid of a sepsis patient.
  • the immunoassay system composed of the above step 3) is a sandwich assay using the two antibodies prepared in 1) and 1) 1 (2).
  • the step of evaluating and selecting the antibody in 5) above is a sandwich in which the measurement result of the body fluid of a normal person is compared with the measurement result of the body fluid of a sepsis patient, and the difference in the compared measurement results is a useful sandwich diagnosis for sepsis.
  • This is a step of evaluating and selecting an antibody to be used for the immunoassay.
  • the method according to the first aspect of the present invention which is a method for screening a combination of antibodies for use in a sandwich immunoassay method useful for measuring the soluble CD14 antigen (10-10) — 9) Screening method.
  • the antibody prepared in 1) or 1)-(2) is bound to an insoluble carrier, and constituted. 9) or the screening method of (10-10).
  • the antibody prepared in 1) or 1)-(2) is labeled and constituted (10-9) or (10 10) The screening method.
  • the prepared antibody is specific to a protein having the amino acid sequence power of any of 6 to 356 selected from the amino acid sequence powers selected from SEQ ID NO: 3.
  • the screening method according to (11) which is an antibody that binds specifically.
  • the antibody prepared specifically binds to a protein containing at least 7 contiguous amino acid residues at which positions 53 to 68 described in SEQ ID NO: 3 are also selected.
  • (11-1) The screening method according to (11-1),
  • the system for evaluating the specific binding by reacting in the step (3) is the antigen immobilization method, wherein One Jung way.
  • the system for evaluating specific binding by reacting in the step (11-5) 3) is a sandwich immunoassay, wherein Screening method of Jung.
  • the system for evaluating specific binding by reacting in the step of (3) is an analysis method for interaction between biomolecules, which is characterized in that Screening method.
  • the present invention provides a method for producing the following specific and soluble soluble CD14 fragment of the above (2).
  • (12-1) a method for producing the recombinant soluble CD14 fragment of the above (2-3), comprising the following steps;
  • the C-terminus is any of positions 134 to 356 of SEQ ID NO: 3
  • the sequence of the cleavage site of the predetermined protease is substituted or inserted after positions 59 to 70 of SEQ ID NO: 3.
  • step 4) of ⁇ 1> the predetermined protease is ProScission Protease, and the sequence of the cleavage site is Leu, Glu, Val, Leu, Phe, Gin, Gly, Pro. (12-1) The method for producing the recombinant soluble CD14 fragment according to the above (2-3).
  • step 4) of ⁇ 1> the predetermined protease is Thrombin and the sequence power of the cleavage site is SLeu, Val, Pro, Arg, Gly, Ser. (2-3) The method for producing a recombinant soluble CD14 fragment.
  • novel soluble CD14 antigen of the present invention is useful as a diagnostic marker for sepsis patients. Further, the soluble CD14 antigen can be a standard substance or a competitor used for measuring the soluble CD14 antigen.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the present invention since the recombinant soluble CD14 fragment of the present invention has immunologically similar properties to the soluble CD14 antigen, it can be used as a standard substance or a competitor for measuring the soluble CD14 antigen, It can be used for screening for antibodies that can be used for the measurement.
  • the immunologically similar properties to the soluble CD14 antigen means that the binding property to the known CD14 antibody and the binding property to the antibody binding to the soluble CD14 antigen are the recombinant soluble properties of the present invention.
  • the CD14 fragment shows that the soluble CD14 antigen is almost identical to the recombinant soluble CD14 fragment of the present invention.
  • kit and method for measuring the soluble CD14 antigen of the present invention include the soluble CD1 antigen.
  • the antigen can be qualitatively or quantitatively determined with high sensitivity, easily and specifically, and is useful for diagnosis of sepsis patients.
  • the screening method of the present invention is useful for searching for an antibody to be used for measuring the novel soluble CD14 antigen.
  • the method for producing a recombinant soluble CD14 fragment of the present invention is a method for producing a recombinant soluble soluble CD14 fragment which has not been able to be expressed in prokaryotic cells or eukaryotic cells, particularly yeast cells. Enable production.
  • FIG. 1 is a view showing the result of the result that only the S68 peptide inhibits the binding between the S68 peptide polyclonal antibody and the soluble CD14 antigen of the present invention.
  • A shows the state of no binding in the serum of a normal human
  • B shows the inhibition of binding of the S68 peptide in the serum of a sepsis patient.
  • FIG. 2 is a diagram showing a standard curve of the EIA kit of Example 7- (1) using sCD14 (1-307) S286C protein.
  • FIG. 3 is a diagram showing that soluble CD14 antigen derived from normal human serum has no effect on the measured value of the EIA kit of Example 7- (1) using sCD14 (1-307) S286C protein. .
  • FIG. 4 shows the results obtained by analyzing the soluble CD14 antigen and the high molecular weight CD14 protein detected in the blood of a sepsis patient by gel filtration chromatography using the EIA kit of Example 7- (1), respectively.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of analysis using the EIA kit and the commercial CD14-EIA kit (IBL-Hamburg).
  • FIG. 5 shows that soluble CD14 antigen and high molecular weight CD14 protein detected by the EIA kit of Example 7- (1) in the serum of a sepsis patient by gel filtration chromatography were measured in Example 7- (1).
  • FIG. 8 shows the results of analysis using an EIA kit and a commercial CD14-EIA kit (IBL-Hamburg). The upper black arrow indicates the position of the marker used for calibration. Left power and others are BSA, ovalbumin, chymotrypsinogen A, and ribonuclease A.
  • Figure 6 shows the fraction obtained by passing the serum from a sepsis patient through an S68-Sepharose TM 4FF antibody column using F1024-1-3-3-Sepharos TM 4B as a pre-column, followed by gel filtration chromatography.
  • the soluble CD14 antigen and the high molecular weight CD14 protein detected by the EIA kit of Example 7- (1) were respectively combined with the EIA kit of Example 7- (1) and the commercially available CD14-EIA kit (IBL-
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of analysis by Hamburg. The upper black arrow is the same as in FIG. [FIG. 7]
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of subjecting gel fractionation chromatography fractions 10-16 shown in FIG. 6 to individual freeze-drying and western blotting.
  • Figure 8 shows that the fraction obtained after passing normal human serum through an S68-Sepharose TM 4FF antibody column using F1024-1-3-3-Sepharos TM 4B as a precolumn was fractionated by gel filtration chromatography.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of fractions 10-16 individually subjected to lyophilization and subjected to western blotting.
  • FIG. 9 is a view showing an image of purified rsCD14-ST (2ST64) and (PSP64) stained by silver staining after swimming by SDS-PAGE.
  • FIG. 10 is a view showing a western blotting image of sCD14-ST and PSP64 stained with an S68 antibody.
  • FIG. 11 is a view showing a standard curve of an EIA kit of Example 16 using rsCD14-ST (2ST64).
  • FIG. 12 is a graph comparing the antibody titer of anti-sera of rabbits to which rsCD14-ST (PSP64) had been administered, compared to that of normal serum of normal rabbits.
  • FIG. 13 is a diagram showing a standard curve of an EIA measurement system of Example 19 using rsCD14-ST (2ST64).
  • the major soluble CD14 proteins present in human blood include the approximately 55 kDa and approximately 49 kDa soluble CD14 proteins described in Landmann et al., Described in the Prior Art section. These are human full-length soluble CD14 proteins and proteins that have a C-terminal length of 41 amino acids or less and are not deleted from human full-length soluble CD14 protein (hereinafter ⁇ human '' is abbreviated and described as high molecular weight CD14). Sometimes). In WO01Z22085, it has been confirmed that these high molecular weight CD14 specifically binds to the F1025-3-1 antibody.
  • the present inventors differed from the high molecular weight CD14 described above and the CD14 having a molecular weight of 36 kDa described in WO01Z22085, and are present in the blood of septic patients more frequently than in normal persons. New soluble CD14 protein was found.
  • soluble CD14 protein refers to a protein present in human plasma (or human serum), and can also be referred to as “soluble CD14 protein”. You. In particular, when used in the meaning of "membrane-bound CD14 protein" which is bound to cell membranes and does not exist in human plasma, it is described as “soluble CD14 protein”!
  • the "antibody prepared using a peptide or fragment or the like as an antigen” or the “antibody prepared using a peptide or fragment or the like as an antigen” described in the present invention refers to a peptide or fragment used as an "antigen" These antibodies are produced or produced by immunizing various animals.
  • the antibody comprises a peptide or fragment that serves as an "antigen” or a part of the epitope.
  • the antibody specifically binds to a peptide or fragment that serves as an “antigen”.
  • the "antibody produced as an antigen” or the “antibody produced as an antigen” may be added with a carrier or carrier protein to make the peptide to be an "antigen” immunogenic, or may have other amino acid residues. Even an antibody prepared as an immunogen using a peptide to which a group has been added is included in “an antibody prepared as an antigen” or “antibody prepared as an antigen” if it exhibits the above properties.
  • the "specifically binding antibody” is an antibody that immunologically binds to a specifically binding target or an antibody that shows a normal antigen-antibody reaction with a specifically binding target.
  • an antigen-antibody reaction can be confirmed by an agglutination method, a sandwich method, a solid-phase direct method or a solid-phase binding method, a competition method, or the like.
  • the dissociation constant (KD) is usually less than 10 -7 M. If no dissociation constant measurement can be obtained in the binding test, state that there is substantially no binding.
  • non-specific binding cannot be confirmed when the binding ability is 10 times or less, preferably 100 times or less, more preferably 1,000 times or less as compared with the case of "specifically bind". , In which case they are not substantially combined.
  • Does not bind to LPS means that the recombinant soluble CD14 fragment has no or little binding ability to LPS.
  • In vivo full-length CD14 or human full-length soluble CD14 protein described in SEQ ID NO: 3 has an ability to bind to LPS in vivo or in serum. And the complex activates the cells.
  • the recombinant soluble CD14 fragment that does not bind to LPS has at most 1Z100 or less than the ability to bind LPS to full-length in vivo CD14 or human full-length soluble CD14 protein described in SEQ ID NO: 3. It is.
  • a first embodiment of the present invention is a soluble CD14 antigen having the following properties 1) to 3).
  • the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention has the above property 1). That is, a band derived from the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention is detected at a position having a molecular weight of 13 ⁇ 2 kDa by SDS-PAGE under non-reducing conditions.
  • the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention has the above property 2).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is identical to the N-terminal amino acid sequence of human CD14 of SEQ ID NO: 3. This confirms that the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention is a kind of human CD14.
  • the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention has the above property 3).
  • the peptide having the amino acid residue power described in SEQ ID NO: 2 described in the above feature 3) corresponds to 16 amino acid residues from position 53 to position 68 of human CD14 described in SEQ ID NO: 3.
  • other human proteins including the sequence of SEQ ID NO: 2 are not known except human CD14, and it can be said that this sequence is a sequence specifically contained in human CD14. This also confirms that the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention is a kind of human CD14.
  • the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention is further characterized by the following property 4).
  • Soluble CD14 antigen (1-1) obtainable from human plasma.
  • the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention which is characterized by the above property 4), is a protein present in human plasma.
  • the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention can be obtained with high purity.
  • the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention has a high concentration in sepsis patients. This can be a marker for sepsis diagnosis or detection method.
  • the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention can be a standard substance or a competitive substance used in a kit for measuring the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention, which is useful for diagnosis or detection of sepsis. .
  • the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention can be purified from human plasma or human serum by a combination of human CD14-related antibody affinity column chromatography, gel filtration chromatography, and SDS-PAGE. .
  • the kit for measuring the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention of the fifth embodiment of the present invention described below the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention of the elution fraction of the column chromatography can be obtained. Detection can be performed efficiently.
  • the human CD14-related antibody is an anti-human CD14 antibody or an antibody against a peptide derived from the amino acid sequence of human CD14.
  • the antibody can be separated from high-molecular-weight CD14 by using affinity chromatography of the F1025-3-1 antibody or the F1024-1-3 antibody as an anti-human CD14 antibody.
  • the high molecular weight CD14 is adsorbed on the antibody, and the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention is fractionated in the first stream.
  • the protein can be separated from other proteins in serum by using affinity chromatography of an antibody that specifically binds to the peptide having the amino acid residue described in SEQ ID NO: 2.
  • the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention is adsorbed to the antibody and eluted by acidifying the solvent.
  • the F1025-3-1 antibody and the hybridoma producing the F1024-1-3 antibody are respectively designated as Accession No.FERM BP-7296 and Accession No.FERM BP-7511 as described in WO01Z22085 and WO01Z72993. It is deposited internationally at the Patent Organism Depositary Center (IPOD), the 6th Independent Administrative Agency of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba East, Ibaraki, Japan.
  • the soluble CD14 antigen in serum can be separated from other proteins by affinity chromatography of an anti-human CD14 polyclonal antibody. Thereafter, the anti-human CD14 monoclonal antibody can be separated from high molecular weight CD14 by affinity chromatography.
  • the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention can be further purified by gel filtration chromatography of human serum or the fraction partially purified by the above-mentioned affinity chromatography.
  • the fraction in which the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention is detected may be collected using the measurement kit of the fifth embodiment of the present invention.
  • a fraction having a molecular weight of 35 ⁇ 10 kDa may be collected by using a molecular weight marker.
  • the fraction can be further purified by performing non-reducing SDS-PAGE of the fraction partially purified as described above and collecting the position of 13 ⁇ 2 kDa.
  • the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention has been purified with high purity as a main protein.
  • the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention is eluted at an ionic strength of around 0.3 M by anion exchange column chromatography at pH 8.5.
  • a second embodiment of the present invention is a recombinant soluble CD14 fragment having the following properties 1) to 3).
  • Examples of the recombinant soluble CD14 fragment according to the second embodiment of the present invention include a recombinant soluble CD14 fragment having the following sequences 5) to 7).
  • the N-terminus is at position 1 to position 17 of SEQ ID NO: 3.
  • Also preferred in 7) is a recombinant soluble CD14 fragment having a C-terminus at any of positions 59 to 80 of SEQ ID NO: 3, a group having a C-terminus at any of positions 64 to 75 of SEQ ID NO: 3.
  • Recombinant soluble CD14 fragment is more preferred
  • Recombinant soluble CD14 fragment having a C-terminus at position 64 of SEQ ID NO: 3 is more preferred.
  • the N-terminal is position 1 of SEQ ID NO: 3
  • the C-terminal is SEQ ID NO:
  • the recombinant soluble CD14 fragment of any one of (2-3) to (2-5) at position 64 of 3 is preferred.
  • a recombinant soluble CD14 fragment which is a fragment having a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in 5) is preferable.
  • a method for producing the recombinant soluble fragment of the second aspect of the present invention by genetic engineering is described below, but is not particularly limited, and a conventional method can be used.
  • the triplet (codon) of the gene encoding the amino acid sequence of the fragment of the present invention is known.
  • the DNA base sequence is not limited to one type. Therefore, any gene may be used as long as it is a gene containing the nucleotide sequence encoding the fragment of the present invention.
  • the gene is preferably a cDNA, which may be a cDNA, a chromosomal DNA and a combination thereof and a cDNA containing an intron which can be appropriately spliced, because of easy handling by genetic engineering.
  • the gene may be one obtained by the V ⁇ method. For example, regardless of whether it is a chemically synthesized DNA or a suitable DNA library, PCR (Polymera) is performed using DNA containing the DNA of the gene encoding the entire length or part of CD 14 se Chain Reaction) method. Alternatively, the gene or fragment thereof obtained by these methods can be produced by annealing and ligation as necessary. Wear.
  • the DNA of the gene can be chemically synthesized as follows. Specifically, the DNA of the gene is divided into fragments having a power of about 20 to 30 bases, and the fragments are synthesized as a plurality of fragments using a DNA chemical synthesizer (for example, Model 394, manufactured by Applied Biosystems). Then, if necessary, the 5 'end of each fragment is phosphorylated to anneal each fragment, and ligated to obtain the target DNA.
  • a DNA chemical synthesizer for example, Model 394, manufactured by Applied Biosystems.
  • the gene can also be obtained by a PCR method using a genomic library or a cDNA library, etc., as type III.
  • a PCR method a known nucleotide sequence and a gene encoding a fragment into which a fragment or a cleavage site of a protease of the present invention is inserted or substituted (hereinafter, sometimes referred to as a fragment of the present invention) may be used.
  • a sense primer and an antisense primer designed based on the base sequence of DNA or the like and, if necessary, a restriction enzyme recognition sequence or the like are prepared, and a known method (Michael AL Equivalent, Polymerase Chain Reaction, P and R Protocols, a guide to methods and applications ⁇ 1990, see Academic Press).
  • the DNA library described above is not particularly limited as long as it contains the DNA of the gene or a part thereof. Therefore, appropriate cells such as lymphocytes, human cell lines, or hybridomas, which have been obtained by using a commercially available DNA library, can be used as appropriate activators.
  • the cDNA may be prepared and used according to the method of Sambrook J. et al.
  • nucleotide sequence of the DNA of the gene is not limited to one type. Therefore, as long as it is a gene containing a base sequence encoding the fragment or the like of the present invention, V may have a certain base sequence strength.
  • the recombinant vector may be in any form, such as circular or linear, single-stranded or double-stranded, or a complex thereof, and may be appropriately selected depending on the intended purpose. From the viewpoint of ease of handling and ease of incorporation into a host, circular is preferred, and stability is preferred, and double-stranded is preferred.
  • the "recombinant soluble CD14 fragment” is a soluble fragment produced by genetic recombination having a partial amino acid sequence of the human full-length CD14 protein shown in SEQ ID NO: 3.
  • the recombinant soluble CD14 fragment according to the second embodiment of the present invention has the above property 1). That is, a band derived from the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention is detected at a position of a molecular weight of 13 ⁇ 2 kDa by SDS-PAGE under non-reducing conditions.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has the property of the above 2). That is, it does not specifically bind to 3C10 and MEM-18.
  • recombinant soluble CD14 fragment does not immunologically bind to both 3C10 and MEM-18 antibodies, or Does not show an antigen-antibody reaction.
  • the "recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention” which does not specifically bind to 3C10 and MEM-18 is the in vivo full-length recombinant CD14 or human full-length recombinant soluble fragment described in SEQ ID NO: 3.
  • the binding ability to each of 3C10 and MEM-18 is less than 1Z100. Preferably it is 1Z1,000 or less.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has the property of the above 3). In particular, it specifically binds to polyclonal antibodies.
  • the peptide having the amino acid residue power described in SEQ ID NO: 2 described in the above feature 3) also corresponds to the 16 amino acid residues up to position 68 in the position 53 of human CD14 described in SEQ ID NO: 3.
  • the polyclonal antibody recognizes a sequence having a length of 7 amino acids or more (see Example 4 described later)
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment is a human CD14 fragment of SEQ ID NO: 3. At least a sequence having a length of 7 or more amino acids at any of the positions 53 to 68 has at least one.
  • 3C10 and MEM-18 are very famous anti-CD14 antibodies, and the epitope on CD14 is recognized to be at positions 7-14 and 57-64, respectively. And conventional Recombinant soluble CD14 fragment derived from human CD14 is recognized as binding to 3C10 or MEM-18 as long as its sequence has the above-mentioned region of the epitope section!
  • the recombinant soluble CD14 fragment according to the second aspect of the present invention has the properties described in 1) to 3) above, whereby the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention and the physical properties And have immunologically similar properties.
  • the fact that the immunological properties are similar can be presumed that the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention has a similar tertiary structure of a sequence of amino acid residues that can serve as an epitope. Therefore, it is particularly useful as a standard substance when measuring the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention.
  • human CD14 has an amino acid at the N-terminal position 1 to 307 of human CD14 and serine at position 286 was substituted with cysteine.
  • the ability to use a recombinant polypeptide hereinafter referred to as rsCD14 (l-307) S286C
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has a similar It is convenient when converting a chemical reaction into a substance amount.
  • the reactivity of the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention is similar to that of the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention even when the state of the solvent changes.
  • the immunity of the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention with rsCD14 (1-307) S286C with the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention is also used.
  • the immunological reactivity is different, the immunological reactivity of the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention and the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention are identical. .
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention has immunologically similar properties to the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention.
  • the antibody can be used as a target of specific binding.
  • the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention is originally used as a target for specific binding, it is present only in a very small amount in the living body.
  • Type soluble CD14 fragments It is particularly useful as a product.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has various utilities, because it has the properties described in 1) to 3) above. That is, the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention having the above-mentioned properties 1) to 3) is not represented by the sequence, but has the physical properties and immunological properties t, Is represented by
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention has the property of not binding to 4) LPS described above.
  • WO96Z20956 does not disclose a specific peptide, but discloses a peptide having 8 to 60 amino acids including positions 57 to 64 of human CD14 and binding to LPS.
  • the peptide and the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention are not identical, the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has the above-mentioned property 4). It can be clearly understood that having
  • the recombinant soluble CD14 fragment according to the second embodiment of the present invention is exemplified by a recombinant soluble CD14 fragment having the following sequences 5) to 7).
  • N-terminus is at position 1 to position 17 of SEQ ID NO: 3.
  • a recombinant soluble CD14 fragment having an N-terminus at any one of positions 1 to 6 of SEQ ID NO: 3 in 6) is preferable, and a recombinant soluble CD14 fragment having an N-terminus at position 1 of SEQ ID NO: 3
  • the CD14 fragment is more preferred.
  • the C-terminus is preferred to be a recombinant soluble CD14 fragment having a C-terminus at positions 59 to 80 of SEQ ID NO: 3, Recombinant soluble CD14 fragment at any of positions 64 to 75 is more preferred. Recombinant soluble CD14 fragment having a C-terminus at position 64 of SEQ ID NO: 3 is more preferred.
  • the N-terminal is position 1 of SEQ ID NO: 3
  • the C-terminal is SEQ ID NO:
  • the recombinant soluble CD14 fragment of any one of (2-3) to (2-5) at position 64 of 3 is preferred.
  • a recombinant soluble CD14 fragment which is a fragment having a partial sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is preferable.
  • the method for producing the fragment of the present invention by genetic engineering is described below, but is not particularly limited, and a conventional method can be used.
  • the amino acid sequence of the fragment of the present invention is encoded.
  • the nucleotide sequence of the DNA of the gene is not limited to one. Therefore, any gene may be used as long as it is a gene containing the nucleotide sequence encoding the fragment of the present invention.
  • the gene is preferably a cDNA, which may be a cDNA, a chromosomal DNA and a combination thereof and a cDNA containing an intron which can be appropriately spliced, because of easy handling by genetic engineering.
  • the gene may be one obtained by the method described in V ⁇ .
  • the DNA containing the DNA of the gene encoding the entire length or a part of CD14 is used as a type III PCR (Polymerase) It may be obtained by the Chain Reaction) method.
  • the gene or a fragment thereof obtained by these methods can be produced by annealing and ligation as necessary.
  • the DNA of the gene can be chemically synthesized as follows. Specifically, the DNA of the gene is divided into fragments having a power of about 20 to 30 bases, and the fragments are synthesized as a plurality of fragments using a DNA chemical synthesizer (for example, Model 394, manufactured by Applied Biosystems). Then, if necessary, the 5 'end of each fragment is phosphorylated to anneal each fragment, and ligated to obtain the target DNA.
  • a DNA chemical synthesizer for example, Model 394, manufactured by Applied Biosystems.
  • the gene can also be obtained by a PCR method using a genomic library or a cDNA library, etc., as type III.
  • a PCR method a known nucleotide sequence and a gene encoding a fragment into which a fragment or a cleavage site of a protease of the present invention is inserted or substituted (hereinafter, sometimes referred to as a fragment of the present invention) may be used.
  • Sense primers and antisense primers were designed based on the nucleotide sequence of, and if necessary, in combination with restriction enzyme recognition sequences, etc. , Polymerase Chain Reaction, P and R Protocols, a guide to methods and applications ⁇ 1990, Academic
  • the DNA library described above is not particularly limited as long as it contains the DNA of the gene or a part thereof. Therefore, appropriate cells such as lymphocytes, human cell lines, or hybridomas, which have been obtained by using a commercially available DNA library, can be used as appropriate activators.
  • the cDNA may be prepared and used according to the method of Sambrook J. et al. In general, it is known that there are up to six types of triplets (codons) in the DNA of a gene encoding an amino acid, depending on the type of the amino acid.
  • the nucleotide sequence of the DNA of the gene is not limited to one type. Therefore, as long as it is a gene containing a base sequence encoding the fragment or the like of the present invention, V may have a certain base sequence strength.
  • the recombinant vector may be in any form, such as circular or linear, single- or double-stranded, or a complex thereof, and may be appropriately selected depending on the intended purpose. From the viewpoint of ease of handling and ease of incorporation into a host, circular is preferred, and stability is preferred, and double-stranded is preferred.
  • the signal sequence to be connected can be selected as appropriate.
  • a preferred example of the recombinant vector is one which transforms a eukaryotic cell such as an animal cell or yeast so as to express the fragment of the present invention from the viewpoint of a host. Therefore, the recombinant vector contains at least a translation initiation codon, a termination codon, a selection marker, a poly-A additional sequence in addition to one gene, and a promoter of SV40 that functions in animal cells.
  • Preferred examples of the recombinant vector include an EF1 ⁇ promoter, an SRa promoter, an AOX1 promoter that functions in yeast, and an SV40 replication origin.
  • the recombinant vector can be obtained by ligating the DNA of the gene with another DNA fragment having an arbitrary nucleotide sequence, or by introducing the DNA into an arbitrary vector (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual). 2nd ed., Cold spring Harbor Laboratory, New York, 1989).
  • a transformant can be obtained by introducing the recombinant vector into a host cell or microorganism.
  • the transformant is preferably a transformant that expresses the fragment or the like of the present invention, and particularly preferably expresses the fragment or the like of the present invention and is secreted into the culture supernatant. . This is because the use of such a transformant makes it easy to produce the fragment or the like of the present invention in large quantities.
  • the transformant is cultured, and gene amplification and expression induction are performed as necessary. Next, the culture mixture is recovered, and if necessary, operations such as concentration, solubilization, dialysis, and various types of chromatography are appropriately combined to purify the fragment or the like of the present invention.
  • the "culture mixture” refers to a transformant, a medium containing the transformant, or a culture supernatant or a lysate of cells.
  • the transformant used in the production method is not limited as long as the transformant expresses the fragment or the like of the present invention.
  • COS cells and mammalian cells such as CHO cells or yeast, or E. coli. It is preferably a transformant using a cell selected from any of the above as a host.
  • the cells are pre-cultured in L-broth and then inoculated to a 1Z50 amount in M9-CA medium. Incubate at 37 ° C. A few hours after the start of the culture, when the OD550 value of the medium reaches 1 to 4 (that is, in the logarithmic growth phase), 3 ⁇ indoleacrylic acid is added to a final concentration of 10%. It is added to give ⁇ gZml to induce expression. By further culturing for about 1 to 2 days, a culture mixture containing the target protein can be obtained.
  • the cells are pre-cultured in a BMGY medium for about 2 days, and after the medium is replaced, methanol is added to induce expression. . Furthermore, culturing is performed at 30 ° C for about 1 to 2 days to obtain a culture mixture containing the target protein.
  • a transformant obtained by transforming a mammalian cell such as a CHO cell with a recombinant vector having an EF1a promoter is cultured in a DMEM medium containing 10% fetal calf serum.
  • Cells are inoculated at a concentration of about 1 to 10 ⁇ 10 4 cells Zml, and cultured at 37 ° C., 5% carbon dioxide, and 95% air.
  • the cells become confluent after 2-3 days, at which time the medium is replaced with serum-free D-MEM.
  • a culture mixture containing the target protein can be obtained.
  • the production amount of the target protein is small, it is possible to increase the production amount by amplifying the gene with methotrexate as described above.
  • the above-mentioned culture mixture power is also appropriately selected from methods such as those generally used for purifying fragments, proteins or polypeptides.
  • various affinity chromatography methods such as salting out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography and antibody chromatography, etc.
  • An appropriate method may be appropriately selected from commonly used methods such as chromatofocusing, adsorption chromatography, and reversed-phase chromatography, and may be combined. If necessary, purification may be performed using an HPLC system or the like.
  • the fragment or the like of the present invention may be expressed as a fusion protein with ⁇ -galactosidase of Escherichia coli or another polypeptide.
  • any of the purification steps may be used.
  • an operation of treating the fusion protein with a chemical substance such as bromocyan or hydroxylamine or an enzyme such as protease to cut out the protein is required.
  • the transformant used is Escherichia coli, the fragment or the like of the present invention is not used.
  • the protein is produced as an inclusion body, which is a fusion protein, during the purification, the steps of solubilizing, denaching, and refolding the inclusion body may be performed at an appropriate step of the purification (Thomas E). J. Molecular Biology, 87, 563-577, 1974).
  • a solubilization buffer containing an appropriate amount of urea or guanidine hydrochloride, a surfactant, reduced daltathione, and oxidized daltathione for example, 5 M guadin hydrochloride, 0.005% Tween 80, 50 mM Tris hydrochloride (pH 8. Buffer solution containing 0), 5 mM EDTA, 2 mM reduced glutathione, and 0.02 mM oxidized glutathione
  • 2-mercaptoethanol add 2-mercaptoethanol to the pellet, and degenerate.
  • the solution is removed, dialyzed and refolded.
  • unnecessary protein portions are cleaved with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as protease, and then appropriate chromatography is performed.
  • the fragment of the present invention can also be chemically synthesized by a general method, and a fragment prepared by chemical synthesis is also included in the fragment of the present invention.
  • a fragment prepared by chemical synthesis is also included in the fragment of the present invention.
  • it can be prepared by a commercially available peptide synthesizer.
  • the book can also be prepared by synthesizing a fragment of a packed fragment with a peptide synthesizer and binding the fragments in a ligatory manner.
  • a third embodiment of the present invention is a recombinant soluble CD14 fragment having the following properties 1) to 3) obtained by the following steps 1> to 3>.
  • the inventors assumed the mechanism by which the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention exists in blood as described below, and used the same method as that for the assumed production process to produce the present invention. An attempt was made to produce the recombinant soluble CD14 fragment of the third aspect. However, the present invention is not restricted or limited by the assumed production process.
  • the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention specifically increases in blood during sepsis. That is, it is found that the concentration increases due to an in-vivo phenomenon which can occur immediately after the initial stage of sepsis, particularly immediately after the living body comes into contact with endotoxin and the like.
  • neutrophil activation an in vivo phenomenon that can occur immediately after a living body comes into contact with endotoxin and the like is neutrophil activation, and activated neutrophils may be proteases such as neutrophil elastase. Ze releases.
  • high-molecular-weight CD14 such as soluble full-length CD14 and membrane-type CD14 (hereinafter sometimes referred to as full-length CD14) in the living body is decomposed by the elastase or the like, and the first embodiment of the present invention is described. It can be assumed that the soluble CD14 antigen is increased.
  • the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention which is produced by the degradation of full-length CD14 by a protease such as elastase, is stable at least to the extent that it can be detected in vivo (in serum). Be there! /
  • the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention thus produced can be immunologically measured by distinguishing the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention from full-length CD14. Is already different from the full-length CD14 in the three-dimensional structure.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the third aspect of the present invention is a recombinant soluble CD14 fragment of the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention. Fragment that is sterically similar to the soluble CD14 antigen of For a fragment having a similar epidemiological specificity, a production method of cleaving the C-terminus with a protease from a relatively large CD14 fragment was attempted, and the recombinant soluble CD14 fragment of the third embodiment of the present invention was produced. Successful separation and purification.
  • step 1) a step of preparing a recombinant soluble CD14 fragment having the sequence of the following 8) to: L 1),
  • N-terminus is !! of 1 to 17 of SEQ ID NO: 3
  • the C-terminus is any of positions 134 to 356 of SEQ ID NO: 3, and
  • Examples of the predetermined protease in step 11) of ⁇ 1> include ProScission Protease, Thrombin, Factor Xa, and the like. Then, when the predetermined protease is ProScission Protease, the sequence of the cleavage site is Leu, Glu, Val, Leu, Phe, Gin, Gly, Pro, and the eight amino acid residues are replaced with 59 of SEQ ID NO: 3. Substitution or insertion after any of the positions 70 to 70 is exemplified.
  • the sequence of the cleavage site is Leu, Val, Pro, Arg, Gly, Ser, and the 6-amino acid residue is substituted with the amino acid residues 59 to 70 of SEQ ID NO: 3. Substitution or insertion after any of the positions is exemplified. Furthermore, when the predetermined protease is Factor Xa, the sequence of the cleavage site is lie, Glu, Gly, and Arg, and the four amino acid residues are located at any of positions 59 to 70 of SEQ ID NO: 3. Substitution or insertion is exemplified.
  • step ⁇ 1> a recombinant soluble CD14 fragment produced by preparing a fragment having an N-terminus at any of positions 1 to 6 of SEQ ID NO: 3 in 9) and producing the fragment is preferred. . Furthermore, a recombinant soluble CD14 fragment produced by producing a fragment having an N-terminus at position 1 of SEQ ID NO: 3 is more preferable.
  • step 1) a fragment which is substituted or inserted after any of positions 59 to 68 of SEQ ID NO: 3 in 11) was prepared. The recombinant soluble CD14 fragment produced is preferred.
  • sequence power of the cleavage site of the predetermined protease was replaced or inserted after position 64 of SEQ ID NO: 3 to create a fragment, and the produced recombinant soluble CD14 fragment was produced. preferable.
  • a fragment in which the N-terminus is any of positions 1 to 6 of SEQ ID NO: 3 and the sequence of the cleavage site of a given protease is substituted or inserted after position 64 of SEQ ID NO: 3 Even more preferred is the recombinant soluble CD14 fragment created and produced.
  • a recombinant soluble CD14 fragment can be prepared as described in the section of the second embodiment of the present invention.
  • Step 2) of the step of cutting the fragment into which the cleavage site of the predetermined protease has been inserted or substituted with the predetermined protease is performed by the usual reaction using the optimum conditions of the predetermined protease.
  • the predetermined protease is ProScission Protease
  • the predetermined protease is Thrombin
  • the mixture is allowed to stand at 22 ° C. so that the enzyme: substrate ratio is 0.001 to 10: 1 (U: g), and the cutting reaction with thrombin is performed.
  • the predetermined protease is Factor Xa
  • the enzyme may be added so that the enzyme: substrate ratio is 0.0008 to 8: 1 (U: g), and the cleavage reaction may be performed.
  • the step of recovering the N-terminal fragment of the cleaved fragment in 3> may be performed in the same manner as the above-described method of purifying the fragment or the like of the present invention.
  • the fragments and the like of the present invention can be industrially mass-produced uniformly and with high efficiency.
  • the specific sequence of the recombinant soluble CD14 fragment of the third embodiment of the present invention can be understood by the steps described above. Preferred fragments have the same sequence as the fragments described in the second aspect of the present invention.
  • the recombinant soluble CD14 fragment according to the third embodiment of the present invention may have a part of the sequence of the cleavage site of a predetermined protease, added to the C-terminal thereof.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the third embodiment of the present invention is particularly preferable because, as a preferable reason, it does not detect high molecular CD14 in blood and detects only the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention.
  • the "recombinant soluble CD14 fragment” is a soluble fragment produced by genetic recombination having a partial amino acid sequence of the human full-length CD14 protein shown in SEQ ID NO: 3.
  • the recombinant soluble CD14 fragment according to the second embodiment of the present invention has the above property 1). That is, a band derived from the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention is detected at a position of a molecular weight of 13 ⁇ 2 kDa by SDS-PAGE under non-reducing conditions.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has the property of the above 2). That is, it does not specifically bind to 3C10 and MEM-18.
  • “Does not specifically bind to 3C10 and MEM-18” means that the recombinant soluble CD14 fragment does not immunologically bind to both 3C10 and MEM-18 antibodies, or Does not show an antigen-antibody reaction.
  • the "recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention” which does not specifically bind to 3C10 and MEM-18 is the in vivo full-length recombinant CD14 or human full-length recombinant soluble fragment described in SEQ ID NO: 3.
  • the binding ability to each of 3C10 and MEM-18 is less than 1Z100. Preferably it is 1Z1,000 or less.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has the property of the above 3). In particular, it specifically binds to polyclonal antibodies.
  • the peptide having the amino acid residue power described in SEQ ID NO: 2 described in the above feature 3) also corresponds to the 16 amino acid residues up to position 68 in the position 53 of human CD14 described in SEQ ID NO: 3.
  • the polyclonal antibody recognizes a sequence having a length of 7 amino acids or more (see Example 4 described later)
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment is a human CD14 fragment of SEQ ID NO: 3. At least a sequence having a length of 7 or more amino acids at any of the positions 53 to 68 has at least one.
  • 3C10 and MEM-18 are very famous anti-CD14 antibodies, and the epitope on CD14 is recognized to be at positions 7-14 and 57-64, respectively.
  • the conventional recombinant soluble CD14 fragment derived from human CD14 has been recognized to bind to 3C10 or MEM-18 as long as its sequence has the above-mentioned epitope region!
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the embodiment has the properties described in 1) to 3) above, whereby the physical properties and immunological properties of the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention are similar. Having.
  • the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention has a similar tertiary structure of a sequence of amino acid residues that can serve as an epitope. Therefore, it is particularly useful as a standard substance when measuring the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention.
  • human CD14 has an amino acid at the N-terminal position 1 to 307 of human CD14 and serine at position 286 was substituted with cysteine.
  • the ability to use a recombinant polypeptide (hereinafter referred to as rsCD14 (l-307) S286C)
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has a similar It is convenient when converting a chemical reaction into a substance amount.
  • the reactivity of the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention is similar to that of the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention even when the state of the solvent changes.
  • the immunity of the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention with rsCD14 (1-307) S286C with the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention is also used.
  • the immunological reactivity of the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention and the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention are the same.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention has immunologically similar properties to the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention.
  • the antibody can be used as a target of specific binding.
  • the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention is originally used as a target for specific binding, it is present only in a very small amount in the living body. Type soluble CD14 fragments are particularly useful as a substitute.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has various utilities, because it has the properties described in 1) to 3) above. That is, the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention having the above-mentioned properties 1) to 3) is not represented by the sequence, but has the physical properties and immunological properties t, Is represented by
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention has the property of not binding to the above-mentioned 4) LPS.
  • WO96Z20956 does not disclose a specific peptide, but discloses a peptide having 8 to 60 amino acids including positions 57 to 64 of human CD14 and binding to LPS.
  • the peptide and the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention are not identical, the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention has the above-mentioned property 4). It can be clearly understood that having
  • the step of cleaving the fragment into which the cleavage site of the predetermined protease has been inserted or substituted by the predetermined protease is performed by applying the optimum conditions of the predetermined protease to the usual reaction. Just do it.
  • the predetermined proteolytic enzyme is ProScission Protease
  • the enzyme: substrate substrate
  • the mixture may be allowed to stand at 22 ° C so that the ratio becomes 0.001 to 10: 1 (U: g), and the cutting reaction with thrombin may be performed.
  • the predetermined protease is Factor Xa
  • the enzyme may be added so that the enzyme: substrate ratio is 0.0008 to 8: 1 (U: g), and the cleavage reaction may be performed.
  • the step of recovering the N-terminal fragment of the cleaved fragment may be performed in the same manner as in the above-described method of purifying the fragment or the like of the present invention.
  • the fragment or the like of the present invention can be industrially mass-produced uniformly and with high efficiency.
  • the fragment of the present invention can also be chemically synthesized by a general method, and a fragment prepared by chemical synthesis is also included in the fragment of the present invention.
  • a fragment prepared by chemical synthesis is also included in the fragment of the present invention.
  • it can be prepared by a commercially available peptide synthesizer.
  • the book can also be prepared by synthesizing a fragment of a packed fragment with a peptide synthesizer and binding the fragments in a ligatory manner.
  • a fourth aspect of the present invention is a method for diagnosing or detecting sepsis, comprising measuring the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention.
  • the method includes the following steps 1) to 3).
  • the blood collected from the subject may be blood collected from the subject, that is, whole blood may be used, or the blood collected from the subject may be prepared into plasma or serum.
  • the step is a step of preparing the plasma or serum to measure the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention.
  • Measure the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention refers to measuring the amount of the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention. That is, the concentration may be measured. The measurement result should be obtained in the unit corresponding to the standard value to be compared in step 2).
  • step 1) measurement by a sandwich immunoassay is simple and easy. Is preferred.
  • the measurement can be performed by a measurement method according to a sixth aspect of the present invention described later.
  • it can be performed by using the measurement kit of the fifth aspect of the present invention.
  • step 1) is not limited by this measurement method.
  • a method in which the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention in blood, plasma or serum collected from a subject is separated by electrophoresis, and the concentration or width of the detected band is measured by densitometry. Is mentioned.
  • the antibody is used in the assay kit according to the fifth aspect of the present invention, and the band is detected using Western Blott. It is.
  • methods such as separation and detection by mass spectrum, HPLC, gas chromatography, TLC, etc. may be used.
  • the measurement results of a plurality of normal persons are obtained in advance, and the values of the normal persons or the range of the values of the normal persons, which are standardized by taking the average value or the range of the measurement results, are corrected.
  • This is a step of comparing with the value measured in step 1) as a standard value for ordinary people.
  • the standard value of a normal person may be determined using the average value of a normal person + 2SD or 3SD as a cutoff value.
  • a step of obtaining a reference value of the sepsis patient in advance and comparing the reference value with the value measured in the step 1) may be performed. This step may be performed instead of the step 2) of comparing with the standard value of normal subjects.
  • the step 3) is a step for evaluating whether the subject has sepsis (positive) or not (negative) based on the result of the comparison in step 2).
  • false positive evaluation or predictive diagnosis may be performed. For example, if the standard range for normal subjects is 0 to 0.1 gZmL and the value for sepsis patients is 0.2 gZmL or more and compared with the measured value, the subject value is 0 to 0.1 / z gZmL. If negative, 0.1-0.2 g ZmL, false positive; if 0.2 / z gZmL or more, evaluate as positive or more likely to develop sepsis within 24 hours, for example And so on.
  • the stability of the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention in a sample may be an important factor in some cases. For example, when freeze-thawing is repeated or left at room temperature for a long time, the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention in serum is degraded, and In some cases, high-molecular-weight CD14 in serum may be decomposed into the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention or a structure similar thereto, resulting in erroneous measurement results.
  • ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), heparin, and citric acid which are used for blood sampling of plasma, can be mentioned as a toner for adding blood when collecting blood.
  • Antithrombm III 1-antitrypsin ⁇ aprotmin, leupeptm, 2- macrogloblm, peps tatin, antipain, chymostatin, amastatin, tripsin inhibitor ⁇ phenylmethyls ulfonyl fluoride (PMSF), EGTA, E-64, benzamidine in serum ⁇
  • PMSF phenylmethyls ulfonyl fluoride
  • EGTA EGTA
  • E-64 benzamidine in serum ⁇
  • Decomposition of proteins can be suppressed by adding various protease inhibitors such as 4-fluoro- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl chloride (AEBSF).
  • lactoce sucrose
  • sucrose to improve the stability of Torehar o soluble in the first aspect of the present invention in the liquid in by addition of synthetic polymers of sugar and PEG such as se CD14 antigen and the high molecular weight CD14 You can also.
  • the fifth aspect of the present invention relates to a method of the present invention contained in a sample, comprising at least one antibody that specifically binds to the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention or a fragment of the antibody.
  • 1 is a kit for measuring a soluble CD14 antigen for measuring a soluble CD14 antigen according to one embodiment.
  • the kit of the present invention comprises at least one antibody that specifically binds to the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention or a fragment of the antibody, and the kit of the first embodiment of the present invention contained in the specimen. Measure soluble CD14 antigen. Further, in order to detect the objective soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention, the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention can be directly measured. Further, a kit that detects only the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention and does not detect the human high molecular weight soluble CD14 antigen and the 36 kDa soluble CD14 protein is preferable.
  • the measurement kit of the present invention does not detect human high molecular weight soluble CD14 protein and 36 kDa soluble CD14 protein when human serum is measured as a sample without any special treatment.
  • the special treatment is a treatment in which a protein is added to human serum or a protein in human serum is denatured.
  • the antibody fragment refers to the antibody fragment. Fab, Fab ', or F (ab') 2 of the antibody.
  • the measurement kit of the present invention comprises at least one antibody specifically binding to the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention or a fragment of the antibody, and comprises the first kit of the present invention contained in a sample.
  • the soluble CD14 antigen of the embodiment can be measured.
  • the antibody or the antibody fragment specifically binding to the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention includes any of the following a) to d), or a fragment of the antibody: This is a kit for measuring soluble CD14 antigen.
  • an antibody prepared using a peptide consisting of 16 amino acid residues of SEQ ID NO: 2 as an antigen d) a recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention or a set of the third embodiment of the present invention An antibody that specifically binds to a recombinant soluble CD14 fragment.
  • it is a measurement kit containing the antibody of the above a), c) or d) or a fragment of the antibody. More preferably, it is a measurement kit containing the antibody of d) or a fragment of the antibody. Particularly preferred is d) an antibody that binds to the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention or a measurement kit containing the antibody fragment.
  • the antibody of d that is, the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention or the recombinant soluble CD14 fragment of the third aspect of the present invention (hereinafter referred to as the second soluble type of the present invention)
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the embodiment or the recombinant soluble CD14 fragment of the third embodiment of the present invention may be collectively described as the recombinant soluble CD14 fragment of the present invention): a) An antibody that specifically binds to the peptide having the amino acid residue capability of SEQ ID NO: 2; b) any of 8 to 16 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 And c) an antibody prepared using a peptide having 16 amino acid residues as an antigen as described in SEQ ID NO: 2 as an antigen.
  • the antibody of d) may include a part of the antibodies of a) to c) described above. Further, the antibody of d) and the above a) In order to clearly distinguish them from the antibodies of (c) to (c), the antibodies of (a) to (c) above may be excluded from the antibody of (d).
  • the recombinant soluble CD14 fragment or the present invention of the second aspect of the present invention may be used as the antibody specifically binding to the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention or a fragment of the antibody.
  • An antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the third aspect of the invention as an antigen or a fragment of the antibody is preferable.
  • an antibody prepared using the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention as an antigen or a fragment of the antibody is also preferable.
  • An antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention as an antigen or a fragment of the antibody is more preferable.
  • a monoclonal antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention as an antigen or a fragment of the antibody is preferable. Particularly, it is substantially different from recombinant high molecular weight CD14 such as human high molecular weight CD14 or a soluble polypeptide having amino acids at positions 1 to 356 of the N-terminal of human CD14 (hereinafter referred to as rsCD14 (1-356)). Antibodies are preferred, and do not bind.
  • the principle of measurement is not particularly limited as long as the antibody or a fragment of the antibody is used to immunologically measure the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention.
  • the antibody of a that is, the ⁇ antibody that specifically binds to the amino acid residue described in SEQ ID NO: 2 '' or the ⁇ recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention ''
  • a sandwich immunoassay method hereinafter sometimes referred to as a sandwich immunoassay kit
  • a known technique can be used for the sandwich immunoassay.
  • Assay method see, for example, “Ultrasensitive Enzyme-Linked Immunoassay” by Eiji Ishikawa, Gakkai Shuppan Center (1993), “New Use Cases of Immunoassay and Diagnostic Reagents” Application to Development ”Immunoassay Development Study Group, Management Education Publishing, Enzyme Immunoassay (3rd edition), edited by Eiji Ishikawa et al., Medical School (1987).
  • the sandwich immunoassay system kit of the present invention includes an antibody that specifically binds to a peptide consisting of the amino acid residues set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid residue of SEQ ID NO: 2 The characteristics of the antibody that specifically binds to the strong peptide, the method of preparation, and the like are as described in the first embodiment of the present invention.
  • the antibody is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the sandwich immunoassay is a method in which an antibody-antigen-antibody complex is formed by using two or more types of antibodies which usually recognize different proteins at different sites.
  • an insoluble carrier to which the first antibody is bound is prepared, and is used as a solid phase or a reaction site.
  • the sandwich method can be either a two-step method (two-step method) or a one-step method (one-step method) in which an antigen and a labeled antibody are simultaneously added.
  • the ⁇ antibody which specifically binds to the peptide capable of amino acid residue described in SEQ ID NO: 2 '' or ⁇ the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention
  • a monoclonal antibody prepared as an antigen, a "soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention” -a "second binding substance that specifically binds to the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention” Measure by forming.
  • the configuration of the sandwich immunoassay kit of the present invention includes "an antibody that specifically binds to a peptide capable of amino acid residue described in SEQ ID NO: 2" or "a set of the second embodiment of the present invention.”
  • An insoluble carrier to which a ⁇ monoclonal antibody prepared using a recombinant soluble CD14 fragment as an antigen '' is bound, and a labeled second binding substance that binds to ⁇ the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention hereinafter simply referred to as , A second binding substance).
  • an insoluble carrier to which a second binding substance has been bound and a ⁇ labeled antibody that specifically binds to the peptide having 16 amino acid residues described in SEQ ID NO: 2 '' or ⁇ the second embodiment of the present invention
  • labeled monoclonal antibodies prepared using the recombinant soluble CD14 fragment as an antigen are examples of the second binding substance.
  • the antibody that specifically binds to the “soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and is not particularly limited, but specifically binds to the peptide having the amino acid residues described in SEQ ID NO: 2.
  • Monoclonal antibodies are preferred in terms of compatibility in sandwich immunoassays using antibodies that bind specifically. It may also be a fragment of the monoclonal antibody. An antibody fragment is Fab, Fab ', or F (ab') 2 of the monoclonal antibody.
  • An antibody that specifically binds to the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention may specifically bind to the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention.
  • Antibodies that specifically bind, and antibodies that specifically bind to high molecular weight CD14 are not particularly limited.
  • the second binding substance specifically binds to any region of amino acid residues 1 to 52 of human high molecular weight CD14, or an antibody fragment thereof, or human high molecular weight CD14.
  • an antibody that competes with or exhibits cross-reactivity with an antibody that specifically binds to any of the amino acid residues at positions 1 to 52, or a fragment of the antibody Particularly preferably, an antibody or a fragment of the antibody, wherein the second binding substance specifically binds to any of the amino acid residues at positions 17 to 26 of the "soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention" Or an antibody that competes with (cross-reacts with) an antibody that specifically binds to any of amino acid residues 17 to 26 of the ⁇ soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention, '' It is a fragment.
  • the production method is, for example, a mixture or recombinant of high molecular weight CD14, "the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention", high molecular weight CD14 and "the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention”.
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be prepared using CD14 as an antigen in the same manner as in the method described in the first embodiment of the present invention.
  • An example of a method for preparing a mixture of high molecular weight CD14 and the “soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” and a second antibody using recombinant CD14 as an antigen is shown in Example 3 described below.
  • an antibody that specifically binds to the peptide consisting of the amino acid residue set forth in SEQ ID NO: 2 and a candidate antibody for the second antibody are preliminarily prepared in the same manner as in Example 3 described later. It is preferable to select a second antibody by configuring a sandwich method system and confirming the measurement sensitivity.
  • Fab, Fab ', and F (ab') which are antibody fragments, can be obtained by a known method ("ultrasensitive enzyme immunoassay").
  • the sandwich immunoassay for binding an antibody to an insoluble carrier has been described in detail above, the sandwich immunoassay can be performed in a solution without using an insoluble carrier.
  • an antigen is reacted with a labeled antibody and a second labeled second binding substance in a liquid phase, and the interaction between the label and the second label is measured.
  • Antibody Antigen This is a method of measuring by competing a labeled antigen or a labeled antigen-like substance with an antigen in a sample in forming an antibody complex.
  • the "antibody which specifically binds to the peptide capable of amino acid residue described in SEQ ID NO: 2" or the "recombinant soluble CD of the second embodiment of the present invention” A “monoclonal antibody prepared using the 14 fragment as an antigen” "a soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” (or a similar substance thereof) "a second antibody that binds to the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” To form a complex of “binding substances”.
  • the configuration of the competition method of the sandwich immunoassay kit of the present invention includes “an antibody that specifically binds to a peptide capable of binding to amino acid residues described in SEQ ID NO: 2” or “the recombinant of the second aspect of the present invention.
  • An insoluble carrier bound with a monoclonal antibody prepared using a soluble CD14 fragment as an antigen, a second binding substance, and a labeled ⁇ soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention '' or a labeled ⁇ soluble CD14 antigen of the present invention.
  • a ⁇ antibody that specifically binds to the peptide having the amino acid residue represented by SEQ ID NO: 2 '' or ⁇ the set of the second embodiment of the present invention '' A monoclonal antibody prepared using a recombinant soluble CD14 fragment as an antigen, an insoluble carrier to which a second binding substance is bound, and a labeled “soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention”. Clause Includes labeled "Soluble CD14 antigen of the first aspect of the invention” analog.
  • the analogous substance of the "soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” includes, for example, the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention, the N-terminal position 1 to position 285 of human CD14.
  • examples thereof include a soluble polypeptide having an amino acid (hereinafter, referred to as rsCD14 (1-285)) and rsCD14 (1-307) S286C.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention is preferably exemplified.
  • a method for preparing r sCD14 (1-285) and rsCD14 (1-307) S286C is described in WO01 / 72993.
  • the measurement can be performed using the second specific binding.
  • Antibody antigen-antibody complex of second specific binding substance or antibody antigen-antibody second specific binding substance specific binding partner of second specific binding substance (hereinafter referred to as second specific binding partner) This is a method of forming a complex and measuring it.
  • the "antibody that specifically binds to the peptide having the amino acid residue described in SEQ ID NO: 2" or the "recombinant soluble CD of the second embodiment of the present invention” A "monoclonal antibody prepared using the 14 fragment as an antigen”"the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention”-"a second binding substance that binds to the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” Forming a complex of a specific binding substance, an "antibody that specifically binds to a peptide consisting of the amino acid residue set forth in SEQ ID NO: 2" or a "recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention” Monoclonal antibody prepared using as an antigen) "Soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention”"Second binding substance that binds to soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention” Second specific binding substance Or a
  • the partner of the second specific binding substance may be "a peptide having the amino acid residue represented by SEQ ID NO: 2".
  • a binding substance it further includes a labeled second specific binding substance.
  • the second specific binding substance include an antibody against the partner of the second specific binding substance.
  • the partner of the second specific binding substance is the second specific binding partner
  • the peptide having the amino acid residue represented by SEQ ID NO: 2 to which the second specific binding substance is bound An antibody that specifically binds to a monoclonal antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention bound to a second specific binding substance as an antigen, And a second binding agent that binds to the soluble CD14 antigen of the embodiment, and an insoluble carrier to which a second specific binding partner has been bound, or a peptide comprising the amino acid residue represented by SEQ ID NO: 2.
  • Second Specific Binding Substances of the combination of the second specific binding partner include an antigen and its antibody, a ligand and its receptor, a sugar chain-containing substance and lectin, a biotin and avidin or a streptavidin, and the like.
  • an antibody-antigen-antibody-anti-immunoglobulin antibody complex is formed using an antibody against an antibody, that is, an anti-immunoglobulin antibody.
  • the second specific binding substance using the anti-immunoglobulin antibody and the second specific binding to form the second specific binding partner, etc. An example is shown.
  • the amino acid described in SEQ ID NO: 2 "An antibody which specifically binds to a peptide having a residue” or "a monoclonal antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention as an antigen""A soluble CD14 of the first embodiment of the present invention”
  • An antigen ''- ⁇ a second binding substance that binds to the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention ''-forming an anti-immunoglobulin antibody complex;
  • a monoclonal antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention as an antigen) or a soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention "A second binding substance that binds to the soluble CD14 antigen according to the first embodiment of the present invention” -forming an anti-immunoglobulin antibody complex, or an anti-immunoglobulin antibody
  • CD14 antigen Second binding substance that binds to soluble CD14 antigen according to first embodiment of the present invention
  • Second specific binding substance Second specific binding partner Forming second specific binding partner, or anti-immunoglobulin antibody
  • Second specific binding substance Second specific binding partner Second specific binding substance Second specific binding partner It is measured such as by causing made.
  • an antibody that specifically binds to a peptide consisting of the amino acid residue set forth in SEQ ID NO: 2” or “the recombinant soluble CD14 of the second embodiment of the present invention” A complex comprising a monoclonal antibody prepared using a fragment as an antigen, a soluble CD14 antigen according to the first embodiment of the present invention, and a second binding substance that binds to the soluble CD14 antigen according to the first embodiment of the present invention.
  • a labeling substance or the like is produced using the second specific binding, it is included in the measurement method of the present invention.
  • any of the sandwich immunoassays as a kit of the sandwich immunoassay, "specifically binds to the amino acid residue capable peptide described in SEQ ID NO: 2" As long as it includes an “antibody” or "a monoclonal antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention as an antigen", it is included in the kit of the present invention. Similarly, as long as the antibody contains any one of the above a) to d), it is included in the kit of the present invention.
  • beads, latex particles, magnetic particles, plates, tubes, membranes or the like may be used as the insoluble carrier used in the sandwich immunoassay kit of the present invention.
  • the material of the beads, plates or tubes includes polystyrene, nylon, glass, silicone rubber, stainless steel, plastic and the like.
  • the membrane include cellulose, cellulose derivative, nitrocellulose, porous synthetic polymer, glass fiber, cloth, nonwoven fabric, and filter paper.
  • beads, latex particles, magnetic particles, or the like can be used as a spherical shape. This is advantageous in securing space during storage. Plates or tubes can be used as wells. This is advantageous in that it can be used with commercially available automated measuring instruments, plate readers, etc.
  • the membrane can be used for the immunochromatography method and the flow-through method described later.
  • Binding of an antibody, a second binding substance, a second specific binding substance or a partner thereof, or an anti-immunoglobulin antibody to an insoluble carrier, which specifically binds to the amino acid residue strong peptide of SEQ ID NO: 2, is performed by thermal adsorption. Method, a chemical bonding method, or the like.
  • a blocking treatment with a substance on the non-adsorption surface where the substance is not bound to the insoluble carrier without affecting the measurement system. It is the power that can increase the specificity or sensitivity of the measurement system.
  • the substance that does not affect the measurement system include proteins such as BSA and casein, and surfactants such as Tween20 and NP-40.
  • Labels used in the sandwich immunoassay system kit of the present invention include enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, oxidase and pericase, ataridimme or a derivative thereof, or aequorin or a modified product thereof.
  • Chemiluminescent substances, fluorescent substances such as FITC or lanthanoids such as pium (Eu) or samarium (Sm), or dyes, colloidal gold, colored latex, or isotopes may be used.
  • chromogenic substrates when peroxidase is used as the enzyme, 3,3 ', 5,5-tetrabenzidine or 1,2-phenylenediamine or the like alkaline phosphatase is used as the chromogenic substrate, and when 4-alkoxyphosphatase is used, 4-trophenyl is used as the chromogenic substrate.
  • Phosphate Isopotency-When using D-galatatosidase examples include 2-2 trophenyl.
  • Enzyme labeling of an antibody, a second binding substance, a second specific binding substance or a partner thereof, or an anti-immunoglobulin antibody that specifically binds to the peptide having the amino acid residue described in SEQ ID NO: 2 is a two-step method. It can be carried out by a talaldehyde method, a periodic acid method, a maleimide method, a pyridyl disulfide method, or the like.
  • Labeling other than the enzyme can also be performed using a known technique such as a heat adsorption method or a chemical bonding method.
  • a chromogenic substrate as exemplified above can be used to measure the enzyme label using an ordinary absorbance measurement system, and the sensitivity is preferably relatively high.
  • a fluorescent substance When a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, a colored label or an isotope is used as a label, it can be measured by a measuring device corresponding to the label.
  • a fluorescent substance such as Eu, for example, cryptate (Eu 3 + cryptate)
  • fluorescence resonance energy transfer can also be measured by using an araphycocyanine derivative such as XL665 as the second label.
  • Labels used in a simple measurement kit for example, a kit using an immunochromatography method or a flow-through method described below are preferable because a dye, colloidal gold or colored latex can be visually observed.
  • the sandwich immunoassay kit of the present invention is characterized in that it is measured by a sandwich immunoassay, and contains an antibody that specifically binds to the peptide having amino acid residues described in SEQ ID NO: 2.
  • sandwich immunoassay known techniques can be used as described above.
  • the amino acid residue described in SEQ ID NO: 2 can be used.
  • the sandwich immunoassay kit of the present invention as long as it contains an antibody that specifically binds to a basic peptide or a monoclonal antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention as an antigen. And is not particularly limited.
  • a buffer or diluent such as a specimen or a labeled antibody, a coloring substrate suitable for the enzyme when the enzyme is used for the labeled antibody (see above), a blocking agent, a reaction terminator Or a cleaning agent is exemplified.
  • the diluent is not particularly limited, but is preferably a diluent containing a substance contained in the specimen.
  • the sample is serum and blood collection for obtaining the serum is performed in the presence of EDTA or citric acid
  • Standard substances are also exemplified.
  • Examples of the standard substance include analogs of “the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” and “the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention”.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the present invention is preferred as a standard substance.
  • the sandwich immunoassay kit of the present invention also includes a kit utilizing an immunochromatography method or a flow-through method based on a sandwich immunoassay method. Furthermore, the sandwich immunoassay kit of the present invention can be used for the measurement by the MED IA method (Japanese Patent Laid-Open No. 5-264552) for electrochemically measuring the signal of the label, and the Imnoassay method using a microchip (“Bioscience and Industry”). 61 449 454 2003), time-resolved fluorescence immunoassay "Analytical biochemistry” (USA), 1984, vol. 137, p.335-343) and homogenous immunoassay. It can also be used for measurement by.
  • a measurement kit using these principles is also characterized in that it is measured by a sandwich immunoassay, and it is characterized by "an antibody that specifically binds to a peptide capable of amino acid residue represented by SEQ ID NO: 2" or "the present invention.
  • the sandwich immunoassay kit of the present invention as long as it contains the “monoclonal antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment as an antigen”.
  • the sandwich immunoassay system kit of the present invention comprises "the amino acid residue of SEQ ID NO: 2
  • the first aspect of the present invention is characterized in that it includes an antibody that specifically binds to a peptide of the present invention or a monoclonal antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention as an antigen.
  • the soluble CD14 antigen of the embodiment can be specifically measured.
  • the sample used for the sandwich immunoassay kit of the present invention is preferably an aqueous sample.
  • measurement of the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention contained in blood components such as blood, serum or plasma, urine, other body fluids, cell culture supernatants, or column eluates is preferred.
  • specimens other than human blood components such as human urine or other body fluids, blood components from non-human species, urine or other body fluids, cell culture supernatants, or column eluates, etc. It is possible to measure not only the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the invention but also proteins and polypeptides similar to the “soluble CD14 antigen of the first embodiment of the invention”.
  • kits for measuring a protein, polypeptide or the like similar to the above-mentioned “soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” is also included in the sandwich immunoassay kit of the present invention.
  • an antibody that specifically binds to the amino acid residue potent peptide described in SEQ ID NO: 2 or "the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention is used as an antigen A Fab, Fab ', or (Fab'), which is a fragment of an antibody that specifically binds to a peptide capable of amino acid residue described in SEQ ID NO: 2) instead of the monoclonal antibody prepared as The recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention
  • Fab fragment of a monoclonal antibody prepared using
  • examples of the principle of measurement include an agglutination method, a solid-phase binding method, and a solution reaction method, and at least one of the "soluble CD14 of the first embodiment of the present invention".
  • An antibody that specifically binds to the "antigen” or a fragment of the antibody preferably, a kit corresponding to these methods containing the antibody of the present invention or the fragment of the antibody can be constituted.
  • kits when the kit is constituted using a single antibody without using the second binding substance, an antibody or a fragment of the antibody specifically binding to the ⁇ soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention '' Full-length soluble CD14 protein in human blood (hereinafter sometimes referred to as human high molecular weight CD14) or a soluble polypeptide having amino acids at the N-terminal position 1 to 356 of human CD14 (hereinafter referred to as rsCD14 (1- 356)), it is preferable to use an antibody that does not substantially bind to recombinant high molecular weight CD14.
  • human high molecular weight CD14 human high molecular weight CD14
  • rsCD14 (1- 356) a soluble polypeptide having amino acids at the N-terminal position 1 to 356 of human CD14
  • an antibody is bound to the surface of a particle, and the presence of the antigen causes aggregation of the particle, and the antigen is specifically qualitatively or quantitatively determined using the degree of aggregation of the particle as an index. .
  • the agglutination immunoassay kit of the present invention for example, the "antibody specifically binding to the peptide capable of amino acid residue represented by SEQ ID NO: 2" or the “recombinant of the second embodiment of the present invention” Monoclonal antibody prepared using a soluble CD14 fragment as an antigen''The soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention is formed and measured by agglutination.As a configuration of the agglutination immunoassay kit of the present invention, The antibody of the present invention includes particles bound to its surface.
  • particles generally used particles such as latex, red blood cells (for example, sheep red blood cells), gelatin, microbeads or carbon particles can be used.
  • the solid phase binding method is a method of measuring by forming a complex of an antibody and an antigen on a solid phase.
  • a sample containing an antigen is adsorbed on an insoluble carrier (ie, solid phase).
  • an insoluble carrier ie, solid phase.
  • a labeled antibody is added and allowed to react, and the amount of complex bound to the solid phase is determined based on the label. Qualitatively or quantitatively.
  • a competitive method a method of measuring the amount of a labeled antibody specifically bound to an antigen-like substance by adsorbing the antigen-like substance on an insoluble carrier and competing with the reaction between the labeled antibody and the antigen in the sample.
  • the antibody is adsorbed on an insoluble carrier, and the reaction with the antigen in the sample is competed with the labeled antigen-like substance, and the amount of the labeled antigen-like substance specifically bound to the antibody is measured. There is a way to do that.
  • the "antibody that specifically binds to the peptide having the amino acid residue described in SEQ ID NO: 2" or “the recombinant of the second embodiment of the present invention” A monoclonal antibody prepared using a soluble CD14 fragment as an antigen '' A complex of the ⁇ soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention '' and ⁇ specifically binds to the peptide having the amino acid residue described in SEQ ID NO: 2 '' "Antibody” or "monoclonal antibody prepared using recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention as an antigen" "Labeled soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” (or an analog thereof)
  • insoluble carrier the analogous substance of the "soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention", the label, and the reagent to be adsorbed are as described in the description of the sandwich immunoassay system kit.
  • an antigen is reacted with a labeled antibody in a liquid phase, and then the antigen, the antibody and the antigen-antibody complex are separated by an agglutination sedimentation method using an antibody or a physicochemical method. This is a method for specifically qualifying or quantifying the “soluble CD14 antigen of the first embodiment”.
  • an antibody that specifically binds to the amino acid residue-enhancing peptide of SEQ ID NO: 2 or "the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention is used as an antigen
  • ⁇ a peptide having a continuous 8 to 16 amino acid residue sequence which is also selected as the amino acid sequence sequence described in SEQ ID NO: 2
  • an antibody prepared using the peptide having 16 amino acid residues represented by SEQ ID NO: 2 as an antigen
  • an antibody prepared using the peptide as an antigen or "Fab, Fab ', or (Fab')" which is a fragment of these antibodies.
  • the force described based on the principle of measuring the example of the measurement kit of the present invention is not limited to these principles.
  • the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention which contains an antibody or a fragment of the antibody specifically binding to at least one "soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention” and is contained in a sample Is included in the measurement kit of the present invention as long as it can be directly measured.
  • Known techniques can be used for the principle of the immunoassay.
  • the "soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” which can be specifically measured by the kit of the present invention increases in septic patients. Therefore, measurement of the “soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” serves as an indicator of sepsis diagnosis, and the kit of the present invention is useful for diagnosis of sepsis.
  • an antibody that specifically binds to the peptide having the amino acid residue represented by SEQ ID NO: 2 or "a monoclonal antibody prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the present invention as an antigen” is dissociation constant when expressed as an affinity that pair to "the recombinant soluble CD14 fragment of the present invention” peptide or (KD) is less than 10- 7 M are preferred. More preferred properly is, 10- 8 M or less, more preferably an antibody or less 10- 9 M.
  • the peptide serving as the antigen is composed of eight or more consecutive amino acid residues of SEQ ID NO: 2. And preferably 10 or more, more preferably 12 or more, and particularly preferably 16 or more consecutive amino acids.
  • the peptide has at least eight consecutive amino acid residues of any of SEQ ID NO: 2. There is no limitation on other amino acid sequences including the above amino acids, but preferably, the entire amino acid sequence of the peptide is derived from the amino acid sequence described in any of SEQ ID NO: 2.
  • An antibody is preferably prepared using a peptide containing eight or more consecutive amino acids of the amino acid residues of SEQ ID NO: 2 as an antigen.
  • the antibody is preferably an antibody prepared using a peptide containing 10 or more consecutive amino acids, more preferably 12 or more consecutive amino acids, particularly preferably 16 consecutive amino acids.
  • the peptide serving as an antigen was described in SEQ ID NO: 2.
  • the number of amino acid residues is not particularly limited as long as it is a peptide consisting of consecutive 8 to 16 amino acid residues selected from the amino acid sequence of
  • the antibody is prepared using a peptide consisting of 10 or more continuous amino acids, more preferably 12 or more continuous amino acids, and particularly preferably 16 consecutive amino acids. That is, preferably, an "antibody prepared using the peptide consisting of 16 amino acid residues described in SEQ ID NO: 2 as an antigen".
  • the "soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” has a different molecular weight from the high molecular weight CD14, and has a shorter amino acid sequence than the high molecular weight CD14. Therefore, it is considered that the structure of the “soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” in blood is different from that of high-molecular-weight CD14, and the reactivity with the antibody is different.
  • the antibodies a) to d) which are preferred examples of the antibodies specifically binding to the ⁇ soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention '' contained in the measurement kit (hereinafter simply referred to as ⁇ above a) to d) Antibody) may bind more strongly to the "soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention", that is, have high affinity.
  • the antibodies a) to d) above may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • the animal species from which the antibody of the present invention is derived is not particularly limited. From the viewpoint of ease of antibody production, egos and goats are preferred.
  • the molecular species is not particularly limited. Immunoglobulins classified into any class, subclass and isotype may be used.
  • the method for producing a peptide to be used as an immunogen includes a method using a commonly used peptide synthesizer (Peptide Synthesizer 433A, Perkin-Elma Japan), a gene Recombinant method (New Cancer Engineering Protocol, Shujunsha), edited by Cancer Research Division, Institute of Medical Science, The University of Tokyo.
  • a commonly used peptide synthesizer Peptide Synthesizer 433A, Perkin-Elma Japan
  • a gene Recombinant method New Cancer Engineering Protocol, Shujunsha
  • a peptide consisting of eight or more consecutive amino acid residues of the amino acid residue set forth in SEQ ID NO: 2 can be synthesized by the Fmoc method using a 433A-type peptide synthesizer, and can be protected from deprotection by TFA and resin. After cleavage, the target peptide can be prepared by purification using a C18 HPLC column (Capcel Pak, Shiseido).
  • an MAP peptide When the antigen is a protein, a peptide having 8 to 30 amino acid residues or less, which can be used as an immunogen as it is, usually has no immunogenicity due to its small molecular weight.
  • an MAP peptide may be prepared by binding to a carrier or by using the Multiple Antigen Peptide (MAP) method to have a molecular weight having immunogenicity and to be used as an immunogen.
  • MAP Multiple Antigen Peptide
  • the carrier to be bound to the peptide includes a carrier protein and a polymer.
  • a carrier protein a heterologous protein such as bovine serum albumin, keyhole limpet hemocyanin (KLH), thyroglobulin or ovalbumin may be used.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • thyroglobulin or ovalbumin may be used.
  • These carrier proteins utilize a side chain functional group contained in the peptide or the amino acid of the carrier protein or introduce a maleimide group, N-hydroxysuccinimide (NHS) group or aldehyde group, What is necessary is just to couple
  • the polymer include sugars such as mannan and chitosan and polyvinylpyrrolidone (PVA). These polymers may be bonded to the peptide by adsorption or chemical bonding as described above.
  • the method for producing the recombinant soluble CD14 fragment of the present invention using an antigen is as described in the description of the second and third embodiments of the present invention.
  • the fragment when used as an antigen, it may be used as an immunogen as it is, or may be combined with a carrier or the like as described above to form an immunogen.
  • the antibody of the present invention can be prepared by using a known technique (for example, see Immunological Experiment Procedures, edited by the Japanese Society of Immunology, published by the Japan Society of Immunology).
  • a polyclonal antibody can be prepared by the following method.
  • Various animals can be immunized by mixing 20 to 1000 ⁇ g of the immunogen prepared as described above with adjuvants such as Freund's complete adjuvant, RIBI adjuvant, and ALUM. each Horses, sheep, goats, pigs, egrets, rats, mice, etc. can be used as seed animals. Immunization methods include intramuscular, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, and lymph node administration, and Freund's incomplete adjuvant, RIBI adjuvant, Booster immunization can be performed by similarly administering an immunogen mixed with an adjuvant such as ALUM, or by directly intravenously administering the immunogen.
  • adjuvants such as Freund's complete adjuvant, RIBI adjuvant, and ALUM.
  • the antiserum can be prepared by collecting blood from the immunized animal in a usual blood sampling method, for example, collecting blood from the carotid artery, ear vein, heart, foot vein and the like, and separating the serum by centrifugation or the like.
  • the obtained antiserum precipitates a ⁇ globulin fraction by salting-out method with the addition of ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., and after dialysis against an appropriate buffer, specific ⁇ globulins such as protein A, protein G, etc.
  • a purified polyclonal antibody of the IgG fraction against the target peptide can be prepared using an affinity matrix that can be purified to a desired degree.
  • specific purification can be performed by selecting an antibody that specifically binds to the antigen.
  • a monoclonal antibody can be prepared by the following method.
  • the present invention provides a hybridoma by fusing immunized mammalian immune cells with myeloma cells to produce a hybridoma, and selecting from these hybridomas a clone that produces an antibody that specifically binds to the peptide.
  • a hybridoma by fusing immunized mammalian immune cells with myeloma cells to produce a hybridoma, and selecting from these hybridomas a clone that produces an antibody that specifically binds to the peptide.
  • a peptide which has 10 or more consecutive amino acid residues from position 53 to position 68 is used as the immunogen. More preferably, a peptide consisting of 12 or more consecutive amino acids, particularly preferably 16 consecutive amino acids is used as the immunogen.
  • the mammal to be immunized is not particularly limited, but is preferably a mouse, rat, hamster, or the like, which is preferably selected in consideration of compatibility with the myeloma cells used for cell fusion.
  • myeloma cells various known cells can be used. This includes myeloid cells such as P3, P3U1, SP2Z ⁇ , NS-1, YB2Z0 and Y3-Agl, 2,3.
  • Immunization can be performed by a known method.
  • the antigen is administered intraperitoneally, subcutaneously, intravenously, or into a footpad. This antigen may be administered in combination with an adjuvant, and is preferably administered more than once.
  • the immunocytes are preferably isolated spleen cells or lymph node-derived cells several days after the final administration of the antigen, for example, three days after.
  • Immune cells and Mie mouth Fusion with a single cell can be carried out using a known method such as the method of Milstein (Methods in EnzymoL, vol. 73, page 3).
  • Milstein Methods in EnzymoL, vol. 73, page 3
  • a method using polyethylene glycol (PEG) as a fusion agent, an electrofusion method and the like can be mentioned.
  • the mixing ratio of the immunocytes and the myeloma cells is not limited as long as they can be fused, but it is preferable to use an lZio amount or an equal amount of the myeloma cells with respect to the immunocytes.
  • the PEG concentration is not particularly limited, but preferably 50%.
  • An auxiliary such as dimethyl sulfoxide (DMSO) may be added as a fusion efficiency promoter. Fusion is initiated by adding the PEG solution warmed to 37 ° C. to the mixed cells, and after 1-5 minutes of reaction, ending by adding medium.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the hybridoma and ibridoma formed by the fusion are cultured in a selective medium such as a medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin (HAT medium) for 1 to 7 days, and separated from unfused cells.
  • a selective medium such as a medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin (HAT medium) for 1 to 7 days, and separated from unfused cells.
  • the obtained hybridoma is further selected depending on the antibody produced.
  • the selected hybridoma is monocloned according to a known limiting dilution method, and established as a monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • a known method can be used as a method for detecting the activity of the antibody produced by the hybridoma.
  • an ELISA method, an agglutination reaction method, and a radioimmunoassay method can be used.
  • the established hybridoma is cultured by a known method, and a monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant.
  • the hybridoma can be proliferated by administering it to a mammal having compatibility with the hybridoma, and can be obtained from the ascites.
  • the antibody can be purified using a known purification means such as a salting-out method, a gel filtration method, an ion-exchange chromatography method or an affinity chromatography method.
  • the stability of the soluble CD14 antigen and the high molecular weight CD14 of the present invention influences and the measured values fluctuate.
  • a sixth aspect of the present invention is directed to a soluble CD14 of at least one of the first aspects of the present invention.
  • the measurement method according to the sixth embodiment of the present invention does not detect human high molecular weight CD14, and measures at least one of the "soluble CD14 antigens of the first embodiment of the present invention” to measure "the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention”.
  • An antibody that specifically binds to the ⁇ soluble CD14 antigen of the first embodiment '' is used to directly measure ⁇ the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention '' contained in a sample.
  • This is an immunological measurement method for “soluble CD14 antigen”.
  • a measurement method characterized by using an antibody or a fragment of the antibody described in a) to d) below.
  • More preferable is a measurement method characterized by using the antibody of the above a), c) or d) or a fragment of the antibody. More preferably, it is a measurement kit containing the antibody of d) or a fragment of the antibody.
  • the antibody fragment is Fab, Fab ', or F (ab') of the monoclonal antibody.
  • any one of the above-mentioned a) to d), or a fragment of the antibody using a second binding substance that binds to the "soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention”
  • any one of the above a) to d) can be used as a solid phase antibody, a labeled antibody, or the like. Also, a second specific binding method and a measurement method using an anti-immunoglobulin antibody are included. In this case, any of the above a) to d) is a free antibody, a second specific binding It can also be used as a substance or an antibody bound to a second specific binding partner.
  • the measurement method of the present invention can be a non-competitive method or a competitive method of a sandwich immunoassay, and includes a measurement by an immunochromatography method or a flow-through method.
  • the principle of the measurement method of the present invention is not limited to the sandwich immunoassay, and other examples include an aggregation method, a solid phase binding method, and a solution reaction method.
  • the detailed measuring method is preferably as described in the section of the kit of the fifth aspect of the present invention.
  • a seventh aspect of the present invention is an antibody that specifically binds to the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention.
  • the antibody of the following a) to d) is used for the antibody of the second aspect of the present invention. Remove it! ,.
  • International Publication WO2004Z44005 is an antibody that binds to the peptide having the amino acid residues described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, and a continuous antibody selected from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6.
  • Antibodies produced using a peptide having a capacity of up to 30 amino acid residues as an antigen are also described, and the antibody that specifically binds to the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention is one of these antibodies. In order to make a clear distinction even if a part is included, these antibodies may be excluded from the antibody that specifically binds to the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention.
  • the seventh embodiment of the present invention "specifically binds to the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention.”
  • the antibody that does not substantially bind to the full-length soluble CD14 protein or rsCD14 (1-356) in human blood, and the recombinant soluble CD14 fragment according to the second embodiment of the present invention is a recombinant soluble CD14 fragment.
  • An antibody that specifically binds to the CD14 fragment is preferred. Further, an antibody that is a monoclonal antibody is preferable.
  • the antibody of the present invention can be prepared using the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention as an antigen.
  • the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention can be measured, and the ⁇ soluble CD1 antigen of the first aspect of the present invention '' of the fifth aspect of the present invention can be measured. 4 kit for measuring antigens ".
  • An eighth aspect of the present invention is an antibody that specifically binds to the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention.
  • the antibodies of the following a) to d) described in Examples of International Publication WO2004Z44005, which is published after the priority date of the present application are also included and partially overlap. Therefore, the antibody that specifically binds to the recombinant soluble CD14 fragment according to the second embodiment of the present invention may include a part of the following antibodies a) to d).
  • International Publication No. WO2004Z44005 is selected from an antibody that binds to a peptide having the amino acid residue described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, and an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6
  • Antibodies prepared using a peptide having 8 to 30 consecutive amino acid residues as an antigen have also been described.
  • Antibodies that specifically bind to the recombinant soluble CD14 fragment according to the second embodiment of the present invention include these antibodies. In order to clearly discriminate even if a part of the antibody is contained, these antibodies may be excluded from the antibody specifically binding to the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention. .
  • the "antibody that specifically binds to the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention” is the full-length soluble CD14 protein or rsCD in human blood.
  • the antibody does not substantially bind to 14 (1-356) and specifically binds to the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention.
  • an antibody that is a monoclonal antibody is preferable.
  • the antibody of the present invention can be prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention as an antigen.
  • a particularly preferred antibody is the F1237-3-4 antibody.
  • the hybridoma producing the F1237-3-4 antibody was obtained on April 27, 2005 (receipt number FERM ABP-10330) at 1-1-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan. Laboratory Deposited internationally at the Patent Depositary for Biotechnology.
  • the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention can be measured using the antibody of the eighth aspect of the present invention, and the "first aspect of the present invention" of the fifth aspect of the present invention can be measured. And a kit for measuring soluble CD14 antigen.
  • the “kit for measuring soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” of the fifth embodiment of the present invention does not measure high molecular weight CD14. This is why antibodies that do not substantially bind to full-length soluble CD14 protein in human blood are preferred. The reason for using a monoclonal antibody in a measurement kit is also preferable. Furthermore, the antibody does not substantially bind to the full-length soluble CD14 protein or rsCD14 (1-356) in human blood, and the antibody can be used alone without using a second binding substance which is different from the sandwich immunoassay. These antibodies can be used, and are particularly useful.
  • WO2004Z44005 discloses an antibody that binds to the peptide having the amino acid residues described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6
  • Antibodies produced using a selected peptide of 8 to 30 amino acid residues as an antigen, and the anti-CD14 antibodies F1031-8-3 antibody and F1106-13-3 antibody are described. Their usefulness is that they can be used in a low-molecular-weight CD14 assay kit useful for diagnosing sepsis.
  • the antibody described in International Publication WO2004Z4 4005 is not directly associated with the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention. The relationship has not been proven, and the invention is said to be useful for a low-molecular-weight CD14 measurement kit useful for diagnosing sepsis when the peptide or CD14 was prepared as an antigen.
  • the antibody of the present invention can be used for the “kit for measuring soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” of the fifth embodiment of the present invention.
  • the “recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention” is an antibody which is similar in immunological properties to the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention, and binds to the fragment. If it is not (ie, the antibody of the present invention), it cannot be used in the kit for measuring the “soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention”.
  • Antibodies that have been hitherto known and that can be used in the kit for measuring the "soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention” include only the above-mentioned antibodies described in International Publication WO2004Z44005.
  • the antibodies that bind to the “recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention” are only the above-mentioned antibodies, and various anti-CD14 antibodies are “recombinant recombinant CD14 fragments of the second embodiment of the present invention”. It does not bind to the "type soluble CD14 fragment”. That is, the antibody of the present invention exhaustively invents and discloses an antibody that can be used for the “kit for measuring the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention”. Furthermore, an antibody prepared using the “recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention” as an antigen has immunological reactivity with the “soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention”. High and especially useful.
  • a ninth aspect of the present invention is an antibody that specifically binds to the recombinant soluble CD14 fragment of the third aspect of the present invention.
  • the antibody of the ninth aspect of the present invention can be prepared using the recombinant soluble CD14 fragment of the third aspect of the present invention as an antigen.
  • Preferred examples of the antibody according to the ninth aspect of the present invention are the same as those described in the section of the eighth aspect of the present invention, and their usefulness and other descriptions are also the same.
  • a tenth aspect of the present invention is a method for screening an antibody useful for measuring a soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention, comprising the following steps.
  • the screening method according to the tenth aspect of the present invention is a method for screening an antibody useful for measuring the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention, which can be a useful marker for diagnosing sepsis. That is, the method for selecting an antibody useful for measuring the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention, which can be a useful marker for diagnosing sepsis.
  • the method for selecting an antibody that can be used in the kit according to the fifth aspect of the present invention is also provided.
  • the screening method according to the tenth aspect of the present invention is characterized in that the amino acid residue of any of 6 to 20 consecutive amino acids selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 prepared in the step 1) is used.
  • a fragment of the antibody may be used as a screening target specimen. (The following description of antibodies also includes descriptions of antibody fragments.)
  • the liquid to be measured in 2) is not particularly limited as long as the liquid contains CD14.
  • the solution contains at least a high molecular weight CD14.
  • the immunoassay system configured in 3) is only required to be able to measure whether the antibody to be screened specifically reacts with CD14 contained in the liquid to be measured.
  • an antigen immobilization method, a sandwich method, a biomolecular interaction analysis method and the like can be mentioned.
  • the present invention is not particularly limited to any of the immunoassay systems described in the fifth and sixth embodiments of the present invention.
  • a substance that specifically binds to the antibody prepared in the step 1) may be measured for the liquid to be measured according to the immunoassay method configured in the step 3).
  • step 5 whether or not it is useful for use in an immunoassay useful for diagnosing the antibody-resistant sepsis as a sample to be screened is evaluated based on the results measured in the step 4).
  • This is a step of selecting an antibody.
  • Indices are not particularly limited
  • the screening method according to the sixth aspect of the present invention uses the method described in “Step 6) of preparing the" consecutive 6 to 20 amino acid residues selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 "
  • This method is characterized in that an antibody that specifically binds to a specific peptide is used as a sample to be screened, and the other steps are not unnecessarily limited.
  • the antibody prepared in the above step 1) is specific to a peptide having a continuous 6 to 20 amino acid residue power which also selects the amino acid sequence power from the N-terminal 1 to 314 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3.
  • An antibody that binds to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 is selected.An antibody prepared using a peptide having 8 to 30 amino acid residues as continuous antigens, or the N-terminal 1 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 It is preferable that the antibody be prepared using a peptide consisting of consecutive 8 to 30 amino acid residues selected from the amino acid sequence from position 314 to position 314 as an antigen.
  • step 1) instead of preparing "an antibody that specifically binds to a continuous peptide having 6 to 20 amino acid residues selected from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3,"
  • the following antibodies ⁇ 1> to ⁇ 4> may be prepared and used.
  • 1> Synthesize a peptide based on the full-length sequence of CD14 by a standard method, prepare an immunizing antigen, and prepare an antibody.
  • ⁇ 2> Purify soluble CD14 in serum and use this as an immunogen to produce antibodies.
  • 3> Prepare recombinant CD14 protein using COS cells or Escherichia coli and use this as an immunogen to produce antibodies. 4) Prepare various CD14 antigens by heat denaturation or DNP conversion, etc., and use them as immunogens to produce antibodies.
  • a labeled antibody against the antibody prepared in the above step 1) for example, a labeled anti- Further prepare globulin antibody
  • the liquid to be measured is preferably a body fluid of a normal human or a sample of human high molecular weight CD14.
  • a 3C10 antibody affinity column adsorption fraction of a normal human body fluid may be prepared.
  • an immunoassay was performed to form a complex of, for example, "the high molecular weight CD14 in the liquid to be measured”-"the antibody prepared in the step 1)" and "labeled anti-immunoglobulin antibody” on the insoluble carrier.
  • the specific binding of the antibody prepared in step (1) to “high molecular weight CD14 in the liquid to be measured” is measured through a label.
  • the solution to be measured is bound to an insoluble carrier, and in step 4), the antibody prepared in 1) is added to the dot blotting measurement system configured in 3).
  • the “labeled anti-immunoglobulin antibody” may be reacted sequentially. Thereafter, the degree of formation of the complex, that is, the substance that specifically binds to the antibody prepared in 1) in the liquid to be measured may be measured based on the strength of the label.
  • the antibody prepared in 1) having low or no labeling strength is compared with the high molecular weight CD14 in the normal human body fluid or the human high molecular weight CD14 preparation. Evaluate that the specific binding is weak or no, and select an antibody that is useful for use in an immunoassay useful for diagnosing sepsis. For example, when an antibody that can be evaluated as having high specific binding to high molecular weight CD14 in blood is used to measure a substance that specifically binds to the antibody in human body fluid, the main protein measured is high. It has a molecular weight of CD14.
  • the soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention which is a protein in a smaller amount than the high molecular weight CD14
  • an antibody that does not specifically bind to the high molecular weight CD14 should be selected. That's all.
  • the antigen solid phase EIA method is used, and in the case where a membrane is used as the insoluble carrier, the dot blotting method is used.
  • sandwich immunoassay is as described in the section of the kit of the fifth aspect of the present invention or the fifth assay of the present invention.
  • an antibody or an anti-CD14 antibody that specifically binds to a peptide having a contiguous 6 to 20 amino acid residue strength selected as another amino acid sequence strength described in SEQ ID NO: 3 may be described as a second antibody) Prepare).
  • the measurement target liquid prepared in the above step 2) is preferably a body fluid of a normal person and a body fluid of a sepsis patient.
  • both body fluids have the same origin. That is, it is more preferable that both body fluids have the same origin, for example, a blood sample of a normal person and a blood sample of a sepsis patient, or a urine sample of a normal person and a urine sample of a sepsis patient.
  • it is preferably a blood sample. Particularly, serum is preferred.
  • sandwich immunization is performed so that a complex of, for example, the antibody prepared in the step (1), the "soluble CD14 antigen of the first embodiment of the present invention", and the “second antibody” is formed on the insoluble carrier. What is necessary is just to comprise a system.
  • one of the “antibody prepared in the step 1” or the “second antibody” is bound to an insoluble carrier, and the other is labeled to constitute a sandwich immune system.
  • the solution to be measured and the labeled antibody may be reacted with the sandwich immune system constituted in the step 3) in order, and the measurement may be performed.
  • step 5 the measurement result of the body fluid of a normal person is compared with the measurement result of the body fluid of a sepsis patient, and the difference in the compared measurement results indicates that the solubility of the first embodiment of the present invention is useful for diagnosing sepsis.
  • the immunoassay composed of 3) is a sandwich assay, it is preferable to select a combination of the antibody prepared in 1) and the antibody of the "second antibody". No. That is, a method for screening a combination of antibodies for use in a sandwich immunoassay useful for diagnosing sepsis, which is used for measuring a blood protein that can be a useful marker for diagnosing sepsis, is preferable.
  • the antibody used in the screening method of the present invention can be prepared according to the description of the measurement kit of the fifth embodiment of the present invention.
  • the description of the materials and the like is as described in the section of the description.
  • the biomolecule interaction analysis method is not particularly limited, but a surface plasmon resonance method is exemplified. For example, it can be performed by using a Biacore apparatus (manufactured by Biacore).
  • An eleventh aspect of the present invention is a method for screening an antibody useful for measuring a soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention, comprising the following steps.
  • the screening method according to the ⁇ -aspect of the present invention is a method for screening an antibody useful for measuring the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention, which can be a useful marker for diagnosing sepsis. That is, the method for selecting an antibody useful for measuring the soluble CD14 antigen according to the first aspect of the present invention, which can be a useful marker for diagnosing sepsis. The method for selecting an antibody that can be used in the kit according to the fifth aspect of the present invention is also provided.
  • the screening method of the ⁇ -th embodiment of the present invention particularly comprises reacting an antibody to be screened with the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention, whereby both are specific. It is characterized by evaluating whether it shows binding, that is, whether it shows an antigen-antibody reaction.
  • the recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention does not specifically bind to 3C10 and MEM-18, and It specifically binds to an antibody prepared using a peptide having 16 amino acid residues as described as an antigen. This is the same immunological property as the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention.
  • evaluating the reaction between the antibody to be screened and the recombinant soluble CD14 fragment of the second aspect of the present invention is useful for measuring the soluble CD14 antigen of the first aspect of the present invention. Antibodies will be selected.
  • the screening target specimen to be prepared is not particularly limited as long as it is an antibody.
  • an antibody fragment may be used as a sample to be screened as long as it has a function of causing an antigen-antibody reaction with an antigen. (In the following explanation about antibodies Also includes instructions for fragments of the antibody. )
  • the screening target specimen in order to increase the efficiency of the screening, the screening target specimen must be specifically selected from a protein consisting of any of 6 to 356 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. It is preferable to prepare an antibody that binds. Further, it is more preferable to prepare an "antibody that specifically binds to a protein containing at least 7 consecutive amino acid residues selected from the 53rd to 68th positions described in SEQ ID NO: 3".
  • the prepared recombinant soluble CD14 fragment of the second embodiment of the present invention is particularly preferably a recombinant soluble CD14 fragment described in the section of the description of the second embodiment of the present invention. Not limited!
  • the antibody prepared in 1) is reacted with the fragment prepared in 2), and the specific binding between the antibody prepared in 1) and the fragment prepared in 2) is evaluated.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method capable of evaluating whether a specific binding, ie, an antigen-antibody reaction is exhibited. Examples include an antigen immobilization method, a sandwich measurement method, and a method for analyzing interaction between biomolecules. These methods are as described in the description of the tenth aspect of the present invention. If the specific binding is evaluated by the sandwich immunoassay using the second antibody, the combination of antibodies by the sandwich assay can be evaluated.
  • the twelfth aspect of the present invention provides the following steps 1) to 3).
  • N-terminus is a shift between positions 1 to 17 of SEQ ID NO: 3
  • the C-terminus is any of positions 134 to 356 of SEQ ID NO: 3,
  • a step of recovering the N-terminal fragment of the fragment cleaved in 3X2> A method for producing a recombinant soluble CD14 fragment according to the second aspect of the present invention, which has the following sequences 5) to 7).
  • the N-terminus is at position 1 to position 17 of SEQ ID NO: 3, and
  • the recombinant of the second aspect of the present invention having a predetermined amino acid sequence is provided.
  • a soluble CD14 fragment can be produced.
  • the detailed production method is as described in the description section of the second embodiment of the present invention.
  • the sequence power of the cleavage site in step 4 of ⁇ 1> may be Leu, Glu, Val, Leu, Phe, Gin, Gly, Pro. No.
  • the sequence power of the cleavage site in step 4) of step 1> may be SLeu, Val, Pro, Arg, Gly, or Ser.
  • the serum of a normal individual and the serum of a sepsis patient used in the following examples were purchased from ProMedDx, Samplex and Sera Care Life Science and used.
  • S68 peptide The peptide to be synthesized (hereinafter referred to as S68 peptide) was synthesized by inserting a cysteine at the N-terminus in order to bind to the carrier protein via the SH group at the N-terminus. That is, using a peptide synthesizer ABI433A (Applied), amino acid columns were arranged according to the amino acid sequence, and an amino acid column for cysteine was installed at the N-terminus to perform automatic synthesis.
  • the synthesized peptide was cut out from the resin by a conventional method, precipitated with ether, recovered, dissolved again in distilled water, and freeze-dried. After dissolving the resulting crude peptide, elution was performed using C18 reverse-phase HPLC (CAPCELL-PAK, Shiseido) with a linear gradient of 5-70% acetonitrile concentration, and the fraction containing the target peptide was collected. did. The collected fraction was lyophilized to obtain 2-3 mg of a purified peptide.
  • the peptide prepared in 1- (1) was dissolved in lOmgZmL with distilled water, and mixed with an equal volume of lOmgZmL of Imject Maleimed Activated keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) (PIERCE). After reacting at room temperature for 2 hours, desalting was performed using a NAP-10 column (Amersham Bioscience) equilibrated with physiological saline to obtain 1 mg of an S68 peptide carrier antigen (hereinafter, referred to as S68 peptide-KLH). The protein concentration described in the examples was obtained by dividing the used KLH amount by the liquid amount.
  • KLH Imject Maleimed Activated keyhole Limpet Hemocyanin
  • each of the S68 peptide-KLH was diluted in 500 ⁇ L of physiological saline, mixed with an equal volume of 500 ⁇ L of Freund's incomplete adjuvant (DIFCO), and then administered subcutaneously on the back.
  • DIFCO Freund's incomplete adjuvant
  • 100 g of S68 peptide-KLH was diluted in 1 mL of physiological saline and administered into the ear vein.
  • the dialysate was applied to a protein A column (Prosep A, Millipore), and the bound IgG fraction was eluted with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (PH 3.0) to obtain a purified antibody.
  • PH 3.0 0.1 M glycine hydrochloride buffer
  • the protein concentration was calculated from the absorbance at 28 Onm (converted value: 0.533 mg / mL). After 0 , the obtained antibody is referred to as S68 peptide polyclonal antibody.
  • Example 1 S68 peptide prepared in (2) —20 ⁇ g of KLH was dissolved in 100 ⁇ L of saline, mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant (DIFCO), and each hind footpad of an 8-week-old Wistar rat female was administered in 100 L aliquots. Two weeks later, iliac lymph nodes were removed and cell fusion was performed. Cell fusion was performed in accordance with Tamoe Ando and Takeshi Chiba, "Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures," p. 83, 1999, Kodansha.
  • DIFCO Freund's complete adjuvant
  • lymphocytes were separated from lymph nodes using a cell strainer (Falcon), mixed with myeloma cells (Sp2ZO-Agl4) at 5: 1, and cell fusion was performed using polyethylene glycol.
  • the fused cells were suspended in a HAT medium. After selection of hybridomas and hybridomas, hybridomas producing the desired antibody were screened.
  • rsCD14 1-307) S286C diluted to 1 ⁇ g / mU with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) was added to an imnoplate (Maxisorb, NUNC), and 50 ⁇ l of phenol was added thereto. The mixture was allowed to stand at ° C for 1 hour. Next, the plate was washed 5 times with ion-exchanged water, 100 L of PBS (pH 6.4) containing 0.1% BSA was added to each well, and the plate was allowed to stand at room temperature for 1 hour for blocking.
  • PBS pH 6.4
  • the obtained culture supernatant which was also sampled from the hybridoma power, was added to each well, reacted at 37 ° C for 1 hour, and washed three times with a physiological saline solution containing 0.05% Tween20.
  • a solution obtained by diluting a peroxidase-labeled anti-rat immunoglobulin antibody (DAKO) 1000 times with PBS containing 10% heron serum was added to each well in a volume of 50 L. After reacting for 1 hour at 37 ° C, the plate was washed 5 times in the same manner, and a tetramethylbenzidine solution (TMB, BioFix) was added to each well. After the reaction at room temperature for 10 minutes, the reaction was stopped with a 0.5 M sulfuric acid solution.
  • DAKO peroxidase-labeled anti-rat immunoglobulin antibody
  • the absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed), and a gel containing an antibody that binds to rsCD14 (1-307) S286C and containing a hybridoma was selected.
  • rsCD14 (1-307) S286C was prepared by using the method described in WO01 / 72993 as column f, practice 9.
  • Example 2 Using the antibodies described in Example 1 and Example 2, a measurement system by the sandwich EIA method was examined.
  • oligomer 8 linkS (5, one agetta gga att t, 3) (SEQ ID NO: 7) and oligomer 8, linkA (5'-ctagaa att cct a-3 ') (SEQ ID NO: 8) were synthesized.
  • sense primer A (5, aca tct aga tga cca cgc cag aac ct—3,) (Torigami U number 9) and antisense primer (5′—ttt gga tec tta cta gag ate gag cac tct-3) ') A (IS sequence number 10) was synthesized, and the plasmid pM1659 described in Example 8 of WO01Z72993 was subjected to PCR using Pyrobest DNA polymerase in the form of type ⁇ .
  • the obtained amplified product of about 900 bp was double digested with Xbal and BamHI to recover a DNA fragment.
  • the vector pM710 described in Example 10 of JP-A-06-025289 was double-digested with Hindlll and BamHI, and then recovered by agarose gel electrophoresis. After ligation of the above-mentioned phosphoric acid-linked linker, PCR-amplified DNA fragment / Xbal + BamHI digested fragment, and vector ZHindlll + BamHI fragment (three-way ligation), E. coli combined cells (JM109 (TOYOBO Transformation was performed in)) to obtain a clone containing the target plasmid. Plasmid DNA was prepared by a standard method.
  • Escherichia coli JE7924 (J. Bacteriol 173, p. 4799 (1991)) was recovered from the glycerol stock and cultured at 37 ° C. in LB medium. Further, the cells were re-inoculated into 50 mL of LB medium, cultivation was continued until the absorbance at 600 nm became 0.5 to 0.6, and the whole culture flask was ice-cooled for 30 minutes. Next, Escherichia coli was collected, and twice with ice-cooled sterile distilled water, and ice-cooled 10% After washing once with a glycerol solution, the suspension was suspended in 100 L of an ice-cooled 10% glycerol solution. Aliquots of 50 L each were placed in two tubes, rapidly frozen in liquid nitrogen, and prepared as a competent cell (JE7924) and stored at -80 ° C until use.
  • the cells were lysed, treated with a solution (US-3, Iuchi Seieido) for 10 minutes, centrifuged at 10,000 X g at 4 ° C for 20 minutes, and The precipitate was suspended again in 50 mL of Bug Buster, and 1 mL of lOmgZmL of lysozyme (Seikagaku Corporation) was added to the suspension. After leaving at room temperature for 10 minutes, adding 1/10 volume of high-concentration Bug Buster (200 mL) followed by stirring, centrifugation was performed in the same manner, and the supernatant was removed. The Bug Buster was suspended in suspension, centrifuged in the same manner, and this operation was repeated several times, and 100 mL of D-PBS was added to the finally obtained precipitate. ⁇ E, to obtain the inclusion bodies.
  • a solution US-3, Iuchi Seieido
  • rsCD14 For the preparation of rsCD14 (1-285), first, the inclusion body was treated with a TE buffer solution containing 1% TritonXlOO ( The mixture was thawed three times and centrifuged to collect the precipitate. It was again dissolved in a TE buffer solution (pH 8.0, Futaba Gene) containing 1% TritonXlOO, and after cooling with ice, sonication was performed at 250 A at 10-second intervals for 12 minutes, and the precipitate was collected after centrifugation.
  • a TE buffer solution pH 8.0, Futaba Gene
  • Monoclonal antibodies were prepared using rsCD14 (1-285) derived from Escherichia coli described above as an administration antigen.
  • rsCD14 1-285 derived from Escherichia coli described above as an administration antigen.
  • the abdominal cavity purified rsCD14 (l-285) of the ddy mice 6 weeks old female 20 8 of Freund's complete adjuvant (DIFCO) and were then mixed in equal amounts administered 200 mu L.
  • DIFCO Freund's complete adjuvant
  • 20 ⁇ g of purified rsCD14 (1-285) was mixed with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant (DIFCO), and 200 L was intraperitoneally administered.
  • 50 g of the antigen was administered to the peritoneal cavity of the mouse.
  • rsCD14 (l-285) was diluted to 0.4 gZmL with PBS (pH 6.4), and added to each well of Imunobrate (Maxisorb, NUNC) in a volume of 50 ⁇ L. After the reaction at 4 ° C, the plate was washed 5 times with ion-exchanged water, and 100 L of PBS (pH 6.4) containing 0.5% BSA was added to each well to perform blocking. The sampled culture supernatant was added to each well, reacted at 37 ° C for 1 hour, and washed three times with a physiological saline solution containing 0.05% Tween20.
  • a solution obtained by diluting a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (DAKO) 1000 times with PBS containing 10% egos serum was added to each well with 50 / zL. After reacting at 37 ° C for 1 hour, the well was washed 5 times in the same manner, and a tetramethylbenzidine solution (TMB. BioFix) was added to each well. After the reaction at room temperature for 10 minutes, the reaction was stopped with a 0.5 M sulfuric acid solution.
  • DAKO peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody
  • the absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed), and a well containing an rsCD14 (l-285) -producing antibody and containing a hybridoma was selected.
  • clawing was performed by the limiting dilution method in accordance with the method of monoclonal antibody experimentation by Tamie Ando and Takez Chiba, p. 83, 1991 (Kodansha) from the selected Pell.
  • screening was similarly performed using the reactivity to rsCD14 (l-285) as an index.
  • 12 types of anti-rsCD14 (1-285) monoclonal antibody-producing hybridomas were obtained.
  • the antibody was produced by culturing in Hybridoma-SFM medium (Invitrogen), and the antibody was purified using protein A (Prosep A, Millipore).
  • the subtype of the F1106-13-1-3 antibody which was highly reactive, was determined using the IsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit (Roche), and the subtype was IgG2b ⁇ ⁇ .
  • the F1031-8-3 antibody was prepared using the method described in Example 7 of WO01Z22085. Briefly, 20 g of CD14 protein in human blood was dissolved in saline, mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant (DIFCO), and the mice were intraperitoneally administered for the first time and two weeks later for the second time1 After one week, the increase in the antibody titer in the serum was confirmed by ELISA for the reactivity with the recombinant human CD14 protein in the same manner as in Example 5 of WO01Z22085. 100 g of the antigen was administered to the abdominal cavity of the mouse for final administration, and three days later, the spleen was removed.
  • DIFCO Freund's complete adjuvant
  • Lymphocytes were separated from the spleen, mixed with myeloma cells (P3 X 63—Ag. 8. U. 1) at a ratio of 10: 1, and subjected to cell fusion using polyethylene glycol.
  • Hybridomas were selected using the HAT medium, and one week later, screening of hybridomas producing antibodies for the purpose was performed by the ELISA method described above. After the reaction with the immobilized soluble CD14 antigen, the hybridomas and hybridomas were cloned by the limiting dilution method. After 10 days, the same screening was carried out to obtain an anti-CD14 protein monoclonal antibody.
  • the subtype determined using the IsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit is IgG2b' ⁇ 31-8-3 antibodies were obtained.
  • a sandwich EIA system was prepared using the antibodies described in Examples 1, 2, 3- (2).
  • Peroxidase-labeled antibody was prepared by dissolving 4 mg of peroxidase (Toyobo) in distilled water according to the method of Nakane et al. (J. Histochem. Cytochem., Vol. 22, p. 1084, 1974) and adding 100 mM periodate to the mixture. The reaction was performed at 25 ° C for 20 minutes. After completion of the reaction, 1.5% ethylene glycol was added, and the mixture was reacted at 25 ° C for 10 minutes, and dialyzed against ImM acetate buffer (pH 4.4).
  • Each of the purified F1031-8-3 antibody and F1106-13-3 antibody was dialyzed against 10 mM carbonate buffer (PH 9.5), and 70 L of 0.2 M carbonate buffer (pH 9.5) was added to 4 mg. 4 mg of peroxidase, which was added and activated, was mixed with the antibody in an equal amount, and reacted at 25 ° C. for 2 hours. Next, 4 mgZmL of sodium borohydride was added, and the reaction was further performed at 4 ° C for 2 hours.
  • the reaction solution is dialyzed against PBS, and a peroxidase-labeled F1031-8-3-3 antibody (hereinafter sometimes referred to as F1031-8-3-HRP) and a peroxidase-labeled F1106-13-3 antibody (hereinafter F1106-13-3) — Sometimes described as HRP).
  • F1031-8-3-HRP peroxidase-labeled F1031-8-3-HRP
  • F1106-13-3 peroxidase-labeled F1106-13-3 antibody
  • a two-step sandwich EIA system was prepared in which the S68 antibody prepared in Example 1 was used as a solid phase antibody and the antibodies prepared in Example 3- (2) [1] and [2] were used as labeled antibodies. That is, the S68 antibody was diluted to 10 g / mL with D-PBS (pH 7.4), and 50 ⁇ L of syrup was added to each well of an immunoplate (Maxisorb, NUNC). After the reaction at 4 ° C, wash with ion-exchanged water 5 times, and add 100 L of D—PBS containing 0.1% StabilGuard (SurModics, Inc) and 0.1% Tween20 to each well. Blocked.
  • 3C10 1% of normal human serum (serum from which soluble CD14 antigen was removed using 3C10, hereinafter referred to as CD14-absorbed serum, 3C10 was prepared from ATCC228-TIB hybridoma obtained from AmericanTypeCultureCollection), 0.1 Using PBS (pH 7.4) containing% BSA as a diluent, a diluted sample was prepared by diluting human normal human serum and human sepsis patient serum 20-fold. Dilution sample was applied 50 / zL was added thereto and reacted at 37 ° C for 2 hours.
  • the plate was washed three times with a physiological saline solution containing 0.05% Tween 20, and then washed with 76 mM PBS (pH 8.0) containing 5% rat serum, 1% mouse serum, and 0.1% Tween 20. 50 ⁇ L of the diluted F1031-8-3-HRP or F1106-13-3-HRP was added to each well at 6 gZmU. After reacting at 37 ° C for 2 hours, the plate was washed 5 times in the same manner, and a tetramethylbenzidine solution (TMB, BioFix) was added to each well.
  • TMB tetramethylbenzidine solution
  • a two-step sandwich EIA system was prepared using the F1146-17-2 antibody prepared in Example 2 as the solid phase antibody and the antibody prepared in Example 3- (2) [2] as the labeled antibody. .
  • the F1146-17-2 antibody was diluted with PBS (pH 6.4) at 120 / z g / mL and diluted with 50 ⁇ L of iminobrate (Maxisorb, NUNC) in each well. After reacting at 56 ° C for 30 minutes, wash 5 times with ion-exchanged water, and add 100 ⁇ L of PBS containing 0.1% StabilGuard (SurModics, Inc) and 0.1% Tween20 (Wako Pure Chemicals) to each well. I kneaded and blocked.
  • a diluted sample was prepared by diluting 10-fold human normal human serum and human sepsis patient serum using PBS containing 1% BSA (pH 6.4) as a diluent.
  • the diluted sample was added at 50 L per well and reacted at 25 ° C for 2 hours.
  • the plate was washed three times with a physiological saline solution containing 0.05% Tween20, and a 76 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 5% rat serum, 1% mouse serum, and 0.1% Tween20 was used.
  • the peroxidase-labeled F1031-8-3 antibody diluted to 0.5 ⁇ g, mL was added to each well with 50 ⁇ L of calo. After reacting at 25 ° C for 2 hours, the wells were washed 5 times in the same manner, and a tetramethylbenzidine solution (TMB, BioFix) was added to each well.
  • TMB tetramethylbenzidine solution
  • the reaction was stopped with a 0.5 M sulfuric acid solution, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed).
  • a plate spectrophotometer NJ-2100, Nippon Intermed.
  • the S68 peptide-specific monoclonal antibody like the S68 antibody, showed a high level in blood serum of sepsis patients, which was almost infrequent in normal human serum. White matter could be measured. That is, it was confirmed that a sandwich measurement system could be used whether the antibody binding to the S68 peptide was a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Example 1 In order to confirm the specificity of the S68 antibody prepared in Example 1, it was examined by the same measurement as in Example 3- (3) whether the antibody was blocked by the peptide. That is, the S68 peptide (amino acid sequence positions 53 to 68) and the synthetic peptide prepared in the same manner as in Example 1 (amino acid sequence positions 53 to 58, amino acid sequence) were added to 25 ⁇ L of a 50-fold diluted solution of sepsis patient serum and normal human serum. Sequences 57-62, amino acid sequences 59-64) or a peptide for negative control (Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys) are diluted to 0, 0.1, 1, and 10 gZmU.
  • the amount of the soluble protein in the serum of a sepsis patient and the serum of a normal individual bound without being blocked by the S68 antibody was measured.
  • the specificity and reaction rate constant of the S68 antibody prepared in Example 1 and the F1146-17-1 antibody prepared in Example 2 were analyzed using Biacore3000 (Biacore).
  • the S68 peptide BSA to be immobilized was prepared using maleimide-immobilized BSA (Imject Maleimed Activated BSA, PIERCE) in the same manner as described in Example 1.
  • S68 peptide-BSA was immobilized on a sensor chip CM5 (Biacore) using an amine coupling kit (Biacore).
  • the measurement was performed using HBS-EP (Biacore) as a running buffer and injecting a dilution series (50, 100, 150, 200, 300 nM) of the F1146-17-2 antibody into the flow cell.
  • Data analysis was performed by subtracting the reference cell data from the flow cell measurement data of S68 peptide BSA and using Biaevaluation soft wear version 3.0 (Biacore).
  • KD dissociation constant
  • the F1146-17-1-2 antibody showed a high affinity of 4.8 ⁇ 10 9 M.
  • KD of the measured similarly specifically purified Usagi S68 peptide polyclonal antibody is 2. was 2 X 10- 1Q M.
  • the amino acid sequence of CD14 was analyzed using a peptide library membrane (Custom SPOTs, Sigma Genosys) synthesized from the N-terminal side by 10 amino acids. That is, after blocking the membrane according to the manual, the F1106-13-3 antibody was reacted, and after washing, a ⁇ -galactosidase-conjugated anti-mouse antibody was reacted. After washing the membrane, the peptide sequence to which the antibody binds was detected using X-gal.
  • peptide sequence of the peptide library membrane 19 peptides were synthesized for the amino acid sequence from the 1st to the 154th position by synthesizing two amino acids at the C-terminus by 10 amino acids.
  • the peptide was prepared in the same manner as in Example 1- (1).
  • the F1106-13-3 antibody was found to have amino acids 17 to 26 from the N-terminus of high molecular weight CD14. It was found to bind to the region corresponding to the acid sequence (CNFSEPQPDW).
  • Example 3- To confirm the specificity of the F1031- 8- 3 antibody in Example 3- (1) derived from E. coli r 5 Ji 014 (1-285) as described and 1 ⁇ ⁇ 001,772,993 of JP Examples 8 and 9 The binding activity was measured using rsCD14 (1-356) and rsCD14 (1-307) S286C prepared by COS cells using the method described.
  • rsCD14 (l-356), rsCD14 (1-307) S286C, rsCD14 (1-285) or BSA was immobilized on Hybond-C extra (Amersham Bioscience) at 250 ngZ spot on the membrane. After shading and drying, blocking was performed with 0.05% Tween 20, PBS (pH 6.4) containing 0.05 g ZmL of skim milk (Meiji Dairies). After standing at room temperature for 1 hour, the F1031-8-3 antibody diluted to 3 / z gZmL with 0.05% Tween20 containing 0.5% BSA and PBS (pH 6.4) was added, and reacted at room temperature for 1 hour. The plate was washed with% Tween 20, PBS (pH 6.4).
  • the binding region (epitope) of the F1031-8-3 antibody was analyzed. That is, a blocking test was carried out with the F1106-13 antibody using the sandwich EIA system of Example 3- (3) [2] using the S103 antibody as the labeled antibody and the F1031-8-3-HRP as the solid phase. .
  • Example 3- (3) [2] the standard product lOOngZmL was added to the S68 antibody solid-phase plate and allowed to react. After washing the plate and before adding F1031—8—3—HRP, add 25 ⁇ L of buffer containing 6 gZmL of F1106—13-3 antibody, mouse IgG antibody or antibody! /, And then add F1031— 8-3-HRP antibody was added in an amount of 25 ⁇ L, and the measurement was carried out in the same manner as in Example 3- (3) [2].
  • the mouse IgG antibody-added syrup did not inhibit the binding, whereas the F1106-13-3 antibody inhibited the binding between F1031-8-3 and the standard. From this, it was considered that at least a part of the region recognized by the F1031-8-3 antibody had a region recognized by the F1106-13-3 antibody.
  • the “inhibition rate” in Table 3 was calculated from the respective reduced absorbances when the absorbance of the buffer alone was taken as 100%.
  • Example 3- (3) shows a configuration example of a soluble protein kit using a combination of a solid phase antibody and a labeled antibody, which showed a high value in the measurement of a sepsis patient and a low value in the measurement of a normal person.
  • Solid-phase antibody S68 antibody-immobilized plate
  • Table 4 shows an example of the configuration of a sandwich EIA-based measurement kit, prepared as described in 7- (1).
  • ⁇ 1> indicates the binding substance immobilized on the plate.
  • ⁇ 2> indicates a labeled binding substance.
  • the components No. 3> to No. 7> and the measuring device of the reference example No. 8> are the same as 7- (1).
  • ⁇ 9> indicates an antibody to which the second specific binding substance has bound. "-" Indicates no description.
  • Example 3- (3) measurement was performed in the same manner as in Example 3- (3) [2]. That is, the S68 antibody was diluted to ⁇ g / mL with D-PBS (pH 7.4), and 50 ⁇ L was added to each well of an immunoplate (Maxisorb, NUNC). After incubating at 4 ° C, wash 5 times with ion-exchanged water. Add 100 L of D-PBS containing 0.1% StabilGuard (SurModics, Inc) and 0.1% Tween20 to each well. And blocked.
  • soluble CD14 antigen derived from normal human serum at a concentration of 0 to 4 ⁇ g ZmL was added to CD14 (1–307) S286C standard. It was added to the sample and measured in the same manner as in (12). As a result, as shown in FIG. 3, soluble CD14 antigen derived from normal human serum did not affect the measured value even at 4 ⁇ g ZmL. From these results, it was evident that the cross-reactivity with the high molecular weight CD14 in this sandwich EIA system was 0.3% or less. In other words, it is confirmed that this system is specific for soluble protein, which does not detect human serum high molecular weight CD14 and shows a high level in the serum of sepsis patients.
  • the reproducibility of the measurement results by the kit of (1) was evaluated. Use three types of specimens as in (12) The coefficient of variation (CV) of the simultaneous reproducibility was 5.8, 3.6, 3.5%, and the reproducibility between measurements was 6.2, 5.2, 5.1%. In addition, the recovery rate of the spiked katsuna recovery test was as good as 88-109%, and no effect of anticoagulants (heparin, citrate, EDTA) was observed. From the above results, it was shown that this kit has sufficient performance for measuring the soluble protein in blood.
  • Example 7 In order to analyze the substances in the septic patient serum detected by the measurement kit described in (1), the septic patient serum was subjected to SMART SYSTEM (Amersham Bioscience) using a gel filtration chromatography column Superdex 200PC3.2ZZ30 (Amersham Bioscience). No.Science) and fractionation using D-PBS as a developing solvent, and measure each fraction using the measurement kit described in Example 7- (1) and the CD14-EIA kit (IBL-Hamburg) on the market. did.
  • the molecular weight was calculated using the aldolase (158 kDa), BSA (67 kDa), ovovalbumin (43 kDa), and chymotrypsin (25 kDa) of the LMW calibration kit and HMW calibration kit (Amersham Biosciences). I went for a calibration.
  • the soluble CD14 antigen with a molecular weight of about 57 kDa was detected in the commercially available CD14-EIA kit, and was determined to be the 49-55 kDa high molecular weight soluble CD14 antigen, which has been reported previously.
  • the kit described in Example 7- (1) a peak was detected around 35 to 45 kDa in molecular weight, and no peak was detected in the vicinity of 57 kDa. It was confirmed that the described kit specifically detected only the soluble protein present in blood.
  • the serum 501 of a sepsis patient was subjected to gel filtration chromatography column Superdex 75 10/300 GL (Amersham Bioscience) to develop 200 mM ammonium acetate (pH 6.8) as a developing solvent. And measured using each kit.
  • the molecular weight was calculated using the LMW calibration kit and the HMW calibration kit (Amersham Bioscience) for BSA (67 kDa), ovoanolebumin (43 kDa), The column was calibrated with trypsinogen (25 kDa) and ribonuclease A (13.7 kDa).
  • Figure 5 shows the results.
  • a peak derived from the soluble protein was detected around 25 to 35 kDa in molecular weight.
  • fraction 12 When the fraction of the peak derived from the soluble protein obtained in ⁇ 2> (for example, fraction 12) is subjected to F1025-3-1 antibody affinity column chromatography, the soluble fraction is obtained. The peak derived from the protein is eluted in the affinity column non-adsorbed fraction.
  • the preparation and implementation of the F1025-3-1 antibody affinity column can be performed according to the method described in Example 10 in WO01Z22085.
  • WO01Z72993 described in Example 2 as Example 2 and prepared F1024-1-3 antibody (as described above, No. and Ibridomas have been deposited under accession number FERM BP-7511). 55 mg was added to 20 ml of ECH-Sepharose. 4B (Amersham Biosciences) was added to the mixture, and water-soluble carbodiimide (Dohin-Danigaku Kenkyusho Co., Ltd.) was added to a final concentration of 0.1 M, and a coupling reaction was carried out at 4 ° C overnight. Next, after washing with 0.1 M sodium acetate (pH 5.0), unreacted F1024-1-3 antibody was recovered.
  • the coupling efficiency was determined by measuring the absorbance at 280 nm of the antibody solution and the washing solution before the coupling reaction (converted value: 0.714 mg ZmL). As a result, the coupling efficiency of the F1024-1-3 antibody was 55%, and it was found that 1.5 mg of the F1024-1-3 antibody was bound per 1 ml of the carrier.
  • Example 18 Using a dialysis membrane (Spectrum) having a molecular weight cutoff of 18 mg of the S68 antibody prepared in Example 1- (4), 0.2 M NaHCO containing 2.5 L of 0.5 M NaCl (p H8.3) was dialyzed overnight at 4 ° C as a dialysate. The dialysate was changed three times. Next, 8 mL of Equilibrated with 0.2 M NaHCO (pH 8.3) containing 0.5 M NaCl in advance
  • SDS-PAGE was performed using 12.5% gel according to the method of Laemmli (Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly or the head of bacteriophage ⁇ 4. Nature. 1970 Aug 15; 227 (259): 680-5.) Performed under non-reducing conditions. That is, 1 volume of Tris-SDS-Separsol (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) was added to 2 volumes of the sample, and the mixture was heated at 100 ° C for 5 minutes. And run for 90 minutes at a constant current of 25 mA using Laemmli's discontinuous buffer system.
  • Laemmli Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly or the head of bacteriophage ⁇ 4. Nature. 1970 Aug 15; 227 (259): 680-5.
  • the gel was stained with a silver staining kit 2D silver staining reagent ⁇ “Daiichi” (Daiichi Pure Chemicals, Ltd.).
  • a silver staining kit 2D silver staining reagent ⁇ “Daiichi” (Daiichi Pure Chemicals, Ltd.).
  • Bio-Rad Bio-Rad
  • the filter paper pre-soaked in the same solution was overlapped so as to prevent air bubbles from entering
  • the filter paper soaked in 5% methanol Z300 mM Tris was overlapped so as to prevent air bubbles from entering.
  • a positive electrode was placed thereon, and transfer was performed at 2 mA / cm 2 for 2 hours at room temperature. After the transfer was completed, the nitrocellulose membrane was immersed in Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and a blocking operation was performed at 37 ° C. for one hour.
  • the trocellulose membrane was reacted with 10 ml of 6.8871111 antibody 1031-8-3-3 at 37 ° C for 2 hours.After washing with 0.05% Tween20ZPBS, anti-mouse IgG antibody (HRP conjugation HDAKO AZS) and 37 ° C C, reacted for 1 hour. After the reaction was completed, the nitrocellulose membrane was washed with 0.05% Tween20ZPBS. After washing away the unreacted conjugate, the conjugate was immersed in 50 ml of TMB-H (Moss. Inc.) diluted 2-fold with distilled water and emitted light at 4 ° C.
  • TMB-H Moss. Inc.
  • the serial column was supplied with 18 mL of sepsis patient serum at a flow rate of 0.02 mL Zmin. After washing the protein not adsorbed to the column with D-PBS (pH 7.4) containing 0.05% Tween20, the S68-Sepharose 4FF column was removed, and the protein adsorbed to the S68-Sepharose 4FF column was washed with 0.05%. Elution was carried out with 10 mM HC1 containing% Tween 20 at a flow rate of 0.2 mL Zmin, and 10 2 mL fractions were collected. Each fraction container was preliminarily charged with 200 L of 500 mM ammonium bicarbonate ammonium, and the pH of the eluate was immediately returned to neutral.
  • the concentration of the soluble protein in the blood detected by the kit of Example 7- (1) in each fraction was measured, and the fraction containing the protein was pooled and freeze-dried. [0296] After the freeze-drying was completed, 0.2 mL of a 150 mM ammonium acetate solution containing 0.05% Tween 20 was dissolved in the freeze-dried powder, and the solution was centrifuged at 3,500 X g for 10 minutes. The supernatant was subjected to gel filtration using Superdex75 10Z300GL (Amersham-Biosciences).
  • each fraction was measured using the kit of Example 7- (1) and a commercially available CD14-EIA kit (IBL-Hamburg).
  • the soluble protein in blood detected by the kit of Example 7- (1) was observed in fractions 11 to 13 having a peak in fraction 12, and from 18 ml of serum of septic patient, 1 .: Lg Blood soluble protein was obtained. The peak of the protein was located at 29 ⁇ 5 kDa.
  • BSA 67. OkDa
  • Ovalbumin 43.0 kDa
  • ChymotrypsinogenA 25. OkDa
  • RibonucleaseA (13.7 kDa
  • Example 9- (1) 20 mL of F1024-1-3-Sepharose 4 B carrier prepared in Example 9- (1) was packed in an XK column 26/20 column (Amersham-Biosciences), and D-PBS containing 0.05% Tween20 was added. (pH 7.4).
  • 8 ml of S68-Sephaorse 4FF carrier prepared in Example 9- (2) was applied to an XK column 16/20 column (Amersham-Biosciences Packed in), equilibrated I spoon at Similarly containing 0. 05% T W een20 D- PBS (pH7. 4).
  • the container to be separated was preliminarily added with 2 mL of 500 mM ammonium bicarbonate, and the pH of the eluate was immediately returned to neutral.
  • the concentration of the soluble protein in the blood detected by the kit of Example 7- (1) in each fraction was measured, and the fraction containing the protein was pooled and freeze-dried.
  • the freeze-dried powder was dissolved by adding lmL of a 150mM ammonium acetate solution containing 0.05% Tween20, and the mixture was filtered through a filter having a pore size of 0.22 ⁇ m (Mylex GV13, Millipore). — Biosciences) for gel filtration.
  • a 150 mM ammonium acetate solution containing 0.05% Tween 20 as a developing solution, 0.5 mL of the sample was applied to the column, and gel filtration was performed at a flow rate of 0.8 mL Zmin.
  • Example 7- (1) Each fraction was measured using the kit of Example 7- (1) and a commercially available CD14-EIA kit (IBL-Hamburg). As a result, the soluble protein in blood detected by the kit of Example 7- (1) was observed in fractions 11 to 13 having a peak in fraction 12. The peak of the protein determined in the same manner as in Example 9- (4) was located at 29 ⁇ 5 kDa.
  • the blood soluble protein detected in the kit of Example 7- (1) lyophilized in Example 10- (1) was developed on an acrylamide gel by SDS-PAGE described in Example 9 (3). Thereafter, electroblotting was performed on a polyvinylidene fluoride (hereinafter, PVDF) film. That is, a filter paper immersed in a 20% methanol Z25 mM TrisZ40 mM ⁇ -aminocaproic acid solution is placed on the cathode of a platinum electrode semi-dry transfer (Viocraft Inc.) as a transfer device, and acrylamide gel after electrophoresis and PVD F The membranes (Clear Blot Membrane P (Atoichi Co., Ltd.)) were placed on top of each other.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the PVDF membrane after electroblotting is immersed in 0.1% Coomassie brilliant blue G250 / 10% acetic acid Z30% acetonitrile solution for about 5 minutes, and then appropriately decolorized with 10% acetic acid 30% acetonitrile solution to detect proteins. did.
  • the protein band with a molecular weight of 13 ⁇ 2 kDa detected on the PVDF membrane was cut out with a clean cutter knife and transferred to a 1.7 mL microcentrifuge tube.
  • the cut-out PVDF membrane fragment was washed three times with a 0.1% trifluoroacetic acid Z50% methanol solution, further washed with methanol, and completely dried.
  • a protein sequencer Procise494 cLC (Applied Biosystems Japan) was used. After washing, the PVDF membrane fragment was set on the inlet tin sequencer, the necessary analysis cycle was set, and analyzed.
  • Xaa may be Cys, Asn, Ser, Thr or other modified amino acids due to the properties of the protein sequencer.However, considering that it is a protein derived from the protein SCD14, it is Cys. it is conceivable that. In addition, it can be determined that Xaa is Cys in the amino acid analysis by the reduced alkylation method.
  • the blood soluble protein detected by the kit of Example 7- (1) has an amino acid sequence Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu at the N-terminus from the first residue of CD14. On SDS-PAGE under non-reducing conditions, the protein was found to be a novel protein having a molecular weight of 13 kDa and 2 kDa. In addition, since it is detected by the kit of Example 7- (1), it is likely that the peptide specifically having 16 amino acid residues described in SEQ ID NO: 2 binds to an antibody prepared using the peptide as an antigen.
  • the distribution was 008-0.100 / z g / mU, and the average value was 0.04 g / mL. In sepsis, it was distributed between 0.190 and 7.260 / z g / mL, with an average value of 2.2.0 / z g / mL.
  • the soluble protein concentration was higher in septic patients than in normal individuals and patients with various diseases, and no disease showing higher values in patients with various diseases than in normal individuals was found.
  • Example 11 The sample of Example 11 was measured using a commercially available CD14-EIA kit (IBL-Hamburg).
  • the concentration of soluble CD14 protein in serum is from 5.6 to: L 1.2 gZmL in normal subjects, High cases were observed in patients with sepsis. However, there were many cases in which the soluble CD14 protein was high in the sera of patients with various diseases, and there was no difference from the sera of septic patients.
  • Example 7 A comparative study was performed with the measured value of the soluble protein measured in Example 11. As shown in Table 6, the CD14—EIA kit for normal sales showed a maximum difference of about 1.7 times between normal, various diseases, and sepsis, whereas the measurement kit of Example 7— (1) showed normal individuals. There is no difference between the disease and various diseases, but there is a 50-fold difference between the normal person and sepsis, and the measured value of the measurement kit of Example 7- (1) is specifically increased in sepsis It became clear.
  • Example X 100 was calculated, and as shown in Table 8, the kit of Example 7- (1) showed that the match rate was 94.3%, the sensitivity was 100.0%, the specificity was 93.8%, and the cutoff value was It has been clarified that setting is useful for differential diagnosis of sepsis. On the other hand, commercially available CD14-EIA did not have the specificity and usefulness to diagnose sepsis in both sensitivity and specificity. [0315] [Table 7] Table 7
  • Example 10 The purpose was to express the soluble protein in blood purified in Example 10 (hereinafter, sometimes referred to as a soluble CD14 subtype or its abbreviation as low-molecular-weight sCD14-ST) as a recombinant protein. .
  • rsCD14-ST a recombinant soluble CD14 fragment
  • CD14 (1-65), the same applies hereinafter
  • the molecule at position 106 also lacks the C-terminus (CD14 (1-105)),
  • the plasmids expressing pCAG65, pCAG70, pCAG75, pCAG80, pCAG85, pCAG90, pCAG95, pCAG100, pCAG105, and pCAGllO expressing E. coli in Euyu cells were constructed in the following manner.
  • Sense primer 1 (5,-TTT CCT ACA GCT CCT GGG-3,) (SEQ ID NO: 11) and antisense primer 1 (5 GG GGT ACC TTA GTC AGC ATA CTG CCG CGG GTC-3,) (SEQ ID NO: 12)
  • Antisense primer 2 (5, -GG GGT ACC TTA GAG AGC CTT GAC CGT GTC AGC-3,) (SEQ ID NO: 13)
  • antisense primer 3 (5, -GG GGT ACC TTA GAG CCG CCG CAC GCG GAG AGC- 3,) (SEQ ID NO: 14), antisense primer 4 (5, —GG GGT ACC TTA TGC GGC TCC CAC TGT GAG
  • antisense primer 5 (5, -GG GGT ACC TTA CTG AGC AGG AAC CTG TGC GGC-3,) (SEQ ID NO: 16)
  • antisense primer 6 (5, -GG GGT ACC TTA GGC GCC TAC CAG TAG CTG AGC-3,) (SEQ ID NO: 17)
  • antisense primer 7 (5 GG GGT ACC TTA CGC TAG CAC ACG CAG GGC
  • antisense primer 8 (5, -GG GGT ACC TTA CTT GAG GCG GGA GTA CGC TAG-3,) (SEQ ID NO: 19), antisense primer 9 (5, -GG GGT ACC TTA CTC GAG CGT CAG TTC CTT GAG-3,) (SEQ ID NO: 20) and And antisense primer 10 (5, -GG GGT ACC TTA GGT TAT CTT TAG GTC CTC GAG-3 ') (SEQ ID NO: 21) were designed.
  • pCAG356 was transformed into a type I sense primer 1 and antisense primer 1, sense primer 1 and antisense primer 2, sense primer 1 and antisense primer 3, sense primer 1 and antisense primer 14, and sense primer 1 Antisense primer 5, Sense primer 1 and antisense primer 6, Sense primer 1 and antisense primer 7, Sense primer 1 and antisense primer 8, Sense primer 1 and antisense primer 9, or Sense primer 1 and antisense primer PCR was performed with each of the 10 primer sets.
  • the PCR reaction conditions were heating at 90 ° C for 2 minutes, and then a cycle of ⁇ 1> 98 ° C for 10 seconds, ⁇ 2> 50 ° C for 30 seconds, and ⁇ 3> 72 ° C for 1 minute was repeated 30 times.
  • pCAG356 is a plasmid in which the CD14 gene derived from the plasmid PUCH14P-4 described in W098Z39438 is inserted into pCGAAS (GENE, vol.15, p269-277 (1989)).
  • rsCD14-ST having a ProScision Protease recognition sequence (8 amino acid residues of LEVLFQGP, one-letter code) inserted between Ala at position 64 and Asp at position 65 of human CD14 described in SEQ ID NO: 3 (PSP64Z356)
  • Plasmid was constructed by the following method.
  • Sense primer 1 (5'—TTT CCT AC A GCT CCT GGG—3,)
  • Sense primer 2 (5, one GCT CTG GAA GTT
  • the plasmid PCAG356 into which the soluble human CD14 structural gene sequence was inserted was subjected to PCR using type A: sense primer 1 and antisense primer 11; and B: sense primer 2 and antisense primer 12.
  • the PCR reaction conditions are: A: Heat at 90 ° C for 2 minutes, then ⁇ 1> 98 ° C for 10 seconds, ⁇ 2> 50 ° C for 30 seconds, 3> 72 ° C for 1 minute 30 times, B: After heating at 90 ° C for 2 minutes, a cycle of ⁇ 1> 98 ° C for 10 seconds, ⁇ 2> 46 ° C for 30 seconds, and ⁇ 3> 72 ° C for 1 minute was repeated 30 times.
  • the PCR reaction conditions were the same as in A above.
  • the obtained PCR amplification product of about 0.9 kb was recovered and cut with restriction enzymes EcoRI and Xhol. This fragment was ligated with an approximately 5.2 kb fragment obtained by cutting pCAG356 with restriction enzymes EcoRI and Xhol, and E. coli JM109 was transformed according to a standard method.
  • the obtained expression plasmid was designated as pCAG356 (PSP64Z356).
  • pCAG356 was digested with restriction enzymes EcoRI and Kpnl, and a fragment of about 1.3 kb was recovered. This fragment is ligated with an approximately 4.4 kb fragment obtained by digesting the mammalian cell expression vector pTK-2043 having the human EF-1 ⁇ promoter with EcoRI and Kpnl, and transforming E. coli JM109 according to a standard method. Thereby, pTK356 (PSP64 / 356) was obtained.
  • rsCD14-ST (2ST64Z356, and the like) having a Thrombin recognition sequence (6 amino acid residues of LVPRGS) inserted between Ala at position 64 and Asp at position 65 of human CD14 described in SEQ ID NO: 3.
  • the plasmid that expresses the gene was constructed by the following method: Sense primer 3 (5, one CTG GTT CCG CGT GGT TCC GAC ACG GTC AAG-3 ') (SEQ ID NO: 25), antisense primer 13 (5, --GA A CCA CGC GGA ACC AGA GCA TAC TGC CGC-3,) (SEQ ID NO: 26), antisense primer 14 (5, — CGG GAT CCT CAA TGA TGA TGA TGA TGA TGG — 3 ′) (SEQ ID NO: 27) were designed and synthesized, and His tag (6 His Xs) was added to the C-terminus of soluble human CD14 of plasmid PCAG356.
  • PCAG356-His having the structural gene sequence of the isolated molecule was subjected to PCR using A: sense primer 1 and antisense primer 13, and B: sense primer 3 and antisense primer 14.
  • the PCR reaction conditions were as follows: After heating at 96 ° C for 2 minutes, a cycle of ⁇ 1> 96 ° C for 30 seconds, ⁇ 2> 55 ° C for 30 seconds, and ⁇ 3> 72 ° C for 1 minute was repeated 25 times.
  • the obtained PCR amplification products A: about 0.5 kb and B: about 0.9 kb were recovered, and the mixture of these two was subjected to PCR using sense primer 1 and antisense primer 4 in the form of ⁇ .
  • the PCR reaction conditions were the same as in A above.
  • the obtained PCR amplification product of about 1.4 kb was recovered, inserted into a pT7-Blue (T) vector, and after confirming the nucleotide sequence, digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI.
  • the obtained 1.3 kb fragment was ligated with an approximately 4.4 kb fragment obtained by digesting pTK-2043 with EcoRI and BamHI, and transformed into E. coli JM109 according to a standard method to obtain pTK356H (TB643). ).
  • Each plasmid described in (1) was transfected into COS-1 cells (ATCC: CRL-1650) using Fugene6 (Roche). That is, according to the manual, 1. LZmL of the transfection reagent and 4 / z gZmL of plasmid were mixed, added to the medium, added to COS-1 cells, and cultured at 37 ° C. After 72 hours, the culture supernatant was collected. The culture supernatant was centrifuged and then filtered through a 0.22 m filter.
  • Plasmids (pTK356 (PSP64 / 356) and pTK356H (TB64)) containing the genes encoding the rsCD14-ST sequences described in (2) -1 and (2) -2 were added to COS-1 cells using Fuge ne6 ( Roche). That is, 1.7 ⁇ L ZmL of the transfection reagent and 4 ⁇ g ZmL of the plasmid were mixed according to the manual and added to the medium. Thereafter, the cells were added to COS-1 cells and cultured at 37 ° C. After 72 hours, the culture supernatant was collected, a new medium was added, and the cells were further cultured for 96 hours. After centrifugation, the culture supernatant was filtered through a 0.22 m filter and used for purification.
  • Each culture supernatant produced in step 2 was purified from 5014014-3 to 3 ⁇ 647356) and 5014014-3T (2ST64Z356), cut with proteolytic enzymes, and purified from sCD14-ST. .
  • Tris-SDS-Seprasol (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) is added to each fraction, and the mixture is heated at 100 ° C for 5 minutes, and then 5-20% e-PAGEL gel (Atoichi Co., Ltd.) ) And electrophoresed at 25 mA for 90 minutes under non-reducing conditions according to the method of Laemmli. After completion of the electrophoresis, the gel was stained with a silver staining kit 2D silver staining reagent ⁇ ⁇ “Daiichi” (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.). The 2ST64 standard was dialyzed overnight against distilled water to obtain a final purified standard.
  • the protein concentration of the final purified sample was measured according to the method described in Example 15- (3) described later.
  • 452 g of rsCD14-ST (2ST64) was obtained from 1000 mL of COS-1 culture supernatant.
  • the purity of the obtained purified sample was confirmed by SDS-PAGE, it was detected as a single band as shown in FIG.
  • the COS-1 culture supernatant obtained in -2 was applied to a 3C10-Separose 4FF column previously equilibrated with PBS at a flow rate of 9 mL Zmin, and the non-adsorbed protein was washed with PBS, and then washed with 10 mM HC1. The adsorbed protein was eluted. The eluted fraction was added with 1Z10 volume of 500 mM ammonium bicarbonate ammonium carbonate to return the pH to neutral, and then lyophilized.
  • the 3C10-Sepharose 4FF column was prepared as follows. Using a dialysis membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa, use the 3C10 antibody with 0.2 M NaHCO (pH 8.3) containing 2.5 L of 0.5 M NaCl.
  • Dialysis was performed at 4 ° C as a dialysate. The dialysate was changed three times. Next, NHS-Activate previously equilibrated with 0.2 M NaHCO (pH 8.3) containing 0.5 M NaCl
  • the carrier was washed.
  • the obtained lyophilized sample was dissolved in a 50 mM Tris-HCl (pH 7) buffer containing 1 mM EDTA and 150 mM NaCl, and the protein concentration was determined by the method described in Example 15- (3) below. It measured according to. Then, PreSsion Protease (Amersham Bioscience) was added so that the enzyme: substrate ratio was 1: 3 (U: / z g), and a 4 ° C.- ⁇ cleavage reaction was performed.
  • the rsCD14-ST (PSP64) preparation was dialyzed against distilled water overnight to obtain a final purified preparation.
  • the protein concentration of the final purified sample was measured according to the method described in Example 15- (3) described later. By the above operation, 13,000 mL of COS-1 culture supernatant was obtained and 368 ⁇ g of PSP64 was obtained. Further, the purity of the obtained purified sample was confirmed by SDS-PAGE, and as a result, it was detected as a single band as shown in FIG.
  • Example 14 Concentration measurement using the kit of Example 7- (3) To confirm whether rsC14-ST was produced in the culture supernatant prepared in Example 13- (3) -1 rsCD14-ST in each culture supernatant using the kit of Example 7- (3) The concentration was measured. Table 9 shows the results. Western blotting of each culture supernatant by the method described in Example 9- (4) showed that no band was detected. From this fact, rs C D14- ST was judged to be very small as a force actual ⁇ white amount is detected with a detectable kits with high sensitivity are produced.
  • Deletion example: 1-65 is a fragment of positions 1 to 65 of SEQ ID NO: 3 (rs).
  • the gel was immersed in a Tris / 40 mM ⁇ -aminocaproic acid solution and placed on a cathode electrode plate of a platinum electrode semi-dry transfer ⁇ 320 (Biocraft), and the gel was immersed in the same solution and overlapped on a filter paper so that air bubbles did not enter. Then, a trocellulose membrane (Trans-Blot Transfer-Medium, Bio-Rad) equilibrated with 5% methanol Z25mM Tris in advance was used. The gel was overlapped so that no air bubbles entered the gel. Further, the filter paper was soaked in advance in the same solution, and the filter paper was layered so as not to cause air bubbles.
  • a trocellulose membrane Trans-Blot Transfer-Medium, Bio-Rad
  • the filter paper soaked in 5% methanol Z300 mM Tris was stacked so that air bubbles did not enter.
  • An anode electrode was placed thereon, and transfer was performed at room temperature for 2 hours at 2 mAZcm 2 .
  • the nitrocellulose membrane was immersed in Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and a blocking operation was performed at 37 ° C. for 80 minutes.
  • the -trocellulose membrane is then reacted with 6.8 / z gZml F1106-13-3 antibody, 6.gZml F1031-8-3 antibody or 6.8 g / ml S68 antibody at 37 ° C for 80 minutes.
  • the trocell membrane was made of anti-mouse Igs antibody HRP conjugate (DAKO) and S68.
  • the nitrocellulose membrane reacted with the antibody was reacted with an anti-Egret IgG antibody HRP conjugate (DAKO) at 37 ° C for 1 hour each.
  • the nitrocellulose membrane was washed with 0.05% Tween20 / PBS. After washing away the unreacted conjugate, add 4 mL of ECL (Plus) (Amersham Bioscience), react at room temperature for 5 minutes, and overlay on HyperfilmTM ECL (Amersham Bioscience). Exposure for seconds.
  • rsCD14-ST (2ST64) and rsCD14-ST (PSP64) prepared in Example 13- (3) -3 were analyzed.
  • the two fragments are substantially the same as rsCD14-ST, except for the proteolytic enzyme used for cleavage, except for the final purified product.
  • N-terminal amino acid sequence analysis was performed using a protein sequencer Procise494cLC (Applied Biosystems Japan). After purification of the purified rsCD14-ST (2ST64) sample, the amino acid sequence of the first residue of CD14 (TTPEPCELDDG) (SEQ ID NO: 1) was confirmed as a main component. No amino acid sequence other than CD14 was identified.
  • the sample for mass spectrometry and the matrix solution were mixed at a ratio of 1: 4, and 1 ⁇ L was used for mass spectrometry.
  • mass spectrometry a molecular weight peak corresponding to the theoretical molecular weight of 7663.5 of the peptide portion of rsCD14-ST (2ST64) was detected as a main peak.
  • N-terminal amino acid sequence analysis it was confirmed that a molecule having a primary structure as designed (a molecule having amino acid sequence power from the 1st to 64th positions of CD14) was obtained.
  • the protein concentration was measured using a BRP Atssay kit (Bio-Rad) and a BSA (Bio-Rad) standard according to the attached manual. That is, 5 mL of Dye-Reagen tl. Diluted 5 times with distilled water was added to 30 ⁇ L of a sample diluted to various magnifications with a BSA standard solution and PBS, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes. The absorbance at 595 nm was measured with a spectrophotometer DU-7400 (Beckman), and the calibration curve force of BSA was also measured for the protein concentration in the sample.
  • Example 10- (1) As a purified sample of sCD14-ST having normal human serum ability, the freeze-dried sample obtained in Example 10- (1) was dissolved in 100 1 of distilled water.
  • the concentration of rsCD14-ST (2ST64) prepared in Example 13- (3) -3 was measured using the kit of Example 7- (1) and rsCD14 (l-307) S286C standard, and the concentration per protein concentration was measured. Calculated as EIA value. That is, rsCD14-ST (2ST64) was diluted to g ⁇ gZmL with a sample diluent from the kit, and then 50 and 25 pgZmL were prepared and measured with the kit. As a result, the rsCD14 (l-307) S286C conversion value per sC D14-ST (2ST64) lpg was 352 pg, indicating that the kit was extremely reactive with rsCD14-ST (2ST64).
  • rsCD14 the ability of ST to bind LPS as well as full-length CD14
  • rsCD14-ST (PSP64) has the ability to bind LPS, JBC, Vol.270, No.3 (1995), pp.1382-1387, "Soluble CD14 Truncated at Amino Acid 152 Binds LPS and Enables Cellular Response to LPS" was used as a reference and examined using an endoscope kit (Seikagaku Corporation). That is, LPS (E. Coli 055: B5, DIFCO) was diluted with PBS containing 0.01% BSA (hereinafter referred to as 0.01% BSAZPBS) to prepare a 0.6 ng ZmL LPS solution.
  • LPS E. Coli 055: B5, DIFCO
  • PBS containing 0.01% BSA hereinafter referred to as 0.01% BSAZPBS
  • rhLBP (R & D Systems) is diluted to 100 gZmL with PBS containing 0.1% HSA, mixed with the above LPS solution, and LPSZLBP solution (LPS concentration is about 0.6 ng / mL, LBP concentration is about 0. 3 nM) was prepared.
  • LPSZLBP solution LPS concentration is about 0.6 ng / mL, LBP concentration is about 0. 3 nM
  • rsCD14-ST PSP64
  • rsCD14 l-356
  • Endo-C lysate Endo-ES ES-24S set; Seikagaku Corporation
  • the reaction was stopped by adding 25% acetic acid, the absorbance was measured at 405 nm, and the LPS concentration in the reaction solution (hereinafter referred to as free LPS concentration) was calculated.
  • the calibration curve was prepared by performing the same operation as the above sample after reacting only the LPS diluted solution at 37 ° C for 1 hour.
  • the amount of free LPS decreased in rCD14 (l-356) depending on the concentration added, and the force at which the binding of rCD14 (l-356) and LPS was confirmed rsCD14-ST (PSP64) increased to 100 nM.
  • the amount of free LPS did not change even after polishing, indicating that rsCD14-ST (PSP64) had no LPS binding ability.
  • a standard curve was prepared using rsCD14-ST (2ST64) prepared in Example 13- (3) -3. That is, rsCD14-ST (2ST64) was diluted with the diluent described in Example 7- (12) to prepare a concentration series of 0.06, 0.5, 1.2, 2, and 3 ng / mL.
  • Example 7 Measured using the kit of (1). Diluent was used for blanks. As shown in FIG. 11, the absorbance increased in a concentration-dependent manner, confirming that rsCD14-ST (2ST64) can be used as a standard product in the kit.
  • sCD14-ST in normal human serum and sCD14-ST in EDT A caroplasma were measured. The degree was about twice as high as that in serum. Since the effect of EDTA on the measurement system was considered as a cause, when EDTA was added to the diluent to a concentration of 0.2 mg / mL, the measured value of serum increased, and there was no difference from EDTA-added plasma. However, it was found that the reactivity of the standard curve prepared using the rsCD14 (1-307) S286C standard decreased, and that the reading was affected by the presence or absence of EDTA. On the other hand, when rsCD14-ST was used as the standard, the standard curve was not affected by the addition of EDTA. Thus, it was judged that rsCD14-ST was better as the standard.
  • rsCD14-ST 20 ⁇ g was diluted in 500 ⁇ l of physiological saline, mixed with an equal amount of 5001 incomplete Freund's adjuvant (DIFCO), and administered subcutaneously on the back.
  • DIFCO incomplete Freund's adjuvant
  • ⁇ 3 ⁇ 14-3 ⁇ ( ⁇ 3 ⁇ 64) 20 / ⁇ was similarly administered.
  • blood was collected from the ear vein, antiserum was separated according to a standard method, and the antibody was purified. First, ammonium sulfate was added to the antiserum to a final saturation concentration of 33%, and the mixture was stirred at 4 ° C for 1 hour, and the precipitated precipitate was centrifuged.
  • the precipitate was dissolved in Dulbecco's PBS buffer (hereinafter referred to as PBS (pH 7.4)) and dialyzed overnight. After filtration, the dialysate was applied to a protein A column (Prosep A, Millipore), and the bound IgG fraction was eluted with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 3.0) to obtain a purified antibody. After dialysis with PBS (pH 7.4), the protein concentration was calculated from the absorbance at 280 nm (extinction coefficient: 0.714 mg / mL). After 0 , the resulting antibody is referred to as an anti-PSP64 polyclonal antibody or an anti-PSP64 antibody.
  • PBS Dulbecco's PBS buffer
  • DNP-PSP64 antigen 30 ⁇ g of DNP-PSP64 antigen was dissolved in 100 ⁇ L of saline, mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant (DIFCO), and administered to each hind footpad of an 8-week-old Wistar rat female by 100 L.
  • DIFCO Freund's complete adjuvant
  • lymphocytes were separated from the lymph nodes using a cell strainer (Falcon), mixed with myeloma cells (Sp2ZO-Agl4) in a ratio of 5: 1, and subjected to cell fusion using polyethylene glycol.
  • the fused cells were Kendak in HAT medium, hybridomas were selected, and then hybridomas producing the desired antibody were screened.
  • rs CD14-ST (PSP64) was directly immobilized on a plate. That is, 014-3 chops (? 3 to 64) diluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) to an imno plate (Maxisorb, NUNC) at a ratio of 2.5 / ⁇ 111 were added to each well at a volume of 50 1 ⁇ . Add the calories and let it stand at 4 ° C overnight. Next, the plate was washed 5 times with ion-exchanged water, 100 L of PBS (pH 7.4) containing 2% StabilGuard (Surmodics) was added to each well, and the plate was allowed to stand at room temperature for 1 hour to perform blocking.
  • PBS pH 7.4
  • StabilGuard StabilGuard
  • the obtained culture supernatant was also added to each well, and the culture was added to each well, reacted at 37 ° C for 1 hour, and washed three times with physiological saline containing 0.05% Tween20.
  • 50 L of a solution obtained by diluting a peroxidase-labeled anti-rat immunoglobulin antibody (DAKO) 1000-fold with PBS (pH 7.4) containing 10% heron serum was added to each well.
  • DAKO peroxidase-labeled anti-rat immunoglobulin antibody
  • PBS pH 7.4
  • TMB tetramethylbenzidine solution
  • the absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (Multiscan JX, Thermo Electron), and a well containing a hybridoma producing an antibody that binds to the 2ST64 protein was selected.
  • the clone was cloned by the limiting dilution method according to the selected Pell according to Tamoe Ando * Takeshi Chiba, "Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures", page 97, 1991 (Kodansha).
  • screening was similarly performed using the reactivity to the 2ST64 protein as an index, and six types of hybridomas were selected.
  • the antibody was purified.
  • the subtypes of the purified F1237-3-4 antibody and F1237-4-4 antibody were determined by a rat typing kit (ZYMED), and the subtypes were rat IgG2a- ⁇ and rat HgG2b, ⁇ , respectively.
  • rs CD14-ST prepared in Example 13- (3) 3 was used. ⁇ Immunize the heron. That is, after diluting 20 ⁇ g of rsCD14-ST (PSP64) in 500 ⁇ l of physiological saline and mixing with 500 ⁇ l of Freund's complete adjuvant (DIFCO) in an equal amount, New Zealand White Egret (Kitayama Labes) female 2.0 —2. Inject 4 kg under the back skin.
  • DIFCO Freund's complete adjuvant
  • rsCD14-ST 20 ⁇ g of rsCD14-ST (PSP64) is diluted in 500 ⁇ l of physiological saline, mixed with an equal volume of 5001 incomplete Freund's adjuvant (DIFCO), and administered subcutaneously on the back.
  • DIFCO incomplete Freund's adjuvant
  • rsCD14- 3 ⁇ 20 / zeta 8
  • the precipitate is dissolved in Dulbecco-phosphate buffer (hereinafter referred to as PBS (pH 7.4)) and dialyzed overnight. After filtration, the dialysate is applied to a protein A column (Prosep A, Millipore), and the bound IgG fraction is eluted with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (PH 3.0) to obtain a purified antibody.
  • PBS Dulbecco-phosphate buffer
  • PH 3.0 0.1 M glycine hydrochloride buffer
  • the obtained purified anti-PSP64 polyclonal antibody was prepared using the high molecular weight CD14 prepared in Example 22 or Specific purification is carried out using the rsCD14 (1-356) -bound resin prepared in Example 6 to obtain an antibody that binds only to rsCD14-ST. That is, 5 mg of high molecular weight CD14 or rsCD14 (1-356) is bound to HiTrap NHS-activated HP Columns (Amersham Bioscience) according to a manual to prepare an affinity column for specific purification.
  • the antibody purified by the protein A column is applied to a specific purification affinity column, and an antibody that does not bind to high molecular weight CD14 or rsCD14 (1-356) is recovered.
  • the obtained antibody is concentrated, dialyzed against PBS (pH 7.4), and the protein concentration is calculated from the absorbance at 280 nm (extinction coefficient: 0. 714 mgZmL;).
  • DNP-PSP64 antigen Dissolve 30 ⁇ g of DNP-PSP64 antigen in 100 ⁇ L of saline, mix in equal volume with Freund's complete adjuvant (DIFCO), and add 100 ⁇ L to each hind footpad of an 8-week-old female Wistar rat or ddY mouse Administer each. Two weeks later, iliac lymph nodes are removed and cell fusion is performed. Cell fusion is carried out according to Tamagawa Ando and Takeshi Chiba, “Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures,” p. 83, 1991 (Kodansha).
  • lymphocytes are separated from the lymph nodes using a cell strainer (Falcon), mixed with myeloma cells (Sp2ZO-Agl4) at 5: 1, and cell fusion is performed using polyethylene glycol. After fusing the fused cells in a HAT medium, selecting the hybridoma, screening the hybridoma producing the desired antibody.
  • Falcon cell strainer
  • Sp2ZO-Agl4 myeloma cells
  • the screening uses an ELISA method in which rsCD14-ST (PSP64), high molecular weight CD14 or rsCD14 (1-356) is directly immobilized on a plate. That is, 50 l of rsCD14-ST (PSP64), high molecular weight CD14 or rsCD14 (l-356) diluted to 2.5 ⁇ g ZmL with PBS (pH 7.4) was added to each well of an immunoplate (Maxisorb NUNC). Cultivate and leave at 4 ° C overnight.
  • PBS pH 7.4
  • SCD14-ST was measured as the sandwich-labeled antibody described in Example 22 from among the monoclonal antibodies against rsCD14-ST prepared in Example 17- (4), and it had the ability to increase in sepsis patients. After selecting the antibody, measure SCD14-ST in the sample. Measure both the cryopreserved sample and the sample stored at room temperature for 24 hours, and select a combination of antibodies with a small difference in the measured values.
  • Example 17- (1) The reactivity of the anti-PSP64 polyclonal antibody prepared in Example 17- (1) was confirmed.
  • RsCD14-ST (PSP64) was immobilized in the same manner as in Example 17- (2).
  • Example 17-The antiserum containing the anti-PSP64 polyclonal antibody prepared in (1) and the normal mouse serum as a control were diluted 500-fold with PBS (pH 7.4), and then diluted twice to prepare a dilution series up to 32,000-fold. did. Each diluted solution was added to the blocking well, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and washed three times with a physiological saline solution containing 0.05% Tween20.
  • rsCD14-ST (PSP64) was administered.
  • the absorbance of the rabbits increased in a dilution factor-dependent manner, whereas that of the normal rabbits did not, indicating the production of rsCD14-ST (PSP64) protein-specific antibodies.
  • the S68 peptide polyclonal antibody was diluted to gZmL with D-PBS (pH 7.4), and 50 ⁇ L was added to each well of an immunoplate (Maxisorb, NUNC). After the reaction at 4 ° C, wash with ion-exchanged water 5 times, and add 100 ⁇ L D-PBS containing 0.1% StabilGuard (SurModics, Inc) and 0.1% Tween20 to each well. And blocked. Next, 76 mM PBS (pH 7.4) containing 1% CD14-absorbed serum and 0.1% BSA was used as a diluent at 0, 0.031, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, and 1.
  • a 2 ng ZmL rsCD14-ST (2ST64) protein standard dilution series was prepared. A standard dilution series was added at 50 L per well and reacted at 37 ° C for 2 hours. After completion of the reaction, and washed 3 times with physiological saline containing 0. 05% T W een20, and 50 mu L added pressure to l% ⁇ shea calf serum ZHybridoma- SFM solution containing F 1237- 3-4 antibody.
  • Example 11 The difference in the concentration between the standard product and the reference product is as shown in Example 16.
  • reaction rate constants of the F1237-3-4 antibody prepared in Example 17- (2) and the 3C10 antibody (ATCC TIB228), which is an anti-CD14 antibody, were prayed using Biacore3000 (Biacore).
  • Biacore3000 Biacore3000
  • rsCD14-ST (2ST64) and rsCD14 (l-356) were separately fixed to a sensor chip CM5 (Biacore) using an amine coupling kit (Biacore).
  • the measurement was performed by using HBS-EP (Biacore) as a running buffer, and injecting a dilution series (1.25 nM to 640 nM, the concentration of which was changed depending on the antibody) of each antibody into the flow cell.
  • the reactivity of the F1237-3-4 antibody prepared in Example 17- (2) and the 3C10 antibody, which is an anti-CD14 antibody, with high molecular weight CD14 is measured using an antigen solid phase EIA system. That is, 50 ⁇ L of high molecular weight CD14 diluted to 2.5 ⁇ g ZmL with D-PBS (pH 7.4) was prepared in an immunoplate (Maxisorb, NUNC) in the same manner as in Example 13- (2). Add and leave at 4 ° C overnight. Next, wash the plate 5 times with ion-exchanged water, add 100 L of PBS (pH 7.4) containing 2% StabilGuard (Surmodics) to each well, and allow to stand at room temperature for 1 hour to perform blocking.
  • PBS pH 7.4
  • StabilGuard StabilGuard
  • F1237- 3-4 antibody, 3C10 antibody Dilute to gZmL with PBS (pH 7.4), add to each well, react at 37 ° C for 1 hour, and add 0.05% Tween20. Wash 3 times with saline. Next, 50 L of a solution obtained by diluting a peroxidase-labeled anti-immunoglobulin antibody (DAKO) for each antibody 1000-fold with PBS (pH 7.4) containing 10% serum was added to each well. After reacting at 37 ° C for 1 hour, wash 5 times in the same manner, and add tetramethylbenzidine solution (TMB, BioFix) to each well. After reacting at room temperature for 10 minutes, stop the reaction with 0.5M sulfuric acid solution.
  • DAKO peroxidase-labeled anti-immunoglobulin antibody
  • the absorbance at 450 nm is measured with a plate spectrophotometer (Multiscan JX, Thermo Electron). As a result, it was confirmed that 3C10 binds strongly to high molecular weight CD14, whereas F1237-3-4 antibody does not substantially bind. Recognized.
  • TMB solution BioFix
  • Add TMB solution BioFix
  • add color stop the reaction with 0.5M aqueous sulfuric acid, and measure the absorbance at 450 nm. Since the absorbance decreases depending on the sCD14-ST concentration in the blood, the measured value reflects the amount of sCD14-ST in the blood, and the sCD14 ST concentration is lower in normal subjects but higher in sepsis patients it can.
  • Labels include other enzymes, radioactive compounds, fluorescent materials, chemiluminescent materials, colloidal gold, Dyes and latexes can be used.
  • Example 23 A method for screening an antibody for measuring the soluble protein in blood
  • an antibody that binds to a peptide having 6 to 20 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is prepared according to the description in Example 1. It can also be prepared as follows. ⁇ 1> A peptide is synthesized by a standard method based on the full-length sequence of CD14, and an immunizing antigen is prepared to prepare an antibody. 2> Purify the purified soluble CD14 antigen in serum and use this as an immunogen to produce antibodies. 3> Prepare recombinant CD14 protein using COS cells and E. coli, and use this as an immunogen to produce antibodies. 4) Prepare various CD14 antigens by heat denaturation or DNP conversion, etc., and use them as immunogens to produce antibodies.
  • the P001 antibody an antibody prepared using the peptide having the amino acid residue represented by SEQ ID NO: 4 as an antigen
  • the P002 antibody the antibody prepared using the peptide having the amino acid residue represented by SEQ ID NO: 5 as an antigen
  • the S68 antibody prepared in Example 1- (4), the F1146-17-2 antibody prepared in Example 2, the F1031-8-3 antibody prepared in Example 3 (2) [2], the Example 3- (2)
  • the F1106-13-3 antibody prepared in [1], the F1237-3-4 antibody prepared in Example 17- (2), and the anti-PSP64 antibody prepared in Example 17- (1) were also used.
  • a cleaning sample was prepared.
  • An antibody screening method for measuring the soluble protein in blood characterized by utilizing the difference in the reactivity of a normal human-derived high molecular weight CD14 protein with an antibody.
  • an antibody that does not bind to high molecular weight CD14 present in normal human serum but binds to the soluble protein in blood is screened.
  • a high molecular weight CD14 protein was prepared as follows. Human serum (Nihon Biotest) was added to a 3C10 antibody-bound resin column (5 mL), washed with PBS, and eluted with a 6M urea aqueous solution. The eluate was dialyzed against PBS, freeze-dried, and subsequently fractionated on a gel filtration column (Superdex 75 10 / 300GL, Amersham Bioscience). Each of the obtained fractions was assayed with a commercially available soluble CD14 protein measurement kit (IBL-kit), and high-molecular-weight CD14 fractions reacting with the IBL kit were pooled and freeze-dried. The lyophilized product was dissolved and measured again with the IBL-kit to calculate the concentration.
  • IBL-kit commercially available soluble CD14 protein measurement kit
  • Antigen solid phase EIA was performed as follows. First, high molecular weight CD14 was allowed to stand on a plate at 2.5 / z gZmL at 4 ° C for binding. Next, blocking was performed with 2% StabilGuardZPBS (pH 7.4), each antibody was diluted with 1 ⁇ g ZmL in PBS, and added to a well on which each antigen was immobilized. After reacting at 37 ° C for 1 hour, wash three times with physiological saline containing 0.05% Tween20, and then add peroxidase-labeled anti- ⁇ globulin antibody (Dako) for each antibody to 10% ⁇ sir serum and PBS containing 0.05% Tween20.
  • Dako peroxidase-labeled anti- ⁇ globulin antibody
  • the antibody can be selected without binding to sCD14-ST.
  • dot blotting is performed as follows. First, spot the high molecular weight CD14 on Trans-BlotTransfer Medium (Bio-Rad) at about 400ngZ dots and dry. Next, block with 100% Block Ace (Yuki Brand Milk Products). Two types of immobilized CD14 and various anti-CD14 antibodies diluted with PBS (pH 7.4) containing 10% Block Ace and 0.05% Tween 20 are reacted at room temperature for 1 hour. Then, add 5% with PBS (pH 7.4) containing 0.05% Tween20.
  • This is a method for screening an antibody for measuring the soluble protein in the blood, characterized by utilizing the difference between the amounts detected in normal human serum and septic patient serum.
  • a sandwich ELISA system is prepared by combining two types of anti-CD14 antibodies, and a normal person and a patient with sepsis are measured.
  • the antibody prepared in 12- (1) was used to prepare a peroxidase-labeled antibody according to the description in Example 3- (3).
  • Each antibody to be screened was diluted to g / mL with D-PBS (pH 7.4), and then added to each well of an immunoplate (Maxisorb, NUNC) in a volume of 50 ⁇ L. After the reaction at 4 ° C., the plate was washed 5 times with ion-exchanged water, and D-PBS containing 2% StabilGuard (SurModics, Inc.) was added to each well with 100 / z L, and blocked. Next, use 0, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, and 200 ng ZmL of CD14 (1-307) S286C in PBS containing 0.1% BSA (pH 7.4) as a diluent.
  • a protein standard dilution series and a 10-fold diluted sample were prepared. Add 50 L of the standard dilution series and diluted sample per well, incubate at 37 ° C for 1 hour, and after the reaction is completed, wash three times with 0.05% Tween20-containing saline, and add 2% rat serum, Peroxidase-labeled antibody diluted to 1 g / mL with PBS (pH 7.4) containing 1% mouse serum and 0.1% Tween 20 was added to each well at 50 / zL. After reacting at 37 ° C for 1 hour, the plate was washed 5 times in the same manner, and a tetramethylbenzidine solution (TMB, BioFix) was added to each well.
  • TMB tetramethylbenzidine solution
  • a screening was performed on the combinations which can prepare a standard curve in this system, in terms of their ability to specifically detect the soluble protein in blood.
  • the sera of two patients with sepsis and two normal patients should be measured using the measurement system created in [1], and a combination of antibodies in the measurement system that shows a low value for normal people and a high value for sepsis patients should be selected.
  • a combination of antibodies that specifically detect sepsis patients was screened.
  • the combinations of the antibodies described in Examples 7- (1) to (8) and Example 22 were selected.
  • the measurement value of the high molecular weight CD14 of each serum may be obtained in advance using the IBL-kit, and a combination of antibodies in a measurement system in which the high molecular weight CD14 is not measured may be selected.
  • Example 17- (2) As a method for screening for an antibody that specifically detects sCD14-ST, the antibody screening method described in Example 17- (2), ie, rsCD14-ST (PSP64) is directly immobilized on a plate This was performed by using an ELISA method.
  • Table 13 shows the screening results of various antibodies.
  • MY4 Coulter
  • MEM18 Monosan
  • 61D3 Southern Biotechnology Associate
  • various ⁇ -globulins were commercially available.
  • Example 23- (2) As a method for screening for an antibody that specifically detects SCD14-ST, the sandwich EIA system described in Example 23- (2) was prepared. In other words, various antibodies to be screened are immobilized on a plate, and sandwiched with rsCD14-ST (PSP64) as an antigen and peroxidase-labeled F1106-13-1-3 antibody or peroxidase-labeled F1031-8-3 antibody This was performed by using an ELISA method. [0376] Table 14 shows the screening results of various antibodies. As the AntiHCG antibody, a commercial product was used.
  • sCD14 (1-70) A soluble polypeptide having the N-terminal 1-70 amino acids of human CD14 (hereinafter referred to as sCD14 (1-70)) was chemically synthesized.
  • THP-1 cells stimulated with vitamin D3 are suspended in RPMI1640 medium containing 0.1% BSA to a final concentration of numan leukocyte elastase (Elastin Products Company, Inc.) of 1 ⁇ .
  • the reaction mixture was added to prepare a final reaction volume of 200 ⁇ L.
  • phenylmethylsulfonyl fluoride was added to stop the enzymatic reaction.
  • the supernatant of each reaction solution was recovered, and SCD14-ST contained in the supernatant was measured using the kit of Example 7- (1).
  • the sCD14-ST concentration increased 3 minutes after elastase addition, and then decreased gradually.
  • a novel antigen having the sequence of CD14 present in human blood is provided. Further, a method for diagnosing sepsis or detecting sepsis by measuring the antigen is provided.
  • a recombinant soluble fragment having an immunological function similar to that of the antigen is provided.
  • a method for producing the recombinant soluble fragment is provided.
  • novel antibodies that bind to the fragments are also provided.
  • ⁇ an antibody that binds to a peptide having a specific amino acid sequence of human full-length soluble CD14 protein '' ⁇ an antibody prepared using a peptide having a specific amino acid sequence of human full-length soluble CD14 as an antigen '' or A kit and a method for measuring the antigen, which comprise "an antibody that binds to the fragment" or a fragment of the antibody as a component, are provided.

Abstract

　生体内の新規な蛋白質であり、敗血症の診断マーカーとして有用な下記１）～３）の性質を有する可溶型ＣＤ１４抗原、組換え型可溶性ＣＤフラグメントを提供する。 　１）非還元条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、 　２）Ｎ末端配列に配列番号１のアミノ酸配列を有する、及び 　３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。

Description

明 細 書
新規可溶性 CD14抗原
技術分野
[0001] 本発明は、敗血症の診断マーカーとなり得る、生体内の新規な抗原に関する。また 、該抗原を測定することを特徴とする敗血症の診断方法、特定の抗体を用いた該抗 原の測定キット及びその測定方法に関する。さらに、該測定キットの標準物質として 有用な組換え型可溶性フラグメント、該フラグメントに結合する抗体、該フラグメントの 生産法、及び該フラグメントを用いた抗体のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] CD14分子は単核球細胞の膜表面上に発現している糖蛋白質を認識する一群の 抗体により同定される蛋白質として 1986年に第 3回 Leukocyte Typing Conferenceに て、命名された。 1990年、 Wrightらはこの CD14分子力 エンドトキシンである LPS のレセプターであることを明らかにした（「サイエンス（Science)」（米国）、 1990年、第 249卷、 p.l431 - 1433) 0この CD14分子は分子量 53〜55kDaの糖蛋白質で、 mR NAは約 1. 4kbのサイズで 356個のアミノ酸からなることが cDNAの解析から明らか にされた（「ヌクレイック アシッド リサーチ（Nucleic Acids Research)」（英国）、 1988 年、第 16卷、 p.4173) 0
[0003] ヒト CD14分子には、膜結合型 CD14のほかに可溶型 CD14があり、血中には分子 量の異なる複数の可溶型 CD14が存在することが報告された (「ョ一口ビアン ジャー ナル ォブ ィムノロジー（European Journal of Immunology)」（独国）、 1993年、第 23 卷、 P.2144— 2151)。また、 Landmannらは、敗血症患者血清の可溶型 CD14のウェス タンプロット分析を行 、、約 55kDaの可溶型 CD14が敗血症死亡例や発作性夜行 性ヘモグロビン尿症 (PNH)患者で高値であり、正常人血清中にはこの分子が認め られず、正常人には分子量の少し小さい 49kDaの可溶型 CD14が検出されたことを 報告した（「ザ ジャーナノレ ォブ インフエクシヨウス ディジーズ（The Journal of Infectious Disease)」（米国）、 1995年、第 171卷、 p.639— 644)。
[0004] この分子量の異なるサブタイプについては、糖鎖の違いが関与していること、また N および O結合型糖鎖を除去してもなお 2種の異なる分子量の可溶型 CD14が血中に 存在することを Stelterらが報告している（「ョ一口ビアン ジャーナル ォブ バイオケミ ストリー（European Journal of Biochemistry)」（独国）、 1996年、第 236卷、 p.457— 464 ) oまた、 Buflerらは可溶型 CD14の C末端分析を行い可溶型 CD14の 327位のセリ ン残基に GPI基が結合すること、約 56kDaの分子量を持つ可溶型 CD14は GPIアン 力リングされない分子種であることを報告した（「ョ一口ビアン ジャーナル ォブ ィム ノロジー（European Journal of lmmunology)」（独国）、 1995年、第 25卷、 p.604—610)
[0005] 組換え型可溶性 CD14全長及びそのフラグメントについて、 Juanらは、ヒト CD14の N末端 1位〜 152位力 なるフラグメントが、 LPSシグナルを細胞に伝達する機能を 有することを報告している（「ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)」（米国）、 1995年、第 278卷、 p. 1382— 1387)力 N末 端 1位〜 124位力もなるフラグメント及び N末端 1位〜 98位力もなるフラグメントの発 現には成功していない。また、 Majerleらは、ロイシンリッチリピート（LRR)領域を 3単 位有するヒト CD14の N末端 1位〜 152位からなるフラグメントは refoldingされ、 LRR 領域を 2単位しか有さないヒト CD14の N末端 1位〜 134位からなるフラグメントは ref oldingされないこと、 N末端 1位〜 69位からなるフラグメントの発現には成功していな いを報告している（「プフリュゲルズ アルチーョ一口ビアン ジャーナル ォブ フイジ ォロジ一（Pflugers Arch-European Journal of Physiology)」（独国）、 2000年、第 439 卷 [Suppl]、 p. R109— R110)力 本報告では、 N末端 1位〜 69位からなるフラグメ ントの発現には成功して ヽな 、。
[0006] CD14分子に対する抗体は、 Bazilらの作製した MEM—18 (「ョ一口ビアン ジャー ナル ォブ ィムノロジー（European Journal of Immunology)」（独国）、 1986年、第 16 卷、 ρ.1583— 1589)、 Shuttらの作製した RoMo— l (「アレルギー ゥント ィムノロジー (Allergie und Immunologie)」（独国）、 1988年、第 34卷、 p.17— 26)、 Steinmanらの作 製した 3C10 (「ジャーナル ォブ イクスペリメンタル メディスン (Journal of
Experimental Medicine)」（米国）、 1983年、第 158卷、 p.126— 145)をはじめ、多くの 抗 CD14抗体が作製され、 CD14蛋白質の同定に使用されている。 [0007] また、これら抗体を用いた可溶型 CD14の測定系が、 Shuttら (西独国特許公開第 2 86876号）、 Bazilら（「モレキュラー ィムノロジー（Molecular Immunology)」（英国）、 1989年、第 26卷、 p.657— 662頁； Grunwaldら（「ジャーナル ォブ ィムノロジカル メ ソッズ（Jounal of Immnological Methods)」（蘭国）、 1992年、第 155卷、 p.225-232)に より報告され、ヒト体液中の可溶型 CD14が測定されるようになった。
さらに、可溶型 CD14— ELISAキット力 BL— Hamburg、 Medgenix, R&D Systems より発売され、敗血症をはじめとして多くの疾患で可溶型 CD14の測定が行われてい る（「タリ-カル ィムノロジー アンド ィムノパソロジー（Clinical Immunology And Immunopathology)」（米国）、 1996年 第 80卷、 p.307— 310 ;「臨床検査」、 1994年、第 38卷、 p.341— 344)。
[0008] しかし敗血症以外の疾患でも疾患の進行度に伴って前述の約 55kDa, 49kDaを 含む可溶型 CD14 (報告により、その分子量は異なるため、約 55kDa、 49kaに限定 されるわけではない、以下同）濃度が上昇し、可溶型 CD14は敗血症特異的なマー カーではないことが明らかになった（「インフエクシヨン アンド ィムニティー（Infection and Immunity)」（米国）、 1999年、第 67卷、 p.417-420 ;「タリ-カル アンド イクスべ リメンタノレ ィムノロジー (Clinical and Experimental Immunology)」（英国）、 2000年、 第 120卷、 p.483— 487 ;「タリ-カル アンド イクスペリメンタル ィムノロジー（Clinical Experimental Immunology)」（英国）、 1994年、第 96卷、 p.15— 19)。また、可溶型 CD 14は敗血症の重症化のマーカーとして期待されていた力 敗血症性ショックとの相 関が見られないこと（「ぺディアトリック アレルギー アンド ィムノロジー（Pediatric allergy and immunology)」（デンマーク）、 1997年、第 8卷、 p.194— 199)、全身性炎症 反応症候群（SIRS)との相関が認められないことから（「ョ一口ビアン ジャーナル ォ ブ クリ-力ノレ インべスティゲーシヨン (European Journal of Clinical Investigation)」 ( 英国）、 1998年 第 28卷、 p.672-678)、敗血症の診断薬としてなり得な力つた。
[0009] また、 Landmannらが報告した上記約 55kDaと 49kDaの 2種等の可溶型 CD14 (高 分子量 CD14 (報告により、その分子量は異なるため、約 55kDa、 49kaに限定され るわけではない、以下同））とは別に、約 36kDaの可溶型低分子量 CD14が血中に 存在すること、該低分子量 CD14は、正常人では少なぐ敗血症患者において増加 することを見出し、可溶型低分子量 CD14の測定が臨床上有用であることが確認さ れた。該可溶型低分子量 CD14の測定法として、血中可溶型 CD14総量から、血中 高分子量 CD14量を差し引いて、血中低分子量 CD14量を間接的に求めることが提 案されている（国際公開第 WO01Z22085号)。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 力かる状況下において、簡便に検出可能な敗血症の診断マーカーとなり得る、生 体内の新規な抗原が望まれて!/ヽる。また特定の抗体を用いた該抗原の測定キット及 びその測定方法が望まれて 、る。さらに該抗原の測定に有用な抗体をスクリーニング する方法が望まれている。さらにまた、該抗原と免疫的な機能が類似する組換え型 可溶性フラグメント及びそのフラグメントの生産方法が望まれている。
課題を解決するための手段
[0011] 発明者等は鋭意研究の結果、ヒト血中に存在する CD14の配列を有する新規な抗 原を発明した。さらに該抗原を測定することによる、敗血症を診断方法若しくは敗血 症を検出する方法を発明した。
また、該抗原と免疫学的に類似した性質を有する組換え型可溶性フラグメント及び そのフラグメントの生産方法を発明し、さらに該フラグメントに特異的に結合する抗体 を発明した。
また、「ヒト全長可溶型 CD14の特定のアミノ酸配列からなるペプチドと特異的に結 合する抗体」若しくは該抗体の断片、「ヒト全長可溶型 CD14の特定のアミノ酸配列か らなるペプチドを抗原として作製される抗体」若しくは該抗体の断片、または「該フラ グメントに特異的に結合する抗体」若しくは該抗体の断片を構成要素として含む、該 抗原を測定することができるキット及び測定方法を発明した。
[0012] さらに、該抗原の測定に有用な抗体をスクリーニングする方法を発明した。
なお、本明細書において、「可溶性 CD14抗原」は「可溶性 CD14蛋白質」というこ とができる。また、「組換え型可溶性 CD14フラグメント」は「組換え型可溶性 CD14蛋 白質」ということができる力 ヒト全長可溶型 CD14の部分配列を有するという意味で、 「フラグメント」という語を使用している。「フラグメント」は、一般的な技術用語として解 釈できる。本発明においても、対象となる蛋白質のアミノ酸配列の部分配列力もなる 蛋白質の一部であり、その蛋白質の立体構造や、糖鎖もしくは脂質等の付カ卩につい て、対象となる蛋白質との違いは特に問うものではない。
[0013] すなわち、本発明は、以下の（1)〜（13)を提供する。
(1)下記 1)〜3)の性質を有する可溶性 CD14抗原、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13± 2kDa、
2) N末端配列に配列番号 1のアミノ酸配列を有する、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
[0014] (2)下記く 1〉〜く 3〉の工程により得られる下記 1)〜3)の性質を有する組換え型可溶 性 CD14フラグメント、
く 1〉所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が置換若しくは挿入されている配列番 号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメント若しくは該部分配列を有 するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜10個のアミノ酸が欠 失、付加若しくは置換したフラグメントを作製する工程、
く 2X1〉で作製した組換え型可溶性 CD14フラグメントを該所定の蛋白分解酵素に より切断する工程、及び
く 3X2〉で切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13± 2kDa、
2) 3C10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
[0015] (3)下記 1)〜3)の性質を有する組換え型可溶性 CD 14フラグメント、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13± 2kDa、
2) 3C10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
(4)上記（1)の可溶性 CD14抗原を測定することを特徴とする敗血症の診断若しくは 検出方法。
(5)少なくとも一つの上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体若しく は該抗体の断片を含む、検体に含まれる上記（1)の可溶性 CD 14抗原を測定するた めの可溶性 CD14抗原の測定キット。
[0016] (6)少なくとも一つの上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体若しく は該抗体の断片を、上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合させることを特徴 とする、上記（1)の可溶性 CD14抗原の免疫学的な測定方法。
(7)上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体。
(8)上記（2)の組換え型可溶性 CD 14フラグメントに特異的に結合する抗体。
(9)上記（3)の組換え型可溶性 CD 14フラグメントに特異的に結合する抗体。
[0017] (10)下記の工程を含む、上記（1)の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体のスク リーニング方法、
1)配列番号 3に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 6〜20アミノ酸残基か らなるペプチドと特異的に結合する抗体をスクリーニング対象検体として用意するェ 程、
2) CD14を含む測定対象液を用意する工程、
3) 1)で用意した抗体若しくは、 2)で用意した測定対象液を用いて、免疫測定系を 構成する工程、
4) 3)で構成した免疫測定系により、測定対象液を測定する工程、及び
5) 4)で得た測定結果により、上記（1)の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体を 評価し、選択する工程。
[0018] (11)下記の工程を含む、上記（1)の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体のスク リーニング方法、
1)抗体をスクリーニング対象検体として用意する工程、
2)上記（2)の組換え型可溶性 CD14フラグメントを用意する工程、
3) 1)で用意した抗体を 2)で用意したフラグメントと反応させ、 1)で用意した抗体と 2 )で用意したフラグメントの特異的な結合を評価する工程、及び、
4) 3)において、 2)で用意したフラグメントに特異的に結合した抗体を、上記（1)の 可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体として、選択する工程。
[0019] ( 12)下記の工程を含む、上記（2)の組換え型可溶性 CD14フラグメントの生産方法 く 1〉下記の 1)〜4)の配列を有する組換え型可溶性 CD14フラグメントを作製するェ 程、
1)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または 該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜： LO 個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
2) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである、
3) C末端が配列番号 3の 134位〜 356位のいずれかである、
4)所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号 3の 59位〜 70位の後ろ に置換若しくは挿入付加されて 、る。
く 2X1〉で作製した組換え型可溶性 CD14フラグメントを該所定の蛋白分解酵素に より切断する工程、及び
く 3X2〉で切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程。
[0020] 以下に、本発明の上記の（1)〜（13)を詳細に記載する。
すなわち、本発明は、以下の新規な可溶性 CD14抗原、組換え型可溶性 CD14フ ラグメント及び新規敗血症の診断方法若しくは検出方法を提供する。
[0021] ( 1)下記（1 1)または（1 2)に示す新規可溶性 CD 14抗原。
( 1 - 1)下記 1)〜3)の性質を有する可溶性 CD14抗原、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13 ± 2kDa、
2) N末端配列に配列番号 1のアミノ酸配列を有する、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
( 1 - 2) 4)ヒト血漿中より得られうる（1— 1)の可溶性 CD14抗原。
[0022] (2)下記（2— 1)〜（2— 18)の 、ずれかに示す組換え型可溶性 CD 14フラグメント。
(2 - 1)下記く 1〉〜く 3〉の工程により得られる下記 1)〜3)の性質を有する組換え型可 溶性 CD14フラグメント、 く 1〉所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が置換若しくは挿入されている配列番 号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメント若しくは該部分配列を有 するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜10個のアミノ酸が欠 失、付加若しくは置換したフラグメントを作製する工程、
く 2X1〉で作製した組換え型可溶性 CD14フラグメントを該所定の蛋白分解酵素に より切断する工程、及び
く 3X2〉で切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13 ± 2kDa、
2) 3C10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
[0023] (2— 2)前記（2— 1)、く 1〉の工程において、下記の 4)〜7)の配列を有する組換え型 可溶性 CD14フラグメントを作製する、
4)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または 該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜： LO 個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
5) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである
6) C末端が配列番号 3の 134位〜 356位のいずれかである、及び
7)所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列力 配列番号 3の 59位〜 90位のいず れかの位置の後ろに置換若しくは挿入されて!ヽる、
(2 - 1)の組換え型可溶性 CD 14フラグメント。
[0024] (2— 3)〈1〉の工程の 7)において所定の蛋白分解酵素が ProScission Proteaseで あり、切断部位の配列が Leu, Glu, Val, Leu, Phe, Gin, Gly, Proである（2— 2) の組換え型可溶性 CD 14フラグメント。
(2— 4)く 1〉の工程の 7)において所定の蛋白分解酵素が Thrombinであり、切断部 位の配列力 SLeu, Val, Pro, Arg, Gly, Serである（2— 2)の組換え型可溶性 CD14 フラグメント。
[0025] (2— 5)〈1〉の工程の 5)において N末端が配列番号 3の 1位〜 6位のいずれかである (2— 2)〜（2— 4)の!、ずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。
(2 - 6)〈1〉の工程の 5)にお!/、て N末端が配列番号 3の 1位である（2— 2)〜（2— 4) の！、ずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。
[0026] (2— 7)く 1〉の工程の 7)において所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列力 配列 番号 3の 59位〜 80位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入されている（2—
2)〜（2— 6)の!、ずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。
(2— 8)く 1〉の工程の 7)において所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列力 配列 番号 3の 64位〜 75位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入されている（2—
2)〜（2— 6)の!、ずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。
[0027] (2— 9)く 1〉の工程の 7)において所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列力 配列 番号 3の 64位の後ろに置換若しくは挿入されて!、る（2— 2)〜（2— 6)の!、ずれかの 組換え型可溶性 CD 14フラグメント。
(2— 10)〈1〉の工程の 5)において N末端が配列番号 3の 1位であり、 7)において所 定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号 3の 64位の後ろに置換若しくは 挿入されて 、る（2— 2)〜（2—4)の!、ずれかの組換え型可溶性 CD 14フラグメント。
[0028] (2 - 1 1)下記の 8)〜： LO)の配列を有する（2— 1)若しくは（2— 10)の組換え型可溶 性 CD14フラグメント、
8)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しく は該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
9) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである、及び、
10) C末端が配列番号 3の 59位〜 90位のいずれかである。
[0029] (2 - 12) 9)にお!/、て N末端が配列番号 3の 1位〜 6位の!/、ずれかである（2— 11)の 組換え型可溶性 CD 14フラグメント。
(2 - 13) 9)において N末端が配列番号 3の 1位である（2—11)の組換え型可溶性 C D 14フラグメント。
[0030] (2 - 14) 10)において C末端が配列番号 3の 59位〜 80位のいずれかである（2— 1 1)〜（2— 13)のいずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。 (2 - 15) 10)において C末端が配列番号 3の 64位〜 75位のいずれかである（2— 1 1)〜（2— 13)のいずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。
[0031] (2 - 16) 10)において C末端が配列番号 3の 64位である（2— 11)〜（2— 13)のい ずれかの組換え型可溶性 CD 14フラグメント。
(2 - 17) 9)において N末端が配列番号 3の 1位であり、 10)において C末端が配列 番号 3の 64位である（2—11)の組換え型可溶性 CD14フラグメント。
[0032] (2 - 18)さらに下記 11)の性質を有する（2— 1)〜（2— 18)の組換え型可溶性 CD1
4フラグメント、
11) LPSに結合しない。
(3)下記（3— 1)〜（3— 9)の 、ずれかに示す組換え型可溶性 CD14フラグメント。
[0033] (3 - 1)下記 1)〜3)の性質を有する組換え型可溶性 CD14フラグメント、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13 ± 2kDa、
2) 3C10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
(3 - 2)さらに下記 4)の性質を有する（3— 1)の組換え型可溶性 CD14フラグメント、
4) LPSに結合しない、
[0034] (3 - 3)下記の 5)〜7)の配列を有する（3— 1)若しくは（3— 2)の組換え型可溶性 C D14フラグメント、
5)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しく は該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
6) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである、及び、
7) C末端が配列番号 3の 59位〜 90位の!/、ずれかである。
[0035] (3 -4) 6)において N末端が配列番号 3の 1位〜 6位のいずれかである（3— 3)の組 換え型可溶性 CD 14フラグメント。
(3 - 5) 6)において N末端が配列番号 3の 1位である（3— 3)の組換え型可溶性 CD 14フラグメント。 (3-6) 7)にお!/、て C末端が配列番号 3の 59位〜 80位の!/、ずれかである（3— 3)〜 (3— 5)の!、ずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。
(3- 7) 7)にお!/、て C末端が配列番号 3の 64位〜 75位の!/、ずれかである（3— 3)〜 (3— 5)の!、ずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。
[0036] (3-8) 6)において N末端が配列番号 3の 1位であり、 7)において C末端が配列番号 3の 64位〜 75位の!/、ずれかである（3— 3)〜（3— 5)の!、ずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。
(3— 9)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである（3— 3)〜（3— 8)の!、ずれかの組換え型可溶性 CD14フラグメント。
[0037] (4)下記（4 1)〜（4 4)の!、ずれかに示す敗血症の診断方法。
(4- 1)上記（1)の可溶性 CD14抗原を測定することを特徴とする敗血症の診断若し くは検出方法。
(4- 2)下記の工程を含むことを特徴とする（2— 1)の敗血症の診断若しくは検出方 法。
1)被験者力も採取した血液中に含まれる上記（1)の可溶性 CD14抗原を測定する
2)測定した値を正常人の標準値と比較する、及び
3)被験者が、敗血症であるかどうかを評価する。
[0038] (4 3)上記（1)の可溶性 CD14抗原を測定する工程力 免疫学的に測定することを 特徴とする（2— 2)の敗血症の診断若しくは検出方法。
(4—4)上記（1)の可溶性 CD14抗原を測定する工程が、サンドイッチ免疫測定法に より測定することを特徴とする（2— 2)の敗血症の診断若しくは検出方法。
また、以下の新規な可溶性 CD14抗原の測定キット及び測定方法を提供する。
[0039] (5)下記（5— 1)〜（5— 8)の!、ずれかに示す上記（1)の可溶性 CD14抗原の測定 やット。
(5— 1)少なくとも一つの上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体若 しくは該抗体の断片を含む、検体に含まれる上記（1)の可溶性 CD14抗原を測定す るための可溶性 CD14抗原の測定キット。 [0040] (5- 2)上記（1)の可溶性 CD 14抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断 片として、以下の a)〜d)の ヽずれかの抗体または該抗体の断片を含むことを特徴と する（5— 1)の可溶性 CD14抗原の測定キット、
a)配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体、 b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 8〜 16アミノ酸残基から なるペプチドを抗原として作製される抗体、
c)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体 d)上記（2)若しくは（3)に記載の組換え型可溶性 CD14フラグメントと特異的に結合 する抗体。
[0041] (5— 3)上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断 片として、 d)上記（2)若しくは（3)の組換え型可溶性 CD14フラグメントと特異的に結 合する抗体または該抗体の断片である（5— 1)若しくは（5— 2)の可溶性 CD14抗原 の測定キット。
[0042] (5— 4)上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断 片として、上記（2)若しくは（3)の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作 製した抗体若しくは該抗体の断片である（5— 1)〜（5— 3)のいずれかの可溶性 CD 14抗原の測定キット。
(5- 5)上記（1)の可溶性 CD 14抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断 片として、上記（2)若しくは（3)の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作 製したモノクローナル抗体若しくは該抗体の断片である（5— 1)〜（5— 4)のいずれ かの可溶性 CD14抗原の測定キット。
[0043] (5— 6)下記（5— 6— 1)〜（5— 6— 19)のいずれかに示す、サンドイッチ免疫測定 法により上記（1)の可溶性 CD14抗原を測定する、（5— 1)〜（5—4)の可溶性 CD1 4抗原の測定キット。
(5-6 - 1)サンドイッチ免疫測定法により上記（1)の可溶性 CD14抗原を測定する、
(5— 1)〜（5— 4)の!、ずれかの可溶性 CD14抗原の測定キット。
(5— 6— 2)上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する第二の結合物質をさ らに含む（5— 6— 1)の可溶性 CD14抗原の測定キット。
(5— 6— 3)上記第二の結合物質力 上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合 する抗体若しくは該抗体の断片である（5— 6— 2)の可溶性 CD14抗原の測定キット
[0044] (5— 6— 4)上記第二の結合物質力 上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合 するモノクローナノレ抗体である（5— 6— 2)の可溶性 CD14抗原の測定キット。
(5— 6— 5)上記第二の結合物質力 配列番号 3に記載のヒト全長可溶型 CD14蛋 白質の 1位〜 52位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特異的に結合する抗体また は該抗体の断片、あるいは配列番号 3に記載のヒト全長可溶型 CD14蛋白質の 1位 〜52位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特異的に結合する抗体と競合する若しく は交差反応性を示す抗体、または該抗体の断片である（5— 6— 2)の可溶性 CD14 抗原の測定キット。
(5-6 -6)配列番号 3に記載のヒト全長可溶型 CD 14蛋白質の 17位〜 26位のアミ ノ酸残基の 、ずれかの領域に特異的に結合する抗体または該抗体の断片、ある 、 は配列番号 3に記載のヒト全長可溶型 CD 14蛋白質の 17位〜 26位のアミノ酸残基 のいずれかの領域に特異的に結合する抗体と競合する若しくは交差反応性を示す 抗体、または該抗体の断片である（5— 6— 2)の可溶性 CD14抗原の測定キット。
[0045] (5-6 - 7)上記 a)〜d)の 、ずれかの抗体または該抗体の断片が不溶性担体に結 合して 、る（5— 6— 1)〜（5— 6— 6)の!、ずれかの可溶性 CD14抗原の測定キット。 (5-6 -8)上記第二の結合物質が不溶性担体に結合して 、る（5— 6— 2)〜（5— 6 6)のいずれかの可溶性 CD14抗原の測定キット。
(5-6 - 9)上記 a)〜d)の 、ずれかの抗体または該抗体の断片が標識されて!、る (5 6— 1)〜（5— 6— 6)若しくは（5— 6— 8)の!、ずれかの可溶性 CD14抗原の測定 やット。
(5-6 - 10)上記第二の結合物質が標識されて!、る（5— 6— 1)〜（5— 6— 7)のい ずれかの可溶性 CD14抗原の測定キット。
[0046] (5-6 - 11)さらに第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質を含む (5— 6
2)〜（5— 6— 10)の!、ずれかの可溶性 CD14抗原の測定キット。 (5-6 - 12)第二の特異結合物質に結合するパートナー力 上記 a)〜c)の 、ずれ かの抗体若しくは該抗体の断片、または上記第二の結合物質である（5— 6— 11)の 可溶性 CD14抗原の測定キット。
(5— 6— 13)さらに第二の特異結合物質に結合する第二の特異結合物質のパート ナーを含む（5— 6— 11)の可溶性 CD14抗原の測定キット。
(5-6 - 14)第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質若しくは第二の特異 結合物質のパートナーが不溶性担体に結合して 、る（5— 6— 11)〜（5— 6— 13)の いずれかの可溶性 CD 14抗原の測定キット。
[0047] (5-6 - 15)第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質若しくは第二の特異 結合物質のパートナーが標識されて 、る（5— 6— 11)〜（5— 6— 13)の!、ずれかの 可溶性 CD14抗原の測定キット。
(5— 6— 16)競合法によるサンドイッチ免疫測定法により測定する、標識した上記（1 )の可溶性 CD14抗原若しくは標識した上記（1)の可溶性 CD14抗原の類似物質を 含む（5— 6— 1)〜（5— 6— 8)若しくは（5— 6— 11)〜（5— 6— 14)のいずれかの可 溶性 CD14抗原の測定キット。
[0048] (5— 6— 17)標識が、酵素、色素、金コロイド、着色ラテックス、化学発光物質、蛍光 物質またはアイソトープの少なくとも一つによる標識である（5— 6— 9)、（5— 6— 10) 、 (5-6- 15)若しくは（5— 6— 16)の!、ずれかの可溶性 CD14抗原の測定キット。 (5-6 - 18)標識した上記（1)の可溶性 CD14抗原の類似物質が、標識した上記 (2 )の組換え型可溶性 CD 14フラグメントである（5— 6— 16)の可溶性 CD14抗原の測 定キット。
(5-6 - 19)上記 a)〜c)のいずれかの抗体または該抗体の断片が不溶性担体に結 合しており、上記第二の結合物質が、上記 d)の抗体または該抗体の断片である（5— 6- 2)の可溶性 CD 14抗原の測定キット。
(5— 7)凝集法、直接固相法若しくは競合法により測定する、（5— 1)〜（5— 6)のい ずれかの可溶性 CD14抗原の測定キット。
(5— 8)上記（2)若しくは（3)の組換え型可溶性 CD14フラグメントを標準物質として さらに含む（5— 1)〜（5— 7)の可溶性 CD14抗原の測定キット。 [0049] (6)下記（6— 1)〜（6— 3)の!、ずれかに示す上記（1)の可溶性 CD14抗原の測定 方法。
(6— 1)少なくとも一つの上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体若 しくは該抗体の断片を、上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合させることを 特徴とする、上記（1)の可溶性 CD14抗原の免疫学的な測定方法。
[0050] (6- 2)上記（1)の可溶性 CD 14抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断 片として、以下の a)〜d)のいずれかの抗体または該抗体の断片を用いることを特徴 とする（6— 1)の可溶性 CD14抗原の免疫学的な測定方法、
a)配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体、 b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 8〜 16アミノ酸残基から なるペプチドを抗原として作製される抗体、
c)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体 d)上記（2)若しくは（3)に記載の組換え型可溶性 CD14フラグメントと特異的に結合 する抗体。
[0051] (6— 3)上記（1)の可溶性 CD14抗原に結合する第二の結合物質を用いて、上記 a) 〜c)のいずれかの抗体若しくは該抗体の断片と該第二の結合物質とのサンドイッチ 免疫測定法により、上記（1)の可溶性 CD14抗原を測定することを特徴とする、 (6- 2)の可溶性 CD14抗原の免疫学的な測定方法。
さらに以下の新規な抗体及び上記（1)の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体 のスクリ一二ング方法を提供する。
[0052] (7)下記（7— 1)〜 〜 4)のいずれかに示す、上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異 的に結合する抗体。
(7- 1)上記（1)の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体。
(7— 2)ヒト血中の全長可溶型 CD14蛋白質に実質的に結合せず、上記（1)の可溶 性 CD14抗原に特異的に結合する（7— 1)の抗体。
(7- 3)上記（2)の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製されたことを 特徴とする（7— 1)若しくは（7— 2)の抗体。 (7-4)モノクローナル抗体である（7— 1)〜（7— 3)のいずれかの抗体。
[0053] (8)下記（8— 1)〜（8— 5)の 、ずれかに示す、上記（2)の組換え型可溶性 CD14フ ラグメントに特異的に結合する抗体。
(8- 1)上記（2)の組換え型可溶性 CD 14フラグメントに特異的に結合する抗体。 (8- 2)ヒト血中の全長可溶型 CD 14蛋白質に実質的に結合せず、上記（2)の組換 え型可溶性 CD 14フラグメントに対して結合する（8— 1)の抗体。
[0054] (8— 3)上記（2)の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製されたことを 特徴とする (8— 1)若しくは (8— 2)の抗体。
(8-4)モノクローナル抗体である（8— 1)〜（8— 3)の!、ずれかの抗体。
(8— 5) F1237— 3— 4抗体である（8— 4)の抗体。
[0055] (9)下記（9 1)〜（9 4)のいずれかに示す、上記（3)の組換え型可溶性 CD14フ ラグメントに特異的に結合する抗体。
(9- 1)上記（3)の組換え型可溶性 CD 14フラグメントに特異的に結合する抗体。 (9— 2)ヒト血中の全長可溶型 CD14蛋白質に実質的に結合せず、上記（3)の組換 え型可溶性 CD 14フラグメントに対して結合する（9— 1)の抗体。
(9— 3)上記（3)の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製されたことを 特徴とする（9 1)若しくは（9 2)の抗体。
(9-4)モノクローナル抗体である（9 1)〜（9 3)の!、ずれかの抗体。
[0056] (10)下記（10— 1)〜（： LO— 13)のいずれかに示す、上記 (1)の可溶性 CD14抗原 の測定に有用な抗体のスクリーニング方法。
(10— 1)下記の工程を含む、上記（1)の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体の スクリーニング方法、
1)配列番号 3に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 6〜20アミノ酸残基か らなるペプチドと特異的に結合する抗体をスクリーニング対象検体として用意するェ 程、
2) CD14を含む測定対象液を用意する工程、
3) 1)で用意した抗体若しくは、 2)で用意した測定対象液を用いて、免疫測定系を 構成する工程、 4) 3)で構成した免疫測定系により、測定対象液を測定する工程、及び
5) 4)で得た測定結果により、上記（1)の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体を 評価し、選択する工程。
[0057] (10- 2)上記 1)の工程で用意する抗体が、配列番号 3に記載のアミノ酸配列のうち N末端が 1位から 314位までのアミノ酸配列力も選択される連続した 6〜20アミノ酸残 基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体であることを特徴とする（10— 1)のスクリ 一ユング方法。
(10- 3)上記 1)の工程で用意する抗体が、配列番号 3に記載のアミノ酸配列から選 択される連続した 8〜30アミノ酸残基カゝらなるペプチドを抗原として作製される抗体 であることを特徴とする（10—1)のスクリーニング方法。
(10-4)上記 1)の工程で用意する抗体が、配列番号 3に記載のアミノ酸配列のうち N末端が 1位から 314位までのアミノ酸配列力も選択される連続した 8〜30アミノ酸残 基カゝらなるペプチドを抗原として作製される抗体であることを特徴とする（10— 2)のス クリーニング方法。
[0058] (10— 5)上記 2)の工程で用意する測定対象液が、正常人の体液若しくはヒト高分子 量 CD14の標品であることを特徴とする（10—1)のスクリーニング方法。
(10-6)上記 3)の工程で構成する免疫測定系が、抗原固相化法であることを特徴と する（10— 1)〜（： LO— 5)のいずれかのスクリーニング方法。
(10- 7) 1)で用意した抗体に対する標識抗体をさらに用意し、上記 3)の工程で構 成する抗原固相化法は、 2)で測定対象液を不溶性担体に結合させて構成し、 4)の 工程は、 3)で構成した抗原固相化法による測定系に 1)で用意した抗体と該標識抗 体を順に反応させることを特徴とする（10— 6)のスクリーニング方法。
[0059] (10— 8)上記 5)の評価し、選択する工程が、 1)で用意した抗体が高分子量 CD14 と特異的には結合しないことを評価して、選択することを特徴とする（10— 6)若しくは (10- 7)のスクリーニング方法。
(10- 9)さらに下記の工程を含む、以下の特徴を有する（10— 1)〜（10— 4)のい ずれかのスクリーニング方法、
1)一（2)もう一つの配列番号 3に記載のアミノ酸配列力 選択される連続した 6〜2 0アミノ酸残基力もなるペプチドと特異的に結合する抗体若しくは抗 CD14抗体を用 意する工程、
上記 2)の工程で用意する測定対象液が、正常人の体液と敗血症患者の体液であ る、
上記 3)の工程で構成する免疫測定系が、 1)と 1)一（2)で用意した 2つの抗体を用 いた、サンドイッチ測定法である、
上記 5)の抗体を評価し、選択する工程が、正常人の体液の測定結果と、敗血症患 者の体液の測定結果を比較し、比較した測定結果の違いにより敗血症の診断に有 用なサンドイッチ免疫測定法に用いるための抗体を評価して、選択する工程である。
[0060] (10— 10)本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の測定に有用なサンドイッチ免 疫測定法に用いるための抗体の組み合わせをスクリーニングする方法であることを特 徴とする（10— 9)のスクリーニング方法。
(10- 11)上記 2)の工程で用意する正常人及び敗血症患者の体液力 血液サンプ ルであることを特徴とする（10— 9)若しくは（ 10— 10)のスクリ一ユング方法。
(10— 12)上記 3)の工程で構成するサンドイッチ免疫系において、 1)若しくは 1) - ( 2)で用意した抗体を、不溶性担体に結合させて、構成することを特徴とする（10— 9 )若しくは（10— 10)のスクリーニング方法。
(10— 13)上記 3)の工程で構成するサンドイッチ免疫系において、 1)若しくは 1) - ( 2)で用意した抗体を、標識させて、構成することを特徴とする（10— 9)若しくは（10 10)のスクリーニング方法。
[0061] (11)下記（11 1)〜（： L 1 5)のいずれかに示す、上記 (1)の可溶性 CD14抗原の 測定に有用な抗体のスクリーニング方法。
(11 - 1)下記の工程を含む、上記（1)の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体の スクリーニング方法、
1)抗体をスクリーニング対象検体として用意する工程、
2)上記（2)の組換え型可溶性 CD14フラグメントを用意する工程、
3) 1)で用意した抗体を 2)で用意したフラグメントと反応させ、 1)で用意した抗体と 2 )で用意したフラグメントの特異的な結合を評価する工程、及び、 4)3)において、 2)で用意したフラグメントに特異的に結合した抗体を、上記（1)の 可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体として、選択する工程。
[0062] (11-2) 1)の工程で、用意する抗体が、配列番号 3に記載のアミノ酸配列力 選択 される連続した 6〜356のいずれかの個数のアミノ酸残基力もなる蛋白質と特異的に 結合する抗体であることを特徴とする（11 1)のスクリーニング方法。
(11-3) 1)の工程で、用意する抗体が、配列番号 3に記載の 53位〜 68位力も選択 される連続した少なくとも 7個のアミノ酸残基を含む蛋白質と特異的に結合する抗体 であることを特徴とする（11— 1)のスクリーニング方法。
(11 4)3)の工程で反応させ、特異的な結合を評価する系が、抗原固相化法であ ることを特徴とする（11 1)〜（11 3)の 、ずれかのスクリ一ユング方法。
[0063] (11-5)3)の工程で反応させ、特異的な結合を評価する系が、サンドイッチ免疫測 定法であることを特徴とする（11 1)〜（11 3)の 、ずれかのスクリ一ユング方法。 (11 6)3)の工程で反応させ、特異的な結合を評価する系が、生体分子間相互作 用解析法であることを特徴とする（11 1)〜（11 3)の 、ずれかのスクリーニング方 法。
[0064] さらにまた、以下の特定の上記（2)の糸且換え型可溶性 CD 14フラグメントの生産方 法を提供する。
[0065] (12)下記（12— 1)〜（12— 3)のいずれかに示す、上記（2)の組換え型可溶性 CD 14フラグメントの生産方法。
(12— 1)下記の工程を含む、上記（2— 3)の組換え型可溶性 CD14フラグメントの生 産方法、
く 1〉下記の 1)〜4)の配列を有する組換え型可溶性 CD14フラグメントを作製するェ 程、
1)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または 該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜： LO 個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
2) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである、
3) C末端が配列番号 3の 134位〜 356位のいずれかである、 4)所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号 3の 59位〜 70位の後ろ に置換若しくは挿入されて 、る。
く 2X1〉で作製した組換え型可溶性 CD14フラグメントを該所定の蛋白分解酵素に より切断する工程、及び
く 3X2〉で切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程。
[0066] (12— 2)〈1〉の工程の 4)において所定の蛋白分解酵素が ProScission Protease であり、切断部位の配列が Leu, Glu, Val, Leu, Phe, Gin, Gly, Proである（12— 1)の上記（2— 3)の組換え型可溶性 CD14フラグメントの生産方法。
(12— 3)〈1〉の工程の 4)において所定の蛋白分解酵素が Thrombinであり、切断部 位の配列力 SLeu, Val, Pro, Arg, Gly, Serである（12— 1)の上記（2— 3)の組換え 型可溶性 CD14フラグメントの生産方法。
発明の効果
[0067] 本発明の新規可溶性 CD14抗原は、敗血症患者の診断のマーカーとして有用で ある。また、該可溶性 CD14抗原は、該可溶性 CD14抗原の測定に用いる標準物質 若しくは競合物質となり得る。
また、本発明の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、該可溶性 CD14抗原と免疫 学的に類似した性質を有するため、該可溶性 CD14抗原の測定に用いる標準物質 若しくは競合物質となり得、さらに該可溶性 CD14抗原の測定に用いることができる 抗体のスクリーニングに用いることができる。
[0068] 該可溶性 CD14抗原と免疫学的に類似した性質とは、公知の CD14抗体との結合 性及び該可溶性 CD14抗原と結合する抗体との結合性が、本発明の組換え型可溶 性 CD14フラグメントは、該可溶性 CD14抗原と本発明の組換え型可溶性 CD14フラ グメントとほぼ一致して 、ることを示す。
また、本発明の該可溶性 CD14抗原の測定キット及び測定方法は、該可溶性 CD1
4抗原を高感度、簡便かつ特異的に定性又は定量でき、敗血症患者の診断に有用 である。
[0069] さらに、本発明のスクリーニング方法は、該新規可溶性 CD14抗原の測定に用いる ための抗体の探索に有用である。 さらにまた、本発明の組換え型可溶性 CD14フラグメントの生産方法は、今まで原 核細胞や真核細胞、特に酵母細胞にぉ 、て発現することができな力つた組換え型可 溶性 CD14フラグメントの生産を可能する。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、 S68ペプチドポリクローナル抗体と本発明の可溶性 CD14抗原の結合 を S68ペプチドのみが阻止する結果を示した図である。（A)は、正常人血清中で結 合していない状態を示し、（B)は、敗血症患者血清中での S68ペプチドの結合阻害 を示す。
[図 2]図 2は、 sCD14 (1— 307) S286C蛋白質を用いた実施例 7— (1)の EIAキット の標準曲線を示した図である。
[図 3]図 3は、 sCD14 (1— 307) S286C蛋白質を用いて実施例 7— (1)の EIAキット の測定値に正常人血清由来可溶性 CD14抗原が影響しないことを示した図である。
[図 4]図 4は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより敗血症患者血中の実施例 7—（1)の E IAキットで検出される可溶性 CD14抗原及び高分子量 CD14蛋白質をそれぞれ実 施例 7—（1)の EIAキット及び巿販 CD14—EIAキット（IBL- Hamburg)により解析し た結果を示した図である。
[図 5]図 5は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより敗血症患者血清中の実施例 7— (1) の EIAキットで検出される可溶性 CD14抗原及び高分子量 CD14蛋白質をそれぞれ 実施例 7— (1)の EIAキット及び巿販 CD14— EIAキット（IBL- Hamburg)により解析 した結果を示した図である。上方の黒矢印は、キャリブレーションに用いたマーカー の位置を示す。左力ら BSA、ォブアルブミン、キモトリプシノーゲン A、リボヌクレア一 ゼ Aである。
[図 6]図 6は、敗血症患者血清を F1024— 1— 3— Sepharos™4Bをプレカラムとした S68— Sepharose™4FF抗体カラムに通した後の画分をゲル濾過クロマトグラフィー にて分画した画分を、実施例 7— (1)の EIAキットで検出される可溶性 CD14抗原及 び高分子量 CD14蛋白質をそれぞれ実施例 7— (1)の EIAキット及び巿販 CD 14— EI Aキット (IBL- Hamburg)により解析した結果を示した図である。上方の黒矢印は、 図 5と同様である。 [図 7]図 7は、図 6に記載したゲル濾過クロマトグラフィー分画フラクション 10— 16を個 別に凍結乾燥に供し、ウェスタンブロッテイングに供した結果を示した図である。
[図 8]図 8は、正常ヒト血清を F1024— 1— 3— SepharosTM4Bをプレカラムとした S6 8— Sepharose™4FF抗体カラムに通した後の画分をゲル濾過クロマトグラフィーに て分画したフラクション 10— 16を個別に凍結乾燥に供し、ウェスタンブロッテイングに 供した結果を示した図である。
[図 9]図 9は、精製した rsCD14— ST (2ST64)及び（PSP64)を SDS - PAGEで泳 動後、銀染色法により染色した像を示した図である。
[図 10]図 10は、 sCD14— ST及び PSP64を S68抗体で染色したウェスタンブロティ ング像を示した図である。
[図 11]図 11は、 rsCD14— ST (2ST64)を用 、た実施例 16の EIAキットの標準曲線 を示した図である。
[図 12]図 12は、 rsCD14— ST (PSP64)を投与したゥサギの抗血清の抗体価を正常 ゥサギ血清と比較した図である。
[図 13]図 13は、 rsCD14— ST (2ST64)を用 、た実施例 19の EIA測定系の標準曲 線を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0071] 以下に、より詳細に本発明を説明する。
ヒト血中に存在する主要な可溶型 CD14蛋白質には、先行技術の欄に記載した Landmannらの報告に記載される約 55kDa及び約 49kDaの可溶型 CD14蛋白質が ある。これらは、ヒト全長可溶型 CD14蛋白質及びヒト全長可溶型 CD14蛋白質から C末端が 41アミノ酸以下し力欠失していない蛋白質 (以降、「ヒト」を省略し、高分子 量 CD14と記載することがある）である。 WO01Z22085号公報では、これらの高分 子量 CD14は、 F1025— 3— 1抗体と特異的に結合することが確認されて 、る。
[0072] また、上記の高分子量 CD14の他に、低分子量の CD14として分子量 36kDaの蛋 白質の記載もある。
本発明者らは、上記の高分子量 CD14及び WO01Z22085号に記載されている 分子量 36kDaの CD14とは異なる、正常人と比較して敗血症患者の血中に多く存在 する新規可溶型 CD14蛋白質を見出した。
なお、本明細書に記載する「可溶型 CD14蛋白質」とは、ヒト血漿中（若しくはヒト血 清中）に存在している蛋白質のことであり、「可溶性 CD 14蛋白質」ともいうことができ る。特に、細胞膜に結合しヒト血漿中には存在しない「膜結合型 CD14蛋白質」と対 比する意味で用いる場合、「可溶型 CD14蛋白質」と記載して!/、る。
[0073] 本発明で記載する「ペプチド若しくはフラグメント等を「抗原として作製される抗体」」 若しくは「「ペプチド若しくはフラグメント等を抗原として作製した抗体」」とは、「抗原」 とするペプチド若しくはフラグメントを各種動物に免疫して、作製される若しくは作製し た抗体である。該抗体は「抗原」とするペプチド若しくはフラグメントをェピトープ若しく はェピトープの一部分とする。また、該抗体は「抗原」とするペプチド若しくはフラグメ ントに特異的に結合する。
[0074] 「抗原として作製される抗体」若しくは「抗原として作製した抗体」には、「抗原」とする ペプチドに免疫原性を有させるためにキャリア若しくはキャリア蛋白を付加させたり、 他のアミノ酸残基を付加させたりしたペプチドを免疫原として作製した抗体であっても 、上記の性質を示せば「抗原として作製される抗体」若しくは「抗原として作製した抗 体」に含まれる。
[0075] また、「特異的に結合する抗体」とは、特異的に結合する対象と免疫学的に結合す る抗体、若しくは特異的に結合する対象と通常の抗原抗体反応を示す抗体である。 例えば、抗原抗体反応を示すことは、凝集法、サンドイッチ法、固相直接法または固 相結合法、競合法等で確認できる。また、「特異的に結合する抗体」と特異的に結合 する対象との結合を親和性として表した場合、通常、解離定数 (KD)は、 10_7M未 満である。結合試験上、解離定数測定が得られない場合に実質的に結合しないと記 載する。また、「特異的に結合する」場合と比べて、その結合能が 10倍以下、好ましく は 100倍以下、より好ましくは 1, 000倍以下である場合等の非特異的結合し力確認 できな 、場合にも実質的に結合しな 、と記載する。
[0076] 「LPSと結合しない」とは、該組換え型可溶性 CD14フラグメントと LPSとの結合能 がない、若しくはほとんどないことである。生体内全長 CD14若しくは配列番号 3に記 載のヒト全長可溶型 CD14蛋白質は、生体内若しくは血清中では LPSとの結合能を 有し、その複合体は細胞を活性ィ匕する。「LPSと結合しない」該組換え型可溶性 CD 14フラグメントは、生体内全長 CD14若しくは配列番号 3に記載のヒト全長可溶型 C D14蛋白質と LPSとの結合能よりも多くとも 1Z100以下であることである。
[0077] 本発明の第一の態様は、下記 1)〜3)の性質を有する可溶性 CD14抗原である。
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13± 2kDa、
2) N末端配列に配列番号 1のアミノ酸配列を有する、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
[0078] 本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、上記 1)の性質を有する。すなわち、 非還元条件下 SDS— PAGEにより、分子量 13± 2kDaの位置に本発明の第一の態 様の可溶性 CD14抗原由来のバンドが検出される。
特に非還元条件下の 12. 5%SDS— PAGEで、 Precision plus protein™ du al color standards (Bio— Rad社）を用いて分子量を算出すると、分子量 13± 2k Daの位置にバンドが検出される。
[0079] 本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、上記 2)の性質を有する。配列番号 1 に記載ののアミノ酸配列は、配列番号 3に記載のヒト CD14の N末端のアミノ酸配列と 一致する。このことから、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、ヒト CD14の 一種であることが確認される。
本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、上記 3)の性質を有する。上記 3)の 特徴に記載される配列番号 2に記載のアミノ酸残基力もなるペプチドは、配列番号 3 に記載のヒト CD14の 53位から 68位までの 16アミノ酸残基に該当する。現在ヒト蛋白 質において配列番号 2の配列を含む他の蛋白質はヒト CD14以外には知られておら ず、該配列はヒト CD14に特異的に含まれる配列であるといえる。このことからも、本 発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、ヒト CD14の一種であることが確認される
[0080] また、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、下記 4)の性質によりさらに特 徴付けられることが好まし 、。
4)ヒト血漿中より得られうる（1— 1)の可溶性 CD14抗原。 上記 4)の性質により特徴付けられる本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、 ヒト血漿中に存在する蛋白質である。後述する精製方法により、本発明の第一の態 様の可溶性 CD14抗原は高純度で得られる。また、本発明の第一の態様の可溶性 C D14抗原は、敗血症患者では高濃度となっている。このことにより、敗血症の診断若 しくは検出方法のマーカーとなり得る。
また、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、敗血症の診断若しくは検出に 有用な本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定するためのキットに用いる標 準物質若しくは競合物質となり得る。
[0081] 本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を精製する方法について記載する。
本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、ヒト血漿若しくはヒト血清から、ヒト C D14関連の抗体ァフィユティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、 SDS— PAGEの組み合わせにより、精製することができる。後述する本発明の第五 の態様の、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の測定キットを用いることにより 、カラムクロマトグラフィーの溶出画分の本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の 検出が、効率よくできる。
[0082] ヒト CD14関連の抗体とは、抗ヒト CD14抗体、またはヒト CD14のアミノ酸配列に由 来するペプチドに対する抗体である。例えば、抗ヒト CD14抗体として F1025— 3— 1 抗体若しくは F1024— 1 - 3抗体のァフィユティークロマトグラフィーを用いることによ り、高分子量 CD14と分離することができる。このとき高分子量 CD14は抗体に吸着し 、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、初流に分画される。さらに、配列番 号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体のァフィ-ティ 一クロマトグラフィーを用いることにより、血清中の他の蛋白と分離することができる。
[0083] 本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、抗体に吸着され、溶媒を酸性にする ことにより溶出される。なお、 F1025— 3— 1抗体は及び F1024— 1— 3抗体を産生 するハイプリドーマはそれぞれ、 WO01Z22085号及び WO01Z72993号に記載 の通り、受託番号 FERM BP— 7296及び受託番号 FERM BP— 7511として、日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センター (IPOD)に国際寄託されている。 [0084] また、抗ヒト CD14ポリクローナル抗体のァフィ-ティークロマトグラフィーにより血清 中の可溶性 CD14抗原と他の蛋白とを分離することができる。その後上記の抗ヒト C D14モノクローナル抗体のァフィ-ティークロマトグラフィーにより高分子量 CD14と 分離することができる。
また、ヒト血清若しくは上記のァフィユティークロマトグラフィーにより部分精製した画 分のゲルろ過クロマトグラフィーにより、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を 、さらに精製ができる。このとき上記の通り、本発明の第五の態様の測定キットを用い て、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を検出される画分を収集してもよい。 また分子量マーカーを用いることにより、分子量 35± lOkDaの画分を収集してもよ い。
[0085] また、上記の通り部分精製した画分の非還元 SDS— PAGEを行い、 13± 2kDaの 位置を収集することにより、さらに精製できる。収集した画分は、本発明の第一の態 様の可溶性 CD14抗原が、メインの蛋白質として、純度高く精製されている。
[0086] さらに陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳 動等により精製することにより、より高い純度を求めることができる。例えば、本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原は、 pH8. 5における陰イオン交換カラムクロマトグ ラフィーでは 0. 3M付近のイオン強度に溶出される。
[0087] 本発明の第二の態様は、下記 1)〜3)の性質を有する組換え型可溶性 CD 14フラ グメントである。
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13± 2kDa、
2) 3C10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
[0088] 本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、下記の 5)〜7)の配 列を有する組換え型可溶性 CD14フラグメントが例示される。
5)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しく は該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである。 6) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである。
7) C末端が配列番号 3の 59位〜 90位の!/、ずれかである。
[0089] この例示した中でも、 6)にお!/、て N末端が配列番号 3の 1位〜 6位の!/、ずれかであ る組換え型可溶性 CD 14フラグメントが好ましく、 N末端が配列番号 3の 1位である組 換え型可溶性 CD 14フラグメントがより好ま 、。
また、 7)において C末端が配列番号 3の 59位〜 80位のいずれかである組換え型 可溶性 CD14フラグメントが好ましぐ C末端が配列番号 3の 64位〜 75位のいずれか である組換え型可溶性 CD 14フラグメントがより好ましぐ C末端が配列番号 3の 64位 である組換え型可溶性 CD 14フラグメントがさらに好ましい。
[0090] 特に、 6)において N末端が配列番号 3の 1位であり、 7)において C末端が配列番号
3の 64位である（2— 3)〜（2— 5)のいずれかの組換え型可溶性 CD 14フラグメント が好ましい。
また、 5)において配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメント である組換え型可溶性 CD 14フラグメントが好ましい。
[0091] 本発明の第二の態様の組換え型可溶性フラグメントを遺伝子工学的に生産する方 法を以下に説明するが、特に限定されず、常法を用いることができる。
一般に、アミノ酸をコードする遺伝子の DNAのトリプレット（コドン）は、アミノ酸の種 類によって 1種類から 6種類まで存在することが知られているので、本発明のフラグメ ントのアミノ酸配列をコードする遺伝子の DNAの塩基配列は 1種類には限定されな い。従って、本発明のフラグメントをコードする塩基配列を含有する遺伝子である限り 、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。該遺伝子は cDNA、染色体 DNA およびそれらの組合せならびに適当にスプライシングされうるイントロンを含む cDNA であってもよぐ遺伝子工学的な取扱いの容易さから、 cDNAであることが好ましい。
[0092] 該遺伝子は、 Vヽかなる方法で得られたものであってもよ ヽ。例えば、化学合成され たものであってもよぐ適当な DNAライブラリ一力も得たものであっても、 CD 14の全 長または部分をコードする遺伝子の DNAを含む DNAを铸型として PCR (Polymera se Chain Reaction)法で得たものであってもよい。また、これらの方法で得た遺伝 子またはその断片を必要に応じてアニーリング、ライゲーシヨンして作製することもで きる。
[0093] 該遺伝子の DNAは、以下のようにして化学合成をすることができる。具体的には、 該遺伝子の DNAを約 20— 30塩基力もなる断片に分けて、 DNA化学合成機 (例え ば、 394型、アプライドバイォシステムズ社製)を用いて、複数の断片として合成し、そ の後、必要に応じて各断片の 5'末端をリン酸ィ匕して各断片をアニーリングし、ライゲ ーシヨンして目的の DNAを得る。
[0094] また該遺伝子は、ゲノムライブラリーもしくは cDNAライブラリ一等を铸型とする PCR 法によっても得ることができる。 PCR法を用いる場合、公知の塩基配列および本発明 のフラグメント若しくは蛋白分解酵素の切断部位を挿入若しくは置換されたフラグメン ト（以下、本発明のフラグメント等と記載することがある）をコードする遺伝子の DNA等 の塩基配列をもとに、また必要に応じて制限酵素認識配列等組み合わせて設計した 、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製し、任意の DNAライブラリー 等に対して公知の方法（Michael AL等編、 Polymerase Chain Reaction, P し R Protocols, a guide to methods and applications ^ 1990、 Academic Press,参照）に準拠して行うことによって得ることができる。 上述した DNAライブ ラリーは、該遺伝子の DNAまたはその一部を含むものであればよぐ特に限定され ない。したがって、市販の DNAライブラリーを使用してもよぐヒトの末梢血など力も得 たリンパ球、ヒトの株化細胞、またはハイプリドーマなどといった適当な細胞を、必要 があれば適当な活性化剤で活性ィ匕し、サムブルック J.らの方法に準拠して cDNA を作製して使用してもよい。 一般に、アミノ酸をコードする遺伝子の DNAのトリプレ ット（コドン）は、アミノ酸の種類によって 1種類カゝら 6種類まで存在することが知られて いるので、本発明のフラグメント等のアミノ酸配列をコードする遺伝子の DNAの塩基 配列は 1種類には限定されない。従って、本発明のフラグメント等をコードする塩基配 列を含有する遺伝子である限り、 V、かなる塩基配列力もなるものであってもよ 、。
[0095] 組換えベクターは、環状または直鎖状等、 1本鎖または 2本鎖ならびにその複合し た鎖等、いかなる形態のものであってもよぐ 目的に応じて適宜選択しうるが、取り扱 いの容易さや宿主中への組み込みの容易さからは、環状であることが好ましぐ安定 性等からは 2本鎖であることが好まし 、。 [0096] 「組換え型可溶性 CD14フラグメント」は、配列番号 3に記載のヒト全長 CD14蛋白 質の部分的なアミノ酸配列を有する遺伝子組換えにより作製した可溶性のフラグメン トである。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 1)の性質を有 する。すなわち、非還元条件下 SDS— PAGEにより、分子量 13± 2kDaの位置に本 発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント由来のバンドが検出される。
[0097] 特に非還元条件下の 12. 5%SDS— PAGEで、 Precision plus protein™ du al color standards (Bio— Rad社）を用いて分子量を算出すると、分子量 13± 2k Daの位置にバンドが検出される。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 2)の性質を有 する。すなわち、 3C10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない。
[0098] 「3C10及び MEM— 18とは特異的に結合はしない」とは、 3C10及び MEM— 18 の両抗体とは、該組換え型可溶性 CD14フラグメントが免疫学的に結合しないこと、 若しくは通常の抗原抗体反応を示さないことである。「3C10及び MEM— 18とは特 異的に結合はしない」本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、 生体内全長 CD14若しくは配列番号 3に記載のヒト全長組換え型可溶型 CD14蛋白 質と比較すると、 3C10及び MEM— 18とのそれぞれの結合能力 lZlOO以下であ る。好ましくは 1Z1, 000以下である。
[0099] 本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 3)の性質を有 する。特にポリクローナル抗体と特異的に結合する。上記 3)の特徴に記載される配 列番号 2に記載のアミノ酸残基力もなるペプチドは、配列番号 3に記載のヒト CD14の 53位力も 68位までの 16アミノ酸残基に該当する。そして、該ポリクローナル抗体は 7 アミノ酸以上の長さの配列を認識する (後述する実施例 4参照)ことより、第二の態様 の組換え型可溶性 CD 14フラグメントは、配列番号 3に記載のヒト CD14の 53位から 68位までのいずれかの連続した 7アミノ酸以上の長さの配列は、少なくとも有してい る。
[0100] 3C10及びMEM—18は、非常に有名な抗 CD 14抗体であり、 CD14上のェピトー プはそれぞれ 7位〜 14位及び 57位〜 64位にあると認識されている。そして、従来の ヒト CD14由来の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、その配列が上記のェピトー プ部分の領域を有する限り、 3C 10若しくは MEM - 18に結合すると認識されて!、る
[0101] 本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 1)〜3)の性質 を有しており、そのことにより、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と物性及び 免疫学的に類似した性質を有する。特に免疫学的な性質が類似しているということは 、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原とェピトープとなり得るアミノ酸残基の配 列の立体構造が類似しているということが推定できる。そのため、本発明の第一の態 様の可溶性 CD14抗原を測定するときの標準物質として、特に有用となる。本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定するときの一般的な標準物質としては、ヒト C D14の N末端 1位〜 307位のアミノ酸を有しかつ 286位のセリンをシスティンに置換 した組換えポリペプチド (以下、 rsCD14 (l— 307) S286Cと記載）が使用可能であ る力 本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、分子量が近似し ていることにより、免疫学的な反応を物質量に換算するときに都合がよい。また、本発 明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、溶媒の状態が変化しても、 本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と反応性が類似する。例えば、クェン酸加 血と EDTA加血力も検体では、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と rsCDl 4 (1— 307) S286Cとの本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原との免疫学的な 反応性は異なるが、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と本発明の第二の態 様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントは、免疫学的な反応性は一致している。同様 に、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を競合法等で測定するときの類似物 質としても有用である。
[0102] さらに、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、本発明の第 一の態様の可溶性 CD14抗原と免疫学的に類似した性質を有するため、本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定するための抗体をスクリーニングする時に特 異的結合の対象として用いることができる。本来本発明の第一の態様の可溶性 CD1 4抗原を特異的結合の対象として用いればょ 、が、生体内にぉ 、てごく微量にしか 存在しないため、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、代 用品として特に有用となる。
[0103] 上記の通り、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、種々の 有用性を有するが、これは上記 1)〜3)の性質を有するためである。すなわち、上記 1)〜3)の性質を有する本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント は、配列により表されるものではなぐ CD14フラグメントの物性及び免疫学的な性質 t 、う機能で表現されるものである。
[0104] さらに、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 4) LPS に結合しない、という性質を有する。国際公開第 WO96Z20956号には、具体的な ペプチドの記載はないが、ヒト CD14の 57位〜 64位を含む 8〜60個のアミノ酸を有 し、 LPSに結合するペプチドが開示されている。該ペプチドと本発明の第二の態様 の組換え型可溶性 CD 14フラグメントは、一致するものではないが、本発明の第二の 態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントは、特に上記 4)の性質を有することにより 、明らかに異なることが理解できる。
[0105] 本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、下記の 5)〜7)の配 列を有する組換え型可溶性 CD14フラグメントが例示される。
5)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しく は該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである。
6) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである。
7) C末端が配列番号 3の 59位〜 90位の!/、ずれかである。
この例示した中でも、 6)において N末端が配列番号 3の 1位〜 6位のいずれかであ る組換え型可溶性 CD14フラグメントが好ましく、 N末端が配列番号 3の 1位である組 換え型可溶性 CD14フラグメントがより好ま 、。
[0106] また、 7)にお!/、て C末端が配列番号 3の 59位〜 80位の!/、ずれかである組換え型 可溶性 CD14フラグメントが好ましぐ C末端が配列番号 3の 64位〜 75位のいずれか である組換え型可溶性 CD14フラグメントがより好ましぐ C末端が配列番号 3の 64位 である組換え型可溶性 CD14フラグメントがさらに好ましい。
特に、 6)において N末端が配列番号 3の 1位であり、 7)において C末端が配列番号 3の 64位である（2— 3)〜（2— 5)のいずれかの組換え型可溶性 CD 14フラグメント が好ましい。
[0107] また、 5)にお 、て配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメント である組換え型可溶性 CD 14フラグメントが好ましい。
本発明のフラグメントを遺伝子工学的に生産する方法を以下に説明するが、特に 限定されず、常法を用いることができる。
[0108] 一般に、アミノ酸をコードする遺伝子の DNAのトリプレット（コドン）は、アミノ酸の種 類によって 1種類から 6種類まで存在することが知られているので、本発明のフラグメ ントのアミノ酸配列をコードする遺伝子の DNAの塩基配列は 1種類には限定されな い。従って、本発明のフラグメントをコードする塩基配列を含有する遺伝子である限り 、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。該遺伝子は cDNA、染色体 DNA およびそれらの組合せならびに適当にスプライシングされうるイントロンを含む cDNA であってもよぐ遺伝子工学的な取扱いの容易さから、 cDNAであることが好ましい。
[0109] 該遺伝子は、 Vヽかなる方法で得られたものであってもよ ヽ。例えば、化学合成され たものであってもよぐ適当な DNAライブラリ一力も得たものであっても、 CD14の全 長または部分をコードする遺伝子の DNAを含む DNAを铸型として PCR (Polymera se Chain Reaction)法で得たものであってもよい。また、これらの方法で得た遺伝 子またはその断片を必要に応じてアニーリング、ライゲーシヨンして作製することもで きる。
該遺伝子の DNAは、以下のようにして化学合成をすることができる。具体的には、 該遺伝子の DNAを約 20— 30塩基力もなる断片に分けて、 DNA化学合成機 (例え ば、 394型、アプライドバイォシステムズ社製)を用いて、複数の断片として合成し、そ の後、必要に応じて各断片の 5'末端をリン酸ィ匕して各断片をアニーリングし、ライゲ ーシヨンして目的の DNAを得る。
[0110] また該遺伝子は、ゲノムライブラリーもしくは cDNAライブラリ一等を铸型とする PCR 法によっても得ることができる。 PCR法を用いる場合、公知の塩基配列および本発明 のフラグメント若しくは蛋白分解酵素の切断部位を挿入若しくは置換されたフラグメン ト（以下、本発明のフラグメント等と記載することがある）をコードする遺伝子の DNA等 の塩基配列をもとに、また必要に応じて制限酵素認識配列等組み合わせて設計した 、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製し、任意の DNAライブラリー 等に対して公知の方法（Michael AL等編、 Polymerase Chain Reaction, P し R Protocols, a guide to methods and applications ^ 1990、 Academic
Press,参照）に準拠して行うことによって得ることができる。 上述した DNAライブ ラリーは、該遺伝子の DNAまたはその一部を含むものであればよぐ特に限定され ない。したがって、市販の DNAライブラリーを使用してもよぐヒトの末梢血など力も得 たリンパ球、ヒトの株化細胞、またはハイプリドーマなどといった適当な細胞を、必要 があれば適当な活性化剤で活性ィ匕し、サムブルック J.らの方法に準拠して cDNA を作製して使用してもよい。 一般に、アミノ酸をコードする遺伝子の DNAのトリプレ ット（コドン）は、アミノ酸の種類によって 1種類カゝら 6種類まで存在することが知られて いるので、本発明のフラグメント等のアミノ酸配列をコードする遺伝子の DNAの塩基 配列は 1種類には限定されない。従って、本発明のフラグメント等をコードする塩基配 列を含有する遺伝子である限り、 V、かなる塩基配列力もなるものであってもよ 、。
[0111] 組換えベクターは、環状または直鎖状等、 1本鎖または 2本鎖ならびにその複合し た鎖等、いかなる形態のものであってもよぐ 目的に応じて適宜選択しうるが、取り扱 いの容易さや宿主中への組み込みの容易さからは、環状であることが好ましぐ安定 性等からは 2本鎖であることが好まし 、。
接続するシグナル配列は、適宜選択することが可能である力 ヒト CD14の Met G lu Arg Ala ¾er Cys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val His
Val Ser Alaの配列のシグナルペプチドをコードするシグナル配列（Goyerら、 N uclic Acid Research、 16卷、 4173頁、 1988年）力 ^好まし!/ヽ。
[0112] また大腸菌を宿主とした封入体として発現させる場合には、メチォニンもしくはメチ ォニンを N末端に含むペプチドを付加することが好ましい。
該組換えベクターの好ましい例は、宿主の観点からすると、本発明のフラグメント等 を発現するように動物細胞または酵母等の真核細胞を形質転換させるものである。 従って、該組換えベクターは、少なくとも、翻訳開始コドン、終止コドン、選択マーカ 一遺伝子に加えてポリ A付加配列を、さらに動物細胞で機能する SV40のプロモータ 一、 EF1 αのプロモーター、 SR aのプロモーターまたは、酵母で機能する AOX1の プロモーターならびに、 SV40の複製開始点等を有するものが該組換えベクターの 好適な例として挙げられる。
[0113] 該組換えベクターは、該遺伝子の DNAを任意の塩基配列を有する他の DNA断 片とライゲーシヨンする方法、または任意のベクターに導入する方法（Sambrook J. 等、 Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed. , Cold spring Harbor Laboratory, New York, 1989、参照）等で得ることができる。
形質転換体は、該組換えベクターを、宿主となる細胞や微生物に導入する事によ つて得ることがでさる。
[0114] 該形質転換体は、好ましくは、本発明のフラグメント等を発現する形質転換体がよく 、特に好ましくは、本発明のフラグメント等を発現し、培養上清中に分泌するものがよ い。このような形質転換体を使用すれば、本発明のフラグメント等を大量に生産する ことが容易になるからである。
該形質転換体を培養し、必要に応じて遺伝子の増幅や発現誘導を行う。次いで培 養混合物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種のクロマトグラフィー等 の操作を適宜組み合わせて、本発明のフラグメント等の精製を行う。
[0115] 「培養混合物」とは、形質転換体、形質転換体を含む培地、もしくは培養上清また は細胞のライセートを意味する。
当該生産方法で使用する形質転換体は、本発明のフラグメント等を発現する形質 転換体であれば、限定されないが、好ましくは、 COS細胞および、 CHO細胞等の哺 乳動物細胞もしくは酵母、もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とし た形質転換体であることが好ま 、。
以下に、形質転換体として大腸菌、 CHO細胞等の哺乳動物細胞、ピキア（Pichia) 属酵母を使用した場合の培養および発現誘導の例を示す。
trpプロモーターを有する組換え DNA分子で形質転換された大腸菌では、 Lーブ ロース（L— Broth)で菌体を前培養し、それを M9 - CAの培地に対して 1Z50量と なるように植え込み、 37°Cで培養を行う。培養開始数時間後に培地の OD550値が 1 〜4 (すなわち対数増殖期）に達した時点で 3 β インドールアクリル酸を終濃度 10 μ gZmlとなるように添加し発現誘導を行う。さらに約 1〜2日の培養を行うことにより 、目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。
[0116] AOX1プロモーターを有する組換えベクターで形質転換されたピキア（Pichia)属 の酵母を用いる場合には、 BMGY培地で約 2日間前培養し、培地交換後、メタノー ルを加えて発現誘導する。さらに、 30°Cで約 1〜2日間の培養を行い、目的蛋白質を 含む培養混合物を得ることができる。
[0117] EF1 aのプロモーターを有する糸且換えベクターで CHO細胞等の哺乳動物細胞を 形質転換して得られた形質転換体は、 10%ゥシ胎児血清を含有する DMEM培地 で培養する。細胞は、約 1〜10 X 104細胞 Zmlの濃度で植え込み、 37°C、 5%炭酸 ガス Z95%空気の条件で培養を行う。通常、 2〜3日後にコンフルェントな状態にな るので、その時点で培地を、血清不含の D— MEMに交換する。さらに引き続き、 2〜 3日間の培養を行うことにより目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。なお 、目的蛋白質の産生量が少ない場合には前述したようにメトトレキセートにより遺伝子 を増幅し、産生量を増加させることも可能である。
[0118] 上述の培養混合物力も本発明のフラグメント等を精製する方法としては、通常フラ グメント、蛋白質若しくはポリペプチドの精製に使用されている方法のな力から適当な 方法を適宜選択して行う。具体的には、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル 濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーゃ抗 体クロマトグラフィー等の各種ァフィ-ティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシン グ法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用される方法の 中から適切な方法を適宜選択し組み合わせ、必要により HPLCシステム等を用いて 精製を行えば良い。
[0119] 当該生産方法において、本発明のフラグメント等は、大腸菌の β ガラクトシダー ゼゃ、他のポリペプチドとの融合蛋白質として発現させてもよいが、この場合には、精 製工程のいずれかのステップにおいて、融合蛋白質をブロムシアンまたはヒドロキシ ルァミン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵素で処理して当該蛋白質を切り出す操 作が必要になる。
[0120] また、使用する形質転換体が大腸菌であった場合に、本発明のフラグメント等を不 溶ィ匕蛋白質であるインクルージョンボディーとして産生させた場合には、精製の際に 、インクルージョンボディーを可溶化し、デネイチヤーし、リフォールデイングするという 操作を精製の適当なステップで行えばよい（Thomas E等， J. Molecular Biolog y, 87, 563- 577, 1974)。
具体的には、まず、菌体を破砕し、遠心分離してペレットを回収する。次に、尿素も しくはグァニジン塩酸、界面活性剤、還元型ダルタチオン、酸化型ダルタチオンを適 量含む可溶化バッファー（たとえば、 5Mグァ-ジン塩酸、 0. 005%Tween80、 50 mMトリス塩酸（pH8. 0)、 5mM EDTA、 2mM還元型グルタチオン、 0. 02mM酸 化型グルタチオンを含む緩衝液）をペレットに加え、 2—メルカプトエタノールをカロえ てデネイチヤーし、上記可溶化バッファ一力もグァ-ジン塩酸を取り除 、た溶液に対 して透析してリフォールデイングする。融合蛋白質として発現させている場合には、こ れらの操作の後で、ブロムシアン等の化学物質もしくはプロテアーゼ等の酵素で不要 な蛋白質部分を切断し、その後、適当なクロマトグラフィーを行う。
[0121] また、本発明のフラグメントは、一般的な方法により化学合成することもでき、化学合 成により作成したフラグメントも本発明のフラグメントに含まれる。例えば、市販のぺプ チド合成機により作成できる。また、本は詰めのフラグメントの断片をペプチド合成機 により合成し、それをィ匕学的に結合させて作成することもできる。
[0122] 本発明の第三の態様は、下記く 1〉〜く 3〉の工程により得られる下記 1)〜3)の性質 を有する組換え型可溶性 CD14フラグメントである。
く 1〉所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が置換若しくは挿入されている配列番 号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメント若しくは該部分配列を有 するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜10個のアミノ酸が欠 失、付加若しくは置換したフラグメントを作製する工程、
[0123] く 2X1〉で作製した組換え型可溶性 CD14フラグメントを該所定の蛋白分解酵素に より切断する工程、及び
く 3X2〉で切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13± 2kDa、
2) 3C10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない、及び 3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
[0124] 発明者らは、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原が血中に存在する機序を 下記の通り想定して、その想定した産生過程と同様な方法を用いて本発明の第三の 態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントを、生産することを試みた。ただし、想定し た産生過程により、本発明を拘束若しくは限定されるものではな ヽ。
本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、後述するが敗血症時に特異的に血 中に増加する。すなわち、敗血症の初期段階、特に生体がエンドトキシン等に接触し た後すぐに起こり得る生体内現象により、増加することがわかる。
[0125] 例えば、生体がエンドトキシン等に接触した後すぐに起こり得る生体内現象とは、好 中球の活性ィ匕であり、活性化された好中球は、好中球エラスターゼ等のプロテア一 ゼが放出する。この時、生体内の可溶型全長 CD14、膜型 CD14 (以降、全長の CD 14と記載することがある）等の高分子 CD14が該エラスターゼ等により、分解され、本 発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原が増加することが想定できる。エラスターゼ による切断は特異性が低いので、種々の断片が生じる可能性が高いが、最終的には 本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に終局されることも想定される。当然、他 のプロテアーゼ等との相互作用により、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に なることち想定される。
[0126] そして、エラスターゼ等のプロテアーゼにより、全長の CD14が分解して生じた本発 明の第一の態様の可溶性 CD14抗原は、少なくとも生体内（血清中）に検出できる程 度には安定して存在して！/、る。
また、後述する通り、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原が全長の CD14と 区別して、免疫学的に測定できることより、このようにして生じた本発明の第一の態様 の可溶性 CD14抗原は、全長の CD14とは、すでに立体構造の点で異なっているこ とが理解される。
[0127] 本発明の第三の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、本発明の第一の態 様の可溶性 CD14抗原の組換え型可溶性 CD14フラグメントであるために、本発明 の第一の態様の可溶性 CD14抗原と立体的に類似しているフラグメント、すなわち免 疫学的な特異性が類似するフラグメントは、比較的大きい CD14フラグメントから、 C 末端をプロテアーゼにより切断する生産方法を試み、本発明の第三の態様の組換え 型可溶性 CD14フラグメントを、生産し、単離精製することに成功した。
[0128] 以下に、本発明の第三の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントの作製の例示 を記載する。
く 1〉の工程において、下記の 8)〜： L 1)の配列を有する組換え型可溶性 CD14フラ グメントを作製する工程、
8)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または 該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜： LO 個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
9) N末端が配列番号 3の 1位〜 17の!、ずれ力位である
10) C末端が配列番号 3の 134位〜 356位のいずれかである、及び
11)所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列力 配列番号 3の 59位〜 90位のいず れかの位置の後ろに置換若しくは挿入されて!ヽる。
〈1〉の工程の 11)における所定の蛋白分解酵素とは、 ProScission Protease, T hrombin, Factor Xa等が例示される。そして、所定の蛋白分解酵素が、 ProSciss ion Protease である場合、切断部位の配列は Leu, Glu, Val, Leu, Phe, Gin, Gly, Proであり、該 8アミノ酸残基を配列番号 3の 59位〜 70位のいずれかの位置の 後ろに置換若しくは挿入することが例示される。また、所定の蛋白分解酵素が、 Thro mbinである場合、切断部位の配列は Leu, Val, Pro, Arg, Gly, Serであり、該 6ァ ミノ酸残基を配列番号 3の 59位〜 70位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿 入することが例示される。さらに、所定の蛋白分解酵素が、 Factor Xaである場合、 切断部位の配列は lie, Glu, Gly, Argであり、該 4アミノ酸残基を配列番号 3の 59位 〜70位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入することが例示される。
[0129] また、〈1〉の工程で、 9)において N末端が配列番号 3の 1位〜 6位のいずれかであ るフラグメントを作成して、生産した組換え型可溶性 CD 14フラグメントが好ましい。さ らに N末端が配列番号 3の 1位であるフラグメントを作成して、生産した組換え型可溶 性 CD14フラグメントがより好まし 、。 また、く 1〉の工程で、 11)において所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列力 配 列番号 3の 59位〜 68位のいずれかの後ろに置換若しくは挿入されているフグメント を作成して、生産した組換え型可溶性 CD14フラグメントが好ま 、。
[0130] さらに所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列力 配列番号 3の 64位の後ろに置 換若しくは挿入されて!ヽるフグメントを作成して、生産した組換え型可溶性 CD 14フラ グメントが好ましい。
特に、 N末端が配列番号 3の 1位〜 6位のいずれかであり、所定の蛋白分解酵素の 切断部位の配列が、配列番号 3の 64位の後ろに置換若しくは挿入されているフグメ ントを作成して、生産した組換え型可溶性 CD 14フラグメントがさらに好ま 、。
[0131] く 1〉の工程は、例えば上記の通り、配列を決定すれば、本発明の第二の態様の項 に記載した通り、組換え型可溶性 CD14フラグメントを作製できる。
く 2〉の所定の蛋白分解酵素の切断部位を挿入若しくは置換されたフラグメントを該 所定の蛋白分解酵素により切断する工程は、該所定の蛋白分解酵素の至適条件を 適用して、通常の反応を行えばよい。例えば、所定の蛋白分解酵素が ProScission Proteaseの場合は、酵素：基質比 =0. 001〜10： 1 (U : g)となるように、 4°C一 晚切断反応を行えばよい。また、所定の蛋白分解酵素が Thrombinの場合は、酵素 ：基質比 =0. 001〜10 : 1 (U : g)となるように 22°C、ー晚静置しトロンビンによる切 断反応を行えばよい。所定の蛋白分解酵素が Factor Xaの場合は、酵素:基質比 =0. 0008〜8 : 1 (U : g)となるように、添加し、ー晚切断反応を行えばよい。
[0132] く 3〉の切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程は、上記した本発 明のフラグメント等を精製する方法と同様に行えばよい。
当該生産方法によれば、本発明のフラグメント等を均一にかつ高効率で工業的 に大量生産することができる。
[0133] また、本発明の第三の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントの具体的な配列 は、上記の通りの工程により、理解できる。好ましいフラグメントは本発明の第二の態 様の項に記載したフラグメントの配列と同様である。また、本発明の第三の態様の組 換え型可溶性 CD14フラグメントの C末端には、所定の蛋白分解酵素の切断部位の 配列の一部が付加されたて 、る場合もある。 [0134] 本発明の第三の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、特に、好ましい理由 として、血中の高分子 CD14は検出せず本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原 のみを検出するキットに反応し、ウェスタンブロッテイングによる検出も、本発明の第一 の態様の可溶性 CD14抗原と同等の反応性を示すことが確認されており（後述する 実施例 14一 (2)参照）、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と実質的に立体 構造が同等と推定できるからである。
[0135] 以下、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント及び本発明の第 三の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを共通して説明する。（両者を共通し て本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメント若しくは本発明の組換 え型可溶性 CD 14フラグメントと記載する場合がある。 )
[0136] 「組換え型可溶性 CD14フラグメント」は、配列番号 3に記載のヒト全長 CD14蛋白 質の部分的なアミノ酸配列を有する遺伝子組換えにより作製した可溶性のフラグメン トである。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 1)の性質を有 する。すなわち、非還元条件下 SDS— PAGEにより、分子量 13± 2kDaの位置に本 発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント由来のバンドが検出される。
[0137] 特に非還元条件下の 12. 5%SDS— PAGEで、 Precision plus protein™ du al color standards (Bio— Rad社）を用いて分子量を算出すると、分子量 13± 2k Daの位置にバンドが検出される。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 2)の性質を有 する。すなわち、 3C10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない。
[0138] 「3C10及び MEM— 18とは特異的に結合はしない」とは、 3C10及びMEM—18 の両抗体とは、該組換え型可溶性 CD14フラグメントが免疫学的に結合しないこと、 若しくは通常の抗原抗体反応を示さないことである。「3C10及び MEM— 18とは特 異的に結合はしない」本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、 生体内全長 CD14若しくは配列番号 3に記載のヒト全長組換え型可溶型 CD14蛋白 質と比較すると、 3C10及び MEM— 18とのそれぞれの結合能力 lZlOO以下であ る。好ましくは 1Z1, 000以下である。 [0139] 本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 3)の性質を有 する。特にポリクローナル抗体と特異的に結合する。上記 3)の特徴に記載される配 列番号 2に記載のアミノ酸残基力もなるペプチドは、配列番号 3に記載のヒト CD14の 53位力も 68位までの 16アミノ酸残基に該当する。そして、該ポリクローナル抗体は 7 アミノ酸以上の長さの配列を認識する (後述する実施例 4参照)ことより、第二の態様 の組換え型可溶性 CD 14フラグメントは、配列番号 3に記載のヒト CD14の 53位から 68位までのいずれかの連続した 7アミノ酸以上の長さの配列は、少なくとも有してい る。
[0140] 3C10及びMEM—18は、非常に有名な抗 CD 14抗体であり、 CD14上のェピトー プはそれぞれ 7位〜 14位及び 57位〜 64位にあると認識されている。そして、従来の ヒト CD14由来の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、その配列が上記のェピトー プ部分の領域を有する限り、 3C 10若しくは MEM - 18に結合すると認識されて!、る 本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 1)〜3)の性質 を有しており、そのことにより、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と物性及び 免疫学的に類似した性質を有する。特に免疫学的な性質が類似しているということは 、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原とェピトープとなり得るアミノ酸残基の配 列の立体構造が類似しているということが推定できる。そのため、本発明の第一の態 様の可溶性 CD14抗原を測定するときの標準物質として、特に有用となる。本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定するときの一般的な標準物質としては、ヒト C D14の N末端 1位〜 307位のアミノ酸を有しかつ 286位のセリンをシスティンに置換 した組換えポリペプチド (以下、 rsCD14 (l— 307) S286Cと記載）が使用可能であ る力 本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、分子量が近似し ていることにより、免疫学的な反応を物質量に換算するときに都合がよい。また、本発 明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、溶媒の状態が変化しても、 本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と反応性が類似する。例えば、クェン酸加 血と EDTA加血力も検体では、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と rsCDl 4 (1— 307) S286Cとの本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原との免疫学的な 反応性は異なるが、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と本発明の第二の態 様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントは、免疫学的な反応性は一致している。同様 に、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を競合法等で測定するときの類似物 質としても有用である。
[0141] さらに、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、本発明の第 一の態様の可溶性 CD14抗原と免疫学的に類似した性質を有するため、本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定するための抗体をスクリーニングする時に特 異的結合の対象として用いることができる。本来本発明の第一の態様の可溶性 CD1 4抗原を特異的結合の対象として用いればょ 、が、生体内にぉ 、てごく微量にしか 存在しないため、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、代 用品として特に有用となる。
[0142] 上記の通り、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、種々の 有用性を有するが、これは上記 1)〜3)の性質を有するためである。すなわち、上記 1)〜3)の性質を有する本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント は、配列により表されるものではなぐ CD14フラグメントの物性及び免疫学的な性質 t 、う機能で表現されるものである。
[0143] さらに、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、上記 4) LPS に結合しない、という性質を有する。国際公開第 WO96Z20956号には、具体的な ペプチドの記載はないが、ヒト CD14の 57位〜 64位を含む 8〜60個のアミノ酸を有 し、 LPSに結合するペプチドが開示されている。該ペプチドと本発明の第二の態様 の組換え型可溶性 CD 14フラグメントは、一致するものではないが、本発明の第二の 態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントは、特に上記 4)の性質を有することにより 、明らかに異なることが理解できる。
[0144] 所定の蛋白分解酵素の切断部位を挿入若しくは置換されたフラグメントを該所定の 蛋白分解酵素により切断する工程は、該所定の蛋白分解酵素の至適条件を適用し て、通常の反応を行えばよい。例えば、所定の蛋白分解酵素が ProScission Prot easeの場合は、酵素：基質比 =0. 001-10 : 1 (U : g)となるように、 4°Cー晚切断 反応を行えばよい。また、所定の蛋白分解酵素が Thrombinの場合は、酵素:基質 比 =0. 001〜10 : 1 (U : g)となるように 22°C、ー晚静置しトロンビンによる切断反 応を行えばよい。所定の蛋白分解酵素が Factor Xaの場合は、酵素:基質比 =0. 0008〜8 : 1 (U : g)となるように、添加し、ー晚切断反応を行えばよい。
[0145] 切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程は、上記した本発明の フラグメント等を精製する方法と同様に行えばよい。
当該生産方法によれば、本発明のフラグメント等を均一にかつ高効率で工業的に 大量生産することができる。
[0146] また、本発明のフラグメントは、一般的な方法により化学合成することもでき、化学合 成により作成したフラグメントも本発明のフラグメントに含まれる。例えば、市販のぺプ チド合成機により作成できる。また、本は詰めのフラグメントの断片をペプチド合成機 により合成し、それをィ匕学的に結合させて作成することもできる。
本発明の第四の態様は、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定すること を特徴とする敗血症の診断若しくは検出方法である。本発明の第四の態様の敗血症 の診断若しくは検出方法を用いることにより、被験者に対して、敗血症の診断若しく は検出ができる。
[0147] 好ましくは、下記 1)〜3)の工程を含むことを特徴とする。
1)被験者力も採取した血液中に含まれる本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原を測定する工程、
2)測定した値を正常人の標準値と比較する工程、及び
3)被験者が、敗血症であるかどうかを評価する工程。
1)の工程において、被験者力 採取した血液とは、被験者から採取した血液、すな わち全血を用いてもよぐまた被験者力 採取した血液を血漿または血清に調製して もよい。好ましくは血漿または血清に調製して本発明の第一の態様の可溶性 CD14 抗原を測定する工程である。「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定する 」とは、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の量を測定することであるが、特に 問わず、単位溶液中の量、すなわち濃度を測定してもよい。 2)の工程において比較 する標準値に合わせた単位で測定結果が得られればよい。
[0148] また、 1)の工程において、サンドイッチ免疫測定法により測定することが、簡便にで きて好ましい。例えば、後述する本発明の第六の態様の測定方法により行うことがで きる。さらに本発明の第五の態様の測定キットを用いることにより行うことができる。た だし、 1)の工程は、この測定法により限定されるわけではない。例えば、被験者から 採取した血液、血漿若しくは血清中の本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を、 電気泳動により分離し、検出されるバンドの濃さ若しくは幅等をデンシトメトリーにより 測定する方法が挙げられる。この方法の好ましい例としては、特に非還元下の SDS - PAGEで分離後、本発明の第五の態様の測定キットに使用して 、る抗体を用 V、る Western Blottによりバンドを検出することである。これらの他に、測定方法としてマ ススペクトル、 HPLC、 Gasクロマトグラフフィー若しくは TLC等による分離及び検出 等の方法を用いても良い。
[0149] 2)の工程は、予め複数の正常人の測定結果を求めておき、その測定結果の平均 値若しくは範囲をとる等により標準化した正常人の値または正常人の値の範囲を、正 常人の標準値として、 1)の工程で測定した値と比較する工程である。例えば、正常 人の平均値 + 2SDまたは 3SDをカットオフ値として正常人の標準値を求めればよい 。また、 2)の工程では、予め敗血症患者の基準値を求めておいて、 1)の工程で測定 した値と比較する工程を行ってもよい。この工程を 2)の正常人の標準値と比較する 工程の代わりに行ってもょ ヽ。
[0150] 3)の工程は、 2)の工程で比較した結果に基づ!/、て、被験者が敗血症である（陽性 )か、若しくは敗血症でないか（陰性)を評価する工程である。また陽性、陰性の他に 偽陽性としての評価若しくは予測的診断を行っても良い。例えば、正常人の標準の 幅を 0〜0. 1 gZmLとし、敗血症患者の値を 0. 2 gZmL以上として測定値と比 較する場合、被験者の値が 0〜0. 1 /z gZmLの場合、陰性として、 0. 1〜0. 2 g ZmLの場合、擬陽性として、 0. 2 /z gZmL以上の場合、陽性として評価する、若し くは例えば 24時間以内に敗血症を発症する蓋然性が高い等の診断をする等である
[0151] 臨床現場において検体中の本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の安定性 が重要な要因となる場合もある。例えば凍結融解を繰り返したり、長時間室温で放置 した場合に、血清中の本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原が分解し、測定で きなくなる場合もあり、また、血清中の高分子量 CD14が、本発明の第一の態様の可 溶性 CD14抗原若しくはそれに近い構造に分解され、測定結果を誤る場合も想定さ れる。
[0152] そのため、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原及び高分子量 CD14の安定 性を担保する目的で、血清中に各種添加剤を加えてもよい。例えば、採血時に添カロ する添力卩剤として、血漿の採血に使用される ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)、 heparin,クェン酸があげられる。また、血清中に安定化剤として antithr ombmIII、 1— antitrypsin ^ aprotmin、 leupeptm、 2— macrogloblm、 peps tatin、 antipain、 chymostatin、 amastatin、 tripsin inhibitor ^ phenylmethyls ulfonyl fluoride (PMSF)、 EGTA、 E— 64、 benzamidineゝ 4— fluoro— (2— a minoethyl) benzenesulfonyl chloride (AEBSF)等の各種プロテアーゼ阻害剤 を添カ卩することにより蛋白の分解を抑制できる。さらに、 lactoce、 sucrose, torehar ose等の糖や PEG等の合成高分子等を添加することにより液中での本発明の第一の 態様の可溶性 CD14抗原及び高分子量 CD14の安定性を向上させることもできる。
[0153] 本発明の第五の態様は、少なくとも一つの本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含む、検体に含まれる本発明 の第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定するための可溶性 CD14抗原の測定キッ トである。
[0154] 本発明のキットは、少なくとも一つの本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に 特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、検体に含まれる本発明の第 一の態様の可溶性 CD14抗原を測定する。また、目的である本発明の第一の態様の 可溶性 CD14抗原を検出するため、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を直 接測定することができる。また、目的である本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原のみを検出し、ヒト高分子量可溶性 CD 14抗原及び 36kDa 可溶型 CD14蛋白質 を検出しないキットが好ましい。実際に、本発明の測定キットは、ヒト血清を特別な処 理をせずにそのまま検体として測定すればヒト高分子量可溶型 CD14蛋白質及び 3 6kDa 可溶型 CD14蛋白質を検出しない。特別な処理とは、ヒト血清に蛋白を添カロ する、若しくはヒト血清中の蛋白を変性する等の処理である。該抗体の断片とは、該 抗体の Fab、 Fab'、若しくは F (ab' ) である。
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[0155] 本発明の測定キットは、少なくとも一つの本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、検体に含まれる本発明 の第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定することができる限り、特に限定されない。 好ましくは、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体若 しくは該抗体の断片として、以下の a)〜d)の 、ずれかの抗体または該抗体の断片を 含む可溶性 CD14抗原の測定キットである。
a)配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体。 b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列力も選択される連続した 8〜16個のいずれかの 個数のアミノ酸残基カゝらなるペプチドを抗原として作製される抗体。若しくは、 c)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体 d)本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント若しくは本発明の第三 の態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントと特異的に結合する抗体。
[0156] より好ましくは、上記 a)、 c)若しくは d)の抗体若しくは該抗体の断片を含む測定キッ トである。さら〖こ好ましくは、 d)の抗体若しくは該抗体の断片を含む測定キットである。 特に好ましくは、 d)本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントに結 合する抗体若しくは該抗体の断片を含む測定キットである。
[0157] d)の抗体、すなわち、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント若 しくは本発明の第三の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント（以下、本発明の第 二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント若しくは本発明の第三の態様の組換 え型可溶性 CD 14フラグメントを合わせて、本発明の組換え型可溶性 CD14フラグメ ントと記載することがある）は、 a)配列番号 2に記載のアミノ酸残基力もなるペプチドと 特異的に結合する抗体、 b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列から選択される連続し た 8〜16個のいずれかの個数のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製され る抗体、若しくは c)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原とし て作製される抗体と、同様な性質を有する抗体も含まれ、一部重複する。このため、 d )の抗体は、上記 a)〜c)の抗体の一部を含んで 、てもよ 、。また、 d)の抗体と上記 a) 〜c)の抗体と明確に区別するためには、 d)の抗体から、上記 a)〜c)の抗体を除け ばよい。
また、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体若しくは 該抗体の断片として、特に d)の抗体として、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント若しくは本発明の第三の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメン トを抗原として作製した抗体若しくは該抗体の断片が好ましい。また、本発明の第一 の態様の可溶性 CD14抗原を抗原として作製した抗体若しくは該抗体の断片も好ま L ヽ。本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製し た抗体若しくは該抗体の断片がより好ましい。また、本発明の第二の態様の組換え 型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体若しくは該抗体 の断片が好ましい。また特に、ヒト高分子量 CD14若しくはヒト CD14の N末端 1位〜 356位のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド (以下、 rsCD14 (1— 356)と記載)等 の組換え型高分子量 CD14とは実質的に結合しな 、抗体が好ま 、。
[0158] また、測定する原理も該抗体若しくは該抗体の断片を使用して免疫学的に本発明 の第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定する方法であれば特に限定されない。 測定する原理の一例として、 a)の抗体すなわち「配列番号 2に記載のアミノ酸残基 力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え 型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を使用して、 サンドイッチ免疫測定法により本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を測定する 測定キット（以下、サンドイッチ免疫測定系キットと記載することがある）について下記 に具体的に記載する。
[0159] サンドイッチ免疫測定法は公知の技術を利用することができる。測定法の原理、応 用及び改良法については、例えば、「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会 出版センター（1993年)、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬'治療薬開発へ の応用」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法 (第 3版)石川栄 治等編、医学書院（1987年）に記載されている。
[0160] また、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは配列番号 2に記載のアミノ酸残基か らなるペプチドと特異的に結合する抗体を含む。該配列番号 2に記載のアミノ酸残基 力 なるペプチドと特異的に結合する抗体の特徴、及び作製法等は本発明の第一の 態様に記載した通りである。該抗体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体 でもよぐ特に限定されない。
サンドイッチ免疫測定法は、通常測定する蛋白質を認識する部位の異なる 2種類 以上の抗体を用いて抗体 抗原 抗体複合体を形成させることにより測定する方法 である。
[0161] まず、第一の抗体が結合した不溶性担体を用意し、固相若しくは反応場所とする。
検体を固相の該不溶性担体に添加し、反応させる。一定時間反応させた後、洗浄し て固相に特異的に結合しなかった物質を除去する。続いて標識した第二の抗体を添 加する。一定時間反応させた後、洗浄して複合体を形成しなかった標識抗体を除去 し、標識物に基づ 、て固相に特異的に結合した複合体の量を特異的に定性または 定量する。サンドイッチ法は上記のように 2段階で行う方法（2ステップ法）と抗原及び 標識抗体を同時に加える 1段階法（1ステップ法)のどちらを使用することもできる。 本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号 2に記載のアミノ酸 残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組 換え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」 「本発 明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」―「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原に特異的に結合する第二の結合物質」複合体を形成させることにより測定する。
[0162] 本発明のサンドイッチ免疫測定系キットの構成としては、「配列番号 2に記載のアミ ノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様 の組換え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」が結 合した不溶性担体、及び「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」に結合する標 識した第二の結合物質 (以下、単に、第二の結合物質と記載することがある)を含む こと、
あるいは、第二の結合物質が結合した不溶性担体、及び「配列番号 2に記載の 16ァ ミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する標識した抗体」若しくは「本発明の第 二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製した標識したモノク ローナル抗体」を含む。 [0163] 第二の結合物質の例示としては、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」に 特異的に結合する抗体が挙げられる。「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」 に特異的に結合する該抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよぐ 特に限定されないが、配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に 結合する抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法における相性の点では、モノクローナ ル抗体が好ましい。また、該モノクローナル抗体の断片であってもよい。抗体の断片 とは、該モノクローナル抗体の Fab、 Fab'、若しくは F (ab' ) である。
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[0164] 本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体 (以下、第二 の抗体と記載することもある）は、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と特異的 に結合する抗体でも、高分子量 CD14とも特異的に結合する抗体でもよぐ特に限定 されない。好ましくは、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的 に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメン トを抗原として作製したモノクローナル抗体」と「本発明の第一の態様の可溶性 CD1 4抗原」に特異的に結合する領域が異なる抗体である。より好ましくは、上記第二の 結合物質がヒト高分子量 CD14の 1位〜 52位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特 異的に結合する抗体または該抗体の断片、あるいはヒト高分子量 CD14の 1位〜 52 位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特異的に結合する抗体と競合する若しくは交 差反応性を示す抗体、または該抗体の断片である。特に好ましくは、上記第二の結 合物質が「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の 17位〜 26位のアミノ酸残 基のいずれかに特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片、または「本発明の第 一の態様の可溶性 CD14抗原」の 17位〜 26位のアミノ酸残基のいずれかに特異的 に結合する抗体と競合する (交差反応性を示す)抗体若しくは該抗体の断片である。
[0165] 作製法は、例えば高分子量 CD14、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」 、高分子量 CD14及び「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の混合物若しく は組換体 CD14を抗原として、本発明の第一の態様に記載の方法と同様にポリクロ ーナル抗体若しくはモノクローナル抗体を作製すればよ ヽ。高分子量 CD 14及び「 本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の混合物、及び組換体 CD14を抗原とし た第二の抗体の作製法の例示を後述する実施例 3に示した。 また、実際の測定をする前に予備的に、後述する実施例 3と同様に、配列番号 2に 記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体と第二の抗体の候補 の抗体とサンドイッチ法の系を構成し、測定感度を確認して、第二の抗体を選択する ことが好ましい。
また、抗体の断片である Fab、 Fab'、 F (ab') は公知の方法（「超高感度酵素免疫測
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定法」石川栄治著 25-40頁、学会出版センター、 1993年)で作製できる。
[0166] 上記にはサンドイッチ免疫測定法にぉ 、て不溶性担体に抗体を結合させるサンド イッチ免疫測定法を詳細に記載したが、不溶性担体を用いずに、溶液中で行うことが できる。例えば、抗原と標識抗体及び第二の標識した第二の結合物質を液相中で反 応させ、該標識と該第二の標識との相互作用を測定する方法である。
サンドイッチ免疫測定法にぉ 、て、上記の別法として競合法により測定することもで きる。抗体 抗原 抗体複合体を形成させる中で、検体中の抗原と標識した抗原若 しくは標識した抗原類似物質を競合させることにより測定する方法である。
[0167] 本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号 2に記載のアミノ酸 残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組 換え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」一標識し た「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」（若しくはその類似物質） 「本発明 の第一の態様の可溶性 CD14抗原に結合する第二の結合物質」複合体を形成させ ること〖こより柳』定する。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットの競合法の構成としては、「配列番号 2に記 載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二 の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗 体」が結合した不溶性担体、第二の結合物質、及び標識した「本発明の第一の態様 の可溶性 CD14抗原」若しくは標識した「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原 」の類似物質を含むこと、あるいは、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるぺプ チドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」、第二の結合物質が結合し た不溶性担体、及び標識した「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」若しくは 標識した「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の類似物質を含む。
[0168] 「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の類似物質とは、例えば、本発明の 第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント、ヒト CD14の N末端 1位〜 285位 のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド（以下、 rsCD14 (1— 285)と記載)及び rsCD 14 (1— 307) S286Cが例示される。特に、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントが好ましく例示される。しかし、測定系において検体中の本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原と競合可能な物質である限り、特に限定されない。 r sCD14 (1— 285)及び rsCD14 (1— 307) S286Cの調製法は、 WO01/72993 号公報に記載されている。
[0169] また、サンドイッチ免疫測定法において、さらに別法として第二の特異結合を利用し て測定することもできる。抗体 抗原 抗体 第二の特異結合物質の複合体若しく は抗体 抗原 抗体 第二の特異結合物質 第二の特異結合物質の特異結合パ 一トナー（以下、第二の特異結合パートナーと記載することがある）の複合体を形成さ せて測定する方法である。
[0170] 本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号 2に記載のアミノ酸 残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組 換え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」 「本発 明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」―「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原に結合する第二の結合物質」 第二の特異結合物質の複合体を形成させること、 「配列番号 2に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しく は「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製した モノクローナル抗体」 「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」 「本発明の第 一の態様の可溶性 CD14抗原に結合する第二の結合物質」 第二の特異結合物質 第二の特異結合パートナーの複合体を形成させること、若しくは、「本発明の第一 の態様の可溶性 CD14抗原に結合する第二の結合物質」 「本発明の第一の態様 の可溶性 CD14抗原」―「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力もなるペプチドと特異 的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメ ントを抗原として作製したモノクローナル抗体」 第二の特異結合物質 第二の特異 結合パートナーの複合体を形成させることにより測定する。
[0171] 本発明のサンドイッチ免疫測定系キットの第二の特異結合を利用した構成としては 、例えば、第二の特異結合物質のパートナーが、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基 力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え 型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」または「本発 明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に結合する第二の結合物質」である場合、標 識した第二の特異結合物質を、さらに含むことである。第二の特異結合物質としては 、上記の第二の特異結合物質のパートナーに対する抗体が挙げられる。
[0172] また、第二の特異結合物質のパートナーが、第二の特異結合パートナーである場 合、「第二の特異結合物質が結合した配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるぺプ チドと特異的に結合する抗体」若しくは「第二の特異結合物質が結合した本発明の 第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナ ル抗体」、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に結合する標識した第二の結 合物質、及び第二の特異結合パートナーが結合した不溶性担体を含むこと、あるい は、配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する標識した 抗体若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原とし て作製した標識したモノクローナル抗体」、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原」に結合する第二の特異結合物質が結合した第二の結合物質、及び第二の特異 結合パートナーが結合した不溶性担体を含む。
[0173] 第二の特異結合物質 第二の特異結合パートナーの組み合わせとしては、抗原と その抗体、リガンドとそのレセプター、糖鎖含有物質とレクチン、ピオチンとアビジン 若しくはストレプトアビジン等が挙げられる。
さらに、上記を含めて、サンドイッチ免疫測定法において、抗体に対する抗体、すな わち、抗ィムノグロブリン抗体を利用して、抗体—抗原—抗体—抗ィムノグロブリン抗 体の複合体を形成させて測定する方法、また、抗ィムノグロブリン抗体及び第二の特 異結合を利用して、抗ィムノグロブリン抗体 抗体 抗原 抗体 第二の特異結合 物質 第二の特異結合パートナー等を形成させて測定する方法が例示される。
[0174] 本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号 2に記載のアミノ酸 残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組 換え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」 「本発 明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」―「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原に結合する第二の結合物質」ー抗ィムノグロブリン抗体の複合体を形成させること 、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若し くは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製し たモノクローナル抗体」 「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」 「本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原に結合する第二の結合物質」ー抗ィムノグロブリン 抗体の複合体を形成させること、若しくは抗ィムノグロブリン抗体 「配列番号 2に記 載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二 の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗 体」 「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」 「本発明の第一の態様の可溶 性 CD14抗原に結合する第二の結合物質」 第二の特異結合物質 第二の特異結 合パートナーを形成させること、若しくは抗ィムノグロブリン抗体 「本発明の第一の 態様の可溶性 CD14抗原に結合する第二の結合物質」 「本発明の第一の態様の 可溶性 CD14抗原」 「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的 に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメン トを抗原として作製したモノクローナル抗体」 第二の特異結合物質 第二の特異 結合パートナーを形成させること等により測定する。
[0175] いずれのサンドイッチ免疫測定法にしても、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基から なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可 溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」 「本発明の第一 の態様の可溶性 CD 14抗原」 -「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に結合 する第二の結合物質」を含む複合体を形成させることにより測定する測定法であれば 、第二の特異結合を利用して、固相、標識物質等を作製しても、本発明の測定法に 含まれる。
[0176] すなわち、いずれのサンドイッチ免疫測定法にしても、サンドイッチ免疫測定系のキ ットとして、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する 抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原とし て作製したモノクローナル抗体」を含む限り、本発明のキットに含まれる。同様に、上 記 a)〜d)のいずれかの抗体を含む限り、本発明のキットに含まれる。 （以下、「「配列 番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本 発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノク ローナル抗体」を含む限り、」との記載も同様である。 )
[0177] 本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに用いる不溶性担体は、ビーズ、ラテックス 粒子、磁性粒子、プレート、チューブまたはメンブレン等を用いればよい。ビーズ、プ レートまたはチューブは、その材料としてポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバ 一、ステンレス、プラスチック等が挙げられる。メンブレンは、セルロース、セルロース 誘導体、ニトロセルロース、多孔性合成ポリマー、グラスファイバー、布、不織布、濾 紙等が挙げられる。形状としては、ビーズ、ラテックス粒子または磁性粒子等は球形と して用いることができる。保存時のスペースの確保の点で有利である。プレートまたは チューブはゥエル形として用いることができる。市販の自動化測定器、プレートリーダ 一等に対応可能な点で有利である。また、メンブレンは後述するィムノクロマト法、フ ロースルー法に用いることができる。
配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体、第二 の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、または抗ィムノグロプリ ン抗体の不溶性担体への結合は熱吸着法、化学結合法等により行うことができる。
[0178] また、不溶性担体に上記物質が結合していない非吸着面に対して、測定系に影響 しな 、物質でブロッキング処理することが好ま 、。測定系の特異性若しくは感度を あげることができる力 である。測定系に影響しない物質とは BSA、カゼイン等の蛋 白質及び Tween20、 NP-40等の界面活性剤等が例示される。
[0179] 本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに用いる標識は、ペルォキシダーゼ、アル カリフォスファターゼ、 β -D-ガラクトシダーゼ、ォキシダーゼ及びゥリカーゼ等の酵素 、アタリジ-ゥム若しくはその誘導体、またはェクオリン若しくはその改変体等の化学 発光物質、 FITCまたはユウ口ピウム (Eu)若しくはサマリウム（Sm)等のランタノイド等 の蛍光物質、色素、金コロイド、着色ラテックス、あるいはアイソトープを用いればよい 例えば酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合は、発色基質として 3, 3' , 5, 5， ーテトラべンジジンまたは 1, 2—フエ二レンジアミン等力 アルカリフォスファターゼを 用いる場合は、発色基質として 4 -トロフエ-ルフォスフェート等力 - D-ガラタト シダーゼを用いる場合は、発色基質として 2—二トロフエ-ル · |8 -D-ガラクトシド等が 例示される。
配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体、第二 の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、または抗ィムノグロプリ ン抗体への酵素標識は、二段階ダルタルアルデヒド法、過ョーソ酸法、マレイミド法、 ピリジル ·ジスルフイド法等により行うことができる。
[0180] 酵素以外の標識についても熱吸着法、化学結合法等の公知の技術を利用して行う ことができる。
酵素標識は、上記に例示される様な発色基質を用いれば、通常の吸光度測定系を 用いて測定でき、また感度も比較的高く好ましい。
化学発光物質、蛍光物質、着色標識若しくはアイソトープを標識として用いる場合 は、その標識に応じた測定機器により測定できる。また、 Eu、例えばクリプテート (Eu 3+ クリプテート）等の蛍光物質を用いる場合は、第二の標識として XL665等のァロ フィコシァニン誘導体を用いて、蛍光共鳴エネルギー転移を測定することもできる。
[0181] また、簡易な測定キット、例えば後述するィムノクロマト法、フロースルー法を利用し たキットに用いる標識は、色素、金コロイド若しくは着色ラテックスが視覚的にも観察 可能であるので好ましい。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、サンドイッチ免疫測定法により測定する ことを特徴とし、配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合す る抗体を含むものである。サンドイッチ免疫測定法は上記した通り公知の技術を利用 することができ、上記の具体的な説明の他、サンドイッチ免疫測定法を特徴としたキッ トであれば、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する 抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原とし て作製したモノクローナル抗体」を含む限り、本発明のサンドイッチ免疫測定系キット に含まれ、特に限定されない。すなわち、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なる ペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶 性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」及びサンドイッチ免 疫測定法に必要な試薬が含まれていれば良ぐまた測定原理に基づく測定結果を阻 害しない限り、含まれるのは限定されない。
[0182] 例えば、任意の構成要素として、検体若しくは標識抗体等の緩衝液若しくは希釈剤 、標識抗体に酵素が使われる場合の酵素に適した発色基質 (上記参照）、ブロッキン グ剤、反応停止剤または洗浄剤等が例示される。希釈剤は、特に限定はないが、検 体に含まれる物質を含む希釈剤が好ましい。検体が血清であり、その血清を入手す るための採血を EDTAやクェン酸存在下で行われた場合、希釈剤としても同量の E DTAやクェン酸が存在することが好ましい。例えば、希釈剤中に EDTAを 0. 2〜1 mg/ml含むことが好まし!/、。
[0183] また標準物質も例示される。標準物質は「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原」、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の類似物質が挙げられる。特に標 準物質として、本発明の組換え型可溶性 CD14フラグメントが好まし 、。
[0184] また、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、サンドイッチ免疫測定法を測定原 理とするィムノクロマト法またはフロースルー法を利用したキットも含まれる。さらに、本 発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、標識の信号を電気化学的に測定する MED IA法 (特開平 5— 264552)による測定、マイクロチップを使用したィムノアツセィ法（「 バイオサイエンスとインダストリ一」第 61卷 449 454頁 2003年）、時間分解蛍光免疫 測定法「アナリティカル バイオケミストリー（Analytical biochemistry)」（米国）、 1984 年、第 137卷、 p.335-343)及びホモジーニアス免疫測定法による測定にも利用可能 である。まこれらの原理を用いた測定キットも、サンドイッチ免疫測定法により測定す ることを特徴とし、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結 合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを 抗原として作製したモノクローナル抗体」を含む限り、本発明のサンドイッチ免疫測定 系キットに含まれる。
[0185] 本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基から なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可 溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を含むことを特徴と しており、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を特異的に測定できる。本発明 のサンドイッチ免疫測定系キットに使用する検体は、水性の検体が好ましい。特に血 液、血清若しくは血漿等の血液成分、尿、その他の体液、細胞培養上清、またはカラ ム溶出液等が好ましぐこれらに含まれる本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原 の測定に有用である。しかし、ヒトの血液成分以外からの検体、例えばヒト尿若しくは その他の体液、ヒト以外の種からの血液成分、尿若しくはその他の体液、細胞培養上 清、またはカラム溶出液等の検体では、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原 」だけではなぐ「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」類似の蛋白質、ポリべ プチド等も測定することが可能である。「配列番号 2に記載のアミノ酸残基からなるぺ プチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 C D 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を含む限り、上記の「本発 明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」類似の蛋白質、ポリペプチド等を測定するた めのキットも、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに含まれる。
[0186] また、以上の説明において、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと 特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フ ラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」の代わりに「配列番号 2に記載の アミノ酸残基力もなるペプチドと特異的に結合する抗体の断片である Fab、 Fab'、若 しくは (Fab' ) 」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント
2
を抗原として作製したモノクローナル抗体の断片である Fab、 Fab'、若しくは (Fab' )
2
」を用いてもよい。
[0187] 上記には、サンドイッチ免疫測定系キットの一例として、 a)の「配列番号 2に記載の アミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態 様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を 使用した例を具体的に示したが、 b)の「配列番号 2に記載のアミノ酸配列力 選択さ れる連続した 8〜16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製される抗体」、 c) の「配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗 体」若しくは d)若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを 抗原として作製した抗体」、またはこれらの抗体の断片である Fab、 Fab'、若しくは (F ab') を用いることもできる。
2
[0188] また、測定する原理の例として、サンドイッチ免疫測定法の他にも、凝集法、固相結 合法及び溶液反応法が挙げられ、少なくとも一つの「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を、好ましくは、本発明 の抗体若しくは該抗体の断片を含むこれらの方法に応じたそれぞれのキットを構成 することができる。特に第二の結合物質を用いず、単独の抗体を用いてキットを構成 する場合は、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」に特異的に結合する抗体 若しくは該抗体の断片として、ヒト血中の全長可溶型 CD14蛋白質 (以下、ヒト高分子 量 CD14と記載することがある）若しくはヒト CD14の N末端 1位〜 356位のアミノ酸を 有する可溶性ポリペプチド（以下、 rsCD14 (1— 356)と記載)等の組換え型高分子 量 CD14とは実質的に結合しな 、抗体を用いることが好ま U、。
[0189] 凝集法は、抗体を粒子の表面に結合させて、抗原が存在することにより粒子の凝集 を生じさせて、該粒子の凝集の程度を指標として抗原を特異的に定性または定量す る。
[0190] 本発明の凝集法免疫測定系キットにおいては、例えば「配列番号 2に記載のァミノ 酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の 組換え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」 「本 発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」を形成させ、凝集させることにより測定する 本発明の凝集系免疫測定系キットの構成としては、本発明の抗体がその表面に結 合した粒子を含む。
粒子としては、ラテックス、赤血球 (例えば羊赤血球）、ゼラチン、マイクロビーズまた はカーボン粒子等、一般に用いられて 、る粒子を使用することができる。
[0191] 固相結合法は、固相上で抗体と抗原の複合体を形成することにより測定する方法 である。抗原を含む検体を不溶性担体 (すなわち固相、以下同）〖こ吸着させる。次に 標識抗体を添加し、反応させ、標識物に基づいて固相に結合した複合体の量を特異 的に定性または定量する。
また、競合法として、抗原類似物質を不溶性担体に吸着させて、標識抗体と検体中 の抗原との反応を競合させることにより、抗原類似物質と特異的に結合した標識抗体 の量を測定する方法がある。さらに競合法の別法として、抗体を不溶性担体に吸着さ せて、検体中の抗原との反応を、標識抗原類似物質により競合させ、抗体と特異的 に結合した標識抗原類似物質の量を測定する方法がある。
[0192] 本発明の固相結合法免疫測定系キットにおいては、「配列番号 2に記載のアミノ酸 残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組 換え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」 「本発 明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の複合体、「配列番号 2に記載のアミノ酸残 基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換 え型可溶性 CD 14フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」一標識した 「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」（若しくはその類似物質)複合体または 「標識した配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗 体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として 作製した標識したモノクローナル抗体」 「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗 原」（若しくはその類似物質)複合体を形成させることにより測定する。
[0193] 不溶性担体、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の類似物質、標識及び 吸着させる試薬につ!、ては、サンドイッチ免疫測定系キットの説明に記載した通りで ある。
溶液反応法は、抗原と標識抗体を液相中で反応させ、その後抗体を用いた凝集沈 降法若しくは物理化学的な手法によって、抗原、抗体と抗原抗体複合体とを分離し、 「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」を特異的に定性または定量する方法で ある。
[0194] また、以上の説明において、「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと 特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フ ラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」の代わりに、「配列番号 2に記載 のアミノ酸配列力も選択される連続した 8〜 16アミノ酸残基力 なるペプチドを抗原と して作製される抗体」、「配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原 として作製される抗体」、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を抗原として作 製した抗体」若しくは「本発明の第三の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを 抗原として作製した抗体」あるいは「これらの抗体の断片である Fab、 Fab'、若しくは（ Fab' ) 」を用いてもよい。
2
[0195] 以上、本発明の測定キットの例を測定する原理に基づいて記載した力 本発明の キットはこれらの原理に限定されない。少なくとも一つの「本発明の第一の態様の可 溶性 CD14抗原」に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、検体に含 まれる「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」を直接測定することができる限り 、本発明の測定キットに含まれる。免疫測定法の原理については、公知の技術を利 用することができる。上記した「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会出版セ ンター（1993年)、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬'治療薬開発への応用 」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法 (第 3版)石川栄治等編 、医学書院（1987年)も参考にできる。
[0196] 本発明のキットで特異的に測定できる「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」 は、敗血症患者において増加する。このため、「本発明の第一の態様の可溶性 CD1 4抗原」を測定することは敗血症の診断の指標となり、本発明のキットは、敗血症の診 断に有用である。
[0197] 「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」若し くは「本発明の組換え型可溶性 CD14フラグメントを抗原として作製したモノクローナ ル抗体」は、該ペプチド若しくは「本発明の組換え型可溶性 CD14フラグメント」に対 する親和性として表した場合の解離定数 (KD)は、 10— 7M未満が好ましい。より好ま しくは、 10— 8M以下、さらに好ましくは 10— 9M以下である抗体である。
[0198] 「配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」の作 製において、抗原とするペプチドは、配列番号 2に記載のアミノ酸残基の連続した 8 個以上のアミノ酸を含むペプチドであり、好ましくは、連続した 10個以上、より好ましく は連続した 12個以上、特に好ましくは連続した 16個のアミノ酸を含むペプチドである 。さらに、ペプチドは配列番号 2のいずれかに記載のアミノ酸残基の連続した 8個以 上のアミノ酸を含めば、その他のアミノ酸配列に限定はないが、好ましくはペプチドす ベてのアミノ酸配列が配列番号 2のいずれかに記載のアミノ酸配列由来であることで ある。
[0199] 好ましくは配列番号 2に記載のアミノ酸残基の連続した 8個以上のアミノ酸を含むぺ プチドを抗原として作製した抗体である。好ましくは連続した 10個以上、より好ましく は連続した 12個以上、特に好ましくは連続した 16個のアミノ酸を含むペプチドを抗 原として作製した抗体である。
「配列番号 2に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 8〜 16アミノ酸残基から なるペプチドを抗原として作製される抗体」の作製にぉ ヽて、抗原とするペプチドは、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 8〜 16アミノ酸残基からな るペプチドであれば、アミノ酸残基数は特に限定されない。好ましくは、連続した 10 個以上、より好ましくは連続した 12個以上、特に好ましくは連続した 16個のアミノ酸 カゝらなるペプチドを抗原として作製される抗体である。すなわち好ましくは、「配列番 号 2に記載の 16アミノ酸残基カゝらなるペプチドを抗原として作製される抗体」である。
[0200] また「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」は、高分子量 CD14と分子量が 異なり、高分子量 CD14よりもアミノ酸配列が短い。このため、血液中での「本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原」の構造が、高分子量 CD14と異なり、抗体に対す る反応性が異なると考えられ、本発明の第五の態様の測定キットに含まれる「本発明 の第一の態様の可溶性 CD14抗原」に特異的に結合する抗体の好適例である上記 a )〜d)の抗体 (以降、単に、「上記 a)〜d)の抗体」と記載することがある）は「本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原」により強く結合すること、すなわち親和性が高いこ とが考えられる。
[0201] 上記 a)〜d)の抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であって もよい。本発明の抗体が由来する動物種は特に限定されない。抗体作製の容易さの 面では、ゥサギ、ャギ等が好ましい。また分子種は特に限定されない。いずれのクラ ス、サブクラス及びアイソタイプに分類される免疫グロブリンであってもよ 、。
免疫原とするペプチドの作製方法は、一般的に使用されるペプチド合成機 (ぺプチ ドシンセサイザー 433A型、パーキン一エルマ一ジャパン）等を用いた方法、遺伝子 組換え法 (東京大学医科学研究所 制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、 秀潤社)等が挙げられる。
[0202] 例えば、配列番号 2に記載のアミノ酸残基の連続した 8個以上のアミノ酸力 なるぺ プチドは 433A型ペプチド合成機を用いて Fmoc法により合成でき、 TFAによる脱保 護、榭脂からの切断の後、 C18 HPLCカラム (Capcel卜 pak、資生堂)を用いて精 製し、目的のペプチドを調製することができる。
抗原が蛋白質である場合は、そのまま免疫原とすることができる力 8〜30アミノ酸 残基以下のペプチドの場合は分子量が小さいため、通常免疫原性を持たないことが ある。この場合、キャリアと結合させて若しくは Multiple Antigen Peptide (MAP)法を 用いて MAPペプチドを調製して、免疫原性を有する分子量を有させ、免疫原とすれ ばよい。
上記ペプチドと結合させるキャリアは、キャリア蛋白、ポリマーが挙げられる。キャリア 蛋白は牛血清アルブミン、キーホールリンペットへモシァニン (KLH)、サイログロブリ ンまたはオボアルブミン等の異種蛋白を用いればよい。これらキャリア蛋白は、ぺプ チド若しくはキャリア蛋白のアミノ酸に含まれる側鎖の官能基を利用して、またはマレ イミド基、 N—ヒドロキシスクシ-ミド (NHS)基若しくはアルデヒド基を導入して、上記 ペプチドと結合させればよい。ポリマーはマンナン若しくはキトサン等の糖類、ポリビ -ルピロリドン (PVA)が挙げられる。これらポリマーは上記ペプチドと、吸着若しくは 上記のような化学結合により結合させればょ 、。
[0203] また抗原とする本発明の組換え型可溶性 CD14フラグメント作製方法は、本発明の 第二の態様及び第三の態様の説明に記載した通りである。該フラグメントを抗原とす る場合は、そのまま免疫原としてもよいし、上記同様キャリア等と結合させて免疫原と してちよい。
本発明の抗体は公知技術を用いることにより作製できる（例えば、免疫実験操作法 、 日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照)。例えばポリクローナル抗体は下記 の方法で作製できる。
[0204] 上記のとおり調製した免疫原 20〜 1000 μ gをフロインド完全アジュバント、 RIBIァ ジュバント、 ALUM等のアジュバントと混合し、各種動物に免疫することができる。各 種動物としては馬、羊、ャギ、ブタ、ゥサギ、ラット、マウス等が使用可能である。免疫 方法としては筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、リンパ節投与等の方 法が使用可能であり、初回投与後 1〜4週間間隔でフロインド不完全アジュバント、 R IBIアジュバント、 ALUM等のアジュバントと混合した免疫原を同様に投与することに より、あるいは免疫原を直接静脈内に投与することにより追加免疫を行うことができる 。抗血清は、免疫した動物から通常の採血方法、例えば頸動脈、耳静脈、心臓、足 の静脈等より血液を採取し、遠心等により血清を分離することにより調製することがで きる。得られた抗血清は硫酸アンモ-ゥム、硫酸ナトリウム等を添加する塩析法により Ύグロブリン分画を沈殿させ、適当な緩衝液に透析後、プロテイン A、プロテイン G等 の Ίグロブリンを特異的に精製することができるァフィユティーマトリクスを用いて目的 のペプチドに対する IgG画分の精製ポリクローナル抗体を調製することができる。また 、上記抗原と特異的に結合する抗体を選択することにより、特異精製することができ る。
また、モノクローナル抗体は下記の方法で作製できる。
免疫した哺乳動物の免疫細胞をミエローマ細胞と融合させてハイプリドーマを作製 し、このノ、イブリドーマの中から、上記ペプチドと特異的に結合する抗体を産生するク ローンを選択することにより、本発明の抗体を作製することができる。好ましくは、 53 位から 68位までのアミノ酸残基の連続した 10個以上力もなるペプチドを免疫原とす ることである。より好ましくは連続した 12個以上、特に好ましくは連続した 16個のアミ ノ酸カもなるペプチドを免疫原とすることである。
免疫する哺乳動物は、特に限定されないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞と の適合性を考慮して選択することが好ましぐマウス、ラットまたはハムスター等が好ま しい。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。これには P3、 P3U1 、 SP2Z〇、NS— 1、 YB2Z0及び Y3— Agl, 2, 3等の骨髄種細胞が含まれる。 免疫は公知の方法により行うことができる。例えば、抗原を腹腔内、皮下、静脈内ま たはフットパッド内に投与して行う。この抗原の投与はアジュバントを併用してもよぐ また複数回投与することが好ましい。免疫細胞は抗原の最終投与の数日後、例えば 3日後に、摘出した脾細胞またはリンパ節由来の細胞が好ましい。免疫細胞とミエ口 一マ細胞との融合は、 Milsteinなどの方法（Methods in EnzymoL, 73卷 3頁）等の公 知の方法を用いて行うことができる。例えば、融合剤としてポリエチレングリコール (P EG)を使用する方法または電気融合法等が挙げられる。
[0206] 免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、それらが融合できる比率であれば限定さ れないが、免疫細胞に対し、ミエローマ細胞を lZio量ないし等量を使用することが 好ましい。 PEG (平均分子量 1, 000〜4, 000)を使用して細胞融合を行う方法では PEG濃度は特に限定されないが 50%で行うことが好ましい。また、融合効率促進剤 としてジメチルスルフォキシド (DMSO)等の補助剤を添カ卩してもょ ヽ。融合は 37°C に加温した PEG溶液を混合した細胞に添加することにより開始し、 1〜5分間反応後 、培地を添加することにより終了する。この融合により形成されたノ、イブリドーマをヒポ キサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地 (HAT培地）等の選択培地で 1日 〜7日間培養し、未融合細胞と分離する。
[0207] 得られたハイプリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイプリ ドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハ イブリドーマとして榭立する。ノ、イブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法 は公知の方法を使用することができる。例えば ELISA法、凝集反応法、ラジオィムノ アツセィ法が挙げられる。榭立したノヽイブリドーマを公知の方法で培養し、その培養 上清よりモノクローナル抗体を得ることができる。また、ハイプリドーマをこれと適合性 を有する哺乳動物に投与して増殖し、その腹水より得ることができる。抗体の精製は 、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはァフィユティークロマト法等の公 知の精製手段を用いて行うことができる。
[0208] また、本発明の第四の態様の診断方法の項に記載した通り、本発明の可溶性 CD1 4抗原及び高分子量 CD14の安定性が影響し、測定値が変動することが想定される 。キットの性能を高めるため、可溶性 CD14抗原に特異性が高ぐ保存中に変化し測 定値が変動する要因となる物質との反応性の低い抗体が使用することがより好ましい 。このような変動を生じな 、キットを構成するための抗体をスクリーニングして得ること ができる。
本発明の第六の態様は、少なくとも一つの「本発明の第一の態様の可溶性 CD14 抗原」に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を、上記「本発明の第一の態 様の可溶性 CD14抗原」に特異的に結合させることを特徴とする、上記「本発明の第 一の態様の可溶性 CD 14抗原」の免疫学的な測定方法である。
[0209] 本発明の第六の態様の測定方法は、ヒト高分子量 CD14を検出せず、「本発明の 第一の態様の可溶性 CD14抗原」を測定するために、少なくとも一つの「本発明の第 一の態様の可溶性 CD14抗原」に特異的に結合する抗体を使用し、検体に含まれる 「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」を直接測定する「本発明の第一の態様 の可溶性 CD14抗原」の免疫学的な測定方法である。好ましくは、以下の a)〜d)の Vヽずれかの抗体または該抗体の断片を用いることを特徴とする測定方法である。 a)配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体、 b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 8〜 16アミノ酸残基から なるペプチドを抗原として作製される抗体、若しくは、
c)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体 。若しくは、
d)本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント若しくは本発明の第三 の態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントと特異的に結合する抗体。
[0210] より好ましくは、上記 a)、 c)若しくは d)の抗体または該抗体の断片を用いることを特 徴とする測定方法である。さらに好ましくは、 d)の抗体若しくは該抗体の断片を含む 測定キットである。また、以上の説明において、抗体の断片とは、該モノクローナル抗 体の Fab、 Fab'、若しくは F (ab' ) である。
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[0211] また、好ましくは、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」に結合する第二の 結合物質を用いて、上記 a)〜d)の 、ずれかの抗体若しくは該抗体の断片と該第二 の結合物質とのサンドイッチ免疫測定法により、「本発明の第一の態様の可溶性 CD 14抗原」を測定する「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の測定方法である
[0212] 上記 a)〜d)のいずれかの抗体を固相抗体、若しくは標識抗体等として使用するこ とができる。また、第二の特異結合、抗ィムノグロブリン抗体を利用した測定方法も含 まれる。この場合、上記 a)〜d)のいずれかの抗体は遊離の抗体、第二の特異結合 物質若しくは第二の特異結合パートナーに結合した抗体等としても使用することがで きる。
本発明の測定方法は、サンドイッチ免疫測定法の非競合法、または競合法が可能 であり、またィムノクロマト法、またはフロースルー法での測定も含まれる。
[0213] また、本発明の測定方法の原理は、サンドイッチ免疫測定法に限定されず、その他 の例としては凝集法、固相結合法及び溶液反応法等が挙げられる。
詳細な測定方法は、好ましい例は、本発明の第五の態様のキットの項に記載した 通りである。
[0214] 本発明の第七の態様は、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に特異的に結 合する抗体である。ただし、本願優先権主張日後の公開である国際公開 WO2004 Z44005号の実施例に記載の下記 a)〜d)の抗体も含まれ、一部重複する。このた め、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントに特異的に結合する 抗体は、下記 a)〜d)の抗体の一部を含んでいてもよい。また、本発明の第二の態様 の抗体と下記 a)〜d)の抗体と明確に区別するためには、本発明の第二の態様の抗 体から、下記 a)〜d)の抗体を除けばよ！、。
a)配列番号 2に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。 b)配列番号 4若しくは配列番号 5に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドを抗原とし て作製されるポリクローナル抗体。
c) F1031— 8— 3抗体。及び、
d) F1106— 13— 3抗体。
なお、国際公開 WO2004Z44005号〖こは、配列番号 2、配列番号 4若しくは配列 番号 5に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと結合する抗体、配列番号 6に記載の アミノ酸配列から選択される連続した 8〜30アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原とし て作製される抗体も説明されており、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14 フラグメントに特異的に結合する抗体は、これらの抗体の一部を含んでいてもよぐ明 確に区別するためには、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント に特異的に結合する抗体から、これらの抗体を除けばよい。
[0215] 本発明の第七の態様の「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に特異的に結 合する抗体」は、ヒト血中の全長可溶型 CD14蛋白質若しくは rsCD14 (1— 356)に 実質的に結合せず、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント組換 え型可溶性 CD 14フラグメントに対して特異的に結合する抗体であることが好ましい。 また、モノクローナル抗体である抗体が好ましい。
[0216] また、本発明の抗体は、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原を抗原として作 製することができる。
本発明の第七の態様の抗体を用いて、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原 を測定することができ、本発明の第五の態様の「本発明の第一の態様の可溶性 CD1 4抗原の測定キット」を構成することができる。
[0217] 本発明の第八の態様は、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメン トに特異的に結合する抗体である。ただし、本願優先権主張日後の公開である国際 公開 WO2004Z44005号の実施例に記載の下記 a)〜d)の抗体も含まれ、一部重 複する。このため、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントに特異 的に結合する抗体は、下記 a)〜d)の抗体の一部を含んでいてもよい。また、本発明 の第二の態様の抗体と下記 a)〜d)の抗体と明確に区別するためには、本発明の第 二の態様の抗体から、下記 a)〜d)の抗体を除けばよ！、。
a)配列番号 2に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。 b)配列番号 4若しくは配列番号 5に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドを抗原とし て作製されるポリクローナル抗体。
c) F1031— 8— 3抗体。及び、
d) F1106— 13— 3抗体。
[0218] なお、国際公開 WO2004Z44005号〖こは、配列番号 2、配列番号 4若しくは配列 番号 5に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと結合する抗体、配列番号 6に記載の アミノ酸配列から選択される連続した 8〜30アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原とし て作製される抗体も説明されており、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14 フラグメントに特異的に結合する抗体は、これらの抗体の一部を含んでいてもよぐ明 確に区別するためには、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント に特異的に結合する抗体から、これらの抗体を除けばよい。 [0219] 本発明の第八の態様の「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメン トに特異的に結合する抗体」は、ヒト血中の全長可溶型 CD 14蛋白質若しくは rsCD 1 4 (1 - 356)に実質的に結合せず、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14 フラグメント組換え型可溶性 CD14フラグメントに対して特異的に結合する抗体である ことが好ましい。また、モノクローナル抗体である抗体が好ましい。
[0220] また、本発明の抗体は、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント を抗原として作製することができる。
特に好ましい抗体は、 F1237— 3— 4抗体である。 F1237— 3— 4抗体を産生する ハイプリドーマは、平成 17年 4月 27日付（受領番号 FERM ABP— 10330)で日本 国茨城県つくば巿東 1-1-1 中央第 6 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生 物寄託センターに国際寄託した。
[0221] 本発明の第八の態様の抗体を用いて、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原 を測定することができ、本発明の第五の態様の「本発明の第一の態様の可溶性 CD1 4抗原の測定キット」を構成することができる。
本発明の第五の態様の「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の測定キット」 は、高分子量 CD14を測定しない。このことが、ヒト血中の全長可溶型 CD14蛋白質 に実質的に結合しない抗体が好ましい理由である。また、測定キットに用いることが、 モノクローナル抗体が好ましい理由である。さらに、ヒト血中の全長可溶型 CD 14蛋 白質若しくは rsCD 14 (1 - 356)とは実質的に結合しな 、抗体は、サンドイッチ免疫 測定法ではなぐ第二の結合物質を用いず、単独の抗体を用いることができ、特に有 用である。
[0222] 上記した通り、国際公開 WO2004Z44005号には、配列番号 2、配列番号 4若しく は配列番号 5に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと結合する抗体、配列番号 6に 記載のアミノ酸配列力も選択される連続した 8〜30アミノ酸残基力 なるペプチドを 抗原として作製される抗体、並びに抗 CD14抗体である F1031— 8— 3抗体及び F1 106— 13— 3抗体力 説明されている。これらの有用性は、敗血症の診断に有用な 低分子量 CD14測定キットに使用できることである。ただし、国際公開 WO2004Z4 4005号に記載の抗体は、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原との直接的な 関係は証明されておらず、当該ペプチド若しくは CD14を抗原として作成したところ、 敗血症の診断に有用な低分子量 CD14測定キットに有用であつたとの発明である。
[0223] 一方、本発明の抗体は、本発明の第五の態様の「本発明の第一の態様の可溶性 C D14抗原の測定キット」に使用することができる。また、「本発明の第二の態様の組換 え型可溶性 CD 14フラグメント」は、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原に免 疫学的性質が類似しており、該フラグメントに結合する抗体 (すなわち本発明の抗体 )でなければ、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の測定キットに使用する ことができない。
[0224] 今までに、公知である抗体で、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」の測定 キットに使用可能である抗体は、国際公開 WO2004Z44005号に記載の上記の抗 体のみであり、また、「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメント」に 結合する抗体も上記の抗体のみであり、種々の抗 CD14抗体は「本発明の第二の態 様の組換え型可溶性 CD 14フラグメント」に結合しな 、ことも明らかとなつて 、る。 すなわち、本発明の抗体は、「本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の測定キ ット」に使用できる抗体を網羅的に発明し、開示することになる。さらに、「本発明の第 二の態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメント」を抗原として作成した抗体は、「本発 明の第一の態様の可溶性 CD14抗原」とは免疫学的な反応性が高ぐ特に有用であ ると考免られる。
[0225] 本発明の第九の態様は、本発明の第三の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメン トに特異的に結合する抗体である。
本発明の第九の態様の抗体は、本発明の第三の態様の組換え型可溶性 CD14フ ラグメントを抗原として作製することができる。
また、本発明の第九の態様の抗体の好ましい例示は、本発明の第八の態様の項の 記載と同じであり、有用性、その他の記載も同様である。
[0226] 本発明の第十の態様は、下記の工程を含む、本発明の第一の態様の可溶性 CD1 4抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法である。
1)配列番号 3に記載のアミノ酸配列力 選択される連続した 6〜20個のいずれか の個数のアミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体を用意する工程、 2) CD14を含む測定対象液を用意する工程、
3) 1)で用意した抗体、若しくは、 2)で用意した測定対象液を用いて、免疫測定系 を構成する工程、
4) 3)で構成した免疫測定系により、測定対象液中の 1)で用意した抗体と特異的に 結合する物質を測定する工程、及び
5) 4)で得た測定結果により本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の測定に有 用な抗体を評価し、選択する工程。
本発明の第十の態様のスクリーニング方法は、敗血症の診断に有用なマーカーと なり得る本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体のスクリー- ング方法である。すなわち、敗血症の診断に有用なマーカーとなり得る本発明の第 一の態様の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体を選別する方法である。また、本 発明の第五の態様のキットに使用可能な抗体を選別する方法である。
本発明の第十の態様のスクリーニング方法は、上記 1)の工程で用意する「配列番 号 3に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 6〜20個のいずれかの個数のアミ ノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」をスクリーニング対象検体とする ことを特に特徴とする。用意するスクリーニング対象検体は「配列番号 3に記載のアミ ノ酸配列から選択される連続した 6〜20個のいずれかの個数のアミノ酸残基からなる ペプチドと特異的に結合する抗体」であれば特に特に限定されない。また、抗原との 間で抗原抗体反応を生じること機能を有して 、れば、該抗体のフラグメントをスクリー ユング対象検体としてもよい。（以下の抗体に関する説明には、抗体のフラグメント〖こ 関する説明も含む。 )
2)の測定対象液は、 CD14を含む液であれば特に限定されない。好ましくは高分 子量 CD14を少なくとも含む液である。
3)で構成する免疫測定系は、スクリーニング対象検体である抗体が、測定対象液 に含まれる CD14と特異的に反応するかどうかを測定することができればよい。例え ば抗原固相化法、サンドイッチ法若しくは生体分子間相互作用解析法等が挙げられ る。ただし、本発明の第五の態様若しくは第六の態様で説明した免疫学的測定法の 系のいずれでもよぐ特に限定されない。 [0228] 4)の工程は、 3)の工程で構成した免疫測定法に準じ、測定対象液を対象として、 1)で用意した抗体と特異的に結合する物質を測定すればよい。
5)の工程は、 4)の工程で測定した結果により、スクリーニング対象検体である抗体 力 敗血症の診断に有用な免疫測定法に用いるために有用であるかどうかを評価し 、有用であれば該抗体を選択する工程である。特に指標は限定されるものではない
[0229] 上記の通り、本発明の第六の態様のスクリーニング方法は、上記 1)の工程で用意 する「配列番号 3に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 6〜20アミノ酸残基か らなるペプチドと特異的に結合する抗体」をスクリーニング対象検体とすることを特に 特徴とする方法であり、その他の工程について必要以上に限定されるものではない。 上記 1)の工程で用意する抗体は、配列番号 3に記載のアミノ酸配列のうち N末端 1 位から 314位までのアミノ酸配列力も選択される連続した 6〜20アミノ酸残基力もなる ペプチドと特異的に結合する抗体、配列番号 3に記載のアミノ酸配列力 選択される 連続した 8〜30アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製される抗体、若しくは 配列番号 3に記載のアミノ酸配列のうち N末端 1位から 314位までのアミノ酸配列から 選択される連続した 8〜30アミノ酸残基カゝらなるペプチドを抗原として作製される抗 体であることが好ましい。
[0230] なお、上記 1)の工程において「配列番号 3に記載のアミノ酸配列力 選択される連 続した 6〜20アミノ酸残基力 なるペプチドと特異的に結合する抗体」を用意する代 わりに、以下の、く 1〉〜く 4〉の抗体を用意して用いても良い。く 1〉CD14全長配列に基 づき定法によりペプチドを合成し、免疫抗原を調製して抗体を作製する。く 2〉血清中 の精製可溶性 CD14を精製し、これを免疫原として抗体を作製する。く 3〉COS細胞 や大腸菌を用いて組換え CD14蛋白質を調製し、これを免疫原として抗体を作製す る。く 4〉調製した各種 CD14抗原を熱変性や DNP化等により処理し、これを免疫原と して抗体を作製する。
[0231] 本発明の 3)で構成する免疫測定法が抗原固相化法である場合の例についてさら に説明する。
この場合、上記 1)の工程で用意した抗体に対する標識抗体、例えば標識抗ィムノ グロブリン抗体、をさらに用意する
上記 2)の工程では、用意する測定対象液は検体が正常人の体液若しくはヒト高分 子量 CD14の標品が好ましい。ヒト高分子量 CD14の標品は、例えば正常人の体液 の 3C 10抗体ァフィユティーカラム吸着画分等を用意すればよ 、。
[0232] そして、不溶性担体上に、例えば「測定対象液中の高分子量 CD14」一「1)の工程 で用意した抗体」 「標識抗ィムノグロブリン抗体」の複合体を形成させるように免疫 測定系を構成すればよぐ「1)の工程で用意した抗体」の「測定対象液中の高分子 量 CD14」に対する特異的な結合性を標識を通して測定する。例えば、 3)の工程に おいて、測定対象液を不溶性担体に結合させて構成し、 4)の工程において、 3)で 構成したドットブロッテイング法による測定系に 1)で用意した抗体と上記「標識抗ィム ノグロブリン抗体」を順に反応させればよい。その後標識の強度により、上記複合体 の形成度合い、すなわち測定対象液中の 1)で用意した抗体と特異的に結合する物 質を測定すればよい。
[0233] 5)の工程においては、例えば、標識の強度が弱い若しくは強度を示さない 1)で用 意した抗体は、正常人の体液若しくはヒト高分子量 CD14の標品中の高分子量 CD1 4と特異的な結合性が弱 、若しくはな 、と評価し、敗血症の診断に有用な免疫測定 法に用いるためには有用である抗体と選択すればょ 、。例えば血中の高分子量 CD 14と特異的な結合性が強いと評価できる抗体を用いて、ヒト体液中の該抗体と特異 的に結合する物質を測定する場合に測定される主な蛋白質は高分子量 CD14となる 。この場合は、高分子量 CD14よりも微量の蛋白質である本発明の第一の態様の可 溶性 CD14抗原を測定する場合には、高分子量 CD14と特異的には結合しない抗 体を選択すればょ ヽこと〖こなる。
抗原固相化法において、特に酵素で標識する場合を、抗原固相 EIA法となり、上 記不溶性担体に、メンブレンを使用する場合、ドットブロッテイング法となる。
[0234] 本発明の 3)で構成する免疫測定法がサンドイッチ測定法である場合の例につ！、て さらに説明する。
サンドイッチ免疫測定法の説明につ 、ては、本発明の第五の態様のキット若しくは 本発明の第五の測定法の項に記載した通りである。 この場合、もう一つの配列番号 3に記載のアミノ酸配列力 選択される連続した 6〜 20アミノ酸残基力もなるペプチドと特異的に結合する抗体若しくは抗 CD14抗体 (第 二の抗体と記載することがある）を用意する。
上記 2)の工程で用意する測定対象液は、正常人の体液と敗血症患者の体液が好 ましい。ここで、両体液の由来は同じであることがより好ましい。すなわち、例えば正 常人の血液サンプルと敗血症患者の血液サンプルであること、若しくは正常人の尿 サンプルと敗血症患者の尿サンプルであること、の様に両体液の由来は同じであるこ とがより好ましい。さらには血液サンプルであることが好ましい。特に血清であることが 好ましい。
[0235] そして、不溶性担体上に、例えば「1)の工程で用意した抗体」 「本発明の第一の 態様の可溶性 CD14抗原」 「第二の抗体」の複合体を形成させるようにサンドイッチ 免疫系を構成すればよい。
例えば、 3)の工程において、「1)の工程で用意した抗体」若しくは「第二の抗体」の 一方を不溶性担体に結合させて、もう一方を標識して、サンドイッチ免疫系を構成す る。
4)の工程において、 3)で構成したサンドイッチ免疫系に測定対象液、標識した抗 体を順に反応させて、測定すればよい。
5)の工程において、正常人の体液の測定結果と、敗血症患者の体液の測定結果を 比較し、比較した測定結果の違いにより、敗血症の診断に有用な、本発明の第一の 態様の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体を評価し、選択すればょ ヽ。
[0236] また 3)で構成する免疫測定法がサンドイッチ測定法である場合は、選択する抗体 は、 1)で用意した抗体及び「第二の抗体」の抗体の組み合わせを選択することが好 ましい。すなわち、敗血症の診断に有用なマーカーとなり得る血中蛋白質を測定する ために用いる、敗血症の診断に有用なサンドイッチ免疫測定法に用いるための抗体 の組み合わせをスクリーニングする方法であることが好ましい。
なお、本発明のスクリーニング方法に用いる抗体の作製は本発明の第五の態様の 測定キットの説明の項に記載に準じ行うことができる。また、材料等の説明についても 、該説明の項に記載した通りである。 生体分子間相互作用解析法は、特に限定されないが、表面プラズモン共鳴法が例 示される。例えば、 Biacore装置（Biacore社製）を用いれば行うことができる。
[0237] 本発明の第十一の態様は、下記の工程を含む、本発明の第一の態様の可溶性 C D14抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法である。
1)抗体をスクリーニング対象検体として用意する工程。
2)本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントを用意する工程。
3) 1)で用意した抗体を 2)で用意したフラグメントと反応させ、 1)で用意した抗体と 2 )で用意したフラグメントの特異的な結合を評価する工程。及び、
4) 3)において、 2)で用意したフラグメントに特異的に結合した抗体を、本発明の第 一の態様の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体として、選択する工程。
[0238] 本発明の第 ^—の態様のスクリーニング方法は、敗血症の診断に有用なマーカー となり得る本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体のスクリー ユング方法である。すなわち、敗血症の診断に有用なマーカーとなり得る本発明の第 一の態様の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体を選別する方法である。また、本 発明の第五の態様のキットに使用可能な抗体を選別する方法である。
[0239] 本発明の第 ^—の態様のスクリーニング方法は、特にスクリーニング対象検体であ る抗体を、本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントに反応させて、 両者が特異的な結合、すなわち抗原抗体反応を示すかどうかを評価することを特徴 とする。本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントは、本発明の第二 の態様の説明の項に記載の通り、 3C10及び MEM— 18に特異的な結合せず、配 列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異 的に結合する。これは、本発明の第一の態様の可溶性 CD14抗原と同じ免疫学的な 性質である。このことにより、スクリーニング対象検体である抗体と、本発明の第二の 態様の組換え型可溶性 CD14フラグメントとの反応を評価することが、発明の第一の 態様の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体を選別することになる。
1)の工程において、用意するスクリーニング対象検体は抗体であれば特に特に限 定されない。また、抗原との間で抗原抗体反応を生じること機能を有していれば、抗 体のフラグメントをスクリーニング対象検体としてもよい。（以下の抗体に関する説明に は、抗体のフラグメントに関する説明も含む。）
特にスクリーニングの効率を上げるためには、スクリーニング対象検体として、「配列 番号 3に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 6〜356個のいずれかの個数の アミノ酸残基からなる蛋白質と特異的に結合する抗体」を用意することが好ましい。ま た「配列番号 3に記載の 53位〜 68位力も選択される連続した少なくとも 7個のアミノ 酸残基を含む蛋白質と特異的に結合する抗体」を用意することがより好ましい。
2)の工程において、用意する本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD14フラ グメントは、本発明の第二の態様の説明の項に記載した組換え型可溶性 CD14フラ グメントであれば特に限定されな!、。
3)の工程において、 1)で用意した抗体を 2)で用意したフラグメントと反応させ、 1) で用意した抗体と 2)で用意したフラグメントの特異的な結合を評価する方法は、両者 が特異的な結合、すなわち抗原抗体反応を示すかどうかを評価できる方法であれば 、特に限定されない。抗原固相化法、サンドイッチ測定法若しくは生体分子間相互作 用解析法が例示される。これらの方法については、本発明の第十の態様の説明の項 に記載した通りである。第二の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法により、特異的 な結合を評価すれば、サンドイッチ測定法による抗体の組み合わせを評価することが でさること〖こなる。
本発明の第十二の態様は、下記のく 1〉〜く 3〉の工程
く 1〉下記の 1)〜4)の配列を有する組換え型可溶性 CD14フラグメントを作製するェ 程、
1)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または 該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜： LO 個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
2) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである
3) C末端が配列番号 3の 134位〜 356位のいずれかである、
4)所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号 3の 59位〜 70位の後ろ に置換若しくは挿入されて 、る
く 2X1〉で作製した組換え型可溶性 CD14フラグメントを該所定の蛋白分解酵素に より切断する工程、及び、
く 3X2〉で切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程。 を含む、下記の 5)〜7)の配列を有する本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメントの生産方法である。
[0241] 5)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しく は該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
6) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである、及び、
7) C末端が配列番号 3の 59位〜 70位の!/、ずれかである。
本発明の第十二の態様の「本発明の第二の態様の組換え型可溶性 CD 14フラグメ ントの生産方法」によれば、所定のアミノ酸配列を有する本発明の第二の態様の組換 え型可溶性 CD 14フラグメントを生産することができる。詳細な生産方法は、本発明 の第二の態様の説明の項に記載した通りである。
[0242] 例えば、所定の蛋白分解酵素が ProScission Proteaseである場合、〈1〉の工程 の 4)において切断部位の配列力Leu, Glu, Val, Leu, Phe, Gin, Gly, Proである ことが挙げられる。
また所定の蛋白分解酵素が Thrombinである場合、く 1〉の工程の 4)において切断 部位の配列力 SLeu, Val, Pro, Arg, Gly, Serであることが挙げられる。
実施例
[0243] 以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示 すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載 において用いる略号は当該分野において慣例として用いられる略号に基づくもので ある。
なお、以下の実施例に使用した正常人血清及び敗血症患者血清は ProMedDx社 製、 Samplex社製及び Sera Care Life Science社製を購入して、使用した。
[0244] (実施例 1)合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体の作製
1 （1 )抗原とするペプチドの調製
配列番号 2に記載の配列（配列番号 3に記載の 53位力も 68位の配列に該当）を有 するペプチド (以下、 S68ペプチドと記載)を、 N末端で SH基を介してキャリア蛋白質 と結合させるため、 N末端にシスティンを挿入して合成した。すなわち、ペプチド合成 機 ABI433A (アプライド）を用いて、アミノ酸配列に従ってアミノ酸カラムを並べ、 N 末端にシスティン用のアミノ酸カラムを設置し自動合成を行った。合成したペプチド は定法により樹脂より切り出し、エーテルで沈殿させ回収後、再度蒸留水で溶解し凍 結乾燥した。得られた粗精製ペプチドは溶解後、 C18逆相 HPLC (CAPCELL— PA K、資生堂)を用いて 5〜70%のァセトニトリル濃度の直線グラジェントで溶出し、目 的のペプチドを含む分画を回収した。回収した分画は凍結乾燥し、精製ペプチドとし て 2〜3mgを得た。
[0245] 1 (2)合成ペプチドを用いたペプチドキャリア抗原の調製
1— (1)で調製したペプチドを蒸留水で lOmgZmLに溶解し、 lOmgZmLのマレ イミドィ匕キーホーノレリンペットへモシァ-ン (Imject Maleimed Activated keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) (PIERCE)と等量混合した。室温で 2時間反応後、生理 食塩水で平衡化した NAP— 10カラム（アマシャム バイオサイエンス）で脱塩し、 S6 8ペプチドキャリア抗原（以下、 S68ペプチド—KLHと記載)を lmg得た。以下の実 施例に記載の蛋白質濃度は使用した KLH量を液量で割ったものを使用した。
[0246] 1 (3)合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体の作製
1 - (2)で調製した S68ペプチド— KLHに対するポリクローナル抗体を作製するた め、 S68ペプチド KLHを用いてゥサギに免疫を行った。すなわち、 S68ペプチド — KLH各 100 μ gを 500 μ Lの生理食塩水に希釈し、 500 μ Lのフロインド完全アジ ュバント（DIFCO)と等量混合後、ニュージーランド白色ゥサギ（北山ラベス)メス 2. 1 —2. 2kgの背部皮下に投与した。その 2週間後、 S68ペプチド— KLH各 100 gを 500 μ Lの生理食塩水に希釈し、 500 μ Lのフロインド不完全アジュバント（DIFCO) と等量混合後、背部皮下に投与した。さらにその 2週間後、 S68ペプチド— KLH10 0 gを lmLの生理食塩水に希釈し耳静脈内に投与した。
[0247] 投与終了 1週間後、耳静脈より採血し、定法にしたがい抗血清を分離し、抗体を精 製した。まず抗血清に最終飽和濃度 33%となるように硫酸アンモ-ゥムを添加し、 4 °Cで 1時間攪拌後、析出した沈殿を遠心分離した。次に沈殿を 76mMリン酸緩衝液 (以下、 PBS (pH6. 4)と記載)で溶解し、一夜透析した。透析液を濾過後、プロティ ン Aカラム（プロセップ A、ミリポア）にアプライし、結合した IgG画分を 0. 1Mグリシン 塩酸緩衝液 (PH3. 0)により溶出し、精製抗体を得た。 PBS (pH6. 4)で透析後、 28 Onmの吸光度より蛋白濃度を算出した (換算値: 0. 533mg/mL) 0以降、得られた 抗体を S68ペプチドポリクローナル抗体と記載する。
[0248] 1一（4)特異精製ポリクローナル抗体の調製
S68ペプチドポリクローナル抗体より S68ペプチドに対する抗体のみを精製するた め、以下の方法により特異精製を行った。まず、システィンを挿入した S68ペプチド（ 以下、 C S68ペプチドと記載)を SH基を介して担体に結合させるため、マ-ユアル に従って SulfoLink Coupling Gel (PIERCE) lmLあたり C S68ペプチド 200 μ gを混 合し反応した。反応終了後残った活性基をブロッキングし、 S68ペプチド結合ァフィ ユティーカラムを調製した。次に、 1— (3)に記載の精製 IgG画分 7. 92mgをアプライ し、リン酸緩衝液 (PH7. 4) (ダルベッコ、以下、 D— PBS (pH7. 4)と記載)でカラム を洗浄し、次に 0. 1Mグリシン塩酸緩衝液 (pH3. 0)で結合した抗 S68ペプチド抗体 を溶出した。溶出後 pHを中性に戻し PBSで透析後、蛋白質濃度を 280nmの吸光 度より算出した (換算値： 0. 533mgZmL)ところ、 0. 52mgの抗 S68ペプチド抗体（ 以下、 S68抗体と記載）が得られた。
[0249] (実施例 2)合成ペプチドを抗原としたモノクローナル抗体の作製
実施例 1— (2)で調製した S68ペプチド— KLH20 μ gを 100 μ Lの生食に溶解し、 フロインド完全アジュバント（DIFCO)と等量混合し、 Wistarラット 8週齢メスの各後足フ ットパッドに 100 Lずつ投与した。 2週間後、腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行つ た。細胞融合は安東民衛，千葉丈 Z著「単クローン抗体実験操作入門」 83ページ、 1 991年 (講談社）にしたがって行った。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（フアル コン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Sp2ZO— Agl4)と 5 : 1で混合し 、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。融合した細胞を HAT培地に懸 濁し、ノ、イブリドーマを選別後、 目的の抗体を産生しているハイプリドーマをスクリー ユングした。
[0250] スクリーニングは rsCD14 (l— 307) S286Cを直接プレートに固相化するELISA 法を用いた。すなわち、ィムノプレート（Maxisorb, NUNC)に 0. 1Mリン酸緩衝液（pH 7. 4)で 1 μ g/mUこ希釈した rsCD14 ( 1— 307) S286Cを各クェノレ【こ 50 μ 添カロ し、 37°Cで 1時間静置した。次にプレートをイオン交換水で 5回洗浄後、 0. 1 %BSA を含む PBS (pH6. 4)を各ゥエルに 100 L添加し、室温で 1時間静置してブロッキ ングを行った。得られたノ、イブリドーマ力もサンプリングした培養上清を各ゥエルに添 加し 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05%Tween20を含む生理食塩水で 3回洗浄し た。
[0251] 次にペルォキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体 (DAKO)を 10%ゥサギ血 清を含む PBSで 1000倍に希釈した溶液を各ゥエルに 50 L添カ卩した。 37°Cで 1時 間反応後、同様に 5回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液 (TMB、 BioFix)を各ゥエル に添加した。室温で 10分間反応後、 0. 5M硫酸溶液で反応を停止した。 450nmの 吸光度をプレート分光光度計 (NJ— 2100、 日本インターメッド)で測定し、 rsCD14 ( 1 - 307) S286Cと結合する抗体を産生するノ、イブリドーマを含むゥエルを選択した
[0252] 次に、選択したゥエルより安東民衛，千葉丈 Z著「単クローン抗体実験操作入門」 83頁、 1991年 (講談社）にしたがって限界希釈法によりクローユングを行った。 10日 後、同様に rsCD14 ( 1— 307) S286Cに対する反応性を指標としてスクリーニングを 行い、 6種類のハイプリドーマを選択した。選択したハイプリドーマを 10%FCSZRP MI 1640培地 (Sigma)で培養後、 Hybridoma - SFM培地（Invitrogen)で培養し抗体 を産生させ、プロテイン Gカラム (Prosep— G、ミリポア）を用いて抗体を精製した。精 製した F1146— 17— 2抗体のサブタイプをラットタイピングキット（ZYMED)を用い て決定したところサブタイプはラット IgG2b ' κであった。
なお、 rsCD14 ( l— 307) S286Cは、 WO01/72993号に実施 f列 9として記載さ れた方法を用いて調製した。
[0253] (実施例 3)サンドイッチ EIA法測定系の検討
実施例 1及び実施例 2に記載の抗体を用いて、サンドイッチ EIA法による測定系を 検討した。
3 - ( 1)組換えヒト CD14の調製 まず、サンドイッチ ELISA法の第二の抗体とする rsCD14 (1— 285)に対するモノ クローナル抗体を作製するため、その免疫原である rsCD 14 (1 - 285)を大腸菌で 調製した。 rsCD14 (l— 285)を大腸菌で発現させるために、以下の方法で発現ブラ スミド pTrp 1659を構築した。
まず、オリゴマー 8, linkS (5，一 age tta gga att t 3，）（配列番号 7)及びオリゴマー 8, linkA (5' -cta gaa att cct a— 3') (配列番号 8)を合成した。
[0254] これらのオリゴマーを等量混合し、 99°Cで 1分間加温した後に、室温まで徐々に冷 却してアニーリングを行った。さらに T4 Polynucleotide Kinaseで 5末端をリン酸化して リンカ一を作製した。
次にセンスプライマー A (5，一aca tct aga tga cca cgc cag aac ct— 3，) (酉己歹 U番号 9) 及びアンチセンスプライマー（5'— ttt gga tec tta cta gag ate gag cac tct - 3') A (IS 列番号 10)を合成し、 WO01Z72993号公報の実施例 8に記載のプラスミド pM165 9を铸型に Pyrobest DNA polymeraseを用いて PCRを行った。
反応液を 90°Cで 2分間加温した後に、 98°C 10秒、 55°C 30秒、 72°C 1分のサ イタルを 30回繰り返して行った。
[0255] 得られた約 900bpの増幅物を、 Xbalと BamHIとで double digestionして、 DNA断片 を回収した。特開平 06— 025289号公報の実施例 10に記載のベクター pM710を、 Hindlllと BamHIとで double digestionした後に、ァガロースゲル電気泳動を行い、回 収した。前述したリン酸ィ匕済みリンカ一、 PCR増幅 DNA断片/ Xbal + BamHI消化断 片、そしてベクター ZHindlll + BamHI断片の 3種を ligationした後に（three— way ligation)、大腸菌コンビテントセル（JM109 (TOYOBO) )に transformationを行 、、 目 的のプラスミドを含むクローンを得た。プラスミド DNAは定法により調製した。
[0256] 次に rsCD14 (l— 285)を生産するための JE7924形質転換株をエレクト口ポレーシ ヨン法により調製した。
まず、大腸菌 JE7924 (J. Bacteriol 173 4799頁（1991) )をグリセロールストックより回 復し、 LB培地にて 37°C —晚培養した。さらに 50mLの LB培地に植菌し直し、 600 nmの吸光度が 0. 5〜0. 6になるまで培養を続けた後に、培養フラスコごと 30分間氷 冷した。次に大腸菌を集菌し、氷冷した滅菌蒸留水にて 2回、氷冷した 10%グリセ口 ール溶液で 1回洗浄した後に、氷冷した 10%のグリセロール溶液 100 Lに懸濁し た。 50 Lずつ 2本のチューブに分注して、液体窒素で急速凍結し、コンビテントセ ル (JE7924)を調製し、使用時まで— 80°Cで保存した。
[0257] 次に、 JE7924コンビテントセル 50 μ Lに、 pTrpl659約 30ngをエレクト口ポレーショ ン法で導入した。機器は BIO— RAD社の Gene Pulserを使用した。また、その時の設 定は、 Voltage2. 5kV、 Resistor 200 Ω、 Capasitor 25 μ Fで行った。その後、 50 μ g/mLのアンピシリンを含む LBァガープレートでー晚培養することで、 pTrpl65 9が導入された形質転 ·を得た。このクローンを LB培地にて 37°Cで一晩培養した 後に、新しい培地に再度植菌し直し、さらに 5時間培養した。 600nmの吸光度が 2〜 3であることを確認し、 3 β— INDOLEACRYLIC ACID (Sigma社）を終濃度 100 μ g/ mLの濃度で添加し、 37°Cで 4時間培養を行い、 rsCD14 (l— 285)を誘導発現させ た。次に、大月易 ¾を回収し、 Bug Buster Protein Extraction Reagent (Novagen干土) 用いて Inclusion bodyを調製した。その後、 SDS— PAGE用バッファ一にて溶解し、 SDS— PAGEを行い、抗 CD14抗体による Western lottingで rsCD14 ( 1— 285)の 発現を確認した。
[0258] 免疫原用 rsCD14 (l— 285)は同様に JE7924形質転換株を 1Lの LB培地で培養し 調製した。まず培養液を遠心分離し、大腸菌を集菌後、菌体を D— PBSで洗浄し、 集め 7こ ΐί体【こ 50mLの Bug Buster Protein Extraction Reagent (Novagen、以" h Bug Busterと記載)を加えて懸濁し、室温で 30分間放置した。菌体溶解後、 10分間ソ- ケーシヨン (US— 3、井内盛栄堂）処理し、 10000 X g、 4°Cにて 20分間遠心分離し 、上清を除去した。再度同様にソ-ケーシヨン処理し、得られた沈殿を 50mLの Bug Busterに懸濁した。懸濁液に lmLの lOmgZmLのリゾチーム（生化学工業）を加え て緩やかに攪拌後、室温で 10分間放置し、続けて 200mLの 10分の 1量の高濃度 Bug Busterを加えて攪拌後、同様に遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿に、 200mLの 1Z10濃度の Bug Busterをカ卩えて懸濁し、同様に遠心分離し、この操作を 数回繰り返した。最終的に得られた沈殿に lOOmLの D—PBSをカ卩え、封入体を得 た。
[0259] rsCD14 (1— 285)の調製は、まず封入体を 1%の TritonXlOOを含む TE緩衝液 ( pH8. 0、二ツボンジーン）に溶解し、凍結融解を 3回行い、遠心し沈殿を回収した。 再度 1%の TritonXlOOを含む TE緩衝液（pH8. 0、二ツボンジーン）に溶解し、氷冷 後 250 Aで 10秒間隔で 12分間超音波処理を行い、遠心後沈殿を回収した。沈殿 を 1%の TritonX100、 0. 2M NaOHを含む TE緩衝液（pH8. 0、 -ツボンジーン） に溶解し、 37°Cで 10分間処理、遠心、再溶解を 3回行った後、沈殿を回収した。得 られた沈殿を 6Mのグァ-ジン塩酸を含む水溶液に溶解し、精製 rsCD14 ( 1— 285) を調製した。濃度は BSAを標準品としてブラッドフォードのタンパクアツセィ法により 算出した。
[0260] 3—（2)抗 CD14モノクローナル抗体の作製
[1] F1106— 13— 3抗体の作製
上記に記載の大腸菌由来 rsCD14 (1— 285)を投与抗原として、モノクローナル抗 体を作製した。まず、 ddyマウス 6週齢メスの腹腔に精製 rsCD14 (l— 285) 20 8を フロインド完全アジュバント（DIFCO)と等量混合して 200 μ L投与した。 2週間後、 精製 rsCD14 (1— 285) 20 μ gをフロインド不完全アジュバント（DIFCO)と等量混合 し、腹腔内に 200 L投与した。細胞融合 3日前にマウスの腹腔に抗原 50 gを投与 した。 3日後、無菌的に脾臓を摘出し、脾臓よりリンパ球を分離し、安東民衛'千葉丈 Z著「単クローン抗体実験操作入門」 83ページ、 1991年 (講談社）にしたがってミエ口 一マ細胞（P3 X 63— Ag. 8. U' l)と 10 : 1で混合し、ポリエチレングリコールを用い て細胞融合を行った。 HAT培地によりハイプリドーマを選別後、 rsCD14 (1— 285) と結合する抗体を産生しているハイプリドーマのスクリーニングを ELISA法で行った。
[0261] まず、 rsCD14 (l— 285)を PBS (pH6. 4)で 0. 4 gZmLに希釈し、ィムノブレ ート（Maxisorb, NUNC)の各ゥエルに 50 μ L添カ卩した。 4°Cでー晚反応後、イオン交 換水で 5回洗浄し、 0. 5%BSAを含む PBS (pH6. 4)を各ゥエルに 100 L添加し、 ブロッキングを行った。サンプリングした培養上清を各ゥエルに添加し 37°Cで 1時間 反応させた後、 0. 05%Tween20を含む生理食塩水で 3回洗浄した。次にペルォキ シダーゼ標識抗マウスィムノグロブリン抗体 (DAKO)を 10%ゥサギ血清を含む PBS で 1000倍に希釈した溶液を各ゥエルに 50 /z L添カ卩した。 37°Cで 1時間反応後、同 様に 5回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液 (TMB. BioFix)を各ゥエルに添カ卩した。 室温で 10分間反応後、 0. 5M硫酸溶液で反応を停止した。 450nmの吸光度をプレ ート分光光度計 (NJ— 2100、 日本インターメッド)で測定し、 rsCD14 (l— 285)と結 合する抗体を産生するノ、イブリドーマを含むゥエルを選択した。次に選択したゥエル より安東民衛，千葉丈 Z著「単クローン抗体実験操作入門」 83ページ、 1991年 (講談 社）にしたがって限界希釈法によりクローユングした。 10日後、同様に rsCD14 (l— 285)に対する反応性を指標としてスクリーニングを行い、ハイプリドーマを選択したと ころ 12種類の抗 rsCD 14 (1— 285)モノクローナル抗体産生ハイブリドーマが得られ た。
[0262] 選択したハイプリドーマを 10%FCSZRPMI1640培地（Sigma)で培養後、
Hybridoma— SFM培地（Invitrogen)で培養し抗体を産生させ、プロテイン A (Prosep A、ミリポア）を用いて抗体を精製した。
特に反応性の高 、抗体である F1106- 13- 3抗体のサブタイプを IsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit (Roche)を用いて決定したところサブタイプは IgG 2b · κであった。
[0263] [2]F1031— 8— 3抗体の作製
F1031— 8— 3抗体は WO01Z22085号公報の実施例 7に記載の方法を用いて 作製した。簡単に記載すれば、ヒト血中の CD14蛋白質 20 gを生食に溶解し、フロ インド完全アジュバンド (DIFCO)と等量混合し、初回及び 2週間後に 2回目をマウス に腹腔内投与をした 1週間後、血清中の抗体価の上昇を、 WO01Z22085号公報 の実施例 5と同様に組換えヒト CD14蛋白質との反応性を ELISA法により確認した。 マウスの腹腔に抗原 100 gを投与し最終投与を行い、 3日後、脾臓を摘出した。脾 臓よりリンパ球を分離し、ミエローマ細胞 (P3 X 63— Ag. 8. U. 1)と 10 : 1で混合し ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。 HAT培地によりハイプリドーマを 選択し、 1週間後目的に抗体を産生しているハイプリドーマのスクリーニングを上記記 載の ELISA法により行った。固相化した可溶性 CD14抗原と反応したノ、イブリドーマ を限界希釈法によりクローユングし、 10日後同様にスクリーニングを行い、抗 CD14 蛋白質モノクロナール抗体を得た。代表的な抗体として、 IsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit (Roche)を用いて決定したサブタイプが IgG2b ' κである F10 31— 8— 3抗体を得た。
[0264] 3—（3)サンドイッチ EIA系の検討
敗血症患者に多く存在する蛋白質を特異的に検出可能な系を作製するため、実施 例 1、 2、 3— (2)に記載の抗体を用いてサンドイッチ EIA系を作製した。
[0265] [1] ペルォキシダーゼ標識抗体の調製
ペルォキシダーゼ標識抗体は中根らの方法（J. Histochem. Cytochem., 22卷、 p.1084, 1974年）に従い 4mgのペルォキシダーゼ（東洋紡）を蒸留水に溶解し、 100 mMの過ヨウ素酸を添カ卩し 25°Cで 20分間反応した。反応終了後、 1. 5%エチレング リコールを添加し 25°Cで 10分間反応させ ImM酢酸緩衝液 (pH4. 4)に対して透析 した。精製した F 1031 -8- 3抗体及び F1106- 13- 3抗体それぞれを 10mM炭 酸緩衝液 (PH9. 5)で透析し、 4mgに対して 0. 2M炭酸緩衝液 (pH9. 5)を 70 L 添加して活性ィ匕した 4mgのペルォキシダーゼを抗体と等量に混合し 25°Cで 2時間 反応した。次に 4mgZmLの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、さらに 2時間 4°Cで反 応した。反応液を PBSに透析し、ペルォキシダーゼ標識 F1031— 8— 3抗体 (以下、 F1031 -8- 3—HRPと記載する場合がある）及びペルォキシダーゼ標識 F1106 — 13— 3抗体 (以下、 F1106— 13— 3— HRPと記載する場合がある）を得た。液量 を測定し使用した抗体量より抗体濃度を算出した。
[0266] [2]サンドイッチ EIA系の作製
固相抗体として実施例 1で作製した S68抗体を使用し、標識抗体として実施例 3— (2) [ 1 ]及び [2]で作製した抗体を使用する 2ステップサンドイッチ EIA系を作製した 。すなわち S68抗体を D— PBS (pH7. 4)で 10 g/mLに希釈し、ィムノプレート（ Maxisorb, NUNC)の各ゥエルに 50 μ L添カ卩した。 4°Cでー晚反応後、イオン交換水 で 5回洗浄し、 0. 1 %StabilGuard (SurModics, Inc)と 0. l%Tween20を含む D— PB Sを各ゥエルに 100 L添カ卩しブロッキングした。次に 1%の正常人血清（3C10を用 いて可溶性 CD 14抗原を除去した血清、以下、 CD14吸収血清と記載、 3C10は A mericanTypeCultureCollectionより入手した ATCC228—TIBハイプリドーマより 調製した）、 0. 1%BSAを含む PBS (pH7. 4)を希釈液として、ヒト正常人血清及び ヒト敗血症患者血清を 20倍に希釈した希釈検体を調製した。希釈検体をゥエル当た り 50 /z L添加し、 37°Cで 2時間反応させた。
[0267] 反応終了後、 0. 05%Tween20を含む生理食塩水で 3回洗浄し、 5%ラット血清、 1 %マウス血清、 0. l %Tween20を含む 76mM PBS (pH8. 0)で 0. 6 gZmUこ 希釈した F1031— 8— 3— HRPまたは F1106 - 13 - 3—HRPを各ゥエルに 50 μ L 添加した。 37°Cで 2時間反応後、同様に 5回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液 (T MB、 BioFix)を各ゥエルに添加した。室温で 20分間反応後、 0. 5M硫酸溶液で反 応を停止し、プレート分光光度計 (NJ— 2100、日本インターメッド)で 450nmの吸光 度を測定した。その結果、表 1に示すように S68ペプチド由来抗体を組み合わせた系 では正常人では上昇せず、敗血症患者特異的に上昇する、血中可溶型蛋白質、が 測定できた。
[0268] [3]サンドイッチ EIA系の作製 〈2〉
固相抗体として実施例 2で作製した F1 146— 17— 2抗体を使用し、標識抗体とし て実施例 3— (2) [2]で作製した抗体を使用する 2ステップサンドイッチ EIA系を作製 した。 F1146— 17— 2抗体を PBS (pH6. 4)で 120 /z g/mL【こ希釈し、ィムノブレ ート（Maxisorb, NUNC)の各ゥエルに 50 μ L添カ卩した。 56°Cで 30分反応後、イオン 交換水で 5回洗浄し、 0. 1 %StabilGuard (SurModics, Inc)と 0. l %Tween20 (和光純 薬）を含む PBSを各ゥエルに 100 μ L添カ卩しブロッキングした。次に 1 %BSAを含む PBS (pH6. 4)を希釈液としてヒト正常人血清及びヒト敗血症患者血清を 10倍に希 釈した希釈検体を調製した。希釈検体をゥエル当たり 50 L添加し、 25°Cで 2時間 反応した。
[0269] 反応終了後、 0. 05%Tween20を含む生理食塩水で 3回洗浄し、 5%ラット血清、 1 %マウス血清、0. l %Tween20を含む 76mMリン酸緩衝液（pH8. 0)で 0. 5 μ g, mLに希釈したペルォキシダーゼ標識 F1031— 8 - 3抗体を各ゥエルに 50 μ L添カロ した。 25°Cで 2時間反応後、同様に 5回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液 (TMB、 BioFix)を各ゥエルに添加した。室温で 20分間反応後、 0. 5M硫酸溶液で反応を停 止し、プレート分光光度計 (NJ— 2100、日本インターメッド)で 450nmの吸光度を測 定した。その結果、表 1に示すように S68ペプチド特異的モノクローナル抗体は S68 抗体同様、正常人血清ではほとんどなぐ敗血症患者血清では高値を示す血中蛋 白質が測定できた。すなわち、 S68ペプチドと結合する抗体はポリクローナル抗体で も、モノクローナル抗体でも、サンドイッチ測定系ができることを確認できた。
表 1の + +は 450nmの吸光度が希釈液単独の吸光度の 4倍以上を示し、 +は 2倍 以上、一は希釈液と同等の吸光度を示す。
[0270] [表 1] 表 1
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[0271] (実施例 4) S68抗体の特異性
実施例 1で作製した S68抗体の特異性を確認するため、実施例 3— (3)と同様な測 定で、ペプチドにより阻止されるか検討した。すなわち、敗血症患者血清及び正常人 血清の 50倍希釈溶液 25 μ Lに S68ペプチド（アミノ酸配列 53位〜 68位）、実施例 1 と同様に調製した合成ペプチド (アミノ酸配列 53位〜 58位、アミノ酸配列 57位〜 62 位、アミノ酸配列 59位〜 64位）またはネガティブコントロール用ペプチド（Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys)を 0、 0. 1、 1、 10 gZmUこ希 釈したもの 25 /z Lをそれぞれ添加、 S68抗体と混合し競合反応させた後、 S68抗体 に阻止されずに結合した敗血症患者血清及び正常人血清中の該可溶型蛋白質量 を測定した。
[0272] その結果、図 1に示すように、低値を示した正常人血清、高値を示した敗血症患者 血清ともに S68ペプチドでは S68抗体と血清中の該可溶型蛋白質の結合は阻止さ れたが、他の部分ペプチド (各々 6アミノ酸)及びネガティブコントロール用ペプチドで は阻止されな力つた。以上の結果より、 S68抗体により血清中に検出されている蛋白 質は S68抗体が特異的に認識しているものであることが確認された。また、 S68ぺプ チドの部分ペプチドである 3種類の合成ペプチド（アミノ酸数 6個）では阻止されな ヽ ことより、抗体の認識する配列は最低でも 7アミノ酸以上の長さを必要とすることが確 f*i¾ れ 。
[0273] (実施例 5)作製した抗体の反応速度定数
実施例 1で作製した S68抗体と実施例 2で作製した F1146- 17- 2抗体の特異性 と反応速度定数を Biacore3000 (ビアコア）を用いて解析した。まず、固定ィ匕する S68 ペプチド BS Aを実施例 1記載の方法と同様にマレイミド化 BS A (Imject Maleimed Activated BSA、 PIERCE)を用いて調製した。次に、 S68ペプチド— BSAをァミン力 ップリングキット（ビアコア）を用いてセンサーチップ CM5 (ビアコア）に固定ィ匕した。測 定はランニング緩衝液として HBS— EP (ビアコア）を使用し、 F 1146— 17— 2抗体 の希釈列（50、 100、 150、 200、 300nM)をフローセルにインジェクトすることで行 つた。データ解析は S68ペプチド BSAのフローセル測定データからリファレンスセ ルデータを差し引き、 Biaevaluation soft wear version3. 0 (ビアコア）を用いて実施し た。解離定数 (KD)を算出した結果、 F1146- 17- 2抗体は 4. 8 X 10— 9Mと高い親 和性を示した。なお、同様に測定した特異精製ゥサギ S68ペプチドポリクローナル抗 体の KDは 2. 2 X 10— 1Q Mであった。
[0274] (実施例 6)抗 CD14モノクローナル抗体の特異性
6—（1) F1106— 13— 3抗体の解析
F1106— 13— 3抗体の結合領域（ェピトープ）を明らかにするため、 CD14のァミノ 酸配列を N末端側から 10アミノ酸ずつ合成したペプチドライブラリーメンブレン（ Custom SPOTs, Sigma Genosys)を用いて解析した。すなわち、メンブレンをマ-ユア ルに従ってブロッキングした後、 F1106— 13— 3抗体を反応させ、洗浄後、 βガラク トシダーゼ結合抗マウス抗体を反応させた。メンブレンを洗浄後、 X— galを用いて抗 体が結合するペプチド配列を検出した。なお、ペプチドライブラリーメンブレンのぺプ チドの配列は、 1位から 154位までのアミノ酸配列を C末端の 2アミノ酸を重ねる形で 1 0アミノ酸ずつ合成した 19ペプチドを解析に使用した。ペプチドは実施例 1— (1)と 同様に調製した。
[0275] その結果、 F1106— 13— 3抗体は高分子量 CD14の N末端より 17〜26位のァミノ 酸配列（CNFSEPQPDW)に相当する領域に結合することが明らかになった。
6—（2)F1031— 8— 3抗体の解析 <1>
F1031— 8— 3抗体の特異性を確認するため、実施例 3— (1)記載の大腸菌由来 r 5じ014(1—285)及び1\^001772993号公報の実施例8及び実施例9に記載の 方法を用いて COS細胞により調製した rsCD14 (1— 356)、 rsCD14 (1— 307) S2 86Cを用いて結合活性を測定した。
[0276] まず、 Hybond— C extra (アマシャム バイオサイエンス）に rsCD14(l— 356)、 rs CD14 (1— 307) S286C、 rsCD14 (1— 285)または BSAを各 250ngZスポットでメ ンブレン上に固定ィ匕し、乾燥後 0.05gZmLのスキムミルク（明治乳業)を含む 0.05 %Tween20、 PBS(pH6.4)でブロッキングした。室温で 1時間静置後、 0.5%BSA を含む 0.05%Tween20、 PBS(pH6.4)で 3/z gZmLに希釈した F1031— 8— 3 抗体をカ卩え、室温で 1時間反応後、 0.05%Tween20、 PBS(pH6.4)で洗浄した。
[0277] 次に 10%ゥサギ血清を含む 0.05%Tween20、 PBS(pH6.4)で 500倍に希釈し たペルォキシダーゼ標識抗マウスィムノグロブリン抗体 (DAKO)を添加し、 37°Cで 3 0分間反応した後、同様に洗浄し ECLキット（アマシャム ノィォサイエンス)で結合 活性を確認した。その結果、表 2に示すように F1031— 8— 3抗体は大腸菌由来 rsC D14(l— 285)、 rsCD14 (1— 307) S286C、 rsCD14 (1— 356)に結合した力 B SAとは結合せず、全てのタイプの CD14蛋白質を特異的に認識していることが明ら 力になった。表 2の +は ECLによりフィルム上にスポットが検出された場合を示し、 - はスポットが検出されな 、場合を示す。
[0278] [表 2] 表 2
r s C D 1 4 r s C D 1 4 r s C D 1 4 B S A
( 1 - 3 5 ( 1 - 3 0 7 ) ( 1 - 2 8 5)
6) S 28 6 C
結合活 + + + ― 性 [0279] 6—（3) F1031— 8— 3抗体の解析 < 2 >
F1031— 8— 3抗体の結合領域 (ェピトープ）の解析を行った。すなわち、固相に S 68抗体を標識抗体として F1031— 8— 3— HRPを用いた実施例 3— (3) [2]のサン ドイッチ EIA系で、 F1106— 1 3抗体による阻止試験を行った。
[0280] まず、実施例 3— (3) [2]と同様に S68抗体固相プレートに標準品 lOOngZmLを 添カロし反応させた。プレートを洗浄後、 F1031— 8— 3— HRPを添加する前に、 6 gZmLの F1106— 13— 3抗体、マウス IgG抗体または抗体を含まな!/、バッファーを 25 μ L添加し、その後 F1031— 8— 3— HRP抗体を 25 μ L添加し、実施例 3— (3) [ 2]と同様に測定した。
表 3に示すようにマウス IgG抗体添カ卩の系では、阻止されないのに対して、 F1106 — 13— 3抗体により F1031— 8— 3と標準品との結合が阻止された。このことにより、 F1031— 8— 3抗体が認識する領域の少なくとも一部に、 F1106— 13— 3抗体が認 識する領域が存在することが考察された。なお表 3の「阻害率」はバッファーのみの吸 光度を 100%としたときのそれぞれの減少した吸光度より算出した。
[0281] [表 3] 表 3
Figure imgf000090_0001
(実施例 7)可溶型蛋白質測定キット
7 - ( 1)サンドイッチ EIA系の測定キット構成例
実施例 3— (3)で敗血症患者の測定では高値を示し、正常人の測定で低値を示し た固相抗体、標識抗体の組み合わせを用いた可溶型蛋白質キットの構成例を示す。 〈1〉固相抗体： S68抗体を固相化したプレート
〈2〉標識抗体：ペルォキシダーゼ標識 F1031 - 8 - 3抗体 く 3〉基質溶液 (テトラメチルベンジジン溶液）
その他の付属品
プレート系構成例
〈4〉プレート洗浄液（0.9%NaCl、0.05%Tween20溶液）
く 5〉試料希釈液 (0.1%BSAを含む PBS溶液）
く 6〉反応停止液 (0.5M H SO溶液）
2 4
く 7〉標準品（CD14 (1— 307) S286C)
上記の測定キットを用いて測定する場合の測定機器 <参考例 >
く 8〉プレート分光光度計 (例えば E— Max (モレキユラデバイス社)）
7—（2)〜（11)サンドイッチ EIA系の測定キット構成例
7- (1)にカ卩えて、さらにサンドイッチ EIA系の測定キット構成例を表 4に示す。く 1〉 はプレートに固相する結合物質を示す。く 2〉は標識した結合物質を示す。構成要素 のく 3〉〜く 7〉、及び参考例の測定機器く 8〉は 7—（1)と同じ。く 9〉は第二の特異結合 物質が結合した抗体を示す。「-」は記載なしを示す。
[表 4] 表 4
< 1 > ぐ 2> < 9>
(2) F1146-17-2抗体 F1031-8-3-HRP
(3) S68抗体 F1106-13-3-HRP ―
(4) F1146-17-2抗体 F1106-13-3-HRP ―
(5) F1031-8-3抗体 S68抗体 -匿 ―
(6) F1031-8-3抗体 F1H6-17-2-HRP ―
(7) F1106-13-3抗体 S68抗体- HRP 一
(8) F1106-13-3抗体 F1H6-17-2-HRP ―
(9) F1031-8-3抗体 SA-HRP Bio-S68抗体
(10) Str F1031-8-3-HRP Bio-S68抗体
(11) S68抗体 SA-HRP Bio-F1031-8-3 [0284] 7- (12)サンドイッチ EIA系の測定キットの標準曲線
( 1)の測定キットにより、実施例 3— (3) [2]と同様な方法で測定した。すなわち、 S 68抗体を D— PBS (pH7. 4)で ΙΟ g/mLに希釈し、ィムノプレート（Maxisorb, NUNC)の各ゥエルに 50 μ L添カ卩した。 4°Cでー晚反応後、イオン交換水で 5回洗浄 し、 0. 1 %StabilGuard (SurModics, Inc)と 0. l %Tween20を含む D— PBSを各ゥェ ルに 100 L添カ卩しブロッキングした。次に 1 %CD14吸収血清、 0. 1 %BSAを含む 76mM PBS (pH7. 4)を希釈液として 0、 3、 25、 60、 100、 150ng/mL( CD14 ( 1— 307) S286C蛋白質標準品希釈系列を調製した。標準品希釈系列をゥエル当 たり 50 L添加し、 37°Cで 2時間反応させた。反応終了後、 0. 05%Tween20を含 む生理食塩水で 3回洗浄し、 5%ラット血清、 1 %マウス血清、ペルォキシダーゼ標識 F1031— 8— 3抗体を 0. l %Tween20を含む 76mM PBS (pH8. 0)で 0. 6 μ & mLに希釈した希釈標識抗体を各ゥエルに 50 L添加した。 37°Cで 2時間反応後、 同様に 5回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液 (TMB、 BioFix)を各ゥエルに添カロし た。室温で 20分間反応後、 0. 5M硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ NJ— 2100、 日本インターメッド)で 450nmの吸光度を測定した。図 2に作製した標 準曲線を示した。測定感度 0. 6ngZmL (ブランク + 3SD)の高感度で簡便な測定 系が実現された。
[0285] 7- (13)サンドイッチ EIA系の特異性
ヒト血清中に存在する高分子量 CD14が、作製した測定系に及ぼす影響を検討す るため、 0〜4 μ gZmLの濃度の正常人血清由来可溶性 CD14抗原を CD 14 ( 1— 3 07) S286C標準品に添加して、（12)と同様に測定を行った。その結果、図 3に示す ように正常人血清由来可溶性 CD14抗原は 4 μ gZmLでも測定値に影響を及ぼさ なかった。この結果より、本サンドイッチ EIA系において高分子量 CD14との交差反 応性は 0. 3%以下であることがわ力つた。すなわち、本系はヒト血清高分子量 CD14 を検出せず、敗血症患者の血清で高値を示す可溶型蛋白質特異的であることが確 f*i¾ れ 。
[0286] 7- (14)サンドイッチ EIA系の測定キットの評価
( 1)のキットによる測定結果の再現性を評価した。 ( 12)と同様に 3種類の検体を用 いた同時再現性の変動係数 (CV)は 5. 8、 3. 6、 3. 5%、測定間再現性は 6. 2、 5. 2、 5. 1%と良好な結果であった。また、添カ卩回収試験の回収率は 88〜109%と良 好であり、抗凝固剤（へパリン、クェン酸、 EDTA)の影響も認められなカゝつた。以上 の結果より、本キットは血中該可溶型蛋白質を測定するのに十分な性能を有している ことが示された。
[0287] (実施例 8)血中可溶型蛋白質の同定
8— ( 1 )ゲルろ過クロマトグラフィー < 1 >
実施例 7— (1)に記載の測定キットが検出する敗血症患者血清中の物質を解析す るため、敗血症患者血清をゲル濾過クロマトグラフィーカラム Superdex 200PC3. 2Z30 (アマシャム バイオサイエンス）により SMART SYSTEM (アマシャム ノィォサ ィエンス)で D—PBSを展開溶媒として用いて分画し、各分画を実施例 7— (1)に記 載の測定キット及び巿販 CD14— EIAキット（IBL— Hamburg)を用いて測定した。分 子量の算出は LMWキャリブレーションキットおよび HMWキャリブレーションキット（ァ マシャムバイオサイエンス）のうちアルドラーゼ（158kDa)、： BSA (67kDa)、ォボア ルブミン（43kDa)、キモトリブシン（25kDa)を用いてカラムをキヤリブレートして行つ た。
その結果、図 4に示すように巿販 CD14— EIAキットでは分子量約 57kDaの可溶 性 CD14抗原が検出され、従来より報告のある 49〜55kDaの高分子量可溶性 CD1 4抗原であると判断された。一方、実施例 7— (1)に記載のキットでは分子量 35〜45 kDa付近にピークが検出され、また 57kDa付近にはピークが検出されな力つたことか ら、実施例 7— (1)に記載のキットは血中に存在する該可溶型蛋白質のみを特異的 に検出していることが確認された。
[0288] 8—（2)ゲルろ過クロマトグラフィー < 2 >
(2)—く 1 >と同様に敗血症患者の血清 50 1をゲル濾過クロマトグラフィーカラム Superdex 75 10/300 GL (アマシャム バイオサイエンス）により展開溶媒として 200mM酢酸アンモ-ゥム (pH 6. 8)を用いて分画し、各キットを用いて測定した。 分子量の算出は LMWキャリブレーションキットおよび HMWキャリブレーションキット（ アマシャム バイオサイエンス）のうち BSA (67kDa)、オボァノレブミン（43kDa)、キモ トリプシノーゲン（25kDa)及びリボヌクレアーゼ A(13. 7 kDa)を用いてカラムをキヤ リブレートして行った。
その結果を図 5に示す。実施例 7— (1)に記載のキットでは分子量 25〜35kDa付 近に、該可溶型蛋白質に由来するピークが検出された。
[0289] 8— (3) F1025— 3— 1抗体ァフィユティーカラムクロマトグラフィー
(2)— < 2 >で得られた該可溶型蛋白質に由来するピークの画分 (例えば、フラクシ ヨン 12)を F1025— 3— 1抗体ァフィユティーカラムクロマトグラフィーに供すると該可 溶型蛋白質に由来するピークは、ァフィユティーカラム非吸着画分に溶出される。な お、 F1025— 3—1抗体ァフィユティーカラムの調整並びに実施は、 WO01Z2208 5号公報に実施例 10として記載されている方法に準じて行うことができる。
[0290] (実施例 9) 敗血症患者血清からの血中可溶型蛋白質の精製
9一（ 1) F1024 - 1 - 3- Sepharose 4B担体の調製
WO01Z72993号に実施例 2として記載され、作成された F1024— 1— 3抗体（上 記に記載の通り、ノ、イブリドーマは受託番号 FERM BP— 7511として寄託されてい る) 55mgを 20mlの ECH— Sepharose 4B(Amersham Biosciences)に添カロし、 終濃度 0. 1Mとなるように水可溶性カルポジイミド ((株)同仁ィ匕学研究所)加え、 4°C 一晩カップリング反応を実施した。次いで、 0. 1M酢酸ナトリウム (pH 5. 0)にて洗浄 後未反応の F1024— 1— 3抗体を回収した。カップリング反応前の抗体溶液と洗液 の 280nmの吸光度をそれぞれ測定しカップリング効率を求めた (換算値: 0. 714mg ZmL)。その結果、 F1024— 1—3抗体のカップリング効率は 55%であり、担体 lml あたり 1. 5mgの F1024— 1— 3抗体が結合していることが判明した。
[0291] 次いで、 1Mエタノールァミン (pH 7. 4)を添カ卩し室温にて 1時間ブロッキング反応 を行い、 100mlの 0. 1M酢酸ナトリウム /0. 5M NaCl (pH4. 0)次いで 100mlの 0. 1M Tris-HCl/0. 5M NaCl (pH 8. 0)にて担体を洗浄した。この操作をさ らに 2回実施し、 20mlの F1024— 1—3 Sepharose 4B担体を調製した。
[0292] 9- (2) S68- Sepharose 4FF担体の調製
実施例 1— (4)にて調製した S68抗体 18mgを 10kDaの分子量カットオフを有する 透析膜（Spectrum社）を使用し、 2. 5Lの 0. 5M NaClを含む 0. 2M NaHCO (p H 8. 3)を透析液として 4°C、一晩透析した。尚、透析液は 3回交換した。次いで、予 め 0. 5M NaClを含む 0. 2M NaHCO (pH 8. 3)にて平衡化しておいた 8mLの
3
NHS— Activated ¾epharose 4Fast Flow (.Amersham Biosciences)を逸 祈した S68抗体溶液に添加し、 4°C一晩、カップリング反応を行った。カップリング反 応終了後、未反応の S68抗体を 0. 5M NaClを含む 0. 2M NaHCO (pH 8. 3)
3
で洗浄し回収した。カップリング反応前の抗体溶液とカップリング反応後の抗体溶液 の 280nmの吸光度をそれぞれ測定しカップリング効率を求めた (換算値: 0. 714mg /mL) 0その結果、 S68抗体のカップリング効率は、 79%であり、担体 ImL当り 1. 8 mgの S68抗体が結合していることが判明した。次いで、 0. 5M NaClを含む 0. 5M モノメタノールァミン (pH 8. 3)を担体に加え、 4°Cー晚ブロッキング反応を行った 。ブロッキング反応終了後、 300mLの 0. 5M NaClを含む 0. 1M酢酸ナトリウム（p H 4)で担体を洗浄し、その後、 300mLの 0. 5M NaClを含む 0. 2M NaHCO (
3 pH 8. 3)で担体を洗浄した。この操作を更に 2回繰り返し、 S68— Sepharose 4Fa st Flow 8mLを調製した。
[0293] 9 - (3) SDS -PAGE
SDS— PAGEは 12. 5%ゲルを用い， Laemmliの手法（Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly or the head of bacteriophage Γ4. Nature. 1970 Aug 15;227(259):680-5.)に従い、非還元条件下実施した。すなわち、試料 2 容量に 1容量の Tris— SDS— Seprasol (第一化学薬品（株））を添カ卩し、 100°C、 5 分間加熱処理後、 12. 5%の ePAGELゲル（アト一株式会社）に供し， Laemmliの 不連続バッファーシステムにより 25mA定電流、 90分間泳動した。泳動終了後、ゲル を銀染色キット 2D銀染色試薬 · Π「第一」（第一化学薬品株式会社)を用いて染色し た。分子量算出には、分子量マーカーとして、 Precision plus protein™ dual color standards (Bio— Rad社)を用いた。
[0294] 9一（4)ウェスタンブロッテイング
予め SDS— PAGEのゲルのサイズに切ってお!、た濾紙を 5%メタノール /25mM Tris/40mM εアミノカプロン酸溶液に浸し、白金電極セミドライトランスファー Β Ε330 ( (株)バイオクラフト）の陰極電極盤上に置き、次 、で、上記（3)に従 、SDS - PAGEを実施後、ゲルを同溶液に浸し濾紙上に気泡が入らないように重ねた。その 後、予め 5%メタノール Z25mM Trisにて平衡化した-トロセルロース膜 (Trans— Blot Transfer -Medium, Bio—Rad)をゲルの上に気泡が入らないように重ねた 。更に同溶液に予め浸しておいた濾紙を気泡が入らないように重ね、最後に、 5%メ タノール Z300mM Trisに浸した濾紙を気泡が入らないように重ねた。その上に陽 極電極をのせ、 2mA/cm2, 2時間室温にて転写を行った。転写終了後、ニトロセル ロース膜をブロックエース（大日本製薬株式会社）に浸し、 37°C、一時間ブロッキング 操作を行った。その後-トロセルロース膜を 10mlの 6. 8 871111の 1031—8— 3 抗体と 37°C、 2時間反応させ、 0. 05% Tween20ZPBSで洗浄後、抗マウス IgG 抗体 HRPコンジユゲー HDAKO AZS)と 37°C、 1時間反応させた。反応終了 後、ニトロセルロース膜を 0. 05% Tween20ZPBSで洗浄した。未反応のコンジュ ゲートを洗い流した後、蒸留水にて 2倍希釈した TMB— H (Moss. Inc) 50mlに浸し 、 4°Cー晚喑所にて発光させた。
9一（5)敗血症患者血清からの血中可溶型蛋白質の精製
9— (1)で調製した lmLの F1024— 1— 3— Sepharose 4 FFを内径 lcmのェコノ カラム（BIO— RAD)につめ、 0. 05%Tween20を含む D— PBS (pH7. 4)で平衡 ィ匕した。同時に実施例 9— (2)で調製した lmlの S68— Sephaorse 4FFを同様に内 径 lcmェコノカラムにつめ、 0. 05%Tween20を含む D— PBS (pH7. 4)で平衡ィ匕 した。次に、 S68— Sepharose™4FFカラムの先端に F1024— 1— 3— Sephraose TM4Bカラムが配置されるように 2本のカラムを直列につないだ。この直列カラムに 18 mLの敗血症患者血清を 0. 02mlZminの流速で供した。カラムに吸着しない蛋白 質を 0. 05% Tween20を含む D— PBS (pH 7. 4)にて洗浄後、 S68— Sepharo se 4FFカラムをはずし、 S68— Sepharose 4FFカラムに吸着した蛋白質を 0. 05 % Tween20を含む 10mM HC1により 0. 2mLZminの流速で溶出し、 2mLずつ 10本、分取した。各分画容器には予め 500mM重炭酸アンモ-ゥム 200 Lを添カロ しておき、溶出液の pHを直ぐに中性に戻した。各分画中の実施例 7—（1)のキットで 検出される血中可溶型蛋白質の濃度を測定し、該蛋白質を含む分画をプール後凍 結乾燥した。 [0296] 凍結乾燥終了後、凍結乾燥粉末に 0. 05%Tween20を含む 150mM酢酸アンモ -ゥム溶液 0. 2mLをカ卩ぇ溶解し、 3, 500 X g、 10分間遠心分離を行い、その上清 を、 Superdex75 10Z300GL (Amersham— Biosciences)を用いたゲルろ過に 供した。展開溶液として 0. 05%Tween20を含む 150mM酢酸アンモ-ゥム溶液を 用い、試料 0. 2mLをカラムに供し、流速 0. 8mLZminで添カ卩した。試料添加後、 7 . 8分後から 0. 45mLずつ 40本分取した。
[0297] 各分画を実施例 7—（1)のキット及び巿販 CD14—EIAキット（IBL—Hamburg社 )にて測定した。その結果、実施例 7— (1)のキットで検出される血中可溶型蛋白質 はフラクション 12にピークを有するフラクション 11から 13までに認められ、敗血症患 者血清 18mlから 1.： L gの血中可溶型蛋白質を得た。なお、該蛋白質のピークは、 29 ± 5kDaの位置であった。分子量マーカーは Gel Filtration LMW Calibrati on Kit (Amersham- Biosciences)中、 BSA (67. OkDa)、 Ovalbumin (43. 0k Da)、 ChymotrypsinogenA(25. OkDa)及び RibonucleaseA(13. 7kDa)を用 いた。
次いで、これらのゲルろ過のフラクションを 9一（4)に示したウェスタンブロッテイング に供し、 Precision Plus Protein™ Dual Color Standards (BIO— RAD)を 用いて実施例 7—（1)のキットで検出される血中可溶型蛋白質の同定及び分子量の 測定を行った。その結果、上記のゲルろ過フラクションの実施例 7—（1)のキットの測 定結果と一致して増減し、フラクション 12にピークを有する血中可溶型蛋白質は、分 子量 13 ± 2kDaのバンドが検出された。（図 6、図 7)
[0298] (実施例 10) 正常ヒト血清からの血中可溶型蛋白質の精製
10— (1)正常ヒト血清力もの血中可溶型蛋白質の精製
日本バイオテスト (株)より購入したヒト正常血清を実施例 7— (1)のキットにより定量 した結果、 61ng,mLの値を得た。
そこで、実施例 9— (1)で調製した 20mLの F1024— 1— 3— Sepharose 4 B担体 を XKカラム 26/20カラム（Amersham— Biosciences)につめ、 0. 05%Tween2 0を含む D— PBS (pH7. 4)で平衡ィ匕した。また、実施例 9— (2)で調製した 8mlの S 68 -Sephaorse 4FF担体を XKカラム 16/20カラム（Amersham— Biosciences )につめ、同様に 0. 05%TWeen20を含む D— PBS (pH7. 4)にて平衡ィ匕した。
[0299] 次に、 S68— Sepharose 4FFカラムの上端に F1024— 1— 3— Sephraose 4B カラムが配置されるように 2本のカラムを直列につな 、だ。この連結カラムに上記ヒト 正常血清 1. 3Lを 0. 5mlZminの流速で供した。吸着しない蛋白質を 0. 05% Tw een20を含む D— PBS (pH 7. 4)にて洗浄後、連結していたカラムをはずし、 S68 -Sepharose 4FFカラムに吸着した蛋白質を 0. 05% Tween20を含む 10mM HC1により lmLZminの流速で 160分間溶出し、 20 mLずつ分取した。分取する 容器には予め 500mM重炭酸アンモ-ゥム 2mLを添カ卩しておき、溶出液の pHを直 ぐに中性に戻した。各分画中の実施例 7—（1)のキットで検出される血中可溶型蛋白 質の濃度を測定し、該蛋白質を含む分画をプール後凍結乾燥した。
[0300] 凍結乾燥粉末に 0. 05%Tween20を含む 150mM酢酸アンモ-ゥム溶液 lmLを 加え溶解し、孔径 0. 22 μ mのフィルター（Mylex GV13、 Millipore)にてろ過後、 Superdex75 10Z300GL (Amersham— Biosciences)カラムを用いたゲルろ過 に供した。展開溶液として 0. 05%Tween20を含む 150mM酢酸アンモ-ゥム溶液 を用い、試料 0. 5mLをカラムに供し、流速 0. 8mLZminでゲルろ過を実施した。試 料添加 7. 8分後力 分取を開始し、 0. 45mLずつ 40本分取した。このゲルろ過を 2 回実施した。
各分画を実施例 7— ( 1 )のキット及び市販 CD 14- EI Aキット（IBL— Hamburg社 )にて測定した。その結果、実施例 7— (1)のキットで検出される血中可溶型蛋白質 はフラクション 12にピークを有するフラクション 11から 13までに認められた。実施例 9 - (4)と同様に求めた該蛋白質のピークは、 29± 5kDaの位置であった。
[0301] 次!、で、これらのゲルろ過のフラクションを実施例 9一（4)に示したウェスタンブロッ ティングに供し、 Precision Plus ProteinTM Dual Color Standards (BIO - RAD)を用いて実施例 7— (1)のキットで検出される血中可溶型蛋白質の同定及び 分子量の測定を行った。その結果、上記のゲルろ過フラクションの実施例 7—（1)の キットの測定結果と一致して増減し、フラクション 12にピークを有する血中可溶型蛋 白質は、分子量 13± 2kDaのバンドが検出された。 （図 8)
[0302] 上記フラクションをプールし、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥標品に 0. 05 %Tween20を含む 150mM酢酸アンモ-ゥム溶液 100 μ Lを加え溶解し、実施例 7 一（1)のキットにより該血中可溶型蛋白質の回収量を求めた。その結果、ヒト正常血 清 1. 3Lから 19 gの血中可溶型蛋白質が得られた。
[0303] 10—（2)アミノ酸配列の同定
[ 1]エレクトロブロッテイング
実施例 10—（1)で凍結乾燥した実施例 7—（1)のキットに検出される血中可溶型 蛋白質を実施例 9 (3)に記載した SDS— PAGEによりアクリルアミドゲル上に展開 した後、ポリビ-リデンジフルオライド（以下、 PVDF)膜へのエレクトロブロッテイング を行った。すなわち、転写装置である白金電極セミドライトランスファー (株式会社バ ィォクラフト）の陰極の上に 20%メタノール Z25mM TrisZ40mM εアミノカプロン 酸溶液に浸したろ紙を置き、その上に電気泳動後のアクリルアミドゲル、さらに PVD F膜 (Clear Blot Membrane P (アト一株式会社)）を重ねて置いた。さらに 20%メタ ノール Z25mM Trisに浸したろ紙、 20%メタノール ZO. 3M Trisに浸したろ紙の 順で重ね、最後に装置の陽極をセットした。転写はおよそ 2mAZcm2の定電流で 1 時間行った。
[0304] [2]転写タンパク質の検出
エレクトロブロッテイング後の PVDF膜を 0. 1 %クマシ一ブリリアントブルー G250/ 10%酢酸 Z30%ァセトニトリル溶液に約 5分浸した後、 10%酢酸 Z30%ァセトニトリ ル溶液で適度に脱色し、タンパク質を検出した。
[0305] [3]アミノ酸配列分析
PVDF膜上で検出した分子量 13 ± 2kDaのタンパク質のバンドをきれいなカッター ナイフで切り出し、 1. 7mLマイクロ遠心チューブに移した。切り出した PVDF膜断片 を、 0. 1 %トリフルォロ酢酸 Z50%メタノール溶液で 3回洗浄し、さら〖こメタノールで 洗浄後、完全に乾燥させた。アミノ酸配列分析はプロテインシーケンサ Procise494 cLC (アプライドバイォシステムズジャパン)を使用した。洗浄後の PVDF膜断片をプ 口ティンシーケンサにセットし、必要な分析サイクルを設定後、分析した。この結果、 主要配列として、 N末端に Thr Thr Pro Glu Pro Xaa Glu Leu Asp Asp Gluのアミノ酸 配列を有するペプチドが確認できた。 なお、 Xaaは、プロテインシーケンサの性質から、 Cys, Asn, Ser, Thrまたはその他 の修飾アミノ酸である可能性があるが、分析した蛋白質力 SCD14由来の蛋白質であ ることを考慮すると、 Cysであると考えられる。また、還元アルキルィ匕法によるアミノ酸 分析で、 Xaaが Cysであると求めることができる。
[0306] これらの結果から、ゲルろ過フラクション後の非還元下 12. 5%SDS— PAGEの分 子量 13 ± 2kDaのバンドを抽出したフラクションは、純度よぐ実施例 7— (1)のキット で検出される血中可溶型蛋白質が精製されたことがわカゝつた。
また、実施例 7— (1)のキットで検出される血中可溶型蛋白質は、 N末端に CD14 の 1残基目からのアミノ酸配列 Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Gluを有し 、非還元条件下 SDS - PAGEでは分子量 13士 2kDaの新規な蛋白であることがわ かった。また、実施例 7— (1)のキットで検出されることから、配列番号 2に記載の 16 アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合することが ゎカゝる。
[0307] 実施例 9及び 10の結果から、敗血症患者血清で確認した実施例 7— (1)のキットで 検出された血中可溶型蛋白質は、正常ヒト血清にも存在することが明らかとなった。 また該蛋白質は、敗血症患者血清ではより多い比率で回収されたことになる。
なお、実施例 8〜： L0で用いた IBL—キットの代わりに、標識抗体として標識した 3C 10を固相抗体として MEM— 18 (Monosan社）を用いたサンドイッチ測定系を用い ても、 IBL—キットと同様な結果が得られた。
標識は実施例 3— (3)に記載に準じて行い、サンドイッチ測定系は実施例 7— (1) に準じて構成した。
[0308] (実施例 11)各種疾患患者の測定
敗血症患者血清は分離菌が同定された 10例を使用した (表 5)。また、正常人 52例 (男性 31例、女性 21例）、及び各種疾患患者（20疾患、 60例）を実施例 7— (1)に 記載の測定キットを用いて測定した。
[0309] [表 5] 表 5
Figure imgf000101_0001
[0310] 血清中の実施例 7— (1)のキットで検出される可溶型蛋白質の濃度は正常人で 0.
008〜0. 100 /z g/mUこ分布し、平均値 ίま 0. 04 g/mLであった。敗血症 者 で ίま 0. 190〜7. 260 /z g/mLに分布し、平均値 ίま 2. Ο /z g/mLであった。該可溶 型蛋白質濃度は敗血症患者では正常人及び各種疾患患者に比べ高値であり、各種 疾患患者中には正常人と比較して高値を示す疾患は見出せな力つた。
[0311] (実施例 12)市販の血中可溶型 CD14蛋白質 ELISAキットとの比較
12—（ 1)各種疾患患者血中可溶型 CD14蛋白質の測定
実施例 11の検体を巿販 CD 14— EIAキット（IBL - Hamburg)を用 、て測定した。 血清中の可溶型 CD14蛋白質の濃度は正常人で 5. 6〜： L 1. 2 gZmLに分布し、 敗血症患者では高値例が認められた。し力しながら、各種疾患患者血清中において も可溶型 CD14蛋白質が高値を示す例が多数認められ、敗血症患者血清との間に 差は認められなかった。
[0312] 12- (2) S68抗体を用いたキットとの比較
実施例 11で測定した該可溶型蛋白質の測定値と比較検討を行った。表 6に示すよ うに巿販 CD14— EIAキットでは正常、各種疾患、敗血症間に最大 1. 7倍程度の差 しか認められないのに対して実施例 7— (1)の測定キットでは正常人と各種疾患の間 に差は認められないが、正常人と敗血症の間には 50倍の差が認められ、実施例 7— (1)の測定キットの測定値が敗血症で特異的に上昇することが明らかになった。
[0313] [表 6] 表 6
Figure imgf000102_0001
[0314] 正常人の平均値 + 3S. D.をカットオフ値（実施例 7—（1)の測定キット： 0. 134 ^ gZmL、巿販 CD14— EIA: 11. 14 gZmL)として陽性例 (敗血症）と陰性例（正 常 +各種疾患）に分けて解析した結果を表 7に示す。その結果に基づき、両キットの 一致率（ (EIA陽性一致数 +EIA陰性一致数) Z総数 X 100)、感度 (EIA陽性一致 数 Z陽性例 X 100)、特異度 (EIA陰性一致数 Z陰性例 X 100)を算出したところ、 表 8に示すように、実施例 7—（1)のキットでは一致率 94. 3%、感度 100. 0%、特異 度 93. 8%とカットオフ値を設定することにより敗血症の鑑別診断に有用であることが 明らかになった。一方、市販の CD14— EIAでは感度、特異度ともに敗血症を診断 できるほどの特異性及び有用性は認められな力つた。 [0315] [表 7] 表 7
Figure imgf000103_0001
[0316] [表 8] 表 8
Figure imgf000103_0002
[0317] (実施例 13)組換え型可溶性 CD14フラグメントの調製
実施例 10において精製した血中可溶型蛋白質 (以降、可溶性 CD14サブタイプ、 若しくはその略号として、低分子 sCD 14— STと記載することがある）を組換え蛋白質 として発現させる目的で、行った。
[0318] 13— (1) CD14 C末欠失改変体発現プラスミドの構築
組換え型可溶性 CD14フラグメント（以降、組換え型可溶性 CD14サブタイプ、若し くはその略号として、 rsCD14— STと記載することがある）を調製するため、 CD14の C末を欠失した蛋白質を産生するプラスミドを構築した。 配列番号 3記載のヒト CD14分子の
1) 66位力も C末端までを欠失した分子 (以降、 CD14 (1— 65)と記載する、以下同 様)、
2) 71位から C末端までを欠失した分子 (CD14 (1— 70) )、
3) 76位から C末端までを欠失した分子 (CD14 (1— 75) )、
4) 81位から C末端までを欠失した分子 (CD14 (1 -80) ) ,
5) 86位から C末端までを欠失した分子 (CD14 (1— 85) )、
6) 91位から C末端までを欠失した分子 (CD14 (1— 90) )、
7) 96位から C末端までを欠失した分子 (CD14 (1— 95) )、
8) 101位力も C末端までを欠失した分子 (CD14 (1— 100) )、
9) 106位力も C末端までを欠失した分子 (CD14 (1— 105) )、
10) 111位力も C末端までを欠失した分子 (CD14 (1— 110) )、
をホ-ユウ細胞で発現するプラスミド、 pCAG65、 pCAG70、 pCAG75、 pCAG80、 pCAG85、 pCAG90、 pCAG95、 pCAG100、 pCAG105及び pCAGllOは以下の方法で 構築した。
センスプライマー 1 (5，- TTT CCT ACA GCT CCT GGG- 3，）（配列番号 11)とアン チセンスプライマー 1 (5 GG GGT ACC TTA GTC AGC ATA CTG CCG CGG GTC- 3，） （配列番号 12)、アンチセンスプライマー 2 (5，- GG GGT ACC TTA GAG AGC CTT GAC CGT GTC AGC- 3，） （配列番号 13)、アンチセンスプライマー 3 (5， -GG GGT ACC TTA GAG CCG CCG CAC GCG GAG AGC- 3，） （配列番号 14)、 アンチセンスプライマー 4 (5，— GG GGT ACC TTA TGC GGC TCC CAC TGT GAG
CCG- 3，） （配列番号 15)、アンチセンスプライマー 5 (5，- GG GGT ACC TTA CTG AGC AGG AAC CTG TGC GGC- 3，） （配列番号 16)、アンチセンスプライマー 6 (5， -GG GGT ACC TTA GGC GCC TAC CAG TAG CTG AGC- 3，） （配列番号 17)、 アンチセンスプライマー 7 (5 GG GGT ACC TTA CGC TAG CAC ACG CAG GGC
GCC- 3，） （配列番号 18)、アンチセンスプライマー 8 (5，- GG GGT ACC TTA CTT GAG GCG GGA GTA CGC TAG- 3，） （配列番号 19)、アンチセンスプライマー 9 (5， -GG GGT ACC TTA CTC GAG CGT CAG TTC CTT GAG- 3，） （配列番号 20)及 びアンチセンスプライマー 10 (5，- GG GGT ACC TTA GGT TAT CTT TAG GTC CTC GAG-3' ) (配列番号 21)を設計した。次に pCAG356を铸型にセンスプライマ 一 1とアンチセンスプライマー 1、センスプライマー 1とアンチセンスプライマー 2、セン スプライマー 1とアンチセンスプライマー 3、センスプライマー 1とアンチセンスプライマ 一 4、センスプライマー 1とアンチセンスプライマー 5、センスプライマー 1とアンチセンス プライマー 6、センスプライマー 1とアンチセンスプライマー 7、センスプライマー 1とアン チセンスプライマー 8、センスプライマー 1とアンチセンスプライマー 9、あるいはセンス プライマー 1とアンチセンスプライマー 10のプライマーセットでそれぞれ PCRを行った。 PCRの反応条件は 90°C 2分間で熱した後、 <1>98°C 10秒、〈2〉50°C 30秒、〈3〉72 °C 1分のサイクルを 30回繰り返した。得られた産物を制限酵素 EcoRIと Kpnlとで double digestionし、 0.4kb〜0.5kbの断片をそれぞれ回収した。これらの断片を、 PCAG356を制限酵素 EcoRI及び Kpnlによって切断することによって得られる約 4.8kb の断片と接合し、 E.coli JM109を定法に従い形質転換し、各発現プラスミドを得た。 なお、 pCAG356は、 pCGAAS (GENE, vol.15 p269-277 (1989)に W098Z39438に 記載のプラスミド PUCH14P— 4由来の CD 14遺伝子を挿入したプラスミドである。
[0320] 13 - (2)蛋白分解酵素の切断配列を挿入した CD14発現プラスミドの構築
実施例 13—（ 1)記載のプラスミドを用 V、た rsCD14— STの生産法では産生量が非 常に低いことから、実施例 1— (1)記載のプラスミドを用いた rsCD14— STの生産法 で発現したフラグメントを標準品として純品まで精製できないと判断した。そこで、 35 6の長さを有する CD14の 64位を特異的に切断する蛋白分解酵素の切断配列を挿 入し、全長で発現した後に蛋白分解酵素で特異的に切断し、配列番号 3の 1位〜 64 位までの部分と残りの部分を分離精製する方法を選択し、 rsCD14— STの調製を行 つた。蛋白分解酵素の切断配列としては ProScission Protease認識配列及び Thr ombin認識配列の 2種類を使用した。
[0321] 13 - (2) - 1 rsCD14— ST(PSP64Z356)発現プラスミドの構築
配列番号 3に記載のヒト CD14の 64位の Alaと 65位の Aspアミノ酸の間に、 ProSci ssion Protease認識配列（LEVLFQGPの 8アミノ酸残基、一文字表記）を挿入し た rsCD14 (以降、 rsCD14— ST(PSP64Z356)と、記載することがある）を発現す るプラスミドは以下の方法にて構築した。センスプライマー 1 (5'—TTT CCT AC A GCT CCT GGG— 3，）、センスプライマー 2 (5，一 GCT CTG GAA GTT
CTG TTC CAG GGG CCC GAC ACG GTC AAG GCT CTC C GC GTG CGG- 3' ) (配列番号 22)、アンチセンスプライマー 11 (5，—GTC GGG CCC CTG GAA CAG AAC TTC CAG AGC ATA CTG CC G CGG GTC GGC GTC CGC— 3' ) (配列番号 23)及びアンチセンスプラ イマ一 12 (5，— TCT CCA TTC CTG TGT TGC GC— 3，） （配列番号 24 )をそれぞれ設計'合成し、配列番号 3に記載の可溶型ヒト CD14構造遺伝子配列を 挿入したプラスミド PCAG356を铸型に A：センスプライマー 1とアンチセンスプライマ 一 11、 B:センスプライマー 2とアンチセンスプライマー 12を用いて PCRを行った。 P CRの反応条件は A: 90°C 2分間で熱した後、〈1〉98°C 10秒、〈2〉50°C 30秒、く 3>72°C 1分のサイクルを 30回、 B : 90°C 2分間で熱した後、〈1〉98°C 10秒、〈2〉 46°C 30秒、〈3〉72°C 1分のサイクルを 30回繰り返した。得られた PCR増幅産物 A ：約 0. 51^、8 :約0. 5kbを回収し、引き続きこれら 2つの混合物を铸型にセンスプラ イマ一 1とアンチセンスプライマー 12を用 V、た PCRを行った。 PCR反応条件は上記 Aと同様に行った。得られた約 0. 9kbの PCR増幅物を回収し、制限酵素 EcoRI及び Xholにて切断した。この断片を、 pCAG356を制限酵素 EcoRI及び Xholにて切断 することによって得られる約 5. 2kbの断片と接合し、 E. coli JM109を定法に従い 形質転換した。得られた発現プラスミドを pCAG356 (PSP64Z356)とした。さらに p CAG356を制限酵素 EcoRI及び Kpnlで消化し、約 1. 3kbの断片を回収した。この 断片を、ヒト EF—1 αプロモーターを持つ哺乳細胞発現ベクター pTK—2043を Eco RI及び Kpnlで消化して得られる約 4. 4kbの断片と接合し、 E. coli JM109を定法 に従って形質転換することにより、 pTK356 (PSP64/356)を得た。
13 - (2) - 2 rsCD14— ST(2ST64Z356)発現プラスミドの構築
配列番号 3に記載のヒト CD14の 64位の Alaと 65位のの Aspアミノ酸の間に、 Thro mbin認識配列（LVPRGSの 6アミノ酸残基）を挿入した rsCD14 (以降、 rsCD14— ST (2ST64Z356と、記載することがある）を発現するプラスミドは以下の方法にて 構築した。センスプライマー 3 (5，一 CTG GTT CCG CGT GGT TCC GAC ACG GTC AAG- 3' ) (配列番号 25)、アンチセンスプライマー 13 (5，—GA A CCA CGC GGA ACC AGA GCA TAC TGC CGC— 3，） （配列番 号 26)、アンチセンスプライマー 14 (5，— CGG GAT CCT CAA TGA TGA TGA TGA TGA TGG— 3' ) (配列番号 27)をそれぞれ設計'合成し、プラスミ ド PCAG356の可溶型ヒト CD14の C末端に Hisタグ（His X 6個）を付加した分子の 構造遺伝子配列を持つ PCAG356 - Hisを铸型に、 A：センスプライマー 1とアンチ センスプライマー 13、 B :センスプライマー 3とアンチセンスプライマー 14を用いて PC Rを行った。 PCRの反応条件は 96°Cで 2分間熱した後、〈1〉96°C 30秒、〈2〉55°C 30秒、〈3〉72°C 1分のサイクルを 25回繰り返した。得られた PCR増幅産物 A:約 0. 5kb、 B :約 0. 9kbを回収し、引き続きこれら 2つの混合物を铸型にセンスプライマー 1とアンチセンスプライマー 4を用いた PCRを行った。 PCR反応条件は上記 Aと同様 に行った。得られた約 1. 4kbの PCR増幅物を回収し、 pT7— Blue (T)ベクターに揷 入し、塩基配列を確認した後に、制限酵素 EcoRI及び BamHIにて切断した。得られ た約 1. 3kbの断片を、 pTK— 2043を EcoRI及び BamHIで消化して得られる約 4. 4kbの断片と接合し、 E. coli JM109を定法に従い形質転換することにより pTK35 6H (TB64)を得た。
[0323] 13—(3)rsCD14— STの調製
13 - (3) - 1 rsCD14— STの調製
(1)に記載の各プラスミドを COS— 1細胞（ATCC : CRL— 1650)に、 Fugene6 ( Roche)を用いてトランスフエクシヨンした。すなわち、マニュアルに従いトランスフエク シヨン試薬 1. LZmL及びプラスミド 4 /z gZmLを混合し、培地に添カ卩した後、 C OS— 1細胞に添加し 37°Cで培養した。 72時間後、培養上清を回収した。培養上清 は遠心後、 0. 22 mのフィルターでろ過した。
[0324] 13 - (3) - 2 rsCD14の調製
(2)— 1及び（2)— 2に記載の rsCD 14— STの配列をコードする遺伝子を含むプラ スミド（pTK356 (PSP64/356)及び pTK356H (TB64) )を COS— 1細胞に Fuge ne6 (Roche)を用いてトランスフエクシヨンした。すなわち、マニュアルに従いトランス フエクシヨン試薬 1. 7 μ LZmL及びプラスミド 4 μ gZmLを混合し、培地に添カ卩した 後、 COS— 1細胞に添加し 37°Cで培養した。 72時間後、培養上清を回収し、新しい 培地を添加して、さらに 96時間培養し、その培養上清も回収した。培養上清は遠心 後、 0. 22 mのフィルターでろ過し、精製に供した。
[0325] 13 - (3) - 3 rsCD14— STの調製（2)
(3) 2で生産した各培養上清ょり 5じ014— 3丁 3?647356)、 5じ014— 3 T(2ST64Z356)を精製し、蛋白分解酵素で切断後、 sCD14— STを精製した。
[0326] < 1 > rsCD14— ST(2ST64)の精製
以降の操作は特に記載しない限り 4°Cにて実施した。
Chelating— Sepharose FF (アマシャムバイオサイエンス）担体に、 0. 1M 硫酸 ニッケル水溶液を等容量流し、次 ヽで蒸留水を 3容量流して未反応のニッケルを洗 浄し、ニッケル Sepharose担体を調製した。
(3)— 2で得られた 1000 mLの COS— 1培養上清を PBSにて平衡化した 40 m Lのニッケル— Sepharoseカラムに流速 8 mLZ分で添カ卩し、非吸着蛋白質を PBS にて洗浄した。次いで、 20 mMのイミダゾールを含む PBSにて非特異的に吸着し た蛋白質を溶出させた後、 500 mMのイミダゾールを含む PBSにて目的蛋白質を 溶出させた。この溶出液を PBSに対して一晩透析した。
透析液の蛋白濃度を後述する実施例 15—（3)で示した手法に従い測定した。この 結果を基に、酵素：基質 = 1 : 50 (U : g)となるようにトロンビンプロテアーゼ (アマシ ャムバイオサイエンス）を添加し、 22°C、ー晚静置しトロンビンによる切断反応を実施 した。
[0327] 1Z10容量の 100 mM ベンズアミジン水溶液を添カ卩し酵素反応を終了し、次い で、 2倍容量の 8 M尿素を含む 50 mM Tris—HCl (pH 8. 5)バッファーを添カロ した。この溶液を予め 8 M尿素を含む 50 mM Tris—HCl (pH 8. 5)バッファー にて平衡化した 3 mLの Q— Sepharose HP (アマシャムバイオサイエンス）カラムに 流速 3 mLZminで供した。非吸着蛋白質を同バッファ一にて洗浄後、吸着した蛋 白質を 0— 500 mM NaClの直線濃度勾配（50分）により溶出した。溶出液を 3 m Lずつ分取し、各フラクションの rsCD14— ST(2ST64Z356)力も 65位以降を切断 して得られた rsCD14— ST (以降、 rsCD14— ST(2ST64)と記載することがある） に相当する画分の含量を実施例 7— (3)のキットにより測定した。
[0328] rsCD14— ST(2ST64)を含むフラクションをプールし、 150 mM 炭酸水素アン モ -ゥム水溶液に対して一晩透析し、その後凍結乾燥した。得られた凍結乾燥標品 を 8 M 尿素を含む PBSにて溶解し、予め同バッファ一にて平衡化された Superdex 75 10/300 GLカラム（アマシャムバイオサイエンス）に 0. 4mLZminの流速で 供した。カラム溶液を 0. 45 μ Lずつ 40本分取し各フラクションの rsCD14— ST(2 ST64)純度を SDS— PAGEにより確認後、プールした。すなわち、各フラクションに 等容量の Tris— SDS— Seprasol (第一化学薬品株式会社)を添加し、 100°C、 5分 間加熱処理後、 5— 20%の e— PAGELゲル（アト一株式会社）に供し， Laemmliの 手法に従い非還元条件下により 25mA、 90分間泳動した。泳動終了後、ゲルを銀染 色キット 2D銀染色試薬 ·Π「第一」（第一化学薬品株式会社)を用いて染色した。この 2ST64標品を蒸留水に対して一晩透析し、最終精製標品を得た。最終精製標品の 蛋白濃度を後述する実施例 15— (3)で示した手法に従い測定した。以上の操作に より、 1000 mLの COS— 1培養上清から 452 gの rsCD14— ST(2ST64)を得た 。得られた精製標品の純度を SDS— PAGEにより確認したところ、図 9に示すように 単一バンドとして検出された。
[0329] < 2> rsCD14— ST(PSP64)の精製
以下の操作は特に記載しない限り 4°Cにて行なった。
(3)— 2で得られた COS— 1培養上清を予め PBSにて平衡化した 3C10— Sephar ose 4FFカラムに流速 9mLZminで供し、 PBSにて非吸着蛋白質を洗浄後、 10 mM HC1にて吸着蛋白質を溶出した。溶出画分は 1Z10容量の 500 mM重炭酸 アンモ-ゥムを添カ卩し pHを中性に戻した後、凍結乾燥した。なお、 3C10— Sepharo se 4FFカラムは次のように調製した。 3C10抗体を 10kDaの分子量カットオフを有 する透析膜を使用し、 2. 5Lの 0. 5M NaClを含む 0. 2M NaHCO (pH 8. 3)を
3
透析液として 4°C、ー晚透析した。尚、透析液は 3回交換した。次いで、予め 0. 5M NaClを含む 0. 2M NaHCO (pH 8. 3)にて平衡化しておいた NHS— Activate
3
d Sepharose 4Fast Flow (Amersham Biosciences) 透析した 3C10 体 溶液に添カ卩し、 4°Cー晚、カップリング反応を行った。次いで、 0. 5M NaClを含む 0 . 5M モノメタノールァミン (pH 8. 3)を担体に加え、 4°Cー晚ブロッキング反応を 行った。ブロッキング反応終了後、 0. 5M NaClを含む 0. 1M酢酸ナトリウム（pH 4)で担体を洗浄し、その後、 0. 5M NaClを含む 0. 2M NaHCO (pH 8. 3)で
3
担体を洗浄した。
[0330] 得られた凍結乾燥標品を 1 mM EDTA及び 150 mM NaClを含む 50 mM Tris-HCl (pH 7)バッファーに溶解し、蛋白濃度を後述する実施例 15— (3)で示 した手法に従い測定した。その後、酵素：基質比 = 1 : 3 (U : /z g)となるように PreSci ssion Protease (アマシャムバイオサイエンス）を添加し、 4°Cー晚切断反応を実施し た。反応終了後、 8 M 尿素を含む 50 mM Tris— HCl (pH 8. 5)バッファーを 2倍容量添カ卩し、 2 mLの Q— Sepharose HPカラムに流速 lmLZminで供した。 非吸着蛋白質を同バッファ一にて洗浄後、吸着した蛋白質を 0— 500 mM NaCl の直線濃度勾配（100分）により溶出した。溶出液を 3 mLずつ分取し、各フラクショ ンの rsCD14— ST (PSP64/356)力ら 65位以降を切断して得られた rsCD14— S T (以降、 rsCD14-ST(PSP64)と記載することがある）に相当する画分の含量を実 施例 7—（3)のキットにより測定した。
[0331] rsCD14— ST(PSP64)を含むフラクションをプールし、 150 mM 炭酸水素アン モ -ゥム水溶液に対して一晩透析し、その後凍結乾燥した。得られた凍結乾燥標品 を 8 M 尿素を含む PBSにて溶解し、予め同バッファ一にて平衡化された Superdex 75 10/300 GLカラム（アマシャムバイオサイエンス）に流速 0. 4mLZminで供 した。 0. 45 mLずつ 40本分取し各フラクションの rsCD14— ST(PSP64)純度を < 1 >で示した SDS— PAGEにより確認後、プールした。この rsCD14— ST(PSP6 4)標品を蒸留水に対して一晩透析し、最終精製標品を得た。最終精製標品の蛋白 濃度を後述する実施例 15— (3)で示した手法に従い測定した。以上の操作により、 13, 000 mLの COS— 1培養上清力ら 368 μ gの PSP64を得た。また、得られた精 製標品の純度を SDS— PAGEにより確認したところ、図 9に示すように単一バンドと して検出された。
[0332] (実施例 14) rsCD14— STの評価
14 (1) 実施例 7—（3)のキットを用いた濃度測定 実施例 13— (3)—1で調製した培養上清中に rsC14— STが産生されているかを 確認するため実施例 7— (3)のキットを用いて各培養上清中の rsCD14— ST濃度を 測定した。その結果を表 9に示す。また、各培養上清を実施例 9一（4)記載の方法に よりウェスタンプロティングした結果全くバンドが検出されな力 た。このことより、 rsC D14— STは産生されており高感度に検出可能なキットでは検出される力 実際の蛋 白量としては非常に少ないと判断された。
[0333] [表 9] 表 9
Figure imgf000111_0001
欠失体標記例 ： 1— 6 5は配列番号 3の 1位〜 6 5位のフラグメント （ r s
C D 1 4 C 1 - 6 5 ) )
[0334] 14一（2)ウェスタンブロティングによる rsCD14— STの検出
実施例 10— (1)で調製した sCD14— ST及び実施例 13— (3)— 3で調製した rsC D14-ST(PSP64)の F1106— 13— 3、 F1031— 8— 3抗体及び S68抗体に対す る反応性を確認した。すなわち、 SDS— PAGEは 12. 5%ゲルを用い、 Laemmliの 手法に従い非還元条件下により実施した。試料に等容量の Tris— SDS— Seprasol (第一化学薬品株式会社)を添加し、 4°C、一晩 SDS処理を行なった後、 12. 5%の e— PAGELゲル（アト一株式会社）に供し、 Laemmliの不連続バッファーシステムに より 40mA、 40分間泳動した。
[0335] 予め SDS— PAGEのゲルのサイズに切ってお!、た濾紙を 5%メタノール Z25mM
Tris/40mM εアミノカプロン酸溶液に浸し、白金電極セミドライトランスファー Β Ε320 (株式会社バイオクラフト）の陰極電極盤上に置き、ゲルを同溶液に浸し濾紙 上に気泡が入らないように重ねた。その後、予め 5%メタノール Z25mM Trisにて 平衡化した-トロセルロース膜（Trans— Blot Transfer -Medium, Bio— Rad)を ゲルの上に気泡が入らな 、ように重ねた。更に同溶液に予め浸してぉ 、た濾紙を気 泡が入らないように重ね、最後に、 5%メタノール Z300mM Trisに浸した濾紙を気 泡が入らないように重ねた。その上に陽極電極をのせ、 2mAZcm2、 2時間室温に て転写を行った。転写終了後、ニトロセルロース膜をブロックエース (大日本製薬株 式会社）に浸し、 37°C、 80分間ブロッキング操作を行った。その後-トロセルロース 膜を 6. 8 /z gZmlの F1106— 13— 3抗体、 6. gZmlの F1031— 8— 3抗体また は 6. 8 g/mlの S68抗体と 37°C、 80分間反応させ、 0. 05% Tween20/PBS で洗浄後、 F1106— 13— 3抗体及び F 1031— 8— 3抗体と反応させた-トロセル口 ース膜は抗マウス Igs抗体 HRPコンジュゲート（DAKO)と、 S68抗体と反応させた ニトロセルロース膜は抗ゥサギ IgG抗体 HRPコンジュゲート（DAKO)とそれぞれ 3 7°C、 1時間反応させた。反応終了後、ニトロセルロース膜を 0. 05% Tween20/P BSで洗浄した。未反応のコンジュゲートを洗い流した後、 ECL (Plus) (アマシャムバ ィォサイエンス） 4mLをカ卩え、室温， 5分間反応させた後、 HyperfilmTM ECL (ァ マシャムバイオサイエンス）の上に重ね、 90秒間露光した。
その結果、 SCD14— ST及び PSP64は 3種類の抗体に対してほぼ同等の反応性 を示した。
[0336] (実施例 15) rsCD14— STの物性解析
実施例 13— (3)— 3で調製した rsCD14— ST(2ST64)及び rsCD14— ST(PSP 64)の物性を解析した。なお、両フラグメントは切断に使用する蛋白分解酵素が異な る以外、最終精製品に差はなぐ実質的に rsCD14— STとしては同一の物質である
[0337] 15—（1) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列分析はプロテインシーケンサ Procise494cLC (アプライドバイ ォシステムズジャパン株式会社)を使用した。 rsCD14-ST(2ST64)精製標品を分 祈した結果、 CD14の1残基目カものァミノ酸配列（TTPEPCELDDG) (配列番号 1 )を主要成分として確認した。 CD14以外のアミノ酸配列は確認されな力つた。
[0338] 15 - (2) 質量分析
rsCD14— ST(2ST64)精製標品は 20mMリン酸ナトリウム緩衝液中で、 N— gly cosidaseF (ロシュ'ダイァグノスティックス株式会社）を添カ卩して 37°Cで 4時間インキ ュペートし、糖鎖を除去した。得られた糖鎖除去 2ST64は ZipTipC18 (ミリポア株式 会社)で脱塩し、質量分析用の試料とした。質量分析装置は autoflexll TOF (ブル カー.ダルト-タス株式会社)を使用した。マトリックス溶液はシナピン酸を 0. 1%トリフ ルォロ酢酸:ァセトニトリル = 2 : 1混合溶液で飽和となるよう溶解して調製した。質量 分析用の試料とマトリックス溶液を 1 :4の比率で混合し、 1 μ Lを質量分析に使用した 。質量分析の結果、 rsCD14— ST(2ST64)のペプチド部分の理論分子量 7663. 5と一致する分子量ピークがメインピークとして検出された。 N末端アミノ酸配列分析 の結果と併せて考えて、設計どおりの一次構造を持つ分子 (CD14の 1位から 64位 のアミノ酸配列力もなる分子）が得られて 、ることを確認した。
[0339] 15 - (3) 蛋白濃度の測定
蛋白濃度の測定は， BRPアツセィキット（Bio—Rad)を用い BSA(Bio—Rad)標準 品を使用して、添付のマニュアルに従って測定した。即ち、 BSA標準溶液及び PBS にて種々の倍率に希釈した試料 30 μ Lに蒸留水にて 5倍に希釈した Dye— Reagen tl. 5mLを添カ卩し、室温にて 15分間静置後、その 595nmの吸光度を分光光度計 D U— 7400 (ベックマン）にて測定し、 BSAの検量線力も試料中の蛋白濃度を測定し た。
[0340] 15 - (4) 分子量の算出
実施例 13— (3)— 3で調製した rsCD14— STと敗血症患者または正常人より精 製した sCD 14— STが類似した蛋白質であることを確認するため、ウェスタンブロッテ イングにより分子量を比較した。
正常ヒト血清力もの sCD14— STの精製標品は、実施例 10— (1)で得られた凍結 乾燥標品を 100 1の蒸留水に溶解して用いた。
実施例 14— (2)に示した F1031— 8— 3抗体を用いたウェスタンブロティングにより Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio— Rad)を用いて分子 量を比較した。その結果、図 10に示すようにヒト血清由来 SCD14— STは分子量 12. 9kDa【こ rsCD14— ST(2ST64) iま 12. 6kDa【こ rsCD14— ST(PSP64) ίま 12. 6k Daに検出された。 [0341] 15 - (5) rsCD14 (l— 307) S286C標準品との比活性の比較
実施例 13— (3)— 3で調製した rsCD14— ST(2ST64)の濃度を実施例 7— (1) のキットと rsCD14 (l— 307) S286C標準品を用いて測定し、蛋白濃度あたりの EIA 値として算出した。すなわち、 rsCD14— ST(2ST64)をキットの検体希釈液で ΙΟΟρ gZmLに希釈後、さら〖こ 50、 25pgZmLを調製し、キットで測定した。その結果、 sC D14— ST(2ST64) lpgあたりの rsCD14 (l— 307) S286C換算値は 352pgとなり 、本キットは rsCD14— ST(2ST64)に対して非常に反応性が高いことが示された。
[0342] 15 - (6) LPS結合能及び IL 6産生に対する影響
rsCD14— STが全長 CD14同様に LPS結合能を有している力、
国際公開 WO01Z72993号記載の IL—6産生抑制作用を有しているかを検討した
[0343] 15—（6)— 1 rsCD14— ST(PSP64)の IL 6産生抑制活性
sCD14- ST (PSP64)の IL - 6産生抑制活性につ!、て調べるために、以下の実 験を行った。ヒト臍帯血管内皮細胞 HUVEC (三光純薬)を、 2%非働化 FBSを含む RPMI 1640培地（Sigma)にて 96— well plateに 2 X 104cells/wellで植え込み、 5 %CO、 37°Cでー晚培養した。翌日、 2%ヒト血清を含む RPMI1640培地（以下、 2
2
。/c^ FBSZRPMIと記載）を調製し、 rsCD14— ST(PSP64)あるいは抗 CD14抗 体である 3C10を 2%非 FBSZRPMIで目的濃度の 2倍濃度に希釈しサンプルを調 製した。また、 LPS (E.Coli 055 : B5、 DIFCO)を、 2%非 FBS/RPMIにて、 20ng ZmLに希釈した。ー晚培養を行った HUVEC細胞の培養上清を捨て、 0. 1%HS A (Sigma)を含む RPMI 1640培地にて、二度洗浄し、上記サンプル及び LPS希釈 液を 50 LZwellずつ添カ卩し、さら〖こ 5%CO、 37°Cで約 18時間培養を行った。そ
2
の後、培養上清中の IL— 6量をヒト IL— 6検出キット（Eli— PAIR hIL— 6； Invitroge n)で定量した。その結果、 3C10は約 0.： gZmLで IL— 6産生をほぼ 50%抑制 するのに対し、 rsCD14-ST(PSP64)は 10 μ gZmLの濃度まで添カ卩しても、全く 抑制活性は示さな力つた。
[0344] 15 - (6) - 2 rsCD14— ST(PSP64)の LPS結合活性
rsCD14-ST(PSP64)に LPS結合能があるかを、 J.B.C, Vol.270, No.3 (1995), pp.1382— 1387,「Soluble CD14 Truncated at Amino Acid 152 Binds LPS and Enables Cellular Response to LPS」を参考にエンドスぺシ一キット（生化学工業）を用いて検 討した。すなわち、 LPS (E.Coli 055 : B5、 DIFCO)を 0. 01%BSAを含む PBS— ( 以下、 0. 01%BSAZPBSと記載）で希釈し 0. 6ngZmLの LPS溶液を調製した。 また rhLBP (R&D Systems)を 0. 1%HSAを含む PBS—で 100 gZmLに希釈 し、上記 LPS溶液と混合して、 LPSZLBP溶液 (LPS濃度が約 0. 6ng/mL, LBP 濃度が約 0. 3nM)を調製した。次に、 rsCD14— ST(PSP64)あるいは rsCD14 (l - 356)を 0. 01%BSAZPBSで目的の濃度に希釈し、 LPSZLBP溶液と等量混 合した。 37°Cで 1時間反応した後に、エンドスぺシ一 Cライセート（エンドスぺシ一 ES — 24Sセット；生化学工業)を添加し、室温で 20分間静置した。その後、 25%酢酸を 添加して反応を停止し、 405nmにて吸光度を測定し、反応液中の LPS濃度（以下、 フリー LPS濃度と記載)を算出した。尚、検量線は LPS希釈溶液のみを 37°Cで 1時 間反応した後に、上記サンプルと同様の操作し、作成した。その結果、 rCD14 (l— 356)では添加濃度に依存して、フリー LPS量が低下し、 rCD14 (l— 356)と LPSの 結合が確認された力 rsCD14— ST(PSP64)では 100nMまで添カ卩しても、フリー LPS量は変化せず、 rsCD14— ST(PSP64)には LPS結合能がないことが明らかに なった。
[0345] (実施例 16) rsCD14— ST標準品の検討
16— (l)rsCD14— ST標準品による標準曲線の作成
実施例 13— (3)— 3で調製した rsCD14— ST(2ST64)を用いて標準曲線を作成 した。すなわち、 rsCD14— ST(2ST64)を実施例 7— (12)に記載の希釈液で希釈 し、 0. 06、 0. 5、 1. 2、 2、 3ng/mLの濃度系列を調製し、実施例 7— (1)のキットを 用いて測定した。ブランクには希釈液を使用した。図 11に示すように濃度依存的に 吸光度が上昇し、 rsCD14-ST(2ST64)がキットの標準品として使用できることが 確認された。
[0346] 16 - (l)rsCD14— ST標準品による標準曲線の作成
実施例 7— ( 3)で作製したキットを用いて正常人血清中の sCD14— ST及び EDT Aカロ血漿中 sCD14— STの測定を行ったところ、 EDTAカ卩血漿では sCD14— ST濃 度が血清中の濃度に比較して約 2倍高値であった。原因として測定系への EDTAの 影響が考えられたため、希釈液に 0.2mg/mLとなるように EDTAを添加したところ、 血清の測定値が上昇し EDTA加血漿と差がない結果となった。し力しながら、 rsCD 14 ( 1— 307) S286C標準品を用いて作製した標準曲線では反応性が低下し、 ED TAの有無により読み値が影響を受けることが明らかになった。一方、 rsCD14— ST を標準品とした場合、 EDTAの添加では標準曲線は影響を受けないことより、 rsCD 14 STが標準品としてよりよいと判断された。
[0347] (実施例 17) rsCD14— STを用いた抗体の作製
17—（l) rsCD14- ST特異的ポリクローナル抗体の作製
実施例 13— (3)— 3で調製した rsCD14- ST (PSP64)に対するポリクローナル抗 体を作製するため、ゥサギに免疫を行った。すなわち、 rsCD14-ST (PSP64) 20 μ gを 500 μ 1の生理食塩水に希釈し、 500 μ 1のフロインド完全アジュバント（DIFCO) と等量混合後、ニュージーランド白色ゥサギ（北山ラベス)メス 2. 0—2. 4kgの背部皮 下に投与した。 2週間後、 rsCD14-ST (PSP64) 20 μ gを 500 μ 1の生理食塩水に 希釈し、 500 1のフロインド不完全アジュバント (DIFCO)と等量混合後、背部皮下 に投与した。 2週間後、 Γ3θϋ14-3Τ (Ρ3Ρ64) 20 /^を同様に投与した。投与終了 1週間後耳静脈より採血し、定法にしたがい抗血清を分離し、抗体を精製した。まず 抗血清に最終飽和濃度 33%となるように硫酸アンモニゥムを添加し、 4°Cで 1時間攪 拌後、析出した沈殿を遠心分離した。次に沈殿をダルベッコ PBS緩衝液 (以下、 P BS (pH7. 4)と記載)で溶解し、一夜透析した。透析液を濾過後、プロテイン Aカラム (プロセップ A、ミリポア）にアプライし、結合した IgG画分を 0. 1Mグリシン塩酸緩衝 液 (pH3. 0)により溶出し、精製抗体を得た。 PBS (pH7. 4)で透析後、 280nmの吸 光度より蛋白濃度を算出した (吸光係数: 0. 714mg/mL) 0以降、得られた抗体を 抗 PSP64ポリクローナル抗体若しくは抗 PSP64抗体と記載する。
[0348] 17 - (2) sCD 14- ST特異的モノクローナル抗体の作製
実施例 13— (3)— 3で調製した rsCD14-ST (PSP64)の抗原性を高めるため、 rs CD14- ST (PSP64)に最終濃度 0. 1 %となるようにジニトロフルォロベンゼン（和光 純薬）を添カ卩し、室温で 1時間インキュベーションした後、 PBS (pH7. 4)で透析し、 投与抗原とした（以下 DNP - PSP64抗原と記載することある）。 DNP - PSP64抗原 30 μ gを 100 μ Lの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（DIFCO)と等量混合 し、 Wistarラット 8週齢メスの各後足フットパッドに 100 Lずつ投与した。 2週間後、 腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行った。細胞融合は安東民衛，千葉丈 Z著「単クロ ーン抗体実験操作入門」 83ページ、 1991年 (講談社)にしたがって行った。すなわ ち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ 細胞（Sp2ZO— Agl4)と 5 : 1で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合 を行った。融合した細胞を HAT培地にケンダクし、ハイプリドーマを選別後、 目的の 抗体を産生しているノ、イブリドーマをスクリーニングした。
スクリーニングは rsCD14-ST(PSP64)を直接プレートに固相化する ELISA法を 用いた。すなわち、ィムノプレート（Maxisorb、 NUNC)に 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7 . 4)で 2. 5 /^ 111しに希釈した じ014-3丁（？3?64)を各ゥェルに50 1^添カロし 、 4°Cで一夜静置した。次にプレートをイオン交換水で 5回洗浄後、 2%StabilGuard (Surmodics)を含む PBS (pH7. 4)を各ゥエルに 100 L添加し、室温で 1時間静 置しブロッキングを行った。得られたノヽイブリドーマ力もサンプリングした培養上清を 各ゥエルに添カ卩し 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05%Tween20を含む生理食塩 水で 3回洗浄した。次にペルォキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体 (DAKO )を 10%ゥサギ血清を含む PBS (pH7. 4)で 1000倍に希釈した溶液を各ゥエルに 5 0 L添加した。 37°Cで 1時間反応後、同様に 5回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液 (TMB、 BioFix)を各ゥエルに添カ卩した。室温で 10分間反応後、 0. 5M硫酸溶液で 反応を停止した。 450nmの吸光度をプレート分光光度計 (マルチスキャン JX、サー モエレクトロン社)で測定し、 2ST64蛋白質と結合する抗体を産生するハイプリドーマ を含むゥエルを選択した。次に選択したゥエルより安東民衛*千葉丈 Z著「単クローン 抗体実験操作入門」 97ページ、 1991年 (講談社)にしたがって限界希釈法によりク ローニングを行った。 10日後、同様に 2ST64蛋白質に対する反応性を指標としてス クリーニングを行い、 6種類のハイプリドーマを選択した。選択したハイプリドーマを 10 %FCSZRPMI— 1640培地（Sigma)で培養後、 Hybridoma—SFM培地（Invitr ogen)で培養し抗体を産生させ、プロテイン Gカラム（Prosep— G、ミリポア）を用いて 抗体を精製した。精製した F 1237- 3- 4抗体及び F 1237-4- 4抗体のサブタイ プをラットタイピングキット (ZYMED)により決定したところサブタイプはそれぞれラット IgG2a- κ、ラッ HgG2b, κであった。
17- (3) 高分子量 CD14には結合しない rsCD14— ST特異的抗 rsCD14— ST ポリクローナル抗体の作製
敗血症患者に存在する SCD14— STに対して特異的に結合し、高分子量 CD14に は結合しないポリクローナル抗体を作製するため、実施例 13— (3) 3で調製した rs CD14- ST(PSP64)をゥサギに免疫する。すなわち、 rsCD14- ST(PSP64) 20 μ gを 500 μ 1の生理食塩水に希釈し、 500 μ 1のフロインド完全アジュバント（DIFCO) と等量混合後、ニュージーランド白色ゥサギ（北山ラベス)メス 2. 0—2. 4kgの背部皮 下に投与する。 2週間後、 rsCD14-ST(PSP64) 20 μ gを 500 μ 1の生理食塩水に 希釈し、 500 1のフロインド不完全アジュバント (DIFCO)と等量混合後、背部皮下 に投与する。 2週間後、 rsCD14- 3Τ(Ρ3Ρ64) 20 /ζ 8を同様に投与し、投与終了 1 週間後耳静脈より採血し、定法にしたがい抗血清を分離し、抗体を精製する。まず抗 血清に最終飽和濃度 33%となるように硫酸アンモニゥムを添加し、 4°Cで 1時間攪拌 後、析出した沈殿を遠心分離する。次に沈殿をダルベッコ-リン酸緩衝液 (以下、 PB S (pH7. 4)と記載)で溶解し、一夜透析する。透析液を濾過後、プロテイン Aカラム（ プロセップ A、ミリポア）にアプライし、結合する IgG画分を 0. 1Mグリシン塩酸緩衝液 ( PH3. 0)により溶出し、精製抗体を得る。 PBS (pH7. 4)で透析後、 280nmの吸光 度より蛋白濃度を算出する（吸光係数: 0. 714mg/mL) 0得られる精製抗 PSP64 ポリクローナル抗体を実施例 22で調製した高分子量 CD14若しくは実施例 6で調製 した rsCD14 (1— 356)を結合した榭脂を用いて特異精製し、 rsCD14— STのみに 結合する抗体を得る。すなわち、高分子量 CD14若しくは rsCD14 (l— 356) 5mgを HiTrap NHS -activated HP Columns (アマシャムバイオサイエンス）にマ-ュ アルに従って結合し、特異精製用ァフィユティーカラムを作製する。次に、プロテイン Aカラムで精製した抗体を特異精製用ァフィユティーカラムにアプライし、高分子量 C D14若しくは rsCD14 (l— 356)に結合しない抗体を回収する。得られる抗体を濃縮 し、 PBS (pH7. 4)で透析後、 280nmの吸光度より蛋白濃度を算出する（吸光係数： 0. 714mgZmL；)。
[0351] 17- (4) 高分子量 CD14には結合しない rsCD14— ST特異的抗 rsCD14— ST モノクローナル抗体の作製
実施例 13— (3)— 3で調製した rsCD14-ST(PSP64)の抗原性を高めるため、 rs CD14- ST(PSP64)に最終濃度 0. 1%となるようにジニトロフルォロベンゼン（和光 純薬）を添カ卩し、室温で 1時間インキュベーションした後、 PBS (pH7. 4)で透析し、 投与抗原とする（以下 DNP - PSP64抗原と記載することある）。 DNP - PSP64抗 原 30 μ gを 100 μ Lの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（DIFCO)と等量混 合し、 Wistarラット若しくは ddYマウス 8週齢メスの各後足フットパッドに 100 μ Lずつ 投与する。 2週間後、腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行う。細胞融合は安東民衛， 千葉丈 Ζ著「単クローン抗体実験操作入門」 83ページ、 1991年 (講談社)にしたが つて行う。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分 離し、ミエローマ細胞（Sp2ZO— Agl4)と 5 : 1で混合し、ポリエチレングリコールを 用いて細胞融合を行う。融合した細胞を HAT培地にケンダクし、ハイプリドーマを選 別後、 目的の抗体を産生しているハイプリドーマをスクリーニングする。
[0352] スクリーニングは rsCD14- ST(PSP64)、高分子量 CD14若しくは rsCD14 (l— 3 56)を直接プレートに固相化する ELISA法を用いる。すなわち、ィムノプレート（Max isorbゝ NUNC)に PBS (pH7. 4)で 2. 5 μ gZmLに希釈した rsCD14— ST(PSP6 4)、高分子量 CD14若しくは rsCD14 (l— 356)を各ゥエルに 50 L添カ卩し、 4°Cで 一夜静置する。次にプレートをイオン交換水で 5回洗浄後、 2%StabilGuard (Surm odics)を含む PBS (pH7. 4)を各ゥエルに 100 L添加し、室温で 1時間静置しプロ ッキングを行う。得られたノヽイブリドーマ力もサンプリングした培養上清を各ゥエルに 添カロし 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05%Tween20を含む生理食塩水で 3回洗 浄する。次にペルォキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体 (DAKO)若しくは ペルォキシダーゼ標識抗マウスィムノグロブリン抗体 (DAKO)を 10%ゥサギ血清を 含む PBS (pH7. 4)で 1000倍に希釈した溶液を各ゥエルに 50 L添加する。 37°C で 1時間反応後、同様に 5回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液 (TMB、 BioFix)を 各ゥエルに添加する。室温で 10分間反応後、 0. 5M硫酸溶液で反応を停止する。 4 50nmの吸光度をプレート分光光度計（マルチスキャン JX、サーモエレクトロン社）で 測定し、 rsCD14— STと結合し、高分子量 CD14若しくは rsCD14 (l— 356)とは結 合しな 、抗体を産生するノ、イブリドーマを含むゥエルを選択する。次に選択したゥェ ルより安東民衛 '千葉丈 Z著「単クローン抗体実験操作入門」 97ページ、 1991年（ 講談社）にしたがって限界希釈法によりクローユングを行う。 10日後、同様に 2ST64 に対する反応性を指標としてスクリーニングを行い、ノ、イブリドーマを選択する。選択 したハイプリドーマを 10%FCSZRPMI— 1640培地（Sigma)で培養後、 Hybrido ma - SFM培地（Invitrogen)で培養し抗体を産生させ、プロテイン Gカラム（Prose p— G、ミリポア）又はプロテイン Aカラム (Prosep— A、ミリポア）を用いて抗体を精製 する。 PBS (pH7. 4)で透析後、 280nmの吸光度より蛋白濃度を算出する（吸光係 数： 0. 714mg/mL) 0精製した抗体のサブタイプを市販のキットを用いて行う。
[0353] 17- (5) 検体の保存方法に依存しない sCD14— ST特異的抗 rsCD14— STモノ クローナル抗体の選択
保存状態が測定結果に影響を及ぼさないキットのためのモノクローナル抗体を得る 。すなわち、実施例 17— (4)で調製した rsCD 14— STに対するモノクローナル抗体 の中より実施例 22に記載のサンドイッチ系の標識側抗体として SCD14— STを測定 し、敗血症患者で上昇する性能を有する抗体を選択後、検体中の SCD14— STを測 定する。凍結保存した検体と 24時間室温で保存した検体の両者を測定し、測定値に 差の少な!/、抗体の組合せを選択する。
[0354] (実施例 18) 抗 sCD14— ST(PSP64)ポリクローナル抗体の反応性
実施例 17—（ 1)で作製した抗 PSP64ポリクローナル抗体の反応性を確認した。実 施例 17— (2)と同様に rsCD14— ST(PSP64)を固相化した。実施例 17— (1)で調 製した抗 PSP64ポリクローナル抗体を含む抗血清及びコントロールとして正常ゥサギ 血清を PBS (pH7. 4)で 500倍希釈した後、倍々希釈し 32000倍までの希釈系列を 調製した。各希釈液をブロッキング後のゥエルに添加し、 37°Cで 1時間反応した後、 0. 05%Tween20を含む生理食塩水で 3回洗浄した。次にペルォキシダーゼ標識 抗ゥサギィムノグロブリン抗体（DAKO)を 10%ャギ血清を含む PBS (pH7. 4)で 10 00倍に希釈した溶液を各ゥエルに 50 /z L添カ卩した。 37°Cで 1時間反応後、同様に 5 回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液 (TMB、 BioFix)を各ゥエルに添カ卩した。室温 で 10分間反応後、 0. 5M硫酸溶液で反応を停止した。 450nmの吸光度をプレート 分光光度計（マルチスキャン JX、サーモエレクトロン社)で測定し、 rsCD14-ST(PS P64)との結合を確認したところ、図 12に示すように rsCD14-ST(PSP64)を投与し たゥサギでは希釈倍率依存的に吸光度が上昇するのに対して正常ゥサギ血清では 上昇せず、 rsCD14-ST(PSP64)蛋白質特異的な抗体の産生が確認された。
[0355] (実施例 19) 抗 rsCD14— ST抗体を用いた sCD14— ST測定系の作製
S68ペプチドポリクローナル抗体を D— PBS (pH7. 4)で gZmLに希釈し、ィ ムノプレート（Maxisorb、 NUNC)の各ゥエルに 50 μ L添カ卩した。 4°Cでー晚反応後 、イオン交換水で 5回洗浄し、 0. l%StabilGuard (SurModics, Inc)と 0. l%Twe en20を含む D— PBSを各ゥエルに 100 μ L添カ卩しブロッキングした。次に 1%CD14 吸収血清、 0. 1%BSAを含む 76mM PBS (pH7. 4)を希釈液として 0、 0. 031、 0 . 063、 0. 125、 0. 25、 0. 5、 1. 2ngZmLの rsCD14— ST(2ST64)蛋白質標準 品希釈系列を調製した。標準品希釈系列をゥエル当たり 50 L添加し、 37°Cで 2時 間反応させた。反応終了後、 0. 05%TWeen20を含む生理食塩水で 3回洗浄し、 F 1237— 3—4抗体を含むl%ゥシ胎児血清ZHybridoma— SFM溶液を50 μ L添 加した。 37°Cで 1時間反応後、同様に 3回洗浄し、 10%ゥサギ血清を含む D— PBS ( pH7. 4)で 1000分の 1に希釈したペルォキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗 体 (DAKO)を各ゥエルに 50 L添カ卩した。 37°Cで 1時間反応後、同様に 5回洗浄し 、テトラメチルベンジジン溶液 (TMB、 BioFix)を各ゥエルに添カ卩し、室温で 10分間 反応後、 0. 5M硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計 (マルチスキャン JX 、サーモエレクトロン社)で 450nmの吸光度を測定した。図 13に作成した標準曲線 を示した。
[0356] (実施例 20) 新規 SCD14— ST測定系による血清測定
実施例 19で作製したサンドイッチ EIA系を用 、て正常人 5例及び敗血症患者 5例 の血清を測定した。その結果、表 10に示すように正常人の血清中 SCD14— ST濃度 は IngZmLであったのに対して敗血症患者では 6. 47ngZmLと約 6倍濃度が高値 であり、実施例 11と同様に敗血症患者を鑑別できることが示された。なお、実施例 11 との濃度の違いは、実施例 16に示した通り、標準品の違いによるものである。
[0357] [表 10] 表 1 0
Figure imgf000122_0001
[0358] (実施例 21) sCD 14— ST蛋白質特異的モノクローナル抗体の評価
SCD14— STに対する抗体の特異性を明らかにするため、各種 CD14蛋白質に対 する親和性を測定した。また、各種抗原に対する反応性を抗原固相 EIA系で測定し た。
21— (1) BIACOREを用いた解離定数 (K )の測定
D
実施例 17— (2)で作製した F1237— 3— 4抗体及び、抗 CD14抗体である 3C10 抗体 (ATCC TIB 228)と反応速度定数を Biacore3000 (ビアコア）を用いて解 祈した。まず、 rsCD14— ST(2ST64)及び rsCD14 (l— 356)を別々にァミンカツ プリングキット（ビアコア）を用いてセンサーチップ CM5 (ビアコア）に固定ィ匕した。測 定はランニング緩衝液として HBS—EP (ビアコア）を使用し、各抗体の希釈列（1. 2 5nM〜640nM、抗体により濃度を変更した）をフローセルにインジェクトすることで 行った。データ解析は各抗原を固定ィ匕したフローセル測定データ力 リファレンスセ ルデータを差し引き、さらにランニング緩衝液をのみのデータを差し引きし、 Biaeval uation soft wear version4.1 (ビアコア)を用 ヽて実施した。 Bivalent analysis を用いて解離定数 (K )を算出した結果、表 11に示すように F1237— 3— 4抗体は r
D
sCD 14— STに高 、親和性を示し、 rsCD 14 (1— 356)とは実質的に結合しな！ヽた め KDは算出できなかった。 3C10は、 rsCD14— STには実質的に結合せず、 rsCD 14 (1 - 356)に対して高い親和性を示した。
[表 11] 表 1 1
Figure imgf000123_0001
21— (2) 抗原固相 EIA系を用いた抗原特異性の解析
実施例 17— (2)で作製した F1237— 3— 4抗体及び、抗 CD14抗体である 3C10 抗体の高分子量 CD14に対する反応性を抗原固相 EIA系で測定する。すなわち、ィ ムノプレート（Maxisorb、 NUNC)に実施例 13— (2)と同様に調整し、 D— PBS (pH 7. 4)で 2. 5 μ gZmLに希釈した高分子量 CD14をゥエルに 50 μ L添加し、 4°Cで 一夜静置する。次にプレートをイオン交換水で 5回洗浄後、 2%StabilGuard (Surm odics)を含む PBS (pH7. 4)を各ゥエルに 100 L添加し、室温で 1時間静置しプロ ッキングを行う。 F1237— 3— 4抗体、 3C10抗体を： gZmLに PBS (pH7. 4)で 希釈し、各ゥエルに添カ卩し 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05%Tween20を含む生 理食塩水で 3回洗浄する。次にそれぞれの抗体に対するペルォキシダーゼ標識抗ィ ムノグロブリン抗体（DAKO)を 10%血清を含む PBS (pH7. 4)で 1000倍に希釈し た溶液を各ゥエルに 50 L添加した。 37°Cで 1時間反応後、同様に 5回洗浄しテトラ メチルベンジジン溶液 (TMB、 BioFix)を各ゥエルに添加する。室温で 10分間反応 後、 0. 5M硫酸溶液で反応を停止する。 450nmの吸光度をプレート分光光度計 (マ ルチスキャン JX、サーモエレクトロン社)で測定する。その結果、 3C10は、高分子量 CD14と強く結合するのに対して F1237— 3— 4抗体は実質的に結合しないことが確 認される。
[0361] (実施例 22) 抗 rsCD14— ST抗体を用いた sCD14— ST測定系の作製（2)
22- (1)サンドイッチ EIA法
表 12に示す抗体の各種組み合わせによるサンドイッチ EIA系を実施例 3— (3)に 記載の方法に従い、作製した。表 12に示すように実施例 17で作製したモノクローナ ル抗体を用いた sCD14測定系はいずれも、正常人では上昇せず、敗血症患者特異 的に上昇していた。
[0362] [表 12] 表 1 2
Figure imgf000124_0001
22— (2)競合 EIA法
F1237— 3— 4抗体を ΙΟ /z gZmLに PBSで希釈しゥエルに添カ卩する。 4°C、ー晚 静置し結合させ、次に 2%StabilGuard/PBS (pH7. 4)でブロッキングする。敗血 症患者血清及び正常人血清 25 μ Lをプレートに添加し、続けて 0. 5 μ gZmLに 1% BSA、 0.1%Tween20を含む PBS (pH7. 4)で希釈したペルォキシダーゼ標識 rs CD14— ST抗原を添カ卩し、 37°Cで 1時間反応後、 0.05%Tween20を含む生理食 塩水で 3回洗浄する。 TMB溶液 (BioFix)を添カ卩し、発色させ、さらに 0. 5M硫酸水 溶液で反応を停止し、吸光度を 450nmで測定する。吸光度は血中の sCD14— ST 濃度に依存して低下するため、測定した値は血中 sCD14— ST量を反映し、 sCD14 ST濃度は正常人では低ぐ敗血症患者では特異的に高いことが確認できる。また 、標識物としては他の酵素、放射性化合物、蛍光物質、化学発光物質、金コロイド、 色素やラテックス等を使用可能である。
[0364] (実施例 23)該血中可溶型蛋白質を測定するための抗体のスクリーニング方法
実施例 9で精製し、同定した血中可溶型蛋白質の測定系を作製することを目的に、 測定するために有用な 2種類のスクリーニング方法を構築した。
23 - (1)スクリーニングの対象とする抗体の調製
スクリーニングの対象とする抗体は、実施例 1の記載に準じて、配列番号 3に記載の アミノ酸配列から選択される連続した 6〜20アミノ酸残基力 なるペプチドと結合する 抗体を調製する。また、以下のようにも調製可能である。く 1〉CD14全長配列に基づ き定法によりペプチドを合成し、免疫抗原を調製して抗体を作製する。く 2〉血清中の 精製可溶性 CD14抗原を精製し、これを免疫原として抗体を作製する。く 3〉COS細 胞ゃ大腸菌を用いて組換え CD14蛋白質を調製し、これを免疫原として抗体を作製 する。く 4〉調製した各種 CD14抗原を熱変性や DNP化等により処理し、これを免疫 原として抗体を作製する。
[0365] 例えば、 P001抗体 (配列番号 4に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドを抗原とし て作製した抗体）、 P002抗体 (配列番号 5に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドを 抗原として作製した抗体)は、実施例 1に記載の方法により調製し、キャリア蛋白質と 結合させた後、投与し、抗体を調製した。さらに、実施例 1— (4)で作製した S68抗体 、実施例 2で作製した F1146— 17— 2抗体、実施例 3— (2) [2]で作製した F1031 —8— 3抗体、実施例 3— (2) [1]で作製した F1106— 13— 3抗体、実施例 17— (2) で作製した F1237— 3—4抗体及び実施例 17— ( 1)で作製した抗 PSP64抗体もス クリーニング検体として用意した。以上のように、配列番号 3に記載のアミノ酸配列か ら選択される連続した 6〜20アミノ酸残基力 なるペプチドと結合する抗体を調製し た抗体を用いて、以下に手順に従い該血中可溶型蛋白質を特異的に検出する抗体 をスクリーニングした。
[0366] 23—（2)抗原固相化法
正常人由来高分子量 CD14蛋白質の抗体に対する反応性の差を利用することを 特徴とする該血中可溶型蛋白質を測定するための抗体のスクリーニング方法である 。高分子量 CD14蛋白質に対する反応性を抗原固相化法により解析することにより、 正常人血清中に存在する高分子量 CD14には結合しないが、該血中可溶型蛋白質 には結合する抗体をスクリ一-ングする方法である。
[0367] [1]高分子量 CD14の調製
まず、高分子量 CD14蛋白質を以下のように調製した。ヒト血清（日本バイオテスト） を 3C10抗体結合榭脂カラム（5mL)に添加し、 PBSで洗浄後、 6M 尿素水溶液で 溶出した。溶出液を PBSに透析後、凍結乾燥し、続けてゲルろ過カラム（Superdex 75 10/300GL、アマシャムバイオサイエンス）で分画した。得られた各フラクション を市販可溶性 CD14蛋白質測定キット (IBL-キット)で検定後、 IBL キットに反応す る高分子量 CD14分画をプールし、凍結乾燥した。凍結乾燥物を溶解し、再度 IBL —キットで測定し濃度を算出した。
[0368] [2]抗原固相 EIA法
抗原固相 EIA法は、以下のように行った。まず高分子量 CD14を 2. 5 /z gZmLで プレートに 4°C、ー晚静置し結合させた。次に 2%StabilGuardZPBS (pH7. 4)で ブロッキングし、各抗体を 1 μ gZmLに PBSで希釈しそれぞれの抗原が固相化され ているゥエルに添加した。 37°Cで 1時間反応後、 0.05%Tween20を含む生理食塩 水で 3回洗浄し、続けて各抗体に対するペルォキシダーゼ標識抗 γグロブリン抗体（ ダコ）を 10%ゥサギ血清、 0.05%Tween20を含む PBS (ρΗ7. 4)で希釈し、室温で 1時間反応させた。同様に 5回洗浄し、 ΤΜΒ溶液 (BioFix)を添加し、発色させ、さら に 0. 5M硫酸水溶液で反応を停止した。続けて、抗体の吸光度を 450nmで測定し 、高分子量 CD14では吸光度が上昇しない抗体を選択した。上記の方法により、 F1 237- 3- 4抗体が選択された。
上記のプレートに結合させる抗体の代わりに、 sCD14— STを結合させれば、 sCD 14 STに結合しな 、抗体が選択できる。
[0369] 次にドットブロティングを以下のように行う。まず Trans- BlotTransfer Medium ( バイオラッド）に高分子量 CD14を約 400ngZドットでスポットし乾燥させる。次に 100 %ブロックエース（雪印乳業）を用いてブロッキングする。 2種類の固定ィ匕 CD14と 10 %ブロックエース、 0.05%Tween20を含む PBS (pH7. 4)で希釈した各種抗 CD 14 抗体を室温で 1時間反応させる。次に 0. 05%Tween20を含む PBS (pH7. 4)で 5 分間 5回洗浄し、続けてペルォキシダーゼ標識抗ゥサギィムノグロブリン抗体 (ダコ、 P448)を 10%ブロックエース、 0.05%Tween20を含む PBS (pH7. 4)で希釈し、 各メンブレンを室温で 1時間反応させる。同様に 5回洗浄し、 ECL— PLUS (アマシャ ム）を用いて抗体の結合の有無をィ匕学発光検出装置（CoolSaver AE— 6955、 A TTO)を用いて発光として検出する。スクリーニングに使用した抗体中の高分子量 C D14ではスポットが検出されない抗体を選択する。
23 (3)サンドイッチ免疫測定法
正常人血清と敗血症患者血清において検出される量の差を利用することを特徴と する該血中可溶型蛋白質を測定するための抗体のスクリーニング方法である。 2種類 の抗 CD 14抗体を組み合わせてサンドイッチ ELISA系を作製し、正常人と敗血症患 者検体を測定する方法である。
[ 1 ]ペルォキシダーゼ標識抗体の調製
12- (1)で作成した抗体を実施例 3— (3)に記載に準じて、ペルォキシダーゼ標 識抗体を調製した。
[2]サンドイッチ EIA系の作製
スクリーニングの対象とする各抗体を D— PBS (pH7. 4)で g/mLに希釈し、 ィムノプレート（Maxisorb、 NUNC)の各ゥエルに 50 μ L添カ卩した。 4°Cでー晚反応 後、イオン交換水で 5回洗浄し、 2%StabilGuard (SurModics, Inc)を含む D— P BSを各ゥエルに 100 /z L添カ卩しブロッキングした。次に 0. 1%BSAを含む PBS (pH 7. 4)を希釈液として 0、 3. 12、 6. 25、 12. 5、 25、 50、 100、 200ngZmLの CD1 4 (1 - 307) S286C蛋白質標準品希釈系列及び 10倍希釈した検体を調製した。標 準品希釈系列及び希釈検体をゥエル当たり 50 L添加し、 37°Cで 1時間反応させ、 反応終了後、 0. 05%Tween20を含む生理食塩水で 3回洗浄し、 2%ラット血清、 1 %マウス血清、 0. l%Tween20を含む PBS (pH7. 4)で 1 g/mLに希釈したぺ ルォキシダーゼ標識抗体を各ゥエルに 50 /z L添加した。 37°Cで 1時間反応後、同様 に 5回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液 (TMB、 BioFix)を各ゥエルに添カ卩した。 室温で 20分間反応後、 0. 5M硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計 (NJ - 2100、 日本インターメッド)で 450nmの吸光度を測定した。 [0371] [3]サンドイッチ EIA系による抗体のスクリーニング
次に本系で標準曲線が作成できる組合せについて、該血中可溶型蛋白質を特異 的に検出することが可能力、スクリーニングした。敗血症患者 2例及び正常人 2例の血 清を [1]で作成した測定系で測定を行い、正常人では低値を示し、敗血症患者では 高値を示す測定系の抗体の組合せを選択することで敗血症患者を特異的に検出す る抗体の組合せをスクリーニングした。その結果、実施例 7— (1)〜（8)及び実施例 2 2に記載の抗体の組み合わせが選択された。なお、予め IBL—キットにより各血清の 高分子量 CD14の測定値を求めておき、高分子量 CD14が測定されない測定系の 抗体の組合せを選択することを行っても良 、。
[0372] (実施例 24) rsCD14— STを使用した抗体のスクリーニング方法
rsCD14— STを使用して抗体をスクリーニングする方法として 2種類の方法を検討 した。
[0373] 24—（1)抗原固相EIA法
sCD 14— STを特異的に検出する抗体をスクリーニングするための方法として、実 施例 17— (2)に記載の抗体のスクリーニング方法、すなわち rsCD14-ST(PSP64) を直接プレートに固相化する ELISA法を用いることにより行った。
表 13に、各種抗体のスクリーニング結果を示す。なお、 MY4 (コールター）、 MEM 18 (Monosan社）、 61D3 (サザンバイオテクノロジーァソシエイト）及び、各種 γグロ ブリンは、市販品を用いた。
[0374] [表 13]
表 1 3
Figure imgf000129_0001
24- (2)サンドイッチ EIA法
SCD14— STを特異的に検出する抗体をスクリーニングするため方法として、実施 例 23— (2)に記載したサンドイッチ EIA系を作製した。すなわち、スクリーニング対象 検体となる各種抗体をプレートに固相化し、 rsCD14-ST(PSP64)を抗原として、さ らにペルォキシダーゼ標識 F1106- 13- 3抗体又はペルォキシダーゼ標識 F 103 1 -8 - 3抗体によるサンドイッチ ELISA法を用いることにより行った。 [0376] 表 14に各種抗体のスクリーニング結果を示す。なお、 AntiHCG抗体は、市販品を 用いた。
[0377] [表 14] 表 1 4
Figure imgf000130_0001
[0378] (実施例 25) sCD14— STの化学合成
ヒト CD14の N末端 1位〜 70位のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド（以下、 sCD 14 (1 - 70)と記載)を化学合成した。
ペプチド合成機 ABI433A (アプライド)を用いて、アミノ酸配列に従ってアミノ酸力 ラムを並べ、自動合成を行った。合成したペプチドは定法により樹脂より切り出し、ェ 一テルで沈殿させ回収後、再度蒸留水で溶解し凍結乾燥した。得られた粗精製ぺプ チドは溶解後、じ18逆相11?1^ ？じ5ししー？八1^、資生堂）を用いて 5〜70%の ァセトニトリル濃度の直線グラジェントで溶出し、目的のペプチドを含む分画を回収し た。回収した分画は凍結乾燥し、精製ペプチドとした。精製ペプチドを実施例 7- (12 )記載の希釈液を用いて溶解し、実施例 7— (3)に記載のキットにより測定したところ 、実施例 7— (3)に記載のキットとは強く反応し、化学合成により調製した SCD14— S Tもまた標準品となり得ることが示された。
[0379] (実施例 26) elastase処理 THP— 1細胞から発現する sCD14— STの測定
ビタミン D3で刺激した 1 X 106の THP— 1細胞を 0. 1%BSAを含む RPMI1640培 地に懸淘し、 numan leukocyte elastase (Elastin Products Company, Inc. ) を終濃度 1 μ Μとなるよう添加し、最終液量 200 μ Lの反応液を調製した。反応液を 3 7°Cで 1、 3、 10、 30または 60分インキュベートした後、フエ二ルメチルスルフォニルフ ルオリドを添加し、酵素反応を停止した。各反応液の上清を回収し、実施例 7— (1) のキットで上清に含まれる SCD14— STを測定した。その結果、 elastase添加から 3 分で sCD14— ST濃度が上昇し、その後は緩やかに減少した。
産業上の利用可能性
[0380] 本発明によれば、ヒト血中に存在する CD14の配列を有する新規な抗原が提供さ れる。さらに該抗原を測定することによる、敗血症を診断方法若しくは敗血症を検出 する方法が提供される。
また、該抗原と免疫的な機能が類似する組換え型可溶性フラグメントが提供される。 該組換え型可溶性フラグメントを生産する方法が提供される。さらに該フラグメントに 結合する新規な抗体も提供される。
また、「ヒト全長可溶型 CD14蛋白質の特定のアミノ酸配列からなるペプチドと結合 する抗体」、「ヒト全長可溶型 CD14の特定のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原と して作製される抗体」若しくは「該フラグメントに結合する抗体」または該抗体の断片を 構成要素として含む、該抗原を測定することができるキット及び測定方法が提供され る。
さらに、該蛋白質の測定に有用な抗体をスクリーニングする方法が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 下記 1)〜3)の性質を有する可溶性 CD14抗原、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13 ± 2kDa、
2) N末端配列に配列番号 1のアミノ酸配列を有する、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
[2] 下記く 1〉〜く 3〉の工程により得られる下記 1)〜3)の性質を有する組換え型可溶性 CD14フラグメント、
く 1〉所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が置換若しくは挿入されている配列番 号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメント若しくは該部分配列を有 するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜10個のアミノ酸が欠 失、付加若しくは置換したフラグメントを作製する工程、
く 2X 1〉で作製した組換え型可溶性 CD 14フラグメントを該所定の蛋白分解酵素に より切断する工程、及び
く 3X2〉で切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13 ± 2kDa、
2) 3C 10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
[3] 前期く 1〉の工程において、下記の 4)〜7)の配列を有する組換え型可溶性 CD 14フ ラグメントを作製する、
4)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または 該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜： LO 個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
5) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである
6) C末端が配列番号 3の 134位〜 356位のいずれかである、及び
7)所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列力 配列番号 3の 59位〜 90位のいず れかの位置の後ろに置換若しくは挿入されて!ヽる、 請求項 2に記載の組換え型可溶性 CD 14フラグメント。
[4] 下記の 8)〜： LO)の配列を有する請求項 2若しくは請求項 3に記載の組換え型可溶 性 CD14フラグメント、
8)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しく は該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
9) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである、及び、
10) C末端が配列番号 3の 59位〜 90位のいずれかである。
[5] 下記 1)〜3)の性質を有する組換え型可溶性 CD14フラグメント、
1)非還元条件下 SDS— PAGEでは、分子量 13 ± 2kDa、
2) 3C 10及び MEM— 18とは特異的な結合はしない、及び
3)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基力もなるペプチドを抗原として作製した抗体 に特異的に結合する。
[6] 請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原を測定することを特徴とする敗血症の診断若 しくは検出方法。
[7] 下記の工程を含むことを特徴とする請求項 6に記載の敗血症の診断若しくは検出 方法、
1)被験者から採取した血液中に含まれる請求項 1に記載の可溶性 CD 14抗原を測 定する工程、
2)測定した値を正常人の標準値と比較する工程、及び
3)被験者が、敗血症であるかどうかを評価する工程。
[8] 少なくとも一つの請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原に結合する抗体若しくは該 抗体の断片を含む、検体に含まれる請求項 1に記載の可溶性 CD 14抗原を測定す るための可溶性 CD14抗原の測定キット。
[9] 請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原に結合する抗体若しくは該抗体の断片として
、以下の a)〜d)の 、ずれかの抗体または該抗体の断片を含むことを特徴とする請求 項 8に記載の可溶性 CD14抗原の測定キット、
a)配列番号 2に記載のアミノ酸残基力 なるペプチドと結合する抗体。 b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 8〜 16アミノ酸残基から なるペプチドを抗原として作製される抗体。
c)配列番号 2に記載の 16アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体 d)請求項 2に記載の組換え型可溶性 CD 14フラグメント若しくは請求項 5に記載の組 換え型可溶性 CD 14フラグメントと特異的に結合する抗体。
[10] 前期請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原に結合する抗体若しくは該抗体の断片 力 d)請求項 2に記載の組換え型可溶性 CD14フラグメントと特異的に結合する抗 体または該抗体の断片である請求項 8若しくは請求項 9に記載の可溶性 CD 14抗原 の測定キット。
[11] 少なくとも一つの請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原に結合する抗体若しくは該 抗体の断片を、請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原に特異的に結合させることを特 徴とする、請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原の免疫学的な測定方法。
[12] 請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原に特異的に結合する抗体。
[13] 請求項 2に記載の組換え型可溶性 CD14フラグメントに特異的に結合する抗体。
[14] ヒト血中の全長可溶型 CD14蛋白質に実質的に結合せず、請求項 2に記載の組換 え型可溶性 CD 14フラグメントに対して結合する請求項 13に記載の抗体。
[15] F1237- 3—4抗体である請求項 13に記載の抗体。
[16] 下記の工程を含む、請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体の スクリーニング方法、
1)配列番号 3に記載のアミノ酸配列から選択される連続した 6〜20アミノ酸残基か らなるペプチドと結合する抗体をスクリーニング対象検体として用意する、
2) CD14を含む測定対象液を用意する、
3) 1)で用意した抗体若しくは、 2)で用意した測定対象液を用いて、免疫測定系を 構成する、
4) 3)で構成した免疫測定系により、測定対象液を測定する、及び
5) 4)で得た測定結果により、請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原の測定に有用な 抗体を評価し、選択する。
[17] 下記の工程を含む、請求項 1に記載の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体の スクリーニング方法、
1)抗体をスクリーニング対象検体として用意する工程、
2)請求項 2に記載の組換え型可溶性 CD 14フラグメントを用意する工程、
3) 1)で用意した抗体を 2)で用意したフラグメントと反応させ、 1)で用意した抗体と 2 )で用意したフラグメントの特異的な結合を評価する工程、及び、
4) 3)において、 2)で用意したフラグメントに特異的に結合した抗体を、請求項 1に 記載の可溶性 CD14抗原の測定に有用な抗体として、選択する工程。
[18] 下記の工程を含む、請求項 4に記載の組換え型可溶性 CD 14フラグメントの生産方 法、
く 1〉下記の 1)〜4)の配列を有する組換え型可溶性 CD14フラグメントを作製するェ 程、
1)配列番号 3に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または 該部分配列を有するフラグメントの配列番号 3の 53位〜 68位以外の領域に 1〜： LO 個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
2) N末端が配列番号 3の 1位〜 17位の 、ずれかである
3) C末端が配列番号 3の 134位〜 356位のいずれかである、
4)所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列力 配列番号 3の 59位〜 70位のいず れかの後ろに置換若しくは挿入されている、
く 2X1〉で作製した組換え型可溶性 CD14フラグメントを該所定の蛋白分解酵素に より切断する工程、及び
く 3X2〉で切断したフラグメントの N末側のフラグメントを回収する工程。
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