WO2005093080A2 - Nitrilhydratase aus rhodococcus - Google Patents

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WO2005093080A2
WO2005093080A2 PCT/EP2005/002134 EP2005002134W WO2005093080A2 WO 2005093080 A2 WO2005093080 A2 WO 2005093080A2 EP 2005002134 W EP2005002134 W EP 2005002134W WO 2005093080 A2 WO2005093080 A2 WO 2005093080A2
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nucleotide sequence
seq
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nitrile hydratase
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Steffen Osswald
Stefan Verseck
Uta Deiting
Christoph Weckbecker
Klaus Huthmacher
Michael Binder
Maria-Regina Kula
Konrad Odendahl
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Degussa Ag
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Definitions

  • the invention relates to a polynucleotide cluster from Rhodococcus, which contains nucleotide sequences coding for polypeptides with the activity of a nitrile hydratase, an auxiliary protein P15K activating this enzyme and a cobalt transporter, thus transformed microorganisms in which the nucleotide sequences coding for these proteins are present to an increased extent and the use of the transformed microorganisms for the production of amides from nitriles.
  • Nitrile hydratases have already been described in the literature (synthetic applications of nitrile-converting enzymes; Martinkova, Ludmila; Mylerova, Veronika; Current Organic Chemistry (2003), 7 (13), 1279-1295). Nitrile hydratases have been used for the production of several thousand tons of acrylamide per year since 1983. This biocatalytic process has proven to be competitive with chemical processes (Enzymic synt esis of acrylamide: a success story not yet over; Kobayashi, Michihiko;
  • nitrile hydratases that can be used for the conversion of acrylonitrile, those have also been described which are particularly suitable for the conversion of methacrylonitrile (A nitrile hydratase of Pseudonocardia thermophila and the genes encoding and manufacture of the enzyme for conversion of nitriles to amides (EP 790310), 3-cyanopyridine (Process for producing amides with Rhodococcus nitrile hydratase (WO 2002055670) or 2-hydroxynitriles such as 2-hydroxy-4-methylthiobutyronitrile (A nitrile hydratase of Rhodococcus and its use in the manufacture of amides (WO 2002070717) and Enzymic conversion of ⁇ -hydroxynitriles to the corresponding ⁇ -hydroxyamides, acids or acid salts, (WO 9832872).
  • methacrylonitrile A nitrile hydratase of Pseudonocardia thermophila and the
  • nitrile hydratases are known so far, with the aid of which 2-aminonitriles can be reacted effectively.
  • the nitrile hydratase from Rhodococcus sp. Cr4 sets e.g. B. 2-hydroxynitriles with high activity around, a simple 2-aminonitrile such as A inoacetonitrile but not at all (WO 2002070717).
  • amides can also be alkali or
  • Alkaline earth metal hydroxides are converted to the corresponding salts of the acids. This procedure is particularly preferred when using calcium hydroxide for the conversion of 4-methylthio- ⁇ -hydroxybutyramide (MHA amide), since the calcium salt of MHA is used directly as an alternative
  • Product form to methionine or MHA can be used as a feed additive.
  • Rhodococcus rhodochrous Jl in addition to the structural genes and the gene of the helper protein that codes for a cobalt transporter (A novel transporter involved in cobalt uptake, Komeda, Hidenobu et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1997), 94 (1), 36-41). Both the overexpression in Rhodococcus and that in E. coli leads to an increased uptake of Co 2+ ions from the
  • the object of the invention is to make nitrile hydratases with high activity accessible, which in particular convert ⁇ -aminonitriles to amides.
  • the invention includes the following subjects:
  • polynucleotides selected from the group: a) polynucleotide consisting of positions 1324 to 1737 of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or the complementary nucleotide sequence, b) polynucleotide with a nucleotide sequence which corresponds to the sequence from a) in the region of the degeneracy of the corresponds to genetic codes, c) polynucleotide which hybridizes with the complementary sequences a) or b) under stringent conditions, and d) polynucleotide with a nucleotide sequence from a), b) or c) which contains functionally neutral sense mutations, the polynucleotides encoding the helper protein P15K.
  • Polynucleotides selected from the group: a) polynucleotide consisting of positions 2076 to 3146 of the nucleotide sequence SEQ ID N0: 1 or the complementary nucleotide sequence, b) polynucleotide with a nucleotide sequence which corresponds to the sequence from a) in the region of the degeneracy of the corresponds to genetic codes, c) polynucleotide which hybridizes with the complementary sequences a) or b) under stringent conditions, and d) polynucleotide with a nucleotide sequence from a), b) or c) which contains functionally neutral mutations, the polynucleotides for a Encode protein with cobalt transporter activity.
  • Probe or primer containing at least 20 consecutive nucleotides within the Positions 1 to 1327 from the nucleotide sequence SEQ ID N0: 1 or its complementary form.
  • Probe or primer containing at least 20 consecutive nucleotides within positions 2076 to 3146 from the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or its complementary form.
  • Isolated polynucleotide according to 2) and 3), which hybridizes under stringent conditions with the complement with positions 1 to 1327 from SEQ ID NO: 1, the stringent conditions washing in 5 x SSC at a temperature of 50 to 68 ° C include.
  • Isolated polynucleotide according to 4) which hybridizes under stringent conditions with the complement with positions 1324 to 1737 from SEQ ID NO: 1, the stringent conditions comprising washing in 5 x SSC at a temperature of 50 to 68 ° C.
  • Isolated polynucleotide according to FIG. 5 which hybridizes under stringent conditions with the complement with positions 2076 to 3146 from SEQ ID NO: 1, the stringent conditions including washing in 5 ⁇ SSC at a temperature of 50 to 68 ° C.
  • Vectors containing (a) polynucleotide (s) selected from 1) to 5) and 12) to 14), or according to 2), 3) and 4) or according to 5).
  • Vector pUD15 consisting of the nucleotide sequence SEQ ID No. 24, containing the sequences according to 2), 3), and 6) from SEQ ID NO: 1, the start codon gtg having been changed to atg.
  • Vector pUDl6 consisting of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 25, containing the sequence from 5), the start codon ttg being changed to atg.
  • Host cell transformed or transfected by the introduction of a polynucleotide according to 1) to 5) and 12) to 14).
  • the host cell can be a eukaryote or prokaryote for which an expression system of sufficient stability is known.
  • Vector DNA can be introduced into eukaryonic or prokaryonic cells by known transformation or transfection techniques.
  • Transformation refers to measures known in the prior art for introducing foreign DNA.
  • the invention also relates to polynucleotides which essentially consist of a polynucleotide sequence which can be obtained by screening by means of hybridization of a corresponding Rhodococcus opacus gene library which contains the complete gene or parts thereof, with a probe which contains the sequences of the invention
  • Polynucleotides containing the sequences according to the invention are suitable as hybridization probes for RNA, cDNA and DNA to nucleic acids respectively
  • Isolate full-length polynucleotides or genes that code for or to the proteins of the invention Isolate nucleic acids or polynucleotides or genes that have a high similarity of the sequences with those of the genes according to the invention. They can also be applied as a probe to so-called “arrays”, “micro arrays” or “DNA chips” in order to detect and determine the corresponding polynucleotides or sequences derived therefrom, such as RNA or cDNA.
  • Polynucleotides which contain the sequences according to the invention are furthermore suitable as primers, with the aid of which polymerase chain reaction (PCR) can be used to produce DNA from genes which code for the proteins according to the invention.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Such oligonucleotides serving as probes or primers contain at least 25 or 30, preferably at least 20, very particularly preferably at least 15 successive nucleotides. Oligonucleotides with a length of at least 40 or 50 nucleotides are also suitable. If appropriate, oligonucleotides with a length of at least 100, 150, 200, 250 or 300 nucleotides are also suitable.
  • Isolated means separated from its natural environment.
  • Polynucleotide generally refers to polyribonucleotides and polydeoxyribonucleotides, which can be unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA.
  • polypeptides are understood to mean peptides or proteins which contain two or more amino acids linked via peptide bonds.
  • polypeptides according to the invention include a polypeptide according to the sequences SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 4 and
  • SEQ ID NO: 6 and also those which are at least 90%, and particularly preferably at least 91%, 95%, 97% or 99% identical to the polypeptides according to the sequences SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO : 4 and SEQ ID NO: 6.
  • the polynucleotide SEQ ID NO: 1 contains several amino acids
  • the genes encoding the ⁇ and ⁇ subunit of nitrile hydratase must be expressed together to obtain an active protein.
  • SEQ ID NO: 2 represents the amino acid sequence of the ⁇ -subunit and SEQ ID NO: 3 that of the ⁇ -subunit of the protein which shows nitrile hydratase activity.
  • SEQ ID NO: 2 is derived from positions 1 to 708 and SEQ ID NO: 3 from positions 710 to 1327 of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence of the so-called heifer protein P15K can be found in SEQ ID NO: 6, corresponding to positions 1324 to 1737 in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.
  • the helper protein activates the nitrile hydratase and must be present together with this enzyme in the microorganism that forms the nitrile hydratase.
  • SEQ ID NO: 4 stands for the amino acid sequence of the cobalt transporter and is derived from positions 2076 to 3146 of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.
  • the start codon ttg in SEQ ID NO: 4 is translated by PatentIn version 3.1 with leucine, the start codon gtg in SEQ ID NO: 6 with valine. It must be called methionine.
  • the co-expression of the cobalt transporter increases the nitrile hydratase activity in E. coli many times over. This also applies if high cobalt concentrations are used in the medium, which are orders of magnitude above the naturally occurring concentrations. Surprisingly, the co-expression of the cobalt transporter does not lead to a poisoning of the organism, but only to a slightly increased sensitivity of the cells to high cobalt concentrations in the medium.
  • E. coli Escherichia coli
  • the creation of gene banks is recorded in well-known textbooks and manuals. Examples include the textbook by Winnacker: Genes and clones, An introduction to genetic engineering (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990), or the manual by Sambrook et al. : Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • a very well-known gene bank is that of the E. coli K-12 strain W3110, which was developed by Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in ⁇ vectors. Bathe et al.
  • Plasmids such as pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) or pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268) can also be used to produce a gene bank in E. coli. be used.
  • E. coli strains that are defective in terms of restriction and recombination are particularly suitable as hosts.
  • An example of this is the strain DH5 ⁇ mcr, which was described by Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649).
  • DNA sequences obtained can then be processed using known algorithms or sequence analysis programs such as e.g. that of Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), that of Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) or the GCG program by Butler (Methods of Biological Analysis 39, 74- 97 (1998)).
  • known algorithms or sequence analysis programs such as e.g. that of Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), that of Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) or the GCG program by Butler (Methods of Biological Analysis 39, 74- 97 (1998)).
  • Coding DNA sequences which result from the in SEQ ID No. 1 contained sequences result from the degeneracy of the genetic code are also part of the invention.
  • DNA sequences which hybridize with these sequences or parts thereof are part of the invention.
  • Conservative amino acid exchanges such as e.g. Replacement of glycine for alanine or aspartic acid for glutamic acid in proteins known as "sense mutations" that do not result in a fundamental change in the activity of the protein, i.e. are functionally neutral. It is also known that
  • DNA sequences are part of the invention which are produced by the polymerase chain reaction (PCR) using primers which result from SEQ ID NO: 1.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Such oligonucleotides are typically at least 15 nucleotides in length.
  • the person skilled in the art can find instructions for identifying DNA sequences by means of hybridization in the manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) and in Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260).
  • the hybridization takes place under stringent conditions, that is, only hybrids are formed in which the probe and target sequence, i. H. the polynucleotides treated with the probe are at least 90% identical.
  • the stringency of the hybridization, including the washing steps is influenced or determined by varying the buffer composition, the temperature and the salt concentration.
  • the hybridization reaction is preferably carried out at a relatively low stringency compared to the washing steps (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
  • a 5x SSC buffer at a temperature of approx. 50 ° C - 68 ° C can be used for the hybridization reaction. Probes can also be used
  • polynucleotide fragments can be isolated which, for example, have at least 90% to 95% identity to the sequence of the probe used. Further instructions for hybridization are available on the market in the form of so-called kits (for example DIG Easy Hyb from Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1603558).
  • the procedure is to insert a well-expressible gene into a vector with a low copy number, genes with weaker expression performance on a vector with a higher copy number and / or a strong one
  • the host cells are transformed with these vectors in such a way that, in comparison to the starting organism, they each contain at least one additional copy of the nucleotide sequences coding for the formation of nitrile hydratase or the other proteins.
  • nucleotides coding for the .alpha. And .beta. Subunit and the helper protein are preferably located together on one vector, with one common or two separate promoters.
  • the transformed or recombinant microorganisms thus produced are also part of the invention.
  • amplification describes the increase in the intracellular activity of one or more enzymes in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by increasing the copy number of the gene or genes, using a strong promoter or a gene used, which codes for a corresponding enzyme with a high activity and optionally combines these measures.
  • the promoter and regulatory region or the ribosome binding site that is upstream of the structural gene can be mutated.
  • Expression cassettes which are installed upstream of the structural gene act in the same way. Inducible promoters also make it possible to increase expression in the course of fermentative amino acid production. Through measures to extend expression is also improved during the lifetime of the m-RNA.
  • genes or gene constructs can either be present in plasmids with different copy numbers or can be integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, overexpression of the genes in question can be achieved by changing the media composition and culture management.
  • the measures of enhancement in particular overexpression, generally reduce the activity or concentration of the corresponding protein by at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500% , increased up to 1000% or 2000%, based on that of the wild-type protein or the activity or concentration of the protein in microorganisms not transformed with the nucleotide sequences according to the invention.
  • Another object of the invention is to provide vectors which are generally autonomously replicable in the selected host strains and which are compatible with one another and contain at least nucleotide sequences according to claims 2, 3 and 4 or a nucleotide sequence according to claim 4.
  • Vector DNA can be introduced into eukaryotic or prokariotic cells by known transformation techniques.
  • Microorganisms for which there are expression systems such as, for. B. Pseudomonas, Pichia, various yeasts, Saccaromyces, Aspergillus or the Streptomyces family, in particular E. coli.
  • Microorganisms of the genus Rhodococcus are also suitable.
  • the invention also relates to a process for the preparation of nitrile hydratase originating from Rhodococcus, in particular Rhodococcus opacus, or microorganisms containing this enzyme, in which
  • this enzyme is isolated from the cells, or
  • the microorganisms are harvested and obtained as resting cells containing the enzyme.
  • the recombinant nitrile hydratase produced converts ⁇ -aminonitriles with an activity of> 50 U / mg dry biomass.
  • the microorganisms used according to the invention can be cultured continuously or discontinuously in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process).
  • batch cultivation batch cultivation
  • feed process fed batch
  • repetitive feed process repeated fed batch process
  • a summary of known cultivation methods is described in the textbook by Chmiel (bioprocess technology 1st introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral devices (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994))
  • the culture medium to be used must meet the requirements of the respective strains in a suitable manner. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981).
  • Sugar and carbohydrates such as e.g. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such as e.g. Soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as Palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as e.g. Glycerin and ethanol and organic acids such as e.g. Acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture.
  • nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used.
  • the nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the source of phosphorus.
  • the culture medium must also contain salts of metals, e.g. Magnesium sulfate or iron sulfate, which are necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used in addition to the substances mentioned above.
  • the feedstocks mentioned can be added to the culture in the form of a single batch or can be added in a suitable manner during the cultivation.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are used in a suitable manner.
  • Anti-foaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to control the development of foam.
  • suitable selectively acting substances such as antibiotics can be added to the medium.
  • oxygen or gas mixtures containing oxygen, such as air are introduced into the culture.
  • the temperature of the culture is usually 10 ° C to 40 ° C, and preferably 10 ° C to 30 ° C.
  • the culture is preferably continued at least until it has passed the logarithmic growth phase. This goal is usually achieved within 10 hours to 70 hours.
  • the invention also relates to a process for the enzymatic production of amides from nitriles, which comprises the following steps:
  • the cells are harvested, washed and taken up in a buffer as a suspension at a pH of 5-9, in particular from 6.8 to 7.9.
  • the cell concentration of the resting cells is generally 1-25%, in particular 1.5 to 15% (wet weight / v).
  • They can be permeabilized using physical or chemical methods, e.g. B. toluene as in Wilms et al. , J. Biotechnol. , Vol 86 (2001), 19-30 described that the nitrile compounds to be converted penetrate the cell wall and the resulting amide can escape.
  • the biocatalyst (whole cell catalyst) shows excellent stability so that product concentrations of over 100 g / 1 can be achieved.
  • nitrile hydratase it is also possible to separate the nitrile hydratase according to the invention from the cells by known methods, if necessary to purify it and to use it to convert the nitriles.
  • X OH, H, alkyl with 1 to 4 carbon atoms, aryl, especially NH 2 ;
  • R H, saturated alkyl radical with 1 to 12 C atoms, branched or unbranched, optionally substituted with NH2, alkenyl radicals with 1 to 12 C atoms, branched or unbranched, cycloalkyl groups with 3 to 6 C atoms, alkylene radicals substituted with alkylthio groups, where alkyl here corresponds to a Ci to C 3 radical and alkylene corresponds to a divalent C 3 to C 8 radical, R 1 : H, alkyl having 1 to 3 C atoms, R ": mono- or dinuclear aromatic ring, having 6 to 12 C atoms, optionally substituted with one or two alkyl groups (Cl - C3) or Cl or F, alkyl nitrile with 1 to 6 C atoms.
  • ot-Aminonitrile ⁇ -aminopropionitrile, ⁇ -aminomethylthiobutyronitrile, ⁇ -aminobutyronitrile, aminoacetonitrile, all nitriles derived from natural amino acids, ⁇ -amino-3,3-dimethylpropionitrile ⁇ -amino-2, 3-dimethylpropionitrile
  • Nitriles with carboxyl groups cyanoacetic acid
  • unsaturated nitriles acrylonitrile, methacrylonitrile, allyl cyanide, crotononitrile
  • ⁇ -Hydroxynitrile ⁇ -Hydroxy-n-propionitrile, ⁇ -Hydroxy-n-butyronitrile, ⁇ -Hydroxy-isobutyronitrile, ⁇ -Hydroxy-n-hexanonitrile, ⁇ -Hydroxy-n-heptanonitrile, ⁇ -hydroxy-n-octyronitrile, ⁇ , ⁇ -dihydroxy- ⁇ , ⁇ -dimethylbutyronitrile, acrolein cyanohydrin, Methacrylaldehyde cyanohydrin, 3-chlorolactonitrile, 4-methylthio- ⁇ -hydroxybutyronitrile and ⁇ -hydroxy- ⁇ -phenylpropionyl.
  • the concentration of the nitriles to be reacted in the reaction solution is not limited to certain ranges.
  • the concentration of the nitrile is generally kept at 0.001 to 10 w / w%, in particular 0.1 to 2 w / w%, based on the amount of the biocatalyst as the dried cell mass.
  • the substrate can be added continuously or discontinuously at the start of the reaction as a whole or in the course of the reaction.
  • solubility of the nitrile compound in the aqueous reaction system is too low, a solubilizer can be added.
  • reaction can also be carried out in a two-phase water / organic solvent system.
  • the amount of cells used relative to the amount of substrate is preferably 0.001 to 8 w / w% as the dried cell mass.
  • the dry weight of the cell mass is determined using a MA45 moisture analyzer (Sartorius).
  • the reaction is generally carried out at temperatures from -5 ° C to 50 ° C, in particular 0 ° C to 30 ° C, and a period of 0.1 to 100 hours.
  • the pH of the reaction mixture to be maintained is not limited to certain values as long as the enzymatic activity is not impaired.
  • the amide formed can be separated from the reaction solution and purified as is known.
  • the invention also relates to a process in which the amide or the solution containing the amide, for. B. separated from the cells of the biomass and the amide either saponified to the corresponding acid or reacted with the addition of alkali or alkaline earth metal hydroxides to the corresponding salts of the acids.
  • MHA amide is preferably saponified with calcium hydroxide and the corresponding calcium salt is isolated.
  • Chromosomal DNA from Rhodococcus opacus was digested with the restriction enzymes PinAI, PstI and Xmal (Röche) and the fragments separated on a 0.8% agarose gel.
  • a Southern blot was carried out according to standard methods (e.g. in Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Pess, 1989) on a positively charged nylon membrane (Hybond-N +, Amersham).
  • the hybridization was carried out with a DIG-labeled probe according to the manufacturer's instructions (Röche).
  • the probe was produced by means of PCR with the degenerate primers IF and IR with genomic DNA as a template.
  • the primers were derived from homologous regions of the ⁇ subunit, which were determined by sequence alignment of different NHases. Their sequences were made up of
  • a new probe was produced using the method described above with the primers 2F and 2R, which hybridizes at the 3 'end of the cloned PinAI fragment.
  • the PinAI fragment cloned in pUC18 served as a template.
  • the color signals and the first probe were first removed from the membrane described above, following instructions from the manufacturer (Röche). An approximately 2 kb PstI band was detected on this membrane with the second probe.
  • the corresponding DNA fragment was cloned into the vector pUCl8 opened with PstI, the product was transformed into E. coli JM109 and positive clones were identified by colony hybridization.
  • the PstI fragment is 1883 nt in size and contains a (3'-) part of the gene of the ⁇ -subunit of nitrile hydratase, the gene of the auxiliary protein P15K and a (5'-) part of the gene of the cobalt transporter.
  • a new probe was produced using the primers 3F and 3R and the Pstl fragment cloned in pUCl ⁇ as a template, which was located at the 3 'end of the cloned PstI fragment hybridized. This probe was used to detect an approximately 1.7 kb Xmal band on the same membrane, from which color signals and the second probe had previously been removed.
  • the corresponding DNA fragment was cloned into the vector pUCl ⁇ opened with X, the product was transformed into E. coli JM109 and positive clones were identified by colony hybridization. A probe was used for this, which had been amplified with the primers 4F and 3R.
  • the Xmal fragment is 1747 nt in size and contains a (3'-) part of the gene of the cobalt transporter.
  • the continuous sequence of the gene cluster which contains the polynucleotides encoding the ⁇ - ⁇ subunits of the nitrile hydratase, the auxiliary protein P15K and the cobalt transporter is given in SEQ ID NO: 1.
  • the structural genes were cloned into a known expression vector for E. coli, in which the inserted genes are under the control of a rhamnose promoter.
  • a second rhamnose promoter In addition, a second rhamnose
  • the gene for the ⁇ -UE was amplified with the primers 5F and 5R, which inserted interfaces for the restriction enzymes Ndel, BamHI and HindIII.
  • the second rhamnose promoter was amplified with the primers 6F and 6R, which inserted sites for the restriction enzymes BamHI, Ncol and Hindlll.
  • the gene for the ⁇ -UE was amplified with the primers 7F and 7R, the interfaces for the restriction enzymes Ncol, Kpnl and Insert Hindlll.
  • the gene for the P15K protein was amplified with the primers 8F and 8R, the sites for the restriction enzymes Kpnl and Hindlll were inserted and the start codon was changed from GTG to ATG.
  • the resulting expression vector is called pUD 15.
  • the restriction map can be found in Figure 1, the sequence under SEQ ID NO: 24.
  • the gene for the cobalt transporter was cloned into another expression vector for E. coli, in which the inserted genes were also under the control of the rhamnose
  • Promoters stand. For this purpose, it was amplified with the primers 9F and 9R, inserted the interfaces for the restriction enzymes Ndel and Hindlll and changed the start codon from TTG to ATG.
  • the resulting expression vector is called pUD 16.
  • the restriction map can be found in Figure 2, the sequence under SEQ ID NO: 25.
  • the expression plasmids were transformed into the strain E. coli DSM 14459, which is deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ).
  • pUDl5 gene of the ⁇ subunit: nt 25-732 gene of the ⁇ subunit: nt 949-1566 gene of P15K: nt 1592-2005
  • pUDl6 gene of the cobalt transporter: nt 25-1095
  • DSM 14559 was deposited in connection with DE 101 55 928.
  • the cells transformed with pUDl5 were grown in LB medium (LB Bouillon according to Miller, VWR), which contained 1 mM CoCl 2 and 100 ⁇ g / ml ampicillin with shaking at 37 ° C. Culturing for the cells transformed with pUDl5 and pUDl6 was carried out analogously, but the medium additionally contained 50 ⁇ g / ml chloramphenicol. The cells were then inoculated 3 more times in the same medium after they had reached an OD 60 o of 2 at least. After 12-16 hours, such a quantity of the last preculture was inoculated into a main culture that it had an OD 60 o of 0.1. The culture medium of the main culture corresponded to that of the preculture, but additionally contained 2 g / L L-rhamnose. The cells were harvested after 22 hours.
  • LB medium LB Bouillon according to Miller, VWR
  • the cells were grown as described in Example 3, separated from the culture medium by centrifugation and resuspended in the standard buffer (50 mM potassium phosphate buffer pH 7.5). 50 ⁇ l of this cell suspension were added to 700 ⁇ l of the standard buffer and in order to start the reaction with 250 ⁇ l of a 200 mM solution of the nitrile
  • the concentration of the cells in the cell suspension was such that the nitrile was converted to 5-30% after 10 min at 20 ° C. After 10 min at 20 ° C the reaction was started by adding 20 ul half-concentrated phosphoric acid was stopped and the cells were separated by centrifugation.
  • the activity of one unit (U) was defined as the amount of enzyme that converts 1 ⁇ mol of N-formylvaline nitrile to the amide in one minute.
  • the specific activity is given in U per mg dry biomass (U / mg BTM).
  • E. coli DSM 14459 cells containing either only plasmid pUDl5 or pUDl5 and pUDl6 were grown as described in Example 3.
  • the cobalt concentration in the medium was varied from 0.5 to 2 mM. After 24 hours the optical density of the culture was measured at ⁇ OOnm.
  • E. coli DSM 14459 cells containing the plasmid pUDl5 were grown as described in Example 3 and centrifuged. 2.8 g of the cells, based on the wet weight, were resuspended in 47.2 ml of 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.5 and methionine nitrile at 20 ° C. with vigorous stirring was added continuously at a rate such that the concentration during the reaction was 15 g / L never exceeded. The pH was kept constant at 7.5. Response tracking was done using

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Polynucleotidcluster aus Rhodococcus, der für Polypeptide mit der Aktivität einer Nitrilhydratase, eines dieses Enzym aktivierenden Hilfsprotein P15K und eines Kobalttransporters kodierende Nukleotidsequenzen enthält transformierte Mikroorganismen, in denen die für diese Proteine kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt vorliegen und die Verwendung der transformierten Mikroorganismen zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen.

Description

Nitrilhydratase aus Rhodococcus
Die Erfindung betrifft einen Polynucleotidcluster aus Rhodococcus, der für Polypeptide mit der Aktivität einer Nitrilhydratase, eines dieses Enzym aktivierenden Hilfsproteins P15K und eines Kobalttransporters kodierende Nukleotidsequenzen enthält, damit transformierte Mikroorganismen, in denen die für diese Proteine kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt vorliegen und die Verwendung der transformierten Mikroorganismen zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen.
Nitrilhydratasen wurden bereits in großer Zahl in der Literatur beschrieben (Synthetic applications of nitrile- converting enzymes; Martinkova, Ludmila; Mylerova, Veronika; Current Organic Chemistry (2003), 7(13), 1279- 1295) . Für die Herstellung von Acrylamid im Maßstab von mehreren tausend Tonnen pro Jahr werden Nitrilhydratasen schon seit 1983 eingesetzt. Dieses biokatalytische Verfahren hat sich gegenüber den chemischen Verfahren als konkurrenzfähig erwiesen (Enzymic synt esis of acrylamide: a success story not yet over; Kobayashi, Michihiko;
Nagasawa, Toru; Yamada, Trends in Biotechnology (1992) , 10(11) , 402-8) .
Neben den Nitrilhydratasen, die für die Umsetzung von Acrylnitril eingesetzt werden können, wurden z.B. auch solche beschrieben, die besonders geeignet sind für die Umsetzung von Methacrylnitril (A nitrile hydratase of Pseudonocardia thermophila and the genes encoding and manufacture of the enzyme for conversion of nitriles to amides (EP 790310) , 3-Cyanopyridin (Process for producing amides with Rhodococcus nitrile hydratase (WO 2002055670) oder 2-Hydroxynitrilen wie 2-Hydroxy-4- methylthiobutyronitril (A nitrile hydratase of Rhodococcus and its use in the manufacture of amides (WO 2002070717) and Enzymic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding α-hydroxyamides , acids or acid salts, (WO 9832872). Demgegenüber sind bisher keine Nitrilhydratasen bekannt, mit deren Hilfe 2-Aminonitrile effektiv umgesetzt werden können. Die Nitrilhydratase aus Rhodococcus sp. Cr4 setzt z. B. 2-Hydroxynitrile mit hoher Aktivität um, ein einfaches 2-Aminonitril wie A inoacetonitril aber überhaupt nicht (WO 2002070717) .
Die enzymatische Umsetzung von Aminonitrilen zu den entsprechenden Amiden eröffnet eine attraktive Syntheseroute zu Aminosäuren, da 2-Aminoamide auf einfache Weise verseift werden können (WO 2001060789) . Dieser Prozess läuft unter milden Bedingungen, mit sehr hoher Selektivität und ohne die Bildung von Nebenprodukten wie Salzen ab, wie sie bei der chemischen Hydrolyse anfallen.
Alternativ können Amide auch mit Alkali- oder
Erdalkalimetallhydroxiden zu den entsprechenden Salzen der Säuren umgesetzt werden. Besonders bevorzugt ist diese Vorgehensweise beim Einsatz von Calciumhydroxid für die Umsetzung von 4-Methylthio-α-hydroxybutyramid (MHA-Amid) , da das Calciumsalz von MHA direkt als alternative
Produktform zu Methionin oder MHA als Futtermittelzusatz eingesetzt werden kann.
Für die Herstellung eines Commodity-Produkts wie z.B. DL- Methionin reicht es jedoch nicht aus, einen Biokatalysator mit hoher Aktivität zur Verfügung zu stellen. Zur Erhöhung der Aktivität muß ein Expressionssystem für die zu verstärkenden Gene etabliert werden. Es bietet sich die heterologe Expression z.B. vor allem in Escherichia coli, Bacillus, Pseudomonas, Pichia, Sacharomyces oder Aspergillus an, da diese Mikroorganismen ein schnelles Wachstum besitzen, sehr hohe Zelldichten erreichen und molekularbiologische Tools verfügbar sind, die sehr hohe Expressionsniveaus erlauben (Lee SY (1996) High cell- density culture of Escherichia coli. TIBTECH 14:98-105; Riesenberg D, Guthke R (1999) High-cell-density cultivation of microorganisms . Appl Microbiol Biotechnol 51:422-430).
Es ist bekannt, dass für die heterologe Expression von Nitrilhydratasen mindestens 3 Gene co-exprimiert werden müssen. Neben den beiden Strukturgenen muß außerdem sowohl für eisenabhängige, als auch für Cobaltabhängige Enzyme ein entsprechendes Helferprotein verstärkt werden (Nojiri
M. et al., (1999) Functional expression of Nitrile hydratases in Escherichia coli: Require ent of a nitrile hydratase activator and a post-translational modification of a ligand cysteine. J Biochem 125: 696-704 und Over- production of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in Escherichia coli: activity requires a novel downstrea protein, Wu, S.; Fallon, R. D.; Payne, M. S. Applied Microbiology and Biotechnology (1997) , 48(6) , 704-708) .
Zusätzlich zu diesen 3 Genen wurde in Rhodococcus rhodochrous Jl in einem Gencluster neben den Strukturgenen und dem Gen des Helferproteins ein weiteres Gen gefunden, das für einen Cobalttransporter codiert (A novel transporter involved in cobalt uptake, Komeda, Hidenobu et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1997), 94(1), 36-41). Sowohl die Überexpression in Rhodococcus als auch die in E. coli führt zu einer erhöhten Aufnahme von Co2+-Ionen aus dem
Kulturmedium. Ausserdem konnte gezeigt werden, daß bei Co- Expression des Cobalttransporters zusammen mit den 3 anderen Proteinen die gleiche Nitrilhydratase-Aktivität bei einer niedrigeren Co-Konzentration im Medium erreicht werden kann, verglichen mit der alleinigen Expression der Strukturgene und des Helferproteins . Allerdings tritt dieser Effekt in Rhodococcus gemäß Komeda et al. nur bei Konzentrationen unterhalb von 42 μM auf. Aus der EP 0 362 829 ist die Fermentation von Rhodococcus rhodochrous in Gegenwart von Kobaltsalzen bekannt.
Aufgabe der Erfindung ist es, Nitrilhydratasen mit hoher Aktivität zugänglich zu machen, die insbesondere α- Aminonitrile zu Amiden umsetzen.
Die Erfindung beinhaltet folgende Gegenstände:
1. Isolierte Polynukleotidcluster aus Rhodococcus, insbesondere Rhodococcus opacus, enthaltend vier Nukleotidsequenzen, die für vier Polypeptide mit Aminosäuresequenzen kodieren, die zu jeweils mindestens 90 % identisch sind mit dem in den Sequenzen SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 5 enthaltenen Aminosäuresequenzen, wobei die Polypeptide die Aktivitäten einer Nitrilhydratase, bestehend aus α- und ß-Untereinheit, des Hilfsproteins P15K und eines Kobalttransporters besitzen.
2. Polynukleotide, ausgewählt aus der Gruppe: a) Polynukleotid bestehend aus den Positionen 1 bis 708 der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder der dazu komplementären Nukleotidsequenz, b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz aus a) im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entspricht, c) Polynukleotid, das mit den komplementären Sequenzen a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und d) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz aus a) , b) oder c) , die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält, wobei die Polynukleotide für die ß-Untereinheit der Nitrilhydratase kodieren. 3. Polynukleotide, ausgewählt aus der Gruppe: a) Polynukleotid bestehend aus den Positionen 710 bis 1327 der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder der dazu komplementären Nukleotidsequenz, b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz aus a) im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entspricht, c) Polynukleotid, das mit den komplementären Sequenzen a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und d) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz aus a) , b) oder c) , die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält, wobei die Polynukleotide für die α-Untereinheit der Nitrilhydratase kodieren.
4. Polynukleotide, ausgewählt aus der Gruppe: a) Polynukleotid bestehend aus den Positionen 1324 bis 1737 der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder der dazu komplementären Nukleotidsequenz, b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz aus a) im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entspricht, c) Polynukleotid, das mit den komplementären Sequenzen a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und d) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz aus a) , b) oder c) , die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält, wobei die Polynukleotide für das Helferprotein P15K kodieren.
5. Polynukleotide, ausgewählt aus der Gruppe: a) Polynukleotid bestehend aus den Positionen 2076 bis 3146 der Nukleotidsequenz SEQ ID N0:1 oder der dazu komplementären Nukleotidsequenz, b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz aus a) im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entspricht, c) Polynukleotid, das mit den komplementären Sequenzen a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und d) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz aus a) , b) oder c) , die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält, wobei die Polynukleotide für ein Protein mit der Aktivität eines Kobalttransporterskodieren.
6) Polypeptid gemäss 2) oder 3) enthaltend die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Nitrilhydratase aufweist.
7) Polypeptid gemäss 4) enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6, wobei das Polypeptid die Aktivität des Hilfsproteins P15 K aufweist.
8) Polypeptid gemäß 5 enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 5, wobei das Polypeptid die Aktivität eines Kobalttransporters aufweist.
9) Sonde oder Primer, enthaltend mindestens 20 aufeinanderfolgende Nukleotide innerhalb der Positionen 1 bis 1327 aus der Nukleotidsequenz SEQ ID N0:1 oder seiner komplementären Form.
10) Sonde oder Primer, enthaltend mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotide innerhalb der Positionen 1324 bis 1737 aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder seiner komplementären Form.
11) Sonde oder Primer, enthaltend mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotide innerhalb Positionen 2076 bis 3146 aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder seiner komplementären Form.
12) Isoliertes Polynukleotid gemäss 2) und 3), das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement mit den Positionen 1 bis 1327 aus SEQ ID NO:l hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen das Waschen in 5 x SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68°C beinhalten.
13) Isoliertes Polynukleotid gemäss 4), das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement mit den Positionen 1324 bis 1737 aus SEQ ID NO:l hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen das Waschen in 5 x SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68°C beinhalten.
14) Isoliertes Polynukleotid gemäss 5, das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement mit den Positionen 2076 bis 3146 aus SEQ ID NO:l hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen das Waschen in 5 x SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68°C beinhalten.
15) Vektoren enthaltend (ein) Polynukleotid (e) ausgewählt aus 1) bis 5) und 12) bis 14), oder gemäss 2), 3) und 4) oder gemäss 5) .
16) Vektor pUDl5, bestehend aus der Nukleotidsequenz SEQ ID No. 24, enthaltend die Sequenzen gemäss 2), 3), und 6) aus SEQ ID NO:l, wobei das Startkodon gtg in atg abgeändert wurde. 17) Vektor pUDl6, bestehend aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 25, enthaltend die Sequenz aus 5), wobei das Startcodon ttg in atg abgeändert wurde.
18) Wirtszelle, transformiert oder transfektiert durch die Einführung eines Polynukleotids gemäß 1) bis 5) und 12) bis 14) . Die Wirtszelle kann ein Eukaryont oder Prokaryont sein, für den ein Expressionssystem ausreichender Stabilität bekannt ist.
19) Wirtszelle, transformiert durch die Einführung eines Vektors gemäß 15) bis 17) .
20) Transformierte Wirtszelle gemäß 18) oder 19) wobei die Wirtszelle ein Bakterium der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia ist.
Vektor DNA kann in eukaryonische oder prokaryonische Zellen durch bekannte Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden.
„Transformation", „Transfektion" , „Konjugation" und „Transduktion" beziehen sich auf nach dem Stand der Techniken bekannten Maßnahmen, um fremde DNA einzuführen.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank von Rhodococcus opacus, die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit einer Sonde, die die Sequenzen der erfindungsgemäßen
Polynukleotide aus der SEQ ID No:l oder Fragmente davon enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise
Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die für die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenzen mit denen der erfindungsgemäßen Gene aufweisen. Sie können ebenso als Sonde auf sogenannte "arrays", "micro arrays" oder "DNA chips" aufgebracht werden, um die entsprechenden Polynukleotide oder hiervon abgeleitete Sequenzen wie z.B. RNA oder cDNA zu detektieren und zu bestimmen.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für die erfindungsgemäßen Proteine kodieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide, enthalten mindestens 25 oder 30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.
„Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt .
„Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.
Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen Polynukleotide gemäß SEQ ID No . 1 oder darin enthaltene Fragmente und auch solche ein, die zu wenigstens 90 %, 93 %, 95 %, 97 % oder 99% identisch sind mit den Polynukleotiden gemäß SEQ ID NO:l oder darin enthaltenen Fragmenten. Unter „Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid gemäß den Sequenzen SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 4 und
SEQ ID NO: 6, und auch solche ein, die zu wenigstens 90%, und besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit den Polypeptiden gemäß den Sequenzen SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6.
Die Polynukleotide SEQ ID NO:l enthält mehrere
EinzelSequenzen, die für unterschiedliche Proteine kodieren. Die Sequenzen für die α-Untereinheit und das Helferprotein P15K überlappen sich.
Die Gene, die für die α- und ß-Untereinheit der Nitrilhydratase kodieren, müssen gemeinsam exprimiert werden, um ein aktives Protein zu erhalten.
SEQ ID NO: 2 gibt die Aminosäuresequenz der ß-Untereinheit und SEQ ID NO: 3 die der α-Untereinheit des Proteins wieder, das Nitrilhydrataseaktivität zeigt.
SEQ ID NO: 2 leitet sich aus den Positionen 1 bis 708 und SEQ ID NO: 3 aus den Positionen 710 bis 1327 der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l ab.
Die Aminosäuresequenz des sogenannten Heiferproteins P15K findet sich in SEQ ID NO: 6, entsprechend den Positionen 1324 bis 1737 in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l.
Das Helferprotein aktiviert die Nitrilhydratase und muss zusammen mit diesem Enzym in dem die Nitrilhydratase bildenden Mikroorganismus vorhanden sein.
SEQ ID NO: 4 steht für die Aminosäuresequenz des Kobalttransporters und leitet sich aus den Positionen 2076 bis 3146 der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l ab. Das Startcodon ttg in SEQ ID NO: 4 wird von PatentlN Version 3.1 mit Leucin, das Startcodon gtg in SEQ ID NO: 6 mit Valin übersetzt. Es muss richtig heissen Methionin.
Es wurde gefunden, dass durch Co-Expression des Cobalttransporters die Nitrilhydrataseaktivität in E. coli um ein Vielfaches gesteigert wird. Dies gilt auch dann, wenn hohe Cobalt-Konzentrationen im Medium verwendet werden, die um Größenordnungen oberhalb der natürlich auftretenden Konzentrationen liegen. Überraschenderweise führt die co-Expression des Cobalttransporters nicht zu einer Vergiftung des Organismus sondern nur zu einer geringfügig gesteigerten Sensitivität der Zellen gegenüber hohen Cobaltkonzentrationen im Medium.
Zur Isolierung des erfindungsgemäßen Genclusters wird im allgemeinen zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al . : Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al . (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al . , 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al . , 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) angelegt wurde.
Zur Herstellung einer Genbank in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al . , 1982, Gene, 19:259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z.B. bei Sanger et al . (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977) beschrieben ist.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z.B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Bioche ical Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht werden.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus den in SEQ ID No. 1 enthaltenen Sequenzen durch die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit diesen Sequenzen oder Teilen von davon hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z.B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als „Sinnmutationen" („sense mutations") bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d.h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, daß
Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), bei O'Regan et al . (Gene 77:237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al . (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), bei Hochuli et al . (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID NO: 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 90% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996) .
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C - 68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit
Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User 's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C - 68°C eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,lx SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558) .
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) .
Im allgemeinen geht man so vor, dass man ein gut exprimierbares Gen in einen Vektor mit niedriger Kopienzahl, Gene mit schwächerer Expressionsleistung auf einem Vektor mit höherer Kopienzahl und/oder starkem
Promotor kloniert. Die Wirtszellen sind mit diesen Vektoren in der Weise transformiert, dass sie im Vergleich zum Startorganismus mindestens jeweils eine zusätzliche Kopie der für die Bildung von Nitrilhydratase bzw. der weiteren Proteine kodierenden Nukleotidsequenzen enthalten.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, das für den Kobalttransporter kodierende Gen in geringerem Umfang, beispielweise mit einem Vektor niedriger Kopienzahl - mindestens eine Kopie weniger - als die für die α- und ß- Untereinheiten und das Helferprotein P15K kodierenden Polynukleotidsequenzen zu exprimieren. Die unterschiedliche Expression der genannten Gene kann auch durch die Verwendung unterschiedlich starker Promotoren erreicht werden.
Die für die α- und ß-Untereinheit und das Helferprotein kodierenden Nukleotide liegen bevorzugt gemeinsam auf einem Vektor, mit einem gemeinsamen oder zwei getrennten Promotoren.
Die so hergestellten transformierten oder rekombinanten Mikroorganismen sind ebenfalls Teil der Erfindung.
Es wurde gefunden, dass die Verstärkung der für die Nitrilhydratase, das Helferprotein P15K und den Kobalttransporter kodierenden Gene in Mikroorganismen zu einer erhöhten Produktion der Nitrilhydratase oder auch zu einer erhöhten Aktivität der Nitrilhydratase führen.
Der Begriff „Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Promotor- und Regluationsregion oder die Ribosomehbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Aminosäure- Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht wer en.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % oder 500 %, maximal bis 1000 % oder 2000 %, bezogen auf die des Wildtyp-Proteins bzw. der Aktivität oder Konzentration des Proteins in nicht mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen transformierten Mikroorganismen erhöht.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von in den ausgewählten Host-Stämmen im allgemeinen autonom replizierbaren Vektoren, die miteinander kompatibel sind und mindestens Nukleotidsequenzen gemäß den Ansprüche 2, 3 und 4 oder eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 4 enthalten.
Vektor DNA kann in eukaryotische oder prokariotische Zellen durch bekannte Transformationstechniken eingeführt werden.
Als Host-Organismus dienen bevorzugt Mikroorganismen, für die es Expressionssysteme gibt, wie z. B. Pseudomonas, Pichia, verschiedene Hefen, Saccaromyces, Aspergillus oder der Familie Streptomyces, isbesondere E. coli.
Mikroorganismen der Gattung Rhodococcus sind ebenso geeignet. Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase mit dem Ursprung Rhodococcus, insbesondere Rhodococcus opacus oder dieses Enzym enthaltende Mikroorganismen, bei dem man
a) einen transformierten Mikroorganismus, der überexprimierte Gene mit den Nukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 enthält, in Gegenwart von 0,15 bis 4 mM (mmol/1) Co2+, insbesondere 0,3 bis 4 mM, unter Bedingungen fermentiert, die zur Bildung der Nitrilhydratase führen,
b) dieses Enzym im Mikroorganismus anreichern lässt, und
c) dieses Enzym aus den Zellen isoliert, oder
d) die Mikroorganismen erntet und als das Enzym enthaltende ruhende Zellen gewinnt.
Die rekombinante erzeugte Nitrilhydratase setzt α- Aminonitrile mit einer Aktivität von > 50 U/mg Biotrockenmasse um.
Bevorzugt fermentiert man in der Gegenwart von 0,5 bis 3,5 mM Co2+, insbesondere 0,7 bis 3 mM das bevorzugt als lösliches Salz der Fermentationsbrühe zugesetzt wird.
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) ) beschrieben. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C. , USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z.B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z.B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogen- phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z.B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff- haltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 10°C bis 40°C und vorzugsweise bei 10°C bis 30°C. Die Kultur wird bevorzugt mindestens solange fortgesetzt, bis sie die logarithmische Wachstumsphase durchschritten hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 70 Stunden erreicht.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Amiden aus Nitrilen, das folgende Schritte enthält:
a) Umsetzung einer Nitrilgruppen enthaltenden Verbindung mit einem Enzym aus Rhodococcus, insbesondere Rhodococcus opacus, das Nitrilhydratase-Aktivität aufweist, und
b) gegebenenfalls Abtrennung das Amids .
In einer Verfahrensvariante werden die Zellen geerntet, gewaschen und in einem Puffer als Suspension bei einem pH- Wert von 5 - 9, insbesondere von 6,8 bis 7,9 aufgenommen. Die Zellkonzentration der ruhenden Zellen beläuft sich auf im allgemeinen 1 - 25 %, insbesondere 1,5 bis 15 % (Feuchtgewicht/v) . Sie können mit physikalischen oder chemischen Methoden so permeabilisiert werden, z. B. Toluol wie bei Wilms et al . , J. Biotechnol . , Vol 86 (2001), 19 - 30 beschrieben, dass die umzuwandelnden Nitrilverbindungen die Zellwand durchdringen und das entstandene Amid austreten kann. Der Biokatalysator (Ganzzellkatalysator) zeigt eine ausgezeichnete Stabilität, so dass Produktkonzentrationen von über 100 g/1 erreicht werden können.
Es ist auch möglich, die erfindungsgemäße Nitrilhydratase aus den Zellen nach bekannten Methoden abzutrennen, sie gegebenenfalls aufzureinigen und zur Umsetzung der Nitrile einzusetzen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Verbindungen der allgemeinen Formeln
Figure imgf000022_0001
(I)
R"-CN (II) in der bedeuten:
X: OH, H,Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, Aryl , insbesondere NH2; R: H, gesättigter Alkylrest mit 1 bis 12 C-Atomen, verzweigt oder unverzweigt, gegebenenfalls mit NH2 substituiert, Alkenylreste mit 1 bis 12 C-Atomen, verzweigt oder unverzweigt, Cycloalkylgruppen mit 3 bis 6 C- Atomen, mit Alkylthiogruppen substituierte Alkylenreste, wobei Alkyl hier einem Ci bis C3-Rest und Alkylen einem zweiwertigen C3 bis C8-Rest entspricht, Rl: H, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen, R" : ein oder zweikerniger aromatischer Ring, mit 6 bis 12 C-Atomen, gegebenenfalls substituiert mit einer oder zwie Alkylgruppen (Cl - C3) oder Cl oder F, Alkylnitril mit 1 bis 6 C-Atomen.
zu den entsprechenden Amiden umsetzt.
Folgende Nitrile werden bevorzugt umsetzt:
gesättigte Mononitrile:
Acetonitril, Propionitril, Butyronitril, Isobutyronitril,
Valeronitril, Isovaleronitril, Capronitril
gesättigte Dinitrile: Malonitril, Succinonitril, Glutaronitril, Adiponitril
aromatische unsubstituierte und substituierte Mono- und
Dinitrile:
Benzonitril, 2, 6-Difluorbenzonitril, Phthalonitril,
Isophtalonitril , Terephthalonitril ,
ot-Aminonitrile: α-Aminopropionitril, α-Aminomethylthiobutyronitril, α- Aminobutyronitril, Aminoacetonitril, alle von natürlichen Aminosäuren abgeleiteten Nitrile, α-Amino-3,3- dimethylpropionitril α-Amino-2 , 3-dimethylpropionitril
Nitrile mit Carboxyl-Gruppen: Cyanessigsäure
ß-Aminonitrile : 3-Aminopropionitril
ungesättigte Nitrile: Acrylnitril, Methacrylonitril, Allylcyanid, Crotononitril
α-Hydroxynitrile : α-Hydroxy-n-propionitril, α-Hydroxy-n-butyronitril, α- Hydroxy-isobutyronitril, α-Hydroxy-n-hexanonitril, α- Hydroxy-n-heptanonitril, α-hydroxy-n-octyronitril, α, γ- Dihydroxy-ß,ß-dimethylbutyronitril, Acroleincyanohydrin, Methacrylaldehyd cyanohydrin, 3-Chlorolactonitril, 4- Methylthio-α-hydroxybutyronitril und α-Hydroxy-α- phenylpropionyl .
Die Konzentration der umzusetzenden Nitrile in der Reaktionslösung ist nicht auf bestimmte Bereiche begrenzt.
Um eine Inhibierung der Enzymaktivität durch das Substrat zu vermeiden, hält man die Konzentration des Nitrils im allgemeinen auf 0,001 bis 10 w/w%, insbesondere 0,1 bis 2 w/w%, bezogen auf die Menge des Biokatalysators als getrocknete Zellmasse. Das Substrat kann zu Beginn der Umsetzung insgesamt oder im Verlauf der Umsetzung kontinuierlich oder diskontinuierlich zugesetzt werden.
Wenn die Löslichkeit der NitrilVerbindung in dem wässrigen Reaktionssystem zu gering ist, kann ein Lösungsvermittler zugesetzt werden.
Die Reaktion kann aber alternativ auch in einem Zweiphasensystem Wasser/organische Lösungsmittel durchgeführt werden.
Bei der Verwendung von Zellen des Mikroorganismus als enzymatisch aktivem Material, verhält sich die Menge der eingesetzten Zellen zur Substratmenge bevorzugt auf 0,001 bis 8 w/w% als getrocknete Zellmasse.
Das Trockengewicht der Zellmasse wird mit einem Moisture Analyser MA45 (Sartorius) bestimmt.
Es ist auch möglich, das isolierte Enzym nach allgemein bekannten Techniken zu immobilisieren und in dieser Form dann einzusetzen.
Die Reaktion wird im allgemeinen bei Temperaturen von -5°C bis 50°C, insbesondere 0°C bis 30°C, und einer Zeitdauer von 0,1 bis 100 Stunden durchgeführt. Der einzuhaltende pH-Wert des Reaktionsgemisches ist so lange nicht auf bestimmte Werte begrenzt, wie die enzymatische Aktivität nicht beeinträchtigt wird. Nach der Umsetzung kann das gebildete Amid aus der Reaktionslösung wie bekannt abgetrennt und gereinigt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren, bei dem man das Amid bzw. die das Amid enthaltende Lösung z. B. von den Zellen der Biomasse abtrennt und das Amid entweder zu der entsprechenden Säure verseift oder unter Zusatz von Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxiden zu den entsprechenden Salzen der Säuren umsetzt. Bevorzugt wird MHA-Amid it Calciumhydroxid verseift und das entsprechende Calciumsalz isoliert.
Beispiele
Beispiel 1
Klonierung der Nitrilhydratase aus Rhodococcus opacus
Chromosomale DNA von Rhodococcus opacus wurde mit den Restriktionsenzymen PinAI, PstI und Xmal (Röche) verdaut und die Fragmente auf einem 0,8%igem Agarose-Gel aufgetrennt. Ein Southern Blot wurde nach Standard-Methoden (z. B. in Sambrook et al . : Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Pess, 1989) auf eine positiv geladene Nylon-Membran (Hybond-N+, Amersham) durchgeführt. Die Hybridisierung erfolgte mit einer DIG- markierten Sonde nach Anweisung des Herstellers (Röche) . Die Sonde wurde mittels PCR mit den degenerierten Primern IF und IR mit genomischer DNA als Template hergestellt. Die Primer waren von homologen Regionen der ß-Untereinheit abgeleitet, die durch Sequenz-AIignment verschiedener NHasen bestimmt wurden. Deren Sequenzen wurden aus
Datenbanken erhalten. Zur Isolierung eines detektierten ca. 2,2 kb großen PinAI-Fragmentes wurden mit PinAI geschnittene DNA-Fragmente zwischen 2 und 2,5 kb über präparative Gelelektrophorese aufgereinigt, in den mit Xmal geschnittenen Vektor pUClδ (Promega) ligiert und der Ligationsansatz in E. coli JM109 (Promega) transformiert. Positive Transformanten wurden über Kolonie-Hybridisierung mit der gleichen Sonde identifiziert. Die so erhaltenen Klone enthielten ein Insert von 2206 nt mit dem Gen der ß- Untereinheit und dem Großteil des Gens der α-Untereinheit der Nitrilhydratase.
Für die fehlende Sequenz wurde mit oben beschriebener Methode mit den Primern 2F und 2R eine neue Sonde hergestellt, die am 3 '-Ende des klonierten PinAI-Fragmentes hybridisiert. Als Template diente das in pUC18 klonierte PinAI-Fragment. Vor der Hybridisierung mit dieser Sonde wurden von der oben beschriebenen Membran zunächst die Farbsignale sowie die erste Sonde nach Anweisung des Herstellers (Röche) entfernt. Auf dieser Membran wurde mit der zweiten Sonde eine ca. 2 kb große Pstl-Bande detektiert. Wie oben beschrieben, wurde das entsprechende DNA-Fragment in den mit PstI geöffneten Vektor pUCl8 kloniert, das Produkt in E. coli JM109 transformiert und positive Klone über Kolonie-Hybridisierung identifiziert. Das Pstl-Fragment ist 1883 nt groß und enthält einen (3'-) Teil des Gens der α-Untereinheit der Nitrilhydratase, das Gen des Hilfsproteins P15K und einen (5'-) Teil des Gens des Kobalttransporters .
Um ein DNA-Fragment mit der fehlenden Sequenz des Kobalttransporter-Genes zu klonieren, wurde mit den Primern 3F und 3R und dem in pUClδ klonierten Pstl-Fragment als Template eine neue Sonde hergestellt, die am 3 '-Ende des klonierten PstI-Fragmentes hybridisiert. Mit dieser Sonde wurde auf der gleichen Membran, von der wiederum zuvor Farbsignale und die zweite Sonde entfernt worden waren, eine ca. 1,7 kb große Xmal-Bande detektiert. Das entsprechende DNA-Fragment wurde in den mit Xmal geöffneten Vektor pUClδ kloniert, das Produkt in E. coli JM109 transformiert und positive Klone über Kolonie- Hybridisierung identifiziert. Dazu wurde eine Sonde eingesetzt, die mit den Primern 4F und 3R amplifiziert worden war. Das Xmal-Fragment ist 1747 nt groß und enthält einen (3'-) Teil des Gens des Kobalttransporters.
Die fortlaufende Sequenz des Genclusters, der die Polynukleotide kodierend für die α-ß-Untereinheiten der Nitrilhydratase, des Hilfsproteins P15K und des Kobalttransporters enthält, ist in SEQ ID NO:l wiedergegeben.
Beispiel 2
Konstruktion der Expressionsvektoren
Die Strukturgene wurden in einen bekannten Expressionsvektor für E. coli kloniert, bei dem die eingefügten Gene unter der Kontrolle eines Rhamnose- Promoters stehen. Zusätzlich wurde ein zweiter Rhamnose-
Promoter eingefügt. Das Gen für die ß-UE wurde dazu mit den Primern 5F und 5R amplifiziert, die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Ndel, BamHI und Hindlll einfügten. Der zweite Rhamnose-Promoter wurde mit den Primern 6F und 6R amplifiziert, die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI, Ncol und Hindlll einfügten. Das Gen für die α-UE wurde mit den Primern 7F und 7R amplifiziert , die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Ncol, Kpnl und Hindlll einfügten. Das Gen für das Protein P15K wurde mit den Primern 8F und 8R amplifiziert, die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Kpnl und Hindllleinfügten und das Startcodon von GTG zu ATG änderten. Der so entstandene Expressionsvektor heißt pUD 15.
Die Restriktionskarte findet sich in Abbildung 1, die Sequenz unter SEQ ID NO: 24.
Das Gen für den Kobalttransporter wurde in einen anderen Expressionsvektor für E. coli kloniert, bei dem die eingefügten Gene auch unter der Kontrolle des Rhamnose-
Promoters stehen. Dazu wurde es mit den Primern 9F und 9R amplifiziert, die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Ndel und Hindlll einfügten und das Startcodon von TTG zu ATG änderten. Der so entstandene Expressionsvektor heißt pUD 16.
Die Restriktionskarte findet sich in Abbildung 2 , die Sequenz unter SEQ ID NO: 25.
Die Expressionsplasmide wurden in den Stamm E. coli DSM 14459 transformiert, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) hinterlegt ist.
Primer :
IF 5'-ATG AAY GGH ATY TC GA-3'
IR 5'-ATC CAG TGY YHG TAG TA-3'
2F 5'-CGA AGA CAT GAT CGT CGT G-3
2R 5 ' -ACC GGT CCC ACA CCG A-3'
3F 5'-TCG AGG AGA TCG GAG G-3'
3R 5' -GTA TCG AAG GTG CTC ATC-3 '
4F 5'-CGC GGG CTG GGT GAA- -3'
5F 5' -CGG CGG AAT TCA AGA AGG AGA CCC GCA TAT GAA CGG-3
5R 5' -GGT GCA AGC TTGGAT CCT GTC AGA TTC CTC GAG TAG-3 '
6F 5'-GCG AAG GAT CCT GCA TGC ATC GAA ATT AAT ACG-3 '
6R 5'-CAT CAA GCT TTT CGC CAT GGC TAT ATC TCC TTC-3 '
7F 5 '-CTG ACA GGA TCC AAG AAG GAG ATA TAG CCA TGG CCG A- ■3 '
7R 5'-GTT GCA AGC TTG GTA CCG CTC AAG ACA TCG CCT CCC T- •3'
8F 5'-GTG GGT ACC AAG AAG GAG GCG ATC ATA TGA GCA CGC-3
8R 5'-GCG GAC GAG TAG CGA AGC TTG TTA GTT CAC CG-3'
9F 5' -TCA AAG CTT GAA GGA GAT ATA CAT ATG ACG ATT ACT-3'
9R 5'-GTC AAG CTT GGT ACC GAC ATC TCA CAC CTT CGA-3 '
Die Gene befinden sich auf den Abschnitten:
pUDl5: Gen der ß-Untereinheit: nt 25 - 732 Gen der α-Untereinheit : nt 949 - 1566 Gen von P15K: nt 1592 - 2005
pUDl6: Gen des Kobalttransporters : nt 25 - 1095
Beispiel 3 Heterologe Expression der Nitrilhydratase in E. coli DSM 14559
DSM 14559 wurde im Zusammenhang mit der DE 101 55 928 hinterlegt .
Die mit pUDl5 transformierten Zellen wurden in LB-Medium (LB Bouillon nach Miller, VWR) , das 1 mM CoCl2 und 100 μg/ml Ampicillin enthielt unter Schütteln bei 37°C angezogen. Die Anzucht für die mit pUDl5 und pUDl6 transformierten Zellen wurde analog durchgeführt, das Medium enthielt aber zusätzlich 50 μg/ml Chloramphenicol. Die Zellen wurden danach noch 3 mal in das selbe Medium überimpft, nachdem sie mindestens eine OD60o von 2 erreicht hatten. Nach 12 - 16 Stunden wurde eine solche Menge der letzten Vorkultur in eine Hauptkultur überimpft, dass diese eine OD60o von 0,1 aufwies. Das Kulturmedium der Hauptkultur entsprach dem der Vorkultur, enthielt aber zusätzlich 2 g/L L-Rhamnose. Die Ernte der Zellen erfolgte nach 22 Stunden.
Beispiel 4
Bestimmung der enzymatischen Aktivität
Die Zellen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben angezogen, durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt und im Standardpuffer (50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5) resuspendiert. 50 μl dieser Zellsuspension wurden zu 700 μl des Standardpuffers gegeben und zum Starten der Reaktion mit 250 μl einer 200 mM Lösung des Nitrils in
Standardpuffer versetzt. Die Konzentration der Zellen in der Zellsuspension war hierbei so bemessen, dass das Nitril nach 10 min bei 20°C zu 5 - 30 % umgesetzt war. Nach 10 min bei 20°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 μl halbkonzentrierter Phosphorsäure abgestoppt und die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt.
HPLC-Analytik
Säule Intersil ODS-3V
Mobile Phase Gemisch aus 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 2,3 und Acetonitril im Verhältnis 85:15 für Methioninnitril, MHA-Nitril und Aceto- cyanhydrin bzw. 99:1 für alle anderen Substrate
Flussrate 1 ml/min
Detektion UV bei 200 nm
Die Aktivität von einem Unit (U) wurde definiert als die Menge an Enzym, die 1 μmol N-Formylvalinnitril in einer Minute zum Amid umsetzt. Die spezifische Aktivität wird in U pro mg Biotrockenmasse (U/mg BTM) angegeben.
Diese wird mit dem Moisture Analyser Modell MA45 (Sartorius) gemessen.
Beispiel 5
Co-Expression derfür die Nitrilhydrataseα-Untereinheit, die ß-Untereinheit und das Protein pl5K kodierenden Gene.
Die Expression wurde wie in Beispiel 3 beschrieben mit dem transformierten Stamm E. coli DSM 14459, der das Plasmid pUDl5 enthält, durchgeführt. Die spezifische Aktivität der Zellen betrug 23 U/mg BTM.
Beispiel 6
Co-Expression der für die Nitrilhydratase α-Untereinheit, die ß-Untereinheit, das Protein pl5K und das Kobalttransporter kodierenden Gene. Die Expression wurde wie in Beispiel 3 beschrieben mit dem transformierten Stamm E. coli DSM 14459, der die Plasmide PUD15 und pUDl6 enthält, durchgeführt. Die spezifische Aktivität der Zellen betrug 81 U/mg BTM. Beispiel 7
Substratspezifität
Verschiedene Nitrile wurden analog zu Beispiel 3 mit ruhenden transformierten E. coli DSM 14459 Zellen, die das Plasmid pUDl5 enthalten, umgesetzt. Die spezifische Aktivität, die mit N-Formylvalinnitril erhalten wurde, wurde gleich 100 % gesetzt. Die anderen Aktivitäten wurden relativ dazu angegeben. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 wiedergegeben.
Beispiel 8 Wachstum von transformiertem E. coli DSM 14459 in Gegenwart von Co 2 +-Salzen
Transformierte E. coli DSM 14459 Zellen, die entweder nur das Plasmid pUDl5 oder pUDl5 und pUDl6 enthalten, wurden wie in Beispiel 3 beschrieben, angezogen. Die Cobaltkonzentration im Medium wurde dabei von 0,5 bis 2 mM variiert. Nach 24 Stunden wurde die optische Dichte der Kultur bei δOOnm gemessen.
Figure imgf000032_0001
Es zeigt sich, dass auch bei hohen Cobaltkonzentrationen nur ein geringer Einfluss auf das Wachstum der Zellen festzustellen ist.
Beispiel 9
Umsetzung von Methioninnitril mit transformierten E. coli DSM 14459 Ruhezellen, die das Plasmid pUDl5 enthalten.
E. coli DSM 14459 Zellen, die das Plasmid pUDl5 enthalten, wurden wie in Beispiel 3 beschrieben, angezogen und abzentrifugiert . 2,8 g der Zellen, bezogen auf das Feuchtgewicht, wurden in 47,2 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH7 , 5 resuspendiert und Methioninnitril bei 20°C unter heftigem Rühren kontinuierlich mit einer solchen Rate zugegeben, dass die Konzentration während der Reaktion 15 g/L zu keinem Zeitpunkt überschritt. Der pH wurde konstant bei 7,5 gehalten. Die Reaktionsverfolgung wurde mittels
HPLC wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Nach 320 min waren 9,1 g des Nitrils vollständig zu 10,4 g Amid umgesetzt worden. Das entspricht einer Konzentration von 176 g/L.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1
Plasmid pUDl5 rhaP Rhamnose-Promotor beta Gen der ß-Untereinheit der Nitrilhydratase alpha Gen der α-Untereinheit der Nitrilhydratase P15K Gen des Hilfsproteins P15K ori Replikationsorigin bla Gen für Ampicillin-Resistenz (ß-Lactamase)
Abbildung 2
Plasmid pUDlδ rhaP Rhamnose-Promotor
CoTrans Gen des Kobalttransporters ori Replikationsorigin
Cmr Gen für Chloramphenicol-Resistenz
Abbildung 3
Relative spezifische Aktivität bei der Umsetzung verschiedener Nitrile im Vergleich zur Aktivität bei der Umsetzung von N-Formylvalinnitril.
BUDAraSTE VERTRAG ÜBER DIE -NΓERNATIONAU! ANERJ E NUNO DER KNIH EOUNO VON MIKROORGANISMEN FOR DIE ZWECKE VW PATENTVEWAKREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Degussa AG Projekcha s Biotechnologie Ro enbac &r Chaussee 63457 Hä-nau EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHr TCR -OUNO. wαge(Ulll EcmtB Regel 7.1 von der «meo angegebene!» INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
(. KENNZEICHNUNG DES MlKROORCA IS Ui
Vom K-NTER1EGER zugeteilte» BozuβneiO-aa! Von der INTERNATIONALEN HIMΕRlJEGUNGSiπEfcLE agcttilte ETNGΛNGSNUMMER:
JM10J) (deltarhaB) DSM 14459 '
II. WISSENSCHAFTUCHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TΛXONOMßCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter t. bcuichnatun Mi rαoiganixαM.. wurde
( ) eine wi-sβαxfaitαicha Be_chreibυ«e ( ) olnc vorε-«lil«8cnc Ronomάchβ Bezeichnung eϊnceteioht (ZvtPeCβndea oitlcrouxcn).
LU. EINGANG UND ANNAHME
Die« intcnuulonate K ilerlegungyMellc nimmt den unter I bαcichneen Müuoorg-nl-mιι. an, der bei ihr αro 2001- 06 - 22 (Datum der Erjthbrrterlcεung)' eingegangen ist.
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezelclnete Mikreorgacism . I« bei dieser Intcmatiαnaleo Himer)-r. n|p-.t- l- am eic-s-pingcn (Danim der Erst- hin-ulβeune) und oin Anonε auf Uπmniuilvnς dieser EKtfilnteflegung in eine Kin-erlcgung g -πiB Bud.ιρe-.cr Vemg ist um (Darum de* Eingangs du Antragi auf OπrwiiftdlimtO
V. rNTEKNATIONALE H-KTERLEGUNGSSTELLE
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INTERNATIONALES FORMBLATT
Degussa AG Pro ekthaus Biotechnologie Rodenbacher Chaussee 63457 Hanau LEBENSFÄfπG £rrSaeSCHET IGUNG ausgestellt gemaβ Regel ) 0.2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE;
[. HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS ame: Degussa AG Ve d*τ INTERNATIONALEN HlNrεRLEGUNσSSTΪΛ.LE Proj ekthaus Biotechnologie rugc-.ni- EINGΛNG5NUMMER: Anschrift; Rodenbacher Chaussee DSM 144 S 9 63457 Hanau Datum der Hinterlegung oder WcitoricJnmg': 2001 - OΘ -22
m. LEHENSrAlflOKElTSBESCHEINlGUNO
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rv. BEDINOUNOEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGRETTSPROFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST4
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name; DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Umtπchrift(en) «er zur Veriretüng der internaliovtalen Hiήκrtcgung.stellc| MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN CmbW befugten Pt.son(.n) oder des (der) vnn ihr crmilchtiς-.n Bediensteten:
Anschrift Maschenjdcf Wog lb D- II2 »ra-nschweig Datum: 20 (0/1-0.6 -2 ü4 £'
Angab« dπ Datums der Enthuiterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Wciierleitune vorgenommen worden in. Ang bo des Daums dar Jawalli letztem erneuten I-CntcrJegung oder Weitcrlcϊtung. In den in Rogcl 10.2 Buchstabe a Ziflar ü und iii o(gesβbenci) Fallen Angnhc dot lo ian Lebon-rMugkelt-prufting. Zutreffendes ankreuzen. Ausr-Ilcn, wenn die Angaben cvurtig. worden sind und wenn die Ergebnisse im PrUTunj; negativ ftn.
Hormblβtl DSMZ-8P/0 (einstige Seite) 019.

Claims

Patentansprüche
1. Isolierte Polynukleotidcluster aus Rhodococcus opacus, enthaltend vier Nukleotidsequenzen, die für vier Polypeptide mit Aminosäuresequenzen kodieren, die zu jeweils mindestens 90 % identisch sind mit dem in den Sequenzen SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 5 enthaltenen Aminosäuresequenzen, wobei die Polypeptide die Aktivitäten einer Nitrilhydratase, bestehend aus α- und ß-Untereinheit, des Hilfsproteins P15K und eines Kobalttransporters besitzen.
2. Polynukleotide gemäss Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe : a) Polynukleotid bestehend aus den Positionen 1 bis 708 der Nukleotidsequenz SEQ ID N0:1 oder der dazu komplementären Nukleotidsequenz, b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz aus a) im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entspricht, c) Polynukleotid, das mit den komplementären Sequenzen a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und d) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz aus a) , b) oder c) , die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält, wobei die Polynukleotide für die ß-Untereinheit der Nitrilhydratase kodieren.
3. Polynukleotide gemäss Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe : a) Polynukleotid bestehend aus den Positionen 710 bis 1327 der Nukleotidsequenz SEQ ID N0:1 oder der dazu komplementären Nukleotidsequenz, b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz aus a) im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entspricht, c) Polynukleotid, das mit den komplementären Sequenzen a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und d) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz aus a) , b) oder c) , die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält, wobei die Polynukleotide für die α-Untereinheit der Nitrilhydratase kodieren.
4. Polynukleotide gemäss Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe : a) Polynukleotid bestehend aus den Positionen 1324 bis 1737 der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder der dazu komplementären Nukleotidsequenz, b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz aus a) im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entspricht, c) Polynukleotid, das mit den komplementären Sequenzen a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und d) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz aus a) , b) oder c) , die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält, wobei die Polynukleotide für das Helferprotein P15K kodieren.
5. Polynukleotide gemäss Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe : a) Polynukleotid bestehend aus den Positionen 2076 bis 3146 der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder der dazu komplementären Nukleotidsequenz, b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz aus a) im Bereich der Degeneriertheit des genetischen Codes entspricht, c) Polynukleotid, das mit den komplementären Sequenzen a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und d) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz aus a) , b) oder c) , die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält, wobei die Polynukleotide für den Kobalttransporter kodieren.
6. Polypeptid gemäss Anspruch 1, enthaltend die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Nitrilhydratase aufweist.
7. Polypeptid gemäss Anspruchl, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4, wobei das Polypeptid die Aktivität des Hilfsproteins P15K aufweist.
8. Polypeptid gemäß Anspruch 1, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 5 wobei das Polypeptid die Aktivität eines Kobalttransporters aufweist.
9. Sonde oder Primer, enthaltend mindestens 20 aufeinanderfolgende Nukleotide innerhalb der Positionen 1 bis 1327 aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder seiner komplementären Form.
10. Probe oder Primer, enthaltend mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotide innerhalb der Positionen 1324 bis 1737 aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder seiner komplementären Form.
11. Sonde oder Primer, enthaltend mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotide innerhalb Positionen 2076 bis 3146 aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l oder seiner komplementären Form.
12. Isoliertes Polynukleotid gemäss Anspruch 2, das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement mit den Positionen 1 bis 1327 aus SEQ ID NO:l hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen das Waschen in 5 x SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68°C beinhalten.
13. Isoliertes Polynukleotid gemäss Anspruch 4, das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement mit den Positionen 1324 bis 1737 aus SEQ ID NO:l hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen das Waschen in 5 x SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68°C beinhalten.
14. Isoliertes Polynukleotid gemäss Anspruch 5, das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement mit den Positionen 2076 bis 3146 aus SEQ ID NO:l hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen das Waschen in 5 x SSC bei einer Temperatur von 50 bis 68°C beinhalten.
15. Vektoren, enthaltend (ein) Polynukleotid (e) ausgewählt aus denen gemäss den Ansprüchen 1 bis 5 und 12 bis 14, oder gemäss den Ansprüchen 2, 3 und 4 und gemäss Anspruch 5.
16. Vektor pUDl5, bestehend aus der Nukleotidsequenz SEQ ID No. 23.
17. Vektor pUDl6, bestehend aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 24.
18. Wirtszelle, transformiert oder transfektiert durch die Einführung eines Polynukleotids gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 und 12 bis 14.
19. Wirtszelle, transformiert durch die Einführung eines Vektors gemäss den Ansprüchen 15 bis 17.
20. Wirtszelle, transformiert durch die Einführung der Vektoren pUDl5 und pUDlδ.
21. Transformierte Wirtszelle gemäß den Ansprüchen 18 oder 19 wobei die Wirtszelle ein Bakterium der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia ist.
22. Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase mit dem Ursprung Rhodococcus, insbesondere Rhodococcus opacus oder dieses Enzym enthaltende Mikroorganismen, bei dem man a) einen transformierten Mikroorganismus, der überexprimierte Gene mit den Nukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 enthält, in Gegenwart von 0,15 bis 4 mM Co2+, unter Bedingungen fermentiert, die zur Bildung der Nitrilhydratase führen, b) dieses Enzym im Mikroorganismus anreichern lässt, und c) dieses Enzym aus den Zellen isoliert, oder d) die Mikroorganismen erntet und als das Enzym enthaltende ruhende Zellen gewinnt.
23. Verfahren gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass man Wirtszellen gemäss den Ansprüchen 18 bis 21 einsetzt.
24 Rekombinant erzeugte Nitrilhydratase mit dem Ursprung Rhodococcus opacus, die α-Aminonitrile mit einer spezifischen Aktivität von > 50 U/mg Biotrockenmasse umsetzt .
25. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Amiden aus Nitrilen, das folgende Schritte enthält: a) Umsetzung einer Nitrilgruppe enthaltenden Verbindung mit einem Enzym aus Rhodococcus, insbesondere Rhodococcus opacus, das Nitrilhydratase-Aktivität und eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 90 % mit den aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 bekannten Sequenzen identisch ist, und b) Abtrennung des Amids .
26. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man das gereinigte und gegebenenfalls immobilisierte Enzym einsetzt.
27. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzym enthaltende ruhende Zellen einsetzt.
28. Verfahren gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet ist, dass man Verbindungen der allgemeinen Formel
Figure imgf000042_0001
(I) und
R"-CN (II) in der bedeuten: X: OH, H, Alkylmit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere NH2; R: H, gesättigter Alkylrest mit 1 bis 12 C-Atomen, verzweigt oder unverzweigt, gegebenenfalls NH2- substituiert, Alkenylreste mit 1 bis 12 C-Atomen, verzweigt oder unverzweigt, Cycloalkylgruppen mit 3 bis 6 C- Atomen, mit Alkylthiogruppen substituierte Alkylenreste, wobei Alkyl hier einem Ci bis C3-Rest und Alkylen einem zweiwertigen C3 bis Cs-Rest entspricht, Rλ : H, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen, R" : ein- oder zweikerniger ungesättigter Ring mit 6 bis 12 C-Atomen, gegebenenfalls mit einer oder zwei Alkylgruppen (Cl - C3), Cl, Br, F substituiert, einwertiger Alkylnitrilrest mit 1 bis 6 C-Atomen, zu den entsprechenden Amiden umsetzt.
29. Verfahren gemäss den Ansprüchen 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass man das Amid bzw. die das Amid enthaltende Lösung von den Zellen der Biomasse trennt und das Amid zu der entsprechenden Säure verseift.
30.Verfarhen gemäss den Ansprüchen 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass man das Amid bzw. die das Amid enthaltende Lösung von den Zellen der Biomasse trennt und das Amid mit Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxiden zu den Salzen der entsprechenden Carbonsäure verseift.
31. Verfahren gemäss Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass man MHA-Amid mit Calciumhydroxid verseift und das Calciumsalz gewinnt.
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