WO2005092922A2 - Antigen des pm-2 antikörpers und dessen verwendung - Google Patents
Antigen des pm-2 antikörpers und dessen verwendung Download PDFInfo
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Classifications
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Definitions
- the invention relates to a polypeptide which is expressed as a membrane-bound protein on the cell surface, which is glycosylated at one or more sites (membrane glycoprotein) and whose amino acid sequence is partially or entirely that of the integrin binding protein p80 (accession # AJ 131720) or REV1 ( accession # AF206019).
- the invention relates to the use of the polypeptide according to the invention in tumor treatment, tumor diagnosis and in tumor research.
- Cancer patients are already at an advanced stage of the disease at the time of initial diagnosis.
- the search for new anti-cancer agents also plays a major role, e.g. by inhibiting cell proliferation or by initiating
- Apoptosis Apoptotic receptors on the cell surface, such as those of the NGF / TNF family, are predominantly expressed on lymphocytes, but are also found on various other cell types, which is why they are disadvantageously unsuitable for cancer therapy. NEN.
- ligands and antibodies for these receptors have resulted in liver damage.
- Tumor-specific receptors (antigens) with apoptotic function which are expressed on the cell surface of neoplastic cells, are therefore particularly important for cancer therapy. This applies in particular against the background that the identification and isolation of human monoclonal antibodies with an apoptotic effect is increasingly successful.
- hybridoma technology has successfully isolated a series of tumor-specific IgM antibodies from the tissue of cancer patients and from the tissue of healthy donors.
- two human monoclonal tumor-specific antibodies and their antigens have already been identified.
- the human monoclonal antibody SC-1 specifically binds to the CD-55 receptor (Cancer Research, 1999 Oct. 15, 59 (20), 5299-5306, Hensel et. Al)
- the human monoclonal PAM-1 antibody specifically binds to the CFR- 1 receptor binds (Oncol. Rep. 2004, Apr. 11 (4), 777-784, Brändlein et. Al).
- Human monoclonal antibodies of this type are thought to play a major role in the treatment and diagnosis of cancer. Their importance for cancer therapy lies in the induction of apoptosis and / or inhibition of cell proliferation after specific binding to the corresponding antigens (receptors) on the surface of neoplastic cells.
- Apoptosis is programmed cell death, i.e. H. Suicide of cells by fragmentation of the DNA, cell shrinkage and dilation of the endoplasmic reticulum, followed by cell fragmentation and the formation of membrane vesicles, the so-called apoptotic bodies. It is the most common cause of death for eukaryotic cells and occurs in embryogenesis, metamorphosis and tissue atrophy. As the physiological form of cell death, apoptosis guarantees a quick and clean removal of unnecessary cells without triggering inflammatory processes or tissue injuries as in the case of necrosis. Under pathological conditions, apoptosis also serves to remove malignant cells, such as cancer precursor cells. Apoptosis can be triggered by a wide variety of stimuli, such as cytotoxic T lymphocytes or cytokines such as tumor necrosis factor, glycocorticoids and antibodies.
- stimuli such as cytotoxic T lymphocytes or cytokines such as tumor necrosis factor, glycocorticoids and antibodies.
- Membrane glycoproteins have sugar residues (Glycokalix) on their extracellular side, which are either bound to the amide nitrogen of an asparagine side chain (/ -binding) or to the oxygen atom of a serine or threonine side chain (O-bond).
- the sugar directly linked to the side chain is mostly N-acetylglucosamine or ⁇ / -acetylgalacatosamine.
- Carbohydrates can form very diverse structures.
- different monosaccharides can be linked to one another via one or more OH groups.
- those on the C-1 atom connecting links have an ⁇ or ⁇ configuration. Using these different linkages, glycomembrane proteins can have extensive branches made up of oligosaccharides.
- the carbohydrate structure (glycosylation pattern, glycocalyx) on the cell surface is of an informational nature for intercellular recognition.
- the immune system uses the glycosylation pattern for recognition and adsorption to the target cell, the structural basis for the process of this
- Integrins are proteins coupled to the surface of cells, the lipophilic part of which spans the cell wall (transmembrane proteins) and whose extracellular components are glycosylated (glycomembrane proteins). Through a process known as adhesion, integrins mediate the binding of cells to the extracellular matrix and to other cells. In addition to the amino acid sequence of the integrins and the three-dimensional protein structure, the structure of the sugars bound to the integrins is responsible for the selectivity of the binding. Integrins are heterodimers that are composed of one and one ⁇ subunit, with about 10 different ⁇ subunits and at least twice as many different ⁇ subunits. The resulting variability for the Integrine receptor type alone explains that the
- integrins are particularly effective in signal transduction, i.e. in the transmission of information from extracellular signals to the inside of the cell and from the inside of the cell to the outside. Adhesion and subsequent signal transmission into the cell interior trigger intracellular processes that can lead to the restructuring of the cytoskeleton and the induction of signal cascades. Integrin binding proteins are the binding partners of the integrins in adhesion.
- Cell adhesion processes have a regulatory effect on the expression pattern and thus on the specificity of the receptors themselves. Cell adhesion mechanisms are therefore important for cell growth, cell migration and differentiation, and they are particularly involved when cells lose their specialized forms and become cancer cells that can be metastasized.
- neoplasm An abnormal tissue mass is called neoplasm or tumors, the growth of which is autonomous (regardless of growth factors), uncoordinated, aimless and progressive.
- Tumors consist of two components. Firstly, the parenchyma cells, which are also called neoplastic cells, and the non-tumorous stroma, ie the connective tissue and the blood vessels.
- a neoplastic cell is a cell that is subject to uncontrolled cell division or a cell that does not have an apoptosis mechanism. has mus.
- a neoplastic cell in the sense of the invention can also have both disorders and can also be distinguished by the fact that its Zeil cycle deviates from the normal Zeil cycle.
- the human REV-1 also known from the prior art
- Protein (accession # AF206019) also has sequence homology to the antigen according to the invention, at least in sections.
- a deoxycytidyl transferase activity is reported as a function of REV1. The deoxycytidyl transferase presumably catalyzes the binding of deoxycytidylate to the daughter DNA
- REV1 is therefore not a membrane-bound protein and is located in the nucleus.
- polypeptides with the same amino acid sequence can be present on the one hand as membrane-bound proteins and on the other hand as proteins in the cell nucleus shows that the post-translational modifications, such as glycosylation, play a major role with regard to the location and function of a polypeptide len and one cannot assume an identity of such proteins despite sequence homology.
- the object of the invention is to identify and characterize an antigen to which the tumor-specific human monoclonal antibody PM-2 binds (DSM entry number: DSM ACC2600), and in the use of the antigen for tumor treatment and tumor diagnosis.
- the PM-2 antibody (DE 102 30 516 A1) is a human monoclonal antibody with heavy and light chain molecules, each of which has an antibody-to-antibody constant and an antibody-to-antibody variable region or a functional fragment thereof, wherein at least one of the variable regions of the light chain substantially each in SEQ
- the PM-2 antibody was produced using the hybridoma technique, the hybridoma cells (DSM ACC2600) being obtained by fusion of the hetero-myeloma cells HAB-1 and their subclones with P lymphocytes.
- DSM ACC2600 the hybridoma cells
- Lymphocytes were preferably taken from a lymphoid organ, the spleen or lymph nodes of a carcinoma patient.
- the human monoclonal antibody PM-2 is characterized by the fact that after specific binding to the corresponding PM-2 antigen on the surface of a neoplastic cell in it
- the invention teaches a glycomembrane protein with antigenic properties, which is characterized in that it is - expressed by neoplastic cells and not by non-neoplastic cells, and - as an antigen, the human monoclonal antibody PM-2 (DSM entry number: DSM ACC2600) binds specifically, and - ⁇ / -glycosidic and O-glycosidic is glycosylated.
- the antigen of the invention is tumor specific, i.e. it is only expressed by neoplastic cells. Glycosylation, which is ⁇ / -glycosidic and O-glycosidic, is responsible for the specific binding of the human monoclonal antibody PM-2 (DSM entry number: DSM ACC2600) to the antigen according to the invention.
- the fact that the p-80 protein integrin binds may provide an indication of the role that the antigen according to the invention plays in the development of tumors. Integrins are important as cell adhesion molecules in angiogenesis. Thus, the ⁇ Vß3 integrin is expressed by the endothelial cells of those vessels that supply tumors. It would be conceivable that the antigen according to the invention, which was detected in the epithelial cells of the blood vessels, also interacts with integrins and that its inhibition has an effect similar to the inhibition of angiogenesis. It is also known that integrins play an important role in the metastasis of tumor cells by reducing the adhesion of the over the blood streams made it possible for tumor cells to be transported into previously tumor-free tissue.
- the / V-glycosidically bound glycostructures presumably play a special role for the specific binding of the antibody PM-2 according to the invention.
- the precise analysis of the glycosylation sites is determined using software known to the person skilled in the art (software of the database of the "UK MRC Human Genome Mapping Project" http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/prot-anal.html).
- REV1 has ⁇ / glycosylation in particular at the amino acid positions 810, 830, 927 and 1045.
- the antigen identified with the help of the human monoclonal antibody is composed of one monomer or of several identical subunits.
- the possibility that it is a homomer of two identical subunits (dimer) or is associated with other proteins could also explain that the molecular weight that can be indicated by means of immunoblot (Western plot) has hitherto varied within a wide range.
- the cells expressing the protein have already been mentioned in connection with the characterization of the PM-2 antibody. Therefore, reference is made here to document DE 102 305 156 A1.
- the hybridoma cell line, which produces the antibody PM-2 is under the Budapest Treaty on the international recognition of the
- Carcinoma cells of the cell line BXPC3 (ATCC number CRL1687) are used because the antigen is particularly well expressed on their surface.
- the antigen is expressed on the surface of epithelial cells in the tumor tissue.
- the therapeutic potential of the antigen according to the invention which consists in that after the PM-2 antibody has bound to the antigen, apoptosis is induced in a neoplastic cell.
- apoptosis is induced in a neoplastic cell.
- due to the specific binding of the PM-2 antibody to the antigen on the surface of neoplastic cells inhibits their cell proliferation.
- a method for isolating the antigen according to the invention was developed. After homogenization and solubilization in a detergent known to the person skilled in the art the antigen was purified by chromatography. Size exclusion chromatography is used in particular. In an improvement of the isolation process it is conceivable that the size exclusion chromatography is followed by a further step in the form of an anion exchange chromatography. This second purification step improves the purity of the isolated glycomembrane protein.
- the antigen isolated in this way can be used to prepare a medicament using the customary pharmaceutical auxiliaries and carriers.
- the purified antigen is administered in vivo in a physiological NaCl solution.
- the purified glycomembrane protein is used as an antigen to identify specific binding ligands or adhesion peptides.
- the polypeptides identified in this way correspond only in sections to the sequence of the human monoclonal antibody PM-2, but nevertheless in neoplastic
- the adhesion peptides or ligands can be coupled to a radionucleotide, a cytotkin, a cytokine or a growth inhibitor.
- the glycomembrane protein according to the invention is used as an antigen in the identification of active substances in the context of high-throughput screening. Such methods and their configurations are known to the person skilled in pharmaceutical research.
- the use of the antigen according to the invention as a tumor marker is also provided within the scope of the invention.
- the detection of the membrane glycoprotein according to the invention can be carried out on the surface of neoplastic cells with the aid of the PM-2 antibody. With the aid of the vector insert specified in sequence listing 1 and 2, it was possible, inter alia, to prove in an antisense experiment that the membrane glycoprotein according to the invention is the antigen for the specifically binding human monoclonal antibody PM-2.
- the carcinoma cell line BXPC-3 (ATCC ⁇ number CRL1687) was used to obtain the receptor.
- Western blot analysis also used the well-known gastric adenocarcinoma cell line 23132/87 (DSMZ entry number DSM201) (Hensel et al. 1999, Int.J. Cancer 81: 229-235).
- the cells were grown to 80% confluency in RPMI-1640 (PAA, Vienna Austria) supplemented with 10% FCS and penicillin / streptomycin (1% for both). For the studies described, the cells were separated with trypsin / EDTA and washed twice with phosphate-buffered saline (PBS).
- PBS phosphate-buffered saline
- BXPC-3 implemented. Shown in abbreviated form, the connected tumor cells were washed twice with PBS, detached with a cell scraper and centrifuged, and dissolved in a hypotonic buffer (20 M HEPES, 3 mM KCI, 3mM MgCI 2 ). After a 15 min. Incubation time on ice and an ultrasound treatment for 5 min., The cores were pelleted by centrifugation at 10,000 g for 10 min. The supernatant was centrifuged for 30 min at 100,000 g in a swing-out rotor and the membrane was thereby pelletized.
- a hypotonic buffer (20 M HEPES, 3 mM KCI, 3mM MgCI 2 .
- the purification of the antigen was carried out with column chromatography using a Pharmazia (Freiburg, Germany) FPLC unit.
- a Pharmazia Superdex 200 (XK 16/60) column was loaded with 5 mg of the membrane preparation and operated with a buffer A (100 mM Tris / Cl, pH 7.5.2 mM EDTA, 40 mM NaCl , 1% Triton X-100). Then the eluate was fractionated and examined for reactions with the antibody PM-2 by Western blot analysis. The positive fractions were placed on a MonoQ (5/5 column) using buffer A.
- the bound proteins were washed out using a linear gradient using buffer B (100 mM Tris / Cl, pH 7.5.1 M NaCl, 2 mM EDTA, 1 M NaCl, 1% Triton X-100), fractionated and with Coomas- stained SDS-PAGE and Western blot analysis were examined.
- buffer B 100 mM Tris / Cl, pH 7.5.1 M NaCl, 2 mM EDTA, 1 M NaCl, 1% Triton X-100
- the amplification was carried out using the following cycle profile: 95 ° C., 2 min; subsequently 35 cycles at 94 ° C, 30 sec; 60 ° C, 30 sec; 72 ° C 60 sec. And finally 72 ° C, 4 min.
- the cloning into the pCR script Amp SK (+) vector and the sequencing of the DNA was carried out as previously described (Hensel et al., 1999 Int.J. Cancer 81: 229-235).
- the insert was cut out from the pCR script Amp SK (+) vector with appropriate restriction enzymes and subcloned into the pHook-2 vector (Invitrogen, Leek, Netherlands).
- Clones were checked for successful cloning by sequencing. A clone was chosen in which the coding sequence was cloned in the antisense direction to the promoter. This clone was amplified and vectors for antisense transfection isolated.
- the transfection of the cell line BXPC-3 with pHook2-anti PM-2-R was completed with a prime factor reagent (PQLab, Er Weg, Germany) according to the supplier manual.
- the plasmid DNA was diluted to 10 ⁇ g / ml and the prime factor reagent was added 1:10 to a serum-free growth medium.
- the diluted plasmid DNA (450 ⁇ l), the diluted primer factor reagent supplement (90 ⁇ l) and the serum-free growth medium (460 ⁇ l) were mixed and incubated at room temperature.
- 60 ml cell culture dishes (70% confluent) were washed twice with the Washed rum-free growth medium and then added the prime factor / DNA mixture dropwise.
- the cells were incubated for 18 hours at 37 ° C. and 7% CO 2 , then the serum-free growth medium was replaced by a growth medium with 10% FCS and the cells were incubated for a further 24 hours before the expression of the receptor protein was examined.
- cytospins Digestion with N-glycosidase on cytospins
- the cells used were detached from the base of their culture bottles using trypsin / EDTA and then incubated for 1 h in RPMI-1640 medium + 10% FCS at 4 ° C. Then cytospin preparations were made with the cells. The cytospins were dried at RT overnight. After drying, the cells were fixed with 100% acetone for 10 min and washed three times with PBS. The fixed cells were then digested with 5 mU / ml N-glycosidase (in 100 ⁇ l phosphate buffer, pH 7.0) in the incubator at 37 ° C. for 3 hours.
- cytospin preparations were then washed three times with PBS and immediately the immunohistochemical staining with the various antibodies pern fed. Cytospins that were only incubated with phosphate buffer or cytospins that were subjected to normal immunohistochemical staining without glycosidase treatment served as a negative control. The coloring was carried out as described. The finished staining was then evaluated microscopically and the results documented with a photo system and an Olympus microscope.
- cytospins Digestion with O-glycosidase on cytospins
- the cells were trypsinized and reconstituted for 1 h in culture medium on ice.
- the cells were incubated with 20 ⁇ U / ml O-glycosidase (in 100 ⁇ l phosphate buffer, pH 6.8) at 37 ° C. for 3 h.
- O-glycosidase in 100 ⁇ l phosphate buffer, pH 6.8
- the cells were extracted, washed and diluted to 1 ⁇ 10 6 cells per ml. 1 ml of the cell solution was centrifuged at 1,500 g for 5 min. The antibody diluted to 40 ⁇ g / ml with complete RPMI is added to a final volume of 1 ml and incubated on ice for 90 min. Then they will
- the cytospins are prepared, air-dried at room temperature and, as described above, fixed in acetone. Then the cytospins are blocked for 15 min with PBS / BSA (0.1%) and incubated for 30 min with 10 ⁇ g / ml primary antibody and then washed three times. The incubation with the secondary antibodies and the staining is carried out as described above.
- FIG. 1 shows the influence of glycosidase digestion on the antibody binding of PM-2 on the cell surface of the pancreatic carcinoma cells BXPC-3. After digestion, the cytospins were stained immunohistochemically with the positive control CAM keratin (A, C, E) and with PM-2 (B, D, F).
- Pictures A and B in Fig. 1 show the controls after incubation of the cells in glycosidase buffer without enzyme.
- Pictures C and D show the effects of the / V-glycosidase incubation on the binding of the antibody PM-2 to the pancreatic carcinoma cells. After digestion with the enzyme ⁇ / -Glycosidase, the antibody PM-
- FIG. 1E and F show the effects of the O-glycosidase incubation on the binding of the antibody PM-2. While the positive control CAM keratin in image E shows no change in color, it is shown after digestion with the enzyme O-glycosidase that the cells can no longer be stained with the antibody PM-2. This suggests that in addition to ⁇ / -bonded sugars, at least one O-glycosidically bound determinant of the antigen was also responsible for the specific binding of the PM-2 antibody.
- Fig. 2 shows the influence of antisense transfection on stains with antibodies PM-2 and living cell staining (magnification 200x).
- the right column of FIG. 2 shows the cells of the BXPC-3 cell line stained with the PM-2. Untransfected cells are shown in the top row. The middle row shows the one with the empty one
- FIG. 3 shows the immunospecific detection of the antigen expressed in BXPC-3 cells and in 23132/87 cells with the aid of the PM-2 antibody.
- Example 4 Determination of the JV glycosylation sites
- glycosylation points indicated in FIGS. 4a and 4b and 5a and 5b were determined using the software of the database of the “UK MRC Human Genome Mapping Project” (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/prot-anal .html) determined.
- FIG. 6 shows the result of the mass spectroscopic analysis of a selected from an SDS gel using the PM-2 antibody
- Protein band A sequence comparison of the peptide sections No. 2, No. 3, No. 4 and No. 6 determined with the aid of the mass spectrometer has sequence homology to the p-80 protein and to the REV1 protein.
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Abstract
Polypeptid, das als membranständiges Protein an der Zelloberfläche exprimiert wird, das an einer oder mehreren Stellen glykosiliert ist (Membranglykoprotein) und dessen Aminosäuresequenz teilweise oder ganz der des Integrin-Bindungsproteins p80 (accession # AJ131720) oder REV1 (accession # AF206019) entspricht, wobei das Membranglykoprotein von neoplastischen Zellen und nicht von nicht-neoplastischen Zellen exprimiert wird, und als Antigen den humanen monoklonalen Antikörper PM-2 (DSM Eingangsnummer: DSM ACC2600) spezifisch bindet, sowie N-glykosidisch und O-glykosidisch glykosiliert ist. Die Erfindung lehrt außerdem ein Verfahren zur Isolation/Herstellung des Antigens und dessen Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittel zur Immunisierung. Das isolierte Antigen dient auch zur Identifikation von Arzneimitteln mit apoptotischer oder zellproliferationsinhibierender Wirkung und darüberhinaus der Verwendung des Glykomembranproteins als Tumormarker.
Description
ANTIGEN DES P -2 ANTIKÖRPERS UND DESSEN VERWENDUNG
Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, das als membranständiges Protein an der Zelloberfläche exprimiert wird, das an einer oder mehreren Stellen glykosiliert ist (Membranglykoprotein) und dessen Aminosäuresequenz teilweise oder ganz der des Integrin-Bindungs- proteins p80 (accession # AJ 131720) oder REV1 (accession # AF206019) entspricht.
Desweiteren betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids in der Tumorbehandlung, Tumordiagnose und in der Tumorforschung.
Hintergrund der Erfindung
Trotz der Fortschritte der Chemotherapie bleibt die erfolgreiche Krebsbehandlung gegenwärtig eine der größten Herausforderungen in der Medizin. Bei diesem Ziel spielt insbesondere die frühe Diagno- se von Krebs eine große Rolle. Eine alarmierende hohe Zahl der
Krebspatienten befindet sich zum Zeitpunkt der Erstdiagnose bereits in einem fortgeschrittenen Stadium der Krankheit. Neben dem frühzeitigen Nachweis von Tumorzellen im Gewebe spielt natürlich auch die Suche nach neuen Mitteln zur Krebsbekämpfung eine große Rol- le, z.B. durch Inhibition der Zeilproliferation oder durch Einleitung der
Apoptose. Apoptotische Rezeptoren an der Zellober läche, wie jene der NGF/TNF-Familie werden prädominant auf Lymphozyten exprimiert, befinden sich aber auch auf verschiedenen anderen Zelltypen, weshalb sie sich nachteiligerweise nicht für eine Krebstherapie eig-
nen. Insbesondere haben bei /n- Vo-Tests Liganden und Antikörper für diese Rezeptoren zu Leberschäden geführt. Tumorspezifische Rezeptoren (Antigene) mit apoptotischer Funktion, die an der Zelloberfläche neoplastischer Zellen exprimiert werden, sind daher für die Krebstherapie besonders wichtig. Das gilt insbesondere vor dem Hintergrund, dass zunehmend die Identifizierung und Isolation humaner monoklonaler Antikörper mit apoptotischer Wirkung gelingt. Durch Einsatz der Hybridomtechnologie ist die Isolierung einer Serie tumorspezifischer IgM Antikörper aus dem Gewe- be von Krebspatienten sowie aus dem Gewebe gesunder Spender gelungen. Insbesondere konnten bereits zwei humane monoklonale tumorspezifische Antikörper und deren Antigene identifiziert werden. So bindet der humane monoklonale Antikörper SC-1 spezifisch am CD-55 Rezeptor (Cancer Research, 1999 Oct. 15, 59 (20), 5299- 5306, Hensel et. al) während der humane monoklonale PAM-1 Antikörper spezifisch am CFR-1 Rezeptor bindet (Oncol. Rep. 2004, Apr. 11 (4), 777-784, Brändlein et. al). Humanen monoklonalen Antikörpern dieser Art wird für die Behandlung und Diagnose von Krebs eine große Rolle zugeschrieben. Ihre Bedeutung für die Krebstherapie liegt in der Induktion von Apoptose und/oder Inhibition der Zellprolife- ration nach spezifischer Bindung an die entsprechenden Antigene (Rezeptoren) auf der Oberfläche neoplastischer Zellen.
Mit Hilfe des humanen monoklonalen Antikörpers PM-2 (DE 102 305 156 A1) (DSM Eingangsnummer: DSM ACC2600) gelang nun die
Identifikation des erfindungsgemäßen Glykomembranproteins, das als Antigen (Rezeptor) den PM-2 Antkörper spezifisch findet. Ein Sequenzvergleich im Rahmen der massenspektroskopischen Analyse (siehe Figur 6) des erfindungsgemäßen Antigens offenbarte die zu- mindest im untersuchten Bereich vorliegende Homologie zwischen
dem erfindungsgemäßen Antigen und einem aus dem Stand der Technik bekannten Protein (NCBI accession # AJ 131720), das als p- 80 Protein bezeichnet wird bzw. REV1 (accession # AF206019) Definitionen
Apoptose ist der programmierte Zelltod, d. h. Selbstmord von Zellen, durch Fragmentation der DNA, Zellschrumpfung und Dilatation des endoplasmatischen Reticulums, gefolgt von Zellfragmentation und der Bildung von Membranvesikeln, den sog. apoptotischen Körpern. Sie ist die häufigste Todesursache eukaryontischer Zellen und kommt vor in der Embryogenese, Metamorphose und Gewebsatro- phie. Die Apoptose garantiert als die physiologische Form des Zelltods eine schnelle und saubere Entfernung unnötiger Zellen, ohne Entzündungsvorgänge oder Gewebeverletzungen auszulösen wie im Falle der Nekrose. Unter pathologischen Bedingungen dient die A- poptose auch zum Entfernen maligner Zellen, wie etwa Krebsvorläuferzellen. Apoptose kann durch verschiedenste Stimuli ausgelöst werden, wie etwa durch zytotoxische T-Lymphozyten oder Zytokine, wie Tumornekrosefakor, Glykokortikoide und Antikörper.
Glykosilierung
Membranglykoproteine weisen auf ihrer extrazellulären Seite Zuckerreste (Glycokalix) auf, die entweder an den Amidstickstoff einer Asparaginseitenkette gebunden sind ( /-Bindung) oder an das Sau- erstoffatom einer Serin- oder Threoninseitenkette (O-Bindung). Der direkt mit der Seitenkette verknüpfte Zucker ist meistens N- acetylglucosamin oder Λ/-Acetylgalacatosamin. Kohlenhydrate können sehr vielfältige Strukturen ausbilden. Zum einen können verschiedene Monosaccharide über eine oder mehrere OH-Gruppen miteinander verknüpft sein. Zum zweiten können die am C-1-Atom
ansetzenden Verknüpfungen eine α- oder ß-Konfiguration haben. Unter Ausnutzung dieser verschiedenen Verknüpfungen können Gly- komembranproteine ausgedehnte aus Oligosacchariden aufgebaute Verzweigungen aufweisen.
Es ist bekannt, dass die Kohlenhydratstruktur (Glykosilierungs- muster, Glykokalix) auf der Zelloberfläche Informationscharakter hat für die interzelluläre Erkennung. So benötigt z.B. das Immunsystem das Glykosilierungsmuster zur Erkennung und Adsorption an die Zielzelle, wobei die strukturellen Grundlagen für den Ablauf dieses
Vorgangs noch nicht verstanden sind.
Integrine sind an die Oberfläche von Zellen gekoppelte Proteine, deren lipophiler Teil die Zellwand durchspannt (Transmembranpro- teine) und deren extrazellulläre Komponenten glykosiliert sind (Gly- komembranproteine). Durch einen als Adhäsion bezeichneten Vorgang vermitteln Integrine die Bindung von Zellen an die extrazelluläre Matrix und an andere Zellen. Für die Selektivität der Bindung ist neben der Aminosäuresequenz der Integrine und der dreidimensionaler Proteinstruktur die Struktur der an die Integrine gebundenen Zucker verantwortlich. Integrine sind Heterodimere, die aus einer - und einer ß- Untereinheit zusammengesetzt sind, wobei es etwa 10 unterschiedliche α-Untereinheiten und mindestens doppelt so viele unterschiedliche ß-Untereinheiten gibt. Die daraus alleine für den Rezep- tortyp der Integrine erwachsende Variabilität erklärt, dass die der
Zelladhäsion unterliegenden allgemeinen Mechanismen noch bei weitem nicht vollständig verstanden sind. Die Spezifität der Integrin- Bindung wird außerdem durch die extrazelluläre Ca2+"Konzentration moduliert. Es ist bekannt, dass Integrine bevorzugt an die Arg-Gly-
Asp-Sequenz (Ruoslahti, Pierschbacher, Science, 1987, 238, 491) der extrazellulären Matrix binden.
Unter den Adhäsionsrezeptoren wirken Integrine insbesondere bei der Signaltransduktion, d.h. bei der Informationsübermittelung extrazellulärer Signale in das Innere der Zelle und aus dem Inneren der Zelle nach außen. Durch Adhäsion und nachfolgender Signalübertragung in das Zellinnere werden intrazelluläre Prozesse in Gang gesetzt, die zur Umstrukturierung des Cytoskeletts und zur Induktion von Signalkaskaden führen können. Integrin-Bindungsproteine sind die Bindungspartner der Integrine bei der Adhäsion.
Zelladhäsionsvorgänge wirken regulatorisch auf das Expressionsmuster und damit auf die Spezifität der Rezeptoren selbst. Zell- Adhäsionsmechanismen sind daher wichtig für das Zellwachstum, die Zellmigration und die Differenzierung, insbesondere sind sie beteiligt, wenn Zellen ihre spezialisierten Formen verlieren und zu me- tastasierenden Krebszellen werden.
Neoplastische Zellen
Als Neoplasma oder Tumore wird eine abnorme Gewebsmasse bezeichnet, deren Wachstum autonom (unabhängig von Wachstumsfaktoren), unkoordiniert, ziellos und progressiv ist. Dabei bestehen Tumore aus zwei Komponenten. Zum einen den Parenchymzellen, die auch als neoplastische Zellen bezeichnet werden und dem nicht- tumorösen Stroma, d.h. dem Bindegewebe und den Blutgefässen. Als neoplastische Zelle wird im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Antigen eine Zelle bezeichnet, die einer unkontrollierten Zellteilung unterliegt oder eine Zelle die keinen Apoptosemechanis-
mus aufweist. Eine neoplastische Zelle im Sinne der Erfindung kann auch beide Störungen aufweisen und kann sich auch dadurch auszeichnen, dass ihr Zeil-Zyklus vom normalen Zeil-Zyklus abweicht.
Beschreibung
Die aus dem Stand der Technik (Wixler et al., FEBS Letters 1999,445,351-355) bekannte Sequenz (accession # AJ 131720) codiert für das α-lntegrin- Bindungsproteins p80 das mit der proximalen Region des α- Integrins interagiert. Diese Bindungseigenschaften legen nahe, dass es sich bei p-80 um ein membranständiges Protein handeln muss. Angaben zur Glykosielierung des p-80 Proteins sind nicht bekannt.
Das ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannte humane REV-1
Protein (accession # AF206019) weist ebenfalls zumindest abschnittsweise Sequenzhomologie zum erfindungsgemäßen Antigen aufweist. Als Funktion von REV1 wird eine Deoxycytidyl-Transferase Aktivität angegeben. Die Deoxycytidyl-Transferase katalysiert ver- mutlich die Anbindung von Desoxycytidylat an denTochter-DNA-
Strang während der DNA-Replikation im Zellkern. REV1 ist also im Gegensatz zum Integrin bindenden Protein p-80 kein membranständiges Protein und ist im Kern lokalisiert.
Die Tatsache, dass Polypetide mit gleicher Aminosäursequenz zum einen als membranständige Proteine und zum anderen als Proteine im Zellkern vorliegen können, zeigt, dass die posttranslationale Modifikationen, wie beispielsweise die Glykosilierung, eine große Rolle im Hinblick auf die Lokalisation und die Funktion eines Polypeptids spie-
len müssen und man trotz Sequenzhomologie nicht von einer Identität solcher Proteine ausgehen kann.
Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Identifikation und Charakte- risierung eines Antigens an das der tumorspezifische humane monoklonale Antikörper PM-2 bindet (DSM Eingangsnummer: DSM ACC2600), sowie in der Verwendung des Antigens zur Tumorbehandlung und Tumordiagnose.
Der PM-2 Antikörper (DE 102 30 516 A1) ist ein humaner monoklo- naler Antikörper mit schweren und leichten Kettenmolekülen, die jeweils einen von Antikörper zu Antikörper konstant und einen von Antikörper zu Antikörper variabel aufgebauten Bereich aufweisen oder eine funktionelles Fragment davon, wobei wenigstens eine der vari- ablen Regionen der leichten Kette substanziell jeweils die in SEQ
NO. 4 und/oder die der schweren Kette in SEQ ID NO. 3 des Sequenzprotokolls aufweist. Der PM-2 Antikörper wurde mit Hilfe der Hybridom -Technik hergestellt, wobei die Hybridom-Zellen (DSM ACC2600) durch Fusion der Hetero-Myelom-Zellen HAB-1 sowie deren Subklone mit P-Lymphozyten gewonnen wurde. Die P-
Lymphozyten wurden aus einem lymphatischen Organ vorzugsweise, der Milz oder Lymphknoten eines Karzinom-Patienten entnommen. Der humane monoklonale Antikörper PM-2 zeichnet sich dadurch aus, dass er nach spezifischer Bindung an das entsprechende PM-2 Antigen auf der Oberfläche einer neoplastischen Zelle in dieser
Zelle Apoptose einleitet und/oder die Zeilproliferation inhibiert. Die Apoptotische Wirkung des PM-2 Anikörpers wurde mit Hilfe eines Cell-Death-ELISA Experiments nachgewiesen und ist in Dokument DE 102 30 516 A1 ausführlich beschreiben.
Zur Lösung der Aufgabe lehrt die Erfindung ein Glykomembranpro- tein mit Antigeneigenschaften, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es - von neoplastischen Zellen und nicht von nicht-neoplastischen Zellen exprimiert wird, und - als Antigen den humanen monoklonalen Antikörper PM-2 (DSM Eingangsnummer: DSM ACC2600) spezifisch bindet, sowie - Λ/-glykosidisch und O-glykosidisch glykosiliert ist.
Das erfindungsgemäße Antigen ist tumorspezifisch, d.h. es wird nur von neoplastischen Zellen exprimiert. Für die spezifische Bindung des humanen monoklonalen Antikörper PM-2 (DSM Eingangsnum- mer: DSM ACC2600) am erfindungsgemäßen Antigen ist des Glykosilierung verantwortlich, die Λ/-glykosidisch und O-glykosidisch ist.
Sowohl beim erfindungsgemäßen Antigen als auch beim zumindest abschnittsweise sequenzgleichen p-80 Protein handelt es sich um membranständige Proteine. Möglicherweise liefert die Tatsache, dass das p-80 Protein Integrin bindet einen Hinweis auf die Rolle, die das erfindungsgemäße Antigen bei der Tumorentstehung spielt. Als Zeiladhäsionsmoleküle sind Integrine bei der Angiogenese wichtig. So wird das αVß3-lntegrin von den Endothelzellen jener Gefäße exprimiert, die Tumore versorgen. Es wäre denkbar, dass das erfindungsgemäße Antigen, das in den Epithelzellen der Blutgefäße nachgewiesen wurde, ebenfalls mit Integrinen wechselwirkt und seine Hemmung einer der Angiogenesehemmung ähnliche Wirkung hat. Bekannt ist auch, dass Integrine bei der Metastasierung von Tumor- zellen eine wichtige Rolle spielen, indem sie die Adhäsion der über
die Blutbahnen transportierten Tumorzellen in bislang tumorfreies Gewebe überhaupt erst ermöglichen.
Für die spezifische Bindung des Antikörpers PM-2 haben erfin- dungsgemäßen Antigen spielen vermutlich die /V-glykosidisch gebundenen Glykostrukturen eine besondere Rolle. Die genauer Analyse der Glykosylierungsstellen mit Hilfe einer dem Fachmann bekannten Software (Software der Datenbank des „UK MRC Human Genome Mapping Project" http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/prot-anal.html) ermittelt.
Ausgehend von der nur partiell vorliegenden Sequenz (774 Aminosäuren) von p-80 ergab diese Analyse, dass die /V-Glykosilierung insbesondere an den Aminsäurepositionen 333, 343, 450 und 568 erfolgt. Eine entsprechende Analyse mit der komplett vorliegenden
Sequenz der REV1 Proteins ergab, dass bei REV1 insbesondere an den Aminosäurepostitionen 810, 830, 927 und 1045 Λ/-Glykosilierung vorliegt.
Die Anzahl der mit Hilfe des gleichen Verfahrens ermittelten O-
Glykosilierungsstellen liegt bedeutend höher.
Es liegt im Rahmen der Erfindung, dass das mit Hilfe des humanen monoklonalen Antikörpers identifizierte Antigen aus einem monomer oder aus mehreren gleichen Untereinheiten aufgebaut ist. Die Möglichkeit, das es sich um ein Homomer aus zwei gleichen Untereinheiten (Dimer) handelt oder mit anderen Proteinen assoziert ist, könnte auch erklären, dass das mittels Immuno-Blot (Western-Plot) angebbare Molekulargewicht bislang in einer weiten Bandbreite variiert.
Die das Protein exprimierenden Zellen wurden bereits im Zusammenhang mit der Charakterisierung der PM-2 Antikörpers genannt. Daher wird hier auf das Dokument DE 102 305 156 A1 verwiesen. Die Hybridomzelllinine, die den Antikörper PM-2 produziert, ist nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der
Hinterlegung von Mikroorganismen für doe Zwecke von Patenthinterlegungen am 02.07.2003 unter der Eingangnummer DSM2600 beim DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig), hinterlegt worden. Für die Charakterisierung des erfindungsgemäßen Antigens wurde insbesondere Pankreas-
Karzinomzellen der Zelllinie BXPC3 (ATCC-Nummer CRL1687) verwendet, weil auf deren Oberfläche das Antigen besonders gut exprimiert wird.
Für die Erklärung der immunbiologischen Bedeutung des erfindungsgemäßen Antigens könnte entscheiden sein, dass das Antigen auf der Oberfläche von Epithelzellen im Tumorgewebe exprimiert wird.
Von entscheidender Bedeutung ist das therapeutische Potenzial des erfindungsgemäßen Antigens, das darin besteht, dass nach Bindung des PM-2 Antikörpers an das Antigen in einer neoplastischen Zelle Apoptose induziert wird. Alternativ ist denkbar, dass aufgrund der spezifischen Bindung des PM-2 Antikörpers an das Antigen auf der Oberfläche neoplastischer Zellen deren Zeilproliferation inhibiert.
Beide Wirkmechanismen sind für die Tumortherapie interessant.
Im Rahmen der Erfindung wurde ein Verfahren zur Isolation des erfindungsgemäßen Antigens entwickelt. Nach Homogenisierung und Solubilisierung in einem dem Fachmann bekannten Detergenz wird
das Antigen chromatographisch aufgereinigt. Dabei kommt insbesondere die Größen-Ausschluss-Chromatographie (Size-exclusion) zum Einsatz. In einer Verbesserung des Isolationsverfahrens ist denkbar, dass sich an die Größen-Ausschluss-Chromatographie ein weitere Schritt in Form einer Anionen-Austausch-Chromatographie anschließt. Durch diesen zweiten Aufreinigungsschritt wird die Reinheit des isolierten Glykomembranproteins verbessert.
Das derart isolierte Antigen kann zur Herstellung eines Arzneimittels unter Verwendung der üblichen pharmazeutischen Hilfs- und Trägerstoff verwendet werden. Im einfachsten Fall ist die in-vivo Verabreichung des aufgereinigten Antigens in einer physiologischen NaCI- Lösung vorgesehen.
Es liegt jedoch ebenso im Rahmen der Erfindung, dass das aufgereinigte Glykomembranprotein als Antigen eingesetzt wird, um spezifisch bindende Liganden oder Adhäsionspeptide zu identifizieren. Prinzipiell ist denkbar, dass die auf diese Weise identifizierten Poly- peptide nur abschnittsweise der Sequenz des humanen monoklona- len Antkörpers PM-2 entsprechen, aber dennoch in neoplastischen
Zellen Apoptose einleiten und/oder in diesen Zellen die Zellprolifera- tion inhibieren. Zur Verstärkung dieser Wirkung können die Adhäsionspeptide oder Liganden mit einem Radionucleotid, einem Cytoto- kin, einem Cytokin oder einem Wachtuminhibitor gekoppelt sein.
Es denkbar, dass das erfindungsgemäße Glykomembranprotein als Antigen bei der Identifikation von Wirkstoffen im Rahmen eines Hoch-Durchsatz-Screenings eingesetzt wird. Derartige Verfahren und deren Ausgestaltungen sind dem in der pharmazeutischen For- schung tätigen Fachmann bekannt.
Im Rahmen der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungs- gemäßen Antigens als Tumormarker vorgesehen. Dabei ist der Nachweis des erfindungsgemäßen Membranglykoproteins auf der Oberfläche neoplastischer Zellen mit Hilfe des PM-2 Antikörpers durchführbar. Mit Hilfe des in den Sequenzprotokollen 1 und 2 angegeben Vektorinserts gelang u.a. in einem Antisense Experiment der Nachweis, dass das erfindungsgemäße Membranglykoprotein das Antigen für den spezifisch bindenden humanen monoklonalen Anti- körper PM-2 ist.
Beispiel 1 Material und Methoden
Zellkultur
Zur Gewinnung des Rezeptors wurde die Karzinomzelllinie BXPC-3 (ATCC~Nummer CRL1687) verwendet. Für vergleichende Untersuchungen, z.B. Western-Blot-Analyse wurde außerdem die bekannte Magenadenokarzinom-Zelllinie 23132/87 (DSMZ Eingangsnummer DSM201) (Hensel et al. 1999, Int.J.Cancer 81:229-235) eingesetzt.
Die Zellen wurden bis zu 80% Konfluenz in RPMI-1640 (PAA, Wien Österreich) ergänzt mit 10% FCS und Penicillin/Streptomycin (1% für beide) gezüchtet. Für die beschriebenen Untersuchungen wurden die Zellen mit Trypsin/EDTA getrennt und zweifach mit Phosphat gepuf- feiler Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
Präparation von Membranauszügen
Die Isolierung der Membranproteine aus Tumorzellen wurde in der Weise, wie sie durch Hensel et al. (Hensel et al., 1999, Int.J.Cancer 81 :229-235) beschrieben wurde, unter Benutzung der Zelllinie
BXPC-3 duchgeführt. Verkürzt wiedergegeben wurden die zusammenhängenden Tumorzellen zweimal mit PBS gewaschen, mit einem Zellschaber abgelöst und zentrifugiert, und in einem hypotonischen Puffer (20 M HEPES, 3 mM KCI, 3mM MgCI2) aufgelöst. Nach einer 15 Min. Inkubationszeit auf Eis und einer Ultraschallbehandlung für 5 Min., wurden die Kerne durch Zentrifugieren bei 10.000 g für eine Dauer von 10 Min. pelletiert. Der Überstand wurde für 30 Min. bei 100.000 g in einem Swing-out-Rotor zentrifugiert und hierdurch die Membran pelletiert. Nachdem die Pellets mit dem hypo- tonischen Puffer gewaschen wurde, wurden sie in einen Membran
Lysis Puffer (50 mM HEPES pH 7.4, 0,1 mM EDTA, 10% Glycerol, und 1% Triton X-100) erneut aufgelöst. Ein Protease Inhibitor (Boeh- ringer, Mannheim, Deutschland) wurde allen Lösungen zugeben.
Reinigung des Antigens
Die Reinigung des Antigens wurde mit Säulenchromatographie unter Verwendung einer Pharmazia (Freiburg, Deutschland) FPLC Einheit durchgeführt. Für die Größenausschluß (Size-Exclusion)- Chromatographie wurde eine Pharmazia Superdex 200 (XK 16/60) Säule mit 5 mg des Membranpräparates geladen und mit einem Puffer A betrieben (100 mM Tris/Cl, pH 7.5,2 mM EDTA, 40mM NaCl, 1% Triton X-100). Dann wurde das Eluat fraktioniert und durch Wes- tern-Blot Analyse auf Reaktionen mit dem Antikörpern PM-2 untersucht. Die positiven Fraktionen wurden auf einer MonoQ (5/5 Säule) unter Verwendung des Puffers A gegeben. Die gebundenen Proteine wurden mit Hilfe eines linearen Gradienten unter Verwendung des Puffers B (100 mM Tris/ Cl, pH 7.5,1 M NaCl, 2 mM EDTA, 1 M NaCl, 1% Triton X-100) ausgewaschen, fraktioniert und mit Coomas- siegefärbtem SDS-PAGE und Western-Blot Analyse untersucht.
Western blotting
Die Auftrennung durch 10 %ige SDS-PAGE Gele und Western blotting der Proteine wurden unter Standardbedienungen, wie anderweitig beschrieben (Hensel et at, 1999, Int.J.Cancer 81:229-235), durchgeführt. Verkürzt wiedergegeben wurden die geblotteten Nitrozellulose -Membrane mit PBS blockiert, welches 2 % Magermilchpulver enthielt, dem eine einstündigen Inkubation mit 10 μg/ml gereinigtem Antikörper 103/51 folgte. Nach dreimaligem Waschen mit PBS + 0,05% Tween-20 wurde der zweite Antikörper (Peroxidase gekoppel- te Hasen antihumane IgM Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutsch-
land)) inkubiert. Die Reaktion wurde mit Hilfe des Supersignal Che- milumineszenz kits von Pierce (KMF, St. Augustin, Deutschland) nachgewiesen.
Die mit Hilfe von Western-Blots auf einem entsprechenden SDC-Gel identifizierten positiven Banden wurden aus dem Gel getrennt und zur MALDI-Analyse genutzt.
MALDI Peptide-Analyse Die aus dem SDS-Gel getrennten Proteinbanden wurden in kleine
Stücke von etwa 1mm x 1mm zerschnitten. Die Gelstücke wurden gewaschen, mit DTT reduziert, S-Alkyliiert mit lodoacetamid und Trypsin behandelt (unmodifiziert, Sequenzgrad, Boehringer) wie anderweitig beschrieben (Shevckenko et al., 1996b Anal.Chem. 68:850-858). Nach 3 Stunden der Verdauung bei 37°C wurden 0.3 μl der Lösung entfernt und einer massenspektroskopischen Analyse (MALIDI) mit Hilfe eines Bruker Reflex MALDI-TOF unterzogen, welches mit einer nachträglichen Extraktion (Brucker, Franzen, Bremen, Deutschland) ausgerüstet war. Die Dünnfilmtechnik wurde zur Pro- benpräparierung angewendet (Jensen et al., 1996 Rapid.Commun.
Mass.Spectrom 10:1371-1378). Die tryptischen Peptid-Massen wurden dazu verwendet, um nicht redundante Proteinsequenzdaten durch ein Peptid-Suchprogramm, das im Hause entwickelt wurde, zu suchen.
Klonierung des p80-Antisense-Vektor und Transfektion RNA Isolierung, cDNA Synthese und PCR wurden wie beschrieben (Hensel et al., 1999 Int.J.Cancer 81:229-235) durchgeführt. Verkürzt wiedergegeben wurde für die Amplifikation eines Fragments mittels PCR aus einem Bereich von Position 181 bis Position 681 der
Nukleotid Sequenz von p-80 (accession # AJ131720) folgende Primer benutzt:
P80-Rev 3' 5' CTGTTCCATACGATTTTCATGC 3' P80-Rev 5' 5' TCGAACTGGTCTATCATCCAA 3'
Die Amplifikation wurde mit folgendem Zyklusprofil durchgeführt: 95°C, 2 Min; nachfolgend 35 Zyklen bei 94°C, 30 sec; 60°C, 30 sec; 72°C 60 sec. und abschließend 72 °C, 4 min. Die Klonierung in den pCR- Skript Amp SK (+) Vektor und das Sequenzieren der DNA wurde wie früher schon beschrieben (Hensel et al., 1999 Int.J.Cancer 81 :229-235) durchgeführt.
Das Insert wurde mit entsprechenden Restriktionsenzymen aus dem pCR- Skript Amp SK (+) Vektor ausgeschnitten und in den pHook-2 Vektor (Invitrogen, Leek, Niederlande) subkloniert. Verschiedene
Klone wurden durch Sequenzierung auf die erfolgreiche Klonierung untersucht. Es wurde ein Klon gewählt, bei dem die codierende Sequenz in Antisense-Richtung zum Promotor kloniert worden ist. Diese Klon wurde amplifiziert und Vektoren für die Antisense- transfektion isoliert.
Die Transfektion der Zelllinie BXPC-3 mit pHook2-anti PM-2-R wurde mit einem Primefaktor Reagenz (PQLab, Erlangen, Germany) entsprechend dem Lieferantenhandbuch vervollständigt. Dafür wurde die Plasmid DNA auf 10 μg/ml verdünnt und das Primefaktorreagenz im Verhältnis 1:10 einem serumfreien Wachstumsmedium beigegeben. Die verdünnte Plasmid DNA (450 μl), das verdünnte Primefaktorreagenz ergänzend (90 μl) und das serumfreie Wachstumsmedium (460 μl) wurden vermischt und bei Raumtemperatur inkubiert. 60 ml Zellkulturschalen (70% konfluent) wurden zweimal mit dem se-
rumfreien Wachstumsmedium gewaschen und anschließend die Primefaktor/DNA-Mischung tropfenweise hinzugegeben. Die Zellen wurden inkubiert für 18 Stunden bei 37°C and 7% CO2, anschließend wurde das serumfreie Wachstumsmedium ersetzt durch ein Wachs- tumsmedium mit 10% FCS und die Zellen wurden weitere 24 Stunden inkubiert, bevor die Expression des Rezeptorproteins untersucht wurde.
a) Ein Teil der Zelllinie BXPC-3 wurde mit einem Kontrollvektor (p- HOOK-2), ein weiterer Teil mit den p80 Antisense-Vektor transfiziert. b) 48 h nach der Transfektion wurden Zytospinpreparationen der Zellen angefertigt. c) Die Zytospinpreparationen wurden mit dem PM-2 Antikörper und einem Kontrollantikörper (nur sekundärer Antikörper) angefärbt d) Zellen, die mit dem p-80 Antisense-Vektor transfiziert sind, zeigen einen deutlichen Abfall in der Bindung des Antikörpers PM-2.
Verdau mit N-Glykosidase auf Zytospins Die verwendeten Zellen wurden mittels Trypsin/EDTA vom Untergrund ihrer Kulturflaschen abgelöst und anschließend zur Regeneration der Membranproteine für 1 h in RPMI-1640 Medium + 10% FCS bei 4°C inkubiert. Danach wurden mit den Zellen Zytospin-Päparate angefertigt. Die Zytospins wurden über Nacht bei RT getrocknet. Nach der Trocknung wurden die Zellen für 10 min mit 100% Azeton fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die fixierten Zellen mit 5 mU/ml N-Glykosidase (in 100 μl Phosphatpuffer, pH 7,0) für 3 Stunden bei 37°C im Brutschrank verdaut. Danach wurden die Zytospin-Präparate dreimal mit PBS gewaschen und sofort der immunhistochemischen Färbung mit den verschiedenen Antikör-
pern zugeführt. Als Negativkontrolle dienten Zytospins, die nur mit Phosphatpuffer inkubiert wurden, bzw. Zytospins, welche ohne Gly- kosidase-Behandlung einer normalen immun-histochemischen Färbung unterzogen wurden. Die Färbung erfolgte wie beschrieben. Die fertige Färbung wurde abschließend mikroskopisch ausgewertet und die Ergebnisse mit einer Photoanlage und einem Olympus Mikroskop dokumentiert.
Verdau mit O-Glykosidase auf Zytospins Auch hier wurden die Zellen abtrypsinisiert und für 1 h in Kulturmedium auf Eis rekonstituiert. Nach Präparation der Zytospin-Präparate und anschließender Fixierung wurden die Zellen mit 20 μU/ml O- Glykosidase (in 100 μl Phosphatpuffer, pH 6,8) bei 37°C für 3 h inkubiert. Als Kontrolle wurden Zytospins nur mit Phosphatpuffer inkubiert oder ohne Inkubation normal gefärbt. Die immunhistochemische Färbung erfolgte wie beschrieben.
Irnmunohistochemisches Färben von lebenden Zellen und Azeton-fixierten Zellen
Für das Färben lebender Zellen wurden die Zellen herausgelöst, gewaschen und verdünnt auf 1 x 106 Zellen pro ml. 1 ml der Zelllösung werden bei 1.500 g für 5 Min. zentrifugiert. Der auf 40 μg/ml mit vollständigen RPMI verdünnte Antikörper wird zu einem Endvolumen von 1 ml ergänzt und für 90 Min. auf Eis inkubiert. Dann werden die
Zellen bei 1.500 g für 5 Min. pelletiert und wieder aufgelöst mit 500 μl RPMI. Mit 200 μl der Zelllösung werden die Zytospinpräparate präpariert und für 30 Min luftgetrocknet. Die Zellen werden in Aceton für 30 Min. fixiert und dreimal mit Tris/NaCI gewaschen. Die HRP- gekoppelten Hasen antihumanen IgM (DAKO) werden 1:50 in
PBS/BSA (01 ,%) verdünnt und für 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wird das Färben, wie oben erwähnt, durchgeführt.
Für das Färben der azeton-fixierten Zellen werden die Zytospins präpariert, bei Raumtemperatur luftgetrocknet und, wie oben beschrieben, in Azeton fixiert. Dann werden die Zytospins für 15 Min. mit PBS/BSA (0,1%) blockiert und für 30 Min. mit 10 μg/ml primärer Antikörper inkubiert und anschließend dreimal gewaschen. Die Inkubati- on mit den sekundären Antikörpern und das Färben wird, wie oben beschrieben, durchgeführt.
Beispiel 2 Ergebnis Glykosidase - Verdau Figur 1 zeigt den Einfluss des Glykosidase-Verdaus auf die Antikörper-Bindung von PM-2 auf der Zelloberfläche der Pankreaskarzinomzellen BXPC-3. Die Zytospins wurden nach dem Verdau immun- histochemisch mit der Positivkontrolle CAM-Keratin (A, C, E) und mit PM-2 (B, D, F) gefärbt.
Die Bilder A und B in Fig. 1 zeigen die Kontrollen nach Inkubation der Zellen in Glykosidase-Puffer ohne Enzym. Die Bilder C und D zeigen die Auswirkungen der /V-Glykosidase-Inkubation auf die Bindung des Antikörpers PM-2 an die Pankreaskarzinomzellen. Nach Verdau mit dem Enzym Λ/-Glykosidase kann nicht mehr mit dem Antikörper PM-
2 angefärbt werden. Das bedeutet, dass der Antikörper nicht mehr an seinen Rezeptor binden konnte, weil die für die spezifische Bindung erforderliche Λ/-gebundene Glykostruktur beim Λ/-Glykosidase- Verdau abgespalten wurde.
Die Bilder in Fig. 1 E und F zeigen die Auswirkungen der O- Glykosidase-Inkubation auf die Bindung des Antikörpers PM-2. Während die Positivkontrolle CAM-Keratin in Bild E keine veränderte Färbung aufweist zeigt sich nach Verdau mit dem Enzym O- Glykosidase, dass die Zellen nicht mehr mit dem Antikörper PM-2 angefärbt werden können. Das legt nahe, dass neben Λ/-gebundenen Zuckern mindestens auch eine O-glykosidisch gebundenen Determinanten des Antigens für die spezifische Bindung des PM-2 Antikörpers verantwortlich war.
Beispiel 3 Ergebnis Antisense Transfektion
Fig. 2 zeigt den Einfluß der Antisense-Transfektion auf Färbungen mit Antikörpern PM-2 und Lebendzellfärbung (Vergrößerung 200x).
Die rechte Spalte von Figur 2 zeigt die mit dem PM-2 angefärbten Zellen der BXPC-3 Zelllinie. In der oberen Reihe sind nicht transfi- zierte Zellen abgebildet. Die mittlere Reihe zeigt die mit dem leeren
Vektor transfizierten Zellen. In beiden Fällen zeigen die Zellen eine deutliche PM-2 Antikörper Färbung. Diese Färbung nimmt deutlich ab nach Transfektion der Zellen mit dem Antisense-Vektor. Dies zeigt das Bild in der rechten Spalte der unteren Zeile. Dieses Expe- riment zeigt, dass der PM-2 Antikörper an ein Membranprotein bindet, dessen Aminosäuresequenz zur Aminosäuresequenz des P-80 Proteins zumindest abschnittsweise homolog sein muss.
Zusammen mit dem Ergebnis des Glucosidase-Verdaus zeigt dies, dass ein Glycomembranprotein, dessen Aminosäuresequenz zumin-
dest teilweise mit der des P-80 Proteins übereinstimmt, das Antigen ist, an das der PM-2 Antikörper spezifisch bindet.
Beispiel 3 Ergebnis Westernblot
Figur 3 zeigt den immunspezifischen Nachweis des in BXPC-3- Zellen und in 23132/87-Zellen exprimierten Antigens mit Hilfe des PM-2 Antikörpers. Beispiel 4 Bestimmung der JV-Glykosilierungsstellen
Die in Figur 4a und 4b sowie 5a und 5b angegebenen Glykosilie- rungsstellen wurden mit Hilfe der Software der Datenbank des „UK MRC Human Genome Mapping Project" (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/prot-anal.html) ermittelt.
Beispiel 5 MALDI-Analyse des PM-2 Antigens
Figur 6 zeigt das Ergebnis der massenspektroskopischen Analyse einer aus einem SDS-Gel mit Hilfe des PM-2 Antikörpers selektierten
Proteinbande. Ein Sequenzvergleich der mit Hilfe des Mas- senspektrometer ermittelten Peptidabschnitte Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 6 Sequenzhomologie zum p-80 Protein bzw. zum REV1 Protein aufweisen.
Claims
1. Polypeptid, das als membranständiges Protein an der Zelloberfläche exprimiert wird, das an einer oder mehreren Stellen glykosiliert ist (Membranglykoprotein) und dessen Aminosäuresequenz teilweise oder ganz der des Integrin-Bindungsproteins p80 (accession # AJ131720) oder REV1 (accession # AF206019) ent- spricht, dadurch gekennzeichnet, dass das Membranglykoprotein - von neoplastischen Zellen und nicht von nicht-neoplastischen Zellen exprimiert wird, und - als Antigen den humanen monoklonalen Antikörper PM-2 (DSM Eingangsnummer: DSM ACC2600) spezifisch bindet, sowie - Λ/-glykosidisch und O-glykosidisch glykosiliert ist.
2. Polypeptid nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die spezifische Bindung des humanen monoklonalen Antikörpers PM- 2 (DSM Eingangsnummer: DSM ACC2600) am Membranglykoprotein durch einen oder mehrere Λ/-glykosilierte Carbohydrat- Rest (=Zucker-Rest) vermittelt wird.
3. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens an einer der Aminosäurepositionen 333, 353, 450 und 568 der partiellen Sequenz (accession # AJ131720) des p-80 Antigens eine Λ/-Glykosilierung vorliegt.
4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens an einer der Aminosäurepositionen 8 0, 830, 927 und 1045 der partiellen Sequenz (accession # AF206019) des REV1 Antigens eine Λ/-Glykosilierung vorliegt.
5. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Membranglykoprotein ein Monomer ist oder aus mehreren gleichen Untereinheiten aufgebaut oder mit anderen Proteinen assoziert ist.
6. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Membrangly- koproteins ca. 80 bis 160 kDa beträgt.
7. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Membranglykoprotein von den neoplastischen Zellen - des Dickdarms - der Bauchspeicheldrüse - der Prostata - der Gebärmutter, - dem Eileiter, - der Nebenniere und/oder - der Lunge, sowie vom - Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre oder der Lunge, - des Magenkarzinoms und - dem duktalen Karzinom der Brust und nicht von nicht-neoplastischen Zellen exprimiert wird.
8. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Membranglykoprotein auf der Oberfläche der Pankreas-Karzinomzelllinie BXPC-3 (ATCC-Nummer CRL1687) exprimiert werden.
9. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Membranglykoprotein insbesondere auf der Oberfläche von neoplastischen Epithelzellen exprimiert wird.
10. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach Bindung des PM-2 Antikörpers (DSM Eingangsnummer: DSM ACC2600) am Membranglykoprotein an einer neoplastischen Zelle in dieser Zelle und nicht in nicht-neoplastischen Zellen Apoptose induziert wird.
11. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach Bindung des PM-2 Antikörpers (DSM Eingangsnummer: DSM ACC2600) an einer neoplasti- sehen Zelle über das Membranglykoprotein in der Zelle die Zellproliferation inhibiert wird.
12. Verfahren zur Gewinnung des Polypeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Membranglykoproteins aus - Membranextrakten der Pankreas-Karzinomzelllinie BXPC-3 durch - Solubilisierung und - nachfolgenden Einsatz der Größenausschluss- Chromotographie isoliert wird.
13. Verfahren zur Gewinnung des Polypeptids nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sich an die Größenausschluss- Chromotographie die Durchführung einer Anionenausstausch- Chromotographie anschließt.
14. Verwendung des Polypeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur der Herstellung eines Arzneimittels unter Verwendung der üblichen pharmazeutischen Hilfs- und Trägerstoffe, das der Bekämpfung von Tumoren durch Immunisierung nach in vivo Verabreichung dient.
15. Verwendung des Polypeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Entwicklung spezifisch bindender Liganden oder Adhäsionspeptiden mit apoptotischer und/oder zellproliferation- sinhibierender Wirkung gegenüber neoplastischen Zellen.
16. Verwendung des Polypeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Entwicklung spezifisch bindender Liganden oder Adhäsionspeptiden, wobei an den Liganden oder an das Adhäsi- onspeptid ein Radionucleotid, ein Fluoreszenz-Marker, ein Cyto- tokin, ein Cytokine oder eine Wachtuminhibitor gekoppelt ist.
17. Verwendung des Polypeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Suche von Wirkstoffen in einem Hoch-Durchsatz- Screens (High-Throughput-Screening - HTS).
18. Verwendung des Polypeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche als Tumormarker.
19. Verwendung des Polypeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche zu Diagnosezwecken, dadurch gekennzeichnet, dass über die spezifische Bindung des PM-2 Antikörpers (DSM Eingangsnummer: DSM ACC2600) an das Membranglykoprotein ein Nachweis der Existenz, der Lokalisierung und/oder der Menge des Antigens führbar ist.
20. Antisense-Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil der Aminosäuresequenz des Vektors der in SEQ NO ID:1 angegeben Sequenz entspricht.
1.Antisense-Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil der Nucleotidsequenz des Vektors der in SEQ NO ID:2 angegeben Sequenz entspricht.
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