WO2005087285A1 - 角膜上皮シート及びその作製方法、並びに同シートを用いる移植方法 - Google Patents

角膜上皮シート及びその作製方法、並びに同シートを用いる移植方法 Download PDF

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corneal
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Yuuji Shirakata
Yuuichi Ohashi
Junji Hamuro
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Definitions

  • the present invention relates to a corneal epithelial sheet, a method for producing the same, and a transplantation method using the sheet.
  • the present invention relates to a corneal epithelial sheet. Specifically, the present invention relates to a corneal epithelial sheet produced by culturing and growing corneal epithelial cells on a collagen gel without using xenogeneic animal-derived cells as a feeder cell, and a method for producing the sheet. And the use of the sheet (transplantation method, etc.).
  • the cornea is one of the tissues expected to contribute to regenerative medicine.
  • the cornea is the outermost layer of the optics that make up the eyeball and is a clear, bloodless tissue that contributes to good vision by forming a smooth surface with tear fluid.
  • the keratoconjunctival epithelial cells are always in contact with the outside world and have a protective effect of protecting the eyeballs, such as foreign substances such as microorganisms from the outside world and light rays such as ultraviolet rays. That is, corneal conjunctival epithelial cells play an extremely important role in protecting the corneal transparency and the entire eyeball and maintaining homeostasis.
  • the cornea may become turbid due to pathological conditions such as keratitis, corneal ulcer, and perforation, and the transparency may be lost.
  • pathological conditions such as keratitis, corneal ulcer, and perforation
  • corneal transplantation involves removing the patient's transparent cornea and then transplanting a transparent cornea, which restores transparency and allows the eye to regain vision.
  • corneal transplants While effective therapeutic effects may be expected from such corneal transplants, there are diseases that cannot be addressed by corneal transplants alone. For example, Stevens' Johnson syndrome, pemphigus ophthalmicus, chemical trauma, burns, etc. Normally, keratoconjunctival epithelial cells divide every day, and old cells flake off and new cells are regenerated from stem cell tissue. However, in the above pathological conditions, it has been found that the stem cell tissue that regenerates the cornea is damaged.
  • Stem cell tissue that regenerates the corneal epithelium is called "corneal limbal tissue” and is limited to the boundary between the iris and the iris, and is in a special environment exposed to the outside world. In the above conditions, It is thought that this stem cell tissue itself will be eradicated by some kind of obstacle. The eradication of the stem cell tissue causes the defect to be covered by the surrounding conjunctival epithelium, lacking transparency, and exerting an extremely poor power of vision. As described above, since the limbus of the cornea dies in the above-mentioned pathological condition, the transplanted cornea cannot be maintained for a long period of time simply by transplanting the cornea. Therefore, it is necessary to transplant the limbus for permanent eye surface reconstruction.
  • amniotic membrane transplantation method As one method for transplanting the limbus, an amniotic membrane transplantation method has been developed (Medical Asahi, September 1999, p62-65, N Engl J Med340: 1697-1703, 1999: Non-patent Document 1).
  • the amniotic membrane used in this transplantation method is obtained from the placenta of a pregnant woman or the like who has undergone cesarean section. Because the amniotic membrane has a thick basement membrane, it acts as a substrate for the proliferation and differentiation of keratoconjunctival epithelial cells when transplanted.
  • amniotic membrane has almost no immunogenicity and also has effects such as anti-inflammatory and scar formation
  • the keratoconjunctival epithelium transplanted onto amniotic membrane and these stem cell tissues are transplant recipients (recipients). ) Will be protected.
  • Non-Patent Document 1 Medical Asahi September 1999 issue: p62-65, N Engl J Med340: 1697-1-1703, 1999
  • Corneal epithelial transplantation is currently performed as a surgical treatment for ocular surface diseases that cause opacity due to the covering of the cornea with the conjunctival epithelium.
  • intractable keratoconjunctival disease accompanied by severe inflammation (Stevens).
  • -Johnson syndrome, pemphigus ophthalmopathy, corneal erosion, etc. the prognosis is extremely poor.
  • allogeneic (oral) corneal epithelium with strong antigenicity is recognized by the host immune system and rejected.
  • complications due to systemic and local administration of large amounts of immunosuppressive drugs after surgery to prevent rejection are also a major factor in poor prognosis.
  • the problem of donor shortage can be solved by achieving a technology that can produce dozens of corneal epithelial sheets using a cornea that can also provide single eye power.
  • the present invention has been made in view of the above background and problems, and a high therapeutic effect is expected.
  • Another object of the present invention is to provide a corneal epithelial sheet having high safety at the time of transplantation.
  • the present inventors attempted to produce a corneal epithelial sheet under conditions that do not use cells derived from xenogeneic animals (feeder cells) when culturing epithelial cells in consideration of safety. saw.
  • feeder cells cells derived from xenogeneic animals
  • the present inventors succeeded in producing a safe and practical corneal epithelial sheet without using cells derived from xenogeneic animals at all.
  • the corneal epithelial sheet of the present invention has extremely high safety since cells derived from xenogeneic animals are not used in the production process.
  • a collagen gel containing fibroblasts an extremely dense cell layer is formed, layered culture becomes possible for the first time, and the engraftment after transplantation becomes extremely high.
  • FIG. 1 is a view showing an image of staining of corneal epithelial sheet prepared by the method of Example with matoxylin and eosin.
  • a corneal epithelial cell layer consisting of 3-4 layers is observed on the gel containing fibroblasts.
  • the morphology of the cells is close to that of normal cornea, and no corneal layer is observed in the uppermost layer, indicating the corneal morphology.
  • FIG. 2 is a view showing an electron microscope image of a corneal epithelial sheet produced by the method of the example.
  • the corneal epithelial cell layer is composed of three to four layers of cells (A). Hemidesmozo in the basement membrane And laminadensa are observed (B). Desmosomes are well formed between cells (C). Microvilli is formed in the uppermost layer, and shows almost the same findings as electron microscopic findings of human cornea. From these facts, it is considered that the microstructure also has a corneal morphology.
  • the present invention provides a corneal epithelial sheet having the following constitutional power. That is, it is a corneal epithelial sheet having a cell layer formed thereon, which is grown on a collagen gel in the absence of foreign animal cells.
  • the corneal epithelial sheet of the present invention is used for corneal epithelial regeneration (reconstruction).
  • corneal epithelial regeneration reconstruction
  • the corneal epithelial sheet of the present invention comprises (a) a step of preparing corneal epithelial cells, (b) a step of culturing human fibroblasts in a collagen gel, and (c) a step of: And culturing and growing the corneal epithelial cells in the absence of xenogeneic animal cells.
  • corneal epithelial cells are prepared.
  • the term “corneal epithelial cell” as used herein is used as a generic expression of cells contained in a corneal epithelial cell layer, that is, includes corneal epithelial cell stem cells and progenitor cells.
  • a method for preparing corneal epithelial cells is described below.
  • Corneal epithelial cells can also obtain limbal tissue strength.
  • limbal tissue force also removes endothelial cells, removes conjunctiva, and creates a single cell suspension. This is stored in a nitrogen tank, and then rapidly thawed at 37 ° C to prepare a corneal epithelial cell suspension. Subculture as necessary. For subculture, use serum-free media such as EpiLife TM (Cascade), MCDB153 medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), or a medium prepared by modifying the amino acid composition of these media. Can be.
  • the corneal epithelial cells also adjust the ability of the recipient of the corneal epithelial sheet to be transplanted (recipient). That is, it is preferable that the donor of the corneal epithelial cell and the recipient of the corneal epithelial sheet be the same person.
  • the use of such autologous cells eliminates the problem of immune rejection.
  • step b human fibroblasts are cultured in a collagen gel.
  • Collagen gel Functions as a culture substrate for human fibroblasts.
  • the type of collagen used as a raw material of the collagen gel is not particularly limited, and type I collagen, type III collagen, type IV collagen and the like can be used. A mixture of a plurality of types of collagen can also be used. These collagens can be extracted and purified from connective tissues such as cartilage and skin of animals such as pigs, pests, and sheep by acid solubilization, alkali solubilization, and enzyme solubilization.
  • telocollagen in which the telopeptide has been removed by treatment with a degrading enzyme such as pepsin or trypsin.
  • Collagen derived from amniotic membrane particularly human amniotic membrane, may be used as a material for the collagen gel.
  • amniotic membrane-derived means that the amniotic membrane is widely used as a starting material.
  • the origin of the human fibroblasts contained in the collagen matrix is not particularly limited, and may be of any tissue as long as it produces collagen, such as skin tissue, oral mucosal tissue, and the like. Human fibroblasts prepared therefrom can be used.
  • fibroblasts are prepared by the following procedure.
  • the skin is harvested and the dermis is subsequently stripped from the skin. Cut the dermis into close contact with a type I collagen coat dish.
  • the cells are detached from the bottom of the dish, and the cell suspension is adjusted and seeded on a cell culture dish.
  • the cells are cryopreserved (eg, stored in liquid nitrogen) as appropriate.
  • a neutralized collagen solution is prepared using type I collagen (see Examples below). Add this to a culture vessel (eg, culture insert) and allow to stand at room temperature for about 10 minutes to gel.
  • fibroblasts in the logarithmic growth phase which have been cultured in advance by the above-described method, are mixed with this gel and gelled again. After that, static culture is performed. By the above procedure, a collagen matrix containing fibroblasts is obtained. By this ingenuity, a collagen matrix having the necessary strength and capable of mounting an amniotic layer and cells derived from a living body is the basis of the present invention. Corneal epithelial cells prepared separately are seeded (placed) on the collagen matrix.
  • Corneal epithelial cells such as cell density of about 1 X 10 3 cells ZCM 2 or more, preferably about 1 X 10 3 cells are / cm 2 - about 1 X 10 7 cells / cm 2, more preferably about 1 X 10 4 cells / cm 2 — about 1 x 10 6 pieces / cm 2 Sown so that it becomes.
  • the culture of the corneal epithelial cells seeded on the collagen matrix (step d) is performed in the absence of xenogenic animal cells.
  • “in the absence of xenogeneic animal cells” means that, as conditions for culturing corneal epithelial cells, animal cells that are xenogeneic to the corneal epithelial cells are not used.
  • human cells when used as corneal epithelial cells, it refers to conditions under which cells of animal species other than humans, such as mice and rats, do not exist (coexist) in the culture medium. By culturing under such conditions, there is no possibility that components derived from different species (including the different types of cells themselves) may be mixed into the finally obtained transplanted material (that is, the corneal epithelial sheet).
  • the medium used for culturing the corneal epithelial cells is not particularly limited as long as the cells are proliferated.
  • a medium that is serum-free and does not contain a protein derived from a heterologous animal On the other hand, a medium to which a growth factor, an antibiotic or the like has been added may be used.
  • a serum-free medium that is, it is preferable to employ a serum-free culture method as the culture method in the present invention. This is because problems such as immune rejection due to contamination with serum-derived components can be avoided.
  • the culture may be performed in a medium containing serum, but in this case, autologous serum using serum derived from the same species (human-derived serum when culturing human corneal epithelial cells) is used. It is preferable to use them. Of course, if possible, it is preferable to use autologous serum which eliminates the risk of causing immune rejection.
  • Culture conditions can be changed during the culture step for the purpose of good growth and stratification of corneal epithelial cells.
  • step d corneal epithelial cells proliferate on the collagen matrix.
  • step e a step of bringing the surface layer of the cell layer into contact with air. This step is also referred to herein as air-lifting. This step e is performed for the purpose of differentiation of cells forming a cell layer, induction of a barrier function, and the like.
  • the surface of the culture solution is lowered by temporarily removing a part of the culture solution using a dropper, a pipette, or the like, so that the outermost layer of the cell layer is temporarily removed from the culture solution.
  • This can be done by exposing.
  • it can be carried out by lifting the cell layer together with the collagen matrix and temporarily exposing the outermost layer to the surface of the culture solution.
  • air may be sent into the culture solution using a tube or the like to bring the air into contact with the uppermost layer of the cell layer. From the viewpoint of ease of operation, it is preferable to perform the method by lowering the surface of the culture solution to expose the outermost layer of the cell layer.
  • the time for performing this step e that is, the time for bringing the outermost layer of the layered cell layer into contact with air varies depending on the state of the cells, culture conditions, and the like, but is, for example, about 3 days to 13 weeks, preferably One to two weeks a day, more preferably about one week.
  • Corneas were purchased from donors from Northwest Lions Eye Bank (Seattle, USA). 1-2. Serum-free culture of corneal epithelial cells
  • the epithelium is also detached using tweezers under a stereoscopic microscope.
  • the detached corneal epithelium is washed with DMEM, then washed with PBS, dipped in 0.25% trypsin solution, and treated at 37 ° C for 10 minutes.
  • the corneal epithelial cell suspension is prepared by adding PBS. Count the cells and centrifuge at 100 rpm for 5 minutes to pellet the cells.
  • the supernatant is aspirated, the cells are suspended in serum-free EpiLife medium, and 1 x 2 x 10 cells / 60 ml per 60 mm collagen-coated Petri dish (Asahi Techno Glass, type I collagen-coated tissue; 4010-020) Seed at the rate of the solution. The next day, Change, and then change the culture medium every other day. Subculture is performed when the cell density reaches about 70-80%.
  • the corneal epithelial cells were cultured in a serum-free medium.
  • a medium containing serum can also be used as in the procedure described below.
  • cryopreservation conditions including the composition of the preservation solution
  • thawing conditions of the prepared corneal epithelial cells are shown below.
  • Cryopreservation conditions Reduce the temperature to -20 ° C at a rate of 1 ° C / hour and then store in a nitrogen tank.
  • the peeled dermis is washed with DMEM, it is cut into small pieces of 2 mm on a side using a scalpel. Adhere the minced dermis pieces to type I collagen-coated dishes at intervals of about 1 cm. CO ink
  • Type I collagen solution (cell matrix type 1A: 3 mg / ml: Nitta gelatin): 0.1N NaOH: 1 volume, 8 times concentration DMEM: 1 volume, 20% FCS / DMEM: 10 volumes per 6 volumes
  • a neutral collagen solution final concentration of collagen: lmg / ml) at 4 ° C, add lml to a 24 mm diameter lubricating insert (Corning-Costar), and allow to stand at room temperature for 10 minutes. Place and gel.
  • the corneal epithelial cells are seeded on the recess. That is, the corneal epithelial cells prepared in 1-2. Are recovered by removing the dish force using trypsin 'EDTA'. Centrifuge at lOOOO rpm for 5 minutes, remove the supernatant, and adjust to about 3-4 xlO 6 cells / ml. Volumetrically, 50-601 suspensions can be added onto the collagen gel. 1.5-2.0 hours CO incubator so that corneal epithelial cells adhere to the gel
  • 0 phosphoethanolamine; 0. lmM, insulin; 5ug / ml, hydrocortis one; 0.4ug / ml,
  • L-glutamine 4mM, Adenin; 0.18mM, transfferin; 5ug / ml, selenious acid; 53nM, triiodothyronine; 20pM, serine; lmM, choline chloride; 0.64mM, linoleic acid; 2ug / ml, FCS; 2%
  • the culture medium is changed on the third day. Cultured cornea is completed after 3 days of air exposure.
  • the corneal epithelial sheet provided by the present invention is used for regeneration (reconstruction) of corneal epithelium. Further, the corneal epithelial sheet of the present invention can be used for gene therapy.
  • Gene therapy can be broadly divided into in vivo and ex vivo methods. The former is a method in which a gene is directly introduced into a living body, and the latter is a method in which cells are immediately removed, the gene is introduced and then returned to the body.
  • the introduction of genes into cultured corneal epithelium will immediately lead to the ex vivo approach.
  • the effectiveness of gene transfer into keratinocytes by various viral vectors has been shown, and in particular, almost all keratinocytes can be transferred by using adenovirus vectors.

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Abstract

　高い治療効果が望めるとともに移植時の安全性が高い角膜上皮シートを提供する。(a)角膜上皮細胞を調製し、一方で(b)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養し、(c)前記角膜上皮細胞を前記コラーゲンゲル上に播種ないし載置し、(d)異種動物細胞非存在下、前記角膜上皮細胞を培養して増殖させることによって、角膜上皮シートを作製する。

Description

明 細 書
角膜上皮シート及びその作製方法、並びに同シートを用いる移植方法 技術分野
[0001] 本発明は角膜上皮シートに関する。詳細には、本発明は、異種動物由来細胞をフ ィーダ一細胞として使用することなぐ角膜上皮細胞をコラーゲンゲル上で培養 '増 殖させることによって作製される角膜上皮シート及び同シートの作製方法、並びに同 シートの利用 (移植方法等）に関する。
背景技術
[0002] 再生医療の貢献が期待されている組織の一つが角膜である。角膜は、眼球を構成 する光学系の最も外層にあり、透明な血管のない組織であって、涙液と共に平滑な 表面を形成することにより良好な視力を得ることに貢献している。また、角結膜上皮細 胞は常に外界と接し、外界の微生物などの異物、紫外線などの光線など力 眼球を 守る防御作用を持っている。すなわち、角結膜上皮細胞は、角膜の透明性と眼球全 体を防御し恒常性を維持するために極めて重要な役割を果たして 、る。
[0003] 角膜は、例えば、角膜炎、角膜潰瘍、穿孔等の病態により濁り、透明性が失われて しまう場合がある。このような角膜の濁りによる永続的な視力の低下に対しては、眼球 提供者カゝら提供された角膜を用いる角膜移植による治療が行われている。角膜移植 は、患者の透明性が失われた角膜を取り除いた後、透明な角膜を移植するというもの であって、この移植により透明性が回復し、再び視力を取り戻すことができる。
このような角膜移植によって効果的な治療効果が期待できる場合がある一方で、角 膜の移植だけでは対処できない疾病が存在する。例えば、ステイーブンス 'ジョンソン 症候群、眼類天疱瘡、化学外傷、熱傷などである。通常、角結膜上皮細胞は、毎日 分裂を繰り返し、古くなつた細胞は、はがれ落ち、幹細胞組織から新たな細胞が再生 される。ところが以上のような病態では、角膜を再生させる幹細胞組織に障害がある ことがわかってきている。
[0004] 角膜上皮を再生させる幹細胞組織は「角膜輪部組織」と呼ばれ、ちょうど黒目と白 目の境界部分に限局し、外界に露出された特殊な環境にある。上述した病態では、 この幹細胞組織自体がなんらかの障害を受けて根絶してしまうと考えられて 、る。そ して、この幹細胞組織の根絶により、その欠損部分は周りに存在する結膜上皮で覆 われ、透明性に欠け、視力の極端な低下力あたらされる。このように上述の病態では 角膜輪部が枯渴して ヽるため、単に角膜を移植するだけでは移植された角膜を長期 に維持できない。そのため恒久的な眼表面再建を図るためには角膜輪部をも移植す る必要がある。この角膜輪部を移植する方法の一つとして羊膜移植法が開発されて いる（メディカル朝日 1999年 9月号： p62— 65、 N Engl J Med340 : 1697— 1703 、 1999 :非特許文献 1)。この移植法に用いられる羊膜は、帝王切開した妊婦等の胎 盤カゝら得られる。羊膜は厚い基底膜をもつことから、移植された場合、角結膜上皮細 胞が増殖、分化するための基質として作用する。さらに、羊膜は免疫原性がほとんど ないことに加え、抗炎症、瘢痕形成抑制などの作用を併せ持つことから、羊膜上に移 植される角結膜上皮やこれらの幹細胞組織は移植受容者 (レシピエント）の拒絶反応 等カゝら保護されることになる。
[0005] 非特許文献 1 :メディカル朝日 1999年 9月号： p62— 65、 N Engl J Med340 : 1697 一 1703、 1999
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 角膜が結膜上皮で覆われ混濁を生じる眼表面疾患に対する外科的治療としては、 現在は角膜上皮移植術が行われて ヽるが、強 ヽ炎症を伴った難治性角結膜疾患（ Stevens-Johnson症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食など）においては、その予後が極 めて不良である。その最大の理由として、強い抗原性を有する異系（ァ口）の角膜上 皮が宿主の免疫系に認識され拒絶を受けることが挙げられる。更に、拒絶反応の予 防のため術後に多量の免疫抑制剤を全身及び局所投与することによる合併症もそ の予後不良の大きな要因となっている。一方、ァ口の角膜上皮を利用する場合には、 ドナー不足の問題がある。一眼力も得られる角膜を用いて数十の角膜上皮シートの 作製できる技術を達成すればドナー不足の課題は解決される。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は以上の背景及び課題に鑑みてなされたものであって、高い治療効果が望 めるとともに移植時の安全性が高い角膜上皮シートを提供することを目的とする。か 力る目的の下、本発明者らは、安全性を考慮して上皮細胞の培養時に異種動物由 来の細胞 (フィーダ一細胞)を使用しない条件とした上で角膜上皮シートの作製を試 みた。その結果、ヒト線維芽細胞を含有したコラーゲンゲル上で角膜上皮細胞を培養 することによって、フィーダ一細胞を使用することなく良好な重層化及び上皮化が達 成された。特に、無血清培地を使用することによって良好な成績が得られた。
以上のように本発明者らは、異種動物由来の細胞を全く用いな 、安全で実用的な 角膜上皮シートの作製に成功した。
[0008] 本発明は以上の成果及び知見に基づいて完成されたものであって、次の構成を提 供する。
[1]異種動物細胞非存在下、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上で増殖さ せた角膜上皮細胞を含有してなる角膜上皮シート。
[2]無血清培地を使用して前記角膜上皮細胞を増殖させることを特徴とする、 [1]に 記載の角膜上皮シート。
[3]血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用して前記角 膜上皮細胞を増殖させることを特徴とする、 [1]に記載の角膜上皮シート。
発明の効果
[0009] 本発明の角膜上皮シートは、その作製過程において異種動物由来の細胞を使用 しないことから安全性が極めて高いものとなる。また、線維芽細胞を含むコラーゲンゲ ルを使用することによって、極めて緻密な細胞層が形成され、重層培養がはじめて可 能となり、移植後の生着性が非常に高くなる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]実施例の方法で作製した角膜上皮シートへマトキシリン'ェォジン染色像を示 す図である。線維芽細胞を含むゲルの上に 3— 4層からなる角膜上皮細胞層が認めら れる。細胞の形態は正常角膜に近いもので、最上層では角層の形成は認められず、 角膜の形態を示している。
[図 2]実施例の方法で作製した角膜上皮シートの電子顕微鏡像を示す図である。角 膜上皮細胞層が 3— 4層の細胞で構成されて ヽる (A)。基底膜部ではへミデスモゾー ムの形成、ラミナデンサの形成が認められる（B)。細胞間ではデスモゾームが良好に 形成されている（C)。最上層では microvilliが形成されており、ヒト角膜の電子顕微鏡 所見とほぼ同様の所見を呈している。これらのことより、微細構造も角膜の形態を呈し ていると考えられる。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、次の構成力もなる角膜上皮シートを提供する。即ち、異種動物細胞非 存在下、コラーゲンゲル上で増殖させた角膜上皮細胞力 なる細胞層が形成されて いる角膜上皮シートである。本発明の角膜上皮シートは、角膜上皮の再生 (再建）に 利用される。以下に本発明の角膜上皮シート及びその製法の特徴を詳述する。
[0012] 本発明の角膜上皮シートは、（a)角膜上皮細胞を調製するステップ、（b)コラーゲンゲ ル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ、（c)前記角膜上皮細胞を前記コラーゲン ゲル上に播種ないし載置するステップ、（d)異種動物細胞非存在下、前記角膜上皮 細胞を培養して増殖させるステップを含む方法によって作製される。
ステップ aでは角膜上皮細胞が調製される。特に記載のない限り、本明細書におい て「角膜上皮細胞」とは角膜上皮細胞層に含まれる細胞を包括した表現として使用さ れ、即ち角膜上皮細胞の幹細胞及び前駆細胞をも含む。角膜上皮細胞の調製方法 の一例を以下に示す。
[0013] 角膜上皮細胞は角膜輪部組織力も得ることができる。例えば角膜輪部組織力も内 皮細胞を剥離除去し、結膜を切除し単一細胞懸濁液を作製する。そしてこれを窒素 タンクで保存し、その後急速に 37°Cで融解して角膜上皮細胞浮遊液を調整する。必 要に応じて継代培養する。継代培養には、例えば無血清培地である EpiLife™ (カス ケード社)、 MCDB153培地（日水製薬株式会社)やこれらの培地のアミノ酸組成等を 改変して作製される培地などを使用することができる。
[0014] 角膜上皮細胞は、角膜上皮シートの移植を受ける者 (レシピエント)力も調製するこ とが好ましい。即ち、角膜上皮細胞のドナーと、角膜上皮シートのレシピエントが同一 人であることが好ましい。このような自家細胞を用いることにより、免疫拒絶の問題が 解消される。
[0015] ステップ bではコラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞が培養される。「コラーゲンゲル」 はヒト線維芽細胞の培養基質として機能する。コラーゲンゲルの原材料となるコラー ゲンの種類は特に限定されず、 I型コラーゲン、 III型コラーゲン、 IV型コラーゲンなど を用いることができる。複数の種類のコラーゲンが混在するものを用いることもできる。 これらのコラーゲンは、ブタ、ゥシ、ヒッジなどの動物の皮膚、軟骨などの結合組織か ら、酸可溶化法、アルカリ可溶化法、酵素可溶化法などにより抽出、精製することが できる。尚、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシンなどの分解酵素で処 理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるァテロコラーゲンとしたものを用い ることが好ましい。コラーゲンゲルの材料として羊膜由来、特にヒト羊膜由来のコラー ゲンを用いてもよい。ここで、羊膜由来とは、広く羊膜を出発原料として得られたもの であることを意味する。
[0016] コラーゲンマトリクスが含有するヒト線維芽細胞の由来は特に限定されず、コラーゲ ンを産生するものであればいずれの組織由来のものでもよぐ例えば、皮膚組織、口 腔粘膜組織などカゝら調製したヒト線維芽細胞を使用することができる。
[0017] コラーゲンマトリクスの作製方法の具体例を示す。まず、以下の手順で線維芽細胞 を調製する。皮膚を採取し、続いて皮膚から真皮を剥離する。真皮を細切し、 I型コラ 一ゲンコートディッシュに密着させる。静置培養し、真皮片から遊走する線維芽細胞 を継代する。細胞がディッシュ底面から剥離させ、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用 ディッシュに播種する。適宜細胞を凍結保存 (例えば液体窒素中で保存)する。 一方、 I型コラーゲンを用いて中和コラーゲン液を調製する (後述の実施例を参照） 。これを培養容器 (例えばカルチャーインサート）に添加し、室温で 10分間程度静置 させてゲル化させる。次に、上述の方法によって予め培養しておいた対数増殖期の 線維芽細胞をこのゲルに混和し、再度ゲル化させる。その後、静置培養する。以上の 手順によって線維芽細胞を含有するコラーゲンマトリクスが得られる。この創意工夫 により、必要な強度を有し、羊膜層や生体由来細胞を載置できるコラーゲンマトリクス となったもので、本発明の根幹をなす。コラーゲンマトリクス上には、別途用意した角 膜上皮細胞が播種 (載置)される。
角膜上皮細胞は、例えば細胞密度が約 1 X 103個 Zcm2以上、好ましくは約 1 X 103 個/ cm2—約 1 X 107個/ cm2、更に好ましくは約 1 X 104個/ cm2—約 1 X 106個/ cm2と なるように播種される。
[0018] コラーゲンマトリクス上に播種した角膜上皮細胞の培養 (ステップ d)は異種動物細 胞非存在下で実施される。本発明において「異種動物細胞非存在下」とは、角膜上 皮細胞を培養する際の条件として、当該角膜上皮細胞に対して異種である動物の細 胞が使用されないことをいう。具体的には角膜上皮細胞としてヒト細胞を使用する場 合に、マウスやラット等、ヒト以外の動物種の細胞が培養液中に存在 (併存)しない条 件のことをいう。このような条件で培養を実施することによって、最終的に得られる移 植材料 (即ち角膜上皮シート）に異種由来の成分 (異種細胞自体を含む)が混入する おそれがなくなる。
角膜上皮細胞を培養する際に用いられる培地は、当該細胞を増殖させるものであ れば特に限定されない特に、本発明では無血清で且つ異種動物由来のタンパク質 を含まない培地を用いることが好ましい。一方、成長因子や抗生物質等が添加され た培地を使用してもよい。但し、血清を含まない培地を使用することが好ましい。即ち 、本発明における培養方法として無血清培養法を採用することが好ましい。血清由 来の成分の混入による免疫拒絶等の問題を回避することができるからである。尚、血 清を含む培地中で培養することにしてもよいが、その場合には同種由来の血清 (ヒト の角膜上皮細胞を培養する際にはヒト由来の血清)を使用する力 自家血清を使用 することが好ましい。勿論、可能であれば、免疫拒絶反応の惹起のおそれがなくなる 自家血清を使用することが好ま ヽ。
角膜上皮細胞の良好な増殖及び重層化を目的として培養ステップの途中で培養 条件を変更することもできる。
[0019] ステップ dの結果、コラーゲンマトリクス上で角膜上皮細胞が増殖する。このようにし て得られた細胞層の表層の角化を促すために、細胞層の表層を空気に接触させるス テツプ (ステップ e)を実施することが好ましい。尚、このステップを本明細書において エアーリフティング (Air-lifting)とも呼ぶ。このステップ eは、細胞層を形成する細胞の 分化、バリア機能の誘導等を目的として行われる。
このステップは、培養液の一部をスポイト、ピペットなどを用いて一時的に除去する ことにより培養液表面を低下させ、これにより細胞層の最表層を一時的に培養液外に 露出させることによって行うことができる。又は、細胞層をコラーゲンマトリクスごと持ち 上げて、最表層を培養液表面力 一時的に露出させることにより行うこともできる。更 には、チューブなどを用いて空気を培養液中に送り込み、細胞層の最上層に空気を 接触させてもよい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて細胞層の最 表層を露出させる方法により行うことが好ましい。
このステップ eを行う時間、即ち重層化した細胞層の最表層を空気に接触させる時 間は、細胞の状態や培養条件などによって変動するが、例えば 3日一 3週間程度で あり、好ましくは 5日一 2週間、更に好ましくは約 1週間である。
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明は当該実施例 に限定されるものではない。
実施例 1
コラーゲンゲルを用いた三次元角膜上皮シートの作製
1.角膜上皮細胞の調製
1-1.角膜の調達
角膜はドナー用のものを Northwest Lions Eye Bank (シアトル、米国）より購入した。 1-2.角膜上皮細胞の無血清培養法
角膜をダルベッコリン酸緩衝液 (PBS)の入ったシャーレに移し、実体顕微鏡下に輪 部をメスにて一辺が 2— 3mmに細切する。細切した輪部を数回 PBSにて洗浄し、 70% エタノールに 1分間浸し滅菌する。 PBSにて洗浄後、デイスパーゼ液 (ディスパーゼ II 、合同酒精社、 250単位/ mlダルベッコ変法 MEM培地； DMEM)に浸し、 4°Cで一晚（ 18— 24時間）静置する。翌日、実体顕微鏡下にピンセットを用いて上皮を実質力も剥 離する。剥離した角膜上皮を、 DMEMにて洗浄、続いて、 PBSにて洗浄後、 0.25%トリ プシン溶液中にひたし、 37°C、 10分間の処理を行う。表皮をトリプシン中和液を入れ たプラスチックシャーレに移しピンセットにて表皮片をほぐし、 15mlの滅菌チューブに 移す。 PBSを添加し、角膜上皮細胞浮遊液を調整する。細胞数を数え、 lOOOrpm, 5 分間遠心し細胞を沈殿させる。上清を吸引し、細胞を無血清培地である EpiLife培地 で懸濁し、 60mmコラーゲンコートシャーレ（旭テクノグラス、 I型コラーゲンコートデイツ シュ; 4010-020)当たり 1一 2 X 106細胞 /5ml培養液の割合で播種する。翌日培養液を 交換し、以後 1日おきに培養液を交換する。細胞密度が 70— 80%程度になった時点 で継代培養を行う。
尚、以上の方法では無血清培地中を使用して角膜上皮細胞を培養することにした 力 以下に示す手順のように血清を含む培地を使用することもできる。
(1)角膜輪部組織力ゝら内皮細胞を剥離除去し、結膜を切除する。
(2)デイスパーゼ液（ディスパーゼ I、合同酒精社、 250単位/ mlダルベッコ変法 MEM 培地； DMEM)に浸して 4°Cでー晚（18— 24時間）静置する。
(3) 0.25%トリプシン溶液中にひたし、 37°C、 10分間の処理を行う。
(4)顕微鏡下で上皮のみをトリプシン溶液中ではがす。
(5)ピペッティングして、 30%FCS/DMEMを同量カ卩えて懸濁する。
(6) PBS (-)で残りの細胞をさらに回収して遠心処理する。
(7)適量の培養液で単一細胞懸濁液とする。
[0021] 調製した角膜上皮細胞の凍結保存条件 (保存液組成含む)及び融解条件の一例 を以下に示す。
凍結保存条件： 1°C/時間の速度で- 20°Cまで温度を低下させ、その後窒素タンクで 保存する。
保存液組成： 20%FCS/10%DMSO/DMEM
融解条件：出来るだけ急速に 37°Cで融解し、 PBSで 10倍希釈する。
[0022] 2.線維芽細胞の調製
剥離した真皮を DMEMにて洗浄後、一辺カ^ー 2mmにメスを用いて細切する。細切 した真皮片を I型コラーゲンコートディッシュに約 lcmの間隔で密着させる。 COインキ
2 ュベータ一に 30分間静置し、完全に密着させる。その後、牛胎児血清を 10%含む DMEM培地を約 5ml添加し、 7日間静置する。 7日目に初回の培養液交換を行う。真 皮片から線維芽細胞が遊走してくるのを確認する。細胞が増殖し、真皮片の周囲 5mmまで遊走してきた段階で、継代を行う。 PBSで洗浄後、 0.125%トリプシン、
0.05%EDTAを含む溶液を 3ml添カ卩し、 37°C、 3分間処理する。細胞がディッシュ底面 力も剥離したことを顕微鏡で確認した後、 3 mlのトリプシンインヒビターを添加し細胞 を回収し 50mlのチューブに移す。 PBSを用いて残りの細胞を回収し、 1000rpm、 5分間 の遠心処理にて細胞を沈殿させ、上清を吸引後、牛胎児血清を 10%含む DMEM培 地を添加し、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。継代の細胞 密度はおおむね 1 : 3程度とする。適宜細胞を凍結保存する。凍結保存液は 10%ダリ セロール、 20%FCS、 70%DMEMを用い、液体窒素中で保存する。
[0023] 3. 中和コラーゲンゲルの作製
I型コラーゲン溶液 (セルマトリクスタイプ 1A: 3mg/ml：新田ゼラチン）： 6容量に対して 0.1N NaOH : 1容量、 8倍濃度 DMEM : 1容量、 20%FCS/DMEM : 10容量の割合で中 和コラーゲン液 (コラーゲンの最終濃度： lmg/ml)を 4°Cにて作製し、直径 24 mmの力 ルチヤーインサート（Corning- Costar社）に lmlずつ添カ卩し、室温で 10分間静置しゲ ル化させる。あら力じめ培養してぉ 、た対数増殖期の線維芽細胞 (デイスパーゼ処理 し表皮を剥離した残りの真皮から outgrowth法で培養し 5-10代継代した細胞を用いる 。）を 5xl05細胞/ ml、 10%FCS/DMEMの濃度に調整し、この細胞懸濁液： 2容量に対し て中和コラーゲン液： 8容量の割合で混和し、細胞を含む中和コラーゲン溶液を調製 する（コラーゲンの最終濃度： 0.8mg/ml)。この溶液を各カルチャーインサートに 3.5ml ずつ添カ卩し、 COインキュベーター内 (37°C
2 、 5%CO )に静置する。約 30分でゲル化し
2
たことを確認する。その後 10%FCS/DMEMをゲルが浸る程度（カルチャーインサイト 内側に 3ml、カルチャーインサート外側に 3ml)加え 5日間静置培養する。培養 2日目よ りゲルは収縮を開始しはじめ、線維芽細胞の増殖を位相差顕微鏡下に観察できる。
[0024] 4.角膜上皮細胞の播種
線維芽細胞の培養開始後 5日目にはコラーゲンゲルの底面はメンブレンに密着し、 一方でコラーゲンゲル上部は収縮して直径 13-15mm、厚さ 2_3 mm程度となる。また、 コラーゲンゲル中央はちょうどクレーター状に陥凹している。この陥凹している上に角 膜上皮細胞を播種する。即ち、 1-2.で調製した角膜上皮細胞をトリプシン 'EDTAを 用いてディッシュ力も剥離し'回収する。 lOOOrpm, 5分間遠心し、上清を除去し、 3-4 xlO6細胞/ ml程度に調整する。容量的には 50— 60 1の懸濁液をコラーゲンゲル上に 添加できる。角膜上皮細胞がゲルに密着するように 1.5— 2.0時間 COインキュベータ
2
一内で静置し、その後表皮細胞増殖用無血清培地を緩やかに添加し (カルチャーィ ンサート内側に 3ml、カルチャーインサート外側に 3ml)、さらに 14日間液相下で培養 を続ける。角膜上皮細胞播種 3日目に培養液を重層化用培養液 (下記参照）に変更 し、以後 2日に 1回培養液を交換する。
重層化用培地は以下のごとく調整する。ダルベッコ変法 MEM培地： F-12培地 = 1:1 、カノレシゥム濃度； 1.95mM、 monoethanolamine;0.1mM、
0— phosphoethanolamine;0. lmM、 insulin;5ug/ ml、 hydrocortis one ; 0.4ug/ ml、
L— glutamine;4mM、 Adenin;0.18mM、 transfferin;5ug/ml、 selenious acid;53nM、 triiodothyronine;20pM、 serine; lmM、 choline chloride ;0.64mM、 linoleic acid;2ug/ml、 FCS;2%
[0025] 5.気相下培養
角膜上皮細胞を播種後 14日目に空気曝露 (エアーリフティング)を行う。空気曝露 用の維持容器に滅菌したフィルターペーパーを設置し、重層化用培地をフィルター ペーパーが浸る程度 (約 9ml)添加する。カルチャーインサート内側の培養液を注意 深く除去し、カルチャーインサートをフィルターペーパー上に移し、 COインキュベー
2
ター内で培養する。培養液は 3日目に交換する。 3日間の空気曝露により培養角膜が 完成する。
[0026] 6.組織学的検索
空気曝露後 3日目では角膜上皮は 3— 4層となり、角層の形成が認められ、正常ヒト 角膜とほぼ同様の構造を呈していた（図 1、 2)。
産業上の利用可能性
[0027] 本発明が提供する角膜上皮シートは、角膜上皮の再生 (再建）に利用される。また 、本発明の角膜上皮シートを遺伝子治療に利用することも可能である。遺伝子治療 には大きく in vivo法と ex vivo法があり、前者は遺伝子を直接生体内に導入する方法 で、後者はいつたん細胞を取り出し、遺伝子を導入した後再び体内に戻す方法であ る。遺伝子治療の現在の技術水準に鑑みると、培養角膜上皮に遺伝子を導入しさえ すれば即座に ex vivo法へと発展する。各種ウィルスベクターによるケラチノサイトへ の遺伝子導入の有効性が示されてきており、特に、アデノウイルスベクターを用いた 場合ほぼ 100%のケラチノサイトに導入可能である。
[0028] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

請求の範囲
[1] 異種動物細胞非存在下、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上で増殖させ た角膜上皮細胞を含有してなる角膜上皮シート。
[2] 無血清培地を使用して前記角膜上皮細胞を増殖させることを特徴とする、請求の 範囲第 1項に記載の角膜上皮シート。
[3] 血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用して前記角膜 上皮細胞を増殖させることを特徴とする、請求の範囲第 1項に記載の角膜上皮シート
[4] 以下のステップを含んでなる、角膜上皮シートの作製方法：
(a)角膜上皮細胞を調製するステップ；
(b)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ；
(c)前記角膜上皮細胞を前記コラーゲンゲル上に播種な 、し載置するステップ；
(d)異種動物細胞非存在下、前記角膜上皮細胞を培養して増殖させるステップ。
[5] 以下のステップを更に含むことを特徴とする、請求の範囲第 4項に記載の作製方法
(e)前記角膜上皮細胞が増殖した後、最表層を空気に接触させるステップ。
[6] 前記ステップ dが、無血清培地を使用して実施されることを特徴とする、請求の範囲 第 4項又は第 5項に記載の作製方法。
[7] 前記ステップ dが、血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を 使用して実施されることを特徴とする、請求の範囲第 4項又は第 5項に記載の作製方 法。
[8] 請求の範囲第 1一 3項のいずれかの角膜上皮シートを移植材料として使用する移 植方法。
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