WO2005085289A1 - Spezifische monoklonale und polyklonale antikörper für repinotan und dessen ringoffene form - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft monoklonale und polyklonale Antikörper, die Repinotan und dessen ringoffene Form spezifisch erkennen, deren Herstellung und Verwendung zur Bestimmung von Repinotan und dessen ringoffene Form in Körperflüssigkeiten sowie die diese Anitkörper produzierenden Hybridomazellen.

Description

Spezifische monoklonale und polyklonale Antikörper für Repinotan und dessen ringoffene Form
Die Erfindung betrifft monoklonale und polyklonale Antikörper, die Repinotan und dessen ringoffene Form spezifisch erkennen, deren Herstellung und Verwendung zur Bestimmung von Repinotan und dessen ringoffene Form in Körperflüssigkeiten sowie die diese Antikörper produzierenden Hybridomazellen.
1 ,2-Benzisothiazol-3 (2H)-one-2-[4-[[3 ,4-dihydro-2H- 1 -benzopyran-2-yl)methyl] amino]butyl]-l , 1 - ' dioxid Monohydrochlorid (generischer Name: Repinotan) der Formel
Figure imgf000002_0001
und dessen agonistische Wirkung am 5-HTlA Rezeptor sowie Eignung als Wirkstoff zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems sind aus den EP 352 613, 749 970 und 1 051 170 bekannt.
Repinotan hat in mehreren klinischen Studien eine gute Verträglichkeit in gesunden Probanden und Patienten nach einem Schlaganfall oder Schädelhirntrauma gezeigt. Als besonders vorteilhaft hat sich eine Akuttherapie von Repinotan erwiesen. Darüber hinaus deuten die vorliegenden klinischen Daten darauf hin, dass die neurologischen und funktionalen Defizite (nach 3 bzw. 6 Monaten je nach Indikation) verbessert werden konnten. Insbesondere bei Patienten, die im Rahmen einer Akuttherapie Blutplasmakonzentrationen im Bereich von ca. 5-20 μg/1 erreichten, war das Behandlungsergebnis deutlich besser als bei den Patienten, die Placebo erhalten hatten. EP 1 339 403 offenbart, dass sich ein besonders guter Behandlungserfolg mit einem erfindungs- gemäßen Kit, das eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Repinotan oder ein physiologisch unbedenkliches Salz von Repinotan und ein Mittel zur Bestimmung der Konzentration von Repinotan oder seinen Metaboliten in Körperflüssigkeiten umfasst, erzielt werden kann.
Im Rahmen einer Akuttherapie zur Behandlung von Schlaganfall oder Schädelhirntrauma eignen sich als Mittel zur Bestimmung der Konzentration von Repinotan besonders immunologische Methoden, die auf Antikörperreaktionen beruhen.
Repinotan der Formel I weist in Lösung im alkalischen pH-Bereich eine ausgeprägte Hydrolyse- empfmdlichkeit auf, die mit steigender Hydroxidionenkonzentration zunimmt. Oberhalb pH 8 wird Repinotan bei Raumtemperatur vollständig hydrolysiert. Die Hydrolyseempfindlichkeit ist auch abhängig von der Konzentration an Repinotan in wässriger Lösung und nimmt mit steigender Verdünnung der Lösung zu. Bei Repinotankonzentrationen in wässriger Lösung von 0.005 Gewichtsprozent ist Repinotan bereits zu 12 % hydrolysiert und bei einer Konzentration von 0.001 Gewichtsprozent sogar zu 33 %. Die Hydrolyse fuhrt zur Öffnung des Saccharinringes unter Bildung der Sulfonamidocarbonsäure der Formel II.
Figure imgf000003_0001
(I) (H)
Unter physiologischen Bedingungen in Blutplasma (pH 7-7.4) ist Repinotan bezüglich der oben beschriebenen Hydrolysereaktion stabil.
Im Körper des Patienten wird Repinotan zu den Metaboliten der Formeln HI bis NU abgebaut, die sich in Körperflüssigkeiten der Patienten nachweisen lassen.
Figure imgf000003_0002
(III) (iv)
Figure imgf000003_0003
(V) (VI)
Figure imgf000003_0004
(VII) ,
Die Reatkionsbedingungen im Rahmen einer immunologischen Methode können zu pH Wert Ver- änderwgen und verdümiteren Lösungen füliren und damit von den physiologischen Bedingungen abweichen, was zu der oben beschriebenen Hydrolysereaktion führt. Repinotan kann während des Diagnoseverfahrens demnach sowohl als Verbindung der Formel I, als auch als ringoffene Verbindung der Formel II vorliegen. Eine Methode, die nur Repinotan diagnostiziert, gibt ein verfälschtes Ergebnis wieder, da die ringoffene Verbindung der Formel II nicht erkannt wird. Das Testergebnis würde eine niedrigere Konzentration an Repinotan anzeigen, als die, die sich tatsächlich in der Körperflüssigkeit befindet. Ein ebenfalls verfälschtes Ergebnis würde erhalten werden, wenn die immunologische Methode sowohl Repinotan als auch die Metaboliten der Formeln III bis VII erkennt, die pharmazeutisch nicht aktiv sind. Das Testergebnis würde eine höhere Konzentration an Repinotan anzeigen, als die, die sich tatsächlich in der Körperflüssigkeit befindet.
Geeignete Antikörper für eine immunologische Methode zur Bestimmung der Konzentration von Repinotan in Körperflüssigkeiten, müssen spezifisch für Repinotan sowie dessen ringoffenen Form der Formel II sein, sollten jedoch die Metaboliten der Formeln IH bis VII nicht erkennen können.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Auffinden eines für Repinotan und dessen ring- offene Form selektiven Antikörpers, geeignet für die Verwendung für ein immunologisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Repinotan in Körperflüssigkeiten. Diese mono- klonalen oder polyklonalen Antikörper sollen Repinotan und dessen ringoffene Form der Formeln I und II selektiv erkennen und nicht die Metaboliten der Formeln DI bis VE, die nach Verabreichung im Körper des Patienten auftreten.
Die für die immunologische Methode verwendeten Körperflüssigkeiten sind Blut oder aus Blut gewonnene Fraktionen, Urin und Speichel. Bevorzugt ist die Verwendung von Blut oder aus Blut gewonnenen Fraktionen, vorzugsweise Blutplasma.
Als immunologische Methode eignen sich beispielsweise ELISA's (enzyme linked immunosorbent assays). Mittel dieser Art sind bekannt.
Polyklonale Repinotan spezifische Antikörper werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Mit Hilfe der in Beispiel 2 beschriebenen immunologischen Diagnosemethode können Kreuzaktivitäten der vorliegenden Antikörper bestimmt werden. Überraschenderweise gelingt es, sowohl polyklonale, als auch monoklonale Antikörper so auszuwählen, dass diese Antikörper Repinotan und die Verbindung der Formel II mit einer Kreuzalctivität von etwa 100 % erkennen. Die Verbindungen der Formeln DI und IV werden mit einer Kreuzalctivität von etwa 10 % erkannt und die Verbindungen der Formeln V bis VD werden von den ausgewählten Antikörpern nicht erkamαt. Zur genaueren Charakterisierung der Repinotan und dessen ringoffenen Form bindenden Regionen wurde die Sequenz der entsprechenenden Sequenzabschnitte eines monoklonalen Antikörpers ermittelt.
Gegenstand der Erfindung sind polyklonale Antikörper, die Repinotan der Formel
Figure imgf000005_0001
sowie dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze, binden.
Bevorzugt sind polyklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, die Repinotan Hydrochlorid sowie dessen Salze und Solvate binden.
Ebenfalls bevorzugt sind polyklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften auf- weisen, die Repinotan der Formel I, dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze und die Verbindung der Formel
Figure imgf000005_0002
dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze, binden.
Ebenfalls bevorzugt sind polyklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften auf- weisen und die. die Verbindungen der Formeln
Figure imgf000006_0001
(V) (VI)
Figure imgf000006_0002
sowie deren Salze, Solvate und Solvat der Salze, nicht binden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper, die Repinotan der Formel
Figure imgf000006_0003
sowie dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze, binden.
Bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, die Repinotan Hydrochlorid sowie dessen Salze und Solvate binden.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, die Repinotan der Formel I, dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze und die Ver- bindung der Formel
Figure imgf000007_0001
dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze, binden.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen und die die Verbindungen der Formeln
Figure imgf000007_0002
(III) (IV)
Figure imgf000007_0003
(V) (VI)
Figure imgf000007_0004
sowie deren Salze, Solvate und Solvat der Salze, nicht binden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 60 % Identität zu SEQ DO NO:l aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 65 % Identität zu SEQ ID NO:l aufweist. Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70 % Identität zu SEQ ID NO:l aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften auf- weisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren rmmunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 75 % Identität zu SEQ ID NO:l aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren hnmunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 % Identität zu SEQ DD NO:l aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 85 % Identität zu SEQ ID NO:l aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90 % Identität zu SEQ DD NO: 1 aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 92 % Identität zu SEQ DD NO:l aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften auf- weisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 94 % Identität zu SEQ ID NO: 1 aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 96 % Identität zu SEQ ID NO:l aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 98 % Identität zu SEQ DD NO:l aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 99 % Identität zu SEQ ID NO: 1 aufweist. Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antiköφer, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette die Aminosäuresequenz, wiedergegeben in SEQ D NO: 1 , umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 60 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 65 % Identität zu SEQ ID NO:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 75 % Identität zu SEQ ID NO:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 85 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Bevofzugt sind monoklonale Antiköφer, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäύre- sequenz umfasst, die mindestens 90 % Identität zu SEQ ID NO:2 aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 92 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antiköφer, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 94 % Identität zu SEQ ID NO:2 aufweist. Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten -Jmmunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 96 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antiköφer, die die oben angegebenen Eigenschaften auf- weisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 98 % Identität zu SEQ ID NO:2 aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antiköφer, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 99 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antiköφer, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette die Aminosäuresequenz, wiedergegeben in SEQ DD NO:2, umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass der. variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 60 % Identität zu SEQ DD NO:l aufweist und der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz, die mindestens 60 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 60 % Identität zu SEQ DD NO:l aufweist und der variable Teil der leichten Immuno- . globinkette eine Aminosäuresequenz, die mindestens 60 % Identität zu SEQ ID NO:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antiköφer dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 65 % Identität zu SEQ DD NO:l aufweist und der variable Teil der leichten Immuno- globinkette eine Aminosäuresequenz, die mindestens 65 % Identität zu SEQ ID NO:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper dadurch gekeimzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70 % Identität zu SEQ DD NO:l aufweist und der variable Teil der leichten . Enmuno- globinkette eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die min- destens 75 % Identität zu SEQ DD N0:1 aufweist und der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz, die mindestens 75 % Identität zu SEQ DD N0:2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die min- destens 80 % Identität zu SEQ DD NO:l aufweist und der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Bevorzugt sind onoklonaler Antiköφer, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90 % Identität zu SEQ ID NO:l aufweist und der variable Teil der leichten Immunoglobinkette die Aminosäuresequenz, die mindestens 90 % Identität zu SEQ DD NO:2 aufweist.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette die Aminosäuresequenz, wiedergegeben in SEQ DD NO: l, umfasst und der variable Teil der leichten Dnmunoglobinkette die Aminosäuresequenz, wieder- gegeben in SEQ DD NO :2, umfasst.
Ebenfalls bevorzugt sind monoklonale Antiköφer, die Kombinationen der oben angegebenen Aminosäuresequenzen der variablen Teile der schweren und leichten Immunoglobinkette aufweisen, aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nuklemsäuremoleküle, welche Antiköper, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, kodieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, welche mindestens ein Nukleinsäure- molekül, das die oben angegebenen Eigenschaften aufweist, beinhaltet.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nuklemsäuremoleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ DD NO: 1 umfasst;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ DD NO: 3 dargestellte Sequenz umfassen;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion einer schweren Immunoglobulinkette eines für Repinotan spezifischen Antiköφers besitzt;
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden;
e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu SEQ DD NO: 3 zeigen, und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion einer schweren Immunoglobulinkette eines für Repinotan spezifischen Antiköφers aufweist; oder
f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85% oder 90% zu SEQ DD NO: 3 zeigen, und deren Expressionsprodukt die biolo- gische Funktion einer schweren hnmunoglobulinkette eines für Repinotan spezifischen Antiköφers aufweist.
Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung Nuklemsäuremoleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ DD NO: 2 umfasst;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ DD NO: 4 dargestellte Sequenz umfassen;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion einer leichten Immunoglobulinkette eines für Repinotan spezi- fischen Antiköφers besitzt;
d) . Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden;
e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu SEQ DD NO: 4 zeigen, und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion einer leichten Immunoglobulinkette eines für Repinotan spezifischen Antiköφers aufweist; oder
f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85% oder 90% zu SEQ' DD NO: 4 zeigen, und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion einer leichten Immunoglobulinkette eines für Repinotan spezifischen Antikörpers aufweist. Stringente Hybridisierungsbedingungen für die Hybridisierung von Nukleinsäuren sind beispielsweise Hybridisierungen in wässriger Lösung enthaltend 0,2 X SSC (1 X Standard saline citrate = 150 mMNaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) bei 68°C.
Bevorzugt sind Hybridomazellen, welche mindestens ein Nukleinsäuremolekül beinhalten, das die oben angegebenen Eigenschaften aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, welche monoklonale Antikörper exprimiert, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen.
Bevorzugt sind Hybridomazellen, welche monoklonale Antiköφer exprimieren, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen.
Ebenfalls bevorzugt ist eine Hybridomazelle mit der Aufnahmenummer DSM ACC2634 (Aufnahmedatum 28.01.2004).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler und polyklonarer Antiköφer, die Repinotan der Formel I, dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze binden.
Bevorzugt ist ein Verfaliren zur Herstellung monoklonaler und polyklonarer Antiköφer, die Repinotan der. Formel I und die Verbindung der Formel D sowie deren Salze, Solvate und Solvate der Salze binden.
Ebenfalls bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler und polyklonarer Antiköφer, die Repinotan der Formel I und die Verbindung der Formel D sowie deren Salze, Solvate und Solvate der Salze binden und die Verbindungen der Formeln DI bis VD sowie deren Salze, Solvate und Solvat der Salze nicht binden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die Repinotan der Formel I, dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze binden. •'
Bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antiköφer, die Repinotan der Formel I und die Verbindung der Formel D sowie deren Salze, Solvate und Solvate der Salze binden.
Ebenfalls bevorzut ist ein Verfaliren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die Repinotan der Formel I und die Verbindung der Formel H sowie deren Salze, Solvate und Solvate der Salze binden und die Verbindungen der Formeln HI bis VE sowie deren Salze, Solvate und Solvat der Salze nicht binden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von polyklonalen Antiköφern, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, zur Bestimmung von Repinotan, dessen Salzen, Solvaten und Solvaten der Salze in Flüssigkeiten.
Bevorzugt ist die Verwendung von polyklonalen Antiköφern, die die oben angegebenen Eigen- schaften aufweisen, zur Bestimmung von Repinotan, dessen Salzen, Solvaten und Solvaten der Salze in Körperflüssigkeiten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von monoklonalen Antiköφem, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, zur Bestimmung von Repinotan, dessen Salzen, Solvaten und Solvaten der Salze in Flüssigkeiten.
Bevorzugt ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen, dessen Salzen, Solvaten und Solvaten der Salze in Köφerflüssigkeiten.
Experimenteller Teil
Beispiel 1: Herstellung Antikörper
Immunisierung:
Das Hapten der Verbindung der Formel
Figure imgf000015_0001
wurde mit drei unterschiedlichen Carrier-Proteinen (BSA, BGG und KLH) in jeweils drei unterschiedlichen molaren Verhältnissen von Substanz/Protein (0.5x, l.Ox und 3.0x) über die Carboxylatfunktion konjugiert. Das Hapten der Formel (VDI) und dessen Herstellung ist aus der EP 1 339 403 bekaimt. Diese Analyt-Konjugate wurden als Immunogene in zwei unterschiedlichen Dosen (10 und 100 μg/Dosis) für die Injektionen in Mäusen (Swiss Webster und Balb/c) verwendet. Insgesamt wurden 21 Gruppen mit jeweils 5 Mäusen mit maximal vier Dosen pro Tier injiziert (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1 : Immunisierung der Mäuse
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000016_0001
Nach 35, 56 und 77 Tagen wurde den immunisierten Mäusen Serum entnommen.
Polyklonale Antikörper Analyse:
Nach 35 Tagen entnommenens Serum (zwei Injektionen des -mmunogens) der Gruppen 1-20 zeigte in einem direkten Bindungs-ELISA Titer von >105 und der Gruppe 21 von 104. Nach 56 und 77 Tagen entnommenes Serum zeigte in einem direkten Bindungs-ELISA, dass alle Gruppen Titer in einem Bereich von 105 bis >106 aufzeigten.
Direkte Bindungsstudien von Serumpools (entnommen nach 56 Tagen) mit Inhibitions-Assays zeitgen, dass 18 der 21 Gruppen durch 10 μg/mL Repinotan zu >15% und zehn Gruppen durch lμg/mL Repinotan zu >10% inhibiert wurden. Die Gruppen 2, 5, 11 und 20 wurden mit 100 ng/mL Repinotan zu >10% inhibiert.
Direkte Bindungsstudien von Serumpools (entnommen nach 77 Tagen) mit Inhibitions-Assays zeigten, dass 15 der 21 Gruppen durch 1 μg/mL Repinotan zu >25% und zehn Gruppen durch 100 ng/mL Repinotan zu >10% inhibiert wurden. Die Gruppen 5, 8,> 11, 20 und 21 wurden mit 10 ng/mL Repinotan zu > 10% inhibiert.
Antikörperproduzierende Hybridomazellen:
Die antikörperproduzierenden Hybridomazellen wurden nach der Methode von Köhler und Milstein hergestellt (Köhler, G; Milstein, C. Nature 256, 495-497 (1975)). Insgesamt :wurden 19 Fusionen durchgeführt, von denen 14 vor der Analyse des Serums (nach 77 Tagen entommen) durchgeführt wurden. Es wurden 2800 Hybridomazellen in einem zweistufigen Prozess gescreent. Der erste Schritt beinhaltete das Screenen mit einem direkten Bindungsassay nach positiven Hybridomazellen. Stark positive Hybridomazellen wurden dann im zweiten Schritt in einem Inhibitionsassay getestet. In diesem Inhibitionsassay wurden sieben unterschiedliche Konzentrationen von Repinotan verwendet, wobei die höchste Konzentration 1.0 μg/mL betrug. Im Rahmen diesen Verfahrens konnten 18 Hybridomazellen identifiziert werden, die bei Repinotankonzentra- tionen von 0.1 ng/mL Repinotan zu einer Inhibition von >20% führten.
Beispiel 2: Kreuzaktivitätsuntersuchungen
Für die Kreuzaktivitätsuntersuchungen wurde ein Modell entwickelt, welches dem Prinzip des kompetitiven Immunoassays entsprach, der in der W099/46591 offenbart ist. Als Auslesemechanismus wurde anstatt eines enzymatischen spektroskopischen Verfahrens das reflektorische Signal von kolloidalen Goldpartikeln verwendet. Hierzu wurden die unten beschriebenen verein- fachten Teststreifen hergestellt.
Für die Herstellung der Teststreifen und die damit durchgeführten Kreuzaktivitätsuntersuchungen wurden die folgenden Reaktionskomponenten verwendet:
a) Zu untersuchender monoklonaler anti-Repinotan Antiköφer b) Gold-Repinotananalog-Ziegen-IgG-Konjugat c) kolloidales Gold, 20 nm d) Nitrocellulose Membran e) Esel anti-Maus Antiköφer f) Kaninchen anti-Ziege Antiköφer g) Standard der Verbindungen der Formeln I, EI bis VD h) ' 0.2% Triton x 305 in Phosphat Buffered Saline Assay Buffer i) 0.4% Nonidet P-40, 2% BSA, 2.5% Sucrose, 1.25%Trehelose, in Phosphate Buffered Saline Lyophilized Buffer j) . 2.5 cm Sink Material k) Plastic Backing, 5.3 cm wide and 8 mil, Thick 1) Human Serum
20 μL einer Lösung von 0.9 μg/mL anti-Repinotan Antikörper (a) in Lyophilized Buffer (i) wurden zusammen mit 20 μL eine 0.375 OD/mL Gold-Repinotananalog-Ziegen-IgG-Konjugat (b)-Lösung in Lyophilized Buffer (i) lyophilisiert.
hnmunochromatographische Teststreifen wurden hergestellt indem die Nitrocellulosemembran (d), aufgebracht auf dem Plastic Backing (k) zuerst mit Ax-tkörper (e) innerhalb der ersten Zone und anschließend mit Antikörper (f) in der zweiten Zone (näher am Kopfende lokalisiert) besprüht wurde und am Kopfende der Membran mit dem Sink Material (j) versehen wurde. Die so her- gestellten Testkarten wurden in 6 mm breite Teststreifen geschnitten und bei Raumtemperatur gelagert.
Der Standard (g) wurde hergestellt, indem Verbindungen der Formel I bis VE jeweils mit Human Serum zu Lösungen mit Konzentrationen von 0, 10, 50, 100 und 500 ppb verdünnt wurden. Diese Serumproben wurden dann jeweils zweimal nach dem oben beschriebenen Verfahren getestet. Wenn der Test ein positives Ergebnis zeigte, wurde ein feinerer Titer angesetzt, um das genaue Detektionslevel des Antikörpers für die getestete Substanz definieren zu können. Wenn der Test bei der Durchführung mit der Probe, die 500 ppb enthält, kein positives Ergebnis anzeigte, wurden keine weiteren Titer angesetzt und keine weiteren Tests durchgeführt.
Testdurchführung:
Für die Testdurchführung wurden das Lyophilisat aus anti-Repinotan Antikörper (a) und Gold- Repinotananalog-Ziegen-IgG-Konjugat (b) mit 10 μL Standard versehen und für 2 Minuten inkubiert. Danach wurden 40 μL Assay Buffer (h) hinzugefügt und der Teststreifen mit der dem Sink Pad (am Kopfende) entgegengesetzten Seite in die Lösung getaucht. Nach 10 Minuten war die Testlösung vollständig von dem Teststreifen aufgenommen und der Teststreifen wurde dann solange in 80 μL Assay Buffer (h) getaucht, bis der Testindikator den Sink Pad erreicht hatte und diesen blau färbte. Am Sink Pad, war eine Absoφtionszone an deren Beginn ein wasserlöslicher Farbstoff aufgetragen war. Dieser Farbstoff bewegte sich mit der Flüssigkeitsfront vorwärts und bewegte ihn an das Ende der Absoφtionszone. Dies zeigte das Ende der Testreaktionen an.
Ergebnis:
Die Inteφretation des Ergebnisses erfolgte analog der in der WO 99/46591. Erkannte der getestete anti-Repinotan Antikörper Verbindungen der Formeln I bis NE, fing der Esel-anti-Maus Antiköφer in der ersten Zone den überwiegenden Teil des Goldkonjugats ab und bildete eine rote Farbzone. Je stärker die attraktiven Wechselwirkungen zwischen getesteten anti-Repinotan Anti- körper und Verbindungen der Formeln I bis VE waren, desto mehr wurde das am anti-Repinotan- Antikörper verdrängte Goldkonjugat in der Kaninchen-anti-Ziege Reaktion in der zweiten Zone abgefangen.
Wie in der WO-A-99/46591 beschrieben, ließ der Vergleich der Intensität der beiden Banden in den Fenstern A und B die einfache halbquantitative Bestimmung zu. War das Signal in Fenster A intensiver als das in Fenster B, lagen starke attraktive Wechselwirkungen zwischen dem verwendeten anti-Repinotan Antikörper vor und bei umgekehrter Intensitätsverteilung schwache attraktive Wechselwirkungen. Beispiel 3: Sequenanalyse der variablen Bereiche des ausgewählten monoklonalen Repinotan spezifischen Antikörpers (produziert von Hybridomazellinie 55J3.2)
Versuchsbeschreibung:
Gesamt-RNA, isoliert aus Hybridomazellen, wurde als Templat verwendet um die variablen Regionen der schweren und leichten Immunoglobulinketten (Ig-Ketten) zu amplifizieren. Die ,first-strand' c-DNA-Synthese wurde mit CK- bzw. Cγ-spezifischen Primern durchgeführt. Für die Amplifizierungsreaktion wurden degenerierte Primer, welche homolog zu einer großen Anzahl unterschiedlicher variabler Regionen waren, verwendet. Zur Vermeidung von Fehlinteφretationen von PCR-Artefakten wurden für die Amplifikation der leichten und der schweren Ketten 6 voneinander unabhängige PCRs durchgefülirt. Alle 12 PCR-Produkte wurden in pCR2.1- oder pUC19-Vektoren (in vitro Gen) kloniert und in E. coli DH5α (in vitro Gen) transformiert. DNA wurde mittels Standardmethoden isoliert und unter Verwendung von Standard-Sequenzierungs- Primern sequenziert. Für jeden der 12 Klone wurden beide Stränge sequenziert. Aufgrund der Degenerierung der Primer ist die Sequenz, welche sich durch die degenerierten Primer ergibt, variabel. Deswegen wurden aus dem Überstand einer Kultur von 55J3.2-Zellen Immunoglobulin- Moleküle isoliert und unter Verwendung von reduzierender SDS-PAGE aufgereinigt. Die N- terminalen Sequenzen der schweren und leichten Ketten wurden mittels automatisierter Aminosäuresequenzierung bestimmt.
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
Geforene Zellen der 55J3.2-Zellinien wurden aufgetaut und in Dulbeckos modifizierten EageF- Medium (DMEM) supplementiert mit Glutamin, Penecillin, Steφtomycin und 10% fötalem Kälberserum (FCS) angezüchtet. Die Zellen wurden vermehrt und ca. 3,8 xlO7 Zellen wurden über Zentrifugation geerntet. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des QIAGEN RNeasy-Kit,- wie vom Hersteller beschrieben, isoliert. Die Konzentration der isolierten RNA wurde photometrisch bestimmt und beträgt 540 ng/μL. Die Integrität der isolierten RNA wurde mittels Agarose-Gel- Elektrophorese bestimmt.
Oligonucleotid-Primer, wie beschrieben in Wang et. al. (2000) und Shittek und Rajewsky (1992) wurden verwendet, um die variablen Regionen der schweren Immunoglobulinketten, die in 55J3.2 exprimiert waren, zu amplifizieren. Der obere Primer befand sich am Beginn der für : den N- Terminus der reifen immunogloulin-kodierenden Sequenz und besaß 6 degenerierte Regionen, um homolog zu möglichst vielen schweren Ketten zu sein. Die unteren Primer waren nicht degeneriert und homolog zu dem 5 '-Bereich einiger konstanter Cγ-Regionen. - -
HC-Upper: 5'- SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC-3 ' HC-Lower 1 : 5'- CCCTTGACCAGGCATCC-3 ' HC-Lower2: 5'- CAGGGGCCAGTGGATAGAC-3 '
(Die Symbole S, R, N und M haben die folgende Bedeutung: S steht für die Basen C oder G; R steht für die Basen A oder G; N steht für die Basen A oder C oder G oder T; M steht für die Basen A ocer C.)
2 μg der RNA wurden inkubiert mit 20 pmol des HC-Lower 1 Primers in 20 μL einer ,first-strand'- Reaktion für 60 min bei 37°C. Dabei wurde die Omniscript Reverse Transcriptase von QIAGEN unter Verwendung der Vorschriften des Herstellers eingesetzt. Darauf wurden 5 μL der ,first- Strand '-Reaktionsmischung einem 50 μL PCR-Ansatz hinzugefügt. Dieser enthielt 50 pmol des HC-Lower2 Primers, 500 pmol des HC-Upper Primers sowie die ProofSTART-Polymerase (QIAGEN Verwendung nach den Vorschriften des Herstellers). 6 voneinander unabhängige PCR- Amplifikationen wurden durchgeführt.
Die variablen Regionen der leichten Immunoglobulinketten expremiert in 55J3.2 wurden in ähnlicher Weise bestimmt. Dazu wurden Oligonucleotid-Primer, wie beschrieben in Wang et. al. (2000) verwendet. Der obere Primer befand sich am Anfang der kodierenden Sequenz des N- Terminus des reifen Proteins und besaß 7 degenerierte Positionen. Damit war er homolog zu so vielen leichten K-Ketten-Genen wie möglich. Der untere Primer war nicht degeneriert und vom 5'- Teil des Cκ-Genes abgeleitet. .
LC-Upper: 5'-GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA -3' LC-Lower: 5'-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3'
(Das Symbol W steht für die Basen A oder T.)
2 μg RNA wurden mit 20 pmol des LC-Lower Primers in 20 μL einer ,first-strand' -Reaktion für 60 min bei 37°C inkubiert. Dabei wurde die Omniscript Reverse Transcriptase von QIAGEN unter Verwendung der Vorschriften des Herstellers eingesetzt. Darauf wurden 5 μL der ,first-strand'- Reaktionsmischung einem 50 μL PCR-Ansatz hinzugefügt. Dieser enthält 50 pmol des LC-Lower Primers, 500 pmol des LC-Upper Primers sowie die ProofSTART-Polymerase (QIAGEN Verwendung nach den Vorschriften des Herstellers). 6 voneinander unabhängige PCR-Amplifika- tionen wurden durchgeführt.
Alle PCR-Produkte wurden auf Agarosegelen analysiert. Die Größe der Amplifikationprodulcte lag nahe der erwarteten Größen (394 Basenpaare für die schwere und 363 Basenpaare für die leichte Kette). Um die PCR-Produkte in den Vektor pCR2.1 zu klonieren wurden 3'A-Überhänge pro- - __ - duziert. Dazu wurde 1 u Taq-Polymerase (Röche) vor der TOPO-TA-Klonierung hinzugefügt. Die TOPT-TA-Klonierung erfolgte nach den Vorschriften des Herstellers (Invitrogen). In einigen Fällen wurde das PCR-Produkt in einem Sma 1 geschnittenen und dephosphorylierten pUC-Vektor Moniert. Kolonien wurden über Restriktionsanalysen gescreent. Dabei wurde mit Eco Rl geschnitten, wenn pCR2.1 verwendet wurde oder mit EcoRl und Pstl, wenn pUC19 verwendet wurde. Ein positiver Klon jeder PCR-Reaktion wurde einer automatisierten Sequenzierung unterzogen. Dabei wurden die folgenden Primer, welche den das einklonierte Fragment flankierende Vektorbereichen des pCR2.1 und pUC19 entsprachen, verwendet: revL (5'- AGGAAACAGCTATGACCATG-3') and T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3ζ) für pCR2.1 und revL (s.o) und M13uni (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3!) für pUC19.
Da die ersten 7 bis 8 Positionen eines jeden Klones durch die Sequenz der degenerierten Primer bestimmt waren, konnten die Ergebnisse der Sequenzierung dieser Positionen nicht verwendet werden, um die eigentliche Sequenz zu bestimmen. Deswegen wurden die N-terminalen Bereiche der Sequenz durch Proteinsequenzierung (Edman-Abbau) ermittelt. Dazu wurden Hybridomazellen in einer Miniperm-Zellkultureinheit (Vivascience) angezogen, um genügend Protein für die Reinigung und Sequenzierung zu erhalten. Der Überstand der Zellkultur wurde auf einer Protein-A/G Affinitätssäule (Pierce) chromatographiert. Gereinigtes Im unglobulin wurde dann einer reduzierenden SDS-PAGE unterzogen. Das Gel wurde auf eine PVDF-Membran geblotted und mit Ponceau S leicht angefärbt. Die Banden, die den schweren und leichten Ketten entsprachen wurden ausgeschnitten und mittels automatisierten Edman-Abbau analysiert.
Ergebnis:
Das Ergebnis der cDNA-Sequenzierung ist nummeriert und beginnt mit dem ersten Nucleotid Codon der ersten Aminosäure des Proteins, welches im Zeilüberstand gefunden wurde. Im Fall der schweren Kette beginnt der Bereich der konstanten Kette mit dem Nucleotid 361 und im Fall der leichten Kette mit dem Nucleotid 325.
Die Aminosäuren, die durch die cDNA-Sequenzierung ermittelt wurden und das Ergebnis der Aminosäuresequenzierung ist unten abgebildet. Die Übersetzung der Sequenz ist zulässig für das erste Codon, dessen Sequenz nicht durch den oberen degenerierten Primer beeinflusst ist, bis hin zum letzten Codon, dessen Sequenz nicht durch den unteren Primer beeinflusst ist.
Aminosäure- und cDNA-Sequenzen der schweren Immuno lobulin Kette aus 55J3.2:
Die Nummerierung der Aminosäuren und der cDNA sind auf der linken Seite aufgetragen und beginnen mit dem ersten Codon der Sequenz des schweren Immunoglobulin Kette. Sequenzen, die kursiv aufgetragen sind, wurden aus Primersequenzen erhalten und können deshalb nicht die tatsächliche Sequenz widerspiegeln. Sequenzen, die die konstante Region des Cγ abbilden, sind unterstrichen dargestellt. AAS steht für Sequenzinfonnationen, die anhand der von Aminosäuresequenzierungen erhalten wurden.
1 E V Q Q Q S G P E L V K P G AAS i Ξ v Q/K L Q Q S G P E L V K P G transl. cDNA 1 GAG GTS MAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAA CTG GTA AAG CCT GGG cDNA SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC HC-Uppβr primer 16 A (S) V K M (S) (X) K AAS 16 A S V K M S C K S S G Y T F s transl. cDNA 46 GCT TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG TCT TCT GGA .TAG ACA TTC TCT cDNA 31 K F A L Q W V R .Q K P G L G L transl. CDNA 91 AAG TTT GCT TTG CAG TGG GTG CGG CAG AAG CCT GGG CTG GGC CTT cDNA 46 E I G Y I N P H N D G T K Y transl. CDNA
136 GAG TGG ATT GGA TAT ATT AAT CCT CAC AAT GAT GGT ACT AAG TAG cDNA 61 N E Q F K . G K A T T S D K s transl. CDNA
181 AAT GAG CAG TTC AAA GGC AAG GCC ACA CTG ACT TCA GAC AAA TCC cDNA 76 S N T A Y M E L S S L T S E D transl. CDNA
226 TCC AAC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG ACC TCT GAG GAC CDNA 91 S A V Y F C A E E Y Y D G S S transl. CDNA 271 TCT GCG GTC TAC TTC TGT GCA GAG GAA TAC TAC GAT GGT AGT TCA cDNA
106 Y F D V . G A G T T V T V S s transl. cDNA
316 TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA cDNA 121 A K T T P P S V Y P L A P 133 transl. cDNA
361 GCC AAA ACA ACA CCC CCA TCA GTC TAT CCA CTG GCC CCT 399 cDNA GTC TAT CCA CTG GCC CCT G HC-Lower2 primer
SEQ DD NO:3 zeigt die ermittelte cDNA Sequenz des variablen Teils der schweren Ig-Kette mit Ausnahme der Primersequenzen.
Die Sequenz des variablen Teils der schweren Immunoglobulin Kette aus 55J3.2 (SEQ ID NO: 1) konnte aus der Analyse wie folgt bestimmt werden:
1 EVQ QQSGPE LVKPGASVK SCKSSGYTFS KFALQ VRQK PGLG EWIGY 51 INPHNDGTKY NEQFKGKATL TSD SSN AY ELSSLTSED SAVYFCAEEY 101 DGSSYFDVW GAGTTVTVSS Aminosäure- und cDNA-Sequenzen der leichten -mmunoglobulin Kette aus 55J3.2:
Die Nummerierung der Aminosäuren uod der cDNA sind auf der linken Seite aufgetragen und beginnen mit dem ersten Codon der Sequenz des leichten kappa Immunoglobi-ilin Kette. Sequenzen, die kursiv aufgetragen sind, wurden aus Primersequenzen erhalten und können deshalb nicht die tatsächliche Sequenz widerspiegeln. Sequenzen, die die konstante Region des CK abbilden, sind unterstrichen dargestellt. -AAS steht für Sequenzinformationen, die anhand der von Aminosäuresequenzierungen erhalten wurden.
1 (D) I K M T H S P (S) S M .Y A S AAS I D I V M T Q T P S S M Y A S L transl. cDNA 1 GAY ATT GTG ATG ACC CAG WCT CCA TCT TCC ATG TAT GCA TCT CTA cDNA GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA LC-Upper primer IÖ G E R V T I O: AAS le G E V T i i C K A S R ü i N" transl. cDNA 46 GGG GAG AGA GTC ACT ATC ACT TGC AAG GCG AGT CGG GAC ATT AAT cDNA 31 R Y S V Q Q K P G K S P K transl. cDNA 91 AGG TAC TTG AGT TGG GTC CAG CAG AAA CCA GGG AAG TCT CCT AAG cDNA 46 T L I Y R A - T R M V . A G V P S transl. CDNA
136 ACC CTG ATC TAT CGT GCA AÄC AGA ATG GTA GCT GGG GTC CCA TCA cDNA 61 R F S G S G S G Q D Y S L T I transl. CDNA
181 AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG CAA GAT TAT TCT CTC ACC ATC cDNA 76 S S .L Ξ Y E ---. M G I Y Y C L Q transl. cDNA
226 AGC AGC CTG GAG. TAT GAA GAT ATG GGA ATT TAT TAT TGT CTA CAG cDNA gi Y V D F Y T F G G G T K E transl. cDNA
271 TAT GTT GAC TTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA CDNA 106 I R R A D A --2- T V -? 116 cDNA trε
316 ATA AGA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC 348 cDNA GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC LC-Lower primer
SEQ ID NO:4 zeigt die ermittelte cDINA Sequenz der leichten Ig-Kette mit Ausnahme der Primersequenzen.
Die Sequenz des variablen Bereichs der leichten Irnmunoglobulin Kette aus 55J3.2 (SEQ ID NO: 2) konnte aus der Analyse wie folgt besti-mmt werden: 1 DIKMTHSPSS MYASLGERV ITCKASRDIN RYLSWVQQKP GKSPKTLIYR 51 ANR VAGVPS RFSGSGSGQD YSLTISS EY EDMGIYYCLQ YVDFPYTFGG 101 GTKLEIRR
Die schwere Kette von 55J3.2 gehört wahrscheinlich zu der Familie der Maus hnmunoglobulingene J558.47 mit einer Homologie von etwa 86% und die leichte Kette zu der ba9-Familie der Maus Igκ-Ketten mit über 90% iger Homologie. Die konstanten Bereiche der schweren und leichten Ketten konnten als IgG2a bzw. IgK bestimmt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Polyklonale Antikörper, die Repinotan der Formel
Figure imgf000025_0001
sowie dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze, binden.
2. Polyklonale Antikörper nach Anspruch-, 1, die Repinotan Hydrochlorid sowie dessen Salze und Solvate binden.
3. Polyklonale Antikörper nach Ansprüchen 1 und 2, die Repinotan der Formel I, dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze und die Verbindung der Fro el
Figure imgf000025_0002
dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze, binden.
4. Polyklonale Antikörper nach Ansprüchen 1 bis 3, die die Verbindungen der Formeln
Figure imgf000026_0001
(III) (IV)
Figure imgf000026_0002
(V) (VI)
Figure imgf000026_0003
(VN) sowie deren Salze, Solvate und Solvat der Salze, nicht binden.
Monoklonale Antikörper, die Repinotan der Formel
Figure imgf000026_0004
sowie dessen Salze, Solvate und SolVate der Salze, binden.
6. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 5, die Repinotan Hydrochlorid sowie dessen Salze und Solvate binden.
7. Monoklonale Antikörper nach Ansprüchen 5 und 6, die Repinotan der Formel I, dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze und die Verbindung der Fromel
Figure imgf000026_0005
dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze, binden.
8. Monoklonale Antikörper nach Ansprüchen 5 bis 7, die die Verbindungen der Formeln
Figure imgf000027_0001
(V) (VI)
Figure imgf000027_0002
sowie deren Salze, Solvate und Solvat der Salze, nicht binden.
9. Monoklonaler Antikörper dadurch gekennzeiclmet, dass der variable Teil der schweren hnmunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 60 % Identität zu SEQ BD O:l aufweist.
10. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90 % Identität zu SEQ ID NO : 1 aufweist.
11. Monoklonaler Antikörper gemäß Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette die Aminosäuresequenz, wiedergegeben in SEQ TD NO :1, umfasst.
12. Monoklonaler Antikörper dadurch gekennzeiclmet, dass der variable Teil der leic-hten Immunoglobinkette eine Ammosäuresequenz umfasst, die mindestens 60 % Identit-Lt zu SEQ ID NO:2 aufweist.
13. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90 % Identität zu SEQ ID NO:2 aufweist.
14 Monoklonaler Antikörper gemäß Ansprüchen 12 und 13 dadurch gekeimzeiclmet, dass der variable Teil der leichten Immunoglobinkette die Aminosäuresequenz, wiedergegeben in SEQ ID NO:2, umfasst.
15. Monoklonaler Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass der variable Teil der scliweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 60 % Identität zu SEQ ID NO:l aufweist und der variable Teil der leichten Immunoglobinkette eine -Aminosäuresequenz, die mindestens 60 % Identität zu SEQ ED NO:2 aufweist.
16. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 15, dadurch gekeimzeiclmet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90 % Identität zu SEQ ED NO:l aufweist und der variable Teil der leichten Immunoglobinkette die Aminosäuresequenz, die mindestens 90 % Identität zu SEQ E) NO>:2 aufweist.
17. Monoklonaler Antikörper dadurch gekeimzeichnet, dass der variable Teil der schweren Immunoglobinkette die Aminosäuresequenz, wiedergegeben in SEQ ) NO: l, umfasst und der variable Teil der leichten Immunoglobinkette die Aminosäuresequenz, wiedergegeben in SEQ -D NO:2, umfasst.
18. Nuklemsäuremoleküle, welche Antiköper gemäß Ansprüchen 5 bis 17 kodieren.
19. Zelle, welche mindestens ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 18 beinhaltet.
20. Zelle, welche monoklonale Antikörper gemäß Ansprüchen 5 bis 17 exprimiert.
21. Hybridomazelle mit der Aufhahmenummer DSM ACC2634 (Aufhahmedatum 28.01.2004).
22. Verfahren zur Herstellung monoklonaler und polyklonarer Antikörper, die Repinotan der Formel I, dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze binden.
23. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die Repinotan der Formel I, dessen Salze, Solvate und Solvate der Salze binden.
24. Verwendung von polyklonalen Antikörpern nach Ansprüchen 1 bis 4 zur Bestimmung von Repinotan, dessen Salzen, Solvaten und Solvaten der Salze in Flüssigkeiten.
25. Verwendung von polyklonalen Antikörpern nach Ansprüchen 1 bis 4 zur Bestimmung von Repinotan , dessen Salzen, Solvaten und Solvaten der Salze in Körperflüssigkeiten.
26. Verwendung von monoklonalen Antikörpern nach Ansprüchen 5 bis 17 zur Bestimmung von Repinotan, dessen Salzen, Solvaten und Solvaten der Salze in Flüssigkeiten.
27. Verwendung von monoklonalen Antikörpern nach Ansprüchen 5 bis 17 zur Bestimmung von Repinotan, dessen Salzen, Solvaten und Solvaten der Salze in Körperflüssigkeiten.
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