WO2005085255A1 - The extract of bulbophgllum radiatum lindl and the preparation and the use - Google Patents

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Naili Wang
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to an extract of lactolithium having an activity of inhibiting NO generation and a preparation method thereof.
  • BACKGROUND-Everyday inflammatory diseases that plague people include arthritis such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, gout arthritis, etc .; inflammatory skin diseases such as eczema, psoriasis, dermatitis, etc .; inflammatory Eye diseases such as uveitis, conjunctivitis, etc .; Pulmonary diseases such as asthma, bronchitis, acute respiratory distress syndrome, etc .; Bacteremia, natoxemia, aphthous ulcer, gingivitis, pancreatitis, etc .; Gastrointestinal diseases For example, segmental ileitis, atrophic gastritis, ulcerative colitis, peritonitis, peptic ulcer, stress bowel syndrome such as mucosal inflammation caused by Helicobacter p
  • Nitric oxide (N O) in the body is known to be a toxic substance that mediates cellular immunity and inflammation. Its precursor is L-arginine (L-arg).
  • L-arg L-arginine
  • One of the two identical hydrogen atoms on the guanidino group at the end of L-arg generates NO under the action of NO synthetase (NOS).
  • NOS NO synthetase
  • Three different types of NOS have been isolated, including endothelial NO synthase (eNOS), neuronal NO synthase (nNOS) and inducible NO synthetase (iNOS).
  • eNOS endothelial NO synthase
  • nNOS neuronal NO synthase
  • iNOS inducible NO synthetase
  • iNOS inducible NO synthetase
  • the Chinese Patent Publication No. is: CN1458155A "—A New Antitumor Compound, Lathyol B”
  • the structural formula of a compound, bulbophylol B, is:
  • the present invention extracts a component with clear anti-inflammatory activity from rhododendron, which is safe and non-toxic, and can effectively inhibit the generation of NO to achieve an anti-inflammatory effect. Disclosure of the Invention-The purpose of the present invention is to extract a component with clear anti-inflammatory activity from the medicinal plant Rhododendron, which can effectively inhibit the production of NO and achieve an anti-inflammatory effect.
  • the present invention provides a rhododendron extract 1 having the following structural formula: Lithuania extract 1 has an activity to inhibit NO production.
  • the present invention also provides a lactolithium extract 2, which has the following structural formula: Lithuania extract 2 has an activity of inhibiting NO production.
  • the present invention also provides a rhododendron extract 3, which has the following structural formula : Lithuania extract 3 has an activity to inhibit NO production.
  • the invention relates to a method for separating an active compound from a medicinal plant Bulbophgllum radiatum Lindl, which is characterized by comprising the following steps ⁇
  • step 2) separating the ethyl acetate and petroleum ether eluate in step 2) by column chromatography;
  • step 4) The eluate collected in step 3) was concentrated under reduced pressure, and further separated and purified; the compounds isolated in step 4) were analyzed for physicochemical properties to determine their structure; test.
  • the concentration of the ethanol extract of the rhododendron is 60%;
  • the chromatography column can be selected in a silica gel column or a Sephaden LH-20 column; and the eluent can be in chloroform: methanol (volume ratio of 100: 0, 95: 5, 90:10, 85:15, 80:20). , 70: 30, 60: 40, 50: 50, 0: 100), or n-hexane: ethyl acetate (100: 0, 95: 5, 90: 10, 85: 15, 80: 20, 70 by volume) : 30, 60: 40, 50: 50, 0: 100), or n-hexane: acetone (100: 0, 95: 5, 90: 10, 85: 15, 80: 20, 70: 30, 60) : 40, 50: 50, 0: 100).
  • the concentration under reduced pressure is preferably performed at 40 ° C.
  • the physical and chemical characteristics analysis technology includes nuclear magnetic resonance technology.
  • the NO production inhibitory activity test was analyzed using the mouse macrophage cell line RAW264. 7 by the griess method.
  • the toxic effect was analyzed by MMT cytotoxicity test.
  • a lactobacillus orchid extract 6 is characterized in that it has the following physical and chemical parameters:
  • a lactobacillus orchid extract 7 characterized in that it has the following physical and chemical parameters:
  • Compound 7 was isolated from rhododendron according to the method described above.
  • the invention also relates to the application of the above-mentioned lactolith extracts 1, 2, and 3 in the preparation of a medicament for treating inflammation related to NO production.
  • the beneficial technical effect obtained by the present invention is that for the first time, an extract with clear anti-inflammatory activity is isolated from rhododendron, and as a natural NO production inhibitor, it overcomes the toxic and side effects of chemical synthetic substances. Best Practice:
  • the entire powder extract was dissolved in 2 liters of water, and extracted three times with 2 liters each of petroleum ether, ethyl acetate, and n-butanol, and the ethyl acetate extract in these extracts was concentrated under reduced pressure at 40 ° C. 32.6 g of brown powder were obtained.
  • the petroleum ether eluent was concentrated to obtain 29.3 g of brown powder, and subjected to silica gel column (Qingdao Ocean Chemical Plant) chromatography.
  • the 95: 5 eluate was concentrated under reduced pressure at 40 ° C.
  • the inhibitory effect of megalith phages on NO production (inhibition of NO production) due to the stimulation of interferon r and lipopolysaccharide was obtained by the following experimental method.
  • the inhibitory effect was evaluated based on the IC50 (um) of the inhibitory effect.
  • N-1-naphthalene ethylenediamine hydrochloride (lg Wako Pure Medicine)
  • Lipopolysaccharide (LPS, 055: B5 lOmg, Sigma)
  • Cytotoxicity was determined by MTT and by microscopy.
  • the MTT method is a known conventional method. Gen Jie, a 96-well microtiter plates, each well 200 ⁇ ⁇ a cell concentration of 1.0 105 cells / 111, different concentrations of an extract component or monomer, the cells were cultured for 16 hours, ⁇ reagent, Incubate for another 4 hours. The supernatant was discarded, and 150 LDMS0 was added to completely dissolve the generated formazane, and the absorbance at 570 nm was measured.
  • N-1-naphthalene ethylenediamine hydrochloride N- 1 -Naphthyethylene-diamine Dihyrochloride
  • p-aminobenzenesulfonamide solution 50ul p-aminobenzenesulfonamide solution 50ul
  • the 0. D. value of 570 nm was measured with a spectrophotometer.
  • STD use sodium nitrite solution (100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0 um). For testing medicinal water for injection is dissolved.

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Description

石豆兰提取物及其制备方法和用途 技术领域：
本发明涉及具有抑制 NO生成活性的石豆兰提取物及其制备方法。 背景技术- 困扰人们的日常炎性疾病包括， 关节炎症例如骨关节炎、 类风湿性 关节炎、 类风湿性脊椎炎、 痛风关节炎等； 炎性皮肤病例如湿疹、 牛皮 癣、 皮炎等； 炎性眼疾例如眼色素层炎、 结膜炎等； 肺部疾病例如哮喘、 支气管炎、 急性呼吸窘迫综合症等； 菌血症、 那毒素血症、 口疮溃疡、 龈炎、 胰腺炎等； 胃肠道疾病例如节段性回肠炎、 萎縮性胃炎、 溃疡性 结肠炎、 腹腔炎、 消化性溃疡、 应激性肠道综合症例如由幽门螺旋杆菌 感染而引起的粘膜炎症或者由非 体类抗炎药引起的肠胃病等等。
有关各种炎症致病作用的机理是： 已知体内一氧化氮 （N O ) 是介 导细胞免疫和炎症的毒性物质。其前体是左旋精氨酸（L - a r g ) , L - a r g末端胍基上的 2个相同的氢原子之一在 N O合成酶（N O S )的作用 下生成 N O。 目前已经分离出三种不同类型的 N0S，包括内皮 NO合成酶 (eNOS) ,神经元 NO合成酶（nNOS)及诱导型 NO合成酶（iNOS)。 目前已知， 巨噬细胞、 肝细胞、 平滑肌细胞、腺癌细胞以及上皮细胞均能表达 iN0S。 某些炎性细胞因子和微生物产物如脂多糖 （LPS) 则可诱导 iNOS表达。 iNOS一旦被诱导即可表达出高度活性，产生大量 Ν0。
因此， 长时间以来， 人们致力于寻找 NO合成酶的抑制剂来治疗与之 相关的炎性疾病。 但这些抑制剂大多局限于化学合成的物质， 副作用较 大。 现有技术中未见从天然中草药植物中提取抗炎活性物质的报道。
石豆兰 （Bulbophgllum radiatum Lindl ), 兰科植物， 主要分布于 中国长江以南的地区。在中国民间使用其新鲜植物（常用量 8〜20g)， 具 有平喘、 活血、 消肿止痛、 四肢麻痹等抗炎作用。
但迄今为止， 对于石豆兰的化学成分及生物活性的研究报道较少。 在中国专利公开号为： CN1458154A "一种新的抗肿瘤化合物石豆兰酚甲" 中公开了一种化合物石豆兰酚甲（bulbophylol A)的结构式为：
Figure imgf000004_0001
在中国专利公开号为： CN1458155A "—种新的抗肿瘤化合物石豆兰 酚乙" 中公开了一种化合物石豆兰酚乙 (bulbophylol B)的结构式为：
Figure imgf000004_0002
在以上两个专利申请说明书中通过核磁共振分析了所公开的化合物 的基本数据， 并以体外培养的宫颈癌 HeLa细胞为模型考察所公开的化合 物的抗肿瘤活性。 都没有涉及分离、 确定石豆兰中的抗炎活性成分。
因此本发明从石豆兰中提取具有明确抗炎活性的组分， 其安全无毒， 并能有效地抑制 NO的生成， 达到抗炎作用。 发明公开- 本发明的发明目的是从药用植物石豆兰中提取具有明确抗炎活性的 组分， 其能有效地抑制 NO的生成， 达到抗炎作用。
本发明提供了一种石豆兰提取物 1， 其具有如下的结构式：
Figure imgf000004_0003
石豆兰提取物 1， 其具有抑制 NO生成的活性。
本发明还提供了一种石豆兰提取物 2， 其具有如下的结构式:
Figure imgf000004_0004
石豆兰提取物 2， 其具有抑制 NO生成的活性。
本发明还提供了一种石豆兰提取物 3， 其具有如下的结构式 :
Figure imgf000005_0001
石豆兰提取物 3， 其具有抑制 NO生成的活性。
本发明涉及一种从药用植物石豆兰（Bulbophgllum radiatum Lindl ) 中分离活性化合物的方法， 其特征在于包含如下的步骤-
1 ) 制备石豆兰的乙醇提取物； 经过乙醇浸泡提取重复 2次， 合并这 些提取液， 经减压浓缩得到褐色粉末提取物；
2)将该粉末提取物溶解在水中， 依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇 作为洗脱液分别提取；
3) 对步骤 2 ) 中的乙酸乙酯、 石油醚洗脱液利用柱层析进行分离；
4) 对步骤 3) 中收集到的洗脱液进行减压浓缩， 进一步分离精制； 对步骤 4) 中分离得到化合物进行理化特性分析以确定其结构； 对石豆兰提取物进行 NO生成抑制活性和毒性测试。
其中， 优选石豆兰的乙醇提取液浓度是 60% ;
其中， 层析柱可以在硅胶柱或 Sephaden LH-20柱中选择； 而洗脱剂 可以在氯仿： 甲醇（体积比为 100： 0， 95： 5, 90： 10， 85： 15， 80： 20, 70： 30, 60： 40， 50： 50， 0： 100)、 或正己垸： 乙酸乙酯 （体 积比为 100： 0, 95： 5， 90： 10， 85： 15, 80： 20, 70： 30, 60： 40, 50 : 50， 0： 100)、 或正己垸：丙酮 （体积比为 100 : 0， 95： 5, 90： 10， 85： 15， 80： 20， 70： 30, 60： 40, 50 : 50， 0： 100) 中选择。
其中， 减压浓缩优选是在 40°C条件下进行的。
其中， 精制的方法为使用 HPLC, 流动相： 甲醇一 H20=1 : 1， 流速
4ml/min, 在室温下制备； 或 HPLC(AQVSAIL SS 4251 Senshu Scientific
Co、 Ltd, 10 X 250mm), 流动相： 正己垸 ：丙酮 =7： 3， 流速 4ml/min。 室温下制备。
其中的理化特性分析技术包括核磁共振技术。
其中， NO生成抑制活性测试是利用小鼠巨噬细胞系 RAW264. 7通过 griess法进行分析的。 其中的毒性作用是通过 MMT细胞毒性试验进行分析的。
一种石豆兰提取物 6， 其特征在它具有如下的理化参数:
13c -NMR 'H-NMR 性状 无色油状 1 136.2 s
EI-MS (m/z) 272 2 102.4 d 6.36 d (2.2)
HR-EI-MS (m/z)实测值 272, 1054 3 148.7 s
计算值 272.1049 4 133.3 s
分子量 272.1 5 143.5 s
分子式 Cl6Hie0 6 107.6 d 6.37 d (2.2)
UV DBI Me0H nm (log s ) 1' 143.3 s
202 (4.35) 2' 115.4 d 6.64 m
207 (3.40) 3' 155.5 s
275 (3.27) 4' 112.8 d 6.64 m
IR v KBrcnf' 5' 129.5 d 7.15 t (7.6)
3464, 2950, 6' 121.0 d 6.78 d (7.6)
2858, 2781, a 37.9 t 2.81 brs
1632, 1589 a 37.7 t 2.81 brs
1350, 926 OCH3 56.5 q 3.85 s
0CH20 101.2 t 5.82 s 化合物 6是从石豆兰中按照上述方法分离得到的
一种石豆兰提取物 7， 其特征在它具有如下的理化参数:
Figure imgf000006_0001
化合物 7是从石豆兰中按照上述方法分离得到的。 本发明还涉及上述石豆兰提取物 1、 2、 3在制备治疗与 NO生成相关 的炎症的药物中的应用。
本发明所取得的有益技术效果是首次从石豆兰中分离得到具有明确 抗炎活性的提取物， 其作为天然的 NO生成抑制剂， 克服了化学合成物质 的毒副作用。 最佳实施方式：
实施例 1 : 提取物的制备与结构的确定
1、 石豆兰的提取物制备： 将 9. 5 kg 的石豆兰全草粉碎， 加入 60% 乙醇 （乙醇：水 = 6 : 4 ) 至 55升， 室温浸泡 12小时， 然后再加热回流 1 小时， 得浸出液。 其滤渣再一次用 60%乙醇 55升如上法提取， 与上次提 取液合并， 在 40°C减压浓缩， 得到 260. 3g 褐色粉末。 把全部的粉末萃 取物溶解于 2升水中， 依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇各 2升分 3次 萃取， 这些萃取液中的乙酸乙酯萃取物 40°C下减压浓缩， 得到 32.6克的 褐色粉末。
将乙酸乙酯提取物 32. 6g上硅胶柱进行分离，洗脱剂分别为：氯仿： 甲醇体积比 （下同） =100 : 0， 95： 5， 90： 10， 85： 15， 80： 20， 70： 30, 60 : 40， 50 : 50， 0： 100, 分别收集 2升的洗脱液。
收集氯仿： 甲醇 =100： 0 的洗脱馏份， 在 40°C下减压浓缩得到浓缩 物 4. 7314g。 将所得浓缩物进行硅胶柱层析， 收集氯仿： 甲醇 =90： 10的 馏份， 40'C减压浓缩， 用正乙烷： 乙酸乙酯 =90： 10重结晶， 得无色针状 结晶化合物式 （1 ) ( 490mg), 未见文献记载。
收集氯仿： 甲醇 =90： 10的洗脱馏分， 40°C减压浓缩。利用 Sephaden LH-20对浓缩物 8. 1625g进行分离，以氯仿： 甲醇 =7： 3为洗脱剂，每 40ml 为一馏份， 收集第 18至 25馏份， 40Ό减压浓缩， 得 0. 9056g浓缩物， 然后上制备 HPLC, 流动相： 甲醇： H20=1： 1， 流速 4ml/min， 在室温下制 备。紫外检测波长 254nm。收集保留时间分别为 16分 42秒与 23分 11秒 的峰， 每瓶 5ml40°C减压浓缩收集的馏份， 分别得无色针状结晶化合物 2 ( 21. 8mg) 以及化合物 3 (22. lmg)。 两个化合物均未见文献报道。
收集乙酸乙酯萃取物的氯仿： 甲醇二 90： 10 的洗脱液， 在 40°C减压 浓缩， 得到浓缩物 8. 1625g上 Sephaden LH-20 ( Pharmacia Biochem， 7 X 15cm) 进行柱层析， 以氯仿： 甲醇 =1： 1作为洗脱剂， 每 40ml为一个 熘分。 收集第 21至 42的馏分， 40°C减压浓缩。 将所得的 1. 0832g浓縮 物上 HPLC (AQVSAIL SS 4251 Senshu Scientific Co、 Ltd, 10 X 250mm) , 流动相： 正己垸 ：丙酮 =7 : 3, 流速 4ml/min; 室温下制备； 紫外检测波 长 254nm，收集保留时间分别为 8分 15秒、 13分 24秒、 18分 14秒的流 分。 40°C减压浓缩收集液， 得白色固体化合物 4 ( 11. 6mg)。 无色油状化 合物 5 ( 12. Img) 以及无色油状化合物 6 ( 18. 5mg), 化合物 4 ( Majumder.P.L and Basak.M., Two bibenzyl derivatives from the orchid Cirrhopetalum andersonii, Phytochemistry^ 30 (1), 321-324 (1991 ) ) 及化合物 5 ( Asahina, Hiroshi; Yoshikawa, Hiromichi; Shuto, Yoshihiro. Effects of batatasin III and its analogs on gibberellic acid-dependent a-amylase induction in embryoless barley seeds and on cress growth, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 62 (8), 1619-1620， (1998). ) 为已知化合物， 化合物 6未见文献报道。
石油醚洗脱液浓缩得 29. 3g褐色粉末， 进行硅胶柱 （青岛海洋化工 厂）层析， 洗脱剂为正己垸：乙酸乙酯= 100： 0, 95： 5， 90： 10， 85： 15， 80： 20, 70： 30, 60： 40， 50： 50, 0： 100, 分别收集 2升。 40°C减压浓缩 95： 5的洗脱液。 将浓缩物 1. 2411g进行硅胶 （青岛海洋 化工厂）柱层析， 洗脱剂为正己垸：丙酮 =100： 0， 95： 5， 90： 10, 85： 15, 80： 20, 70： 30， 60： 40， 50： 50, 0： 100， 各收集 300ml， 40°C减 压浓缩 90： 10洗脱部分的第 23至 29馏分。将 0. 2101g浓缩物在正己垸 与丙酮的混合溶剂中重结晶， 得白色结晶化合物 7 ( 21. 4mg)0 化合物 7 未见文献报道。
2、 确定结构式： 化合物 1一 7的性状见表 1， 1:iC -醒 R与 1 H-NMR的数 据见表 2。 并由以上数据最终确定了化合物的结构式。 表 1 化合物 1一 3的性状
化合物 1 化合物 2 化合物 3
Figure imgf000009_0001
表 1续 化合物 4一 7的性状
Figure imgf000009_0002
化合物 1-7 的匪 R数据（ppm CDC13 5 0 0 MH z)
1 2
13C-NMR Ή-NMR 13C-NMR Ή-NMR
Figure imgf000010_0001
5 6
13C-N R Ή-N R '3c-腿 Ή-N R δ
Figure imgf000011_0001
其中化合物 1-3的结构确定如下:
Figure imgf000012_0001
实施例 2抑制 NO生成的活性
由于干扰素 r以及脂多糖刺激而产生的巨石噬细胞对 NO生成的阻碍 效果 （抑制 NO生成的效果）通过下面的实验方法求得。 并且根据阻碍效 果的 IC50 (um)来评价 NO生成的抑制效果。
所用材料-
RAW 264. 7细胞 (大日本制药)
N-1-盐酸萘乙二胺 （lg和光纯药）
磺胺 （500g 和光纯药）
Ham， s F12 培养基 （SIGMA N488 500mL)
IFN- y (Geneyme/Techne 100 g)
脂多糖 (LPS, 055： B5 lOmg, Sigma)
磷酸 （500ml 和光纯药）
DMS0 ( 500ml 和光纯药）
96孔微滴定板 （50/盒 住友电木，商品名 （8096R) )
微滴定板记数器 （BIO- RAD 3550)
N0生成抑制活性的试验方法：
调整 RAW264. 7细胞的浓度至 1-5 X 105个 /ml ，分注于 96孔板,每孔 200ul , 置于 C02孵箱中，传代 1个小时。加入检体后， 加入脂多糖 2 ul 。 在 C0孵箱中培养 16小时。调整最终浓度至干扰素 r ( IFN-r ) 0. 33ng/ml , LPS 100ng/ml。 将检体溶解于 DMS0， 调整含量至 0. 2%。 在显微镜下观察 细胞并进行 MTT实验。
细胞毒性通过 MTT法、 由镜检确定。 MTT法是已知的常规方法。 艮卩， 于 96孔微滴定板，每孔 200 μ ΐ细胞浓度为 1. 0 105细胞/11 1， 添加不同 浓度的提取物或单体组分， 将细胞培养 16小时， 加入 ΜΤΤ试剂， 再培养 4小时。 弃上清， 添加 150 LDMS0， 将生成的甲臜 （formazane) 完全溶 解， 测定 570nm下的吸光度。
利用 griess法进行 N0生成评价。
取 上 清 lOOul , 加 入 0. 1% N-1- 盐 酸 萘 乙 二 胺 ( N- 1 -Naphthyethylene-diamine Dihyrochloride) 溶液 50ul, 对胺基苯磺 酰胺溶液 50ul， 室温放置 10分钟。 用分光光度计测 570nm的 0. D.值。 在 STD中， 用亚硝酸钠溶液 （100， 50, 20, 10， 5， 2， 1， 0 um)。 供试 药用注射用水溶解。
活性评价
计算出 NC 的量， 代入下面的公式求出抑制效果
抑制效果 (%) ={1- (X-Y) I (Z-Y) }X 100
X： 在实验化合物存在下， 由 IFN-γ和 LPS诱导产生的 N02—的量， Y; 在实验化合物、 IFN-γ 和 LPS 均不存在的情况下， 诱导产生的 N02—的量，
Z: IFN-γ和 LPS诱导产生的 N02—的量。
NO生成抑制效果的 IC5。如下所示：
表 3 石豆兰浸膏及萃取物的 NO生成抑制试验的结果 抑制率 ( ICso uL)
石豆兰 60%浸膏 54. 9
正己垸层浸膏 87. 6
乙酸乙酯层浸膏 15. 9
正丁醇层浸膏 38. 8
水层浸膏 一
—： IC50 >100uL, 水层浸膏 lOOug/mL时抑制率 40. 3% 表 4 单体的 N0生成抑制试验结果
化合物 抑制率 （IC5。 uM)
1 4. 8
2 29. 0
3 15. 2
4 18. 5
5 6. 5
6 13. 2
7 22. 6

Claims

权利要求
1. 一种石豆兰提取物 1， 其特征在于具有如下的结构式:
Figure imgf000014_0001
2. 如权利要求 1所述的化合物， 其特征在于其具有抑制 NO生成的 活性。
3. —种石豆兰提取物 2， 其特征在于具有如下的结构式：
Figure imgf000014_0002
4. 如权利要求 3所述的化合物， 其特征在于其具有抑制 NO生成的 活性。
5. 一种石豆兰提取物 3， 其特征在于具有如下的结构式：
Figure imgf000014_0003
6. 如权利要求 5所述的化合物， 其特征在于其具有抑制 NO生成的 活性。
7. 一种从药用植物石豆兰中分离活性化合物的方法， 其特征在于包 括如下的步骤：
1 ) 制备石豆兰的乙醇提取物； 经过乙醇浸泡提取重复 2次， 合 并这些提取液， 经减压浓缩得到粉末提取物；
2 ) 将该粉末提取物溶解在水中， 依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正 丁醇作为洗脱液分别提取；
3 )对步骤 2 )中的乙酸乙酯、石油醚洗脱液利用柱层析进行分离；
4)对步骤 3)中收集到的洗脱液进行减压浓缩，进一步使用 HPLC 分离精制。
8. 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于所述的石豆兰的乙醇 提取液优选浓度是 60%。
9. 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于所述的层析柱选自在 硅胶柱或 Sephaden LH-20柱中选择。
10. 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于所述的洗脱剂选自氯 仿： 甲醇、 或正己烷：乙酸乙酯、 或正己垸：丙酮。
11. 如权利要求 10所述的方法， 其特征在于所述的洗脱剂比例 为氯仿： 甲醇（体积比为 100： 0， 95： 5 , 90： 10, 85： 15 , 80： 20， 70： 30, 60 : 40， 50 : 50， 0： 100)、 正己垸：乙酸乙酯（体 积比为 100： 0， 95： 5， 90： 10， 85： 15 , 80： 20, 70 : 30， 60 : 40， 50： 50， 0： 100)、 正己垸：丙酮 （体积比为 100 : 0， 95： 5， 90： 10， 85： 15， 80： 20, 70： 30, 60： 40, 50： 50, 0： 100)。
12. 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于其中减压浓缩优选是 在 40 °C条件下进行的。
13. 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于其中精制的方法为使 用 HPLC, 流动相： 甲醇一 H20=1： 1， 流速 4ml/min， 在室温下制备； 或 HPLC, 流动相 s 正己垸 ：丙酮二 7 : 3, 流速 4ml/min。
14. 一种石豆兰提取物 6， 其特征在它具有如下的理化参数:
Figure imgf000016_0001
15. —种石豆兰提取物 7， 其特征在它具有如下的理化参数-
13C-NMR Ή-NMR
Figure imgf000017_0001
16. 如权利要求 1、 3、 5中任一项所述石豆兰提取物， 其特征在 于在制备治疗与 NO生成相关的炎症的药物中的应用。
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