CN113912619B - 五味子中提取分离的倍半萜化合物及其方法和应用 - Google Patents

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Abstract

五味子中提取分离的倍半萜化合物及其方法和应用，属于天然产物化学技术领域，涉及从五味子干燥根茎中提取分离的一种式I所示的具有保肝活性倍半萜化合物。所述倍半萜化合物的制备方法是五味子干燥根茎为原料，用化学溶剂提取、萃取，经过正相柱色谱初步分离，再用MCI、正相柱色谱分离，然后用制备HPLC分离获得。所述应用为上述化合物应用于制备肝脏保护药物中。

Description

五味子中提取分离的倍半萜化合物及其方法和应用
技术领域
本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及五味子中一种具有保护肝脏活性的倍半萜化合物及其制备方法和应用。
背景技术
由于环境污染、过度饮食、过度饮酒、食品添加剂滥用等因素使肝病发病率不断升高，导致我国肝炎、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等疾病的较高发病率，严重威胁人类健康。到目前为止，一些保肝药物的药效不能让人满意，我们仍然缺乏高效、无明显毒副作用的保肝药物，而天然药物的保肝活性研究却显现了广阔的运用前景。因此，开发活性更佳、治疗效果更好的肝病治疗药物是研究人员亟需解决的问题。
五味子Schisandra chinensis为五味子科(Schisandraceae)五味子属多年生藤本植物，目前有30余种五味子属(Schisandra)植物和28余种南五味子属(Kadsura)植物被记载，我国分别有约19种和10种，主产于西南部至东南部。《本草纲目》中记载：五味子酸咸入肝而补肾，辛苦入心而补肺，甘入中宫益脾胃。现代药理学研究表明五味子具有肝保护，抗糖尿病，抗氧化等功效。本发明旨在从五味子中分离得到具有保肝活性的化合物，为保肝药物的开发提供新的途径与思路。
发明内容
本发明提供一种来源于五味子中的倍半萜化合物，所述倍半萜化合物的结构如式I所示：
Figure BDA0003377295180000011
本发明还提供了式I所示倍半萜化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)以五味子干燥茎叶为原料，以乙醇冷浸提取，浓缩得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于水中得混悬液；
(2)依次加入与混悬液体积相等的石油醚和乙酸乙酯进行萃取，将萃取溶液浓缩，得到浸膏；
(3)将乙酸乙酯萃取液浓缩后的浸膏经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱；
(4)二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇的洗脱物经小孔树脂柱色谱，用体积比为3:7-1:0的甲醇/乙醇-水溶剂梯度洗脱；
(5)甲醇/乙醇-水体积比为3:7的洗脱物经制备ODS高效液相色谱进行纯化，以甲醇-水溶液为流动相，得式I所示倍半萜化合物。
所述制备方法中，
步骤(1)中所述乙醇的浓度为75％-100％。所述乙醇冷浸提取的次数为2-4次，提取时间为每次1.5-3小时。使用的乙醇的体积为五味子干燥茎叶重量的10-30倍。
步骤(4)中二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇体积比为20:1的洗脱物经小孔树脂柱色谱。
步骤(5)所述的制备ODS高效液相色谱流动相甲醇-水溶液的体积比为20:80-40:60。
利用高分辨质谱、NMR、计算ECD对化合物进行结构鉴定：
式I所示倍半萜化合物为无色油状，
Figure BDA0003377295180000022
10％硫酸乙醇显紫色。HR-ESI-MS给出其准分子离子峰243.1591[M+H]+，确定式I所示倍半萜化合物的分子式为C13H23O4(不饱和度为3)。由13C-NMR数据中发现有一对烯碳信号δC124.4和136.3；5个连氧碳信号δC93.3,86.9,85.7,83.6和69.2；四个甲基碳信号δC 24.0,23.3,32.5和25.1；根据1H-NMR波谱数据，在δH5.71(2H,d,J＝2.4Hz)处观察到一组烯质子信号，推测其子结构为反式烯键。此外，1H-NMR谱给了三个连氧次甲基信号δH3.74(1H,s,),4.04(1H,d,J＝6.6Hz)和4.31(1H,m)：四个甲基氢信号δH1.26(3H,s),1.10(3H,s),0.90(3H,s)和1.37(3H,s)。根据以上的光谱信息，结构被推测为降碳倍半萜。其结构类似于megastagman-7-en-3,6-epoxy-5,9-diol9-O-β-d-glucopyranoside，此外，在1H-1H COSY光谱中观察到H-2/H-3/H-4、H-7/H-8/H-9/H-10处存在两个关键的自旋-自旋耦合，这进一步证实了式I所示倍半萜化合物的平面结构。根据NOESY和圆二色性确定了式I所示倍半萜化合物的立体化学性质。H-4与H3-12、H-3与H3-11存在的NOESY相关关系，H-3、HO-4、CH＝CH-6和CH3-11为共面取向，随机分配为α取向。通过与Mo2(OAc)4溶液配合物的ECD光谱确定了式I所示倍半萜化合物中邻二醇基团的绝对构型。根据诊断型O-C-C-O部分Cotton效应符号的螺旋度规则，在ECD光谱中310～340nm处的负Cotton效应表明是5位为R构型。此外，通过实测和计算ECD确定绝对构型，最终确定为(3S,4R,5R,6R)。通过以上解析，最终确定式I所示化合物即为降碳倍半萜。
表1：式I所示倍半萜化合物的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据(DMSO-d6)
Figure BDA0003377295180000021
Figure BDA0003377295180000031
本发明还提供一种药物组合物，包含所述倍半萜化合物和药学上可接受的辅料。
本发明还提供式I所示倍半萜化合物或包含所述倍半萜化合物的药物组合物的应用，应用于制备肝脏保护药物中。药物剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂及靶向制剂。
本发明的有益效果：
本发明在从五味子中分离得到具有保肝活性的化合物，为保肝药物的开发提供新的途径与思路。
具体实施方式
实施例1
式I所示倍半萜化合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)以五味子干燥茎叶(41.1kg)为原料，以95％乙醇冷浸提取，浓缩得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于水中得混悬液(4.2kg)，加入的乙醇的体积为五味子干燥茎叶重量的20倍。
(2)依次加入与混悬液体积相等的石油醚和乙酸乙酯，将萃取溶液浓缩，得到乙酸乙酯浸膏(760g)。
(3)将乙酸乙酯浸膏经硅胶柱色谱，用体积比为100:0、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、1:1、0:100的二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱。
(4)将得到的二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇体积比为20:1的洗脱物(62.4g)经小孔树脂柱色谱，用体积比为3:7、5:5、7:3、9:1、1:0的甲醇/乙醇-水溶剂梯度洗脱。
(5)将得到的甲醇/乙醇-水体积比为3:7的洗脱物(1.6g)经制备ODS高效液相色谱进行纯化，以甲醇-水体积为30:70溶液为流动相，得式I所示倍半萜化合物。
实施例2
式I所示倍半萜化合物的药理活性测试
试验方法和结果
LO2(人正常胚胎肝细胞)细胞在含10％胎牛血清的1640培养基中培养，采用MTT法测定样品的细胞毒性。将96孔板放置于含5％CO2于37摄氏度下孵育过夜后，将10μM的测试样品和最终浓度为8mM的APAP加入孔中，再孵育16小时。取培养基后，每孔加入0.5mg/mLMTT 200μL，再孵育4小时。抽吸培养基后，将所得的MTT溶解于150μL DMSO中。置10min，震荡40s左右，使甲瓒晶体完全溶解。将96孔板置于酶标仪中，检测490nm处的OD值。利用酶标仪及相应软件进行数据处理，利用平均值按如下公式计算细胞抑制率：细胞抑制率％＝1－样品组OD平均值/空白对照组OD平均值×100％。
取对数生长期培养的宫颈癌细胞HELA用含10％胎牛血清的新鲜1640培养基培养，将细胞密度调至5×104个/mL接种于96孔板中。然后加100μM受试化合物，药物预处理48小时后吸上培养基并加上200μL 500μg/mL的MTT溶液于培养箱中继续培养4小时。小心吸弃MTT，每孔加入150μL的DMSO。放置10min，震荡40s左右，使甲瓒晶体完全溶解。将96孔板置于酶标仪中，检测490nm处的OD值。结果表明，式I所示倍半萜化合物对人正常胚胎肝细胞的成活率为73％，具有较好的肝保护作用，在保肝药物研究领域开发有很好的应用前景。

Claims (7)

1.一种五味子中提取分离的倍半萜化合物，其特征在于，结构如式I所示：
Figure FDA0003826980620000011
2.一种权利要求1所述五味子中提取分离的倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以五味子干燥茎叶为原料，以乙醇冷浸提取，浓缩得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于水中得混悬液；
(2)依次加入与混悬液体积相等的石油醚和乙酸乙酯进行萃取，将萃取溶液浓缩，得到浸膏；
(3)将乙酸乙酯萃取液浓缩后的浸膏经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱；
(4)二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇体积比为20:1的洗脱物经小孔树脂柱色谱，用体积比为3:7-1:0的甲醇/乙醇-水溶剂梯度洗脱；
(5)甲醇/乙醇-水体积比为3:7的洗脱物经制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积比为20:80-40:60的甲醇-水溶液为流动相，得式I所示倍半萜化合物。
3.根据权利要求2所述五味子中提取分离的倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述乙醇的浓度为75％-100％；使用的乙醇的体积为五味子干燥茎叶重量的10-30倍。
4.根据权利要求2所述五味子中提取分离的倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述乙醇冷浸提取的次数为2-4次，提取时间为每次1.5-3小时。
5.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述五味子中提取分离的倍半萜化合物和药学上可接受的辅料。
6.一种权利要求1所述五味子中提取分离的倍半萜化合物或权利要求5所述药物组合物的应用，应用于制备肝脏保护药物中。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物剂型选自片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂及靶向制剂。
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