JP4792596B2

JP4792596B2 - 石豆蘭抽出物およびその調製方法と用途

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Publication number: JP4792596B2
Application number: JP2007501093A
Authority: JP
Inventors: ▲ジュエ▼ 王; 進北中; 新生姚; 乃利王; 家欣張
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2004-03-04
Filing date: 2004-03-04
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2024-03-04
Also published as: WO2005085255A8; WO2005085255A1; CN1976937B; JP2007526259A; CN1976937A

Description

本発明は、ＮＯの産生を抑制する活性を有する石豆蘭からの抽出物およびその調製方法に関する。

多くの人を悩ませている日常的な炎症性の疾患としては、骨関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊髄炎、痛風関節炎などの関節炎；湿疹、乾癬、皮膚炎などの炎症性皮膚病；ブドウ膜炎、結膜炎などの炎症性眼疾；喘息、気管支炎、急性呼吸促迫症候群などの肺疾患；菌血症、内毒素血症、潰瘍性口内炎、歯茎炎、膵臓炎など；限局性回腸炎、萎縮性胃炎、潰瘍性結腸炎、腹膜炎、消化性潰瘍、およびピロリ菌感染による粘膜炎症あるいは非ステロイド系抗炎症薬による胃腸病などの過敏性腸管症候群などがある。

各種の炎症の発症メカニズムとしては、体内の一酸化窒素（ＮＯ）が細胞の免疫および炎症を導く毒性物質であることが知られている。その前駆物質はＬ−アルギニンであり、Ｌ−アルギニンの末端にあるグアニジン基の２個の同じ窒素原子のうち１個がＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）の働きによりＮＯを産生する。現在、内皮型ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）、神経型ＮＯ合成酵素（ｎＮＯＳ）、誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）の３つの異なるタイプのＮＯＳがすでに単離されている。また、マクロファージ細胞、肝細胞、平滑筋細胞、腺癌細胞および上皮細胞がいずれもｉＮＯＳを発現し得ることが知られている。一部の炎症性細胞因子および例えばリポ多糖（ＬＰＳ）のような微生物生成物はｉＮＯＳの発現を誘導する。ｉＮＯＳは、誘導されると直ちに高度の活性を発現し、大量のＮＯを産生する。

このため長期にわたり、ＮＯ合成酵素の抑制剤により上記に関連する炎症性疾病を治療することに力が注がれてきた。しかしこれらの抑制剤はその大部分が化学的に合成された物質であり、副作用が比較的大きい。従来技術においては、民間薬として使われている天然の植物からの抗炎症活性物質の抽出に関してはいまだ報告されていない。

石豆蘭（ＢｕｌｂｏｐｈｙｌｌｕｍｒａｄｉａｔｕｍＬｉｎｄｌ．)は、ラン科の植物であり、主に中国の長江以南の地域に分布している。中国では民間薬としてその生の植物が使用されており（通常の使用量８〜２０ｇ）、喘息の鎮静、血行促進、消炎鎮痛、四肢の麻痺などの抗炎症作用を有する。

しかし今日まで、石豆蘭の化学成分および生物的活性に関する研究についてはあまり報告されていない。中国特許公開番号ＣＮ１４５８１５４Ａ号の「新たな抗腫瘍化合物−バルボフィロールＡ」には、化合物バルボフィロールＡ（ｂｕｌｂｏｐｈｙｌｏｌＡ）の構造式が次のように開示されている。

中国特許公開番号ＣＮ１４５８１５５Ａ号の「新たな抗腫瘍化合物−バルボフィロールＢ」には、化合物バルボフィロールＢ（ｂｕｌｂｏｐｈｙｌｏｌＢ）の構造式が次のように開示されている。

以上２つの特許文献の明細書では、核磁気共鳴法により、開示する化合物の物理化学的分析を行い、かつ体外培養した子宮頚癌ＨｅＬａ細胞を用いて、開示する化合物の抗腫瘍活性に関する検討を行っている。いずれにおいても石豆蘭中の抗炎症活性成分の単離、決定への言及はない。

このため本発明では、石豆蘭から、毒性がなく安全でかつＮＯ産生を効果的に抑制し抗炎症の働きをする明確な抗炎症活性を有する成分を抽出する。

本発明の目的は、薬用植物である石豆蘭から、ＮＯ産生を効果的に抑制し抗炎症の働きをする明確な抗炎症活性を有する成分を抽出することである。

本発明は、次の構造式を有する石豆蘭抽出物１を提供する。

石豆蘭抽出物１は、ＮＯの産生を抑制する活性を有する。

本発明は、次の構造式を有する石豆蘭抽出物２をさらに提供する。

石豆蘭抽出物２は、ＮＯの産生を抑制する活性を有する。

本発明は、次の構造式を有する石豆蘭抽出物３をさらに提供する。

石豆蘭抽出物３は、ＮＯの産生を抑制する活性を有する。

本発明は、薬用植物である石豆蘭（ＢｕｌｂｏｐｈｙｌｌｕｍｒａｄｉａｔｕｍＬｉｎｄｌ．）から活性化合物を単離する方法にも関するが、該方法は下記のステップを含むことを特徴とする。
１）石豆蘭のエタノール抽出物を調製する、すなわち、エタノール冷浸による抽出を２回繰り返し行い、これらの抽出液を合わせ、減圧濃縮することにより褐色の粉末状の抽出物を得る。
２）上記粉末状抽出物を水に溶解し、石油エーテル、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールを抽出溶媒としてこの順にそれぞれ抽出を行う。
３）ステップ２）の酢酸エチルおよび石油エーテルの抽出液に対し、カラムクロマトグラフィにより単離を行う。
４）ステップ３）にて回収した溶出液に対して減圧濃縮を行い、さらに単離精製する。
ステップ４）にて単離した化合物に対し、物理化学的特性の分析を行い、その構造を決定する。
石豆蘭抽出物に対し、ＮＯ産生抑制活性および毒性の試験を行う。

前記石豆蘭のエタノール抽出液の濃度は好ましくは６０％である。
前記クロマトグラフ用カラムはシリカゲルカラムまたはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０カラムから選択してもよく、溶出剤はクロロホルム：メタノール（体積比１００：０、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、０：１００）またはｎ−ヘキサン：酢酸エチル（体積比１００：０、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、０：１００）またはｎ−ヘキサン：アセトン（体積比１００：０、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、０：１００）から選択してもよい。
前記減圧濃縮は好ましくは４０℃の温度条件で行う。
前記精製の方法としてはＨＰＬＣを用い、移動相をメタノール−Ｈ₂Ｏ＝１：１、流速４ｍｌ／分として室温で分取するか、またはＨＰＬＣ（ＡＱＶＳＡＩＬＳＳ４２５１（株）センシュー科学、１０×２５０ｍｍ）を用い、移動相はｎ−ヘキサン：アセトン＝７：３、流速４ｍｌ／分として室温で分取する。

前記物理化学的特性の分析には核磁気共鳴が含まれる。
前記ＮＯ産生抑制活性の測定には、マウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７を用い、グリース法により測定を行う。
前記毒性作用についてはＭＭＴ細胞毒性試験により行う。

下記の物理化学的特性値を有することを特徴とする石豆蘭抽出物６

化合物６は、石豆蘭から上記の方法にしたがい単離することにより得られる。

下記の物理化学的特性値を有することを特徴とする石豆蘭抽出物７

化合物７は、石豆蘭から上記の方法にしたがい単離することにより得られる。

本発明は、ＮＯの産生と関わる炎症に対する治療薬への上記石豆蘭抽出物１、２、３の応用にも関する。

本発明により得られた有益な技術的効果は、初めて石豆蘭から明確な抗炎症活性を有する抽出物を単離して得たことであり、これは天然のＮＯ産生抑制剤であり、化学合成物質のもつ有害な副作用の問題を克服することができる。

実施例１抽出物の調製および構造の決定
１、石豆蘭抽出物の調製：
石豆蘭の全植物体９．５ｋｇを粉砕し、６０％のエタノール（エタノール：水＝６：４）を加えて５５Ｌにし、室温にて１２時間浸漬した後、さらに１時間加熱還流を行い、浸出液を得る。その濾過残渣に対し再度６０％エタノール５５Ｌを用いて上記の方法で抽出を行い、前回の抽出液と合わせ、４０℃にて減圧濃縮し、２６０．３ｇの褐色の粉末を得た。粉末状抽出物の全量を２Ｌの水に溶解し、石油エーテル、酢酸エチル、ｎ−ブタノール各２Ｌをそれぞれ用い、この操作を３回行い、これらの抽出液のうちの酢酸エチル抽出物に対し４０℃にて減圧濃縮を行い、３２．６ｇの褐色の粉末を得た。

酢酸エチル抽出物３２．６ｇをシリカゲルカラムに付し単離を行う。溶出剤はクロロホルム：メタノール［体積比（以下同じ）］＝１００：０、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、０：１００をそれぞれ用い、各溶出液を２Ｌずつ分画した。

クロロホルム：メタノール＝１００：０による溶出画分を回収し、４０℃にて減圧濃縮し、濃縮物４．７３１４ｇを得た。得られた濃縮物に対しシリカゲルカラムにてクロマトグラフを行い、クロロホルム：メタノール＝９０：１０の画分を回収し、４０℃にて減圧濃縮し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９０：１０により再結晶させ、無色の針状結晶の化合物、構造式１（４９０ｍｇ）を得た。この化合物について記載した先行文献はない。

クロロホルム：メタノール＝９０：１０による溶出画分を回収し、４０℃にて減圧濃縮する。セファデックスＬＨ−２０を用い、濃縮物８．１６２５ｇに対し単離を行い、クロロホルム：メタノール＝７：３を溶出剤として、４０ｍｌを１画分とし、１８番目から２５番目までの画分を分画し、４０℃にて減圧濃縮し、０．９０５６ｇの濃縮物を得た。次いで分取ＨＰＬＣに付し、移動相はメタノール：Ｈ₂Ｏ＝１：１、流速４ｍｌ／分として、室温にて分取を行う。紫外線検出波長は２５４ｎｍとする。保持時間１６分４２秒および２３分１１秒におけるピークをそれぞれ分取し、分取した画分を各フラスコに５ｍｌずつ取り、４０℃にて減圧濃縮し、それぞれ無色の針状結晶の化合物２（２１．８ｍｇ）および化合物３（２２．１ｍｇ）を得た。いずれの化合物もこれまで文献に公表されていない。

酢酸エチル抽出物のクロロホルム：メタノール＝９０：１０による溶出画分を回収し、４０℃にて減圧濃縮し、得られた濃縮物８．１６２５ｇをセファデックスＬＨ−２０（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｃｈｅｍ、７×１５ｃｍ）に付しカラムクロマトグラフィを行い、クロロホルム：メタノール＝１：１を溶出剤として、４０ｍｌを１画分とし、２１番目から４２番目までの画分を回収し、４０℃にて減圧濃縮する。得られた濃縮物１．０８３２ｇをＨＰＬＣ（ＡＱＶＳＡＩＬＳＳ４２５１（株）センシュー科学、１０×２５０ｍｍ）に付し、移動相はｎ−ヘキサン：アセトン＝７：３、流速４ｍｌ／分、室温にて分取、紫外線検出波長２５４ｎｍにて、保持時間８分１５秒、１３分２４秒、１８分１４秒における画分をそれぞれ回収する。回収した液を４０℃にて減圧濃縮し、白色の固体の化合物４（１１．６ｍｇ）、無色のオイル状の化合物５（１２．１ｍｇ）および無色のオイル状の化合物６（１８．５ｍｇ）を得た。化合物４［Ｍａｊｕｍｄｅｒ，Ｐ．Ｌ．ａｎｄＢａｓａｋ，Ｍ．，ＴｗｏｂｉｂｅｎｚｙｌｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｆｒｏｍｔｈｅｏｒｃｈｉｄＣｉｒｒｈｏｐｅｔａｌｕｍａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（１），３２１−３２４（１９９１）］および化合物５［Ａｓａｈｉｎａ，Ｈｉｒｏｓｈｉ；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｈｉｒｏｍｉｃｈｉ；Ｓｈｕｔｏ，Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ，ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｂａｔａｔａｓｉｎＩＩＩａｎｄｉｔｓａｎａｌｏｇｓｏｎｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃａｃｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ α−ａｍｙｌａｓｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎｅｍｂｒｙｏｌｅｓｓｂａｒｌｅｙｓｅｅｄｓａｎｄｏｎｃｒｅｓｓｇｒｏｗｔｈ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２（８），１６１９−１６２０，（１９９８）］は既知の化合物であり、化合物６はこれまで文献に公表されていない。

石油エーテルの溶出液を濃縮して褐色の粉末２９．３ｇを得、シリカゲル（青島海洋化工廠）によるカラムクロマトグラフィを行った。溶出剤はｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、０：１００とし、それぞれ２Ｌずつ回収した。９５：５による溶出液を４０℃にて減圧濃縮し、濃縮物１．２４１１ｇに対しシリカゲル（青島海洋化工廠）によるカラムクロマトグラフィを行った。溶出剤はｎ−ヘキサン：アセトン＝１００：０、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、０：１００とし、それぞれ３００ｍｌずつ回収し、９０：１０による溶出分の２３番目から２９番目までの画分を４０℃にて減圧濃縮した。得られた濃縮物０．２１０１ｇをｎ−ヘキサンとアセトンとの混合溶剤中で再結晶させ、白色結晶の化合物７（２１．４ｍｇ）を得た。化合物７はこれまで文献に公表されていない。

２．構造式の決定：
化合物１〜７の性状は表１のとおりであり、¹³Ｃ−ＮＭＲおよび¹Ｈ−ＮＭＲのデータは表２のとおりである。以上のデータより、化合物の構造式を最終的に決定した。

s:一重線、d: 二重線、t : 三重線、m: 多重線

このうち化合物１〜３の構造を次のように決定した。

実施例２ＮＯ産生を抑制する活性
インターフェロンγおよびリポ多糖の刺激を受けて発生したマクロファージ細胞によるＮＯの産生を阻害する効果（ＮＯ産生抑制効果）は下記の試験方法により求めた。そして、この阻害効果のＩＣ５０（μｇ）値にもとづきＮＯ産生の抑制効果を評価した。

使用材料：
ＲＡＷ２６４．７細胞（大日本製薬）
Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（１ｇ和光純薬）
スルファニルアミド（５００ｇ和光純薬）
ハムＦ１２培地（ＳｉｇｍａＮ４８８５００ｍｌ）
ＩＦＮ−γ（Ｇｅｎｅｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ１００μｇ）
リポ多糖（ＬＰＳ、０．５５：Ｂ５１０ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）
リン酸（５００ｍｌ和光純薬）
ＤＭＳＯ（５００ｍｌ和光純薬）
９６ウェル・マイクロ滴定プレート［５０／ケース住友ベークライト、商品名（８０９６Ｒ）］
マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ３５５０）

ＮＯ産生抑制活性の試験方法：
ＲＡＷ２６４．７細胞の濃度を１−５×１０⁵個／ｍｌに調整し、９６ウェルプレートの各穴に２００μｌずつ分注し、ＣＯ₂インキュベータに入れ、１時間継代培養する。検体を入れた後、リポ多糖２μｌを添加し、ＣＯインキュベータ内で１６時間培養する。終濃度がインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）０．３３ｎｇ／ｍｌ、ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌとなるように調整する。検体をＤＭＳＯに溶解し、含量を０．２％に調整する。顕微鏡で細胞を観察し、かつＭＴＴ試験を行う。

細胞の毒性はＭＴＴ法により、顕微鏡検査で決定する。ＭＴＴ法は公知の一般的な方法である。すなわち、９６ウェル・マイクロプレート上の各穴に濃度が１．０×１０⁵細胞／ｍｌの細胞を２００μｌずつ分注し、各濃度の抽出物または単離した成分を添加し、細胞を１６時間培養し、ＭＴＴ試薬を加え、さらに４時間培養する。上清を捨て、ＤＭＳＯ１５０μｌを添加し、生成したフォルマザンを完全に溶解させ、５７０ｎｍにおける吸光度を測定する。

グリース法によりＮＯ産生の評価を行う。
上清１００μｌを取り、０．１％のＮ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩溶液５０μｌ、スルファニルアミド溶液５０μｌを添加し、室温で１０分間放置する。分光光度計にて５７０ｎｍのＯ．Ｄ．値を測定する。ＳＴＤには、亜硝酸ナトリウム溶液（１００、５０、２０、１０、５、２、１、０μｍ）を使用する。供試薬は注射用水で溶解する。

活性の評価
ＮＯ₂ ^-の量を算出し、下記の公式に代入して抑制効果を求める。
抑制効果（％）＝｛１−（Ｘ−Ｙ）／（Ｚ−Ｙ）｝×１００
Ｘ：試験化合物の存在下で、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳに誘導されて産生したＮＯ₂ ^-の量
Ｙ：試験化合物、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳがいずれも存在しない状態で、誘導されて産生したＮＯ₂ ^-の量
Ｚ：ＩＦＮ−γおよびＬＰＳに誘導されて産生したＮＯ₂ ^-の量

ＮＯ産生抑制効果のＩＣ₅₀値は下記のとおりである。

−：ＩＣ₅₀ ＞１００μＬ、水層エキス１００μｇ／ｍＬの時の抑制率は４０．３％

Claims

下記の構造式を有することを特徴とする化合物。

式中、
Ｒ₁は水素原子又はＯＣＨ₃基を表し、
Ｒ₁が水素原子である場合、Ｒ₂及びＲ₃は一緒になってメチレンジオキシ基を表し、Ｒ₄はＯＣＨ₃基を表し、
Ｒ₁がＯＣＨ₃基である場合、Ｒ₂及びＲ₄は水素原子を表し、Ｒ₃はＯＣＨ₃基を表す。
請求項１に記載の化合物を含むＮＯの産生を抑制する抗炎症剤。
下記の構造式を有することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
請求項３に記載の化合物を含むＮＯの産生を抑制する抗炎症剤。
下記の構造式を有することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
請求項５に記載の化合物を含むＮＯの産生を抑制する抗炎症剤。
薬用植物である石豆蘭から請求項１に記載の化合物を単離する方法であって、
１）石豆蘭のエタノール抽出物を調製する、すなわち、エタノールによる冷浸出抽出を２回繰り返し行い、これらの抽出液を合わせ、減圧濃縮することにより粉末状の抽出物を得るステップと、
２）前記粉末状抽出物を水に溶解し、石油エーテル、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールを抽出溶媒としてこの順にそれぞれ抽出を行うステップと、
３）ステップ２）の酢酸エチルおよび石油エーテルの抽出溶媒に対し、カラムクロマトグラフィにより単離を行うステップと、
４）ステップ３）にて回収した酢酸エチルおよび石油エーテル抽出液に対し減圧濃縮を行い、さらにＨＰＬＣを用いて単離精製するステップ
とを含むことを特徴とする方法。
前記石豆蘭のエタノール抽出液の濃度は６０％であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
前記クロマトグラフ用カラムがシリカゲルカラムまたはセファデックスＬＨ−２０カラムから選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
前記溶出剤がクロロホルム：メタノール、またはｎ−ヘキサン：酢酸エチル、またはｎ−ヘキサン：アセトンから選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
前記溶出剤の配合比が、クロロホルム：メタノール（体積比１００：０、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、０：１００）、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（体積比１００：０、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、０：１００）、ｎ−ヘキサン：アセトン（体積比１００：０、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、０：１００）であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記減圧濃縮は４０℃の温度条件で行うことを特徴とする請求項７に記載の方法。
前記精製の方法が、ＨＰＬＣを用い、移動相をメタノール−Ｈ₂Ｏ＝１：１、流速４ｍｌ／分として室温にて分取するか、またはＨＰＬＣを用い、移動相はｎ−ヘキサン：アセトン＝７：３、流速４ｍｌ／分として行うことを特徴とする請求項７に記載の方法。