WO2005050188A1 - 同位体標識化内部標準物質を用いる定量方法、該定量方法を実行する解析システムおよび該解析のためのプログラム - Google Patents

同位体標識化内部標準物質を用いる定量方法、該定量方法を実行する解析システムおよび該解析のためのプログラム Download PDF

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Yasushi Ishihama
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
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Definitions

  • Quantitative method using isotope-labeled internal standard analysis system for executing the quantitative method, and program for the analysis
  • the present invention provides a method of adding an internal standard substance, which is a metabolically isotope-labeled biomolecule, or a cell containing a metabolically isotope-labeled biomolecule, to a sample. And a method for quantifying one or more biomolecules in a sample by measuring with a mass spectrometer.
  • the present invention relates to a method for quantitative analysis of a biomolecule, and more particularly, the present invention relates to an analysis method using an isotope-labeled biomolecule and a program for the analysis. .
  • the genome is the total DNA contained in one cell, including all genes and intergenic regions of the organism, and the life we know is determined by the genome. At present, human nucleotide sequences have already been read, and the number of genes is being predicted. However, in order to elucidate life phenomena, base sequence information alone is not enough.In fact, the power of the entire genome, such as Escherichia coli, yeast, nematodes, and Drosophila, has been revealed. Is not clear.
  • proteomics is one of the important items in the post-genome era, and this technology is attracting attention in performing functional analysis of genes.
  • the current proteome technology, a mass spectrometer, database, and search engine connecting them, has greatly facilitated protein identification, allowing specific protein mixtures (for example, certain protein complexes) to be identified.
  • Comprehensive identification has become possible (for example, see Non-Patent Documents 1-4).
  • identifying a protein or clarifying its constituent components is not enough as a functional analysis.
  • the proteome is dynamic, its expression state changes from time to time and from place to place. Therefore, it is the answer that the advantage of proteomics can be vitalized only by analyzing the variation of individual proteins. So, DNA Similar to the differential display on the chip, various attempts have been made to create a differential display at the protein level in the proteome and to capture changes in individual protein levels.
  • this in vivo labeling method can be applied to all cells in principle as long as it is a cultured cell, but in practice, changing the culture conditions greatly changes the growth rate of cells. Culture in a medium containing stable isotopes is often difficult. In other words, it can be performed only on a limited number of cells that are not affected by culture conditions. Furthermore, tissues such as animals and humans cannot be easily cultured and cannot be measured by this method.
  • the following method was found as a method for comprehensively quantifying proteins in tissues. That is, by adding an isotope-labeled cystine residue reagent and an unisotope-labeled cysteine residue reagent to two types of samples to be compared, cysteine residues of the protein contained in the sample are labeled. Then, the protein was purified by a column, analyzed by a mass spectrometer, and the intensity of the peaks of the pair was compared, whereby the protein quantification became possible (for example, see Non-Patent Documents 14-19).
  • this method cannot quantify proteins that do not contain cysteine residues, nor can it correct for fluctuations in quantitative values from experiment to experiment, such as purification.
  • the current quantitative proteome analysis methods can be broadly classified into in vivo labeling methods and in vitro labeling methods.
  • the former is easy to label and can be expected to have high reproducibility data.However, in the case of samples that cannot be grown in a medium containing tissues, biological fluids, organelles, protein complexes, and stable isotopes, It is not applicable to proteins that do not incorporate stable isotopes contained in them.
  • the latter can be applied to any sample, but cannot correct for variations in quantitative values from one experiment to another in pretreatment steps such as disruption, extraction, digestion, fractionation, and purification of the sample until labeling.
  • the labeling reaction itself is often not easy, and the difference in the experience of the experimenter is likely to occur.
  • the conventional quantitative proteome analysis method directly compares the internal standard substance with the analyte, and when the measurement target changes, the internal standard substance to be labeled also needs to be changed. On the other hand, it was not easy to quantify the biomolecule of the internal standard substance, and thus it was very difficult to determine the absolute quantity.
  • the AQUA method has been reported so far as an absolute quantification method among the quantitative proteome analysis methods (for example, see Patent Document 2).
  • a stable isotope is incorporated into a part of a synthetic peptide, and the ratio to a target protein is determined. But this way Therefore, it is difficult to comprehensively quantify because it is necessary to always prepare isotope-labeled synthetic peptides for each experiment, and to quantify each experiment.
  • proteome analysis refers to an analysis that clarifies the relationship between genetic information and various proteins that interact in a complex manner in cells (for example, see Non-Patent Document 24).
  • proteome analysis is a method that comprehensively analyzes all proteins that make up cells.
  • two-dimensional electrophoresis the expressed protein is developed on a gel, and the type of the protein can be comprehensively identified by cutting out spots corresponding to the target protein. Therefore, two-dimensional electrophoresis is a useful qualitative analysis tool in proteome analysis.
  • mass spectrometry is used as another important protein analysis technique.
  • This method is to analyze the accurate mass of proteins and peptides using a mass spectrometer.
  • This mass spectrometer generally comprises a device for ionizing proteins and peptides, and a mass spectrometer provided with a mass separation unit for separating according to the mass thereof and analyzing the mass.
  • protein databases, and search systems that link them protein identification has become much easier today. Therefore, it is possible to comprehensively identify a specific protein group (for example, a protein group forming a complex).
  • simply identifying a protein by mass spectrometry or clarifying its constituent components is not sufficient as a function analysis of a protein. This is because proteome-based functional analysis allows comparison of disease states, analysis of changes in individual proteins due to the effects of drug or ligand stimulation, and the knockout or overexpression of target genes. Quantitative data is required.
  • Non-Patent Document 1 "Nature Charges (Nature Genetics)", Volume 20, September 1998, p. 46-50
  • Non-Patent Document 2 "Journal of Cell Biology", Vol. 141, No. 4, May 18, 1980, p. 967-977
  • Non-Patent Document 3 “Current Opinion in Cell Biology”, Vol. 15, No. 2, April 2003, p. 199—205
  • Non-Patent Document 4 "Current Opinion in Chemical Biology", Vol. 7, No. 1, February 2003, p. 21-27
  • Non-Patent Document 5 ⁇ Surgery Today '', Vol. 23, No. 3, 1993, p.
  • Non-Patent Document 6 "Rapid Communications in Mass Spectrometry," Volume 8, No. 5, 1994, p. 377-380
  • Non-Patent Document 7 "Journal” 'Chromatography One' Aournal of
  • Non-Patent Document 8 "Analytical Biochemistry” Vol.231, No.1, October 1995, p.141-150
  • Non-Patent Document 9 "Journal of Ob 'Chromatography ⁇ ⁇
  • Non-Patent Document 10 "Proceedings of the National Academv of Sciences of the United States of America), Vol. 100, No. 12, 2003 June, p. 6940-6945
  • Non-Patent Document 11 “Current Opinion in Chemical Biology”, Vol. 7, No. 1, February 2003, p. 70-77
  • Non-Patent Document 12 "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. of America), Vol. 96, No. 12, June 1999, p. 6591-6596
  • Non-Patent Document 13 "Methods” Vol. 29, No. 2, February 2003, p. 124-130
  • Non-Patent Document 14 "Nature Biotechnology", Vol. 17, Vol. No. 10, October 1999, p. 994-999
  • Non-Patent Document 15 “Analytical Chemistry”, Vol. 70, No. 24, December 1998, p. 5150-5158
  • Non-Patent Document 16 "Rapid Communications in Mass Spectrometry ⁇ Vol. 16, No. 15, 2002, p. 1416—1424
  • Non-Patent Literature 17 "Journal of the Bible-American Society” Mass. Statrometry
  • Non-Patent Document 18 “Nature Biotechnology”, Vol. 19, Vol.
  • Non-Patent Document 19 "Molecular and Cellular Proteomics", Vol. 1, No. 1, January 2002, p. 19-29
  • Non-Patent Document 20 "Analytical Chemistry” Vol. 73, No. 13, July 2001, p. 2836-2842
  • Non-Patent Document 21 "Rapid Communications in Mass Spectrometry ⁇ Vol. 15, No. 14, 2001, p. 1214-122
  • Non-Patent Document 22 " Nichiya Bio Technology (Nature Biotechnology), Vol. 20, No. 2, February 2002, p. 163-170
  • Non-Patent Document 23 "Nature Biotechnology", Vol. 20, No. 5, May 2002, p. 512-515
  • Non-Patent Document 24 Karn, P. Science 270, pp. 369-370, 1995
  • Non-patent document 25 "Proteome analysis method", Yodosha, published July 10, 2000 pp. 111-122 Patent document 1: USP 6391649
  • Patent Document 2 WO2003 016861
  • the present invention has been made in view of such a situation, and the problem to be solved is a sample that cannot be metabolically labeled (eg, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, Accurate quantification of one or more biomolecules in a protein complex or the like, and furthermore, absolute quantification.
  • a sample that cannot be metabolically labeled eg, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, Accurate quantification of one or more biomolecules in a protein complex or the like, and furthermore, absolute quantification.
  • the present invention provides an analysis system and an analysis method that enable quantitative analysis of a mass spectrometry spectrum even when a plurality of mass spectrometry spectra of different biomolecular forces contribute to the mass spectrometry spectrum. It is to provide. Further, the present invention provides an analysis system and an analysis method for adding quantitative analysis and functional information on powerful biomolecules.
  • Still another object of the present invention is to provide a program for causing a computer to execute the quantitative analysis method.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, in mass spectrometry for biomolecules, prepared isotope-labeled biomolecules in advance and added to each sample. Quantifies one or more biomolecules in a sample that cannot be metabolically labeled (eg, tissue, biological fluid, cells, organelles, protein complexes, etc.) I found out. In addition, by quantifying previously prepared isotope-labeled biomolecules, comprehensive absolute quantification of biomolecules can be achieved. Have been found possible, and the present invention has been completed. The authors also found that more accurate quantitative analysis of biomolecule expression can be performed by applying waveform separation processing to mass spectrometry spectra together with the isotope labeling method in biomolecule mass spectrometry. The invention has been completed.
  • a sample is supplemented with an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule or a cell that contains an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule.
  • a method for quantifying biomolecules comprising:
  • a method for quantifying one or more biomolecules in a sample comprising:
  • a method for quantifying one or more biomolecules in a sample comprising:
  • biomolecules are an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule or a metabolically labeled biomolecule.
  • biomolecule according to any one of [1] to [14], wherein the biomolecule is a molecule selected from the group consisting of proteins, lipids, sugar chains, nucleic acids, and combinations thereof. the method of,
  • biomolecule is a protein, further comprising a step of extracting and fractionating the protein, and digesting the protein.
  • a sample containing an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or a cell containing an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule is added to each sample. Analyzing each biomolecule in the mass spectrometer and receiving the analysis result from the mass spectrometer;
  • a sample containing an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or a cell containing an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule is added to each sample. Extracting and fractionating biomolecules from the sample, analyzing the fractionated biomolecules with a mass spectrometer, and receiving analysis results from the mass spectrometer;
  • a program for absolute quantification of one or more biomolecules in a sample The known amount of the biomolecule in the internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or in the cell containing the internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule; A program or the like according to any one of [27] to [29] is provided.
  • [31] data of mass spectrometry of the first biomolecule and the second biomolecule isotope-labeled with respect to the first biomolecule may be obtained.
  • An analysis system comprising: a mass spectrometer that performs mass spectrometry of the first and second biomolecules; and a control unit having a data input / output unit that receives data related to mass spectrometry of the biomolecules from the mass spectrometer.
  • the control unit comprises a first m / z value for the biomolecule in which the sequence of the biomolecule is determined, and the second m / z value in which the sequence of the biomolecule is determined.
  • an analysis system that includes a waveform processing unit that receives a spectrum (mask mouth matogram) and performs a waveform separation process on a mass spectrometric spectrum (mask mouth matogram) for the above-described time.
  • the determination of the first and second m / z values may be performed by determining the sequence of a component of a biomolecule. From the value of the first m / z of the first biomolecule, based on the number of components of the isotope unlabeled of the first biomolecule and information on the charge of the first biomolecule, Determining a second m / z value of the second biomolecule, or from a second m / z value of the second biomolecule from which the sequence of components of the biomolecule has been determined, The first m / z value of the first biomolecule is determined based on the number of isotope-labeled constituent components of the second biomolecule and information on the charge of the second biomolecule.
  • the control unit comprises a unique biomolecule obtained by the waveform separation processing from the waveform separation processing unit. Calculate the area of the waveform derived from the first biomolecule at the first m / z value and the unique biomolecule at the second m / z value.
  • a calculating unit for calculating a ratio of (the first waveform area) / (the second waveform area) from the value of the second waveform area derived from the above.
  • control unit may perform, after the waveform separation, the component of the biomolecule.
  • control unit is configured to determine a sequence of a biomolecule from a component of the biomolecule.
  • a calculation unit for determining an average value from the quantitative values of the components of each biomolecule constituting the biomolecule and using the average value as a representative quantitative value of the biomolecule. According to the powerful configuration, a representative quantitative value of the component of the biological molecule can be obtained, and it can be associated with the function information by referring to a database described later.
  • control unit may include a sequence of a component of the biomolecule.
  • An information adding unit for collating with the database having the above function information and acquiring the function information of the biomolecule is further provided. According to such a configuration, it is possible to obtain knowledge on the relationship between the representative quantitative value of the component and the function information.
  • a method for performing mass analysis of the first and second biomolecules Performing mass spectrometry in the presence of an internal standard; the waveform processing unit receives a mass spectrometry spectrum (mask mouth graph) with respect to time at the m / z value of the internal standard; Then, in order to obtain a waveform unique to the internal standard material, a waveform separation process is further performed, and the arithmetic unit calculates a waveform area unique to the internal standard material from the waveform processing unit, The ratio of (one waveform area) / (waveform area specific to the internal standard) and / or the ratio of (the second waveform area) / (waveform area specific to the internal standard) Calculate further. According to the powerful configuration, when the biomolecule in the internal standard substance has a known amount, absolute quantification becomes possible.
  • a mass spectrometer for performing mass spectrometry of the first and second biomolecules and the isotope-labeled biomolecule; and receiving data related to mass spectrometry of the biomolecule from the mass spectrometer.
  • a control unit having a data input / output unit, the control unit comprising: a first and a second m / z value for the biomolecule in which the sequence of the components of the biomolecule is determined; and a configuration of the biomolecule.
  • the first and second biomolecules and the Data including mass spectrometry spectra for the m / z value of biomolecules and time versus mass spectrometry (mask mouth mattogram) of the internal reference material are extracted from the mass spectrometry data obtained by the mass spectrometer.
  • a mass spectrometry spectrum with respect to time at the m / z value of the first and second and internal standard substances from the processing section, And a waveform processing unit that performs a waveform separation process on the mouth matogram.
  • the determination of the m / z value of the first and second and the internal standard substance may be carried out by: From the first and second m / z values of the first and second biomolecules whose sequence has been determined, the number of non-isotopically labeled components of the first and second biomolecules Said The m / z value of the internal standard of the biomolecule of the internal standard is determined based on the information on the charge of the first and second biomolecules, or the sequence of the components of the biomolecule is determined.
  • control unit has a unique characteristic obtained by the waveform separation processing from the waveform separation processing unit.
  • the area of the waveform derived from the biomolecule is calculated, and the values of the first and second waveform areas derived from the unique biomolecule at the first and second m / z values and the internal standard substance are calculated.
  • the image processing apparatus further includes a calculation unit that calculates a ratio of (the second waveform area) / (a waveform area unique to the internal standard).
  • control unit may perform, after the waveform separation, the component of the biomolecule.
  • An information adding unit for classifying each sequence, collating the sequence with a database having functional information of biomolecules, and associating the sequence with the function based on the collation result, is further provided.
  • control unit converts the biomolecule from a sequence of a component of the biomolecule.
  • An arithmetic unit is further provided which determines the average value from the quantitative values of the constituents of each biomolecule constituting the biomolecule and uses the average value as a representative quantitative value of the biomolecule.
  • control unit may include a sequence of a component of the biomolecule.
  • An information adding unit that obtains function information of the biomolecule by collating with a database having the above function information is further provided.
  • the analysis system according to any one of the above [31] to [43] is provided.
  • the isotope used in the isotope-labeled [44] is, 2 H, 13 C, 15 N, "0, 18 0, 33 P and 34 S and any one selected the group force consisting combinations force thereof Isotope of
  • the determination of the sequence of the component [46] may be performed by comparing data obtained by MS / MS processing with a database on biomolecules. By collation, the arrangement of the constituent components is determined.
  • the biomolecule in the analysis system according to any one of [31] to [46], [47] is a biomolecule whose sample force is separated with time. It is.
  • the analysis system according to any one of [31] to [47], wherein the biomolecule is a protein, a lipid, a sugar chain, a nucleic acid,
  • these combined forces are group forces that are any of the molecules selected.
  • [0048] in a fourth aspect of the present invention there is provided: [49] Analysis of data relating to mass spectrometry of a first biomolecule and a second biomolecule which is isotope-labeled with respect to the first biomolecule.
  • the determination of the first and second m / z values is based on the first m / z value of the first biomolecule in which the sequence of the component of the biomolecule is determined.
  • the second m / z value of the second biomolecule based on the number of components of the isotope-unlabeled component and the information on the charge of the first biomolecule; or The number of the isotope-labeled components of the second biomolecule and the number of the second biomolecules are determined from the second m / z value of the second biomolecule in which the sequence of the components is determined.
  • the analysis method according to [49] wherein the analysis is performed by determining a first m / z value of the first biomolecule based on information of the electric charge of the first biomolecule.
  • [51] a step of calculating the area of a waveform derived from the unique biomolecule obtained in the waveform separation processing step, and a first waveform derived from the unique biomolecule at the first m / z value From the value of the area and the value of the second waveform area derived from the unique biomolecule at the second value of m / z, the ratio of (the first waveform area) / (the second waveform area)
  • the analysis method according to [49] or [50] further comprising:
  • a step of specifying a biomolecule from the sequence of components of the biomolecule, and a step of obtaining an average value from quantitative values of components of each biomolecule constituting the biomolecule and setting the average value as a representative quantitative value of the biomolecule The analysis method according to any one of [49] to [52], further comprising:
  • the method according to any one of [49] to [54], further comprising a step of calculating a ratio of a waveform area unique to the substance).
  • a method for analyzing data relating to mass spectrometry with respect to an internal standard substance, which is an isotope-labeled biomolecule, for a first and a second biomolecule comprising: Among the data relating to mass spectrometry of biomolecules, the first and second m / z values of the first and second biomolecules in which the sequence of the biomolecules is determined, and Determining the m / z value of the internal standard of the biomolecule of the sequenced internal standard; and determining the first and second values from the m / z values of the first and second and the internal standard.
  • the data including the mass spectrometry spectrum for the m / z value of the biomolecule of the second biomolecule and the biomolecule of the internal standard and the mass spectrometry plot (mask mouth mattogram) for time is extracted from the data related to the mass spectrometry.
  • the determination of the m / z values of the first and second and the internal standard is performed by determining the first and second biomolecules of the first and second biomolecules in which the sequence of the components of the biomolecules has been determined. From the value of m / z, based on the number of the isotope-unlabeled constituents of the first and second biomolecules and the information on the charges of the first and second biomolecules, Determine the value of m / z of the internal standard of the biomolecule or from the value of m / z of the internal standard of the biomolecule of the internal standard whose sequence of components of the biomolecule has been determined, The first and second m / z of the first and second biomolecules are determined based on the number of isotope-labeled components of the biomolecules of the substance and the information on the charge of the biomolecules of the internal standard substance.
  • the analysis method according to [56] wherein the analysis method is performed by determining a value of
  • the isotope used for the isotope labeling is 2 H, 13 C, 15 N, 170 , 180 , 33 P and 34 S, and any isotope selected from a group force including a combined force thereof.
  • the biomolecule is any one of the above-mentioned [49] to [65], which is a molecule selected from proteins, lipids, sugar chains, nucleic acids, and a combination or group power thereof. And the like.
  • the quality of the first biomolecule and the quality of the second biomolecule that is isotope-labeled with respect to the first biomolecule obtained in the mass spectrometer A program for causing a computer that receives data relating to quantitative analysis to analyze the data, wherein a component of a biomolecule is included in data related to mass analysis of the biomolecule measured by the mass spectrometer.
  • the value of the first m / z of the first biomolecule whose sequence has been determined and the value of the second m / z of the second biomolecule whose sequence of components of the biomolecule has been determined Determining from the first and second m / z values a mass spectrometry plot for the m / z values of the first biomolecule and the second biomolecule and a mass for time.
  • the determination of the first and second m / z values is based on the first m / z value of the first biomolecule in which the sequence of the component of the biomolecule has been determined.
  • the second m / z value of the second biomolecule is determined based on the information on the number of unlabeled components of the biomolecule and the charge of the first biomolecule. Or the number of isotope-labeled components of the second biomolecule and the number of the second biomolecules are determined from the second value of m / z of the second biomolecule in which the sequence of the components of the biomolecule is determined.
  • the program according to [67] wherein the program is executed by determining a first m / z value of the first biomolecule based on information on a charge of the second biomolecule,
  • the ratio of (the first corrugated area) / (the corrugated area unique to the internal standard), and / or (the second corrugated area) / (the waveform area specific to the internal standard) The program according to any one of [67] to [72], further comprising the step of calculating a ratio to
  • the determination of the m / z value of the first and second and the internal standard is performed by From the first and second m / z values of the first and second biomolecules in which the sequence of the components of the first and second biomolecules is determined, the isotope-unlabeled components of the first and second biomolecules are determined.
  • the m / z value of the internal standard of the biomolecule of the internal standard is determined based on the number and the information on the charges of the first and second biomolecules, or the sequence of the components of the biomolecule is determined.
  • the isotope used for the isotope labeling is 2 H, 13 C, 15 N, 170 , 180 , 33 P, and 34 S.
  • the combined force of these is also selected as the group force,
  • biomolecule according to any of [67] to [83], wherein the biomolecule is a molecule selected from proteins, lipids, sugar chains, nucleic acids, and a combination or a group force thereof. Provide the described program.
  • a sixth aspect of the present invention provides a method for analyzing data relating to mass spectrometry of an internal standard substance, which is an isotope-labeled biomolecule, with respect to the first and second biomolecules.
  • the data on the mass spectrometry of the biomolecule measured by the mass spectrometer, the first and second biomolecules of the first and second biomolecules for which the arrangement of the constituent components of the biomolecule has been determined.
  • the m / z value of the first and second biomolecules and the m / z value of the biomolecule of the internal standard material are calculated from the m / z values of the first and second and internal standard materials.
  • the determination of the m / z values of the first and second and the internal standard is performed by determining the first and second biomolecules of the first and second biomolecules in which the sequence of the components of the biomolecules has been determined. From the value of m / z, the number of the isotope-unlabeled components of the first and second biomolecules is determined.
  • the isotope used for the isotope labeling is 2 H, 13 C, 15 N, 170 , 180 , 33 P and 34 S, and any isotope selected from a group force including a combined force thereof.
  • the biomolecule is a biomolecule that has been subjected to sample force separation over time. 85] to [93], the analysis method according to any one of
  • biomolecule is a protein, a lipid, a sugar chain, or a nucleic acid, or a combination thereof.
  • the present invention relates to mass analysis of first and second biomolecules obtained by a mass spectrometer and an internal standard substance, which is an isotope-labeled biomolecule of the first and second biomolecules.
  • a computer for receiving the data is a program for analyzing the data, wherein the sequence of the components of the biomolecule is determined from the data on the mass analysis of the biomolecule measured by the mass spectrometer. The values of the first and second m / z of the first and second biomolecules and the m / z of the internal standard of the biomolecule of the internal standard are determined.
  • the m / z value of the first and second biomolecules and the m / z value of the biomolecule of the internal standard substance are determined from the m / z values of the first, second, and internal standard substances. Extracting the mass spectroscopy spectrum for time and mass spectroscopy spectrum for time (mask mouth mattogram) as well as the data power for the mass spectrometry, the program according to [96],
  • the determination of the m / z values of the first and second and the internal standard substance is performed by determining the first and second biomolecules of the first and second biomolecules in which the sequence of the components of the biomolecules has been determined. From the value of m / z, based on the number of the isotope-unlabeled constituents of the first and second biomolecules and the information on the charges of the first and second biomolecules, Determine the value of m / z of the internal standard of the biomolecule or from the value of m / z of the internal standard of the biomolecule of the internal standard whose sequence of components of the biomolecule has been determined, The first and second m / z of the first and second biomolecules are determined based on the number of isotope-labeled components of the biomolecules of the substance and the information on the charge of the biomolecules of the internal standard substance.
  • biomolecule according to the above [96] to [105], wherein the biomolecule is a molecule selected from the group consisting of proteins, lipids, sugar chains, nucleic acids, and combinations thereof.
  • the program described in any one of the above is provided.
  • a computer receiving data related to mass analysis of one or more biomolecules in a sample, obtained in the mass spectrometer comprises: A program for quantifying biomolecules. The first m / z value of the first biomolecule in which the sequence of the constituent components of the biomolecule is determined from the data on the mass spectrometry of the biomolecule measured by the mass spectrometer; Determining a second m / z value of the second biomolecule in which the sequence of the constituents of the molecule has been determined, and determining the first biomolecule value from the first and second m / z values.
  • Extracting data including a mass spectrometry spectrum for the m / z value of the molecule and the second biomolecule and a mass spectrometry spectrum for the time (mask mouth mattogram) from the data relating to the mass spectrometry; Performing a waveform separation process on a mass spectrometry spectrum (mask mouth matogram) of the first and second biomolecules with respect to time; and
  • the determination of the first and second m / z values is based on the first m / z value of the first biomolecule in which the sequence of the component of the biomolecule has been determined.
  • the second m / z value of the second biomolecule is determined based on the information on the number of unlabeled components of the biomolecule and the charge of the first biomolecule. Or the number of isotope-labeled components of the second biomolecule and the number of the second biomolecules are determined from the second value of m / z of the second biomolecule in which the sequence of the components of the biomolecule is determined.
  • the program according to [107] wherein the program is executed by determining a first m / z value of the first biomolecule based on information on a charge of the second biomolecule.
  • a process of identifying a biomolecule from the sequence of components of the biomolecule, and calculating an average value from quantitative values of the components of each biomolecule constituting the biomolecule to obtain a representative value The program according to any one of [107] to [110], further comprising the step of:
  • the isotope used for the isotope labeling is 2 H, 13 C, 15 N, 170 , 180 , 33 P, and 34 S, and any isotope selected from the group force and the combination force thereof.
  • the sequence of the component is determined by comparing data obtained by MS / MS processing with a database on biomolecules.
  • the biomolecule is a molecule selected from proteins, lipids, sugar chains and nucleic acids, and a group force including a combination thereof, and any of the above [107] to [116].
  • the program or the like described in (1) is provided.
  • one or more biomolecules in a sample that cannot be metabolically labeled eg, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, a protein complex, and the like
  • a sample that cannot be metabolically labeled eg, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, a protein complex, and the like
  • the conventional in vivo labeling method could be performed only on a limited number of cells that are not affected by culture conditions, but in the present invention, a biomolecule labeled with a metabolically isotope is used.
  • Cells containing an internal standard or an internal standard that is a metabolically-labeled biomolecule are added to the sample, so samples that cannot be metabolically labeled (e.g., tissues, It has become possible to quantify one or more biomolecules in biological fluids, cells, organelles, and protein complexes.
  • an internal standard substance which is a metabolically-labeled biomolecule or a metabolically-isotopically labeled biomolecule is used before crushing, extracting, digesting, fractionating, purifying, etc. a sample.
  • the addition of cells containing a certain internal standard has made it possible to accurately quantify one or more biological molecules in a sample.
  • the present invention facilitates comparison between three or more samples. That is, the conventional quantitative proteome analysis method directly compares the internal standard substance with the analyte, and thus it is necessary to prepare a sample each time the measurement is performed. Furthermore, if the measurement target changes, the internal standard substance to be labeled also changes, so it is necessary to examine the conditions for labeling each time.Also, it was difficult to compare between experiments, but in the present invention, metabolic By storing cells containing an internal standard that is an isotope-labeled biomolecule or an internal standard that is a biomolecule that is metabolically isotope-labeled and appropriately using them, data comparison between experiments can be performed, for example.
  • comparative data can be obtained and analyzed for certain experimental data. Furthermore, by transferring or lending the cells containing the internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or the internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule, Data comparison between researchers, which was not possible until now, becomes possible.
  • the concentration of a biomolecule in a cell containing an internal standard substance that is a biomolecule that is metabolically labeled in advance or an internal standard substance that is a biomolecule that is metabolically labeled isotope is determined.
  • absolute quantification of biomolecules became possible.
  • By transferring or lending cells containing metabolically isotope-labeled biomolecules or internal standards that are metabolically isotope-labeled biomolecules Data sharing is possible.
  • the absolute amount of biomolecules in cells containing an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule can be determined. Since there is no need to quantify each experiment, it can be applied to various experiments.
  • the analysis device and the analysis method of the present invention unique biomolecules A derived mass spectrometry spectrum can be obtained, and it becomes possible to quantitatively analyze the expression level of a biomolecule that changes with time in cells in a living body.
  • the program according to the present invention allows the computer to realize the analysis method.
  • functional information can be added to the quantitative analysis results.
  • a biomolecule in a cell containing an internal standard substance which is a metabolically labeled biomolecule or an internal standard substance which is a metabolically labeled biomolecule is quantified.
  • cells containing the internal standard substance, which is a metabolically labeled biomolecule, or the internal standard substance, which is a metabolically labeled biomolecule are added to the sample.
  • the peptides that can be quantified include not only peptides having the same sequence as the synthetic peptide, but also other peptides derived from the protein constituted by the peptide. Therefore, since a single protein is quantified by multiple peptides, accurate and highly reproducible quantitative values can be obtained without errors in the measurement results of individual peptides greatly affecting the quantitative values of proteins. It became possible.
  • the peptide synthesizer uses a 10-fold excess of the reagent, and the force and the scale of the synthesis are on the order of milligrams. Therefore, the synthesis of the isotope-labeled peptide is extremely expensive, and it is difficult to comprehensively quantify by a conventional method in terms of cost.
  • the method of the present invention since the isotope labeling of the biomolecule is performed by cell culture, even a very small amount can be efficiently produced.
  • synthetic peptides for quantifying biomolecules in cells containing an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule are: Since isotope is not required and can be handled by ordinary peptide synthesis, it is suitable as a comprehensive quantification method.
  • sample used in the present invention indicates a measurement object containing a biomolecule, and preferably refers to a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, or a protein complex.
  • the tissues include, for example, brain, various parts of the brain (e.g., olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla oblongata, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, spleen, kidney , Liver, gonads, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, duodenum, small intestine, large intestine, blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, parotid gland, sublingual gland, peripheral blood, prostate, Examples include testes, ovaries, placenta, uterus, bones, joints, etc.
  • biological fluid examples include blood (including plasma and serum), urine, feces, saliva, tear fluid, infiltration fluid (including ascites and tissue fluid).
  • cells include hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, spleen j8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, Fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (e.g., macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes), Examples include megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, stromal cells or their precursor cells, stem cells, cancer cells, and the like.
  • Cell organs include, for example, nuclei, organelles (nucleolus, nuclear membrane, cell membrane, mitochondria, lysosomes, ribosomes, peroxinome, endoplasmic reticulum (rough endoplasmic reticulum, smooth endoplasmic reticulum, sarcoplasmic reticulum, etc.), Golgi Body, microtubule, centrosome, actin filament, etc.), cytosol, synapse, basal Examples include a membrane and an intercellular adhesion device.
  • a protein complex refers to a state in which two or more proteins are physically bound. The examples given here are specific examples, and the present invention is not limited to these examples.
  • biomolecule used in the present invention refers to a protein, a lipid, a sugar chain, a nucleic acid, or a combination thereof, and is preferably a protein. It goes without saying that biomolecules also include those that have undergone physiological modification (for example, phosphoric acid protein).
  • protein used in the present invention includes a peptide in which two or more amino acids are bound by a peptide bond.
  • metabolically labeled biomolecule refers to a metabolically labeled biomolecule by adding an isotope-labeled precursor of the biomolecule.
  • metabolic indicates a physiological condition via an enzymatic reaction or the like, and is preferably a metabolic reaction in a cultured cell.
  • the term "precursor" used in the present invention refers to a molecule that can be a component of a biomolecule.
  • the precursor is preferably an amino acid, more preferably an essential amino acid, for example, leucine, isoleucine, tryptophan, methionine, lysine, phenylalanine, palin, threonine, particularly preferably leucine.
  • the molecule is a lipid, for example, if it is a sphingolipid, if serine is preferred, if saccharide is preferred, if glucose is preferred, aspartic acid, glutamine, and glycine will also have purine nucleotide biosynthesis Therefore, these are preferable, but are not limited thereto. That is, the type of the precursor is not limited as long as it is incorporated into the biomolecule.
  • the term "internal standard substance” used in the present invention means that when quantifying a substance to be measured by a mass spectrometer, a fixed amount in a sample is mainly used to correct fluctuations in quantitative values from experiment to experiment.
  • the substance that can be prepared is mainly used to correct fluctuations in quantitative values from experiment to experiment.
  • an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule used in the present invention refers to an internal standard that contains one or more metabolically labeled biomolecules.
  • cells containing an internal standard substance that is a metabolically-labeled biomolecule used in the present invention refers to an internal standard containing one or more metabolically-labeled biomolecules. Remove cells containing the substance.
  • quantification used in the present invention broadly includes absolute quantification and relative quantification.
  • absolute quantification used in the present invention is a quantification method for the purpose of obtaining a measurement result as a quantity or concentration
  • relative quantification refers to a quantification method other than absolute quantification.
  • sample that cannot be metabolically labeled refers to a sample other than a sample that can be metabolically labeled.
  • the sample that can be metabolically labeled refers to a sample that can be metabolically labeled without being affected by the isotope-labeled precursor of the biomolecule by culturing.
  • samples that cannot be labeled metabolically include, for example, samples that can be labeled metabolically while being affected by the precursor of the biomolecule labeled with the isotope by culturing and administration to living organisms, tissue culture, and others. It shall include samples that can be labeled by the method described above.
  • sample that cannot be labeled by cell culture refers to a sample from which cells cannot be cultured. That is, samples that cannot be cultured by cells and can be labeled by administration to a living organism, tissue culture, or other methods other than cell culture are included in “samples that cannot be labeled by cell culture”.
  • a tissue, a biological fluid, a cell organ, or a protein complex can be used.
  • the present invention provides an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule, a cell that contains an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule, and a reagent that contains the internal standard.
  • an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule
  • a reagent that contains the internal standard Provide reagents containing cells containing internal standard substances
  • Cells containing an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule are subjected to the measurement Cells that are easy to grow in a medium of the same species as the elephant sample, preferably from the same tissue, and particularly preferably contain isotopes, but are not limited thereto.
  • a medium containing an isotope-labeled biomolecule as a precursor of the biomolecule
  • cells containing an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule are prepared. can do. Regardless of the culturing conditions, any suitable conditions for culturing the living cells in a liquid medium or solid medium may be selected.
  • a medium such as DMEM, MEM, RPMI1640, or IMDM
  • serum such as fetal calf serum (FCS), amino acids, glucose, penicillin, or streptomycin, if necessary.
  • FCS fetal calf serum
  • the culture can be carried out at a pH of about 6-8, 30-40 ° C for about 15-200 hours.
  • the medium can be exchanged midway, and aeration and agitation can be performed.
  • the isotope a radioactive isotope can be applied, but a stable isotope is preferably used.
  • Stable isotopes preferably 2 H, 13 C, 15 N , 17 0, 18 0, 33 P or 34 S or a combination thereof, particularly preferred is not intended to be limited to a force using a 13 C. That is, the type of the isotope of the present invention is not limited as long as it can be taken into cells and can label a biomolecule.
  • 13 C-labeled ( 13 CX 6) leucine manufactured by Cambridge Isotope Labs (CIL), L-Leucine U- 13 C6, CLM-2262 Is mentioned.
  • the cell containing the internal standard substance which is a metabolically isotope-labeled biomolecule obtained as described above can be used as it is, or can be crushed. How to granulated Blast, Dounce teflon kappa ⁇ homogenizer, a polytron, a Waring 'Brenda one, Potter type glass' homogenizer, sonicator, cell lysate (e.g., PIERCE Inc. M- PER:. Cat no 78501, T -PER: cat no. 78510) or a freeze-thaw method, preferably a cell lysate. The protein can be quantified if necessary.
  • Dounce teflon kappa ⁇ homogenizer e.g., Dounce teflon kappa ⁇ homogenizer, a polytron, a Waring 'Brenda one, Potter type glass' homogenizer, sonicator, cell lysate (e.g., PIERCE Inc
  • an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule can be produced.
  • Cells containing these metabolically isotope-labeled biomolecules or internal standards that are metabolically isotope-labeled biomolecules may be prepared under appropriate conditions, preferably at 20 ° C or lower. Especially good Preferably, it can be stored below -80 ° C.
  • the present invention provides a mass spectrometer-based sample, which comprises adding, to the sample, an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or a cell containing the internal standard substance that is the biomolecule.
  • the present invention provides a method for quantifying a biomolecule.
  • This quantification method comprises the steps of: adding, to a sample, cells containing an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule; The steps of extracting and fractionating biomolecules from each sample, measuring with a mass spectrometer, and obtaining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak of each biomolecule. And quantifying the biomolecule.
  • the program according to the present invention causes a computer to execute each step of the quantification or analysis method according to the present invention, as described later.
  • the program according to the present invention can be installed or downloaded to a computer through various recording media such as a CD-ROM, a magnetic disk, and a semiconductor memory.
  • cells containing an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule, preferably a certain amount of metabolically labeled isotope A cell containing an internal standard that is a biomolecule obtained or an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule is added.
  • a sample containing cells containing an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule is crushed, After extraction of the molecules, preferably proteins, they can be fractionated. This is the fractionated sample.
  • the method of crushing and extracting is as follows: dounce type Teflon ⁇ homogenizer, polytron, Waring blender, potter type glass homogenizer, ultrasonic crusher, cell lysate (for example, Pierce ⁇ -PER: cat no. 78501, T - PER:.
  • the fractionated sample can be purified.
  • Purification methods include group-specific affinity column purification, cation exchange chromatography, ion-exchange chromatography, and reverse phase chromatography, immunoprecipitation, ammonium sulfate precipitation, and organic solvent precipitation. , Ultrafiltration, gel filtration, dialysis, etc., and preferably group-specific affinity column purification. Crushing •
  • the extraction, fractionation, and purification operations are not limited to these, and appropriate ones may be selected and combined according to the common general technical knowledge of those skilled in the art.
  • the purified sample can be separated and digested.
  • This is the separated sample and digested sample.
  • the separation method include two-dimensional electrophoresis, SDS PAGE, and various types of chromatography (eg, affinity chromatography, reverse phase chromatography, ion-exchange chromatography, cation-exchange chromatography, etc.).
  • the digestion method include enzymatic digestion, chemical decomposition, and the like.
  • an enzyme digestive force is not limited thereto, and an appropriate method may be selected.
  • enzymes used for enzymatic digestion include trypsin, chymotrypsin, Lys-C, Asp-N, Glu-C and the like, with trypsin being preferred.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • a measurement sample meaning a fractionated sample, a purified sample, a separated sample, a digested sample, or a sample separated by HPLC
  • a mass spectrometer is mass spectrometers combined with gas chromatographs, such as gas chromatography mass spectrometry (GC / MS) and liquid chromatography. It can be carried out using a general-purpose device such as liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS), which is a device connected to a chromatograph. The ionizing method in the mass spectrometer can be appropriately selected according to each device.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • ESI electrospray ionization
  • EI electro ionization
  • CI ionization ionization
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization
  • FAB Fast atom bombardment method
  • LD FD
  • SIMS SIMS
  • TSP time-of-flight type
  • ion trap ion trap
  • a double focusing type a quadrupole type
  • Fourier transform type a Fourier transform type.
  • the apparatus and method for mass spectrometry are not limited to those described above, and those skilled in the art may appropriately select those usually used for mass spectrometry.
  • Biomolecules preferably proteins
  • Biomolecules can be identified using data obtained as a result of measurement by mass spectrometry.
  • the obtained data is converted into a commercially available software, for example,
  • NCBInr www.ncbi.nlm.nih.gov/
  • IPI sports, etc.
  • NCBInr can be used to analyze and automatically identify proteins in a sample. It is easy for those skilled in the art to identify proteins using measurement data obtained by mass spectrometry (Nat Genet. 1998: 20, 46-50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977; J Cell Biol. 2000: 148, 635-651; Nature. 2002: 415, 141-147; Nature. 2002: 415, 180-183; Curr Opin Cell Biol. 2003: 15, 199-205; Curr Opin Cell Biol. 2003: 7, 2t 27).
  • the term “labeled peak of biomolecule” refers to the m / z of Metabolic isotope labeling in mass spectroscopy spectra for values (hereinafter simply referred to as “mass spectroscopy spectra”) and / or mass spectroscopy spectra for time (hereinafter sometimes referred to as “mask mouth matograms”).
  • Signal intensity derived from the biomolecule or the sum thereof it can be understood by those skilled in the art that the area is usually represented by an area) (hereinafter, may be simply referred to as a labeled peak).
  • unlabeled peak of a biomolecule refers to a biomolecule that is metabolically labeled with an isotope in a mass spectrometry spectrum and / or a mask mouth matogram. Signal intensity or the sum thereof (hereinafter, may be simply referred to as an unlabeled peak).
  • Biomolecules labeled metabolically isotope have a higher molecular weight by the isotope-labeled molecular weight than biomolecules derived from the sample, and are observed as paired peaks in mass spectrometry (see Figure 2).
  • the molecular weight of the isotope-labeled biomolecule can be determined by calculating the sequence of the identified protein, lipid, sugar chain or nucleic acid.
  • the unlabeled peak of each biomolecule in sample A is compared with the labeled peak of the internal standard substance corresponding to the biomolecule.
  • the unlabeled peak / labeled peak (peak intensity ratio A) in the biomolecule is obtained.
  • the unlabeled peak / labeled peak (peak intensity ratio B) of the biomolecule is determined. .
  • the peak intensity ratio A and the peak intensity ratio B the biomolecules in the sample A and the sample B can be relatively quantified.
  • cells containing an internal standard substance which is a metabolically labeled biomolecule or an internal standard substance which is a metabolically labeled biomolecule may be used.
  • Biomolecules eg, proteins, etc.
  • a peak derived from a nearby internal standard substance preferably a peak having a short elution time in chromatography for LC / MS, a molecular weight close for a MALD-MS, and a peak can be determined by comparing the peak intensity ratio between the samples. Therefore, it is possible to measure all biomolecules (eg, proteins) in a sample.
  • biomolecules X when comparing biomolecules X in sample A and sample B, biomolecules X may not be present in the internal standard substance, and biomolecules Y may be present in the vicinity.
  • the vicinity means a peak derived from an internal standard substance, a peak having a short elution time by chromatography in LC / MS, and a peak having a close molecular weight in MALD-to-MS.
  • the unlabeled peak of biomolecule X in sample A by the labeled peak of the internal standard substance corresponding to biomolecule Y, the unlabeled peak of biomolecule X / the labeled peak of biomolecule Y is obtained. (Peak intensity ratio C).
  • the unlabeled peak of biomolecule X in sample B by dividing the unlabeled peak of biomolecule X in sample B by the labeled peak of the internal standard corresponding to biomolecule Y, the unlabeled peak of biomolecule X / the labeled peak of biomolecule Y ( Determine the peak intensity ratio D).
  • the peak intensity ratio C and the peak intensity ratio D the biomolecules in the sample A and the sample B can be relatively quantified. By selecting a plurality of nearby biomolecules, the accuracy of the measurement can be improved.
  • the present invention enables absolute quantification of one or more biomolecules, preferably proteins, used for mass spectrometry.
  • one or more biomolecules have a known amount, an internal standard substance that is a metabolically labeled isotope-labeled biomolecule, and a metabolic isotope that has one or more biomolecules with a known amount.
  • Cells comprising an internal standard that is a labeled biomolecule are provided.
  • each biomolecule sample preferably a protein sample, an internal standard substance or a metabolically isotope-labeled biomolecule that is a metabolically labeled biomolecule
  • an internal standard substance preferably an internal standard substance or a metabolically isotope-labeled biomolecule that is a metabolically labeled biomolecule
  • the absolute amount of the isotope-labeled biomolecule is determined in this way, then, in various experiments, the internal standard substance that is the isotope-labeled biomolecule or the metabolically isotope-labeled biomolecule Since cells containing an internal standard substance can be used, this method is extremely useful as compared with the conventional method, in which quantification must be performed for each experiment. [0096] The details are described below.
  • the absolute amount of a biomolecule present in a cell containing an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule is a known amount of a biomolecule. It is possible to determine the absolute amount by measuring with a mass spectrometer using a sample.
  • a chemically synthesized biomolecule of a known amount is used as an internal standard substance that is a metabolically isotopically labeled biomolecule or a metabolically isotopically labeled biomolecule.
  • Add to the cells containing the internal standard and disrupt, extract, fractionate, and purify as required by the methods described above.
  • an internal standard substance that is a metabolically labeled biomolecule or a metabolically labeled isotope The absolute amount of the biomolecule present in the cell containing the internal standard substance that is the biomolecule obtained is determined.
  • biomolecule is a protein
  • SDS-PAGE SDS-PAGE
  • EIA EIA
  • cells containing a fixed amount of an internal standard that is a metabolically labeled isotope-labeled biomolecule or a cell that contains an internal standard that is a metabolically labeled isotope-labeled biomolecule are appropriately treated.
  • Crushing is performed under appropriate conditions, preferably under the same conditions as the above-described method for preparing a measurement sample, and a protein is extracted.
  • an internal standard substance that is a metabolically labeled biomolecule or a metabolically isotope By measuring the target protein in this extract by SDS-PAGE, EIA, ELISA, RIA, Western plot, etc., an internal standard substance that is a metabolically labeled biomolecule or a metabolically isotope The absolute amount of the biomolecule present in the cells containing the internal standard, which is a body-labeled biomolecule, is determined.
  • the specific activity activity intensity per protein amount
  • the specific activity specific to the substance may be determined by using the reported activity or by measuring. Therefore, the aforementioned extraction
  • cells containing an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or a cell that contains an internal standard substance that is a metabolically isotope-labeled biomolecule can be measured. The absolute amount of the biomolecule present is determined.
  • the object of quantification is not limited to proteins, but quantifies and identifies all substances produced by cells using nutrients in the medium, such as lipids, sugar chains or nucleic acids. It can be applied to the intended analysis.
  • a method for determining and comparing the intensity ratio between a labeled peak and an unlabeled peak of a biomolecule, and a method for quantifying a biomolecule contained in an internal standard substance that is a metabolically labeled biomolecule A program according to the present invention for executing the program will be described later.
  • FIG. 3 shows a schematic overall scheme of a method for quantitative analysis of a protein as an example of a biomolecule according to the second embodiment of the present invention.
  • a measurement sample is prepared, and then mass spectrometry is performed using a mass spectrometer.
  • the quantitative analysis method according to the present invention is executed.
  • the preparation of the measurement sample shown in step S 11 in FIG. 3 includes a step of isotopically labeling the sample and a step of extracting and fractionating biomolecules with respect to the strength of each sample.
  • Methods for isotopically labeling a sample include a method of culturing in a medium containing an isotope-labeled amino acid and a method of chemically or enzymatically isotopically labeling in vitro.
  • the method of culturing in a medium containing an isotope-labeled amino acid involves adding an isotope-labeled amino acid to an isotope-unlabeled cell that does not contain an isotope-labeled amino acid and is grown and / or cultured in an environment.
  • suitable conditions for culturing the cells in a liquid medium or solid medium may be used regardless of the culture conditions.
  • the method can be performed according to the method described in the first embodiment of the present invention described above.
  • a medium such as DMEM, MEM, RPMI1640, or IMDM may be used, if necessary.
  • Serum such as fetal calf serum (FCS), amino acids, Lucose, penicillin, streptomycin, or the like can be added, and cultivation is performed at a pH of about 6-8, 30-40 ° C for about 15-200 hours.
  • the medium can be exchanged midway, or aerated and agitated, if necessary.
  • Cells containing the isotope-labeled protein thus obtained can be used as they are, or can be crushed and used.
  • Methods for crushing include Dounce type Teflon 'homogenizer, Polytron, Waring' Plender, Potter type glass' homogenizer, ultrasonic crusher, cell lysate (for example, Pierce's M-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510) or a freeze-thaw method, and a method using a cell lysate is preferable.
  • an isotope-labeled protein can also be prepared in vitro.
  • cysteine residues in a protein can be isotopically labeled by alkylating the cysteine residue using an isotope-labeled alkylation reagent (“Rabbit Communications in Mass Spectroscopy”). Metric (Rapid and ommunications in Mass spectroscopy), Vol. Lb, No. 5, 2002,
  • isotopically labeled cysteine residues in the protein can be obtained by biotinylation using a biotinylated reagent labeled with isotopes. Further, it is possible to purify only the labeled protein using an avidin column ("Nature Biotechnology", Vol. 17, No. 10, October 1999, pp.994-999).
  • a peptide fragment obtained by digesting a protein can be labeled with an isotope-labeled molecule at the C-terminus, N-terminus, glutamic acid residue, aspartic acid residue, and the like.
  • water labeled with 180 is added to a buffer solution.
  • digestive enzymes chymotrypsin, trypsin, Asp-N, Lys-C, and Glu-C can be used.
  • Kimotoribushin when using the Asp-N is 18 0 Gertz be located at the C-terminus of peptides after hydrolysis, trypsin, Lys- C, when using Glu- C, the C-terminal carboxylic peptides after hydrolysis It is known that both oxygen atoms of an acid are 180 .
  • the isotope-labeled protein or cells containing the isotope-labeled protein can be stored under appropriate conditions, preferably 20 ° C or lower, particularly preferably 80 ° C or lower.
  • the thus obtained isotope-labeled protein can also be used as an internal standard in the analysis described below.
  • a radioactive isotope can be applied.
  • a stable isotope having no radioactivity is particularly preferable because of easy handling.
  • the stable isotopes but are not limited to, 2 H, 13 C, 15 N, "0, 18 0, 33 P Moshiku is include 34 S, or a combination thereof, preferably 13
  • the type of the isotope used in the present invention is not particularly limited as long as it can be taken up by cells and label the protein. 13 c label (13 CX6 pieces) leucine (Cambridge Isotope Labs (CIL) Co., L- leucine U- 13C6, CLM- 2262) can be mentioned.
  • FIG. 4 shows the measurement sample preparation using the isotope labeling according to the present invention.
  • 2 shows a scheme of one embodiment of the second embodiment of the invention.
  • the samples to be measured one is prepared as a sample 1 containing an isotope-labeled protein, and the other is prepared as a sample 2 containing a protein not labeled with an isotope. And mix sample 1 and sample 2
  • the mixed sample is crushed to extract proteins. Then, if necessary, the above-described sample can be purified. Purification methods include group-specific affinity column purification, cation exchange chromatography, ion-exchange chromatography, reverse phase chromatography, immunoprecipitation, ammonium sulfate precipitation, precipitation with an organic solvent, Ultrafiltration, dialysis and the like can be mentioned.
  • Separation methods include, but are not limited to, two-dimensional electrophoresis, SDA PAGE, various chromatographic methods (eg, affinity chromatography, reverse phase chromatography, aion exchange chromatography, cation exchange Chromatography).
  • Digestion methods include, but are not limited to, enzymatic digestion, chemical degradation, and the like. Examples of enzymes used for enzymatic digestion include trypsin, chymotrypsin, Lys-C, Asp-N, and Glu-C.
  • the sample product thus obtained can be separated by force HPLC, which can be measured as it is.
  • the column used for HPLC includes, but is not limited to, a 1S-one exchange column or a cation exchange column.
  • HPLC conditions flow rate, detector, mobile phase
  • flow rate, detector, mobile phase are easily understood by those skilled in the art, and can be appropriately selected.
  • the sample prepared as described above is subjected to mass spectrometry in step S12 shown in FIG.
  • This mass spectrometry is based on gas chromatography (GC / MS), a mass spectrometer coupled to a gas chromatograph, and liquid chromatography mass spectrometry (LC / LC), a mass spectrometer coupled to a liquid chromatograph. / MS) can be used.
  • the ionizing method in mass spectrometry can be appropriately selected according to each apparatus.
  • MALDU ESI, EI, CI, APCI, FAB, LD, FD, SIMS, TSP and the like can be mentioned.
  • the analyzer can be appropriately selected according to each device. For example, TOF, ion trap, double focusing, quadrupole, It can be performed using a general-purpose device such as a conversion type.
  • Proteins can be identified using data obtained as a result of measurement by mass spectrometry. Using commercially available software such as SonarMSMS (Genomic solution) and a database such as NCBInr (hhtp: //www.ncbi.nlm.nih.gov/), IPI, Sport etc. Allows automatic identification of proteins. It is easily understood by those skilled in the art to identify proteins using measurement data obtained by mass spectrometry (for example, Nat Genet. 1998: 20, 45-50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977). J Cell Biol. 200: 148, 635—651; Nature, 2002: 415,
  • a peak derived from an isotope-labeled protein serving as an internal standard substance for each protein and a sample using data obtained from the results of measurement by mass spectrometry.
  • an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule is included.
  • the step of adding cells and the step of extracting and fractionating biomolecules from each sample are performed in step S13 shown in FIG.
  • the biomolecules are measured by a mass spectrometer (see step S12 in FIG. 3).
  • the results obtained by the mass spectrometer were obtained, and after selecting a labeled peak and a non-labeled peak of each biomolecule, the intensity ratio of each peak was determined. If desired, the biomolecules can be quantified.
  • Fig. 5 shows a scheme of the quantitative analysis method according to the present invention after mass spectrometry in the mass spectrometer.
  • the quantitative analysis method according to the present invention determines the amino acid sequence of a mass analysis spectrum of an analysis target by MS / MS processing (step S111), and the mass spectrometry spectrum (first m / z ) (Step S112), the protein was isotopically labeled from the first m / z value of the determined protein.
  • step S113 The calculation of the second m / z value of the isotope-labeled protein (step S113), the mass spectrometry spectrum with respect to time at the first and second m / z values (hereinafter also referred to as “mask mouth matogram”) ) (Step S114), waveform separation of the mask mouth matogram of each protein corresponding to the first and second m / z values (step S115), and the uniqueness obtained by the waveform separation processing.
  • step S116 Calculation of the waveform area derived from the protein (step S116), the value of the first waveform area corresponding to the first m / z, and the value of the second waveform area corresponding to the second m / z.
  • step S117 calculates the ratio of (the second waveform area) I (the first waveform area)
  • the analysis method has been described based on the method of obtaining the mass spectrometry spectrum of the corresponding isotope-labeled protein from the mass spectrometry spectrum of the isotope-unlabeled protein. It is known to those skilled in the art that the analysis method according to the present invention can also be performed by a method for determining the mass analysis spectrum of the corresponding isotope-unlabeled protein after determining the mass analysis spectrum of the isotope-labeled protein. Is easy to understand.
  • FIG. 6 shows a spectrum obtained by a typical mass spectrometer.
  • the types of spectra obtained include, from an arbitrary time axis point, a spectrum showing the intensity axis with respect to m / z (mass spectroscopy spectrum with respect to m / z) and the total amount of ions detected in terms of intensity at each time.
  • step S111 shown in FIG. 5 the amino acid sequence is determined based on the MS / MS processing power obtained mass spectrum (step S111). Thereafter, the first m / z value of the protein to be analyzed is determined (step SI12).
  • the MS / MS process described above refers to the use of a plurality of mass separation units to separate one of the ion species generated in the ionization chamber of the first mass separation unit (hereinafter, "MS1").
  • MS1 mass separation unit
  • This is a processing method in which the precursor ions are selected and the ions generated by the decomposition of the precursor ions are detected in the second mass separation section (MS2).
  • MS2 mass separation section
  • the analysis of the amino acid sequence is performed based on the value of the m / z value of the product ion.
  • the second m / z of the isotope-labeled protein corresponding to the protein is determined from the first m / z value of the protein whose amino acid sequence has been determined. This is because, when preparing a sample in step S11 shown in FIG. 3, cells using a reagent whose stable isotope is known, for example, 13 C-labeled ( 13 C ⁇ 6) leucine, are used as the amino acids to be labeled with isotopes. By culturing, the difference between the first m / z value and the second m / z value is 6 for 12 C and 13 C, and the difference is 6. Then, the second value of m / z can be calculated in step S113 from the value of the charge of the protein.
  • first mass spectrometry spectrum with respect to time hereinafter, referred to as "first mass spectrometry spectrum with respect to time (hereinafter,” first Of the second mass spectroscopy with respect to time (hereinafter sometimes referred to as the "second mask mouth mattogram”;)
  • second mask mouth mattogram Is extracted from the mass spectrum obtained by the mass spectrometer (step S114).
  • FIG. 7 shows an example of a mask opening matogram in which a plurality of peaks overlap at a single m / z value.
  • a waveform separation process is performed on the first mask mouth matogram and the second mask mouth matogram described above (step S115) to separate them into mask mouth matograms derived from unique proteins.
  • the waveform separation processing used in the present invention is a synthetic separation method based on a curve fitting method for a complicated waveform. This first assumes that each peak component can be represented by a particular analytical function. Based on this assumption, several peak functions are generated and synthesized, and the parameters included in each peak function are adjusted to minimize the deviation from the observed waveform. This is performed by decomposing and separating each peak waveform from the parameter at the minimum deviation point.
  • the waveform parameters used for the waveform separation processing include the number of peaks, the shape of each peak, the peak position, the peak height, the shape of the baseline, and the like.
  • FIG. 8 shows a mask mouth matogram obtained by separating the mask mouth matogram shown in FIG. 7 by the waveform separation processing according to the present invention.
  • waveform separation can be performed using a Gaussian function and a Lorentz function.
  • the actually measured mask opening matogram shown by the solid line is divided into five by the mask opening matogram represented by the dotted line and the like by the waveform separation processing according to the present invention.
  • the waveform separation processing shown in Fig. 8 is performed on the isotope-unlabeled protein and the corresponding isotope-labeled protein.
  • the mask mouth matogram obtained in this way is a mask mouth matogram derived from an intrinsic protein.
  • the area of the mask mouth matogram is calculated for each of the above-mentioned isotope-unlabeled protein and isotope-labeled protein, and these are defined as a first waveform area and a second waveform area, respectively (step S116).
  • step S117 the ratio of (second waveform area) / (first waveform area) is determined, and can be used for quantitative analysis of protein fluctuation. This allows for quantitative analysis by always comparing with isotopically labeled proteins.
  • FIG. 9 shows an example of a functional block diagram of a configuration of an analysis system 10 to which the present invention is applied. Note that FIG. 9 conceptually shows only a part related to the present invention in the above configuration, and is constituted by a microcomputer.
  • the analysis system 10 generally includes an analysis device section 30 for analyzing mass analysis data obtained by the mass spectrometer 20, an external analysis program for amino acid sequence determination, and the like.
  • An external device section 40 to be provided is communicably connected via a network 50.
  • the network 50 shown in FIG. 9 has a function of connecting the analysis device unit 30 and the external device unit 40 to each other, and is, for example, the Internet or the like.
  • the mass spectrometer 20 used in the present invention is not particularly limited, and may be any commercially available mass spectrometer. Further, the mass spectrometer 20 may include a data storage unit 25 for storing the results obtained by the measurement by the mass spectrometer itself. In addition, the mass spectrometer 20 used in the present invention has a control unit for controlling the apparatus and an input / output unit. It may have a part.
  • the external device section 40 shown in Fig. 9 is interconnected via a network to the analysis device section 30 for analyzing mass spectrometry data, and provides the user with an external database ⁇ homology database for amino acid sequence information and the like. It has a function to provide a web site for executing external analysis programs such as one search.
  • the external device section 40 may be configured as a WEB server, an ASP server, or the like, and the hardware configuration thereof is generally a commercially available information processing device such as a workstation or a personal computer, and an accessory device thereof. May be used.
  • Each function of the external device section 40 is realized by a CPU, a disk device, a memory device, an input device, an output device, a communication control device, and the like in a hardware configuration of the external device portion, and a program for controlling them. You.
  • a database such as NCBInr can be used as the external device.
  • the analysis device section 30 shown in FIG. 9 includes a control section 60 such as a CPU that comprehensively controls the entire mass spectrometer 20 and a communication device such as a router connected to a communication line or the like. (Not shown
  • An input / output control interface unit 80 connected to an output device 90 such as a display printer, and a storage unit 100 for storing various databases. It is configured with.
  • Each unit is communicably connected via an arbitrary communication path.
  • the analysis unit 30 according to the present invention is communicably connected to a network via a communication device such as a router and a wired or wireless communication line such as a dedicated line.
  • Various databases (such as mass spectrometry data and amino acid sequence database) stored in the storage unit 100 are storage means such as a fixed disk device, and store files and data.
  • the mass spectrometry database is a database obtained by the mass spectrometer 20.
  • the amino acid sequence database is an amino acid sequence database as a result of mass spectrometry analysis obtained by the mass spectrometer or an external amino acid sequence database accessible via the Internet. Is also good.
  • these databases may be copied, the original sequence information may be stored, or an in-house database created by adding a unique identification number may be used.
  • the control unit 60 is a device that stores a program for executing the analysis method according to the present invention, and controls the analysis device unit 30, and thus the entire analysis system 10.
  • the control unit 60 has a control program such as an operating system (OS), a program defining various processing procedures, and an internal memory (not shown) for storing required data. Performs information processing for executing various processes.
  • a program for executing the analysis method according to the present invention may be stored in the storage unit 100.
  • FIG. 10 is a flowchart conceptually showing one program for executing the analysis method according to the present invention.
  • control unit 60 acquires the mass analysis data obtained by mass spectrometer 20. Then, the acquired mass spectrometry data is stored in the storage unit 100. At this time, for convenience of analysis described later, identification of a scan number or the like is performed on each mass spectrometry data so as to facilitate data search. A number is assigned (step S201).
  • control is performed by MS / MS processing while collating with an external database, for example, the NCBInr database, via the Internet 50 via the communication control interface unit.
  • the amino acid sequence can be determined in the part 60 (Step S202) o From the mass spectrometry data, a mass spectrometric spectrum to be analyzed is determined (see Step S203). At that time, determine the m / z of the mass spectrometry spectrum determined as described above, and use this as the first m / z.
  • This first m / z value may be a mass spectroscopy spectrum of the isotope-unlabeled protein or a mass spectroscopy spectrum of the isotope-labeled protein. Such a determination can easily be made as described above.
  • step S204 from the first m / z value of the protein whose amino acid sequence has been determined, a second m / z value of the isotope-labeled protein corresponding to the protein is determined.
  • This determination step can be easily performed based on the number of isotope atoms contained in the isotope-labeled amino acid used in the preculture in step S11 in FIG. 3 and the charge of the protein corresponding to the first m / z. Can be determined.
  • the mass chromatogram of that value is also extracted from the mass spectrometry data stored in the storage unit 100 (see step S205).
  • step S206 a waveform separation process is performed.
  • the mask mouth matogram derived from the unique protein is separated and stored in the storage unit 100.
  • the first waveform area and the second waveform area are calculated as the waveform area of the mask mouth matogram obtained in this manner (step S207), and in step S208, the (second waveform area) I ( (One waveform area).
  • the value of the ratio can be displayed or printed on an output device 90 such as a display or a printer as necessary.
  • the series of steps shown in Fig. 10 is performed while comparing with the mass spectrometry spectrum caused by the isotope-labeled protein, it is possible to quantitatively analyze the change in the protein expression level in the sample. . If necessary, the series of steps shown in FIG. 10 can be repeatedly performed on another mass spectrometry spectrum to be analyzed. For example, it is possible to observe a difference in the expression pattern of a protein derived from a cell deficient in a gene by comparing it with a protein derived from a normal cell.
  • the description is given of the isotope-unlabeled biomolecule and the isotope-labeled biomolecule.
  • an isotope-labeled internal standard is used instead of the isotope-labeled biomolecule.
  • the biomolecule that is the quality can be used instead of the isotope-labeled biomolecule.
  • the waveform area ratio shown in step SS208 in FIG. 10 is calculated as the ratio of (biomolecule waveform area) / (waveform area specific to the internal standard). You.
  • FIG. 11 is a functional block diagram showing a detailed configuration of the control unit 60 used in the present invention.
  • the control unit 80 for executing the analysis method according to the present invention described with reference to FIG. 10 transmits the mass analysis data obtained by the mass spectrometer 20 to the control unit through the input control interface unit 80.
  • the amino acid sequence of the mass spectrometric data of the obtained protein is determined by the processing unit of the control unit 60 by MS / MS processing, while checking the data with an external database, for example, the NCBInr database.
  • the mass spectrometry spectrum to be analyzed is determined based on a signal from an input unit (not shown) connected to the mass spectrometer 20 or the control unit 80.
  • examples of the input means include a keyboard and a mouse connected to the control unit.
  • the first m / z value is determined by the above determination, and the processing unit of the control unit 60 determines the second m / z value.
  • the determination of the second value of m / z can be performed by step S113 in FIG.
  • the protein having the first m / z value and the second m / z value has a relationship between an unlabeled amino acid and a protein labeled with the same amino acid.
  • the mask mouth matogram at the first and second m / z values determined as described above is read from the mass spectrometry database in the storage unit 100 or the mass spectrometer 20 via the data input / output unit. , Obtained by the processing unit.
  • the mask opening matograms at the obtained first and second m / z values are subjected to waveform separation processing by the processing unit as described in step S115 in FIG. 5 and step S206 in FIG.
  • the mask mouth matogram at the m / z value alone can be used to generate a mask mouth matogram derived from a unique protein even if it is apparently a single protein peak. Can be separated (see Figure 8)
  • the data separated into the mask mouth matogram derived from the unique protein is sent from the waveform processing unit to the calculation unit, where the calculation of the waveform area separated by the calculation unit and the determination of the isotope non-labeling are performed.
  • the calculation of the waveform area ratio between the mask mouth matograms derived from the corresponding unique protein is executed.
  • each sample is provided with an internal standard substance that is a metabolically labeled protein or a metabolically labeled protein in advance.
  • the cells containing the internal standard are collected, proteins from each sample are extracted, fractionated, and measured by a mass spectrometer.
  • the analysis method according to the present invention including the waveform separation processing enables the quantitative analysis of biomolecules. It should be noted that, if the sample cannot be cultured, This method is useful when the sample can be cultured, but is affected by subculture, or when the sample cannot be prepared at the same laboratory at the same time. Furthermore, if the protein in the internal standard is a known amount, absolute quantification is possible.
  • FIG. 12 shows a process chart of a program for obtaining and comparing the intensity ratio in the first embodiment of the present invention.
  • mass spectrometry data of various measurement samples measured by the mass spectrometer 20 is acquired by the analyzer unit 30 of the analysis system 10 according to the present invention. As described above, it includes a fractionated sample, a purified sample, a separated sample, a digested sample or a sample separated by HPLC prepared in the method for preparing a measurement sample.
  • a biomolecule that is not metabolically labeled with an isotope and a biomolecule that is not labeled with an isotope are targeted.
  • step S301 the MS / MS / MS / MS / MS / MS / MS / MSB / MSB / MSB / MSB / MSB / MSB / MS / MS / MS / MS / MS /
  • the MS processing the obtained data on mass spectrometry, specifically, identification of isotope-labeled and unisotope-labeled proteins, that is, the amino acid sequence is identified in the processing unit of the control unit 60. Thereafter, the target isotope-labeled peak and the isotope-unlabeled peak are specified (see step S302).
  • step S303 the control unit 60 sets the peak intensity ratio between the isotope-labeled peak and the isotope-unlabeled peak in the molecule in which the amino acid sequence of the peptide was identified. calculate. By performing the above operation on a plurality of peptides obtained for each sample force, the peak intensity ratio can be compared between different peptides.
  • the present invention can provide a program for absolutely quantifying the biomolecule.
  • the mask mouth matogram actually measured and subjected to the waveform separation is originally obtained by subjecting the sample to be analyzed to two-dimensional electrophoresis or the like. This is the result of mass analysis of the separated protein.
  • the gel in the container is digested with an enzyme such as trypsin to collect fragments into peptides, and mass spectrometry is performed.
  • the peptide recovered in this manner is derived from a band derived from the cleaved protein spot.
  • the same protein itself does not contain a single protein, even if the same protein It is customary for the peptide to be cleaved during processing and to be present in multiple bands. Therefore, the same peptide is measured as a plurality of waveform-separated mask mouth matograms even if the mask mouth matogram is waveform-separated as described above.
  • the ratio of (peak of unlabeled peptide) / (peak of labeled peptide) and (waveform area of unlabeled peptide) I isotopically labeled peptide
  • the values of the ratios (hereinafter, collectively referred to as “quantitative values”) differ for each peak subjected to mass spectrometry, and there are a plurality of values.
  • the function information of the protein can be obtained by comparing the result of the mass spectrometry spectrum with a database such as LocusLink having the function information of the protein.
  • LocusLink provides “Locus IDJt, link information to common keys and protein function information from key information in multiple databases such as NCBInr, IPI, Sport, etc.
  • the key information in each database can be obtained using databases such as NCBInr, IPI, Sport, etc.
  • the Locus ID can be obtained from the key information using LocusLink.
  • Function information of proteins can be obtained, for example, key information "GiNo" is obtained from peptide sequences using a database such as NCBInr.
  • LocusLink uses LocusLink to get the Locus ID from GiNo.
  • protein function information can be obtained from the Locus ID.
  • FIG. 13 shows a scheme for acquiring function information using an external database used in the present invention.
  • a database containing protein functional information for example, NCBInr, IPI, Sport, etc.
  • the sequence patterns are collated using NCBI-BLAST.
  • GiNo which is the key information of the obtained array pattern force NCBInr
  • LocusLink which is a database having detailed function information, and obtain Locus ID from GiNo. After that, those having the same Locus ID are grouped, and Gene Symbol, Gene
  • FIG. 14 is a process chart for executing a method of adding function information based on the result of the determined peptide sequence after waveform separation (step S400) in the present invention.
  • step S401 classification is performed for each sequence of the selected peptide, and a peptide sequence to be analyzed later is specified.
  • an external database is accessed via the communication control interface to acquire function information.
  • specific examples of the external database include databases such as NCBInr (hhtp: @ www.ncbi.nlm.nih.gov /), IPI, and Sport. Then, a sequence pattern is searched from such a database to obtain information such as GiNo.
  • step S402 the presence or absence of information on the protein that the peptide constituted was determined from information such as the GiNo of the peptide. inspect. If it has protein information, it is grouped as a sequence that shares powerful information. The quantitative value of the grouped proteins is calculated (see step S403). In addition, as shown in FIG. 14, this information includes an event such as Gene Symbol, GO (biological process) ⁇ uOi, cellular component) uO (molecular interaction), etc. ⁇ You can do it manually. The calculation of the average of the above-described quantitative values and the calculation of the representative quantitative value of the peptide can be performed by the calculation unit of the control unit 60 shown in FIGS. 9 and 11.
  • the MS / MS processing power is used to determine the amino acid sequence constituting the peptide from the obtained mass spectrometry spectrum, and then perform a waveform separation process without performing a waveform separation process. (NCBInr, etc.) to find the relationship between the quantitative value of the peptide and the biological data. This means that it is not necessary to separate the waveform of the peptide itself whose amino acid sequence has been determined by mass spectrometry! ⁇ Also applicable to cases.
  • FIG. 15 shows the results of mass spectrometry of a peptide in the presence of an internal standard substance, which is an isotope-labeled biomolecule, without waveform separation, specifically based on the results of an amino sequence.
  • FIG. 4 shows a process chart for executing a method of adding function information. Steps S500 to S502 shown in FIG. 15 are the same as steps S200 to S205 shown in FIG. 10, and a description thereof will be omitted.
  • step S503 a mask mouth matogram at the m / z of the first and second and internal standard substances is extracted.
  • an external database is accessed via the communication control interface shown in FIG. 9 to acquire function information.
  • examples of the external database include databases such as NCBInr (hhtp: @ www.ncbi.nlm.nih.gov /), IPI, and Sport. From such a database, a peptide sequence pattern is searched to obtain information such as GiNo. Thereafter, in step 505, the presence or absence of information on the protein constituting the peptide is searched from information such as GiNo of the peptide. If the peptide has information on the protein, Gene Symbol, GO (biological process), It can be related to functional information such as GO (cellular component), GO (molecularmputation), and representative quantitative values.
  • step S502 does not show the step of calculating the ratio of the waveform area of the isotope-labeled peptide to that of the isotope-labeled peptide, which was performed in step S209 in FIG.
  • the waveform area of each peptide was determined, and the waveform area of (isotope-labeled peptide waveform) / (isotope-labeled peptide waveform area) ) Is calculated, and the steps S504 and S505 are executed, so that it can be related to the function information.
  • the waveform area of each peptide was determined, and the waveform area of (isotope-labeled peptide waveform) / (isotope-labeled peptide waveform area) ) Is calculated, and the steps S504 and S505 are executed, so that it can be related to the function information.
  • a peak intensity ratio that is not only a waveform area ratio is used, it can be similarly related to function information.
  • the mouse neuroblastoma cell line Neuro2A was cultured.
  • RPMI-1640 (Sigma, R-7130) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE, BATCH 32300102), 100 U / ml penicillin G, 100 g / ml streptomycin (GIBCO, 15140-122) was used.
  • RPM 1640 is prepared by selecting a powdered medium that does not contain L-glutamine, L-lysine, L-methionine, L-leucine, and sodium bicarbonate, and adding the defective components to the medium (L-glutamine).
  • Lutamine (Sigma, G-8540), L-lysine (Sigma, L-9037), L-methionine (Sigma, M-5308), sodium bicarbonate (Wako Pure Chemical, 191-01305) 0.3 g / L, 0.04 g / L, 0.015 g / L, and 2 g / L, respectively, and further, 0.05 g / L-leucine (Cambridge Isotope Laboratories, CLM-2262) labeled with a stable isotope L added).
  • the medium thus prepared was cultured at 37 ° C under 5% CO. The cells obtained by this culture
  • the cells were used in the following experiments as cells containing an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule (Examples 2-7).
  • mice C57BL / 6
  • mice lacking the ADAM22 gene were prepared as samples, and ⁇ I was excised and cryopreserved. To determine the amount of protein per brain wet weight, one of them was measured for brain wet weight and a protease inhibitor (Complete TM (Roche Diagnostics, Inc., product number 1697498)) was added. 2 tablets per 50 mL of extract from the sample)
  • the soluble fraction was prepared by centrifugation at 100,000 ⁇ gl hours. When the amount of protein in this soluble fraction was measured, the amount of protein per lg of brain wet weight was 39.4 mg.
  • the brain as a subject was thawed, the brain wet weight was measured, and the protein amount of the subject was estimated from the protein amount per brain wet weight described above. Then, the cells containing the internal standard substance, which is a metabolically isotope-labeled biomolecule obtained in Example 1, are added to the number of cells (12.1xl0 7 ) so that the amount of protein is equal, and the mixture is treated with a Teflon R homogenizer. Homogenized, 500xg
  • Unbroken cells, nuclei, etc. were removed by centrifugation for 5 minutes.
  • a soluble fraction was prepared by centrifuging the supernatant at 100,000 ⁇ g for 1 hour.
  • the adsorbed protein was eluted with a PBS-10 mM NADH solution (NADH, Sigma, N-8129) to recover cMDH.
  • the collected fraction was concentrated by ultrafiltration, purified by SDS PAGE (ATTO, e-PAGEL, E-T520L), and the band corresponding to cMDH was cut out and trypsin (Promega, Cat. No. V5111). ), And digested in a gel (Rapid Comm Mass Spectrom., 15, 1416-1421, 2001: Rapid Comm Mass Spectrom., 17, 1071-1078, 2003) to obtain a digested sample.
  • the digested sample was transferred to MALDI-MS (ABI4700, manufactured by Applied Biosystems).
  • ⁇ of wild-type mouse (C57B6) was excised and cryopreserved. Brain wet weight was measured, and protease inhibitor (Complete TM (Roche's Diagnostics Co., Ltd., product number 1697498) was dissolved in two tablets per 50 mL of extract from the sample). Contain 10mM HEPES- (pH7.4) -lmM DTT-lmM MgCl -ImM NaF-lmM
  • a soluble fraction was prepared by centrifugation at 100,000 ⁇ g for 1 hour.
  • the soluble fraction was adjusted to have a protein concentration of 3.7 mg / mL.
  • Example 1 obtained in Example 1 was metabolically isotope cell lysates including cellular 1.9 ⁇ 10 7 pieces of the internal standard is labeled biomolecule M-PER (PIERCE Co., 78501) solubilized in lmL Then, the insoluble fraction was removed by centrifugation to prepare an internal standard substance, which is a metabolically labeled biomolecule.
  • the internal standard, which is a metabolically labeled biomolecule is mixed with the soluble fraction at a ratio of 1: 3, 1: 1, 3: 1, and 10: 1 to obtain the soluble fraction of the sample. Minutes (0.2 mL each).
  • the digested sample was transferred to MALDI-MS (ABI4700, manufactured by Applied Biosystems).
  • the soluble fraction was adjusted to have a protein concentration of 3.7 mg / mL.
  • mice wild-type mice (C57B6) and mice deficient in the ADAM22 gene (strain, breeder) were prepared, and their ⁇ I were excised and cryopreserved.
  • the brain was thawed and the brain wet weight was measured. From the protein amount per brain wet weight obtained in Example 1, the protein amount in the sample was calculated.
  • the cells containing the internal standard substance, which is a metabolically isotope-labeled biomolecule obtained in Example 1 are subjected to cell counts such that the protein amounts are equal, and homogenized with a Teflon R homogenizer, Unbroken cells, nuclei, etc. were removed by centrifugation at 500 ⁇ g for 5 minutes.
  • the supernatant was centrifuged at 100,000 ⁇ g for 1 hour to prepare a soluble fraction.
  • the amount of the protein was measured, the amount of the protein derived from the wild-type mouse was 3.02 mg / mL, and the amount of the protein derived from the mouse lacking the ADAM22 gene was 3.12 mg / mL. This was used as a fractionated sample. Subsequently, the following procedures were performed for each fractionated sample by 2 mL each (two 1 mL tubes). Urea (Bio-Rad Cat. No. 161-0731) was added to make 8M, and 0.5M Tris containing 3mg of dithiothreitol (Wako Pure Chemical Cat. No.
  • DTT per mL was added.
  • 500 ⁇ L of a buffer solution pH 8.3, manufactured by Sigma was added to each fractionated sample, and incubated at 37 ° C. for 3 hours to reduce cysteine residues in the protein. Thereafter, urine was added to make the volume 8 ⁇ , and 500 ⁇ L of 0.5 M Tris buffer (pH 8.3) containing 8 mg of acrylamide (Cat. No. 161-0107 manufactured by Bio-Rad) was fractionated. Samples were incubated at room temperature for 3 hours to alkylate cysteine residues. Excess acrylamide was deactivated by adding 8 mg of DTT to the mixture. Using SnakeSkin with a molecular weight of 10,000 cuts (Pierce, Cat. No.
  • HPLC conditions were as follows: 0.2 mL / min flow rate, 235 nm & 280 nm UV detection wavelength, 5% acetonitrile in 25 mM formic acid and 1 M in mobile phase B in the case of a cation exchange column. PH 3.5, 5% acetonitrile.
  • mobile phase A is Moyua was adjusted to 5% acetonitrile
  • mobile phase B was adjusted to pH 8.6 with 1M ammonium acetate to 5% acetonitrile.
  • the gradient consisted of 100% mobile phase A for the first 5 minutes, followed by a linear increase in mobile phase concentration to 40% over 40 minutes, followed by 5 minutes with mobile phase B at 100% for 15 minutes.
  • Each fraction that eluted from the column was acidified by washing with TFA, washed with acetonitrile, and conditioned with 0.1% TFA water.
  • the flow rate used was the flow-splitting method, and the column was adjusted to a flow rate of about 12 L / min.
  • a 50 ⁇ L sample was injected with the CTC Autosampler PAL, and the sample was once incorporated into the sample loop of the injector.
  • the mass spectrometer is equipped with ThermoFinnigan's LCQ Duo equipped with AMR's custom-built sub-nano sprayer that does not use seed gas and that can adjust the spray position arbitrarily by using the XYZ stage.
  • -One dollar GL Science (Cat. No. 7820-59001) was used directly connected to the C18 column. 2.6 kV was applied as the ESI voltage.
  • the J link was Dvnamic Exclusion in Data Dependent mode. Repeat was set to 1. In order to increase the number of scans, the measurement was performed in a so-called double play mode without the Zoom Scan mode.
  • the protein was automatically identified using SonarMSMS (Genomic solution) and NCBInr database. At this time, a part of the program was modified so that leucine labeled with a stable isotope (increase of molecular weight 6 per leucine []) could be searched for NCBInr.
  • SonarMSMS was also used to find the search results, searching for a pair of peaks and automatically calculating the peak intensity ratio.
  • identification of the protein and calculation of the peak intensity ratio were performed.
  • proteins that are present in the sample and identified by mass spectrometry and are not present in the internal standard, which is a metabolically labeled biomolecule their peptides are identified.
  • of a mouse lacking the ADAM22 gene was calculated by comparing the peak intensity ratio obtained above.
  • FIG. 19 and FIG. 22 show the results of protein identification obtained in Example 5 according to the present invention.
  • a plurality of biomolecules for example, protein phosphatase 2a, myotrophin, heat shock protein 1, protein phosphatase PP2A, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, ADP-ribosylation factor, cofilin, tubulin-beta, etc.
  • Figs. 23 to 26 show the results of the ratio of the waveform area derived from the unique protein, which has been subjected to the waveform separation processing according to the present invention based on the above-mentioned protein identification results.
  • proteome analysis will be described using a protein containing leucine as an example. From the results of mass spectrometry of the protein derived from protein phosphatase 2a shown in Fig. 19, we focused on the peak derived from the protein containing unlabeled leucine with m / z value of 644.7 (Fig. L). It should be noted that the fact that this peak is derived from leucine has also revealed the aforementioned MS / MS processing power. That is, in the above description, steps S200 to S203 shown in FIG. 10 have already been performed.
  • FIG. 23 is a diagram showing a time, that is, a mass spectrometry spectrum at a specific continuous scan number. From the results shown in Fig. 23, it can be seen from the fluctuation of the peak height that the m / z value of 644.7 reaches the maximum in scan 2 and then attenuates.
  • Fig. 24 shows a mask mouth matogram obtained as a result of connecting the scan numbers shown in Fig. 23 by the required number continuously. Specifically, Fig. 24 shows a mask port created by connecting mass spectrometric spectra up to scan number 975-1005 with the center at 644.7 (m / z value: 644.2—645.2). 3 shows a mattogram.
  • the isotope-labeled leucine has a higher molecular weight by 6 / z than the unlabeled protein.
  • z is the charge of the protein.
  • M / z value of mass spectrometry spectrum derived from isotope-labeled leucine 2a Power: 644.7 + 6/3 646.7, focusing on the peak of mass spectrometry spectrum and extracting the actually measured mass spectrometry power (Step 205 in Fig. 10).
  • the mass spectrometry spectrum derived from the protein containing isotope-labeled leucine is indicated by H.
  • Fig. 25 shows a mask mouth matogram obtained as a result of connecting the scan numbers shown in Fig. 23 by a necessary number continuously. Specifically, Fig. 24 shows the mass spectroscopy spectra up to scan number 975-1005, with the center at 646.7 (m / z value: 646.2—647.2). Fig. 4 shows a mask mouth matogram created by the above method.
  • the waveform separation processing of the mass spectrometry spectra obtained in FIGS. 24 and 25 is performed in step S206 in FIG.
  • the procedure was as follows. That is, the waveform separation processing was executed by the curve fitting method by combining the Gaussian function and the Lorentz function.
  • FIG. 26 shows the result of the waveform separation processing according to the present invention.
  • A in FIG. 26 shows the results of the waveform separation processing of the mass chromatogram represented by L of protein phosphatase 2a derived from the wild-type mouse brain (Wild) shown in FIG. 19, whereas
  • the measured L and H mask mouth matograms were each found to be a superposition of the mask mouth matograms derived from five unique proteins.
  • the area of each waveform can be calculated by integration.
  • the area of each of the waveforms 6 to 10 after the waveform separation can be calculated by integration (step S207 in FIG. 10).
  • the analysis result with the above explanatory power can be saved in the recording unit 100 shown in Fig. 9.
  • the waveform area is expressed in cells. It is possible to quantitatively track the change over time of a specific protein whose amino acid sequence has been identified, based on the ratio to the protein containing an isotope-labeled amino acid.
  • FIG. 27 is a diagram showing the results obtained by the analysis method of the present invention.
  • Figure 27 shows peak intensities from wild-type mouse brain (Wild) and ADAM22 gene-deficient mouse brain (K / 0) versus peaks from an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule.
  • Wild wild-type mouse brain
  • ADAM22 gene-deficient mouse brain K / 0
  • Hsp60 ELISA Kit Stressgen, EKS-600. Attach a cell containing an internal standard is metabolically isotope labeled biomolecule obtained in Example 1 PBS (Sigma Co., D-8537) and washed with cell 3.75Xl0 7 pieces of the Hsp60 ELISA Kit The resultant was dissolved in 3 mL of the prepared lysis solution, and the centrifuged supernatant was used as a soluble fraction.
  • the quantification operation was performed according to the instructions of the Hsp60 ELISA Kit.
  • the HSP60 concentration in the soluble fraction was determined to be 480 ng / mL. Therefore, the 3.75Xl0 7 or cells containing an internal standard is metabolically isotope-labeled biomolecules issued calculated that there is HSP60 in 1440Ng.
  • HSP60 in the brain of a wild-type mouse was quantified.
  • CMDH used as a standard was prepared as follows.
  • the human cMDH gene was cloned and a FLAG tag was inserted into the N-terminal of the gene, and the resulting fragment was inserted into a baculovirus vector.
  • the baculovirus having the vector was infected into S19 cells and cultured.
  • the cultured cells were collected by centrifugation, the precipitate was frozen at ⁇ 80 ° C., re-thawed, and suspended in 25 mL of PBS to extract cMDH. After the extraction, the insoluble fraction was removed by centrifugation, and the supernatant was used as a crude extract.
  • Reaction buffer 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) -0.15 M NaCl 0.98 mL Oxa-mouth acetic acid (Wako Pure Chemical, Lot.SEH1972) 10 mM aqueous solution O.OlmL
  • NADH (Sigma, Lot.l02K701) lOmM aqueous solution O.OlmL
  • the cMDH concentration in the wild-type mouse brain was quantified as follows.
  • the amount of protein in the soluble fraction is 6.2 mg / mL (Example 1).
  • the peak intensity ratio between cMDH derived from wild-type mouse brain and cMDH derived from an internal standard that is a metabolically labeled biomolecule in the measurement by mass spectrometry was about 2.0.
  • HFSVEGQLEFR heat shock protein 90- beta
  • HLIPAANTGESK 14-3-3 epsilon
  • SYELPDGQVITIGNER mutant beta- actin (beta and actnv
  • ELEAELEDER Myosin heavy chain, nonmuscle type B. 2 pmol of each of these synthetic peptides was added to the soluble fraction. 3 mL of a mixed solution of a soluble fraction (990 ng / mL) and a synthetic peptide (91 nmol / mL) was measured by LC / MSMS (QSTAR PULSAR i made by applied clay). The measurement conditions are as follows. [0209] ⁇ LC conditions>
  • HTS-PAL CTC Analytica
  • Mass spectrometry conditions ESI interface: For nanoelectrospray (protana)
  • MSMS scan Up to four MS scans, 85-1400 amu, 1.5 seconds each, Measurement time: 110 minutes
  • MS / MS spectra were searched using a database search engine.
  • Protein Peptide Ratiodabe unlabel ProteinCfmoi / uL) MW (kD) ng / u Wt% heat shock 70kDa protein 8 isoforrr SQIHDIVLVGGSTR 1.36 123.64 70.97 8.77 0.88 heat shock protein 90-beta HFSVEGQLEFR 1.65 150.00 83.42 12.51 1.26
  • Example 4 the peak intensity ratio between the protein derived from the wild-type mouse brain and the protein derived from the internal standard substance, which is a metabolically labeled biomolecule, is determined. And a biomolecule that is metabolically isotopically labeled with the wild-type mouse brain The cells containing the internal standard were mixed and measured so that the protein amounts would be the same (Example 4). The amount of protein per lg of mouse brain is 39.4 mg (Example 2). Therefore, the absolute amount contained in mouse brain lg could be calculated as shown in Table 4.
  • FIG. 28 is a diagram showing an array after waveform separation focused on in one embodiment of the present invention and quantitative values of the array. Specifically, in this embodiment, (1)
  • the mass spectrometry spectrum of the protein itself is not actually measured. However, assuming that the mass spectrometry spectrum of the protein itself has been measured, it can provide information that suggests a link between the quantitative value of the protein and its biological function.
  • LC system auto sampler, pump, UV detector, fraction collector, controller
  • LClOAvp manufactured by Shimadzu Corporation
  • MSMS scan Up to 4 times per MS scan, 85-1400 amu, 1.5 seconds each, Measurement time: 110 minutes
  • the output was output to Mascot (Matrix Science, London).
  • the SwissProt protein database http: @ kr.expasy.org / sprot /) was used as the protein database. Quantification was performed using the peak intensity ratio on the mass spectrometry spectrum. Metabolically isotope-labeled biomolecules in the soluble fraction are easily labeled with leucine at 13 Cx6 stable isotopes, and thus the peak derived from the added synthetic peptide and the mass spectrum. Can be distinguished.
  • Example 4 wild-type and ADAM22 knockout mouse brain-derived
  • the cells containing the internal standard, which is a biomolecule that is metabolically labeled with the mouse brain, are mixed and measured to have the same amount of protein, and the weight mixing ratio is known. (Example 4). Therefore, the absolute amount contained in lmg of mouse brain could be calculated as shown in Table 8. Therefore, it was revealed that the absolute quantification can be performed in the measurement by MS by using the cells containing the internal standard substance which is a metabolically labeled isotope-labeled biomolecule.
  • one or more biomolecules in a sample such as a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, or a protein complex, including a sample that cannot be metabolically labeled, can be accurately quantified. It has become possible.
  • the conventional in vivo labeling method could only be performed on a limited number of cells that were not affected by culture conditions, but in the present invention, a biomolecule labeled metabolically isotope was used.
  • a biomolecule labeled metabolically isotope was used.
  • tissues including samples that cannot be metabolically labeled, which are limited to cells that can be cultured. It has become possible to quantify one or more biomolecules in samples such as biological fluids, cells, cell organs, and protein complexes.
  • the present invention facilitated comparison between three or more samples. That is, the conventional quantitative proteome analysis method directly compares the internal standard substance with the analyte, and thus it is necessary to prepare a sample each time the measurement is performed. Furthermore, if the measurement target changes, the internal standard substance to be labeled also changes, so it is necessary to examine the conditions for labeling each time.Also, it was difficult to compare between experiments, but in the present invention, metabolic By storing cells containing an internal standard that is an isotope-labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule, and using it as appropriate, data comparison between experiments, For example, it is possible to obtain and analyze comparative data after a certain period of time (for example, one month, one year, etc.) for certain experimental data.
  • a certain period of time for example, one month, one year, etc.
  • the concentration of a biomolecule in a cell containing an internal standard substance that is a biomolecule that is metabolically labeled in advance or an internal standard substance that is a biomolecule labeled with a metabolic isotope is determined.
  • absolute quantification of biomolecules became possible.
  • By transferring or lending cells containing metabolically isotopically labeled biomolecules or internal standards that are metabolically isotope-labeled biomolecules data between researchers can be obtained. Sharing is possible.
  • a mass spectrometry spectrum derived from a unique biomolecule can be obtained, and the expression amount of a biomolecule that changes every moment in cells in a living body can be quantitatively determined. Can be analyzed in Furthermore, the program according to the present invention allows the computer to implement the analysis method.
  • the peptides that can be quantified include not only peptides having the same sequence as the synthetic peptide, but also other peptides derived from the protein constituted by the peptide. Therefore, since a single protein is quantified by multiple peptides, accurate and highly reproducible quantitative values can be obtained without errors in the measurement results of individual peptides greatly affecting the quantitative values of proteins. It became possible.
  • the peptide synthesizer uses a 10-fold excess of reagents, and the force and the scale of synthesis are on the order of milligrams. Therefore, the synthesis of the isotope-labeled peptide is extremely expensive, and it is difficult to comprehensively quantify by a conventional method in terms of cost. On the other hand, in the method of the present invention, since the isotope labeling of the biomolecule is performed by cell culture, even a very small amount can be efficiently produced.
  • synthetic peptides for quantifying biomolecules in cells containing an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule or an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule are: Since isotope is not required and can be handled by ordinary peptide synthesis, it is suitable as a comprehensive quantification method.
  • FIG. 1 shows a quantification method according to the prior art.
  • FIG. 2 shows a quantitative method according to the present invention.
  • FIG. 3 shows a schematic overall scheme of a method for quantitatively analyzing biomolecules according to the present invention.
  • FIG. 4 shows a scheme of one embodiment of measurement sample preparation using an isotope label according to the present invention.
  • FIG. 5 shows a scheme of an analysis method according to the present invention after mass spectrometry.
  • FIG. 6 shows a mass spectrometry spectrum obtained by a typical mass spectrometer.
  • V shows an example of the spectrum.
  • [8] A waveform spectrum obtained by separating the spectrum shown in FIG. 7 by the waveform separation processing used in the present invention.
  • FIG. 10 is a flowchart conceptually showing a program for executing the analysis method according to the present invention.
  • FIG. 11 is a functional block diagram showing a detailed configuration of a control unit used in the present invention.
  • FIG. 12 shows a process chart of a program for executing the method in the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 shows a process chart for executing a method of adding function information based on the result of a mask mouth matogram of a peptide after waveform separation according to the present invention.
  • Figure 15 shows the results of mass spectrometry analysis of peptides without waveform separation.
  • FIG. 16 shows mass spectrometry spectra of cMDH derived from wild-type mouse brain and derived from an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule.
  • [17] Shows the dose dependence of the ratio of mass spectrometry spectra of [17] cMDH from wild-type mouse brain and from an internal standard that is a metabolically isotope-labeled biomolecule.
  • FIG. 3 shows mass spectrometry spectra from brain (K / 0) (L) and from an internal standard substance (H) which is a metabolically labeled biomolecule.
  • FIG. 20 Wild-type protein phosphatase PP2A and heat shock protein 1 Mass spectrometry spectra of mouse brain (Wild) (L) and metabolically labeled biomolecule derived internal standard (H), ADAM22 gene-deficient mouse brain (K / 0) and metabolic Shows a mass spectrometry spectrum of (H) derived from an internal standard substance, which is a biomolecule labeled with isotope.
  • FIG.22 Mass spectrometry spectra of cofilin and tubulin-beta derived from wild-type mouse brain (Wild) (L) and metabolically-labeled biomolecules derived from an internal standard (H)
  • the figure shows mass spectrometry spectra derived from the brain of an ADAM22 gene-deficient mouse (K / 0) and from an internal standard substance (H) which is a metabolically isotope-labeled biomolecule.
  • FIG. 23 is a diagram showing a mass spectrometry spectrum at time, that is, at specific consecutive scan numbers.
  • L in the figure indicates a peak derived from a protein containing leucine which is not isotopically labeled.
  • FIG. 24 is a diagram showing a mask mouth mattogram at scan numbers 975-1005 at m / z values with a width of 644.2 to 645.2, where the center is 644.7.
  • FIG. 25 is a diagram showing a mask mouth mattogram at scan numbers 975-1005 at m / z values with a width of 646.2 to 647.2, with the center at 646.7. H in the figure indicates a peak derived from a protein containing isotope-labeled leucine.
  • FIG. 26 shows the result of the waveform separation processing according to the present invention.
  • (A) in FIG. 26 shows the result of the waveform separation processing of the mask mouth matogram indicated by L shown in FIG. 19, while (B) in FIG. 26 shows the result by H shown in FIG. 27] shows the results of the waveform separation processing of the mask mouth matogram.
  • the brain derived from the wild-type mouse (Wild) and the ADAM22 gene-deficient mouse brain correspond to the peak derived from the internal standard, which is a metabolically isotope-labeled biomolecule.
  • FIG. 28 is a diagram showing an array after waveform separation focused on in one embodiment of the present invention and quantitative values of the array.
  • FIG. 29 is a diagram showing a list of GiNos of proteins identified for each sequence as a result of performing a pattern search using HomoSapiens in the NCBInr database in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 30 is a diagram showing an example of the result of analyzing mass spectrometry data after waveform separation using a database in the present invention.

Abstract

　【課題】本発明の課題は、組織、生体液、細胞、細胞器官又はタンパク質複合体など、サンプル中の１若しくは複数の生体分子を精度よく定量すること、さらには、絶対定量することにある。 　【解決手段】代謝的に同位体標識された生体分子を内部標準物質として添加し、質量分析計で測定することにより、サンプル中の１若しくは複数の標的分子を精度よく定量することが可能となった。また、質量分析の解析に際し、波形分離処理を実行することで、質量分析の高精度な定量的解析法を提供する。  

Description

明 細 書
同位体標識化内部標準物質を用いる定量方法、該定量方法を実行する 解析システムおよび該解析のためのプログラム
技術分野
[0001] 本発明は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、サンプルに 添加し、質量分析計で測定することにより、サンプル中の 1又は複数の生体分子を定 量する方法に関する。
[0002] さらに、本発明は生体分子の定量的解析方法に係り、より詳細には、本発明は、同 位体標識ィ匕生体分子を利用した解析方法および該解析のためのプログラムに関す る。
背景技術
[0003] ゲノムとは、その生物の全ての遺伝子と遺伝子間領域を含む、一つの細胞に含ま れる全 DNAのことであり、我々が知る生命はゲノムによって決められている。現在、既 にヒトの塩基配列が読み終わり、遺伝子の数も予測されつつある。しかし、生命現象 を解明するためには、塩基配列情報だけでは不充分であり、実際に大腸菌、酵母、 線虫、ショウジヨウバエなど全ゲノムが明らかになった力 これらモデル生物の全ての 遺伝子機能が明らかになつたわけではない。
[0004] プロテオミクスはポスト'ゲノム時代の重要な項目の一つであるが、この技術が遺伝 子の機能解析を行う上で注目を集めつつある。現在のプロテオーム技術、つまり質 量分析装置とデータベース、そしてそれらを結ぶ検索エンジンによってタンパク質同 定が飛躍的に容易になったことによって、特定のタンパク質混合物（例えば、あるタン ノ^質複合体)を網羅的に同定できるようになった (たとえば、非特許文献 1-4参照） 。し力しながら、タンパク質を同定するだけでは、あるいは構成成分を明らかにするだ けでは、機能解析としては不十分である。なぜなら、プロテオームは動的なものであり 、その時々あるいは場所によって発現状態が変化している。よって個々のタンパク質 の変動解析を行ってこそ、プロテオミタスの利点が活力される答である。そこで、 DNA チップにおける Differential Displayと同様に、プロテオームにおいてもタンパク質レ ベルでの Differential Displayを作製し、個々のタンパク質レベルの変化を捉える種 々の試みが行われて 、る。
[0005] プロテオーム解析の手段として二次元電気泳動が汎用されている力 このようなゲ ル上で染色されたタンパク質のスポットを比べる方法では、比較すべき二つの試料に 存在する個々のタンパク質の存在量を正確に比較することは極めて難しい。なぜなら
1 ;細胞からの抽出の再現性や細胞分画'粗精製など前処理操作による再現性 2；二次元電気泳動などタンパク質の分離における再現性
3 ;ゲル染色の再現性
などに課題があり、さらに
4；一つのスポット'バンドに複数のタンパク質が混在して!/、る場合は個々のタンパク 質に対する定量性は失われる。
よって現状では、ゲル染色によるパターン比較では発現量が 10-100倍以上と劇的な 変化をする場合を除き、微小な変化を捉えることは難し 、。
[0006] また、このように劇的な変化を検知したとしても、ゲル上のスポットを比較するだけで は、そのスポットが対応するタンパク質が不明のままであり、ゲルから目的のスポットを 切り出し質量分析装置によってタンパク質の同定作業を行うことになる。
[0007] 質量分析装置による分析において、イオン化率の再現性が悪いため、定量的デー タを得るためには、必ず内部標準物質による補正が必要である。また、質量分析装 置で分析するまでの前処理操作 (抽出や誘導体化、分離など）により、実験ごとに定 量値を非常に変動させる。そこで、 目的の低分子物質又はタンパク質等を安定同位 体で標識した内部標準物質を、サンプルに予め添加することで、これらの全ての補正 が可能になり、定量精度が飛躍的に向上している。薬物、脂質およびタンパク質など において、安定同位体元素で標識した内部標準物質を用いて、定量分析が行われ ている（たとえば、非特許文献 5— 10参照)。
[0008] 上記の薬物や脂質のような低分子物質およびタンパク質の質量分析装置による定 量は、あくまでも目的とする物質が既知の場合に適用できる。一方、プロテオミタスで は未知かつ多数の目的物質を測定する必要がある。このため、近年、比較すべきサ ンプルに含まれるタンパク質全てを標識することにより、質量分析装置を使った定量 的プロテオームが可能になってきている。現在報告されている手法 (たとえば、非特 許文献 11参照)を大きく分けると、以下の 3通りに分類することが出来る（図 1参照)。
[0009] In vivo標識法
安定同位体と質量分析装置を組み合わせた定量的プロテオームとして、小田らの15 N で酵母のタンパク質を標識する方法がある (たとえば、特許文献 1および非特許文献 12 - 13参照)。比較する 2種類の細胞を、それぞれ同位体標識アミノ酸を含む培地と 同位体標識アミノ酸を含まない培地で培養し、培養された細胞を混合した後、タンパ ク質の抽出および分画をして、質量分析装置で分析し、同位体標識されたタンパク 質と同位体標識されてないタンパク質とのピーク強度を比較する。この方法では、分 祈における回収率の誤差があつたとしても、細胞間の相違を定量的に知ることができ 、また、スペクトルデータによりタンパク質の同定を同時に行うことが出来る。
[0010] しかしながら、この in vivo標識法は、培養細胞であるならば原理的に全ての細胞に 応用可能であるが、実際には培養条件を変えることで細胞の成長速度が大きく変わ るなど、安定同位体を含む培地での培養は困難なことが多い。つまり、培養条件に影 響を受けないような限られた細胞でしか実施できない。さらに、動物や人などの組織 は、容易に培養することができず、この方法によって測定することはできない。
[0011] 消化前の In vitro標識法
そこで、組織中のタンパク質を網羅的に定量する方法として、以下の方法が見出され た。すなわち、比較する 2種類のサンプルに対し、それぞれ同位体標識したシスティ ン残基反応試薬と同位体標識していないシスティン残基反応試薬を加えることにより サンプノレ中に含まれるタンパク質のシスティン残基を標識し、カラムによってタンパク 質を精製し、質量分析装置で分析し、ペアのピークの強度を比較することでタンパク 質定量が可能になった (たとえば、非特許文献 14-19参照)。しかしながら、この方 法では、システィン残基を含まないタンパク質は定量できず、また、精製など前処理 段階での実験ごとに定量値が変動することの補正はできない。
[0012] 消化後，消化中の in vitro標識法 システィン残基を含まな ヽタンパク質や精製の操作性を向上した方法カ^ヽくつか報 告されて!/、る。比較する 2種類のサンプルに含まれるタンパク質を酵素消化して得ら れたペプチド断片の C末、 N末、グルタミン酸残基、ァスパラギン酸残基などを、同位 体標識した分子と同位体標識して ヽな ヽ分子でそれぞれ標識し、質量分析装置で 分析し、ペアのピークの強度を比較することでタンパク質定量が可能になった (たとえ ば、非特許文献 20— 23参照)。
[0013] し力しながら、これらの方法では、サンプルに含まれるタンパク質の消化、分画、精 製など前処理段階での実験ごとに定量値が変動することの補正はできない。
[0014] 上述したように、現在の定量的プロテオーム解析法は、 in vivo標識法と in vitro標 識法に大別できる。前者は、標識が簡単であり、高い再現性データが期待できるが、 組織、生体液、細胞器官、タンパク質複合体、安定同位体を含む培地中で生育でき ない細胞などがサンプルの場合には、それらに含まれる安定同位体を取り込まない タンパク質には適応できない。後者は、あらゆるサンプルに応用できるが、標識する までのサンプルの破砕、抽出、消化、分画、精製など前処理段階での実験ごとに定 量値が変動することの補正はできない。また、標識反応自体が簡単でない場合が多 く実験者の経験の差が出やすい。
[0015] これまでの定量的プロテオーム解析法は、内部標準物質と被検体とを直接比較し ていたため、測定のたびにサンプル調製を行う必要があった。また、 3個以上のサン プルの比較を行うには単純ではなぐそれだけ精度も低下していた。さらに、測定対 象が変わると標識すべき内部標準物質も変わるため、その都度、標識についての条 件検討を行う必要があり、また、実験間の比較もできな力つた。
[0016] さらには、これまでの定量的プロテオーム解析法は、内部標準物質と被検体とを直 接比較しており、測定対象が変わると標識すべき内部標準物質も変える必要があつ た。一方、内部標準物質の生体分子を定量することは容易ではなぐしたがって、絶 対定量をすることが非常に困難であった。
[0017] これまで報告されて!、る定量的プロテオーム解析法のうち絶対定量する方法として は、 AQUA法がある（たとえば、特許文献 2参照)。これは、合成ペプチドの一部に安 定同位体を組込み、目的のタンパク質との比を求める方法である。しかし、この方法 では、実験ごとに常に同位体標識した合成ペプチドを用意し、さらに、実験毎に定量 する必要があるため、網羅的に定量するのは困難である。また、目的タンパク質の精 製過程における回収率の影響や、一般的に 30-50%と言われているゲル内消化効率 の影響も受け、正確に定量することは困難である。
[0018] 一方で、ポストゲノム時代をむかえて、生体内の生体分子として重要であるタンパク 質を分離同定し、さらに定量することが、ますます重要になってきている。特に、病気 の診断'治療技術の研究開発には、多数のタンパク質の機能を解明することが必要 である。
[0019] 従来、細胞が発現するタンパク質のプロテオーム解析には、二次元電気泳動が用 いられていた。ここで、用語「プロテオーム解析」とは、遺伝子情報と細胞内で複雑に 相互作用している多様なタンパク質との関係を明らかにする解析のこという（たとえば 、非特許文献 24参照)。つまり、プロテオーム解析は、細胞を構成するすべてのタン パク質を網羅的に解析する手法を ヽぅ。
[0020] 前述の二次元電気泳動では、発現したタンパク質をゲル展開し、対象とするタンパ ク質に対応したスポットの切り出しにより、その種類を総合的に同定することを可能に するものである。このため、二次元電気泳動はプロテオーム解析における有用な定 性的解析手段である。
[0021] しかし、展開されるタンパク質の量が僅少であり、分析時の回収率に誤差が生じ易 いことに起因して、二次元電気泳動ではタンパク質の定量的解析には不向きである ことが指摘されている。
[0022] 他方、もう一つの重要なタンパク質の解析技術として、質量分析法が利用されてい る。本方法は質量分析装置を用いたタンパク質やペプチドの正確な質量を分析する 方法である。この質量分析装置は、一般には、タンパク質及びペプチドをイオンィ匕す る装置と、その質量に応じて分離する質量分離部を備え、該質量を分析する質量分 析計とから構成されている。そして、質量分析計とタンパク質のデータベース、及びそ れらを結ぶ検索システムによって、今日ではタンパク質の同定は飛躍的に容易にな つたといえる。そのため、特定のタンパク群 (たとえば、ある複合体を形成するタンパク 群）を網羅的に同定することが可能である。 [0023] しかし、質量分析法によってタンパク質を同定する、あるいは構成成分を明らかに するだけでは、タンパク質の機能解析としては不十分である。なぜなら、プロテオーム による機能解析では、病態との比較や、薬物あるいはリガンドによる刺激、それに標 的遺伝子のノックアウトや過剰発現などの影響による個々のタンパク質の変動解析、 つまりは、タンパク質の発現量が比較可能である定量的データが必要になる。
[0024] 力かる背景のもと、質量分析装置を用いて、同位体標識を利用した定量的解析が 試みられて!/ヽる（たとえば、非特許文献 25参照)。
非特許文献 1：「ネィチャージエネテイクス（Nature Genetics)」第 20卷、 1998年 9月、 p. 46-50
非特許文献 2 :「ジャーナル'ォブ'セル'バイオロジー Oournal of Cell Biology)」第 14 1卷、第 4号、 1 年 5月 18日、 p. 967-977
非特許文献 3 :「カレント'オピニオン 'イン 'セル'バイオロジー（Current Opinion in Cell Biology)」第 15卷、第 2号、 2003年 4月、 p. 199—205
非特許文献 4 :「カレント'オピニオン 'イン 'ケミカル'バイオロジー（Current Opinion in Chemical Biology)」第 7巻、第 1号、 2003年 2月、 p. 21—27
非特許文献 5 :「サージエリー'トウディ (Surgery Today)」第 23卷、第 3号、 1993年、 p.
228-233
非特許文献 6 :「ラビッド 'コミュニケーションズ 'イン 'マス'スぺタトロメトリー (Rapid Communications in Mass Spectrometry) 第 8巻、第 5号、 1994年、 p. 377—380 非特許文献 7 :「ジャーナル'ォブ 'クロマトグラフィ一'エー Oournal of
Chromatography A)」第 694卷、第 1号、 1995年 5月、 p. 209—218
非特許文献 8 :「アナリティカル 'バイオケミストリー (Analytical Biochemistry)」第 231 卷、第 1号、 1995年 10月、 p. 141-150
非特許文献 9 :「ジャーナル'ォブ'クロマトグラフィ^ ~ ·ビー（Journal of
Chromatography B)」第 729卷、第 1—2号、 1999年 6月、 p. 147—155
非特許文献 10：「プロシーディンダス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン スィズ ·ォブ ·ザ'ユナイテッド ·ステイツ ·ォブ 'アメリカ（Proceedings of the National Academv of Sciences of the United States of America)」第 100卷、第 12号、 2003年 6月、 p. 6940-6945
非特許文献 11 :「カレント 'オピニオン'イン 'ケミカル'バイオロジー（Current Opinion in Chemical Biology)」第 7巻、第 1号、 2003年 2月、 p. 70—77
非特許文献 12：「プロシーディンダス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン スィズ ·ォブ ·ザ'ユナイテッド ·ステイツ ·ォブ 'アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)」第 96卷、第 12号、 1999年 6 月、 p. 6591-6596
非特許文献 13 :「メソッズ（Methods)」第 29卷、第 2号、 2003年 2月、 p. 124— 130 非特許文献 14 :「ネィチヤ一'バイオテクノロジー（Nature Biotechnology)」第 17卷、第 10号、 1999年 10月、 p. 994-999
非特許文献 15 :「アナリティカル 'ケミストリー (Analytical Chemistry)」第 70卷、第 24 号、 1998年 12月、 p. 5150-5158
非特許文献 16 :「ラビッド 'コミュニケーションズ 'イン 'マス'スぺタトロメトリー (Rapid Communications in Mass Spectrometry^第 16卷、第 15号、 2002年、 p. 1416—142 4
非特許文献 17：「ジャーナル ·ォブ ·ジ ·アメリカン'ソサエティ ·マス ·スぺタトロメトリー
(J Am Soc Mass Spectrum)」第 12卷、第 12号、 2001年 12月、 p. 1238—1246 非特許文献 18 :「ネィチヤ一'バイオテクノロジー（Nature Biotechnology)」第 19卷、第
10号、 2001年 10月、 p. 946-951
非特許文献 19 :「モレキユラ一'アンド'セルラ一'プロテオミクス（Molecular and Cellular Proteomics)j第 1卷、第 1号、 2002年 1月、 p. 19—29
非特許文献 20 :「アナリティカル 'ケミストリー (Analytical Chemistry)」第 73卷、第 13 号、 2001年 7月、 p. 2836-2842
非特許文献 21 :「ラビッド 'コミュニケーションズ 'イン 'マス'スぺタトロメトリー (Rapid Communications in Mass Spectrometry^第 15卷、第 14号、 2001年、 p. 1214—122 非特許文献 22 :「ネィチヤ一'バイオテクノロジー（Nature Biotechnology)」第 20卷、第 2号、 2002年 2月、 p. 163-170 非特許文献 23 :「ネィチヤ一'バイオテクノロジー（Nature Biotechnology)」第 20卷、第 5号、 2002年 5月、 p. 512-515
非特許文献 24 : Karn, P. Science 270, pp. 369-370, 1995
非特許文献 25：「プロテオーム解析法」羊土社 2000年 7月 10日発行 pp. 111-122 特許文献 1 : USP 6391649
特許文献 2 :WO2003 016861
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0025] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しょうとする課題 は、代謝的に標識することができないサンプル (例えば、組織、生体液、細胞、細胞 器官、タンパク質複合体など）中の 1又は複数の生体分子を精度よく定量すること、さ らには、絶対定量することにある。
[0026] また、同位体標識を利用した解析において、一つの質量分析スペクトルピークに対 して、複数の異なる生体分子力もの質量スペクトルが寄与している場合もあり、生体 分子の定量的解析を困難にしている。そこで、本発明は、質量分析スペクトルに対し て複数の異なる生体分子力 の質量分析スペクトルが寄与している場合であっても、 質量分析スペクトルの定量的解析を可能とする解析システムおよび解析方法を提供 することである。さらに、本発明では、力かる生体分子に関する定量的解析と機能情 報を付加させる、解析システムおよび解析方法を提供する。
[0027] さらにまた、前記定量的解析方法をコンピュータに実行させるプログラムを提供する ことである。
課題を解決するための手段
[0028] 本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、生体分子に対 する質量分析法において、あらかじめ同位体標識された生体分子を調製し、各サン プルに加えて質量分析装置で測定することにより、代謝的に標識することができない サンプル (例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官、タンパク質複合体など）中の 1又 は複数の生体分子を精度よく定量することを見出した。また、あらかじめ調製した同 位体標識された生体分子を定量しておくことにより、生体分子の網羅的な絶対定量 をも可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。また、生体分子の質量分 析法において、同位体標識法とともに、質量分析スペクトルに波形分離処理を施すこ とにより、より高精度な生体分子発現の定量的解析が可能であることを見出し、本発 明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第一の態様では、
[1] サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又 は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、加える ことを特徴とする質量分析計によるサンプル中の生体分子を定量する方法、
[2]サンプル中の 1又は複数の生体分子を定量する方法であって、
同位体標識された生体分子の前駆体を加えて培養し、代謝的に同位体標識された 生体分子である内部標準物質を、又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を、サンプルに添加する工程と、
当該各サンプルから生体分子を抽出し分画する工程と、
当該分画した各生体分子を質量分析装置により分析する工程と、
質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を定量 する工程と、
を含む、生体分子を定量する方法、
[3] 各サンプル間の該ピーク強度比を比較し、生体分子を相対定量する、前記 [1] または [2]のいずれか一に記載の方法、
[4] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の、又は代謝的 に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分子が既知 量である、前記 [1]な 、し [3]の 、ずれか一に記載の方法、
[5] 定量が絶対定量である、前記 [1]ないし [4]のいずれか一に記載の方法、
[6] サンプル中の 1または複数の生体分子を定量する方法であって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、また は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、添カロ する工程と、 (2)当該サンプル中の各生体分子を質量分析する工程と、
(3)質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
(4)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、
を含む、サンプル中の 1または複数の生体分子を定量する方法、
[7] サンプルから生体分子を抽出し分画する工程をさらに含む、前記 [6]に記載の 方法、
[8] 同位体標識された生体分子の前駆体を加えて培養し、生体分子を代謝的に 同位体標識する工程をさらに含む、前記 [6ほたは [7]に記載の方法、
[9] 複数のサンプルについて行い、各サンプル間の各生体分子のピーク強度比を 比較する工程をさらに含む、前記 [6]ないし [8]のいずれか一に記載の方法、
[10] サンプル中の 1または複数の生体分子を絶対定量する方法であって、 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の生体分子、または、 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分 子が、既知量である、 [6]ないし [9]のいずれか一に記載の方法、
[11] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の生体分子を、 または、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の 生体分子を、絶対定量する工程をさらに含む、前記 [6]ないし [10]のいずれか一に記 載の方法、
[12] 前記 [11]に記載の工程が、
(a)同位体非標識の合成ペプチドを、代謝的に同位体標識された生体分子である内 部標準物質、または、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を 含む細胞に添加する工程と、
(b)当該代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質または代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞力 生体分子を抽出し 分画する工程と、
(c)当該分画した各生体分子を質量分析する工程と、
(d)質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、 (e)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 絶対定量する工程と、
を含む、前記 [11]に記載の方法、
[13] サンプルが、代謝的に標識できないサンプルである、前記 [1]ないし [12]のい ずれか一に記載の方法、
[14] サンプルが、細胞培養によって標識できないサンプルである、前記 [1]ないし [ 13]の!、ずれか一に記載の方法、
[15] 生体分子がタンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群力も選択される 、ずれかの分子である、前記 [1]な 、し [14]の 、ずれか一 に記載の方法、
[16] 生体分子がタンパク質である、前記 [1]ないし [15]のいずれか一に記載の方 法、
[17] 生体分子がタンパク質であって、当該タンパク質を抽出し分画し、タンパク質 を消化する工程をさらに含む、前記 [1]ないし [16]のいずれか一に記載の方法、
[18] サンプルが、組織、生体液、細胞、細胞器官およびタンパク質複合体力ゝらな る群から選択される 、ずれかのサンプルである、前記 [1]な 、し [17]の!、ずれか一に 記載の方法、
[19] 同位体が、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pおよび34 S並びにこれらの組み合わせか らなる群力 選択されるいずれかの同位体である、前記 [1]ないし [18]のいずれか一 に記載の方法、
[20] 同位体が、 13Cである、前記 [1]ないし [19]のいずれか一に記載の方法、
[21] 前記 [1]ないし [20]のいずれか一に記載の方法に用いられる代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質、
[22] 前記 [1]ないし [20]のいずれか一に記載の方法に用いられる代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞、
[23] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含有する、前記 [1]な!、し [20]の!、ずれか一に記載の方法のための試薬、
[24] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を含 有する、前記 [1]ないし [20]のいずれか一に記載の方法のための試薬、
[25] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質の、 [1]ないし [20] のいずれか一に記載の方法のための使用、
[26] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞の、前 記 [1]な!、し [20]の!、ずれか一に記載の方法のための使用、
[27] 質量分析装置において得られた、サンプル中の 1または複数の生体分子の 質量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1又は複数の 生体分子の定量をさせるためのプログラムであって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は 、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加し、 当該各サンプル中の各生体分子を質量分析装置により分析し、質量分析装置から 分析結果を受ける工程と、
(2)質量分析の分析結果から当該生体分子を同定する工程と、
(3)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、を実行させるプログラム、
[28] 質量分析装置において得られた、サンプル中の 1または複数の生体分子の 質量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1又は複数の 生体分子の定量をさせるためのプログラムであって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は 、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加し、 当該各サンプルから生体分子を抽出し分画し、当該分画した各生体分子を質量分 析装置により分析し、質量分析装置から分析結果を受ける工程と、
(2)質量分析の分析結果から当該生体分子を同定する工程と、
(3)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、を実行させるプログラム、
[29] 複数のサンプルについて行い、各サンプル間の各生体分子のピーク強度比 を比較する工程をさらに実行させる、前記 [27]または [28]に記載のプログラム、
[30] サンプル中の 1又は複数の生体分子の絶対定量をするためのプログラムであ つて、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の、又は代謝的 に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分子が既知 量である、前記 [27]ないし [29]のいずれか一に記載のプログラム等を提供する。
[0030] また、本発明の第二の態様では、 [31] 第一の生体分子と、前記第一の生体分子 に対して同位体標識された第二の生体分子との質量分析に関するデータの解析シ ステムであって、前記第一および第二の生体分子の質量分析を実行する質量分析 装置と、前記質量分析装置から、前記生体分子の質量分析に関するデータを受ける データ入出部を有する制御部と、を備え、前記制御部は、生体分子の構成成分の配 列が決定された前記生体分子に対する第一の m/zの値と、生体分子の構成成分の 配列が決定された前記第二の生体分子に対する第二の m/zの値とを決定するととも に、前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子および前記第二の 生体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析ス ベクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質量分析装置にて得られた質量 分析に関するデータから抽出する処理部と、前記処理部から前記第一および第二の m/zの値における時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を受け、前 記時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する波形処 理部と、を備える解析システムを提供する。カゝかる構成によれば、固有の生体分子に 由来する質量分析スペクトルを入手でき、より定量的な解析を可能とする。
[0031] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]に記載の解析システムにおいて、 [32] 前 記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定された 前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同位体非標識 の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二の生 体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位体標 識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第 一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される。力かる構成によれ ば、同位体非標識と同位体標識の構成成分を含む生体分子の発現変化を、一方の 生体分子に着目しながら追跡可能となる。 [0032] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]または [32]に解析システムにおいて、 [33] 前記制御部は、前記波形分離処理部からの波形分離処理により得られた固有の生 体分子に由来する波形の面積を算出し、前記第一の m/zの値における固有の生体 分子に由来する第一の波形面積の値と、前記第二の m/zの値における固有の生体 分子に由来する第二の波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記第二の 波形面積)の比を算出する演算部を、さらに備える。力かる構成によれば、一方のタ ンパク質との対比により、タンパク質の発現の定量的解析が可能となる。
[0033] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [33]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [34] 前記制御部は、波形分離後、前記生体分子の構成成分の配 列毎に分類し、前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し、そ の照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループィ匕する情報付加部を、さ らに備える。力かる構成によれば、波形分離された生体分子の構成成分の配列と機 能情報とを関連付けることが可能となる。
[0034] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [34]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにいて、 [35] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列から生体分子を特 定し、生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、 生体分子の代表定量値とする演算部を、さらに備える。力かる構成によれば、生体分 子の構成成分の代表的な定量値を求めることができ、後述するデータベースとの照 合により機能情報との関連付けをすることができる。
[0035] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [35]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [36] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列を、生体分子の 機能情報を有するデータベースに照合し、当該生体分子の機能情報を取得する情 報付加部を、さら〖こ備える。カゝかる構成によれば、構成成分の代表的定量値と機能 情報との関連性に関する知見を得ることができる。
[0036] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [36]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [37] 前記第一および第二の生体分子の質量分析を実行する際、 内部標準物質の存在下で質量分析を実行し、前記波形処理部は、前記内部標準物 質の m/zの値における時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を受け て、前記内部標準物質に固有の波形を得るために、さらに波形分離処理を行い、前 記演算部は、前記波形処理部からの内部標準物質に固有の波形面積を算出すると ともに、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、およ び/または、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を 、さらに算出する。力かる構成によれば、内部標準物質中の生体分子が既知量であ る場合には、絶対定量が可能となる。
[0037] また、本発明の第三の態様では、 [38] 第一および第二の生体分子に対して、同 位体標識された生体分子である内部標準物質との質量分析に関するデータの解析 システムであって、前記第一および第二の生体分子並びに同位体標識された生体 分子の質量分析を実行する質量分析装置と、前記質量分析装置から、前記生体分 子の質量分析に関するデータを受けるデータ入出部を有する制御部と、を備え、前 記制御部は、生体分子の構成成分の配列が決定された前記生体分子に対する第一 および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記同位体標 識された生体分子に対する内部標準物質の m/zの値とを決定するとともに、前記第 一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二の生体分 子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルお よび時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質 量分析装置にて得られた質量分析に関するデータから抽出する処理部と、前記処理 部から前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値における時間に対する 質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を受け、前記時間に対する質量分析スぺタト ル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する波形処理部と、を備える解析システムを 提供する。力かる構成によれば、生体分子が同位体非標識であっても、同位体標識 された内部標準物質との比較において、その生体分子に固有の生体分子に由来す る質量分析スペクトルを入手でき、より定量的な解析を可能とする。
[0038] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]に記載の解析システムにおいて、 [39] 前 記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成成 分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/zの 値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前記 第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生体 分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が 決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記内 部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物質 の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値を決定することにより実行される。
[0039] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]または [39]に記載の解析システムにおいて 、 [40] 前記制御部は、前記波形分離処理部からの波形分離処理により得られた固 有の生体分子に由来する波形の面積を算出し、前記第一および第二の m/zの値に おける固有の生体分子に由来する第一および第二の波形面積の値と、前記内部標 準物質の m/zの値における固有の生体分子に由来する内部標準物質の波形面積 の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比 、および Zまたは、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積） の比を算出する演算部を、さらに備える。
[0040] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]ないし [40]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [41] 前記制御部は、波形分離後、前記生体分子の構成成分の配 列毎に分類し、前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し、そ の照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループィ匕する情報付加部を、さ らに備える。
[0041] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]ないし [41]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [42] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列から生体分子を 特定し、生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて 、生体分子の代表定量値とする演算部を、さらに備える。
[0042] 本発明の好ましい態様では、前記 [38]ないし [42]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [43] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列を、生体分子の 機能情報を有するデータベースに照合し、当該生体分子の機能情報を取得する情 報付加部を、さらに備える。
[0043] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [43]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [44] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 "0、 18 0、33Pおよび34 S並びにこれらの組み合わせ力 なる群力 選択されるいずれかの同 位体である。
[0044] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [44]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [45] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる
[0045] 本発明の好ましい態様では、前記 [45]に記載の解析システムにおいて、 [46] 前 記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関する データベースとの照合により、前記構成成分の配列の決定が行われる。
[0046] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [46]のうち何れか一に記載の解析シ ステムにおいて、 [47] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分 子である。
[0047] 本発明の好ましい態様では、前記 [31]ないし [47]のうち何れか一に記載の解析シ ステムであって、 [48] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びに これらの組み合わせ力 なる群力 選択されるいずれかの分子である。
[0048] また、本発明の第四の態様では、 [49] 第一の生体分子と、前記第一の生体分子 に対して同位体標識された第二の生体分子の質量分析に関するデータの解析方法 であって、質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータ のうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/ zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値を決定する工程と、前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体 分子および前記第二の生体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよび時 間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質量分析 に関するデータ力 抽出する工程と、前記第一及び第二の生体分子の時間に対す る質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する工程と、を含む、解析 方法、
[50] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が 決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体成分の同 位体非標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第二の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配 列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子 の同位体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ いて、前記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [49]に記載の解析方法、
[51] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面 積を算出する工程と、前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第 一の波形面積の値と、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の 波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記第二の波形面積)の比を算出 する工程と、をさらに備える、前記 [49]または [50]に記載の解析方法、
[52] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、前 記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照合 結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに含む、前 記 [49]な 、し [51]のうち何れか一に記載の解析方法、
[53] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに含む、前記 [49]ないし [52]のいずれか一に記載の解析方 法、
[54] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに含む、前記 [49] な!、し [53]の 、ずれか一に記載の解析方法、
[55] 前記第一および第二の生体分子とともに、内部標準物質の m/zの値の決定 する工程と、内部標準物質の時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム） を含むデータを抽出する工程と、前記内部標準物質の時間に対する質量分析スぺク トル (マスク口マトグラム）の波形分離処理する工程と、前記内部標準物質に固有の波 形の面積を算出する工程とを実行し、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質 に固有の波形面積)の比、および/または、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準 物質に固有の波形面積)の比を、算出する工程を、さらに含む、前記 [49]ないし [54] のうち何れか一に記載の解析方法、
[56] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内 部標準物質との質量分析に関するデータの解析方法であって、質量分析装置にて 測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生体分子の構成成分 の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/zの値 と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部 標準物質の m/zの値を決定する工程と、前記第一および第二並びに内部標準物質 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子並びに前記内部標準物質の生体 分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析スぺタト ル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質量分析に関するデータから抽出する 工程と、前記第一および第二並びに内部標準物質の生体分子の時間に対する質量 分析スペクトル (マスク口マトグラム)を波形分離処理する工程と、を含む、解析方法、
[57] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子 の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個 数と前記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の 配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、 前記内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標 準物質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の 第一および第二の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [56]に記載の解 析方法、
[58] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面 積を算出する工程と、前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に 由来する第一および第二の波形面積の値と、前記内部標準物質の m/zの値におけ る固有の生体分子に由来する内部標準物質の波形面積の値とから、（前記第一の波 形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第 二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を算出する工程と、を さらに備える、前記 [56]または [57]に記載の解析方法、
[59] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、前 記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照合 結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに含む、前 記 [56]ないし [58]のうち何れか一に記載の解析方法、
[60] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに含む、前記 [56]ないし [59]のいずれか一に記載の解析方 法、
[61] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに含む、前記 [56] な!、し [60]の 、ずれか一に記載の解析方法、
[62] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pおよび34 S 並びにこれらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、前 記 [49]な 、し [61]のうち何れか一に記載の解析方法、
[63] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [49]ない し [62]のうち何れか一に記載の解析方法、
[64] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分 子に関するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [6 3]に記載の解析方法、
[65] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、前記 [ 49]ないし [64]のうち何れか一に記載の解析方法、
[66] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合 わせ力もなる群力も選択されるいずれかの分子である、前記 [49]ないし [65]のうち何 れか一に記載の解析方法等を提供する。
さらに、本発明の第五の態様では、 [67] 質量分析装置において得られた、第一の 生体分子と、前記第一の生体分子に対して同位体標識された第二の生体分子の質 量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記データの解析をさせるためのプ ログラムであって、前記質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関 するデータのうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子 の第一の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分 子の第二の m/zの値を決定する工程と、前記第一および第二の m/zの値から、前記 第一の生体分子および前記第二の生体分子の m/zの値に対する質量分析スぺタト ルおよび時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前 記質量分析に関するデータから抽出する工程と、前記第一および第二の生体分子 の時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する工程と 、を実行させるプログラム、
[68] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が 決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同 位体非標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第二の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配 列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子 の同位体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ いて、前記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行させる、前記 [67]に記載のプログラム、
[69] 前記波形分離処理により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を 算出する工程と、前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一の 波形面積の値と、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波形 面積の値とから (前記第一の波形面積) I (前記第二の波形面積)の比を算出するェ 程と、をさらに実行させる、前記 [67]または [68]に記載のプログラム、
[70] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、前 記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照合 結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに実行させ る、前記 [67]ないし 69のうち何れか一に記載のプログラム、
[71] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに実行させる、前記 [67]ないし [70]のいずれか一に記載のプ ログラム、
[72] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに含む、前記 [67] な！、し [71]の!、ずれか一に記載のプログラム、
[73] 前記質量分析装置において、前記第一および第二の生体分子とともに、内 部標準物質の質量分析に関するデータを得て、前記質量分析に関するデータから、 前記内部標準物質の時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を抽出 するとともに、前記内部標準物質の時間に対する質量分析スペクトル (マスクロマトグ ラム)を波形分離処理し、前記波形分離処理により得られた内部標準物質に固有の 波形面積を算出し、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面 積)の比、および/または、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波 形面積）に比を算出する工程を、さらに実行させる、前記 [67]ないし [72]のうち何れ か一に記載のプログラム、
[74] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内 部標準物質との質量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記データの解 析をさせるためのプログラムであって、質量分析装置にて測定された前記生体分子 の質量分析に関するデータのうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記 第一および第二の生体分子の第一および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分 の配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値を 決定する工程と、前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記 第一および第二の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対 する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析スペクトル (マスク口マトグラム) を含むデータを、前記質量分析に関するデータから抽出する工程と、前記第一およ び第二並びに内部標準物質の生体分子の時間に対する質量分析スペクトル (マスク 口マトグラム)を波形分離処理する工程と、を実行するプログラム、
[75] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子 の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個 数と前記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の 配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、 前記内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標 準物質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の 第一および第二の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [74]に記載のプロ グラム。
[76] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面 積を算出する工程と、前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に 由来する第一および第二の波形面積の値と、前記内部標準物質の m/zの値におけ る固有の生体分子に由来する内部標準物質の波形面積の値とから、（前記第一の波 形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第 二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を算出する工程と、を さらに実行させる、前記 [74]または [75]に記載のプログラム、
[77] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、前 記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照合 結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに実行させ る、前記 [74]ないし [76]のうち何れか一に記載のプログラム、
[78] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに実行させる、前記 [74]ないし [77]のいずれか一に記載のプ ログラム、
[79] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに含む、前記 [74] な！、し [78]の!、ずれか一に記載のプログラム、
[80] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pよび34 S並 びにこれらの組み合わせ力もなる群力 選択される 、ずれかの同位体である、前記 [
69]ないし [90]のうち何れか一に記載のプログラム、
[81] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [69]ない し [80]のうち何れか一に記載のプログラム、
[82] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分 子に関するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [8 1]に記載のプログラム、
[83] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、前記 [ 67]ないし [82]のうち何れか一に記載のプログラム、
[84] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合 わせ力もなる群力も選択されるいずれかの分子である、前記 [67]ないし [83]のうち何 れかーに記載のプログラム等を提供する。
さらに、本発明の第六の態様では、 [85] 第一および第二の生体分子に対して、同 位体標識された生体分子である内部標準物質の質量分析に関するデータの解析方 法であって、質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデー タのうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分 子の第一および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記 内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、得られた 配列データをもとに、生体分子の機能情報を有するデータベースに照合して、当該 生体分子の機能情報を取得する工程とを含む解析方法、
[86] 前記決定工程の後、前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値 から、前記第一および第二の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/z の値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析スペクトル (マスク口 マトグラム)を、前記質量分析に関するデータから抽出する工程と、さらに含む前記 [8 5]に記載の解析方法と、
[87] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子 の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個 数と前記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の 配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、 前記内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標 準物質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の 第一および第二の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [85]または [86]に 記載の解析方法、
[88] 前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一 および第二のピークの値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分 子に由来する内部標準物質のピークの値とから、（前記第一のピーク)/ (前記内部標 準物質に固有のピーク)の比、および/または、（前記第二のピーク)/ (前記内部標準 物質に固有のピーク）の比を算出する工程とをさらに備える、前記 [85]なしひ [87]の うち何れか一に記載の解析方法、
[89] 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに含む、前記 [85]ないし [88]のうち何れか一に記載の解析方法、
[90] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を構 成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定量 値とする工程と、をさらに含む、前記 [85]ないし [89]のいずれか一に記載の解析方 法、
[91] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pおよび34 S 並びにこれらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、前 記 [85]な 、し [90]の 、ずれか一に記載の解析方法、
[92] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [85]ない し [91]のうち何れか一に記載の解析方法、
[93] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分 子に関するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [9 2]に記載の解析方法、
[94] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、前記 [ 85]ないし [93]のうち何れか一に記載の解析方法、
[95] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖もしくは核酸またはこれらの組み合 わせである、前記 [85]ないし [94]のうち何れか一に記載の解析方法、および、
[96] 質量分析装置において得られた、第一および第二の生体分子と、当該第一 および第二の生体分子に対して同位体標識された生体分子である内部標準物質と の質量分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記データの解析をするための プログラムであって、質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関す るデータのうち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生 体分子の第一および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された 前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、得ら れた配列データをもとに、生体分子の機能情報を有するデータベースに照合して、 当該生体分子の機能情報を取得する工程と、を実行させるプログラム、
[97] 前記決定工程の後、前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの 値から、前記第一および第二の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m /zの値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対する質量分析スペクトル (マスク 口マトグラム)を、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程と、をさらに実行さ せる前記 [96]に記載のプログラム、
[98] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子 の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二 の m/zの値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個 数と前記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の 配列が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、 前記内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標 準物質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の 第一および第二の m/zの値を決定することにより実行される、前記 [96]または [97]に 記載のプログラム、
[99] 前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一 および第二のピークの値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分 子に由来する内部標準物質のピークの値とから、（前記第一のピーク) / (前記内部標 準物質に固有のピーク)の比、および Zまたは、（前記第二のピーク)/ (前記内部標準 物質に固有のピーク)の比を算出する工程と、をさらに実行させる、前記 [96]ないし [ 98]のうち何れか一に記載のプログラム、
[100] 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループィヒする工程と をさらに実行させる、前記 [96]ないし [99]のうち何れか一に記載のプログラム、
[101] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を 構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定 量値とする工程と、をさらに実行させる、前記 [96]ないし [100]の何れか一に記載の プログラム、
[102] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pおよび 34S並びにこれらの組み合わせ力 なる群力 選択される 、ずれかの同位体である、 前記 [96]ないし [101]のうち何れか一に記載のプログラム、
[103] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [96]な いし [102]のうち何れか一に記載のプログラム、
[104] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られた生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [103]に 記載のプログラム、
[105] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、前記 [96]ないし [104]のうち何れか一に記載のプログラム、
[106] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み 合わせであるからなる群力も選択される 、ずれかの分子である、前記 [96]な 、し [10 5]のうち何れか一に記載のプログラム等を提供する。
さらに、本発明の第七の態様では、 [107] 質量分析装置において得られた、サン プル中の 1または複数の生体分子の質量分析に関するデータを受けるコンピュータ に、前記サンプル中の 1または複数の生体分子の定量をさせるためのプログラムであ つて、質量分析装置にて測定された生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値と、 生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値 を決定する工程と、前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子およ び前記第二の生体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよび時間に対す る質量分析スペクトル (マスク口マトグラム）を含むデータを、前記質量分析に関する データから抽出する工程と、前記第一および第二の生体分子の時間に対する質量 分析スペクトル (マスク口マトグラム）を波形分離処理する工程と、を実行させるプログ ラム、
[108] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が 決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同 位体非標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第二の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配 列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子 の同位体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ いて、前記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行させる、前記 [107]に記載のプログラム、
[109] 前記波形分離処理により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積 を算出する工程と、前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一 の波形面積の値と、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波 形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記第二の波形面積)の比を算出す る工程と、をさらに実行させる、前記 [107]または [108]に記載のプログラム、
[110] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、 前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、前記照 合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、をさらに実行さ せる、前記 [107]ないし [109]のうち何れか一に記載のプログラム、
[111] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、生体分子を 構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定 量値とする工程と、をさらに実行させる前記 [107]ないし [110]の何れか一に記載の プログラム、
[112] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベース に照合して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、をさらに実行させる、前記 [107]な!、し [111]の何れか一に記載のプログラム、
[113] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 170、 180、 33Pよび34 S 並びにこれらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、前 記 [107]ないし [112]のうち何れか一に記載のプログラム、
[114] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、前記 [107]な いし [113]のうち何れか一に記載のプログラム、
[115] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体 分子に関するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、前記 [
112]に記載のプログラム、
[116] 前記生体分子は、経時的にサンプルから分離された生体分子である、前記 [107]ないし [115]のうち何れか一に記載のプログラム、
[117] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み 合わせ力もなる群力も選択される 、ずれかの分子である、前記 [107]な 、し [116]のう ち何れか一に記載のプログラム等を提供する。
発明の効果
[0052] 本発明により、代謝的に標識することができないサンプル (例えば、組織、生体液、 細胞、細胞器官、タンパク質複合体など）中の 1若しくは複数の生体分子を精度よく 定量することが可能となった。
[0053] すなわち、従来の in vivo標識法では、培養条件に影響を受けないような限られた 細胞でしか実施できなかったが、本発明では、代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 を含む細胞をサンプルに加えるため、培養できる細胞に限られることなぐ代謝的に 標識することができないサンプル (例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官、タンパク 質複合体など）中の 1若しくは複数の生体分子を定量することが可能となった。 [0054] また、従来の in vitro標識法では、サンプルの破砕、抽出、消ィ匕、分画、精製など 前処理段階での実験ごとに定量値が変動することの補正はできな力つたが、本発明 では、サンプルの破砕、抽出、消化、分画、精製などを行う前に代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子で ある内部標準物質を含む細胞を加えるため、サンプル中の 1若しくは複数の生体分 子を精度よく定量することが可能となった。
[0055] 本発明により、 3個以上のサンプル間の比較が容易になった。すなわち、これまで の定量的プロテオーム解析法は、内部標準物質と被検体とを直接比較して 、たため 、測定のたびにサンプル調製を行う必要があった。さらに、測定対象が変わると標識 すべき内部標準物質も変わるため、その都度、標識についての条件検討を行う必要 があり、また、実験間の比較もできな力つたが、本発明では、代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を保存し、適宜、用いることにより、実験間のデータ比較、 例えばある実験データに対し、一定期間経過後（例えば、 1ヶ月後、 1年後等）に比較 データを得て解析することが可能となる。さらには、使用した代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を譲渡又は貸し渡しすることにより、今まで不可能であった 研究者間のデータ比較が可能となる。
[0056] 本発明により、あらかじめ代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の 生体分子の濃度を算出しておくことにより、生体分子の絶対定量が可能となった。代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質を含む細胞を、譲渡又は貸し渡しすることにより、 研究者間のデータ共有ィ匕が可能となる。また、 1度代謝的に同位体標識された生体 分子である内部標準物質もしくは代謝的に同位体標識された生体分子である内部 標準物質を含む細胞中の生体分子の絶対量を求めておけば、実験ごとに定量する 必要がなぐその後各種実験に応用できる。
[0057] さらにまた、本発明による解析装置および解析方法によれば、固有の生体分子に 由来する質量分析スペクトルを得ることができ、生体内の細胞で時々刻々変化する 生体分子の発現量を定量的に解析することが可能となる。また、本発明によるプログ ラムにより、前記解析方法を、コンピュータに実現させることができる。くわえて、かか る定量的解析結果を、 NCBInr等のデータベースと照合することにより、定量的解析 結果に機能情報を付加させることもできる。
[0058] 従来の方法 (AQUA法)では、サンプルに対して、合成ペプチドを添加するため、分 画、抽出、精製、消化 (特にゲル内消ィ匕）の過程におけるタンパク質の回収率の低さ により、精度のよい定量値が得られな力つた。一方、本発明の方法では、サンプルに 対して、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質または代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加するため、分画、 抽出、精製、消化 (特にゲル内消化)の過程におけるタンパク質の回収率の影響を受 けず、精度よく再現性の高い定量値を得ることが可能となった。
[0059] また、従来の方法では、サンプルに対して、合成ペプチドを添加するため、定量で きるペプチドは、合成ペプチドと同一の配列を有するペプチドのみである。そのため 、当該ペプチドの測定結果の誤差により、タンパク質の定量値が大きく影響を受ける こととなる。一方、本発明の方法では、代謝的に同位体標識された生体分子である内 部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞中の生体分子を定量しておき、サンプルに対して、当該代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子であ る内部標準物質を含む細胞を添加するため、定量できるペプチドは、合成ペプチドと 同一の配列を有するペプチドのみならず、当該ペプチドが構成して 、たタンパク質 由来のその他のペプチドについても定量することができる。そのため、一つのタンパ ク質に対し、複数のペプチドによって定量するため、個々のペプチドの測定結果の 誤差により、タンパク質の定量値が大きく影響を受けることがなぐ精度よく再現性の 高い定量値を得ることが可能となった。
[0060] さら〖こは、ペプチド合成機は、 10倍過剰量の試薬を用い、し力も合成スケールがマ イクログラム力もミリグラム単位となる。そのため、同位体標識されたペプチドの合成は 、非常に高価となり、従来の方法で網羅的な定量することはコストの面で難しい。一 方、本発明の方法では、生体分子の同位体標識は、細胞培養によって行うので、ごく 微量でも効率がよく生成することができる。また、代謝的に同位体標識された生体分 子である内部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質を含む細胞中の生体分子を定量するための合成ペプチドは、同位体を必要とし な 、通常のペプチド合成で対応できるので、網羅的な定量方法として適して 、る。 発明を実施するための最良の形態
[0061] 以下に本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。以下 の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ 限定する趣旨ではない。本発明はその要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実 施することができる。なお、本明細書において引用した文献、公開公報、特許公報そ の他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
[0062] 本発明において用いる用語「サンプル」とは、生体分子を含む測定対象物を示し、 好ましくは、組織、生体液、細胞、細胞器官又はタンパク質複合体を指す。組織とし ては、例えば、脳、脳の各部位 (例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、 視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、脾臓、腎臓、肝臓、生殖腺、 甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、十二指腸、小腸、大腸、血管、心臓、 胸腺、脾臓、顎下腺、耳下腺、舌下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、 骨、関節、骨格筋などがあげられる。生体液としては、例えば、血液 (血漿、血清を含 む）、尿、糞、唾液、涙液、浸潤液 (腹水、組織液を含む)などがあげられる。細胞とし ては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、脾臓 j8細胞、骨髄細胞、メ サンギゥム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平 滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例えば、マクロフ ァージ、 T細胞、 B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好酸球、好塩基 球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞 、間質細胞もしくはこれらの前駆細胞、幹細胞、癌細胞などがあげられる。細胞器官 としては、例えば、核、細胞小器官 (核小体、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、リソソーム 、リボソーム、ペルォキシノーム、小胞体 (粗面小胞体、滑面小胞体、筋小胞体など） 、ゴルジ体、微小管、中心体、ァクチンフィラメントなど）、サイトゾル、シナプス、基底 膜、細胞間接着装置などがあげられる。タンパク質複合体とは、二以上のタンパク質 が物理的に結合している状態のものをいう。ここにあげたものは具体例であって、これ らに限定されるものではない。
[0063] 本発明において用いる用語「生体分子」とは、タンパク質、脂質、糖鎖又は核酸若 しくはこれらの組み合わせを指し、好ましくはタンパク質である。また、生体分子には、 生理的な修飾を受けているもの（例えば、リン酸ィ匕タンパク質等)も含まれることは言う までもない。
[0064] 本発明において用いる用語「タンパク質」とは、 2以上のアミノ酸がペプチド結合に よって結合したペプチドを含む。
[0065] 本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識された生体分子」とは、同位体 標識された当該生体分子の前駆体を加えることにより、代謝的に標識された生体分 子を指す。上記「代謝的に」とは、酵素反応などを介した生理的条件を示し、好ましく は培養細胞における代謝反応である。
[0066] 本発明において用いる用語「前駆体」とは、生体分子の構成成分になりうる分子を 指す。前駆体は、生体分子がタンパク質の場合には、好ましくはアミノ酸、より好ましく は必須アミノ酸、例えば、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチォニン、リジン、フ ェニルァラニン、パリン、スレオニン、特に好ましくはロイシンであり、生体分子が脂質 の場合には、例えばスフインゴ脂質であればセリンが好ましぐ糖の場合には、ダルコ ースが好ましぐ核酸の場合には、ァスパラギン酸、グルタミン、グリシン力もプリンヌク レオチドが生合成されるためこれらが好ましいが、これらに限定されるものではない。 つまり、前駆体は、生体分子に取り込まれるものであれば、その種類は限定されない
[0067] 本発明において用いる用語「内部標準物質」とは、質量分析装置にて測定物質を 定量するときに、主として実験ごとに定量値が変動することを補正するため、サンプル 中に一定量をカ卩えられる物質を 、う。
[0068] 本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質」とは、代謝的に同位体標識された生体分子を 1又は複数含んだ内部標準物質 をいう。 [0069] 本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質を含む細胞」とは、代謝的に同位体標識された生体分子を 1又は複数含んだ内 部標準物質を含む細胞を 、う。
[0070] 本発明において用いる用語「定量」とは、絶対定量及び相対定量を広く含むもので ある。本発明にお 、て用いる用語「絶対定量」とは測定結果を量又は濃度として得る ことを目的とする定量方法であり、「相対定量」とは絶対定量以外の定量方法を指す
[0071] 本発明において用いる用語「代謝的に標識できないサンプル」とは、代謝的に標識 できるサンプル以外のサンプルを指す。代謝的に標識できるサンプルとは、培養する ことによる同位体標識された当該生体分子の前駆体の影響を受けることなく代謝的 に標識できるサンプルをいう。「代謝的に標識できないサンプル」には、たとえば、培 養することによる同位体標識された当該生体分子の前駆体の影響を受けつつ代謝 的に標識できるサンプル及び生体への投与、組織培養、その他の方法により標識で きるサンプルが含まれるものとする。
[0072] 本発明にお 、て用いる用語「細胞培養によって標識できな 、サンプル」とは、細胞 を培養することができないサンプルを指す。つまり、細胞培養をできず、生体への投 与、組織培養、その他の細胞培養以外の方法により標識できるサンプルは、「細胞培 養によって標識できないサンプル」に含まれるものとする。例えば、組織、生体液、細 胞器官又はタンパク質複合体があげられる。
[0073] (本発明の第一の実施態様）
本発明は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質、代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞、および前記内部標準 物質を含有する試薬と前記内部標準物質を含む細胞を含有する試薬等を提供する
[0074] 以下では、特に、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質および 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞の作製方法を 記載する。
[0075] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞は、測定対 象となるサンプルと同じ種の、好ましくは同じ組織由来の、特に好ましくは同位体を含 む培地中で生育が容易な細胞であるが、これに限定されるものではない。選択され た細胞を、同位体標識された当該生体分子の前駆体としての構成成分を含む培地 で培養することによって、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 を含む細胞を作製することができる。培養条件はどのようなものであってもよぐ液体 培地あるいは固体培地に該生細胞を培養するのに好適な条件を選択すればょ ヽ。 例えば、動物細胞を選択した場合には、 DMEM、 MEM, RPMI1640、 IMDM等の培地 を用い、必要に応じゥシ胎児血清 (FCS)等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリン 又はストレプトマイシンなどを添カ卩することができ、 pH約 6— 8、 30— 40°Cにおいて 15 一 200時間前後の培養を行うことができる。その他必要に応じ途中で培地の交換を行 つたり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
[0076] 同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、安定同位体を用いることが好 ましい。安定同位体には、好ましくは2 H、 13C、 15N、 170、 180、 33P又は34 S若しくはこれら の組み合わせ、特に好ましくは13 Cを用いる力 これに限定されるものではない。つま り、本発明の同位体は、細胞に取り込まれ、生体分子を標識しうるものであれば、そ の種類は限定されない。具体例としては、同位体標識された生体分子の前駆体とし て、 13 C標識（13C X 6個）ロイシン（Cambridge Isotope Labs (CIL)社製、 L- Leucine U-13C6, CLM-2262)が挙げられる。
[0077] 上述のようにして得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質を含む細胞は、そのまま用いることができるが、破砕しておくことも可能である。破 砕する方法は、ダウンス型テフロン Κ·ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング'プレンダ 一、ポッター型ガラス'ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液 (例えば、 PIERCE社の M- PER: cat no. 78501, T- PER: cat no. 78510など）を用いる方法 又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法である。必要に応 じて、タンパク質を定量しておくことができる。このようにして、代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質を作製することができる。これらの代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分 子である内部標準物質を含む細胞は、適当な条件、好ましくは 20°C以下、特に好 ましくは- 80°C以下で保存することができる。
[0078] 本発明は、サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 又は当該生体分子である内部標準物質を含む細胞を加えることを特徴とする質量分 析計によるサンプル中の生体分子の定量方法を提供する。
[0079] この定量方法は、サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を 加える工程と、各サンプルから生体分子を抽出、分画等する工程と、質量分析装置 で測定する工程と、質量分析装置で得られた結果力 各生体分子の標識ピークと非 標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を定量する工程とからなる。
[0080] また、本発明に係るプログラムは、後述するように、本発明による定量または解析方 法の各工程をコンピュータ上で実行させる。本発明に係るプログラムは、 CD— ROM 、磁気ディスク、半導体メモリなどの各種記録媒体を通じてコンピュータにインスト一 ルまたはダウンロードすることが可能である。
[0081] 以下に、詳細について記載する。
<質量分析による測定サンプルの調製方法 >
各サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞、好ましくは一定量 の代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体 標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を加える。
[0082] 続いて、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を加えたサンプルを破 砕し、生体分子、好ましくはタンパク質を抽出後、分画することができる。これを分画 したサンプルとする。破砕'抽出する方法は、ダウンス型テフロン κ·ホモジナイザー、 ポリトロン、ワーリング.プレンダー、ポッター型ガラス.ホモジナイザー、超音波破砕装 置、細胞溶解液（例えばピアス社の Μ- PER: cat no. 78501, T- PER: cat no. 78510など）を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくはダウンス型テフロン R •ホモジナイザー、ポッター型ガラス ·ホモジナイザーを用いる方法である。分画する 方法は、分画遠心法やショ糖密度勾配遠心法などがあげられ、好ましくはショ糖密度 勾配遠心法である。
[0083] 次に、必要に応じて、分画したサンプルを精製することができる。これを精製したサ ンプルとする。精製する方法は、群特異的ァフィユティーカラム精製、カチオン交換ク 口マトグラフィー、ァ-オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する 方法、免疫沈降法、硫安沈殿法、有機溶媒による沈殿法、限外ろ過法、ゲルろ過法 、透析法などがあげられ、好ましくは群特異的ァフィユティーカラム精製である。破砕 •抽出、分画、精製の各操作は、これらに限定されるものではなぐ当業者における技 術常識により、適当なものを選択し、また、組み合わせればよい。
[0084] その後、必要に応じて、精製したサンプルを分離および消化を行うことができる。こ れを分離したサンプルおよび消化したサンプルとする。分離方法は、二次元電気泳 動、 SDS PAGE,各種クロマトグラフィー（例えば、ァフィ-ティークロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、ァ-オン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフ ィーなど)等が考えられるが、これに限定されるものではなぐ適当なものを選択すれ ばよい。消化方法には、酵素消化、化学分解等があげられ、好ましくは酵素消化であ る力 これに限定されるものではなぐ適当なものを選択すればよい。酵素消化に用 いる酵素としては、トリプシン、キモトリブシン、 Lys-C, Asp-N, Glu-Cなどがあげら れ、好ましくはトリプシンである。
[0085] こうして得られた分画したサンプル、精製したサンプル、分離したサンプル又は消化 したサンプルは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)により分離することができる。こ れを HPLCにより分離されたサンプルとする。 HPLCに用いるカラムは、当業者におけ る技術常識により、適当なものを選択すればよぐ好ましくはァニオン交換カラム又は カチオン交換カラムである。 HPLCの諸条件 (流速、検出器、移動相など）は、当業者 における技術常識により、適宜選択できる。
[0086] <質量分析装置による測定サンプルの測定方法 >
次に、上記の操作により得られた測定サンプル (分画したサンプル、精製したサンプ ル、分離したサンプル、消化したサンプル又は HPLCにより分離されたサンプルを意 味する)を質量分析装置で測定する。質量分析装置は、ガスクロマトグラフと結合され た質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススぺタトロメトリー (GC/MS)や液体 クロマトグラフと結合された装置である液体クロマトグラフィーマススぺタトロメトリー（ LC/MS)等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析装置におけるイオンィ匕 方法は、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、 MALDI (マトリックス支援レーザー 脱離イオン化法）、 ESI (エレクトロスプレーイオンィ匕法）、 EI (電子イオン化法）、 CI (ィ匕 学イオン化法)、 APCI (大気圧化学イオン化法)、 FAB (高速原子衝撃法)、 LD、 FD、 SIMS, TSP等があげられ、好ましくは MALDI又は ESIである。アナライザ一は、各装置 に応じて適宜選択できる。例えば、 TOF (飛行時間型）、イオントラップ、二重収束型 、四重極型、フーリエ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析の 装置及び方法は、ここにあげたものに限定されるものではなぐ当業者において質量 分析に通常使用されるものを適宜選択すればよい。
[0087] <生体分子の同定方法 >
質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、生体分子、好ましくはタンパク 質を同定することができる。得られたデータを市販のソフトフェア、例えば、
SonarMSMS (Genomic solution社）およびデータベース、例えば、
NCBInr(hhtp：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)、 IPI、 Sport等のデータベースを使用すること により解析し、サンプル中のタンパク質の自動同定が可能である。質量分析による測 定データを用いて、タンパク質を同定することは当業者にとって容易である（Nat Genet. 1998: 20, 46-50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977; J Cell Biol. 2000: 148, 635-651; Nature. 2002: 415, 141-147; Nature. 2002: 415, 180-183; Curr Opin Cell Biol. 2003: 15, 199-205; Curr Opin Cell Biol. 2003: 7, 2ト 27)。
[0088] <生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて比較する方法 > 本発明において、「生体分子の標識ピーク」とは、質量分析の測定結果から得られる m/zの値に対する質量分析スペクトル (以下、単に「質量分析スペクトル」という。）お よび/または時間に対する質量分析スペクトル (以下、「マスク口マトグラム」と称する場 合がある）において、代謝的に同位体標識された生体分子に由来するシグナル強度 又はその総和（通常面積で表されることは当業者であれば理解できる）をいう（以下、 単に標識ピークと称する場合がある)。 [0089] 本発明にお 、て、「生体分子の非標識ピーク」とは、質量分析スペクトルおよび/ま たはマスク口マトグラムにぉ 、て、代謝的に同位体標識されて 、な 、生体分子に由 来するシグナル強度又はその総和をいう（以下、単に非標識ピークと称する場合があ る)。
[0090] 質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、各生体分子について、代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来の標識ピークとサンプル 由来の非標識ピークの強度比を求めて、サンプル間で該ピーク強度比の値を比較す ることにより、サンプル間の生体分子を相対定量することができる。代謝的に同位体 標識された生体分子は、サンプル由来の生体分子に比べ、同位体標識されている 分子量の分、分子量が大きくなり質量分析においてペアのピークとして観測される ( 図 2参照)。同位体標識されている生体分子の分子量は、同定されたタンパク質、脂 質、糖鎖又は核酸配列力 計算によって求めることができる。
[0091] より具体的には、例えば、サンプル Aおよびサンプル Bに含まれる生体分子量を比 較する場合、サンプル Aにおける各生体分子の非標識ピークを該生体分子に対応 する内部標準物質の標識ピークで除することによって、該生体分子における非標識 ピーク/標識ピーク (ピーク強度比 A)を求める。一方、サンプル Bにおける各生体分 子の非標識ピークを該生体分子に対応する内部標準物質の標識ピークで除すること によって、該生体分子における非標識ピーク/標識ピーク (ピーク強度比 B)を求める 。次に、ピーク強度比 Aとピーク強度比 Bとを比較することで、サンプル Aおよびサン プル Bにおける生体分子を相対的に定量することができる。
[0092] なお、サンプル中では存在して ヽて、代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含 む細胞には存在していない生体分子 (例えば、タンパク質等）力 S存在することがある。 この場合には、質量分析装置で測定した際に、近傍の内部標準物質由来のピーク、 好ましくは LC/MSならクロマトグラフィーでの溶出時間が近いピーク、 MALD卜 MSなら 分子量が近 、ピークを対象としてピーク強度比を求めて、サンプル間で該ピーク強 度比を比較することによって定量することができる。したがって、サンプル中のすべて の生体分子 (例えば、タンパク質)を測定することが可能である。 [0093] より具体的には、サンプル Aおよびサンプル Bにおける生体分子 Xを比較する場合 、内部標準物質に生体分子 Xが存在せず、近傍に生体分子 Yが存在することがある 。ここで、近傍とは、内部標準物質由来のピークで、かつ、 LC/MSならクロマトグラフィ 一での溶出時間が近いピーク、 MALDト MSなら分子量が近いピークである。この場 合には、サンプル Aにおける生体分子 Xの非標識ピークを生体分子 Yに対応する内 部標準物質の標識ピークで除することによって、生体分子 Xにおける非標識ピーク/ 生体分子 Yにおける標識ピーク（ピーク強度比 C)を求める。一方、サンプル Bにおけ る生体分子 Xの非標識ピークを生体分子 Yに対応する内部標準物質の標識ピークで 除することによって、生体分子 Xにおける非標識ピーク/生体分子 Yにおける標識ピ ーク（ピーク強度比 D)を求める。次に、ピーク強度比 Cとピーク強度比 Dとを比較する ことで、サンプル Aおよびサンプル Bにおける生体分子を相対的に定量することがで きる。近傍の生体分子を複数選択することによって、測定の精度を上げることができ る。
[0094] 本発明によって、質量分析に用いた 1又は複数の生体分子、好ましくはタンパク質 の絶対定量が可能となる。また、これに伴い、 1又は複数の生体分子が既知量である 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質及び 1又は複数の生体分 子が既知量である代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞が提供される。
[0095] つまり、既知量の各々の生体分子標品、好ましくはタンパク質標品を使って、代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識され た生体分子である内部標準物質を含む細胞に存在する生体分子量、好ましくはタン ノ ク質の絶対量を求めておくことで、目的のサンプルに含まれる生体分子、好ましく はタンパク質の絶対定量が可能である。したがって、これまでの定量的プロテオーム 解析ではできな力つた絶対定量が可能となる。このようにして同位体標識された生体 分子の絶対量を求めておけば、その後、各種実験に当該同位体標識された生体分 子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質を含む細胞を使用できるため、実験ごとに定量を行うことを余儀なくされていた従 来の方法に比べて非常に有用である。 [0096] 以下に、詳細について記載する。
<代謝的に同位体標識された生体分子である、内部標準物質に含まれる生体分子 の定量方法 >
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質を含む細胞に存在する生体分子の絶対量は 、既知量の生体分子標品を用いて質量分析装置で測定することにより絶対量を求め ることがでさる。
[0097] より具体的には、例えば、化学合成した既知量の生体分子を、代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子で ある内部標準物質を含む細胞に添加し、必要に応じて、上述の方法により、破砕、抽 出、分画、精製を行う。次に、質量分析装置で測定し、化学合成した生体分子由来 のピークと標識ピークとを比較することにより、代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 を含む細胞に存在する当該生体分子の絶対量が求められる。
[0098] 生体分子がタンパク質である場合には、上記の方法に加え、 SDS-PAGE、 EIA、
ELISA、 RIA、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーにより測定できる。これらは例示 であり、これに限定されるものではなぐ当業者にとって最適と考えられる方法を用い ることがでさる。
[0099] より具体的には、一定量の代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、適 当な条件下、好ましくは上述の測定サンプルの調製方法と同じ条件下で破砕し、タン パク質を抽出する。この抽出液中の目的のタンパク質を SDS-PAGE、 EIA、 ELISA、 RIA、ウェスタンプロットなどの方法で測定することにより、代謝的に同位体標識された 生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部 標準物質を含む細胞に存在する当該生体分子の絶対量が求められる。
[0100] また、生体分子が酵素などの活性を有するものであれば、その生体分子固有の比 活性 (タンパク質量あたりの活性の強さ）が求められている。物質固有の比活性は、 報告されている活性を用いてもよぐ測定して求めてもよい。したがって、前述の抽出 液中のタンパク質の持つ活性を測定することにより、代謝的に同位体標識された生 体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質を含む細胞に存在する当該生体分子の絶対量が求められる。
[0101] なお、本発明において定量の対象は、タンパク質に限ったものではなぐ細胞が培 地の栄養分を使って作り出す全ての物質、例えば、脂質、糖鎖又は核酸などに対し て定量および同定を目的とした分析に応用可能である。
[0102] なお、生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて比較する方法、お よび代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質に含まれる生体分子 の定量方法を実行するための、本発明に係るプログラムについて後述する。
[0103] (本発明の第二の実施態様）
図 3は、本発明の第二の実施態様による生体分子の一例としてのタンパク質の定量 的解析方法の概略的な全体スキームを示す。図 3に示すように、まず、測定サンプル 調製を行い、その後、質量分析装置を用いて質量分析を行う。次いで、本発明による 定量的解析方法を実行する。
[0104] 図 3の工程 S 11に示す測定サンプル調製には、サンプルを同位体標識する工程と 、各サンプル力も生体分子を抽出、分画等する工程とからなる。サンプルを同位体標 識する方法には、同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養する方法、 in vitroに おいて化学的または酵素的に同位体標識する方法などがある。
[0105] 同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養する方法は、同位体標識されたァミノ 酸を含まな 、環境で育成および/または培養された同位体非標識細胞に、同位体標 識アミノ酸の添加により生合成されるタンパク質が、同位体標識アミノ酸を代謝的に 取り込み、同位体標識アミノ酸を有する同位体標識タンパク質を作出する工程を含 む。
[0106] 同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養する方法は、培養条件はどのようなも のであってもよぐ液体培地あるいは固体培地に、該細胞を培養するのに好適な条 件を設定すればよい。たとえば、前述の本発明の第一の態様にて説明した方法に準 じて行うことができ、動物細胞を選択した場合には、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDM等の培地を用い、必要に応じて、ゥシ胎児血清 (FCS)等の血清、アミノ酸、グ ルコース、ペニシリン又はストレプトマイシンなどを添カ卩することができ、 pH約 6— 8、 3 0— 40°Cにおいて、 15— 200時間前後の培養を行う。その他、必要に応じて、培地 を途中で交換したり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。このようにして得られ た同位体標識されたタンパク質を含む細胞は、そのまま用いることもできるが、破砕し て利用することも可能である。破砕する方法は、ダウンス型テフロン 'ホモジナイザー 、ポリトロン、ワーリング'プレンダー、ポッター型ガラス'ホモジナイザー、超音波破砕 装置、細胞溶解液（たとえば、ピアス社の M- PER : cat no. 78501, T- PER: cat no.78510など）を用いる方法又は凍結融解法が挙げられ、好ましくは細胞溶解液を 用いる方法である。
[0107] また、本発明の第二の実施態様において、同位体標識されたタンパク質は、 in vitroにおいても調製することができる。たとえば、タンパク質中のシスティン残基を同 位体標識されたアルキルィ匕試薬を用いてアルキルィ匕することにより、同位体標識する ことができる（「ラビッド.コミュケーシヨンズ.イン.マス.スぺクトノレメトリー（Rapid し ommunications in Mass spectroscopy)」第 lb卷、第丄 5 、 2002年、
pp.1416-1424参照)。さらに、タンパク質中のシスティン残基を同位体標識されたビ ォチンィ匕試薬を用いてピオチン化することにより、同位体標識することもできる。これ を、さらに、アビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可 能である（「ネィチヤ一'バイオテクノロジー（Nature Biotechnology)」第 17卷、第 10 号、 1999年 10月、 pp.994- 999)。
[0108] さらにまた、タンパク質を消化して得られたペプチド断片の C末、 N末、グルタミン酸 残基、ァスパラギン酸残基などを同位体標識した分子で標識することができる。具体 的には、タンパク質を酵素で消化する際に、緩衝液中に 180で標識された水を加える 。消化酵素としては、キモトリブシン、トリプシン、 Asp-N、 Lys-C、 Glu-Cを用いること ができる。キモトリブシン、 Asp-Nを用いたときには、加水分解後のペプチドの C末側 に180がーつ、トリプシン、 Lys- C、 Glu- Cを用いたときには、加水分解後のペプチドの C末のカルボン酸の酸素原子が二つとも180になることが知られている。
[0109] くわえて、タンパク質を消化して得られたペプチド断片の C末、グルタミン酸残基、ァ スパラギン酸残基のカルボン酸をメチルエステルにする方法が知られており（ Goodlett DR, Keller A, Watts JD, Newitt R, Yi EC, Purvine S, Eng JK, von Haller P, Aebersold, Koller E. Differential stable isotope labeling of peptides for quantitation and de nove sequence derivation. Rapid Commun mass Spectrom. 2001: 15, pp.1214- 1221参照）、同位体標識されたメタノールを用 いてメチルイ匕することにより、同位体標識することも可能である。
[0110] また、タンパク質を消化して得られるペプチド断片の N末をニコチン酸誘導体化する 方法 (Munchbach M, Quadroni M, iotto u, James P. Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotropic N— terminal labeling of peptides with a fragmentation-directing moiety. Anal. Chem. 2000:72, pp.4047- 4057参照）や、ァセチル化する方法（Ji. J. Chakraborty A, Geng M, Zhang X, Amini A, Bina M, Regnier F. Strategy for quantitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides. J
Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2000:745, pp.197- 210参照）が知られている。 そのため、これらの同位体標識された試薬を用いることにより、同位体標識することも できる。
[0111] なお、同位体標識されたタンパク質または同位体標識されたタンパク質を含む細胞 は、適当な条件、好ましくは 20°C以下、特に好ましくは 80°C以下で保存すること ができる。そして、このようにして得られた同位体標識されたタンパク質は、後述する 解析において内部標準物質としても用いることができる。
[0112] 本発明で用いる同位体標識アミノ酸は、放射性同位体を適用することもできるが、 放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安 定同位体には、以下に限定されるものではないが、 2H、 13C、 15N、 "0、 180、 33P若しく は34 S又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは13 Cである。本発明に利用され る同位体は、細胞に取り込まれ、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は 特に限定されない。具体的には、同位体標識タンパク質の前駆体として、 13c標識 (13 Cx6個）ロイシン（Cambridge Isotope Labs(CIL)社製、 L- Leucine U- 13C6, CLM-2262)を挙げることができる。
[0113] 図 4は、本発明による同位体標識を利用する測定サンプル調製について、本発明 の第二の態様の一つの態様のスキームを示す。測定対象のサンプルのうち、一方を 同位体標識されたタンパク質を含むサンプル 1、他方を同位体標識されていないタン パク質を含むサンプル 2を準備する。そして、サンプル 1およびサンプル 2を混合する
[0114] 次いで、混合後のサンプルを破砕し、タンパク質を抽出する。そして、必要に応じて 、前述のサンプルを精製することができる。精製方法は、群特異的ァフィユティーカラ ム精製、カチオン交換クロマトグラフィー、ァ-オン交換クロマトグラフィー、逆相クロ マトグラフィーを利用する方法、免疫沈澱法、硫安沈殿法、有機溶媒により沈殿法、 限界ろ過法、透析法などが挙げられる。
[0115] その後、さらに必要に応じて、各種分離や消化を行うことができる。分離方法には、 以下に限定されるものではないが、二次元電気泳動、 SDA PAGE,各種クロマトダラ フィー（たとえば、ァフィ-ティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ァ-オン 交換フロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど)等が考えられる。消化 方法には、以下に限定されるものではないが、酵素消化、化学分解等が挙げられる。 酵素消化に用いる酵素としては、たとえば、トリプシン、キモトリブシン、 Lys-C、 Asp-N 、 Glu-C等が挙げられる。
[0116] このようにして得られたサンプル生成物をそのまま測定することもできる力 HPLCに より分離することもできる。 HPLCに用いるカラムには、以下に限定されるものではない 1S ァ-オン交換カラム又はカチオン交換カラム等が挙げられる。 HPLCの諸条件（ 流速、検出器、移動相）は、当業者には容易に理解され、適宜選択できる。
[0117] 前述のように調製されたサンプルを、図 3に示す工程 S 12にて質量分析を行う。こ の質量分析は、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトダラ フィーマススぺタトロメトリー (GC/MS)や液体クロマトグラフと結合された質量分析装 置である液体クロマトグラフィーマススぺタトロメトリー (LC/MS)等の汎用の装置を利 用することができる。質量分析におけるイオンィ匕方法は、前述の本発明の第一の態 様で説明したように、各装置に応じて適宜選択できる。たとえば、 MALDU ESI、 EI、 CI 、 APCI、 FAB、 LD、 FD、 SIMS, TSP等が挙げられる。アナライザーには、各装置に応 じて適宜選択できる。たとえば、 TOF、イオントラップ、二重収束型、四重極型、フーリ ェ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。
[0118] 質量分析による測定の結果力も得られたデータを用いて、タンパク質を同定するこ とができる。得られたデータを市販のソフトウェア、たとえば、 SonarMSMS(Genomic solution社)及びデータベース、たとえば、 NCBInr(hhtp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、 IPI、 Sport等のデータベースを使用することによりタンパク質の自動同定が可能である 。質量分析による測定データを用いて、タンパク質を同定することは、当業者には容 易に理解できる（たとえば、 Nat Genet. 1998:20, 45-50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977; J Cell Biol. 200: 148, 635—651; Nature, 2002: 415,
141-147; Nature. 2002: 415, 180-183; Curr Opin Cell Biol. 2003: 15, 199-205; Curr Opin Cell Biol. 2003: 7, 21-27)。
[0119] 本発明に係る解析方法では、概略的には、質量分析による測定の結果から得られ たデータを用いて、各タンパク質についての内部標準物質となる同位体標識タンパク 質由来ピークと、サンプル中のタンパク質由来ピークの強度比や、より詳細には、固 有のタンパク質に由来する波形分離したマスク口マトグラムを求めて、サンプル間でこ れらのピーク強度比の値や、波形面積を比較することにより、図 3の工程 S13に示す サンプル中のタンパク質の定量的解析を可能とする。たとえば、本発明による第一の 実施態様で説明したように、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を加 える工程と、各サンプルから生体分子を抽出、分画等する工程を、図 3に示す工程 S 13にて行う。次いで、前記生体分子を質量分析装置で測定する（図 3の工程 S12参 照)。その後、図 3の工程 S13に示す定量的解析にて、前記質量分析装置で得られ た結果を取得し、各生体分子の標識ピークと非標識ピークとを選択した上で各ピーク の強度比を求めて、当該生体分子を定量するができる。
[0120] 図 5は、質量分析装置における質量分析後に、本発明に係る定量的解析方法のス キームを示す。図 5に示すように、本発明による定量的解析方法は、被解析対象の質 量分析スペクトルの MS/MS処理によるアミノ酸配列の決定（工程 S111)、前記質量 分析スペクトル (第一の m/z)の決定工程 (工程 S 112)、前記アミノ酸配列が決定さ れたタンパク質の第一の m/zの値から、前記タンパク質に対して同位体標識された 同位体標識タンパク質の第二の m/zの値の算出（工程 S113)、前記第一及び第二 の m/zの値における時間に対する質量分析スペクトル（以下、「マスク口マトグラム」と 称する場合もあある。）の抽出（工程 S114)、前記第一及び第二の m/zの値に対応 する各タンパク質のマスク口マトグラムに対する波形分離（工程 S115)、前記波形分 離処理により得られた固有のタンパク質由来による波形面積の算出（工程 S116)、 前記第一の m/zに対応する第一の波形面積の値と、前記第二の m/zに対応する第 二の波形面積の値とから、（前記第二の波形面積) I (前記第一の波形面積)の比の 算出（工程 S117)を、含む。以下、各工程を詳述することにより、本発明に係る定量 的解析方法を説明する。
[0121] なお、前記解析方法は、同位体非標識タンパク質の質量分析スペクトルから、対応 する同位体標識されたタンパク質の質量分析スペクトルを求める方法に基づいて説 明したが、先に、解析対象として同位体標識タンパク質の質量分析スぺ外ルを決定 した後で、対応する同位体非標識タンパク質の質量分析スペクトルを求める方法でも 、本発明に係る解析方法は実施可能であることは、当業者には容易に理解できる。
[0122] 図 6は、典型的な質量分析装置にて得られるスペクトルを示す。得られるスペクトル の種類には、任意の時間軸点から、 m/zに対する強度軸を示すスペクトル (m/zに対 する質量分析スペクトル)や、検出された全イオン量を、各時間に対する強度で示す スペクトル（時間に対する質量分析スペクトル (以下、「マスク口マトグラム」と称する場 合もある。）がある。
[0123] 図 5に示す工程 S111では、 MS/MS処理力 得られた質量分析スペクトルにより、ァ ミノ酸配列を決定する（工程 S 111)。その後、解析対象とするタンパク質の第一の m/ zの値を定める（工程 SI 12)。
[0124] 前述した MS/MS処理とは、複数の質量分離部を用い、 1つ目の質量分離部（以下、 「MS1」という。 )のイオン化室で生成したイオン種のうちの一つを前駆イオンとして選 択し、 2つ目の質量分離部 (MS2)で、その前駆イオンの分解によって生じる生成ィォ ンを検出する処理法である。そして、生成イオンの m/zの値カゝらアミノ酸配列の解析 を行うものであり、当業者には、 MS/MS処理によりアミノ酸配列を決定する手法は容 易に理解される（たとえば、「ポストゲノム'マススぺタトロメトリー」 1993年、 pp 39-72 丹羽利充編 化学同人 参照)。この MS/MS処理によるアミノ酸配列の決定は、イン ターネットを介して NCBInr (hhtp：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)データベースとの照合に より実行することが可能である。
[0125] その後、前記アミノ酸配列が決定されたタンパク質の第一の m/zの値から、そのタ ンパク質に対応する同位体標識タンパク質の第二の m/zを求める。これは、図 3に示 す工程 S 11にてサンプル調製する際、同位体標識させるアミノ酸として、安定同位体 が既知である試薬、たとえば、 13C標識 (13Cx6個）ロイシンを利用して細胞を培養させ れば、第一の m/zの値と第二の m/zの値の差は、 12Cと13 Cの 6個分であり、その差が 6 である。そして、タンパク質の電荷の値から、工程 S113にて第二の m/zの値を算出 することができる。
[0126] 前記第一の m/z及び前記第二の m/zの値における、時間に対する質量分析スぺク トル (以下、それぞれ、「時間に対する第一の質量分析スペクトル (以下、「第一のマス クロマトグラム」と称する場合がある。；)」という、「時間に対する第二の質量分析スぺク トル (以下、「第二のマスク口マトグラム」と称する場合がある。；)」という）を、質量分析 装置にて得られた質量分析スペクトルから抽出する（工程 S114)。
[0127] ところで、細胞中には複数のタンパク質が存在しており、その多くのタンパク質を一 度に質量分析すると、一つのマスク口マトグラムであっても、異なるタンパク質のピー クが重なる現象が観測される。図 7は、単一の m/zの値において、複数のピークが重 なって 、る一例のマスク口マトグラムを示す。
[0128] 力かる現象により、細胞中のタンパク質の発現量の定量的解析を困難にしている。
そこで、本発明では、前示の第一のマスク口マトグラム及び第二のマスク口マトグラム に対して、波形分離処理を行い（工程 S 115)、固有のタンパク質由来のマスク口マト グラムに分離する。
[0129] 本発明で用いる波形分離処理とは、複雑な波形に対する曲線適合法を基本とする 合成的分離法である。これは、最初に各ピーク成分が特定の解析関数で表現できる と仮定する。この仮定に基づき、いくつかのピーク関数を生成'合成し、各ピーク関数 に含まれるパラメータを調整して観測波形との偏差を最小化する。偏差の最小点に おけるパラメータより、各ピーク波形を分解'分離することにより行う。なお、本発明に よる波形分離処理に利用される波形パラメータには、ピークの個数、各ピークの形、 ピーク位置、ピーク高さ、ベースラインの形等が挙げられる。
[0130] 図 8は、図 7に示したマスク口マトグラムを、本発明による波形分離処理により分離し たマスク口マトグラムを示す。本発明では、たとえば、ガウシアン関数とローレンツ関数 とを利用して波形分離することができる。図 8から明らかなように、実線で示される、実 際に測定されたマスク口マトグラムは、本発明による波形分離処理により、点線等で 表されるマスク口マトグラムにより 5分割される。
[0131] 図 8に示す波形分離処理を、同位体非標識タンパク質とそれに対応する同位体標 識タンパク質とで実行する。このようにして得られたマスク口マトグラムは、固有のタン パク質に由来するマスク口マトグラムである。そして、そのマスク口マトグラムの面積を、 前記同位体非標識タンパク質及び同位体標識タンパク質のそれぞれについて算出 し、それぞれを、第一の波形面積及び第二の波形面積とする（工程 S116)。次いで 、工程 S117にて、（第二の波形面積)/ (第一の波形面積)の比を求め、タンパク質変 動の定量的解析に利用できる。これは、常に、同位体標識されたタンパク質との比較 を行うことで、定量的解析を可能にするものである。
[0132] 次に、本発明による定量的解析方法に係るプログラムを、コンピュータにて実行さ せる解析システムについて説明する。図 9は、本発明が適用される解析システム 10の 構成の機能ブロック図の一例を示す。なお、図 9では、前記構成のうち、本発明に関 係する部分のみを概念的に示し、マイクロコンピュータ力 構成される。
[0133] 本発明に係る解析システム 10は、概略的には、質量分析装置 20にて得られた質 量分析データを解析する解析装置部 30と、アミノ酸配列決定用の外部分析プロダラ ム等を提供する外部装置部 40とを、ネットワーク 50を介して通信可能に接続して構 成される。なお、図 9に示すネットワーク 50は、解析装置部 30と外部装置部 40とを相 互に接続する機能を有し、たとえば、インターネット等である。
[0134] 本発明にて用いられる質量分析装置 20は、特に限定されるものではなぐ市販の 質量分析装置であればよい。そして、前記質量分析装置 20は、それ自体に該装置 にて測定して得られた結果を保存するデータ保存部 25を備えていてもよい。また、本 発明に用いられる質量分析装置 20は、それ自体に装置を制御する制御部や入出力 部を備えるものであってもよ 、。
[0135] 図 9に示す外部装置部 40は、ネットワークを介して、質量分析データを解析する解 析装置部 30と相互に接続され、利用者に対してアミノ酸配列情報等に関する外部デ ータベースゃホモロジ一検索等の外部分析プログラムを実行するウエッブサイトを提 供する機能を具有する。
[0136] ここで、外部装置部 40は、 WEBサーバや ASPサーバ等として構成してもよく、その ハードウェア構成は、一般に巿販されるワークステーション、パーソナルコンピュータ 等の情報処理装置及びその付属装置により構成してもよい。また、外部装置部 40の 各機能は、外部装置部のハードウェア構成中の CPU、ディスク装置、メモリ装置、入 力装置、出力装置、通信制御装置等およびそれらを制御するプログラム等により実 現される。
[0137] 本発明では前記外部装置部として NCBInr等のデータベースを利用することができ る。
[0138] 図 9に示す解析装置部 30は、概略的には、質量分析装置 20の全体を統括的に制 御する CPU等の制御部 60、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置 (不図示
)に接続される通信制御インターフェース部 70、質量分析装置 20、およびディスプレ ィゃプリンタ一等の出力装置 90に接続される入出力制御インターフェース部 80、お よび各種のデータベースを格納する記憶部 100を備えて構成される。各部は任意の 通信路を介して通信可能に接続される。さら〖こ、本発明による解析装置部 30は、ル ータ等の通信装置及び専用線等の有線又は無線の通信回線を介して、ネットワーク に通信可能に接続されて 、る。
[0139] 記憶部 100に格納される各種のデータベース (質量分析データやアミノ酸配列デ ータベース等）は、固定ディスク装置等のストレージ手段であり、ファイルやデータ等 を格納する。
[0140] 前記記憶部 100の各構成要素のうち、質量分析データベースは、質量分析装置 2 0にて得られたデータベースである。また、アミノ酸配列データベースは、質量分析装 置にて得られた質量分析スペクトルの解析結果としてのアミノ酸配列データベースや 、インターネットを経由してアクセス可能な外部のアミノ酸配列データベースであって もよい。さらに、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納し たり、さらに独自の識別番号を付与し作成したインハウスデータベースであってもよい
[0141] 制御部 60は、本発明に係る解析方法を実行するプログラムを格納し、前記解析装 置部 30を、ひいては解析システム 10の全体を制御する装置である。前記制御部 60 は、 OS (operating system)等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプロ グラム、および所要データを格納するための内部メモリ（不図示）を有し、これらのプロ グラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。なお、本発明に係る 解析方法を実行するプログラムは、前記記憶部 100に格納されて ヽてもよ ヽ。
[0142] 図 10は、本発明に係る解析方法を実行する一のプログラムを、概念的に表すフロ 一チャートである。工程 S200にて、制御部 60は、質量分析装置 20にて得られた質 量分析データを取得する。そして、取得した質量分析データを記憶部 100に保存す るが、その際に、後述する解析の便宜のため、データ検索を容易にするように、各質 量分析データに、スキャン番号等の識別番号を付与する（工程 S201)。次に、図 5の 工程 S 111にて説明したのと同様に、通信制御インターフェース部を介したインター ネット 50を通じて、外部のデータベース、たとえば、 NCBInrデータベースと照合させ ながら、 MS/MS処理により、制御部 60にてアミノ酸配列を決定することができる（工程 S202) o前記質量分析データの中から、解析対象とする質量分析スペクトルを決定 する（工程 S203参照)。その際、前述のように決定した質量分析スペクトルの m/zを 定め、これを第一の m/zとする。この第一の m/zの値は、同位体非標識タンパク質の 質量分析スペクトル、または同位体標識タンパク質の質量分析スペクトルであっても よい。かかる決定は、前述のスキャン番号力 容易に行うことができる。
[0143] 工程 S204にて、前記アミノ酸配列が決定されたタンパク質の第一の m/zの値から 、そのタンパク質に対応する同位体標識タンパク質の第二の m/zの値を求める。この 決定工程は、図 3の工程 S11にて予め培養させる際に利用した同位体標識のァミノ 酸に含まれる同位体原子の数と、前記第一の m/zに対応するタンパク質の電荷から 容易に決定することができる。決定した第二の m/zの値から、その値のマスクロマトグ ラムを、記憶部 100に格納された質量分析データ力も抽出する（工程 S205参照)。 [0144] 次いで、第一の m/z及び第二の m/zの値における第一のマスク口マトグラムおよび 第二のマスク口マトグラムに対して、図 7及び図 8にて説明したように、工程 S206にて 波形分離処理を行う。本処理により、固有のタンパク質に由来するマスク口マトグラム を分離し、記憶部 100に格納する。このようにして得られたマスク口マトグラムの波形 面積として、第一の波形面積及び第二の波形面積を算出し (工程 S207)、工程 S20 8にて、（第二の波形面積) I (第一の波形面積)の比を求める。
[0145] その後、必要に応じ、前記比の値を、ディスプレイ若しくはプリンタ一等の出力装置 90に表示若しくは印字することができる。
[0146] 図 10に示す一連の工程を、同位体標識タンパク質に起因する質量分析スペクトル と比較しながら行うため、サンプル内のタンパク質発現量の変化を、定量的に解析す ることが可能となる。また、必要に応じて、解析対象とする別の質量分析スペクトルに 対して、図 10に示す一連の工程を繰り返し実行することも可能である。たとえば、正 常な細胞由来のタンパク質との比較から、遺伝子欠損した細胞由来のタンパク質の 発現パターンの相違を観測することも可能である。
[0147] さらに、図 10では、同位体非標識された生体分子と同位体標識された生体分子に て説明したが、同位体標識された生体分子に代えて、同位体標識された内部標準物 質である生体分子を利用することもでき、その場合、図 10の工程 SS208に示す波形 面積比は、（生体分子の波形面積)/ (内部標準物質に固有の波形面積)の比として 算出される。
[0148] 図 11は、本発明に用いる制御部 60の詳細な構成を示す機能ブロック図である。前 述のように、図 10で説明した本発明に係る解析方法を実行するための制御部 80は、 質量分析装置 20にて得られた質量分析データを、入力制御インターフェース部 80 を通じて、制御部 80のデータ入出力部にて入手する。外部のデータベース、たとえ ば、 NCBInrデータベースと照合させながら、 MS/MS処理により、入手したタンパク質 の質量分析データについてのアミノ酸配列を、制御部 60の処理部にて決定する。解 析対象としての質量分析スペクトルを、質量分析装置 20、または制御部 80と接続さ れた不図示の入力手段からの信号に基づき決定する。ここで、前記入力手段として は、たとえば、制御部に接続されたキーボードやマウス等が挙げられる。 [0149] 前記決定により第一の m/zの値が決まり、制御部 60の処理部にて第二の m/zの値 を決定する。第二の m/zの値の決定は、図 5の工程 S113により行うことができる。な お、第一の m/zの値と第二の m/zの値のタンパク質は、アミノ酸の同位体非標識と、 同じアミノ酸が同位体標識されたタンパク質の関係にある。
[0150] このように決定された第一及び第二の m/zの値におけるマスク口マトグラムを、デー タ入出力部を介して、記憶部 100の質量分析データベースや、質量分析装置 20か ら、処理部にて入手する。入手した第一および第二の m/zの値におけるマスク口マト グラムを、図 5の工程 S115や図 10の工程 S206にて説明したように、処理部にて波 形分離処理する。かかる波形分離処理により、 m/zの値におけるマスク口マトグラムの 結果力 だけでは、一見、単一のタンパク質のピークと観測されたものであっても、固 有のタンパク質に由来するマスク口マトグラムに分離することが可能となる（図 8参照）
[0151] 次いで、固有のタンパク質に由来するマスク口マトグラムに分離されたデータを、波 形処理部から演算部へ送り、前記演算部にて分離された波形面積の算出と、同位体 非標識と同位体標識されたタンパク質において、対応する固有のタンパク質に由来 するマスク口マトグラム間の波形面積比の算出と、を実行する。
[0152] このように、本発明に係る解析方法によれば、同位体非標識と同位体標識のァミノ 酸を含むタンパク質において、固有のタンパク質に由来する波形分離されたマスク口 マトグラム間の比較により、定量的解析を可能とする。
[0153] 次に、代謝的に同位体標識されたタンパク質である内部標準物質または代謝的に 同位体標識されたタンパク質である内部標準物質を含む細胞を利用した解析方法 について説明する。
[0154] 本発明の第一の実施態様において説明したように、各サンプルに、予め、代謝的 に同位体標識されたタンパク質である内部標準物質または代謝的に同位体標識さ れたタンパク質である内部標準物質を含む細胞をカ卩え、各サンプルからのタンパク質 を抽出、分画等し、質量分析装置に測定する。その後、図 5、図 9一図 11にて説明し たように、波形分離処理を伴う、本発明による解析方法を行うことにより、生体分子の 定量的解析を可能とする。なお、カゝかる解析方法は、サンプルが培養できない場合、 サンプルが培養できても、継代培養により影響を受ける場合、サンプルを同時期、同 研究所で準備できない場合に、有用な方法である。さらに、前記内部標準物質中の タンパク質が既知量であるならば、絶対定量を可能とする。
[0155] ここで、本発明の第一の実施態様における、生体分子の標識ピークと非標識ピーク との強度比を求めて比較する方法を実行するプログラムについて説明する。図 12は 、本発明の第一の態様における強度比を求め、比較するためのプログラムの工程図 を示す。図 12に示す工程 S300にて、質量分析装置 20にて測定された各種測定サ ンプルの質量分析データを、本発明に係る解析システム 10の解析装置部 30にて取 得する。前述のとおり、測定サンプルの調製方法に調製された、分画したサンプル、 精製サンプル、分離サンプル、消化したサンプル又は HPLCにより分離されたサンプ ルを含むものである。ここでは、特に、代謝的に同位体標識されていない生体分子と 、同位体非標識の生体分子を対象とする。
[0156] 次いで、工程 S301にて、前記質量分析スペクトルの測定結果に関するデータを、 解析装置部 30の通信制御 IF部 70を介して、外部のデータベース、たとえば、 NCBInrデータベースと照合させながら、 MS/MS処理により、入手した質量分析に関 するデータ、具体的には、同位体標識および同位体非標識のタンパク質の同定、つ まりはアミノ酸配列を制御部 60の処理部にて同定する。その後、対象とする同位体 標識ピークと同位体非標識ピークとを特定する（工程 S302参照)。
[0157] 以上の結果に基づき、工程 S303に示すように、制御部 60にて、ペプチドのァミノ 酸配列が同定された分子における、同位体標識ピークと同位体非標識ピークのピー ク強度比を算出する。以上の操作を、各サンプル力 得られた複数のペプチドにつ いて実行することにより、異なるペプチド間で、ピーク強度比の比較することができる
[0158] さらに、同位体標識された生体分子が既知量である場合には、図 12に示す工程を 実行すると、本発明では、生体分子を絶対定量するプログラムを提供することができ る。
[0159] ところで、波形分離されたマスク口マトグラムに関して、実際に測定され、波形分離さ れたマスク口マトグラムは、元来、解析対象であるサンプルを二次元電気泳動等によ り分離されたタンパク質を質量分析したものである。そのサンプル調製の際、ゲル上 のタンパク質スポットのバンドを切断し、容器に回収する。次いで、当該容器内のゲ ルを、トリプシン等の酵素で消化してペプチドに断片を回収して、質量分析を行う。
[0160] このように回収されたペプチドは、切断されたタンパク質スポットに由来するバンドか ら誘導されるものであるが、当該バンド自体が単一のタンパク質を含有するものでは なぐ同じタンパク質でも、サンプル処理過程でペプチドが切断され得ることにより、 複数のバンドに存在していることが通例である。そのため、前述のように波形分離さ れたマスク口マトグラムであっても、同一のペプチドは複数の波形分離されたマスク口 マトグラムとして測定される。よって、同一のペプチドであっても、（同位体非標識ぺプ チドのピーク) / (同位体標識ペプチドのピーク)の比や（同位体非標識ペプチドの波 形面積) I (同位体標識ペプチドの波形面積)の比の値 (以下、これらを総称して「定 量値」という。）は、質量分析したピーク毎に異なり、複数の値が存在することになる。
[0161] そこで、波形分離されたマスク口マトグラムの結果から、 1又は複数のペプチドに着 目して、当該ペプチドが構成するタンパク質が同定される力否かを検討することがで きる。たとえば、前記質量分析スペクトルの結果を、タンパク質の機能情報を有する LocusLink等のデータベースと照合して、タンパク質の機能情報を得ることができる。 ここで LocusLinkには、 NCBInr、 IPI、 Sport等の複数のデータベースにおけるキー情 報から「Locus IDJ t 、う共通のキーへのリンク情報およびタンパク質の機能情報が 提供されている。そこで、ペプチド配列から、 NCBInr、 IPI、 Sport等のデータベースを 使用して、各データベースにおけるキー情報を得る。次に、 LocusLinkを使用して、キ 一情報から Locus IDを得ることができる。そして、当該 Locus IDから、タンパク質の 機能情報を得ることができる。例えば、ペプチド配列から、 NCBInr等のデータベース を使用して、「GiNo」というキー情報を得る。次に、 LocusLinkを使用して、 GiNoから Locus IDを得る。そして、当該 Locus IDから、タンパク質の機能情報を得ることができ る。
[0162] 図 13は、本発明で用いる、外部データベースを利用した機能情報の取得に関する スキームを示す。図 13に示すように、波形分離後のペプチド毎に分類した上で、タン パク質の機能情報を有するデータベース、たとえば、 NCBInr、 IPI、 Sport等へァクセ スする。特に、 NCBI-BLASTを利用して配列パターンを照合する。得られた配列パタ ーン力 NCBInrのキー情報である GiNoを取得し、詳細な機能情報を有するデータべ ースである LocusLinkへ接続し、 GiNoから Locus IDを取得する。その後、同一の Locus IDを有するものをグループ化するとともに、かかる IDから Gene Symbol, Gene
Ontology(biological process八 Gene Ontology (cellular component)、 ene Ontology(molecular lunction),代表定量値の情報を入手することができる。なお、波 形分離前の工程は、図 5および図 10に示した工程と同様である。
[0163] さらに、前述のグループ化された Gene Symbolから各ペプチドが構成していたタン ノ ク質の情報も取得でき、複数のペプチドにおける測定値力もタンパク質の定量値を 算出することが可能となる。これにより、力かるタンパク質の定量値と生物学的情報と の関連付けが実現される。なお、ペプチドの定量値の場合、単にその平均の定量値 を算出することもできる力 その場合、ペプチドの定量値の極大値および極小値の影 響を受けやすい。一方で、タンパク質の定量値を算出するにあたり、グループィ匕され た機能タンパク質にて標準偏差を求め、その標準偏差の範囲内のデータのみで再 度平均を求めてそのタンパク質の定量値とすれば、ペプチドの定量値よりも、タンパ ク質の定量値とその生物学的情報との関係性に意義があるものとなる。
[0164] 前述の定量値と機能情報との付加の操作は、図 11に示した情報付加部により、外 部のデータベースを利用して行うことができる。なお、質量分析データに関する処理 は、図 9に示した手段等により、波形分離までの情報処理工程と同様である。
[0165] 図 14は、本発明において、波形分離後（工程 S400)、決定されたペプチドの配列 の結果に基づき、機能情報の付加を行う方法を実行するための工程図を示す。工程 S401にて、選択したペプチドの配列ごとに分類し、その後の解析の対象とするぺプ チド配列を特定する。次いで、図 9に示すように、通信制御インターフェースを介して 、外部のデータベースへ、機能情報を取得するためにアクセスする。ここで、外部の データベースの具体例としては、 NCBInr(hhtp：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)、 IPI、 Sport 等のデータベースを挙げることができる。そして、かかるデータベースから、配列パタ ーンを検索し、 GiNo等の情報を取得する。その後、工程 S402において、ペプチドの GiNo等の情報から、当該ペプチドが構成していたタンパク質に関する情報の有無を 検査する。タンパク質の情報を有する場合には、力かる情報を共有する配列としてグ ループ化する。このグループィ匕されたタンパク質における定量値を算出する（工程 S 403参照）。さらに、この情報には、図 14に示すように、 Gene Symbol, GO(biological process) ^ uOi,cellular component) uO(molecular i nction)等の機會†青？ ^ 人手 することもできる。なお、前述の定量値の平均値を求め、当該ペプチドの代表定量値 を算出することは、図 9および図 11に示す制御部 60の演算部にて行うことができる。
[0166] このようにして、決定されたペプチドの配列の結果から、ペプチドが構成して ヽたタ ンパク質を検出し、そのタンパク質の定量値と機能情報、具体的には、 Gene
Ontology情報との関連を付けることができる。これは、タンパク質の定量値と生物学 的データとの関連性を示唆するものである。
[0167] また、本発明では、 MS/MS処理力 得られた質量分析スペクトルにより、ペプチドを 構成するアミノ酸配列を決定したのち、波形分離処理を施さずに、前述のタンパク質 の機能情報を有するデータベース (NCBInr等)へアクセスし、ペプチドの定量値と生 物学的データとの関連性を見出すこともできる。これは、アミノ酸配列の決定されたぺ プチドの質量分析スぺ外ル自体を波形分離する必要がな！ヽ場合にも、適用できる。
[0168] 図 15は、波形分離をせずに、同位体標識された生体分子である内部標準物質存 在下でのペプチドの質量分析スペクトルの結果、具体的にはァミノ配列の結果に基 づき、機能情報の付加を行う方法を実行するための工程図を示す。図 15に示すェ 程 S500— S502までは、図 10に示す工程 S200— S205と共通するため、その説明 は省略する。本発明の好ましい態様では、工程 S503にて第一および第二、並びに 内部標準物質の m/zにおけるマスク口マトグラムを抽出する。工程 S502後、工程 S5 04にて、図 9に示す通信制御インターフェースを介して、外部のデータベースへ機 能情報を取得するためにアクセスする。前述のように、外部のデータベースとしては、 NCBInr(hhtp：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)、 IPI、 Sport等のデータベースを挙げることが できる。かかるデータベースから、ペプチドの配列パターンを検索し、 GiNo等の情報 を取得する。この後、工程 505にて、ペプチドの GiNo等の情報から、そのペプチドは 構成していたタンパク質の関する情報の有無を検索する、タンパク質の情報を有する 場合には、そのタンパク質情報から、 Gene Symbol, GO(biological process), GO(cellular component), GO(molecular fonction)、代表定量値等の機能情報と関 連させることができる。なお、図 15に示す工程図では、図 10の工程 S209にて実行し た、同位体非標識のペプチドと同位体標識のペプチドの波形面積の比を求める工程 を記載していない。しかし、工程 S502にて配列決定された同位体標識および同位 体非標識のペプチドにおいて、各々のペプチドの波形面積を求め、（同位体非標識 ペプチドの波形面積)/ (同位体標識ペプチドの波形面積)の比を算出し、工程 S504 および S505を実行することにより、機能情報と関連させることもできる。なお、波形面 積の比だけでなぐピーク強度比を用いても、同様に、機能情報と関連させることもで きる。
実施例
[0169] 以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではな い。
[実施例 1]
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を調製するた め、以下の操作を行った。
マウス神経芽細胞種 Neuro2Aを培養した。培地には、 10%牛胎児血清（ MOREGATE社、 BATCH 32300102)、 100U/ml ペニシリン G、 100 g/mlストレプト マイシン（GIBCO社、 15140- 122)を含む RPMI- 1640 (Sigma社、 R— 7130)を用いた。 RPMト 1640としては、 L-グルタミン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-ロイシン、炭酸水素ナ トリウムを含まな 、粉末培地を選択し、当該培地に欠損した成分を加えて調製 (L-グ ルタミン（Sigma社製、 G- 8540)、 L-リジン（Sigma社製、 L- 9037)、 L-メチォニン（Sigma 社製、 M-5308)、炭酸水素ナトリウム（和光純薬、 191-01305)をそれぞれ 0.3g/L、 0.04g/L、 0.015g/L、 2g/Lをカ卩え、さらに、安定同位体で標識された L-ロイシン（ Cambridge Isotope Laboratories社、 CLM- 2262)を 0.05g/L加えた）した。このように して調製した培地を用いて、 5%CO下 37°Cで培養した。この培養によって得られた細
2
胞を、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞として 以下の実験に用いた (実施例 2— 7)。
[0170] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞におけるタ ンパク質量を測定するために以下の操作を行った。
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞 1.9xl07個を 細胞溶解液 M-PER (PIERCE社、 78501) lmLで可溶化し、遠心分離により不溶性画 分を除去して可溶性画分を調製した。この可溶性画分に含まれるタンパク質量をタン パク質定量試薬 Micro BCA (PIERCE社、 23235)を用いて定量した。その結果、 6.2mg/mLで teつた。
[0171] [実施例 2]
再現性を確認するために、以下の実験を行った。
<測定サンプルの調製 >
サンプルとして、野生型マウス（C57BL/6)および ADAM22遺伝子を欠損させたマウス を複数用意し、それぞれの^ I を摘出し凍結保存した。脳湿重量あたりのタンパク質 量を測定するため、そのうちの 1個の脳湿重量を測定し、さらにプロテアーゼインヒビ ター（コンプリート™ (ロシュ ·ダイァグノスティックス株式会社、製品番号 1 697 498) をサンプルからの抽出液 50 mLあたり 2錠になるように溶解した）を含む
lOmMHEPES- (pH7.4)- ImMDTT- ImMMgCl - ImMNaF- ImM vanadate中でホモジ
2
ナイズし、 100,000xgl時間の遠心分離により可溶性画分を調製した。この可溶性画 分のタンパク質量を測定したところ、脳湿重量 lgあたりタンパク質量 39.4mgとなった。
[0172] 被検体とする脳を解凍して脳湿重量を測定し、上述の脳湿重量あたりのタンパク量 から、被検体のタンパク質量を推定した。そして、実施例 1で得られた代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞をタンパク質量が等しくなる ような細胞数（12.1xl07個）加えて、テフロン Rホモジナイザーでホモジナイズし、 500xg
5分間の遠心分離により未破壊の細胞、核などを除去した。次にその上清を 100,000xg 1時間の遠心分離することにより可溶性画分を調製した。
[0173] <サンプルの抽出、分画、精製、消化 >
サンプル中のあるタンパク質が定量できることを確認するために、 cytosolic malate dehydrogenase (cMDH)と親和性を持つことが知られている E70700. Med. Chem. 42, 3789-99, 1999)を固定化したァフィユティーマトリックス（Anal. Chem. 75, 2159-2165, 2003)を使用して、以下の操作を行った。可溶性画分 O.lmLを 0.9mLの PBSで希釈し、 E7070を固定ィ匕したァフィユティーマトリックス 0. lmLと混合して反応さ せた後に遠心分離で上清を除去した。沈殿したァフィユティーマトリックスを PBS、 1 MNaClで洗浄した後、吸着したタンパク質を、 PBS-10mM NADH溶液（NADHは、 Sigma社、 N-8129)で溶出することにより cMDHを回収した。回収した画分を限外ろ過 で濃縮して SDS PAGE(ATTO社製、 e- PAGEL、 E- T520L)にかけて精製し、 cMDH に相当するバンドを切り出してトリプシン（Promega社製， Cat. No. V5111)でゲル 内消化（Rapid Comm Mass Spectrom., 15, 1416-1421, 2001: Rapid Comm Mass Spectrom., 17, 1071-1078, 2003)し消化したサンプルを得た。
[0174] <消化したサンプルの測定 >
消化したサンプルを MALDI- MS (ABI4700, Applied Biosystems社製：
alpha— cyano— 4— hyaroxyl cinnamicacid (し Hし A)をマトリクスとして Dry— droplet法でサ ンプルと共結晶化した)で測定した。得られた結果を基に、フラグメントの同定、ピーク 強度比の算出 (付属のソフトウェアにピーク面積を計算させて、強度比を計算)を行 つた。具体的な計算は、以下のように行った。
[0175] 野生型マウス（Wild)および ADAM22遺伝子ノックアウトマウス（KO)における cMDH について、野生型マウスにおける cMDH由来の非標識ピーク（例えば、 m/z = 1750 のとき、非標識ピーク =12405.31)を内部標準物質における cMDH由来の標識ピーク（ m/z = 1762のとき（ロイシンを 2つ含むため分子量は 12増加する）、標識ピーク = 5373.19)で除することによって、 cMDHにおける非標識ピーク/標識ピーク（
12405.31/5373.19 = 2.308743)を求めた。次に、同じく野生型マウスにおける cMDH由来の非標識ピーク (例えば、 m/z = 1770のとき、非標識ピーク =
4533.977)を内部標準物質における cMDH由来の標識ピーク (m/z = 1776のとき（口 イシンを 1つ含むため分子量は 6増加する）、標識ピーク = 3156.617)で除すること によって、 cMDHにおける非標識ピーク/標識ピーク（4533.977/3156.617 =
1.436341)を求めた。さらに、同じく野生型マウスにおける cMDH由来の非標識ピーク m/z = 1392, 1039についても同様に非標識ピーク/標識ピークの比を求め、それぞ れ 2.435703, 1.750933と算出した。次に、このそれぞれのピーク強度比 2.308743, 1.436341, 2.435703, 1.750933の平均値 1.98293を求め、これを野生型マウスにお ける cMDH由来のピーク強度比とした。
[0176] 一方、 ADAM22遺伝子ノックアウトマウスにおける cMDHの非標識ピーク（非標識ピ ーク = 13011.03)を内部標準物質における cMDH由来の標識ピーク (標識ピーク = 6035.838)で除することによって、該生体分子における非標識ピーク/標識ピーク（ 13011.03/6035.838 = 2.155629)を求めた。同様に非標識ピーク/標識ピークの比 を求め、それぞれ 2.056147, 2.340332, 2.090195と算出した。次に、このそれぞれの ピーク強度比 2.155629, 2.056147, 2.340332, 2.090195の平均値 2.160576を求め、 これを ADAM22遺伝子欠損マウスにおける cMDH由来のピーク強度比とした。
[0177] 次に、野生型マウスにおけるピーク強度比（2.308743)と ADAM22遺伝子ノックアウト マウスにおけるピーク強度比（2.160576)とを比較し、比 0.917778を得た。
この操作を 5回繰り返し、実験間の測定値の変動を検討した。
その結果、ァフィユティー精製と言う実験間の測定値の変動が大き!、ステップを経て いるにも関わらず、 CV値 4.1%という再現性の良い結果を得ることが出来た。 （図 16 および表 1)
[0178] [表 1]
Figure imgf000063_0001
[表 1] cMDHについて、野生型マウス脳および ADAM22遺伝子欠損マウス脳にお ける代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質とのピーク強度比なら びに内部標準物質に対する野生型マウス脳のピーク強度比と ADAM22遺伝子欠損 マウス脳のピーク強度比との比較における再現性 (n=5)を表して 、る。
[0179] [実施例 3]
目的物質の量の変化に応じて質量分析スペクトル上のピーク強度比が比例的に変 化することを確認するために以下の実験を行った。
<測定サンプルの調製 >
サンプルとして、野生型マウス (C57B6)の^ | を摘出し凍結保存した。脳湿重量を測 定し、プロテアーゼインヒビター（コンプリート™ (ロシュ'ダイァグノスティックス株式会 社、製品番号 1 697 498)をサンプルからの抽出液 50mLあたり 2錠になるように溶 解した）を含む 10mM HEPES-(pH7.4)-lmM DTT-lmM MgCl -ImM NaF-lmM
2
vanadate中でホモジナイズし、 100,000xg 1時間の遠心分離により可溶性画分を調 製した。可溶性画分のタンパク質濃度が 3.7mg/mLになるように調製した。
[0180] 実施例 1で得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含 む細胞 1.9x107個を細胞溶解液 M-PER (PIERCE社、 78501) lmLで可溶化し、遠心分 離により不溶性画分を除去して、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質を調製した。代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を上 記可溶性画分に対し、 1 : 3、 1 : 1、 3 : 1、 10 : 1の割合で混合して、サンプルの可溶性 画分とした（0.2mLずつ）。
[0181] <測定サンプルの抽出、分画、精製、消化 >
サンプル中のあるタンパク質が定量できることを確認するために、 cytosolic malate dehydrogenase (cMDH)と親和性を持つことが知られている E70700. Med. Chem. 42, 3789-99, 1999)を固定化したァフィユティーマトリックス（Anal. Chem. 75, 2159-2165, 2003)を使用して、以下の操作を行った。サンプルの可溶性画分 0.1 mL を 0.9mLの PBSで希釈し、 E7070を固定化したァフィユティーマトリックス 0. lmLと混合 して反応させた後に遠心分離で上清を除去した。沈殿したァフィユティーマトリックス を PBS、 lMNaClで洗浄した後、吸着したタンパク質を、 PBS-lOmM NADH溶液（ NADHは、 Sigma社、 N-8129)で溶出することにより cMDHを回収した。回収した画分 を限外ろ過で濃縮して SDS PAGE (ATTO社製、 e- PAGEL、 E- T520L)にかけて精製 し、 cMDHに相当するバンドを切り出してトリプシン（Promega社製， Cat. No. V5111 )でゲル内消化（Rapid Comm Mass Spectrom., 15, 1416-1421, 2001: Rapid Comm Mass Spectrom., 17, 1071-1078, 2003)し、消化したサンプルを得た。
[0182] <測定サンプルの測定 >
消化したサンプルを MALDI- MS (ABI4700, Applied Biosystems社製：
alpha— cyano— 4— hyaroxyl cinnamicacid (し Hし A)をマトリクスとして Dry— droplet法でサ ンプルと共結晶化した)で測定した。得られた結果を基に、でフラグメントの同定、ピ ーク強度比の算出 (付属のソフトウェアにピーク面積を計算させて、強度比を計算)を 行った。その結果、ピーク強度比はサンプル量に比例した直線となり（R2=0.97)、非 常に精度良く定量することが可能であった（図 17および 18)。
[0183] [実施例 4]
動物組織由来のサンプル間の比較にぉ 、て、本法が適用できることを確認するため に以下の実験を行った。
<測定サンプルの調製 >
可溶性画分のタンパク質濃度が 3.7mg/mLになるように調製した。
サンプルとして、野生型マウス（C57B6)および ADAM22遺伝子を欠損させたマウス（ 系統、ブリーダー）を用意して、それぞれの^ I を摘出し凍結保存した。次に、脳を 解凍して脳湿重量を測定し、実施例 1で得た脳湿重量あたりのタンパク質量から、サ ンプル中のタンパク質量を算出した。そして、実施例 1で得られた代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質を含む細胞をタンパク質量が等しくなるような 細胞数カ卩えて、テフロン Rホモジナイザーにてホモジナイズし、 500xg 5分間の遠心分 離により未破壊の細胞、核などを除去した。次に、その上清を 100,000xg 1時間の遠 心分離することにより可溶性画分を調製した。タンパク質量を測定したところ、野生型 マウス由来のタンパク質は 3.02mg/mL、 AD AM22遺伝子を欠損させたマウス由来のタ ンパク質は 3.12mg/mLであった。これを分画したサンプルとした。 続、て、各分画したサンプルにっき 2mLずつ（lmLチューブ 2本ずつ）にっき以下の 操作を行った。尿素（Bio- Rad社 Cat. No. 161- 0731)を加えて 8Mとし、 lmLあたり 3mgのデイチオスレィトール (和光純薬 Cat.No. 045-08974: DTT)をカ卩えた 0.5M Tris緩衝液 (pH8.3, Sigma社製） 500 μ Lを各分画したサンプルに加え、 37度で 3時間 インキュベーションすることでタンパク質中のシスティン残基を還元した。その後、尿 素を加えて 8Μとし、 8mgのアクリルアミド (Bio- Rad社製 Cat. No. 161- 0107)をカ卩えた 0.5M Tris緩衝液 (pH8.3) 500 μ Lを、各分画したサンプルカ卩えて室温で 3時間イン キュベーシヨンしてシスティン残基をアルキル化した。そこに 8mgの DTTをカ卩えること で過剰のアクリルアミドを失活させた。分子量 1万カットの SnakeSkin (ピアス社、 Cat. No.68100)を使い、 1000倍量の 10mMの炭酸水素アンモ-ゥム緩衝液により、 4°Cにて 、 1昼夜透析することにより還元アルキルィ匕試薬を除去し、当該分画したサンプルを 野生型マウス由来のタンパク質、 ADAM22遺伝子を欠損させたマウス由来のタンパク 質それぞれ 2本ずつのチューブに分け、 SpeedVacにて凍結乾燥した。この各分画し たサンプルを 8Mの尿素を含む 0.2%ベータ'ォクチルダルコシド水溶液 200 μ Lで再 溶解し、 50mMの炭酸水素アンモ-ゥムで 5倍に希釈し、計 lmLとした。タンパク質量 0.3mgに対して 100 Lのトリプシン（プロメガ社製、 Cat. No. V5111)をカ卩えて 37°Cに て 24時間消化を行った。ここで消化したサンプルを得た。この各消化したサンプル（ 野生型マウス由来のタンパク質、 ADAM22遺伝子を欠損させたマウス由来のタンパク 質）を各 1本ずっァ-オン交換カラム（Mini- Q PC 3.2/3: Amersham Biosciences Cat. No. 17- 0686- 01)およびカチオン交換カラム (Mini- S PC 3.2/3: Amersham Biosciences Cat. No. 17- 0687- 01)にアプライし、 1分ごとに分取を行った。ァ-ォ ン交換カラムの場合には、消化したサンプルに 50 Lのアンモニア水と 0.5mLの超純 水をカ卩えて 2万 Gで 1分間遠心し、上清をァ-オン交換カラムに注入した。一方、カチ オン交換カラムの場合には、消化したサンプルに 50 Lのギ酸と 0.5mLの超純水を加 えて 2万 Gで 1分間遠心して上清をカチオン交換カラムに注入した。 HPLC条件は、流 速が毎分 0.2mL、 UV検出波長が 235nm & 280nm、カチオン交換カラムの場合には 、移動相 Aが 25mMのギ酸に 5%ァセトニトリル、移動相 Bが 1Mのギ酸アンモ-ゥムで pH3.5、 5%ァセトニトリルとした。ァ-オン交換の場合には、移動相 Aが 25mMのアン モユアに 5%ァセトニトリル、移動相 Bが 1Mの酢酸アンモ-ゥムで pH8.6に 5%ァセトニ トリルとした。グラディエントは、最初 5分間が 100%移動相 Aで、その後 40分かけて移 動相濃度を直線的に 40%まで増加させ、その後 15分間で移動相 Bを 100%として 5分 間流した。カラム力も溶出してくる各フラクションを、 TFAをカ卩えることにより酸性とし、 あらかじめァセトニトリルで洗浄後 0.1%TFA水でコンディショニングしておいた
ZipTipC18 (ミリポア社製 Cat. No. ZTC18S960)にアプライした。続いて、 5%ァセト 二トリルを含む 0.1%TFA 水 20 μ Lで 3回洗浄し、 5 μ Lの 70%ァセトニトリルを含む 0.1 %TFA水で溶出することにより脱塩した。ここで、 HPLCにより分離したサンプルを得 た。
次に、この HPLCにより分離したサンプルを 95 μ Lの 0.1%TFA水で希釈して
LC(C18column)/MS (ThermoFinnigan LCQ) で測定を行った。このときの条件は、 HPLC側としては Michrom BioResources Inc社の Magic C18カラム 0.2xl50mm (Cat.
No. 902-61261-00)に移動相 Aとして 5%ァセトニトリルと 0.01 %TFAを含む 0.2%酢 酸水、移動相 Bとして 95%ァセトニトリルと 0.01%TFAを含む 0.2%酢酸水を用いて、 最初の 1分間は 100%移動相 Aとして、その後 35分間で移動相 Bを直線的に 40%とし 、その後 0.1分間で移動相 Bを 100%にして 7分間維持、その後移動相 Aを 100%として 14分後に次のサンプルを注入した。装置には島津製作所の LC-10Aシリーズの ROM をミクロ対応として、また、ミキシングチャンバ一としては付属の島津製作所製を外し てノ レコ社の Tコネクターを採用した。流速としては Flow-splitting方式を採用し、カラ ムには約毎分 1 2 Lの流速となるように調整した。サンプルを CTC社のオートサンプ ラー PALによって 50 μ L注入し、サンプルを一度インジェクターのサンプルループに 組みこんだペプチド用キヤピラリートラップカラム (Michrom BioResource社
Cat.No.004-25109-32)で濃縮した後に分析カラムに送り込んだ。質量分析装置は、 ThermoFinnigan社の LCQ Duoに AMR社に特注した、シーズガスを使用しない、そし て XYZステージによってスプレー位置を任意に調整できる低流速対応のサブナノス プレイヤーを装着し、かつ、スプレーにはメタル-一ドル（GLサイエンス社製 (カタログ 番号 7820-59001)を C18カラムに直接つないで使用した。 ESI電圧としては 2.6kVを印 カロした。 1 J疋は、 Data Dependentモ ~~ドで Dvnamic Exclusionの Repeatを 1とした。 なお、スキャン回数を稼ぐために Zoom Scanモードを外したいわゆるダブルプレーモ ードで測定した。
[0186] 得られたデータについては、 SonarMSMS (Genomic solution社)および NCBInrデ ータベース用いてタンパク質の自動同定を行った。このとき、安定同位体で標識した ロイシン（ロイシン 1つにつき分子量 6の増力 [])でも NCBInrに対して検索できるように、 プログラムの一部を改変した。定量はロイシンを含むペプチドのピークで行うため、 SonarMSMSにより同定されたペプチドのうち、ロイシンを含むペプチドのみ選び出し、 かつ、そのペプチドピークの溶出位置（HPLCでの保持時間 =質量分析でのスキャン 番号）を特定するために LCQ Duoの付属ソフトである LCQ_dta.exeファイルからスキ ヤン情報を自動で選び出すソフトウェアを構築した。そして、そのスキャン番号の情報 から、そのスキャン番号の質量分析スペクトルを抜き出し、天然型ロイシンペプチドの ピークと同位体ペプチドのピークにっ 、て、 MS/MSを測定した際の親イオンの情報 (m/z値)とそのペプチド内に何個のロイシンがあるカゝ、そして電荷は何個かを
SonarMSMSでの検索結果力も求めて、ペアとなるピークを探し、そのピーク強度比を 自動計算した。このように構築した、本発明に係る解析ソフトウェアを用いてタンパク 質の同定およびピーク強度比の算出を行った。また、サンプル中に存在し、かつ、質 量分析により同定されていて、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質に存在しな ヽタンパク質につ ヽては、そのペプチドが同定された質量分析スぺ タトルと同じ又は近い Scan番号に存在する、代謝的に同位体標識された生体分子で ある内部標準物質由来のペプチドピークとのピーク強度比を求めた。続いて野生型 マウスの^ I と ADAM22遺伝子を欠損させたマウスの^ | との間で可溶性画分に含 まれるタンパク質量について、先に求めたピーク強度比を比較することで算出した。
[0187] 図 19一図 22は、本発明による実施例 5にて得られたタンパク質の同定結果を示す その結果、複数の生体分子 (f列えば、 protein phosphatase 2a, myotrophin, heat shock protein 1, protein phosphatase PP2A, glyceraldehyde— 3— phosphate dehydrogenase, ADP— ribosylation factor, cofilin, tubulin— beta等)力 S同疋 れ、後 述するように、網羅的に相対定量することができた。 [0188] 図 23ないし 26は、前述のタンパク質の同定結果に基づき、本発明による波形分離 処理を施した、固有なタンパク質に由来する波形面積の比の結果を示す。
ロイシンを含むタンパク質を例として、本発明に係るプロテオーム解析にっ ヽて説 明する。図 19に示す、 protein phosphatase 2aに由来するタンパク質の質量分析結 果より、 m/z値が 644. 7の同位体標識されていないロイシンを含むタンパク質に由来 するピークに着目した（図 19中にて Lで示される)。なお、本ピークがロイシンに由来 するものであることは、前述の MS/MS処理力も判明している。つまり、前述の説明に て、図 10に示す工程 S200— S203は、既に実行されている。
[0189] 図 23は、時間、つまり、特定の連続したスキャン番号における質量分析スペクトル を示す図である。図 23に示す結果から、 644. 7である m/z値がスキャン 2で極大を むかえ、その後、減衰していることが、ピークの高さの変動から分かる。
[0190] 図 24は、図 23に示すスキャン番号を、必要な数だけ連続してつなぎ合わせた結果 のマスク口マトグラムを示す。具体的には、図 24は、中心を 644. 7として（m/z値： 64 4. 2— 645. 2)、スキャン番号 975— 1005までの質量分析スペクトルをつなぎ合わ せて作成したマスク口マトグラムを示す。
[0191] 以上の操作は、前述の解析ソフトにより、必要なスキャン情報を呼び出して実行す ることは可能であることは、当業者には容易に理解できる。
[0192] 次に、同位体標識されたロイシンを含むタンパク質に由来するピークに着目した。こ の場合、同位体標識されたロイシンは、非標識のタンパク質よりも 6/zだけ分子量が 大きい。ここで、 zとは、タンパク質が有する電荷のことである。図 19に示す質量分析 スペクトルの結果から、図 10の工程 S204にて、電荷が 3である protein phosphatase
2aの同位体標識されたロイシンに由来する質量分析スペクトルの m/z値力 644. 7 + 6/3 = 646. 7の質量分析スペクトルのピークに着目し、実測された質量分 析スペクトル力も抽出した（図 10の工程 205)。なお、図 19中において、同位体標識 されたロイシンを含むタンパク質に由来する質量分析スペクトルを Hで表示する。
[0193] 図 25は、図 23に示すスキャン番号を、必要な数だけ連続してつなぎ合わせた結果 のマスク口マトグラムを示す。具体的には、図 24は、中心を 646. 7として（m/z値： 64 6. 2— 647. 2)、スキャン番号 975— 1005までの質量分析スペクトルをつなぎ合わ せて作成したマスク口マトグラムを示す。
[0194] 通常、特定の m/z値におけるマスク口マトグラムは、単一のロイシンを含むタンパク 質に由来するものであるならば、単一のピークが観測されるはずである。しかしながら 、図 24および図 25に示す結果から、複数のピークが観測された。
[0195] そこで、本発明において、固有のタンパク質に由来するマスク口マトグラムを得るた めに、図 24および図 25で得られた質量分析スペクトルの波形分離処理を、図 10の 工程 S206にて、以下のように行った。すなわち、ガウシアン関数とローレンツ関数と を組み合わせて曲線適合法により、波形分離処理を実行した。
[0196] 図 26は、本発明による波形分離処理の結果を示す。図 26中の（A)は、図 19に示 す野生型マウス脳（Wild)由来の protein phosphatase 2aの Lで表示されるマスクロマ トグラムの波形分離処理の結果であり、一方、図 26中の（B)は、図 19に示す野生型 マウス脳（Wild)由来の同位体標識された protein phosphatase 2aの Hで表示される マスク口マトグラムの波形分離処理の結果である。実測された L及び Hのマスク口マト グラムは、各々、 5つの固有のタンパク質に由来するマスク口マトグラムの重ね合わせ であることが判明した。
[0197] 図 26 (A)に示す波形分離後の波形 1ないし波形 5において、各波形の面積を、積 分により算出することができる。同様に、図 26 (B)においても、波形分離後の波形 6 ないし波形 10において、各波形の面積を、積分により算出することができる（図 10の 工程 S 207)。
[0198] 必要に応じて、以上の説明力も得られた解析結果を、図 9に示す記録部 100に保 存をすることができる。このように算出した波形面積を、同位体標識したアミノ酸を含 むタンパク質由来の波形と、同位体非標識のアミノ酸を含むタンパク質由来の波形と の比を観測することにより、細胞中で発現されている、アミノ酸配列を同定した特定の タンパク質の経時変化を、同位体標識されたアミノ酸を含むタンパク質との比から、定 量的に追跡することが可能となる。
[0199] 図 27は、本発明の解析方法により得られた結果を示す図である。図 27では、代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来のピークに対する野生型 マウス脳 (Wild)由来および ADAM22遺伝子欠損マウス脳（K/0)由来のピーク強度 比を算出するにあたって、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質由来の同一配列のピークを用いた場合および別の配列のピークを用いた場合に おいて、野生型マウス脳 (Wild)由来および ADAM22遺伝子欠損マウス脳（Κ/Ο)由 来のピーク強度比の比較したものを示す。
絶対定量ができることを確認するために以下の実験を行った。
[0200] [実施例 5]代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中 の HSP60の定量（ELISAで定量した例）
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の HSP60 の定量は、 Hsp60 ELISA Kit (Stressgen社、 EKS- 600)を用いて行った。実施例 1で 得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を PBS (Sigma社、 D-8537)で洗浄し、細胞 3.75xl07個を Hsp60 ELISA Kitに添付され ている溶解液 3mLで溶解して、その遠心上清を可溶性画分とした。以下、定量操作 は Hsp60 ELISA Kitの説明書にしたがって行った。その結果、可溶性画分中の HSP60濃度は 480ng/mLと求められた。よって、代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質を含む細胞 3.75xl07個には 1440ngの HSP60が存在することが算 出された。
[0201] この値を元に、野生型マウス脳中の HSP60の定量を行った。脳 lgから抽出されたタ ンパク質量は 39.4mgであり、同タンパク質量の代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質を含む細胞（12.1X107個）を加えたので (実施例 2)、サンプルに 加えた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の HSP60量とし ては、 12.1χ107個 X 1440 ng/3.75xl07個 = 4636ngとなる。一方、質量分析における 野生型マウス脳由来の HSP60 (配列 LPDGVAVLK)と代謝的に同位体標識された生 体分子である内部標準物質由来の HSP60のピーク強度比は、 6.8であった。よって、 野生型マウス脳 1 gあたり 4636ng X 6.8 = 約 32 gの HSP60が存在したことが算出さ れた。
[0202] したがって、この代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞を用いることによって、質量分析による測定において、絶対定量を行うことができ ることが明らかになった。 [0203] [実施例 6]代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞 中の cMDHの定量 (精製酵素標品の比活性を指標にした例）
実施例 1で得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含 む細胞 1.9 107個を\1-?51? (^61^社、 78501) lmLにて溶解しその遠心上清を可溶性 画分とした。
[0204] <標準物質の調製 >
標準物質として用いる cMDHは、以下のようにして調製した。ヒト cMDH遺伝子をクロ 一ユングし、その N末端側に FLAGタグを挿入したものを、バキュロウィルスベクターに 組み込んだ。そして、そのベクターを持つバキュロウィルスを、 S19細胞に感染させて 培養した。培養した細胞を遠心分離で回収し、その沈殿を- 80°Cで凍結後再融解し、 25mLの PBSで懸濁させて cMDHを抽出した。抽出後、不溶性画分を遠心分離により 除去し、その上清を粗抽出液とした。 cMDHの精製は、 Anti FLAG M2 Agarose ( Sigma社、 A-2220) 1.5mLに粗抽出液をアプライし、 10mLの PBSで洗浄した後に、 5mL の FLAG PEPTIDE (Sigma社、 F- 3290)溶液（0.1mg/mL in PBS)で溶出した。溶出 主画分のタンパク質濃度は、 0.4mg/mLであった。この画分を標準 cMDH標品として 定量に用いた。
[0205] <比活性の測定 >
cMDH活性の測定は、以下の反応用溶液に cMDH溶液 1 μ Lを加え、 NADHに由来 する 340應の吸光度の減少を、分光光度計 (アマシャムバイオサイエンス社、 Ultrospec 4300 pro)を用いて経時的に測定し、 1分間あたりの吸光度の減少を cMDH活性とした。その結果、 cMDH濃度 0.02mg/mLの溶液 1 μ Lを用いたときの吸光 度の減少が 0.068/分、可溶性画分 1 μ Lを用いたときの吸光度の減少が 0.057/分で めつに。 反応用緩衝液 10mM Tris-HCl(pH7.4)-0.15M NaCl 0.98mL ォキザ口酢酸（和光純薬、 Lot.SEH1972) 10mM水溶液 O.OlmL
NADH (Sigma社、 Lot.l02K701) lOmM水溶液 O.OlmL
反応用溶液 1 mL この測定結果から、以下のように、野生型マウス脳中の cMDH濃度を定量した。 可溶性画分中のタンパク質量は 6.2mg/mLである（実施例 1)。また、可溶性画分中の 溶液に対する cMDH濃度は 0.057/0.068 x 0.02mg/mL = 0.0167mg/mLである。よ つて、可溶性画分中のタンパク質量に対する cMDH濃度は、 0.0167/6.2 =
0.0027mg/mg、と算出される。
[0206] また、質量分析による測定 (実施例）における野生型マウス脳由来の cMDHと代謝 的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来の cMDHとのピーク強度 比は約 2.0であった (表 lWild)。よって、野生型マウス脳由来の可溶性画分中のタン パク質量に対する cMDH濃度は、 0.0027 x 2 = 0.0054mg/mgとなる。また、野生型 マウス脳 lgあたり 39.4mgのタンパク質を含んでいる（実施例 2)。したがって、野生型 マウス脳 lgあたり 39.4 X 0.0054 = 0.21mgの cMDHが存在したことを算出できた。
[0207] したがって、この代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞を用いることによって、質量分析による測定において、絶対定量を行うことができ ることが明らかになった。
[0208] [実施例 7]生体分子の絶対定量 (合成ペプチドを用いた例）
実施例 1で得られた代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含 む細胞 1.9xl07個を、 M-PER (Pierce社、 78501) lmLで溶解しその遠心上清を可溶性 画分とした。
<合成ペプチドの調製 >
以下に掲げる 5種類の合成ペプチドは、ペプチド研究所株式会社 (大阪）に依頼し標 品を得た。 SQIHDIVLVGGSTR(heat shock 70kDa protein 8 isoforml),
HFSVEGQLEFR (heat shock protein 90- beta), HLIPAANTGESK(14- 3- 3 epsilon), SYELPDGQVITIGNER (mutant beta- actin (betaし actnv,
ELEAELEDER(Myosin heavy chain, nonmuscle type B)。これら合成ペプチド各 2pmolを先の可溶性画分に添加した。可溶性画分 (990ng/mL)と合成ペプチド (91nmol/mL)の混合溶液 3mLを LC/MSMS (アプライドネ土製 QSTAR PULSAR i)により 測定した。測定条件は以下の通りである。 [0209] < LC条件 >
オートサンプラー： HTS- PAL(CTC Analytica社製）
ポンプおよびコントローラー： LC-lOAvp 2台（高圧グラジェントシステム）
，SCL- ΙΟΑνρ (島津製作所製）
フロースプリツター： 3方ティー（GLサイエンス社製）に抵抗管（内径 25 μ m長さ l50mm のフューズドシリカキヤビラリ一、 GLサイエンス社製）をつけたもの。
カラム：エレクトロスプレー用ニードル（New Objective社製、内径 0.1mm, 長さ
150mm,先端径 8 μ m、導電物質被覆なし）に逆相系充填剤（ReproSil- Pur 120
C18-AQ, Dr.Maisch社製）をスラリー充填したもの。
移動相： (A) 0.5%酢酸水溶液、（B) 0.5%酢酸水溶液, 80%ァセトニトリル
流速： 0.06mL/min (ポンプ出力値）、 250nL/min (スプリット後）
グラジェント溶出条件：
[0210] [表 2]
Figure imgf000074_0001
測定時間： 110分
質量分析条件： ESIインターフェース： nanoelectrospray用（プロタナ社製）
MS スキャン: 350- 1400 amu, 1.0秒
MSMS スキャン: 1回の MSスキャンにっき最大 4回， 85-1400 amu, 各 1.5秒、 測定時間： 110分
スプレー電圧： 2400V
[0211] ペプチド配列の同定は、 MS/MSスペクトルをデータベース検索エンジン
Mascot(MatrixScience, London)に出力して行った。タンパク質データベースには NCBIタンパク質データベース（http：〃 www4.ncbi.nlm.nih.gov/)を用いた。定量は質 量分析スペクトル上のピーク強度比を用いて行った。可溶性画分中の代謝的に同位 体標識された生体分子は、ロイシンが安定同位体13 Cx6個で標識されているため、添 カロした合成ペプチド由来のピークと質量分析スペクトル上において、容易に区別でき る。
[0212] また、ピーク強度比力も計算した値を基に、可溶性画分中に存在していた各タンパ ク質の絶対量にっ 、て表 3に示した (右端 wt%：可溶性画分中に含まれて 、る割合） [0213] [表 3]
Protein Peptide Ratiodabeレ unlabel: ProteinCfmoi/uL) MW(kD) ng/uし Wt% heat shock 70kDa protein 8 isoforrr SQIHDIVLVGGSTR 1.36 123.64 70.97 8.77 0.88 heat shock protein 90-beta HFSVEGQLEFR 1.65 150.00 83.42 12.51 1.26
14-3-3 epsilon HLIPAANTGESK 0.24 21.82 29.32 0.64 0.06 mutant beta-actin (beta'-actin) SYELPDGQVITIGN 3.47 315.45 41.98 13.24 1.34
Myosin heavy chain, nonmuscle tyf ELEAELEDE 0.058 5.27 229.48 1.21 0.12
[表 3] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質に発現していた 各タンパク質の絶対量につ 1、て測定結果を表す。
一方、実施例 4に示したように、野生型マウス脳由来のタンパク質と代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質由来の当該タンパク質とのピーク強度比 が求められる。そして、野生型マウス脳と代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞は、それぞれタンパク質量が同じになるように混ぜて測定 している（実施例 4)。また、マウス脳 lgあたりのタンパク質量は、 39.4mgである（実施 例 2)。よって、マウス脳 lgに含まれている絶対量は表 4のように算出することができた
[0215] したがって、この代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞を用いることによって、質量分析による測定において、絶対定量を行うことができ ることが明らかになった。
[0216] [表 4]
Figure imgf000076_0001
[表 4] 野生型マウス脳および ADAM22遺伝子欠損マウス脳中の各タンパク質の絶 対量につ ヽて測定結果を表す。
[0217] 以上のように、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細 胞中の各タンパク質について絶対定量しておくことによって、網羅的に生体分子を絶 対定量することができた。
[0218] 次に、実施例 4にて得られた波形分離後の質量分析スペクトルに関するデータ、特 に、定量値の値と、機能情報との関連付けについて説明する。
[実施例 8] まず、実施例 4で例示したように、波形分離後の一つ又は複数の配列に着目した。 図 28は、本発明の一の実施例において着目した波形分離後の配列と、その配列の 定量値を示す図である。具体的には、本実施例では、（1)
ALVLELCCNDESGEDVEVPWRゝ
(2) KPLLESGTLGTK, (3) NFPNAIEHTLQWAR, (4) YFLVGAGAIGCELLK,の 4 つの配列に着目した。また、図 28に示す定量値は、力かる配列毎の値を表す。なお 、同位体標識は、安定同位体で標識された L-Leudneを用いて行われた。図 28に示 すように、配列： NFPNAIEHTLQWAR および配列： YFLVGAGAIGCELLKには、同 一のペプチドに対して複数の定量値が算出されている。
[0219] 図 28に示すペプチド配列に基づき、外部データベース、具体的には、 NCBInrデー タベースへ照合し、かかるデータベースにて、 HomoSapiensにてパターン検索を実行 した。その結果、検索対象である各配列に対して同定タンパクの GiNoが得られた（図 29参照）。検索対象とした全ての配列において、（l) giI23510340IreflNP_695012.1I、 (2) giI35830IembICAA40296.1I、 (3) giI24485IembICAA37078.1Iが同定された。この 3つの GiNoに対して、 LocusLinkにて検索すると、 LocusID = 7317に集約された。こ の LocusIDに対して、図 30に示す結果が得られた。
[0220] 一方、 LocusID = 7317のタンパク質について、 L- Leucineにて同位体標識された 場合の、（LocusID = 7317のタンパク質の波形面積)/ (同位体標識された LocusID = 7317の波形面積）の定量値は、 1.10726332649であった。この値は、図 28に示す 各ペプチド配列にて得られた値とは相違する力 タンパク質の定量値として採用し、 各タンパク質毎に、この定量値を用いれば、機能が公知のタンパク質と定量値の関 連付けをすることができる。なお、本発明では、質量分析のために、予めサンプルを 酵素等で消化させ分解して 、るため、実際にタンパク質自体の質量分析スペクトル は測定されていない。しかし、タンパク質自体の質量分析スペクトルが測定されたと 仮定した場合、タンパク質の定量値と生物学的機能との関連性を示唆する情報を提 供することができる。
[0221] [実施例 9]
<合成ペプチドの調製 > 以下に掲げる 114種類の合成ペプチドのうち、 8種類はペプチド研究所株式会社（ 大阪）から入手した。残り 106種類（少なくとも 1つの Leu,ひとつの Tyrを含むもの）は、 島津 PSSM-8ペプチド合成機を用いて自家合成した。合成法および切り出し法は装 置に付属の F-moc用プロトコールに従った。以下に示す HPLC条件で分画した後、目 的画分の質量数を MSで確認した。さらに目的画分を HPLC- UV(280nm)で分析し、主 ピークのピーク面積と Tyrのモル吸光係数より溶液濃度を算出した。
く分取 HPLC条件〉
LCシステム (オートサンプラー、ポンプ、 UV検出器、フラクションコレクター、コント口 一ラー）： LClOAvp (島津製作所製）
カラム： YMC- Pack Pro C18 (10mm径、 150mm長）
移動相： (A) 0.1%トリフルォロ酢酸水溶液、（B)ァセトニトリル
流速： 4mL/min
検出器波長： 220 nm
グラジェント溶出条件：
[表 5]
Figure imgf000078_0001
測定時間: 20分
<分析 HPLC条件 >
流速、カラム径、検出器波長以外上記と同じ, カラム： YMC- Pack Pro C18 (4.6mm径、 150mm長）
流速： lmL/min
検出器波長： 280 nm
[0224] こうして得られた合成ペプチド各 2 pmolを先の可溶性画分に添加した。可溶性画分 (990 ng/mL)と合成ペプチド (91 nmol/mL)の混合溶液 3 mLを LC/MSMS (アプライド 社製 QSTAR PULSAR i)により測定した。さらに、合成ペプチド含量を 5倍および 5分 の 1にした混合溶液を調製し、同様に測定した。測定条件は以下の通りである。
[0225] [表 6]
Figure imgf000079_0001
測定時間： 110分
MS条件：
ESIインターフェース： nanoelectrospray用（プロタナ社製）
MSスキャン： 350-1400 amu, 1.0秒
MSMSスキャン： 1回の MSスキャンにっき最大 4回， 85-1400 amu,各 1.5秒、 測定時間： 110分
スプレー電圧： 2400V [0227] ペプチド配列の同定は、 MS/MSスペクトルをデータベース検索エンジン
Mascot(Matrix Science, London)に出力して行った。タンパク質データベースには SwissProtタンパク質データベース（http：〃 kr.expasy.org/sprot/)を用いた。定量は 質量分析スペクトル上のピーク強度比を用いて行った。可溶性画分中の代謝的に同 位体標識された生体分子は、ロイシンが安定同位体13 Cx6個で標識されて 、るため、 添加した合成ペプチド由来のピークと質量分析スペクトル上において、容易に区別 できる。
[0228] また、ピーク強度比力も計算した値を基に、可溶性画分中に存在して!/ヽた各タンパ ク質の絶対量について表 4に示した（右端 Cone in neuro2a: neuro2a可溶性画分タン ノ ク質 lmg当たりに含まれて 、る割合)。
[0229] [表 7]
[8¾
Figure imgf000081_0001
OZ JO/tOOZdf/IDd 6Z 88T0S0/S00Z OAV
Figure imgf000082_0001
[Οΐ挲]
Figure imgf000083_0001
L£Ll0/P00Zdr/13d 88T0S0/S00Z OAV
Figure imgf000084_0001
L£Ll0/P00Zdr/13d 38 8810S0/S00Z O
Figure imgf000085_0001
[表 7から表 11] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質に発現 して 、た各タンパク質の絶対量にっ 、て測定結果を表す。
一方 実施例 4に示したように、野生型および ADAM22ノックアウトマウス脳由来のタ ンパク質と代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来の当該タ ンパク質とのピーク強度比が求められる。そして、マウス脳と代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質を含む細胞は、それぞれタンパク質量が同じにな るように混ぜて測定しており、重量混合比は既知である（実施例 4)。よって、マウス脳 lmgに含まれている絶対量は表 8のように算出することができた。したがって、この代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を用いることによ つて、 MSによる測定において、絶対定量を行うことができることが明らかになった。
[表 12]
Accession Cone in Neuro2a Cone in Brain wild Cone in Brain
Protein Name Peptide sequence
number (pmol/mci) type {pmol/mat (ADAM22-ko)
P35215 14-3-3 protein zeta/delta (Protein kinase C inhibi NLLSVAYK 180.9 326.54 254.51
P10B52 4F2 cell-surface antigen heavy chain ( F2hc) YLWLNFR 10.3 6.63 6.66
P57780 Alpha-actinin 4 (Non-muscle alpha-actinin 4) (F-actin cross linking protein) HRPELIEYDK 4.6 3.88 3.40
P05201 Aspartate aminotransferase, cytoplasmic (EC 2.6.1.1) (Transaminase A) VNLGVGAYR 6.3 7.49 7.02
P05202 Aspartate aminotransferase, mitochondrial precursor ILIRPLYSNPPLNGAR 19.5 13.18 12.06
Q91V92 ATP-citrate synthase (EC 2.3.3.8) (ATP-citrate (pro-S-)-lyase) (Citrate cleavage enzyme) DGVYILDLAAK 19.4 9.08 10.47
P48975 Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin). SYELPDGQVITIGNER 572.9 645.73 617.19
P51B81 ADP.ATP carrier protein, fibroblast isoform YFPTQAし NFAFK 125.4 120.20 121.35
P05064 Fructose-bisphosphate aldolase A (EC 4.1.2.13) LQSIGTENTEENR 99.8 119.89 88.97
Q61024 Asparagine synthetase (glutamtne-hydrolyzing] (EC 6.3.5.4) ELYLFDVLR 19.4 5.70 5.09
Q03265 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor HALIIYDDLSK 70.5 73.05 65.91
P56480 ATP synthase beta chain, mitochondrial precursor (EC 3.6.3.14) VALTGLTVAEYF 79.8 88.57 69.58
Q9DCX2 ATP synthase D chain, mitochondrial (EC 3.6.3.14) VTALVDQEE 13.1 13.35 13.91
Q06647 ATP synthase oligomycin sensitivity conferral protein YATALYSAASK 37.1 47.47 40.14
Q91V12 C tosolic acyl coenzyme A thioester hydrolase (EC 3.1.2.2) VLEVPPIVYLR 10.8 15.80 12.60
Q64433 0 kDa heat shock protein, mitochondrial (Hsp10) (10 kDa chaperonin) (CPN10) DYFLFR 41.0 20.14 20.19
P11442 Clathrin heavy chain. ALEHFTDLYDIK 26.1 49.56 48.33
P 18760 Cofilin, non-muscle isoform YALYDATYETK 49.6 80.12 71.98
P14211 Calreticulin precursor (CRP55) (Calregulin) FYALSAK 54.2 3771 31.45
Q9JIK5 Nucleolar RNA helicase II (Nucleolar RNA helicase STYEQVDLIGK 14.3 ND ND
Q91VC3 Probable ATP-dependent helicase DDX48 (DEAD-box protein 48) LDYGQHWAGTPGR 4.6 ND ND
Q62167 DEAD-box protein 3 (DEAD-box RNA helicase DEAD3) (mDEAD3) (Embryonic RNA helicase) YLVLDEAD 6.8 3.17 3.20
Q61656 Probable RNA-dependent helicase p68 (DEAD-box protein p68) (DEAD-box protein 5) NFYQEHPDLA 14.8 ND ND
070133 ATP-dependent RNA helicase A (Nuclear DNA helicase II) (NDH II) (DEAH-box protein 9) DFVNYLVR 9.7 ND 4.46
Q62188 Dihydropyrimidinase related protein-3 (DRP-3) IFNし YPR 14.3 22.74 23.42
P20001 Elongation factor 1 -alpha 1 (EF-1-alpha-1) EHALLAYTLGVK 413.5 197.82 214.17
mm
Figure imgf000088_0001
Figure imgf000088_0002
L£Ll0/P00Zdr/13d 98 88T0S0/S00Z OAV [ST¾
Figure imgf000089_0001
oz.ez.io/i700idfx3d Z8 8810S0/S00Z OAV [ ]
Figure imgf000090_0001
L£Ll0/ 00ZdT/13d 88 88T0S0/S00Z OAV
Figure imgf000091_0001
[表 12から表 16] 野生型マウス脳および ADAM22遺伝子欠損マウス脳中の各タン パク質の絶対量につ!、て測定結果を表す。
[0232] 以上のように、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細 胞中の各タンパク質について絶対定量しておくことによって、網羅的に生体分子を絶 対定量することができた。
産業上の利用可能性
[0233] 本発明により、代謝的に標識することができないサンプルを含む、組織、生体液、 細胞、細胞器官、タンパク質複合体などのサンプル中の 1若しくは複数の生体分子を 精度よく定量することが可能となった。
[0234] すなわち、従来の in vivo標識法では、培養条件に影響を受けないような限られた 細胞でしか実施できなかったが、本発明では、代謝的に同位体標識された生体分子 である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質 を含む細胞をサンプルに加えるため、培養できる細胞に限られることなぐ代謝的に 標識することができないサンプルを含む、組織、生体液、細胞、細胞器官、タンパク 質複合体などのサンプル中の 1若しくは複数の生体分子を定量することが可能となつ た。
[0235] また、従来の in vitro標識法では、サンプルの消ィ匕、分画、精製など前処理段階で の実験ごとに定量値が変動することの補正はできな力つたが、本発明では、サンプル の消化、分画、精製などを行う前に代謝的に同位体標識された生体分子である内部 標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細 胞を加えるため、サンプル中の 1若しくは複数の生体分子を精度よく定量することが 可能となった。
[0236] 本発明により、 3個以上のサンプル間の比較が容易になった。すなわち、これまで の定量的プロテオーム解析法は、内部標準物質と被検体とを直接比較して 、たため 、測定のたびにサンプル調製を行う必要があった。さらに、測定対象が変わると標識 すべき内部標準物質も変わるため、その都度、標識についての条件検討を行う必要 があり、また、実験間の比較もできな力つたが、本発明では、代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を保存し、適宜、用いることにより、実験間のデータ比較、 例えばある実験データに対し、一定期間経過後（例えば、 1ヶ月後、 1年後等）に比較 データを得て解析することが可能となる。さらには、使用した代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を譲渡又は貸し渡しすることにより、今まで不可能であった 研究者間のデータ比較が可能となる。
[0237] 本発明により、あらかじめ代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物 質又は代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の 生体分子の濃度を算出しておくことにより、生体分子の絶対定量が可能となった。代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質、又は代謝的に同位体標識 された生体分子である内部標準物質を含む細胞を譲渡又は貸し渡しすることにより、 研究者間のデータ共有ィ匕が可能となる。
[0238] さらに、本発明による解析装置および解析方法によれば、固有の生体分子に由来 する質量分析スペクトルを得ることができ、生体内の細胞で時々刻々変化する生体 分子の発現量を定量的に解析することが可能となる。さらにまた、本発明によるプロ グラムにより、前記解析方法を、コンピュータに実現させることができる。
[0239] くわえて、本発明によれば、タンパク質における（同位体非標識のタンパク質)/ (同 位体標識されたタンパク質)と 、う定量値と機能情報とを関連付けることが可能となる
[0240] 従来の方法 (AQUA法)では、サンプルに対して、合成ペプチドを添加するため、分 画、抽出、精製、消化 (特にゲル内消ィ匕）の過程におけるタンパク質の回収率の低さ により、精度のよい定量値が得られな力つた。一方、本発明の方法では、サンプルに 対して、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質または代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加するため、分画、 抽出、精製、消化 (特にゲル内消化)の過程におけるタンパク質の回収率の影響を受 けず、精度よく再現性の高い定量値を得ることが可能となった。
[0241] また、従来の方法では、サンプルに対して、合成ペプチドを添加するため、定量で きるペプチドは、合成ペプチドと同一の配列を有するペプチドのみである。そのため 、当該ペプチドの測定結果の誤差により、タンパク質の定量値が大きく影響を受ける こととなる。一方、本発明の方法では、代謝的に同位体標識された生体分子である内 部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む 細胞中の生体分子を定量しておき、サンプルに対して、当該代謝的に同位体標識さ れた生体分子である内部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子であ る内部標準物質を含む細胞を添加するため、定量できるペプチドは、合成ペプチドと 同一の配列を有するペプチドのみならず、当該ペプチドが構成して 、たタンパク質 由来のその他のペプチドについても定量することができる。そのため、一つのタンパ ク質に対し、複数のペプチドによって定量するため、個々のペプチドの測定結果の 誤差により、タンパク質の定量値が大きく影響を受けることがなぐ精度よく再現性の 高い定量値を得ることが可能となった。
[0242] さら〖こは、ペプチド合成機は、 10倍過剰量の試薬を用い、し力も合成スケールがマ イクログラム力もミリグラム単位となる。そのため、同位体標識されたペプチドの合成は 、非常に高価となり、従来の方法で網羅的な定量することはコストの面で難しい。一 方、本発明の方法では、生体分子の同位体標識は、細胞培養によって行うので、ごく 微量でも効率がよく生成することができる。また、代謝的に同位体標識された生体分 子である内部標準物質または代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準 物質を含む細胞中の生体分子を定量するための合成ペプチドは、同位体を必要とし な 、通常のペプチド合成で対応できるので、網羅的な定量方法として適して 、る。 図面の簡単な説明
[0243] [図 1]従来技術による定量法を表したものを示す。
[図 2]本発明による定量法を表したものを示す。
[図 3]本発明による生体分子の定量的解析方法の概略的な全体スキームを示す。
[図 4]本発明による同位体標識を利用する測定サンプル調製の一の態様のスキーム を示す。
[図 5]質量分析後、本発明による解析方法のスキームを示す。
[図 6]典型的な質量分析装置にて得られる質量分析スペクトルを示す。
[図 7]単一の m/zの値におけるマスク口マトグラムに対して、複数のピークが重なって
V、る一例のスペクトルを示す。 圆 8]図 7に示したスペクトルを、本発明にて用いた波形分離処理により分離された波 形スペクトルを示す。
圆 9]本発明が適用される解析システムの構成の機能ブロック図の一例を示す。 圆 10]本発明に係る解析方法を実行するプログラムを、概念的に表すフローチャート である。
圆 11]本発明に用いる制御部の詳細な構成を示す機能ブロック図である。
[図 12]本発明の第一の態様における方法を実行するためのプログラムの工程図を示 す。
圆 13]本発明で用いる外部データベースを利用した機能情報の取得に関するスキー ムを示す。
[図 14]本発明における波形分離後のペプチドのマスク口マトグラムの結果に基づき、 機能情報の付加を行う方法を実行するための工程図を示す。
[図 15]図 15は、波形分離をせずに、ペプチドの質量分析スペクトルの結果に基づき
、機能情報の付加を行う方法を実行するための工程図を示す。
[図 16]cMDHについて、野生型マウス脳由来および代謝的に同位体標識された生体 分子である内部標準物質由来の質量分析スぺ外ルを示す。
圆 17]cMDHについて、野生型マウス脳由来および代謝的に同位体標識された生体 分子である内部標準物質由来の質量分析スペクトルの比における用量依存性を表し たものを示す。
[図 18]cMDHにつ 、て、質量分析による野生型マウス脳由来および代謝的に同位体 標識された生体分子である内部標準物質由来の発現量における理論上の比と実際 に測定した比とをプロットしたものを示す。
[図 19]protein phosphatase 2aおよび myotrophinについて、野生型マウス脳（Wild) 由来 )および代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来 (H) の質量分析スペクトル、ならびに ADAM22遺伝子欠損マウス脳（K/0)由来（L)およ び代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来 (H)の質量分析ス ぺクトノレを示す。
[図 20]protein phosphatase PP2Aおよび heat shock protein 1について、野生型 マウス脳 (Wild)由来 (L)および代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質由来 (H)の質量分析スペクトルならびに ADAM22遺伝子欠損マウス脳 (K/0) 由来 )および代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来 (H) の質量分析スペクトルを示す。
[図 21]giyceraldehyde- 3- phosphate denydrogenaseおよび ADP- ribosylation factor について、野生型マウス脳 (Wild)由来 (L)および代謝的に同位体標識された生体分 子である内部標準物質由来 (H)の質量分析スペクトルならびに ADAM22遺伝子欠損 マウス脳 (K/0)由来 )および代謝的に同位体標識された生体分子である内部標 準物質由来 (H)の質量分析スペクトルを示す。
[図 22]cofilinおよび tubulin- betaについて、野生型マウス脳（Wild)由来（L)および代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来 (H)の質量分析スぺク トルならびに ADAM22遺伝子欠損マウス脳 (K/0)由来 )および代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質由来 (H)の質量分析スぺ外ルを示す。
[図 23]時間、つまり、特定の連続したスキャン番号における質量分析スペクトルを示 す図である。図中における Lとは、同位体標識されていないロイシンを含むタンパク質 に由来するピークを指す。
[図 24]中心を 644. 7とする、 644. 2— 645. 2の幅での m/z値におけるスキャン番号 975— 1005でのマスク口マトグラムを示す図である。
[図 25]中心を 646. 7とする、 646. 2— 647. 2の幅での m/z値における、スキャン番 号 975— 1005でのマスク口マトグラムを示す図である。図中における Hとは、同位体 標識されたロイシンを含むタンパク質に由来するピークを指す。
[図 26]本発明による波形分離処理の結果を示す。図 26中の (A)は、図 19に示す L で表示されるマスク口マトグラムの波形分離処理の結果を示し、一方で、図 26中の（ B)は、図 19に示す Hで表示されるマスク口マトグラムの波形分離処理の結果を示す 圆 27]代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質由来のピークに対 する野生型マウス脳 (Wild)由来および ADAM22遺伝子欠損マウス脳 (K/0)由来の ピーク強度比を算出するにあたって、同位体標識された生体分子である内部標準物 質由来の同一配列のピークを用いた場合および別の配列のピークを用いた場合に おいて、野生型マウス脳 (Wild)由来および ADAM22遺伝子欠損マウス脳（K/0)由 来のピーク強度比の比較した結果を示す。
圆 28]本発明の一の実施例において着目した波形分離後の配列と、その配列の定 量値を示す図である。
[図 29]本発明の一の実施例において、 NCBInrデータベースの HomoSapiensにてパタ ーン検索を行った結果、各配列に対して同定されたタンパクの GiNoの一覧を示す図 である。
圆 30]本発明において、波形分離後の質量分析データを、データベースを利用して 解析した結果の一例を示す図である。

Claims

請求の範囲
[1] サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は代 謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、加えることを 特徴とする質量分析計によるサンプル中の生体分子を定量する方法。
[2] サンプル中の 1又は複数の生体分子を定量する方法であって、
同位体標識された生体分子の前駆体を加えて培養し、代謝的に同位体標識された 生体分子である内部標準物質を、又は代謝的に同位体標識された生体分子である 内部標準物質を含む細胞を、サンプルに添加する工程と、
当該各サンプルから生体分子を抽出し分画する工程と、
当該分画した各生体分子を質量分析装置により分析する工程と、
質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を定量 する工程と、
を含む、生体分子を定量する方法。
[3] 各サンプル間の該ピーク強度比を比較し、生体分子を相対定量する、請求項 1また は 2に記載の方法。
[4] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の、又は代謝的に同 位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分子が既知量で ある、請求項 1な 、し 3の 、ずれか一項に記載の方法。
[5] 定量が絶対定量である、請求項 1ないし 4のいずれか一項に記載の方法。
[6] サンプル中の 1または複数の生体分子を定量する方法であって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、また は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を、添カロ する工程と、
(2)当該サンプル中の各生体分子を質量分析する工程と、
(3)質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
(4)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、 を含む、サンプル中の 1または複数の生体分子を定量する方法。
[7] サンプルから生体分子を抽出し分画する工程をさらに含む、請求項 6に記載の方 法。
[8] 同位体標識された生体分子の前駆体を加えて培養し、生体分子を代謝的に同位 体標識する工程をさらに含む、請求項 6または 7に記載の方法。
[9] 複数のサンプルにつ 、て行 、、各サンプル間の各生体分子のピーク強度比を比較 する工程をさらに含む、請求項 6ないし 8のいずれか一項に記載の方法。
[10] サンプル中の 1または複数の生体分子を絶対定量する方法であって、
代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の生体分子、または、 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分 子が、既知量である、請求項 6ないし 9のいずれか一項に記載の方法。
[11] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の生体分子を、また は、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体 分子を、絶対定量する工程をさらに含む、請求項 6ないし 10のいずれか一項に記載 の方法。
[12] 請求項 11に記載の工程が、
(a)同位体非標識の合成ペプチドを、代謝的に同位体標識された生体分子である内 部標準物質、または、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を 含む細胞に添加する工程と、
(b)当該代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質または代謝的に 同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞力 生体分子を抽出し 分画する工程と、
(c)当該分画した各生体分子を質量分析する工程と、
(d)質量分析の情報から当該生体分子を同定する工程と、
(e)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 絶対定量する工程と、
を含む、請求項 11に記載の方法。
[13] サンプルが、代謝的に標識できな!/、サンプルである、請求項 1な!、し 12の 、ずれか 一項に記載の方法。
[14] サンプルが、細胞培養によって標識できな!/、サンプルである、請求項 1な!ヽし 13の
V、ずれか一項に記載の方法。
[15] 生体分子がタンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ力 なる 群から選択される!、ずれかの分子である、請求項 1な!ヽし 14の ヽずれか一項に記載 の方法。
[16] 生体分子がタンパク質である、請求項 1ないし 15のいずれか一項に記載の方法。
[17] 生体分子がタンパク質であって、当該タンパク質を抽出し分画し、タンパク質を消化 する工程をさらに含む、請求項 1ないし 16のいずれか一項に記載の方法。
[18] サンプルが、組織、生体液、細胞、細胞器官およびタンパク質複合体力ゝらなる群か ら選択される 、ずれかのサンプルである、請求項 1な 、し 17の!、ずれか一項に記載 の方法。
[19] 同位体が、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pおよび34 S並びにこれらの組み合わせ力 なる 群から選択されるいずれかの同位体である、請求項 1ないし 18のいずれか一項に記 載の方法。
[20] 同位体が、 13Cである、請求項 1ないし 19のいずれか一項に記載の方法。
[21] 請求項 1な!、し 20の 、ずれか一項に記載の方法に用いられる代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質。
[22] 請求項 1な!、し 20の 、ずれか一項に記載の方法に用いられる代謝的に同位体標 識された生体分子である内部標準物質を含む細胞。
[23] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含有する、請求項 1な
V、し 20の!、ずれか一項に記載の方法のための試薬。
[24] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を含有する 、請求項 1な 、し 20の!、ずれか一項に記載の方法のための試薬。
[25] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質の、請求項 1ないし 20の いずれか一項に記載の方法のための使用。
[26] 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞の、請求項 1 な！、し 20の!、ずれか一項に記載の方法のための使用。
[27] 質量分析装置おいて得られた、サンプル中の 1又は複数の生体分子の質量分析 に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1又は複数の生体分子の 定量をさせるためのプログラムであって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は 、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞を添加し、 当該各サンプル中の各生体分子を質量分析装置により分析し、質量分析装置から 分析結果を受ける工程と、
(2)質量分析の分析結果から当該生体分子を同定する工程と、
(3)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、
を実行させるプログラム。
[28] 質量分析装置において得られた、サンプル中の 1又は複数の生体分子の質量分 祈に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1又は複数の生体分 子の定量をさせるためのプログラムであって、
(1)サンプルに、代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質を、又は 、代謝的に同位体標識された生体分である内部標準物質を含む細胞を添加し、当 該各サンプルから生体分子を抽出し分画し、当該分画した各生体分子を質量分析 装置により分析し、質量分析装置カゝら分析結果を受ける工程と、
(2)質量分析の分析結果から当該生体分子を同定する工程と、
(3)各生体分子の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、当該生体分子を 定量する工程と、
を実行させるプログラム。
[29] 複数のサンプルにつ 、て行 、、各サンプル間の各生体分子のピーク強度比を比較 する工程をさらに実行させる、請求項 27または 28に記載のプログラム。
[30] サンプル中の 1又は複数の生体分子の絶対定量をするためのプログラムであって、 代謝的に同位体標識された生体分子である内部標準物質中の、又は代謝的に同位 体標識された生体分子である内部標準物質を含む細胞中の生体分子が既知量であ る、請求項 27な!、し 29の!、ずれか一項に記載のプログラム。
[31] 第一の生体分子と、前記第一の生体分子に対して同位体標識された第二の生体 分子との質量分析に関するデータの解析システムであって、
前記第一および第二の生体分子の質量分析を実行する質量分析装置と、 前記質量分析装置から、前記生体分子の質量分析に関するデータを受けるデータ 入出部を有する制御部と、を備え、
前記制御部は、生体分子の構成成分の配列が決定された前記生体分子に対する 第一の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子 に対する第二の m/zの値とを決定するとともに、前記第一および第二の m/zの値から 、前記第一の生体分子および前記第二の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを含むデータを、前記質量分析装置にて得られた 質量分析に関するデータから抽出する処理部と、
前記処理部力 前記第一および第二の m/zの値におけるマスク口マトグラムを受け 、前記時間軸に対する質量分析スペクトルを波形分離処理する波形処理部と、を備 える、解析システム。
[32] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同位体非 標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二 の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決 定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位 体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 31に 記載の解析システム。
[33] 前記制御部は、前記波形分離処理部からの波形分離処理により得られた固有の生 体分子に由来する波形の面積を算出し、前記第一の m/zの値における固有の生体 分子に由来する第一の波形面積の値と、前記第二の m/zの値における固有の生体 分子に由来する第二の波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記第二の 波形面積)の比を算出する演算部を、さらに備える、請求項 31又は 32に記載の解析 システム。
[34] 前記制御部は、波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類し、前記 配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し、その照合結果から、前 記配列と機能とを関連付けてグループィ匕する情報付加部を、さらに備える、請求項 3 1ないし 33のうち何れか一項に記載の解析システム。
[35] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定し、生体分子を 構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定 量値とする演算部を、さらに備える、請求項 31ないし 34のいずれか一項に記載の解 析システム。
[36] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列を、生体分子の機能情報を有するデ ータベースに照合し、当該生体分子の機能情報を取得する情報付加部を、さらに備 える、請求項 31な 、し 35の 、ずれか一項に記載の解析システム。
[37] 前記第一および第二の生体分子の質量分析を実行する際、内部標準物質の存在 下で質量分析を実行し、
前記波形処理部は、前記内部標準物質の m/zの値におけるマスク口マトグラムを受 けて、前記内部標準物質に固有の波形を得るために、さらに波形分離処理を行い、 前記演算部は、前記波形処理部からの内部標準物質に固有の波形面積を算出す るとともに、（前記第一の波形面積) / (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、 および/または、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の 比を、さらに算出する、請求項 31ないし 36のうち何れか一項に記載の解析システム
[38] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内部標準 物質との質量分析に関するデータの解析システムであって、
前記第一および第二の生体分子並びに同位体標識された生体分子の質量分析を 実行する質量分析装置と、
前記質量分析装置から、前記生体分子の質量分析に関するデータを受けるデータ 入出部を有する制御部と、を備え、
前記制御部は、生体分子の構成成分の配列が決定された前記生体分子に対する 第一および第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記同位 体標識された生体分子に対する内部標準物質の m/zの値とを決定するとともに、前 記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二の生 体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析スぺタト ルおよびマスク口マトグラムを含むデータを、前記質量分析装置にて得られた質量分 祈に関するデータから抽出する処理部と、
前記処理部力 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値におけるマ スクロマトグラムを受け、前記マスク口マトグラムを波形分離処理する波形処理部と、 を備える、解析システム。
[39] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 38に記載の解析シ ステム。
[40] 前記制御部は、前記波形分離処理部からの波形分離処理により得られた固有の生 体分子に由来する波形の面積を算出し、前記第一および第二の m/zの値における 固有の生体分子に由来する第一および第二の波形面積の値と、前記内部標準物質 の m/zの値における固有の生体分子に由来する内部標準物質の波形面積の値とか ら、（前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を 算出する演算部を、さらに備える、請求項 38又は 39に記載の解析システム。
[41] 前記制御部は、波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類し、前記 配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し、その照合結果から、前 記配列と機能とを関連付けてグループィ匕する情報付加部を、さらに備える、請求項 3 8ないし 40のうち何れか一項に記載の解析システム。
[42] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定し、生体分子を 構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体分子の代表定 量値とする演算部を、さらに備える、請求項 38ないし 41のいずれか一項に記載の解 析システム。
[43] 前記制御部は、生体分子の構成成分の配列を、生体分子の機能情報を有するデ ータベースに照合し、当該生体分子の機能情報を取得する情報付加部を、さらに備 える、請求項 38な 、し 42の 、ずれか一項に記載の解析システム。
[44] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pおよび34 S並び にこれらの組み合わせからなる群力も選択される!、ずれかの同位体である、請求項 3
1ないし 43のうち何れか一項に記載の解析システム。
[45] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 31ないし 44 のうち何れか一項に記載の解析システム。
[46] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により、前記構成成分の配列の決定が行われる、請求項 4
5に記載の解析システム。
[47] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 31な
V、し 46のうち何れか一項に記載の解析システム。
[48] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群から選択されるいずれかの分子である、請求項 31ないし 47のうち何れか 一項に記載の解析システム。
[49] 第一の生体分子と、前記第一の生体分子に対して同位体標識された第二の生体 分子の質量分析に関するデータの解析方法であって、
質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値と、 生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値 を決定する工程と、
前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子および前記第二の生 体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよびマスク口マトグラムを含むデー タを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程と、
前記第一及び第二の生体分子のマスク口マトグラムを波形分離処理する工程と、 を含む、解析方法。
[50] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体成分の同位体非 標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二 の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決 定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位 体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 49に 記載の解析方法。
[51] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を 算出する工程と、
前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一の波形面積の値と 、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波形面積の値とから、 (前記第一の波形面積) I (前記第二の波形面積)の比を算出する工程と、 をさらに備える、請求項 49又は 50に記載の解析方法。
[52] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに含む、請求項 49ないし 51のうち何れか一項に記載の解析方法。
[53] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値力 平均値を求めて、生体分 子の代表定量値とする工程と、
をさらに含む、請求項 49ないし 52のいずれか一項に記載の解析方法。
[54] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し て、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、 をさらに含む、請求項 49ないし 53のいずれか一項に記載の解析方法。
[55] 前記第一および第二の生体分子とともに、内部標準物質の m/zの値の決定するェ 程と、内部標準物質のマスク口マトグラムを含むデータを抽出する工程と、前記内部 標準物質のマスク口マトグラムの波形分離処理する工程と、前記内部標準物質に固 有の波形の面積を算出する工程とを実行し、
(前記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および/ま たは、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比を、算 出する工程を、さらに含む、請求項 49ないし 54のうち何れか一項に記載の解析方法
[56] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内部標準 物質との質量分析に関するデータの解析方法であって、
質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、
前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二 の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを含むデータを、前記質量分析に関するデータから 抽出する工程と、
前記第一および第二並びに内部標準物質の生体分子のマスク口マトグラムを波形 分離処理する工程と、
を含む、解析方法。
[57] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 56に記載の解析方 法。
[58] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を 算出する工程と、
前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一および 第二の波形面積の値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分子に 由来する内部標準物質の波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記内部 標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第二の波形面積)/ (前記 内部標準物質に固有の波形面積)の比を算出する工程と、
をさらに備える、請求項 56又は 57に記載の解析方法。
[59] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに含む、請求項 56ないし 58のうち何れか一項に記載の解析方法。
[60] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値力 平均値を求めて、生体分 子の代表定量値とする工程と、
をさらに含む、請求項 56ないし 59のいずれか一項に記載の解析方法。
[61] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し て、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
をさらに含む、請求項 56ないし 58のいずれか一項に記載の解析方法。
[62] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pおよび34 S並び にこれらの組み合わせ力もなる群力も選択される 、ずれかの同位体である、請求項 4
9ないし 61のうち何れか一項に記載の解析方法。
[63] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 49ないし 62 のうち何れか一項に記載の解析方法。
[64] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られるデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 63に記 載の解析方法。
[65] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 49な V、し 64のうち何れか一項に記載の解析方法。
[66] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群から選択されるいずれかの分子である、請求項 49ないし 65のうち何れか 一項に記載の解析方法。
[67] 質量分析装置において得られた、第一の生体分子と、前記第一の生体分子に対し て同位体標識された第二の生体分子の質量分析に関するデータを受けるコンビユー タに、前記データの解析をさせるためのプログラムであって、
前記質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのう ち、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの 値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/z の値を決定する工程と、
前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子および前記第二の生 体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよびマスク口マトグラムを含むデー タを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程と、
前記第一および第二の生体分子のマスク口マトグラムを波形分離処理する工程と、 を実行させるプログラム。
[68] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同位体非 標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二 の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決 定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位 体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行させる、請求項 67に 記載のプログラム。
[69] 前記波形分離処理により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を算出 する工程と、
前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一の波形面積の値と 、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波形面積の値とから、 (前記第一の波形面積) I (前記第二の波形面積)の比を算出する工程と、 をさらに実行させる、請求項 67又は 68に記載のプログラム。
[70] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに実行させる、請求項 67ないし 69のうち何れか一項に記載のプログラム。
[71] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値力 平均値を求めて、生体分 子の代表定量値とする工程と、
をさらに実行させる、請求項 67ないし 70のいずれか一項に記載のプログラム。
[72] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し て、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
をさらに含む、請求項 67な!、し 71の!、ずれか一項に記載のプログラム。
[73] 前記質量分析装置において、前記第一および第二の生体分子とともに、内部標準 物質の質量分析に関するデータを得て、
前記質量分析に関するデータから、前記内部標準物質のマスク口マトグラムを抽出 するとともに、前記内部標準物質のマスク口マトグラムを波形分離処理し、
前記波形分離処理により得られた内部標準物質に固有の波形面積を算出し、（前 記第一の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積)の比、および/または 、（前記第二の波形面積)/ (前記内部標準物質に固有の波形面積）に比を算出する 工程を、さらに実行させる、請求項 67ないし 72のうち何れか一項に記載のプログラム
[74] 第一および第二の生体分子と、当該第一および第二の生体分子に対して同位体 標識された生体分子である内部標準物質との質量分析に関するデータを受けるコン ピュータに、前記データの解析をさせるためのプログラムであって、
質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、
前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二 の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを含むデータを、前記質量分析に関するデータから 抽出する工程と、
前記第一および第二並びに内部標準物質の生体分子のマスク口マトグラムを波形 分離処理する工程と、
を実行させるプログラム。
[75] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 74に記載のプロダラ ム。
[76] 前記波形分離処理工程により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を 算出する工程と、
前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一および 第二の波形面積の値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分子に 由来する内部標準物質の波形面積の値とから、（前記第一の波形面積)/ (前記内部 標準物質に固有の波形面積)の比、および Zまたは、（前記第二の波形面積)/ (前記 内部標準物質に固有の波形面積)の比を算出する工程と、
をさらに実行させる、請求項 74又は 75に記載のプログラム。
[77] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに実行させる、請求項 74ないし 76のうち何れか一項に記載のプログラム。
[78] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体 分子の代表定量値とする工程と、
をさらにさせる、請求項 74ないし 77のいずれか一項に記載のプログラム。
[79] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合し て、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
をさらに含む、請求項 74ないし 78のいずれか一項に記載のプログラム。
[80] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pよび34 S並びに これらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、請求項 67 ないし 79のうち何れか一項に記載のプログラム。
[81] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 67ないし 80 のうち何れか一項に記載のプログラム。
[82] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 81に記 載のプログラム。
[83] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 67な
V、し 82のうち何れか一項に記載のプログラム。
[84] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群から選択されるいずれかの分子である、請求項 67ないし 83のうち何れか 一項に記載のプログラム。
[85] 第一および第二の生体分子に対して、同位体標識された生体分子である内部標準 物質の質量分析に関するデータの解析方法であって、 質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、
得られたデータをもとに、生体分子の機能情報を有するデータベースに照合して、 当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
を含む解析方法。
[86] 前記決定工程の後、
前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二 の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程 と、
をさらに含む解析方法。
[87] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 85または 86に記載 の解析方法。
[88] 前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一および 第二のピークの値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分子に由 来する内部標準物質のピークの値とから、（前記第一のピーク)/ (前記内部標準物質 に固有のピーク)の比、および Zまたは、（前記第二のピーク)/ (前記内部標準物質に 固有のピーク）の比を算出する工程と、 をさらに備える、請求項 85ないし 87のうち何れか一項に記載の解析方法。
[89] 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、
をさらに含む、請求項 85ないし 88のうち何れか一項に記載の解析方法。
[90] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体 分子の代表定量値とする工程と、
をさらに含む、請求項 85ないし 89のいずれか一項に記載の解析方法。
[91] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pよび34 S並びに これらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、請求項 85 な 、し 90の 、ずれか一項に記載の解析方法。
[92] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 85ないし 91 のうち何れか一項に記載の解析方法。
[93] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 92に記 載の解析方法。
[94] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 85な
V、し 93のうち何れか一項に記載の解析方法。
[95] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖もしくは核酸またはこれらの組み合わせ である、請求項 85な 、し 94のうち何れか一項に記載の解析方法。
[96] 質量分析装置において得られた、第一および第二の生体分子と、当該第一および 第二の生体分子に対して同位体標識された生体分子である内部標準物質との質量 分析に関するデータを受けるコンピュータに、前記データの解析をさせるためのプロ グラムであって、
質量分析装置にて測定された前記生体分子の質量分析に関するデータのうち、生 体分子の構成成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一およ び第二の m/zの値と、生体分子の構成成分の配列が決定された前記内部標準物質 の生体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する工程と、
得られたデータをもとに、生体分子の機能情報を有するデータベースに照合して、 当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
を実行させるプログラム。
[97] 前記決定工程の後、
前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値から、前記第一および第二 の生体分子並びに前記内部標準物質の生体分子の m/zの値に対する質量分析ス ベクトルおよびマスク口マトグラムを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程 と、
をさらに実行させる請求項 96に記載のプログラム。
[98] 前記第一および第二並びに内部標準物質の m/zの値の決定は、生体分子の構成 成分の配列が決定された前記第一および第二の生体分子の第一および第二の m/z の値から、前記第一および第二の生体分子の同位体非標識の構成成分の個数と前 記第一および第二の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記内部標準物質の生 体分子の内部標準物質の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列 が決定された前記内部標準物質の生体分子の内部標準物質の m/zの値から、前記 内部標準物質の生体分子の同位体標識された構成成分の個数と前記内部標準物 質の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第一および第二の生体分子の第一 および第二の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 96または 97に記載 のプログラム。
[99] 前記第一および第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一および 第二のピークの値と、前記内部標準物質の m/zの値における固有の生体分子に由 来する内部標準物質のピークの値とから、（前記第一のピーク)/ (前記内部標準物質 に固有のピーク)の比、および Zまたは、（前記第二のピーク)/ (前記内部標準物質に 固有のピーク）の比を算出する工程と、
をさらに実行させる、請求項 96ないし 98のうち何れか一項に記載のプログラム。
[100] 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、
をさらに実行させる、請求項 96ないし 99のうち何れか一項に記載のプログラム。
[101] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体 分子の代表定量値とする工程と、
をさらに実行させる、請求項 96ないし 100のいずれか一項に記載のプログラム。
[102] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pよび34 S並びに これらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、請求項 96 ないし 101のうち何れか一項に記載のプログラム。
[103] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 96ないし 102 のうち何れか一項に記載のプログラム。
[104] 前記構成成分の配列決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関す るデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 103に記 載のプログラム。
[105] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 96な
V、し 104のうち何れか一項に記載のプログラム。
[106] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ であるからなる群力 選択されるいずれかの分子である、請求項 96ないし 105のうち 何れか一項に記載のプログラム。
[107] 質量分析装置において得られた、サンプル中の 1または複数の生体分子の質量分 祈に関するデータを受けるコンピュータに、前記サンプル中の 1または複数の生体分 子の定量をさせるためのプログラムであって、
質量分析装置にて測定された生体分子の質量分析に関するデータのうち、生体分 子の構成成分の配列が決定された前記第一の生体分子の第一の m/zの値と、生体 分子の構成成分の配列が決定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値を決 定する工程と、
前記第一および第二の m/zの値から、前記第一の生体分子および前記第二の生 体分子の m/zの値に対する質量分析スペクトルおよびマスク口マトグラムを含むデー タを、前記質量分析に関するデータ力も抽出する工程と、
前記第一および第二の生体分子のマスク口マトグラムを波形分離処理する工程と、 を実行させるプログラム。
[108] 前記第一および第二の m/zの値の決定は、生体分子の構成成分の配列が決定さ れた前記第一の生体分子の第一の m/zの値から、前記第一の生体分子の同位体非 標識の構成成分の個数と前記第一の生体分子の電荷の情報に基づいて、前記第二 の生体分子の第二の m/zの値を決定する、または生体分子の構成成分の配列が決 定された前記第二の生体分子の第二の m/zの値から、前記第二の生体分子の同位 体標識された構成成分の個数と前記第二の生体分子の電荷の情報に基づ!、て、前 記第一の生体分子の第一の m/zの値を決定することにより実行される、請求項 107 に記載のプログラム。
[109] 前記波形分離処理により得られた固有の生体分子に由来する波形の面積を算出 する工程と、
前記第一の m/zの値における固有の生体分子に由来する第一の波形面積の値と 、第二の m/zの値における固有の生体分子に由来する第二の波形面積の値とから、 (前記第一の波形面積) I (前記第二の波形面積)の比を算出する工程と、 をさらに実行させる、請求項 107又は 108に記載のプログラム。
[110] 前記波形分離後、前記生体分子の構成成分の配列毎に分類する工程と、
前記配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合する工程と、 前記照合結果から、前記配列と機能とを関連付けてグループ化する工程と、 をさらに実行させる、請求項 107ないし 109のうち何れか一項に記載のプログラム。
[111] 生体分子の構成成分の配列から生体分子を特定する工程と、
生体分子を構成する各生体分子の構成成分の定量値から平均値を求めて、生体 分子の代表定量値とする工程と、
をさらに実行させる、請求項 107ないし 110のいずれか一項に記載のプログラム。
[112] 生体分子の構成成分の配列を生体分子の機能情報を有するデータベースに照合 して、当該生体分子の機能情報を取得する工程と、
をさらに実行させる、請求項 107ないし 111のいずれか一項に記載のプログラム。
[113] 前記同位体標識に用いられる同位体は、 2H、 13C、 15N、 "0、 180、 33Pよび34 S並びに これらの組み合わせ力もなる群力も選択されるいずれかの同位体である、請求項 10
7な!、し 112のうち何れか一項に記載のプログラム。
[114] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により行われる、請求項 107ないし 11 3のうち何れか一項に記載のプログラム。
[115] 前記構成成分の配列の決定は、 MS/MS処理により得られたデータと生体分子に関 するデータベースとの照合により構成成分の配列の決定が行われる、請求項 114に 記載のプログラム。
[116] 前記生体分子は、経時的にサンプル力 分離された生体分子である、請求項 107 な！、し 115のうち何れか一項に記載のプログラム。
[117] 前記生体分子は、タンパク質、脂質、糖鎖および核酸並びにこれらの組み合わせ からなる群から選択されるいずれかの分子である、請求項 107ないし 116のうち何れ か一項に記載のプログラム。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006170710A (ja) * 2004-12-14 2006-06-29 Mitsui Knowledge Industry Kk ピークの抽出方法および該方法を実行するためのプログラム
WO2007123274A1 (ja) 2006-04-20 2007-11-01 Eisai R & D Management Co., Ltd. スルホンアミド化合物の新規感受性マーカー
JP2007312653A (ja) * 2006-05-24 2007-12-06 Nec Soft Ltd 時系列遺伝子発現量データの特徴抽出と比較分類を目的とする解析方法、および該解析方法に基づく解析装置
JP2008128922A (ja) * 2006-11-24 2008-06-05 Taiyo Nippon Sanso Corp 安定同位体濃度の分析方法
JP2008256667A (ja) * 2006-10-13 2008-10-23 Hitachi High-Technologies Corp 質量分析装置を用いた定量分析方法
WO2009123297A1 (ja) * 2008-04-03 2009-10-08 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析装置を用いた定量分析方法
JP2011522210A (ja) * 2007-06-01 2011-07-28 アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） ポリペプチドを絶対定量化するための方法
WO2012111249A1 (ja) * 2011-02-14 2012-08-23 学校法人麻布獣医学園 質量分析法における質量変化を検出する方法及び安定同位体標識タンパク質の絶対量の定量方法
JP2013528818A (ja) * 2010-06-16 2013-07-11 アッヴィ・インコーポレイテッド 蛋白質試料の比較
CN110869039A (zh) * 2017-02-10 2020-03-06 C2N诊断有限公司 用于测量生物流体中的生物分子的浓度的方法
JP2021526209A (ja) * 2018-06-08 2021-09-30 アムジエン・インコーポレーテツド ランタイム信号強度校正によってマルチ特性分析（ｍａｍ）の試験室間及び／又は機器間のばらつきを縮小するシステム及び方法

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE554391T1 (de) 2003-12-19 2012-05-15 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur analyse von metaboliten
EP2306198A1 (en) * 2004-07-02 2011-04-06 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method of analyzing protein structural affinity relationship
US8101368B2 (en) 2006-02-13 2012-01-24 Dvs Sciences Inc. Quantitation of cellular DNA and cell numbers using element labeling
EP1995593B1 (en) * 2006-03-07 2015-05-06 Shimadzu Corporation Chromatograph mass spectrometer
EP2498096A1 (en) * 2006-07-21 2012-09-12 Amgen Inc. Method of detecting and/or measuring hepcidin in a sample
US20100050737A1 (en) * 2008-09-01 2010-03-04 Andrew Mark Wolters Separation technology method and identification of error
JP6166016B2 (ja) 2008-12-05 2017-07-19 シー２エヌ ダイアグノスティクス 生体分子の濃度を測定するための方法
JP5317336B2 (ja) 2009-02-23 2013-10-16 国立大学法人東北大学 質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチド、人工標準タンパク質、及びタンパク質の定量方法
WO2010116961A1 (en) * 2009-04-10 2010-10-14 Canon Kabushiki Kaisha Method of forming mass image
US9405884B2 (en) 2010-06-16 2016-08-02 Abbvie Inc. Methods and systems for the analysis of protein samples
US8367366B2 (en) 2010-12-04 2013-02-05 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods and kits for quantitative methyltransferase and demethylase measurements
JP5454462B2 (ja) * 2010-12-22 2014-03-26 株式会社島津製作所 クロマトグラフ質量分析装置
US8945861B2 (en) 2011-08-03 2015-02-03 Pierce Biotechnology, Inc. Methods for isotopically labeling biomolecules using mammalian cell-free extracts
JP2015500472A (ja) * 2011-12-02 2015-01-05 シー２エヌ ダイアグノスティクス 生体分子の濃度を測定するための方法
GB2513805B (en) 2012-04-18 2020-04-01 Waters Technologies Corp Methods for quantifying polypeptides using mass spectrometry
EP3004861B1 (en) 2013-06-07 2020-03-25 Pierce Biotechnology, Inc. Absolute quantitation of proteins and protein modifications by mass spectrometry with multiplexed internal standards
CN104655710B (zh) * 2013-11-18 2017-08-04 谱天（天津）生物科技有限公司 一种蛋白质变化程度检测方法及其应用
EP3180612A1 (en) * 2014-08-14 2017-06-21 Universität Zürich Highly multiplexed absolute quantification of molecules on the single cell level
US11105814B2 (en) 2016-06-06 2021-08-31 Uvic Industry Partnerships Inc. Assay for quantitation of proteins and peptides using stable isotope standards
EP3287788B1 (en) * 2016-08-22 2018-11-14 BiognoSYS AG Methods for mass spectrometry-based quantification using labelled compounds
CN106770614B (zh) * 2016-12-30 2019-11-12 复旦大学 亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法
JP6779500B2 (ja) * 2017-03-30 2020-11-04 株式会社島津製作所 クロマトグラフ質量分析方法及び装置
KR102108855B1 (ko) * 2017-10-30 2020-05-12 한국표준과학연구원 안정동위원소 표지 핵산을 내부표준물질로 활용하는 핵산 정량 방법 및 이의 용도
EP3713588A4 (en) * 2017-11-22 2021-08-04 Seagen Inc. ACID MEDIATION ASSAY FOR THE ANALYSIS OF LIGAND-DRUG CONJUGATES
JP7295513B2 (ja) * 2019-05-10 2023-06-21 大陽日酸株式会社 質量分析用標識組成物、代謝物の定量分析法、及び代謝物の動態解析法
US20220283193A1 (en) * 2019-07-25 2022-09-08 Hitachi High-Tech Corporation Specimen analyzer
US11232936B2 (en) 2020-05-28 2022-01-25 Thermo Finnigan Llc Absolute quantitation of a target analyte using a mass spectrometer
CN112630349B (zh) * 2020-12-28 2022-12-09 盐城师范学院 一种Cangrelor中间体杂质的HPLC检测方法
CN113671097B (zh) * 2021-07-19 2024-02-23 中国农业科学院油料作物研究所 一种基于13c代谢全位标记脂质结合同位素稀释质谱法的全脂质定量方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000131305A (ja) * 1998-10-27 2000-05-12 Hitachi Ltd クロマトグラフのデータ処理装置およびデータ処理方法
US6391649B1 (en) 1999-05-04 2002-05-21 The Rockefeller University Method for the comparative quantitative analysis of proteins and other biological material by isotopic labeling and mass spectroscopy
US20020123055A1 (en) 2000-08-25 2002-09-05 Estell David A. Mass spectrometric analysis of biopolymers
WO2003016861A2 (en) 2001-08-14 2003-02-27 President And Fellows Of Harvard College Absolute quantification of proteins and modified forms thereof by multistage mass spectrometry
JP2003107066A (ja) * 1998-08-25 2003-04-09 Univ Of Washington 複合した混合物中のタンパク質またはタンパク質機能の迅速定量分析

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0675003B2 (ja) * 1986-07-17 1994-09-21 株式会社島津製作所 スペクトル分離処理方法
US6300626B1 (en) * 1998-08-17 2001-10-09 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Time-of-flight mass spectrometer and ion analysis
JP2002333430A (ja) 2001-05-09 2002-11-22 Japan Science & Technology Corp プロテオーム解析方法
WO2003042774A2 (en) * 2001-11-13 2003-05-22 Caprion Pharmaceuticals Inc. Mass intensity profiling system and uses thereof
US20050092910A1 (en) * 2001-12-08 2005-05-05 Scott Geromanos Method of mass spectrometry
EP1475632B1 (en) * 2002-02-14 2013-05-22 Ajinomoto Co., Inc. Method of analyzing aminofunctional compound and analytical reagent
JP3583771B2 (ja) * 2002-10-10 2004-11-04 株式会社日立製作所 クロマトグラム解析方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003107066A (ja) * 1998-08-25 2003-04-09 Univ Of Washington 複合した混合物中のタンパク質またはタンパク質機能の迅速定量分析
JP2000131305A (ja) * 1998-10-27 2000-05-12 Hitachi Ltd クロマトグラフのデータ処理装置およびデータ処理方法
US6391649B1 (en) 1999-05-04 2002-05-21 The Rockefeller University Method for the comparative quantitative analysis of proteins and other biological material by isotopic labeling and mass spectroscopy
US20020123055A1 (en) 2000-08-25 2002-09-05 Estell David A. Mass spectrometric analysis of biopolymers
WO2003016861A2 (en) 2001-08-14 2003-02-27 President And Fellows Of Harvard College Absolute quantification of proteins and modified forms thereof by multistage mass spectrometry

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Proteome Analysis Method", 10 July 2000, YODOSHA, pages: 111 - 122
KARN, P., SCIENCE, vol. 270, 1995, pages 369 - 370
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 20, 5 May 2002 (2002-05-05), pages 512 - 515
ROMIJN P.E. ET AL: "Recent liquid Chromatographic-(tandem) mass spectrometric applications in proteomics", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, vol. 1000, no. 1/2, 6 June 2003 (2003-06-06), pages 589 - 608, XP004427315 *
See also references of EP1686372A4 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006170710A (ja) * 2004-12-14 2006-06-29 Mitsui Knowledge Industry Kk ピークの抽出方法および該方法を実行するためのプログラム
JP4621491B2 (ja) * 2004-12-14 2011-01-26 三井情報株式会社 ピークの抽出方法および該方法を実行するためのプログラム
WO2007123274A1 (ja) 2006-04-20 2007-11-01 Eisai R & D Management Co., Ltd. スルホンアミド化合物の新規感受性マーカー
JP2007312653A (ja) * 2006-05-24 2007-12-06 Nec Soft Ltd 時系列遺伝子発現量データの特徴抽出と比較分類を目的とする解析方法、および該解析方法に基づく解析装置
JP4555256B2 (ja) * 2006-05-24 2010-09-29 Ｎｅｃソフト株式会社 時系列遺伝子発現量データの特徴抽出と比較分類を目的とする解析方法、および該解析方法に基づく解析装置
JP2008256667A (ja) * 2006-10-13 2008-10-23 Hitachi High-Technologies Corp 質量分析装置を用いた定量分析方法
JP2008128922A (ja) * 2006-11-24 2008-06-05 Taiyo Nippon Sanso Corp 安定同位体濃度の分析方法
JP2011522210A (ja) * 2007-06-01 2011-07-28 アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） ポリペプチドを絶対定量化するための方法
JPWO2009123297A1 (ja) * 2008-04-03 2011-07-28 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析装置を用いた定量分析方法
WO2009123297A1 (ja) * 2008-04-03 2009-10-08 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析装置を用いた定量分析方法
JP5337144B2 (ja) * 2008-04-03 2013-11-06 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析装置を用いた定量分析方法
JP2013528818A (ja) * 2010-06-16 2013-07-11 アッヴィ・インコーポレイテッド 蛋白質試料の比較
WO2012111249A1 (ja) * 2011-02-14 2012-08-23 学校法人麻布獣医学園 質量分析法における質量変化を検出する方法及び安定同位体標識タンパク質の絶対量の定量方法
JPWO2012111249A1 (ja) * 2011-02-14 2014-07-03 学校法人麻布獣医学園 質量分析法における質量変化を検出する方法及び安定同位体標識タンパク質の絶対量の定量方法
CN110869039A (zh) * 2017-02-10 2020-03-06 C2N诊断有限公司 用于测量生物流体中的生物分子的浓度的方法
EP3579859A4 (en) * 2017-02-10 2020-12-16 C2N Diagnostics, LLC METHOD OF MEASUREMENT OF BIOMOLECULE CONCENTRATIONS IN BIOFLUIDS
CN110869039B (zh) * 2017-02-10 2024-03-26 C2N诊断有限公司 用于测量生物流体中的生物分子的浓度的方法
JP2021526209A (ja) * 2018-06-08 2021-09-30 アムジエン・インコーポレーテツド ランタイム信号強度校正によってマルチ特性分析（ｍａｍ）の試験室間及び／又は機器間のばらつきを縮小するシステム及び方法

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