JP2011522210A - ポリペプチドを絶対定量化するための方法 - Google Patents
ポリペプチドを絶対定量化するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(a)分析する試料を準備するステップと、
(b)前記標的ポリペプチドの既知量の同位体標識相同体を試料に添加し、それにより、スパイクされた試料を得るステップと、
(c)スパイクされた試料をプロテアーゼ活性で処理して、複数のタンパク質分解性ペプチドを得るステップと、
(d)質量分析法(MS)により、ステップc)で得られたタンパク質分解性ペプチドを分析するステップと、
(e)対応する未標識タンパク質分解性ペプチドに対する、同位体標識タンパク質分解性ペプチドの比率を決定するステップと、
f)この比率および同位体標識相同体の既知量から、試料中の標的ポリペプチドの量を算出するステップと
を含む方法を提唱する。
(a)分析する試料を準備することと、
(b)前記標的ポリペプチドの既知量の同位体標識相同体を試料に添加し、それにより、スパイクされた試料を得るステップと、
(c)スパイクされた試料をプロテアーゼ活性で処理して、複数のタンパク質分解性ペプチドを得るステップと、
(d)質量分析法(MS)により、ステップc)で得られたタンパク質分解性ペプチドを分析するステップと、
(e)対応する未標識タンパク質分解性ペプチドに対する、同位体標識タンパク質分解性ペプチドの比率を決定するステップと、
f)この比率および同位体標識相同体の既知量から、試料中の標的ポリペプチドの量を算出するステップとを含む方法
を提供する。
− [13Cおよび/または15N]−リシンおよび/または[15Nおよび/または13C]−アルギニン標識ポリペプチドならびにトリプシン。
本研究において、本発明者らは、in vitroで合成された同位体標識全長タンパク質を絶対定量化のための標準物質として使用する革新的な戦略(PSAQ)を提示する。それらのタンパク質標準物質は、標的タンパク質の生化学的特性と完全に一致するため、分析する試料に直接添加することができ、前分画された複雑な試料中であってもタンパク質の非常に正確な定量化を可能にする。バイオマーカーを正確に絶対定量化するための本発明者らのPSAQ方法論の能力は、公衆衛生が目的とする典型的なバイオマーカーとしての黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)スーパー抗原性毒素で汚染した水および尿試料の両方で実証された。PSAQ方法論で得られた結果を、AQUAペプチド戦略およびQCAT戦略で得られた結果と比較した。
AAA:アミノ酸分析
AMT:精密質量および時間標識
AQUA:絶対定量化
DDA:データ依存分析
ESI:エレクトロスプレー
MALDI:マトリックス支援レーザー脱離イオン化法
MRM:多反応モニタリング
PSAQ:タンパク質標準物質絶対定量化
QCAT:絶対定量化用の標準ペプチドのコンカテマー
SEA:ブドウ球菌エンテロトキシンA
SEB:ブドウ球菌エンテロトキシンB
SEG:ブドウ球菌エンテロトキシンG
SEI:ブドウ球菌エンテロトキシンI
SEM:ブドウ球菌エンテロトキシンM
SEN:ブドウ球菌エンテロトキシンN
SEO:ブドウ球菌エンテロトキシンO
SRM:単一反応モニタリング
sMRM:スケジュールMRM
TSST−1:毒素性ショック症候群毒素−1
化学薬品および試薬
AQUA(商標)[13C6、15N]L−ロイシン標識ペプチドは、Sigma−Genosys社(Saint Quentin Fallavier、フランス)により合成された。これらのペプチドは、供給者によってアミノ酸分析(AAA)により定量化されていた。組換えブドウ球菌エンテロトキシンSEAおよびTSST−1は、Toxin Technology社(Sarasota、フロリダ州、米国)から購入した。低吸着性チューブ(Dutscher社製、Brumath、フランス)中で、定量化標準物質および市販毒素の希釈を系統的に実施した。
図1に示されているようにQCATタンパク質を設計した。手短かに言えば、8つのブドウ球菌スーパー抗原性毒素(SEA、SEB、TSST−1、SEG、SEI、SEM、SEN、およびSEO)由来のトリプシンペプチドを、ブドウ球菌スーパー抗原間のそれらの配列固有性およびnanoLC−MS分析におけるそれらの検出性に従って選択した。これらのペプチド配列を人工QCATタンパク質に連結し、逆翻訳して、対応する人工QCAT遺伝子を設計した(より詳細には、参考文献9を参照されたい)。QCAT遺伝子を、順方向鎖および逆方向鎖を包含する53個の5’リン酸化オリゴヌクレオチド(Sigma−Genosys社製)から合成した(図7を参照)。合成QCAT遺伝子を、Taq DNAリガーゼ(New England Biolabs社製、フランクフルト、ドイツ)を用いたリガーゼ連鎖反応により構築し、表IIに表示されているプライマーを使用して、Expand High Fidelityポリメラーゼ(Roche社製、Meylan、フランス)を用いて増幅した。増幅されたQCAT遺伝子を精製し、NcoI(Roche社製)およびSmaI(New England Biolabs社製)で消化し、C末端ヘキサヒスチジン精製用標識を提供するpIVEX2.3dベクター(Roche社製)に挿入した。ライゲーションは、迅速DNAライゲーションキット(Roche社製)を使用して達成した。その結果生じたプラスミドを、XL1−Blue菌株(Stratagene社製、アムステルダム、オランダ)にクローニングし、QIAprepスピンミニプレップキット(Qiagen社製、Courtaboeuf、フランス)を使用して精製した。最後に、本発明者らは、それを組換えタンパク質合成に使用する前に、QCAT構築体配列を検査した(Genome Express社、Meylan、フランス)。QCATタンパク質産生は、以下の改変を施した製造業者の説明書に従って、RTS 500 ProteoMaster大腸菌HYキット(Roche社製)を使用し、in vitroで実施した:本発明者らは、提供されていたアミノ酸混合物の代りにRTSアミノ酸サンプラーキット(Roche社製)を使用し、本発明者らは、L−リシンおよびL−アルギニンを同位体標識[13C6、15N2]L−リシンおよび[13C6、15N4]L−アルギニン(Cambridge Isotope Laboratories社製、Andover、マサチューセッツ州、米国)に置換した。[13C6、15N2]L−リシンおよび[13C6、15N4]L−アルギニンの同位体濃縮度は、98%13Cおよび98%15Nであった。QCATタンパク質は、析出した形態で効率的に産生され、6Nのグアニジンに可溶化した。QCAT精製を、6Nのグアニジン中で20mM〜250mMイミダゾール勾配を使用して、ニッケル親和性カラム(Ni Sepharose 6 Fast Flow、Amersham Biosciences社製、Freiburg、ドイツ)で実施した。精製後、QCATを、純水および1%SDS、Tris HCl 50mM、pH7.5に対して連続して透析した。Biochrom30アミノ酸アナライザー(Biochrom社製、ケンブリッジ、英国)を用いて、AAAによりQCAT定量化を実施した。nanoLC−MS/MS分析およびnanoLC−MS分析により、QCAT一次構造および同位体標識化をさらに評価した(図8)。
フランス国立ブドウ球菌リファレンスセンター(French National Staphylococci Reference Center)の菌株コレクションから、SEAまたはTSST−1遺伝子を担持する2つの黄色ブドウ球菌株を選択した。同位体標識SEB標準物質は、その生成が公式に制限されているため合成しなかった。QIAamp DNA Stoolミニキット(Qiagen社製)を使用して、ゲノムDNAを調製した。PCR増幅に使用したプライマーは、表IIに記載されている。SEAおよびTSST−1 PCR断片を精製し、KspI(Roche社製)およびSmaI(New England Biolabs社製)で消化し、N末端の切断可能なヘキサヒスチジン精製用タグを提供するpIVEX2.4d発現ベクター(Roche社製)にクローニングした。本発明者らのPSAQ戦略は、各毒素とそのPSAQ標準物質との間の生化学的等価性に依存する。したがって、本発明者らは、N末端の切断可能なタグの恩恵を行使して、無細胞合成により産生されたタンパク質に報告されている限定N末端不均質性のポリッシングを可能にした[16]。QCATについて上述したように、これらの構築体を、Xl1blueにクローニングし、精製し、配列決定して、[13C6、15N]L−リシンおよび[13C6、15N]L−アルギニンの存在下でin vitroタンパク質合成に使用した。同位体標識SEAおよびTSST−1は、可溶性形態で容易に産生され、イミダゾール勾配を使用してニッケル親和性カラム(Ni Sepharose 6 Fast Flow、Amersham Biosciences社製)で精製した。製造業者の説明書に従って、ビオチン化第Xa因子(第Xa因子除去キット、Roche社製)により、各同位体標識タンパク質のN末端ヘキサヒスチジンタグを切断した。ストレプトアビジンをコーティングしたビーズおよびNi Sepharose 6 Fast Flow樹脂の混合物を使用して、その結果生じたヘキサヒスチジンタグペプチドおよびビオチン化第Xa因子の両方を単一ステップで取り除いた。これらの同位体標識SEAおよびTSST−1をAAAにより定量化した。nanoLC−MS/MSおよびnanoLC−MS分析により、タンパク質の一次構造および標識化効率を確認した[データ非表示]。
本実験室で産生した組換えPSAQタンパク質ならびに購入したSEAおよびTSST−1はすべて、Imperialタンパク質染色およびSYPRO Ruby染色(Biorad社製、Marnes−la−Coquette、フランス)の両方を使用したSDS−PAGEで純度を検査した。市販毒素の量は少量過ぎてAAA分析ができず、市販TSST−1毒素は、正確なAAA定量化を妨げる著しい汚染を示していた。したがって、市販毒素は、SYPRO Ruby染色を使用したSDS−PAGEで、本発明者らのAAA較正PSAQ標準物質と比較することにより系統的に定量化した[17]。SYPRO Ruby蛍光をTyphoon9400(Amersham Biosciences社製)で走査した(レーザー 532nm、フィルター 610BP30)。
飲料水試料を、5つの異なる量のSEAおよびTSST−1市販毒素で汚染した。各試料を、各々9つの120μl等量に分割した。各試料の3つの等量(分析的重複測定)に、規定量のQCATまたはPSAQ毒素標準物質のいずれかをスパイクした。配列決定等級の修飾トリプシン(Promega社製、マディソン、ウィスコンシン州、米国)を1:2のプロテアーゼ対毒素比率で使用した25mM NH4HCO3の溶液中で、終夜37℃でトリプシン消化を実施した。試料を真空遠心分離により乾燥し、5%のACN、0.2%のギ酸中に再可溶化した。nanoLC−MS分析の前に、規定量のAQUAペプチドを、QCAT標準物質もPSAQ標準物質も含有しない等量に添加した。
30歳の健康な女性から尿を収集し、4つの異なる量のSEAおよびTSST−1市販毒素で汚染した。各試料を、各々9つの100μl等量に分割した。各試料の3つの等量(分析的重複測定)を、規定量のPSAQ毒素標準物質で汚染した(図6A)。各100μl等量を、製造業者の説明書に従って5μlのStrataclean樹脂(Stratagene社製)に吸着させた。上清を除去した後、樹脂に吸着したタンパク質を、2%SDSおよび5%β−メルカプトエタノールを含有する10μlの解重合緩衝液に直接溶出した。この段階で、PSAQ標準物質を欠く試料の半分に、制御された量のQCAT標準物質をロードした(図6A)。95℃で5分間の熱変性ステップの後で、試料を、Invitrogen社(Cergy Pontoise、フランス)から購入したプレキャストNovex NuPAGE Bis−Trisゲル(4〜12%アクリルアミド勾配)に添加した。200Vで30分間ゲルを流し、30%エタノール−7.5%酢酸中で30分間固定し、Biosafeクマシーブルー(Biorad社製)で染色した。毒素およびQCATを包含するゲルの25kDa領域のタンパク質バンドを切り出し、25mM NH4HCO3中で15分間、その後同じ緩衝液(25mM NH4HCO3)中の50%(v/v)ACNで15分間インキュベートするサイクルを繰り返すことにより脱染した。真空遠心分離により乾燥した後、ゲル片を酸化溶液(7%H2O2)で15分間インキュベートした[18]。その後、100%ACNで脱水する前に、ゲル片を、HPLC等級水(Sigma−Aldrich社製)で15分間洗浄した。ゲル内消化を、25mM NH4HCO3中の1:2のトリプシン対タンパク質比率(配列決定等級の修飾トリプシン、Promega社製)を使用して終夜37℃で実施した。以下の溶液中:50%ACN、次いで5%ギ酸、最後には100%ACNで受動拡散を使用して、ペプチドをゲルから抽出した。抽出物を真空遠心分離により乾燥し、ペプチドを5%ACN、0.2%ギ酸中に再可溶化した。nanoLC−MS分析の前に、制御された量のAQUAペプチドを、PSAQまたはQCAT標準物質でスパイクされていなかった試料に添加した(図6A)。
質量分析は、QTOF Ultima質量分析計(Waters社製、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国)に接続されているnanoLC装置で実施した。手短かに言えば、ペプチド消化物を、まず300μm×5mmのPepMap C18プレカラム(LC−Packings−Dionex社製、サニーベール、カリフォルニア州、米国)で濃縮した。次いで、ペプチド消化物を、C18カラム(75μm×150mm)(LC−Packings−Dionex社製)に通し、10%ACN、0.1%ギ酸から80%ACN、0.08%ギ酸までの勾配を用いて溶出した(実行時間60分、流速200nl/分)。半値全幅が9,000〜11,000の分解能を有する陽イオンエレクトロスプレーイオン化モードで、質量分析計を操作した。MS/MSにはデータ依存分析を使用した(各サイクルにおいて最も豊富な3つのイオン):2分間の動的排除を用いた1s質量分析法(m/z 400〜1,600)および最大4sMS/MS(m/z 50〜2,000、連続モード)。MS/MS生データを、MassLynx4.0ソフトウェア(平滑化 3/2 Savitzky Golay)(Waters社製)を使用して処理した。その結果生じたMS/MSデータセットから、本実験室のMASCOTサーバー(バージョン2.0)(Matrix Sciences社製、ロンドン、英国)を使用して、ペプチド同定を達成した。定量化は、MassLynx 4.0ソフトウェアを用いて、特定の質量(±0.1Da)を抽出することにより得られた再構成クロマトグラムの未標識/標識ペプチド対のピークを積分した後で、nanoLC−MSデータから手動で行った。定量化に考慮した最小信号雑音比は、15:1であった。
市販毒素溶液の評価
商業的に供給されたSEAおよびTSST−1の量を、AAAにより事前に定量化した本発明者らの同位体標識毒素標準物質と比較して再評価した。SDS−PAGE分析により、市販TSST−1は、より高分子量のタンパク質でわずかに汚染されており、市販SEA毒素は、本発明者らのSEA PSAQ標準物質と同じ程度に純粋であったことが明らかになった。しかしながら、2つの異なるバッチで試験した場合、市販SEAおよびTSST毒素の公表濃度は、本発明者らのAAA較正PSAQ標準物質と比較すると、一貫して過大評価されていた。したがって、これらの市販毒素の量を、SYPRO Ruby染色を使用したSDS−PAGEで系統的に再評価した[17]。
SEAおよびTSST−1組換えブドウ球菌毒素を、SDS−PAGEおよびトリプシンを用いたゲル内消化に供した。ペプチド消化物を、nanoLC−MS/MSおよびnanoLC−MSにより分析した。特異的トリプシンペプチド(マーカーペプチド)を、2つの毒素の各々について選択した(表I)。マーカーペプチドを、ブドウ球菌スーパー抗原間のそれらの配列固有性およびMS分析におけるそれらの最適な検出性により選択した。これらのマーカーペプチドのうちの3つ(表Iの太字)を、1つの[13C6、15N]L−ロイシンを有するAQUAペプチドとして合成した(質量増加は7Da)。
規定量の市販SEAおよびTSST−1ブドウ球菌毒素を、飲料水に添加した。トリプシン消化を溶液中で実施した。nanoLC−MS分析の前に、既知量のAQUAペプチドをペプチド消化物に添加した。選択した3つの未標識/標識ペプチド対(表Iを参照)の場合、Δm=7Daの質量で分離されたピークダブレット([13C6、15N]L−ロイシンペプチド)が、MS調査で観察された。これらのピークダブレットの各々を積分して、天然ペプチド(質量m)およびその対応する標識AQUA標準物質(質量m+Δm)の合計イオンシグナルを決定した。これらのシグナルの比率は、添加量に対してプロットされた推定天然毒素量の直接的算出を可能にした(図2)。理想的には、100%の回収率が観察されるはずだった。取得されたSEAおよびTSST−1滴定曲線は、50から750pgに及ぶ毒素の添加量では線形であった。イオンシグナル飽和の結果、これらの値を超える線形性からの逸脱が起こった。正確さおよび精度の測定を、それぞれ、滴定曲線の傾き値およびデータの標準平均誤差(s.e.m.)値により評価した。AQUAペプチド標準化は、高度に精密な定量化戦略である(図2)。しかしながら、正確さに関しては、SEAを標的とする2つのAQUAペプチド間に重大な相違が観察された(YNLYNSDVFDGKペプチドの場合は傾き値=1.37およびNVTVQELDQARペプチドの場合は傾き値=0.44)(図2A)。3つの考え得るバイアスがそのような結果を説明することができる:i)AQUAペプチドは、AAAを使用して供給者により定量化され、凍結乾燥されて取得されており、供給者独自のガイドラインに従って再可溶化された。しかしながら、定量的再可溶化を当たり前のことと考えるべきでなく、AAAによる再可溶化ペプチドのその後評価は、提供されているよりさらに多くの物質を必要とするだろう。ii)AQUA標準物質は、試料にそれらを添加する前に高度に希釈しなければならない。それらの物理化学的特性に依存するが、純粋ペプチドの希釈は、バイアルへの吸着によりペプチドの重大な喪失に結びつく場合がある。iii)AQUAペプチドを用いる標準化は、プロテアーゼ消化ステップの収率を考慮していない。このステップは、タンパク質分解に対する各タンパク質の内在的感受性のため、タンパク質間に可変性を導入する。加えて、試料間の可変性は、消化条件(試料緩衝液の組成、トリプシンの量、インキュベーション中の温度など)からも生じる場合がある。バイアルへの標準ペプチドの吸着または不完全な可溶化は両方とも、真の標準物質濃度の過大評価および結果的には標的タンパク質の過大評価に結びつく。したがって、AQUAペプチドYNLYNSDVFDGK(傾き値=1.37)によりもたらされたSEA存在量の37%過大評価は、不完全な再可溶化および/またはこの標準ペプチドがバイアルに部分的に吸着したことに起因した可能性が高い。反対に、ペプチドNVTVQELDQARおよびLPTPIELPLKは、トリプシン消化により効率的に産生されず、したがって、SEAおよびTSST−1存在量(それぞれ、傾き値=0.44および0.54)の重大な過小評価に結びついた可能性がある。これは、AQUAペプチド戦略の主要な制限を強調する:この戦略は、天然タンパク質に由来する様々なペプチドの実際の消化収率を考慮していない。実際、この欠点は、タンパク質分解に耐性であることが知られているブドウ球菌スーパー抗原性毒素などのタンパク質の場合、特に問題である[13]。
本発明者らは、ブドウ球菌スーパー抗原性毒素マーカーペプチド(QCAT)の同位体標識コンカテマーを設計および産生した(図1Aおよび1B)。本発明者らは、AQUA標準物質として以前に選択されたペプチドをすべて、この構築体に含めた。各毒素用に複数のペプチド標準物質が存在することは、定量化ロバストネスの向上を目的としていた。QCATを消化および分析した際、理論的に産生される14個のマーカーペプチドのうち、11個がMALDI−TOF分析により検出され(図1C)、13個がnanoLC−MS分析で観察された[データ非表示]。残りのペプチド(ペプチドP11、図1A)は、恐らくその高い疎水性のため、nanoLC−MS分析では観察されなかった。
規定量の市販SEAおよびTSST−1毒素を飲料水試料に添加した。これらの試料を、既知量のSEAおよびTSST−1 PSAQ標準物質でスパイクした。[13C6、15N2]−リシンおよび[13C6、15N4]−アルギニンの、これらの無細胞発現標準物質への組み込み収率は、98%を超えていた[データ非表示]。QCATについて記載したように、水試料を溶液中で消化し、nanoLC−MSデータを分析した。図5に示されているように、SEAおよびTSST−1 PSAQ標準物質は、それぞれ、3つおよび2つの未標識/標識マーカーペプチド対を用いた定量化を可能にした。これは、TSST−1の配列カバー率の増加を表わした。PSAQ標準物質を用いた較正は、高度に精密であり、測定の正確さを向上させた。SEAに関して、3つの標準ペプチドを使用して取得された結果は、高度に一貫していたが、わずかに過大評価されていた(傾き値は1.26から1.42に及ぶ)。これは、希釈工程中にSEA PSAQ標準物質がバイアルに部分的に吸着したことに起因する可能性が高い。TSST−1の場合には、2つの標準ペプチド、LPTPIELPLKおよびQLAISTLDFEIRは両方とも、81%の回収率を可能にした(傾き値=0.81)。
最後の実験群では、本発明者らは、ブドウ球菌性毒素性ショック症候群に最も頻繁に関与する毒素であるSEAおよびTSST−1でヒト尿試料を汚染した[13、14]。汚染された試料を、Strataclean樹脂で前分画し、SDS−PAGEにより脱複雑化し、トリプシンでゲル内消化した。これらの試料を、PSAQ毒素、またはQCATコンカテマー、またはAQUAペプチドのいずれかでスパイクした(図6A)。既知量のPSAQ標準物質を、尿試料に直接添加した。QCAT標準物質に関して、本発明者らは、その分子量を標的毒素の分子量(24kDa)に調整することにより、以前に記載されているQCAT概念[9]を改良し、その結果:(i)QCAT標準物質は、電気泳動ゲル内で毒素標的と共に移動し、(ii)QCAT標準物質は、ゲル内で毒素と共に共消化され、(iii)QCATおよび毒素タンパク質分解により産生されたペプチドは、ゲルから同時に抽出される。QCATを24kDaに調整することは、他のブドウ球菌スーパー抗原性毒素用の定量化標準物質として潜在的に有用な追加的なペプチドの組み込みにより達成した(図1、本研究で定量化されなかった他の毒素を参照されたい)。QCAT構築体は、1%SDSに可溶化したため、Strataclean樹脂で捕獲することができなかった。結果的に、SDS−PAGE直前にQCAT構築体を試料に導入した。そのサイズにより、SDS−PAGE分画ステップ後にそれらを添加することが強いられるAQUAペプチド標準物質を、以前に記載されているように[6]、nanoLC−MS分析直前に試料へ添加した。
SEAおよびTSST−1毒素に関して、2つのAQUAペプチドがそれらの量を著しく過小評価した(図2)。そのような観察は、ペプチド標準物質を使用する際に考慮されていないトリプシン消化効率の可変性に起因する可能性が最も高い。したがって、本発明者らのデータを考慮すると、AQUAを、ペプチドミクス用の精巧な定量化戦略と考えることができる[23]。しかしながら、タンパク質を正確に定量化するためには、本発明者らは、この戦略が、低複雑性試料と、トリプシン消化効率が特徴付けられている標的タンパク質とに制限されるべきであると考える。AQUAペプチドとは対照的に、QCAT定量化は、同一タンパク質の異なるマーカーペプチド間でより一貫した結果をもたらした(図4)。QCATは、標的と共消化された際に、消化条件により誘導されたプロテアーゼ活性の可変性を補正することも可能にした(図3)。しかしながら、本質的にはタンパク質分解の感受性が異なるため、QCAT標準物質は、それにもかかわらず毒素の過小評価を招いた(図4)。最後に、PSAQ戦略は、飲料水中の毒素定量化について、ペプチド間の一貫性および正確さの両方の点から、AQUAおよびQCAT手法に対する著しい優位性を実証した(図5)。SEA存在量が26から42%過大評価されるのは、希釈工程(スパイク前の終濃度:10nM)中にSEA PSAQ標準物質がバイアルに吸着することに起因する可能性がある。したがって、尿試料中のSEAおよびTSST−1滴定の両方について、優れた正確さが観察された(図6Bおよび6C)。飲料水試料と比較すると、尿試料をスパイクするために使用されたPSAQ標準物質溶液は、よりいっそう濃縮されており(200nM)、バイアルへのタンパク質吸着が防止された可能性がある。QCATおよびAQUA戦略の両方の場合、任意の所与のタンパク質の定量化に使用するのに最も良好なペプチド(複数可)の選択は、経験に裏付けられた推測に基づくことが非常に多い。生物学的マトリックスおよび前分画戦略に応じて、単一の標準ペプチドを選択することは不適当であり得る(例えば、標準ペプチドが他の支配的なペプチドにより抑制される場合)。PSAQ戦略は、最大のタンパク質カバー率を可能にし、これらの考え得る問題を回避し、標的のよりロバストな定量化を提供する。AndersonおよびHunterが小型タンパク質について示唆しているように[10]、良好なペプチドリポーターを見出すのが困難であることから、トリプシンを、ペプチド消化用の異なるプロテアーゼと交換することを強いられる場合がある。長期にわたる研究では、QCATまたはAQUA標準物質は、定量化標準物質の選択を凍結する一方で、PSAQ戦略は代替的ペプチド標準物質への道を切り開く。
要約
ブドウ球菌エンテロトキシンは、食物媒介性疾患の主要な原因物質である。リスク評価または食中毒発生調査のために食物残余物中でそれらを検出することには、包括的な免疫学的ツールの欠如という難点がある。本研究では、本発明者らは、免疫捕捉と、同位体標識エンテロトキシンをMSに基づく分析の内部標準物質として使用するPSAQ戦略との組合せが、食物マトリックス中のこれらの汚染物質を特異的に同定および定量化するために有力であることを実証する。この手法は、ブドウ球菌食中毒発生の解明を著しく向上させる。
多くのタンパク質、とりわけ、確立された潜在的なバイオマーカーは、グリコシル化されている。これは、癌バイオマーカー癌胎児抗原(CEA)または前立腺特異的抗原(PSA)の場合に当てはまる。本発明者らは、PSAQ定量化をグリコシル化タンパク質に適応させるための戦略を起想した。生体試料では、所与のタンパク質のグリコシル化は、多くの場合不均質である。これは、SDS−PAGEで観察される、グリコシル化タンパク質バンドのブロードニングにより十分に例示される。タンパク質グリコシル化の生化学的不均質性は、異なってグリコシル化されたタンパク質がLC−MS分析に先立つ生化学的ステップで不均質集団として振る舞えば、LC−MS定量化を台無しにする場合がある。SDS−PAGEで明白に証拠付けられるため、タンパク質の酵素的脱グリコシル化は、均質性を回復するための良好な方法である。さらに、リソソーム内タンパク質の例から、グリコシル化が、プロテアーゼ攻撃に対する良好な防御であることを理解できる。これにより、トリプシン消化効率に対する影響も異なる場合がある。したがって、本発明者らは、PGNase−Fのような効率的なN−グリコシダーゼを用いた生体物質の処理を、グリコシル化タンパク質に特化したPSAQ定量化プロトコールの実験フローチャートの初期に含めるべきであると考える。しかしながら、この脱グリコシル化ステップは、潜在的に3つの制限を導入する:i)定量化には、所与のタンパク質の特異的脱グリコシル化収率を評価すべきであり、ii)PGNase−F脱グリコシル化は、N−グリコシル化アスパラギンをアスパラギン酸に転換する。この点は、特化したPSAQを設計する際に考慮するべきであるが、iii)脱グリコシル化は、一般的に、タンパク質の総合的な水溶性を減少させる。これは、適切な可溶化緩衝液の選択により修正することができる。定量化するグリコシル化タンパク質を考慮し、これらの制限を考慮に入れて、以下のワークフローを有利に確立することができる:報告されている公知のN−グリコシル化点で、アスパラギンをアスパラギン酸に置換して、PSAQ標準物質を設計する。このPSAQ標準物質および広範に脱グリコシル化された天然タンパク質を使用して、脱グリコシル化ペプチドの絶対量を、そのタンパク質の他の未グリコシル化ペプチドの絶対量と比較する。脱グリコシル化が完全であれば、ペプチドはすべて等モルであるはずである(図11を参照)。
本出願の全体にわたって、種々の参考文献は、本発明が関する現況技術を記載している。これらの参考文献の開示は、これにより参照によって本開示に組み込まれる。
Claims (19)
- 試料中の標的ポリペプチドを定量化するための方法であって、
(a)分析する試料を準備するステップと、
(b)前記標的ポリペプチドの既知量の同位体標識相同体を前記試料に添加し、それにより、スパイクされた試料を得るステップと、
(c)前記スパイクされた試料をプロテアーゼ活性で処理して、複数のタンパク質分解性ペプチドを得るステップと、
(d)質量分析法(MS)により、ステップc)で得られた前記タンパク質分解性ペプチドを分析するステップと、
(e)対応する未標識タンパク質分解性ペプチドに対する、同位体標識タンパク質分解性ペプチドの比率を決定するステップと、
f)前記比率および前記同位体標識相同体の既知量から、前記試料中の前記標的ポリペプチドの量を算出するステップと
を含む方法。 - 前記同位体標識相同体が、無細胞抽出物の使用により同位体標識される、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)がプロテアーゼにより実施される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記標的ポリペプチドが、バイオマーカー、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、植物タンパク質、酵母タンパク質、カビタンパク質、真菌タンパク質、動物タンパク質、または毒素である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記標的ポリペプチドがスーパー抗原性毒素である、請求項4に記載の方法。
- 前記試料が、生体液、組織ホモジネート、細胞ホモジネート、細胞培養上清、水、食物、または生物収集液から取得される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップ(b)とステップ(d)の間に1つまたは複数の分画ステップを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記標的ポリペプチドおよびその同位体標識相同体が、前記標的ポリペプチドとその同位体標識相同体の間の酸化状態の違いを回避するために、還元およびアルキル化されているか、または酸化剤により酸化されている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記標的ポリペプチドが1つまたは複数の翻訳後修飾を担持し、前記方法が、ステップ(a)とステップ(c)の間に、前記標的ポリペプチドの前記1つまたは複数の翻訳後修飾を取り除く追加的ステップを含み、前記同位体標識相同体が、前記標的ポリペプチドの前記1つまたは複数の翻訳後修飾を取り除く前記ステップにより取得されたポリペプチドの同位体標識相同体である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップ(c)で使用される前記プロテアーゼによりいったん消化された前記同位体標識相同体から、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 同位体標識ポリペプチドおよびプロテアーゼを別々の構成要素として含むキット。
- 前記プロテアーゼによりいったん消化された前記同位体標識ポリペプチドから、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる、請求項11に記載のキット。
- 前記同位体標識ポリペプチドまたは前記プロテアーゼによる前記同位体標識ポリペプチドの消化により取得されたタンパク質分解性ペプチドを認識する抗体をさらに含む、請求項11または12に記載のキット。
- 同位体標識ポリペプチドのライブラリー。
- 前記ライブラリーの前記同位体標識ポリペプチドがすべて、同じプロテアーゼにより切断可能であり、前記プロテアーゼによりいったん消化された前記ライブラリーの前記同位体標識ポリペプチドから、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる、請求項14に記載のライブラリー。
- 同位体標識ポリペプチドのライブラリーおよびプロテアーゼを別々の構成要素として含むキット。
- 前記プロテアーゼによりいったん消化された前記ライブラリーの前記同位体標識ポリペプチドから、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる、請求項16に記載のキット。
- 請求項14または15に記載の同位体標識ポリペプチドのライブラリーを含有する試料収集デバイス。
- 請求項14または15に記載の同位体標識ポリペプチドのライブラリーを含むマトリックスを含有する、請求項18に記載の収集デバイス。
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