WO2005036953A1 - 植物形質転換方法およびそれに用いる植物形質転換用器具 - Google Patents

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WO2005036953A1
WO2005036953A1 PCT/JP2004/015242 JP2004015242W WO2005036953A1 WO 2005036953 A1 WO2005036953 A1 WO 2005036953A1 JP 2004015242 W JP2004015242 W JP 2004015242W WO 2005036953 A1 WO2005036953 A1 WO 2005036953A1
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WO
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plant
microporous body
transformation
microporous
seeds
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PCT/JP2004/015242
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French (fr)
Inventor
Daisuke Suzumura
Ryou Hasegawa
Original Assignee
Phytoculture Control Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Definitions

  • Plant transformation method and plant transformation instrument used therefor Plant transformation method and plant transformation instrument used therefor
  • the present invention relates to a plant transformation method, a plant transformation instrument and a plant transformation system, and more particularly, to a plant transformation by a particle gun method or an in-planta method. It relates to preferred methods, instruments and systems. Further, the present invention relates to a method for selecting a plant having a heterologous gene of a parent transformed plant.
  • Non-Patent Document 1 Bechtold N, Ellis J, Pelletier (1993) In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C.R.Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316: 1194—1199.
  • Non-Patent Document 2 "Model Plant Laboratory Manual”, edited by Masaaki Iwabuchi, Kiyotaka Okada, Isao Shimamoto, Springer 'Fairlark Tokyo Co., Ltd., published on April 13, 2000
  • the experiment efficiency was low.
  • the culture soil is also immersed in the transformation solution, impurities are mixed in the solution, or the culture soil is infiltrated with the solution. Troubles, such as failures.
  • the vacuum infiltration method is used among the in-planter methods, the number of plants that can be treated in one operation is limited because the volume of the decompression chamber used is also limited.
  • a special space is required for the acclimatization treatment after the transformation, and a mistake tends to occur in the management of the plant until flowering and fruiting.
  • selection of a plant having a heterologous gene of a parent transgenic plant is usually carried out by checking the presence or absence of a drug resistance gene to be introduced simultaneously with the heterologous gene, so that the seed contains the drug. It is performed by determining whether or not it has the ability to germinate or grow on the selection medium.After that, the grown plants are replanted in the culture soil. Each time, a complicated operation of transferring a plant seed or a plant to a different selection medium is required, and roots are cut off when the plant is replanted from the selection medium to the culture soil. Furthermore, in the conventional selection method, when a plant is transferred between a plurality of selection media or under the condition of normal conditions for selection, stress due to rapid environmental changes may be applied when transferring to normal growth conditions. , Desirable,.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies in view of the above-described problems, and as a result, have grown a plant for transformation using a microporous body and directly subjected to transformation by an in-planter method.
  • the present inventors have found that the above problem can be solved by germinating and growing seeds obtained from a transformed plant on a microporous body immersed in a selection medium, thereby completing the present invention.
  • the seeds of the plant are germinated and grown on the surface of the microporous body, and the plant seeds lose the nutrient water retained by the communication holes of the microporous body. Grow by absorbing from the surface of the microporous body;
  • It is intended to provide a plant transformation method comprising applying a carrier solution holding a gene for transformation to a plant grown on the surface of the microporous body and transforming the carrier by an in-planter method.
  • the plant grows by absorbing nutrient water supplied by the microporous body, environmental management such as irrigation is not required for a long time. Further, since no soil is required, the occupied area per plant can be kept small, and a large number of plants can be efficiently grown and efficiently subjected to transformation. In addition, since it is possible to grow independently in one plant unit, it is possible to conduct an experiment in which a plant body having a uniform growth degree is selected and subjected to transformation. In addition, since a fluid medium such as soil is not used, a rigorous experiment can be performed without introducing impurities into a transformation solution that is easy to handle.
  • the conventional method requires operations such as squeezing out the carrier solution from the viewpoint of infiltration of the carrier solution into the soil at the time of transformation and biological containment.
  • the microporous body is filled with nutrients and water, which may cause stress on the body. This eliminates the need for operations such as squeezing the carrier solution, which makes it difficult for microorganisms and the like to invade the microporous body, thereby improving the efficiency of experiments and work and eliminating stress on the plant.
  • the microporous material is biologically contained.
  • sterilization must be carried out in a limited space such as an autoclave, but in this case, the treatment can be carried out efficiently for the reasons described above.
  • the ability to interfere with nutrients and water is low, and the microporous material that does not contain growth-inhibiting components allows plants to grow with high activity (growth power) and can maintain a certain nutrient and water content.
  • growth power growth power
  • the effect of the components to be contained can be directly exerted on the plant.
  • the plants are grown independently, physical contact between the plants can be minimized, and the plants can be protected from such physical stress.
  • the present invention also provides the method for transforming a plant according to the first aspect, wherein the in-planter method is a vacuum infiltration method in the second aspect.
  • the transformation efficiency of the plant in the first aspect can be further increased.
  • the plurality of microporous bodies are detachably held by holding means;
  • Plant seeds are sown on the surface of each microporous body, and the plant seeds germinate by absorbing the nutrient water retained by the communication holes inside the microporous body from the surface of the microporous body. Then;
  • the present invention also provides the method for transforming a plant according to the third aspect, wherein the in-planter method according to the fourth aspect is a vacuum infiltration method.
  • the transformation efficiency of the plant in the third aspect can be further increased.
  • a microporous body having a plant that has grown to a stage suitable for transformation is selected by applying only one microporous body.
  • a method for transforming a plant according to the third or fourth aspect which comprises carrying the transformant while retaining it in a retaining means.
  • the growth stages of the plants to be transformed can be made uniform, so that it is possible to carry out experiments using more strictly transformed plants. it can.
  • the carrier solution is sprayed and the carrier solution is applied only to a part of the plant through the opening.
  • the carrier solution is applied only to a target portion of the plant. be able to.
  • the present invention also relates to a seventh aspect, wherein the plant is Arabidopsis thaliana, and a part of the plant is a flower bud that has been pulled out.
  • a method for transforming a plant according to the sixth embodiment is provided.
  • a faster and more efficient experiment can be performed on a plant that is currently being actively studied using transformation.
  • the plant seeds will not germinate or grow
  • seeds or plants having heterozygous genes can be easily selected for multiple selections simply by changing the nutrient water for selection for immersing the microporous body.
  • the roots of the grown plants are not cut because they do not need to be replanted in the culture soil, and the nutrient water for selection gradually increases in the microporous body even when subjected to different selections. Therefore, the seeds or plants are not stressed by sudden environmental changes, and plants harboring the heterologous gene of the parent transgenic plant and the seeds obtained from the plants are strictly and simply and Faster 'can be selected efficiently.
  • the present invention provides the method according to the ninth aspect, wherein the plant seed having the resistance gene to the first selection agent obtained in the eighth aspect is sowed on the surface of the microporous body, In addition, the plant seed absorbs one or more selection agents or nutrients different from the first selection agent held by the communication holes inside the microporous body from the surface of the microporous body. At least one step of confirming that germination or growth has occurred and that a resistance gene to the selection drug different from the first selection drug is included, or that the trait of the gene to be introduced can be expressed as a phenotype.
  • the present invention provides a method for selecting a plant having a heterologous gene of a parent transgenic plant, characterized in that the method is performed more than once.
  • the parent transformant strictly possesses the heterologous gene of the object, and expresses it by expressing it You can select plants.
  • a microporous body for germinating and growing a plant seed on a surface having a communication hole for retaining nutrient water, and covering a plant having an opening
  • the plant seeds germinate and grow by absorbing the nutrient water retained by the communication holes of the microporous body by absorbing the surface force of the microporous body.
  • the present invention provides a plant transformation instrument used directly in the transformation method according to the embodiment.
  • the plants can be protected from damage or stress caused by contact between adjacent plants, It can reduce the mortality of the body and increase the efficiency of collecting plant seeds. In other words, it leads to improvement of transformation efficiency.
  • the plant transformation according to the tenth aspect wherein the carrier solution is applied to only a part of the plant through the opening when spraying the carrier solution.
  • Equipment
  • the carrier solution can be more reliably and easily adhered to only the target site of the plant, and the carrier (eg, agropacterium) other than the target site can be attached. It can reduce excessive (unnecessary for genetic recombination) stress on the plant due to infection of the plant, and can suppress a decrease in the activity of the plant. Therefore, the efficiency of plant seed collection is improved, and more transformants can be obtained. In other words, the efficiency of the transformation operation can be improved.
  • the carrier eg, agropacterium
  • plant seed refers to a seed of a plant in an ungerminated state
  • plant refers to a plant power after germination determined by a particle 'gun method or an in' planter method.
  • a plant that has grown to a stage suitable for transformation is referred to as a “plant”, which means that these plant seeds and plants are included.
  • transformation, object refers to a plant into which a heterologous gene has been introduced by the transformation method of the present invention or any other transformation method known in the art.
  • heterologous gene includes any foreign gene intended to be introduced into a plant, a marker gene such as a drug resistance for screening transformed plants, and the like. It includes genes involved in plant morphogenesis, genes of specific enzymes, genes involved in the production of useful substances, and genes involved in disease resistance.
  • carrier solution refers to a suspension of a carrier such as a bacterium or a virus containing a plasmid vector carrying a specific heterologous gene, which is capable of transforming a plant by the in-planter method.
  • a carrier such as a bacterium or a virus containing a plasmid vector carrying a specific heterologous gene, which is capable of transforming a plant by the in-planter method.
  • a suspension or homogenate for example, Agrobacterium tumefaciens (Agrobactenum tumefaciens no, "7 gulono, quarium 'Agrobacterium rhizogenes) suspensions and the like.
  • osmotic pressure control Additives suitable for transformation of plants by the in-planter method such as stabilizers, pH adjusters, surfactants, and plant growth regulators, can be included.
  • the transformation method by using the reduced pressure infiltration method of the in-planter method, the transformation efficiency of the plant can be further increased, and in that case, the same additive can be contained, Similar carriers can be used.
  • upper end and lower end respectively refer to a part on which a microporous plant seed is placed and a part facing the same.
  • the term “apply” refers to not only applying the carrier solution to the plant body by applying means such as a brush, but also spraying the carrier solution onto the plant body by spraying or the like. .
  • FIG. 1 is a view showing a method conventionally used for transforming a plant by an in-planter method.
  • FIG. 2 is a diagram showing a plant transformation system according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a plant transformation system according to one embodiment of the present invention, in which a plurality of microporous bodies inserted into one holding means are installed in a storage tank.
  • FIG. 4 is a partial cross-sectional view showing a microporous body provided with a nutrient supply unit according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing a plant transformation system according to one embodiment of the present invention in which a plurality of microporous bodies are fitted into a holding means having a tapered recess.
  • FIG. 6 is a diagram showing a step of transforming a plant by an in-planter method using the plant transformation system of the embodiment of FIG. 5.
  • FIG. 7 is a diagram showing a plant transformation system according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram showing a plant transformation system according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing a plant transformation device according to one embodiment of the present invention. Explanation of symbols
  • the plant transformation device of the present invention corresponds to the microporous material and the carrier solution used in the plant transformation system of the present invention, the plant transformation system is mainly described here. To explain plant transformation equipment, plant transformation method and plant selection method
  • FIG. 2 shows a microporous body (1) that germinates and grows plant seeds on its surface, where the microporous body is illustrated in a cylindrical form. After sufficient supply of nutrients and water, plant seeds are sown on the inner surface near the end to germinate and grow the plant seeds.
  • the inside of the microporous body is composed of communication holes, and if nutrient is supplied to a part of the microporous body, nutrient water is supplied to the whole of the microporous body through the communication holes and held inside. .
  • the seeds sown on the surface of the microporous body germinate and grow by absorbing the nourishment water retained inside the microporous body by the surface force of the microporous body.
  • the transfer of nutrient water to the plant occurs based on the difference in the suction power between the nutrient and the microporous body, and between the microporous body and the plant, and the suction force at the contact point between the microporous body and the plant.
  • the capillary force is recovered by the amount of the microporous body dried, and the microporous body absorbs and retains the nutrient water again, so that the nutrient water is always supplied to the plant without excess or shortage.
  • plants that are susceptible to drying and wetness can be germinated and grown stably and easily.
  • FIG. 2 shows a holding means (2) capable of detachably holding the plurality of microporous bodies (1), wherein the holding means (2) has a cylindrical shape.
  • a hole (3) having a diameter substantially the same as the outer diameter of the microporous body is provided so that the microporous body can be detachably held.
  • the part is provided with a taper (4) and a ring (5).
  • the other ring (not shown) of the holding means (2) is passed through the lower end force of the microporous body, and the holding means (2) is clamped together with the ring (5) by passing the lower force.
  • the holding means (2) of the porous body (1) can hold the porous body securely without being displaced, and the vertical positions of the plurality of plant bodies can be adjusted to a fixed position.
  • These tapers and rings may have the same material strength as the microporous body (1), or may have the same material strength as resin, or may have a taper (4) and ring.
  • the microporous body itself may be integrally molded into these shapes.
  • the plant transformation system of the present invention comprises at least these microporous bodies and holding means.
  • a part of the plurality of microporous bodies (1) inserted into the holes (3) of the holding means (2) as described above is stored in the storage tank (6).
  • plant seeds are sown on the inner surface near the upper end of the microporous body (1) and the plant is seeded. Germinate by incubating under normal growth and growth conditions.
  • the microporous body is stably installed on the holding means by substantially matching the size of the holding means (2) with the size of the storage tank (6).
  • the plant in order to apply the carrier solution only to a specific part of the plant, the plant is shielded so that only the part is opened.
  • Means can be provided, but in FIG. 3, the storage tank (6) serves as a shielding means and opens its upper surface so that the carrier solution is applied only to the upper part of the grown plant. Lateral force of the tank (6) The carrier solution can be sprayed.
  • a microporous body (1) is provided with a nutrient and water supply means (9) together with a locking means (8), Nutrient water can also be indirectly supplied to the microporous body via the supply means.
  • the locking means (8) is preferably made of a material having shrinkage and repulsion, such as foamed polystyrene, foamed polyurethane, foamed polyethylene, or a material such as polypropylene or polyethylene. It has a material and structure that can lock the nutrient and water supply means to the microporous body without lowering the performance.
  • the nutrient and water supply means (9) has a material and shape that can supply nutrient and moisture to the microporous body even when the microporous body is suspended substantially vertically and the other end is immersed in the nutrient and moisture.
  • it also has an open-cell foamed plastic such as a cord-shaped polyvinyl alcohol, or a fiber bundle such as a glass fiber, a carbon fiber, an acrylic fiber, and a nonwoven fabric.
  • the microporous body (1) can be detachably held by press-fitting the lower end thereof.
  • a plurality of microporous bodies held by the means (30) are shown, wherein the holding means is provided with a tapered recess (10), into which one end is press-fitted. Body (1) is retained. Also, by storing the nutrient water in the tapered recess (10) of the holding means (30), the nutrient water is directly supplied to the microporous body, and the microporous body (1) and the holding means (30) are supplied. ), A plant transformation system that is powerful.
  • a plurality of microporous materials are removably press-fitted into the holding means and the nutrient water is dispensed into the tapered recess of the holding means (I). Seeding of plant seeds on the surface of each microporous material supplied to the whole ( ⁇ ), germination of plant seeds * Growth process ( ⁇ ), after a certain period, plants are divided into groups according to their growth stages
  • the method includes a step (IV), a step (V) of selecting only a group suitable for transformation, and a step (VI) of applying a carrier solution to the plants of the selected group to transform.
  • a mode using the above-mentioned tapered concave portion as the holding means is shown!
  • the holding means can hold a plurality of microporous bodies
  • the form of the shift is as follows. It may be.
  • a shielding means is provided on the microporous body during the step (I) and the carrier solution is sprayed at the time of the application in the step (VI), and the carrier solution is applied only to a specific part of the plant. May be applied.
  • the plant can be placed under reduced pressure conditions to increase the carrier infection efficiency.
  • the transformed plant can be confirmed by any method well-known to those skilled in the field of genetic engineering.
  • a certain drug selection marker is previously used as a carrier. Seeds obtained from the plants are selected for their ability to grow on a medium containing the drug, and then the selected plants are crossed, and the seeds are collected and grown. Finally, the expression of the heterologous gene for the purpose of introduction (plant morphology, enzymatic activity, production of specific substances, disease resistance, etc.) can be confirmed.
  • the microporous body used in the present invention can be any one that can supply and retain nutrient water that has come into contact with a part of the microporous body through the internal communication hole as described above.
  • water absorption capable of holding 0.05 to 0.5 (weight Z weight) times, preferably 0.05 to 0.3 times, more preferably 0.1 to 0.2 times water at 20 ° C is usually used.
  • a microporous body having a porosity (volume Z volume) of preferably 0.1 to 0.4, more preferably 0.2 to 0.3 is preferable.
  • Such a microporous material is prepared by kneading a non-metallic inorganic solid material such as No. 10 soil, porcelain No. 2 soil (Shiroyama Cerapot Co., Ltd.), Murakami clay (produced in Niigata Prefecture) or the like according to a usual method.
  • the non-metallic inorganic solid raw material when the non-metallic inorganic solid raw material is made into a microporous material that is microporous and easily absorbs and releases moisture, for example, it contains 50 to 60% by weight of petalite, alumina, and the like. It is preferable to bake.
  • the Bae Taraito usually 70 to 90 wt%, preferably 75 - 85 weight 0/0, more preferably 75 - 80 weight 0/0 of SiO, usually 10- 20
  • Wt% preferably 12-18 wt%, more preferably 15-17 wt% Al 2 O 3,
  • 0.1-0.5 wt% preferably 0.2-0.5 wt%, more preferably 0.3-0.45 wt% 1 ⁇ 0, and usually 0.5-2 wt%, preferably 0.7-1.8 wt%, more preferably 0.8-1.
  • the non-metallic inorganic solid raw material may contain a powdered inorganic foam.
  • the microporous body used in the present invention may be made of a nonmetallic inorganic material whose strength does not substantially decrease even when water is absorbed.
  • Examples of the method for molding the nonmetallic inorganic solid raw material include molding methods known in the art, such as injection molding, extrusion molding, press molding, potter's wheel molding, etc. 1S Especially mass production and cost reduction Extrusion molding is preferred. In addition, drying after molding can be performed using ordinary methods and conditions known in the art. Subsequent firing of the molded body is not particularly limited as long as it is a condition and method usually performed.For example, it is possible to select, for example, oxidizing firing in which a desired pore is easily obtained. 1000 ° C-2000 ° C, preferably 1100 ° C-1500 ° C, more preferably 1150-1300 ° C, most preferably around 1200 ° C. If the sintering temperature of the nonmetallic inorganic solid raw material is lower than 1000 ° C, the sulfur component tends to remain, while if it exceeds 2000 ° C, the desired water absorption cannot be obtained.
  • examples of a method for molding a microporous body made of an open-cell plastic foam include methods such as melt foam molding, solid phase foam molding, and cast foam molding. Processes include melt kneading, unfoamed sheet molding, heat foaming or pressing. Foaming, cooling, cutting and kneading.
  • solid-state foam molding a polymer is foamed in or near a solid phase.
  • casting foam molding a liquid raw material (monomer or oligomer) is cast in the air while reacting in the air to foam.
  • a foaming agent is generally used in order to foam a continuous foam type plastic foam.
  • the microporous body can be formed in a shape of! / ⁇ depending on the type of the target plant and the use conditions, but is preferably cylindrical, flat, columnar, or bottomed.
  • the shape may be a cylindrical shape, a columnar body having a honeycomb-shaped cross section, or a cylindrical shape having a polygonal cross section (for example, a hexagonal cylinder or a square cylinder).
  • the holding means used in the present invention holds the microporous body by means of fitting or press-fitting, applies the carrier solution to the plant body as described above, and performs the in-planter method.
  • the material and the shape may be different, but preferably, as described above, a plate-like polystyrene foam having holes or tapered recesses, foamed polyethylene, The foamed polyurethane power can also be higher.
  • the holding means is preferably made of a material having elasticity and capable of repeatedly holding the microporous body in a detachable manner.
  • the holding means for holding the microporous body is moved to a predetermined position by another transporting means (not shown). It is also contemplated that the carrier solution is applied to a plurality of plants almost simultaneously by the application means.
  • the holding means used in the present invention can be a holding means (40) having a partially cylindrical concave portion to which a microporous body can be laterally mounted as shown in FIG.
  • the carrier solution can be applied almost simultaneously to a plurality of plants by the holding means fitted with the microporous body.
  • the holding means used in the present invention can be holding means (60) for holding the side portions of a plurality of microporous bodies.
  • the holding means of this embodiment is provided with a wavy hook that can be held so that the microporous body (1) does not fall off.
  • the holding means of this embodiment has wings (21) that reduce the labor for supporting the microporous body and that can be placed on the side wall of the storage tank when immersing the plant in nutrient water. Is provided. Further, in the present invention, as shown in FIG.
  • the surroundings of the plants grown on the microporous body to a stage suitable for the transformation by the in ′ planter method are covered with a shielding means such as a sleeve (24). ).
  • a shielding means such as a sleeve (24).
  • the shielding means can be easily handled alone even when a plurality of microporous bodies and plants are arranged at high density, and can protect plants from damage due to contact between adjacent plants. .
  • the leaves of adjacent plants will adhere to each other, which may damage the leaves when handled alone, or damage the adjacent plants due to vibration during transportation. However, it can be prevented by covering with a shielding means such as a sleeve.
  • the shielding means may be of any shape and material as long as it can cover the periphery of the plant! / Those made of a plastic film such as a cellophane film are more preferable.
  • the sleeve may be fixed to the holding means with a string, rubber band, or the like, in addition to the upper part of the microporous body as shown in FIG.
  • examples of plants to be subjected to the plant transformation system of the present invention are not particularly limited as long as they can be transformed by an in-planter method or a vacuum infiltration method.
  • dokuzerimodoki (Ammi majus), onion (Allium cepa),-, snowy (Allium sativum), celery (Apium graveolens), Z snow ⁇ fu gas (Asparagus officinalis), Ansai (Beta vulgaris), Caliphwa ⁇ ⁇ ( Botrytis, Brassica oleracea var.gemmifera, Cabbage (Brassica oleracea var.
  • the nutrient water used in the present invention is water or nitrate nitrogen, ammonia nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, iron and manganese, copper, zinc, molybdenum necessary for germinating and growing plant seeds.
  • vitamins such as thiamine, pyridoxine, nicotinic acid, piotin and folic acid, natural substances such as coconut milk, casein hydrolyzate and yeast extract, and glutamic acid, aspartic acid and alanine.
  • Contains plant growth regulators such as nitrogen source, auxin, cytoforce, gibberellin, carbon sources such as glucose, sucrose, fructose, and maltose; antibiotics such as kanamycin and hygromycin; and pesticides such as nosta. It is an aqueous solution.
  • in ′ planter method and the reduced pressure infiltration method used in the present invention are described, for example, in Bechtold N, Ellis J, Pelletier (1993) In planta Agrobactenum mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants.CR Acad. Sci. Paris, Life sciences 316: 1194-1199. And "Model Plant Laboratory Manual”, edited by Masaaki Iwabuchi, Kiyotaka Okada, Isao Shimamoto, Springer 'Fairlark Tokyo K.K., published on April 13, 2000 be able to.
  • a plant grown on the microporous body according to the present invention is prepared in a form suitable for transformation, and then a carrier solution for transformation is applied thereto to apply a vacuum.
  • a carrier solution for transformation is applied thereto to apply a vacuum.
  • the plants are grown under appropriate acclimatization conditions, and transformants are selected on a medium containing an antibiotic or the like by a conventional method, and seeds and the like can be harvested if desired.
  • the present invention also provides a method for plant transformation, a device for plant transformation, a system for plant transformation, and a method for selecting a plant seed and a plant having a heterologous gene from a parent transformed plant.

Abstract

　本発明は、植物形質転換方法ならびに植物形質転換用器具および植物形質転換用システム、より詳細には、パーティクル・ガン法またはイン・プランタ（in planta）法による植物体の形質転換に好適な方法、器具およびシステムに関する。さらに、本発明は、親形質転換植物体の異種遺伝子を保有する植物の選抜方法にも関する。本発明は、微多孔質体の表面で植物種子を発芽・生育させ、ここに植物種子は微多孔質体が有する連通孔により保持された養水分を該微多孔質体の表面から吸収して生育し；ついで該微多孔質体の表面に生育した植物体に形質転換用遺伝子を保持する担体溶液を塗布してイン・プランタ法により形質転換することを含む植物形質転換方法を提供する。

Description

明 細 書
植物形質転換方法およびそれに用いる植物形質転換用器具
技術分野
[0001] 本発明は、植物形質転換方法ならびに植物形質転換用器具および植物形質転換 用システム、より詳細には、パーティクル ·ガン法またはイン 'プランタ（in planta)法に よる植物体の形質転換に好適な方法、器具およびシステムに関する。さらに、本発明 は、親形質転換植物体の異種遺伝子を保有する植物の選抜方法にも関する。
背景技術
[0002] 現在、高等植物における形質転換は、食糧増産のための育種改良や植物固有の 有用物質生産の高速 ·効率ィ匕につながるとして大きな注目を集めている。その中でも 、高等植物のモデル植物として特に研究が進められて ヽるシロイヌナズナおよびイネ 、その他タバコなどではパーティクル'ガン法や簡便なイン'プランタ法による形質転 換が盛んに行われ、研究 ·開発速度が高速ィ匕している (非特許文献 1および非特許 文献 2を参照されたい)。したがって、健全で高品質の植物体を質的および量的に安 定して供給し得る、より厳密，簡便、かつより高速，効率的な実験、研究および開発方 法が求められている。
[0003] 非特許文献 1： Bechtold N, Ellis J, Pelletier (1993) In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194—1199.
非特許文献 2 : "モデル植物ラボマニュアル"、編者 岩渕雅榭、岡田清孝、島本功、 シュプリンガー 'フエアラーク東京株式会社、 2000年 4月 13日発行
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] し力しながら、従来行われている植物体のパーティクル ·ガン法では大きな設備が 必要な上、細胞培養を行って植物体まで分化させなければ個体、種子が採取できず 、実験に長時間を要する。また、イン'プランタ法による形質転換では、図 1に示すよう に、植物栽培用ポットなどの容器に入れた培養土で生育させた植物体を用いるため に、灌水などの環境管理が必要であった。また、 1の容器は被験植物体の数、大きさ に比して大きぐ多数の植物体を生育するためには広いスペースや大型の環境制御 設備が必要となり、比較的大きな研究施設でないと実験効率を向上させることができ なかった。また、容器単位で植物体を形質転換しているため、形質転換時に植物体 の生育度合いを細力べ揃えた実験ができな力つたり、担体溶液に浸漬するのに適し ていない被験植物体もあり、実験効率が低力つた。また、植物体は容器に植えた状 態で形質転換用の溶液に浸漬するために、培養土も形質転換用の溶液に浸漬され たり、溶液に不純物が混入したり、培養土に溶液が浸潤するなどの不具合を生じるこ とがあった。また、イン'プランタ法のうち減圧浸潤法を用いる場合には、用いる減圧 用チャンバ一にも容積制限があるため、一回の操作で処理し得る植物体の数が制限 されていた。さらに、形質転換後の順化処理にも特別なスペースを必要とし、開花' 結実までの植物体の管理にミスが生じ易いという問題があった。また、減圧下に置い たり、浸透圧調節剤を用いることにより、組換え対象となる植物体は弱り、さらにァグロ ノ クテリゥムの感染により弱る。その結果、植物体は開花 ·結実する前にその多くの個 体が死滅してしまう。したがって、高い形質転換効率が期待される過酷な条件にも耐 性があり、活性度 (生命力）が高ぐ実験用植物として均一な状態の植物体の供給が 強く求められていた。また、大量の植物を同時に形質転換することにより、より形質転 換の効率を高めることが望まれて 、た。
[0005] また、従来、親形質転換植物体の異種遺伝子を保有する植物の選抜は、通常、異 種遺伝子と同時に導入される薬剤耐性遺伝子の保有の有無について、種子が該薬 剤を含有する選抜用培地で発芽ないし生育する能力を有するか否かを判定すること により行われ、その後、生育した植物体は培養土に植え替えられているが、複数の選 抜を行う場合には、その都度、異なる選抜用培地に植物種子ないし植物体を移す煩 雑な操作が必要であり、また、植物体を選抜用培地から培養土に植え替える際に根 が切断されるという問題があった。さらに、従来の選抜方法では、植物体を複数の選 抜用培地間でまたは選抜用の条件力 通常の生育条件下に移行する際には急激な 環境変化によるストレスが力かることも考えられるため、望ましくな 、。
[0006] 上述のように、従来の培養土で生育させる植物体の形質転換法および親形質転換 体の異種遺伝子を保有する植物の選抜方法では、厳密'簡便、かつより高速'効率 的な実験、研究および開発方法を行うことができな力つた。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、前記の問題点に鑑みて鋭意検討した結果、微多孔質体を介して形 質転換用の植物体を生育させ、そのままイン ·プランタ法による形質転換に付すこと により、また、形質転換植物体から得られた種子を選抜用培地に浸漬した微多孔質 体上で発芽、生育させることにより前記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完 成するに至った。
[0008] すなわち、本発明は、第 1の態様において、微多孔質体の表面で植物種子を発芽 •生育させ、ここに植物種子は微多孔質体が有する連通孔により保持された養水分を 該微多孔質体の表面から吸収して生育し；っ 、で
該微多孔質体の表面に生育した植物体に形質転換用遺伝子を保持する担体溶液 を塗布してイン'プランタ法により形質転換することを含む植物形質転換方法を提供 する。
[0009] 本発明の第 1の態様によれば、植物体が微多孔質体によって供給される養水分を 吸収して生育するため、長期間、灌水などの環境管理が不要となる。また、土壌を必 要としないため、 1の植物体当りの占有面積を小さく抑えることができ、多数の植物体 を効率よく生育させ、また、効率よく形質転換に付すことができる。また、 1の植物体 単位で独立して生育し得るため、生育度合いを細力べ揃えた植物体を選抜して形質 転換に付する実験が可能となる。また、土壌などの流動性の媒体を用いないため、 取扱い易ぐ形質転換用の溶液に不純物が混入することなぐ厳密な実験を行うこと ができる。さらに、従来の方法では、形質転換時に担体溶液が土壌に浸潤しやすぐ 生物的封じ込めの観点から土壌力 担体溶液を搾り出すなどの作業が必要であり、 実験および作業効率が低下する上、植物体にストレスを与えることもあったが、本発 明では、微多孔質体に養水分が充満しているため、形質転換時に、担体溶液が微 多孔質体に接触してもその担体溶液中の微生物等が微多孔質体に侵入しにくぐ担 体溶液を搾り出すなどの作業が不必要となり、実験および作業効率が向上し、植物 体にストレスを与えることもなくなる。また、使用後、微多孔質体は、生物的封じ込め および再利用または廃棄の観点力 オートクレープ等の制限された空間中で殺菌処 理しなければならないが、その際にも上述した理由によって効率的に処理することが できる。
また、土壌等とは異なり養水分への干渉能力が低ぐ成長阻害成分を含まない微 多孔質体により、植物を高い活性度 (成長力)でもって生育させることができ、所定の 養水分に含有させる成分 (植物体に与える所定の効果を有する成分)の影響を植物 体に直接及ぼすことができる。また、独立して植物体を生育させるため、植物体同士 の物理的な接触を最小限に抑えることが可能となり、植物体をかかる物理的ストレス 力ら保護することができる。
[0010] また、本発明は、第 2の態様において、イン'プランタ法が減圧浸潤法であることを 特徴とする第 1の態様の植物形質転換方法を提供する。
[0011] 本発明の第 2の態様によれば、第 1の態様における植物体の形質転換効率をさら に高めることができる。
[0012] また、本発明は、第 3の態様において、複数の微多孔質体を保持手段に着脱可能 に保持し；
各微多孔質体の表面に植物種子を播種し、ここに植物種子は微多孔質体内部が 有する連通孔により保持された養水分を該微多孔質体の表面から吸収して発芽 '生 育し；ついで
該保持手段に保持された複数の微多孔質体の表面に生育した複数の植物体に形 質転換用遺伝子を保持する担体溶液を略同時に塗布してイン'プランタ法により形 質転換することを含む植物形質転換方法を提供する。
[0013] 本発明の第 3の態様によれば、上述した第 1の態様の利点に加えて、複数の植物 体を平行して同時に形質転換に付する実験が可能となるため、より高速 ·効率的な実 験を行うことができる。
[0014] また、本発明は、第 4の態様において、イン'プランタ法が減圧浸潤法であることを 特徴とする第 3の態様の植物形質転換方法を提供する。
[0015] 本発明の第 4の態様によれば、第 3の態様における植物体の形質転換効率をさら に高めることができる。 [0016] また、本発明は、第 5の態様において、さらに、担体溶液を塗布する前に、形質転 換に好適な段階まで生育した植物体を有する微多孔質体のみを選抜して 1の保持 手段に保持して、形質転換に付すことを含む第 3または 4の態様の植物形質転換方 法を提供する。
[0017] 本発明の第 5の態様によれば、形質転換に付する植物体の成長段階を均一に揃え ることができるので、より厳密な形質転 ^¾物を用いた実験を行うことができる。
[0018] また、本発明は、第 6の態様において、開口を有する遮蔽手段によって植物体を覆 つた後に、担体溶液を噴霧して該開口を通じて植物体の一部分のみに担体溶液を 塗布することを特徴とする第 1一 5いずれか 1の態様の植物形質転換方法を提供する
[0019] 本発明の第 6の態様によれば、第 1一 5の態様の利点に加えて、担体溶液を植物 体に噴霧しても、植物体の目的の部分にのみ担体溶液を塗布することができる。
[0020] また、本発明は、第 7の態様にお!、て、該植物体がシロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana)であって、該植物体の一部分が抽台した花芽であることを特徴とする第 6の 態様の植物形質転換方法を提供する。
[0021] 本発明の第 7の態様によれば、形質転換を利用する研究が現在盛んに行われてい る植物体についてより高速 ·効率的な実験を行うことができる。
[0022] また、本発明は、第 8の態様において、（i)微多孔質体の一部分を 1以上の第 1の 選抜用薬剤を含有する養水分に浸潰し；
(ii)第 1一 7の態様に記載の植物形質転換方法により得られた形質転換植物体か ら得られた植物種子を該微多孔質体の表面に播種し、ここに形質転,物体は該 第 1の選抜用薬剤に対する耐性遺伝子を含む少なくとも 1の異種遺伝子で形質転換 されており、ここに植物種子は微多孔質体内部が有する連通孔により保持された選 抜用薬剤を含有する養水分を該微多孔質体の表面から吸収して、親形質転換植物 体の該異種遺伝子を保有する植物種子は発芽な 、し生育することができ、親形質転
^¾物体の該異種遺伝子を保有しな 、植物種子は発芽な 、し生育することができ ず；ついで
(iii)発芽な 、し生育することができた植物体を得る力、または、 さらに、この植物体力 得られた植物種子と第 1の選抜用薬剤またはその代わりに該 第 1の選抜用薬剤とは異なる 1以上の選抜用薬剤とを用いて (i)ないし (iii)の工程を 1回以上繰返すことを含み、ここに該形質転換植物体がその選抜用薬剤に対する耐 性遺伝子をも含むことを特徴とする親形質転換植物体の異種遺伝子を保有する植 物の選抜方法を提供する。
[0023] 本発明の第 8の態様によれば、微多孔質体を浸漬する選抜用の養水分を取り換え るだけで異型接合体遺伝子を保有する種子ないし植物体を複数の選抜に簡便に付 すことができ、培養土に植え替える必要がないため生育した植物体の根が切断され ることもなく、また、異なる選抜に付す場合にも選抜用の養水分が微多孔質体内で徐 々に置換されるため種子ないし植物体に急激な環境変化によるストレスが力かること もなく、親形質転換植物の異種遺伝子を保有する植物体およびその植物体から得ら れる種子を厳密'簡便、かつより高速 '効率的に選抜することができる。
[0024] また、本発明は、第 9の態様において、第 8の態様で得られた、第 1の選抜用薬剤 に対する耐性遺伝子を有する植物種子を該微多孔質体の表面に播種し、ここに、該 植物種子は微多孔質体内部が有する連通孔により保持された該第 1の選抜用薬剤 とは異なる 1以上の選抜用薬剤もしくは養水分を該微多孔質体の表面から吸収して、 発芽ないし生育し、該第 1の選抜用薬剤とは異なる選抜用薬剤に対する耐性遺伝子 を含むこと、もしくは導入目的とした遺伝子の形質が表現形として表現し得ることを確 認する作業を少なくとも 1回以上行うことを特徴とする親形質転換植物体の異種遺伝 子を保有する植物の選抜方法を提供する。
[0025] 本発明の第 9の態様によれば、第 8の態様において記載したような利点にカ卩えて、 さらに厳密に親形質転,物体の異種遺伝子を保有し、かつ、それを形質発現する 植物を選抜することができる。
[0026] また、本発明は、第 10の態様において、養水分を保持した連通孔を有し、表面で 植物種子を発芽 *生育させるための微多孔質体と、開口を有する植物体を覆うため の遮蔽手段とを含み、ここに植物種子は微多孔質体が有する連通孔により保持され た養水分を該微多孔質体の表面力 吸収して発芽 ·生育することを特徴とする第 6の 態様の形質転換方法に直接使用する植物形質転換用器具を提供する。 [0027] 本発明の第 10の態様によれば、高密度で複数の植物体が配置された場合でも、 隣接した植物体同士の接触による損傷やストレスから植物体を保護することができ、 植物体の枯死率を下げたり、植物種子の採取効率を高めることができる。つまりは、 形質転換効率を向上させることにつながる。
[0028] また、本発明は、第 11の態様において、担体溶液を噴霧する際に、該該開口を通 して植物体の一部のみに担体溶液を塗布する第 10の態様の植物形質転換用器具 を提供する。
[0029] 本発明の第 11の態様によれば、より確実かつ簡単に、植物体の目的部位にのみ 担体溶液を付着させることができ、目的部位以外への担体 (ァグロパクテリゥムなど） の感染による過剰な (遺伝子組換え作業に不必要な)植物体へのストレスを軽減し、 植物体の活性度の低下を抑制することができる。したがって、植物種子の採取効率 が向上し、より多くの形質転換体を得ることができ、つまりは、形質転換作業の効率を 向上させることができる。
[0030] 本明細書中にて「植物種子」とは、未発芽状態の植物の種を! 、、また「植物体」と は、発芽後の植物力もパーティクル'ガン法またはイン'プランタ法による形質転換に 好適な段階まで生育した植物までを 、 、、単に「植物」と 、う場合はこれら植物種子 および植物体を包含することを意味する。さら〖こ、「形質転,物体」とは、本発明の 形質転換方法または当該技術分野で知られて ヽる ヽずれか他の形質転換方法によ り異種遺伝子が導入された植物体をいい、ここに「異種遺伝子」とは、植物に導入す ることを目的とする ヽずれの外来の遺伝子をも ヽ、形質転換された植物をスクリー ユングするための薬剤耐性等のマーカー遺伝子のほか、植物の形態形成に関与す る遺伝子、特定の酵素の遺伝子、有用物質の生産に関与する遺伝子、病害抵抗性 に関連する遺伝子などが含まれる。
[0031] また、本明細書中にて「担体溶液」とは、イン'プランタ法により植物体を形質転換し 得る、特定の異種遺伝子を担持するプラスミドベクターを含む細菌、ウィルスなどの 担体の懸濁液またはホモジネートをいい、例えば、ァグロバタテリゥム 'ッメファシェン ス (Agrobactenum tumefaciensノ、 "7グロノ、クァリウム'リゾゲネス (Agrobacterium rhizogenes)の懸濁液などが挙げられ、この担体溶液には、例えば緩衝剤、浸透圧調 整剤、 pH調整剤、表面活性剤、植物成長調節剤などの植物体のイン'プランタ法に よる形質転換に好適な添加剤を含有させることができる。また、形質転換方法として は、イン'プランタ法のうち減圧浸潤法を用いることにより、植物体の形質転換効率を さらに高めることができ、その場合においても同様の添加剤を含有させることができ、 同様の担体を用いることができる。
[0032] また、本明細書中にて「上端」および「下端」という場合は、各々、微多孔質体の植 物種子を設置する側およびそれと対畤する側の部分をいう。
また、本明細書中にて「塗布する」という場合は、刷毛等の塗布手段で担体溶液を 植物体に接触させて塗ることのほか、スプレー等によって担体溶液を植物体に噴霧 することをいう。
図面の簡単な説明
[0033] [図 1]図 1は、イン'プランタ法により植物体を形質転換するために従来用いられてい た方法を示す図である。
[図 2]図 2は、本発明の 1の実施形態の植物形質転換用システムを示す図である。
[図 3]図 3は、 1の保持手段に挿嵌された複数の微多孔質体を貯溜タンクに設置して いる本発明の 1の実施形態の植物形質転換用システムを示す図である。
[図 4]図 4は、本発明の 1の実施形態における養水分供給手段を付設した微多孔質 体を示す部分断面図である。
[図 5]図 5は、テーパ状凹部を有する保持手段に複数の微多孔質体を揷嵌した本発 明の 1の実施形態の植物形質転換用システムを示す図である。
[図 6]図 6は、図 5の実施形態の植物形質転換用システムを用いて植物体をイン 'ブラ ンタ法により形質転換する工程を示す図である。
[図 7]図 7は、本発明の 1の実施形態の植物形質転換用システムを示す図である。
[図 8]図 8は、本発明の 1の実施形態の植物形質転換用システムを示す図である。
[図 9]図 9は、本発明の 1の実施形態における植物形質転換用器具を示す図である。 符号の説明
[0034] 1 微多孔質体
2 保持手段 3 孔
4 テ ~~パ
5 リング
6 貯溜タンク
7 養水分
8 係止手段
9 養水分供給手段
10 テーパ状凹部
21 翼部
24 遮蔽手段
30 保持手段
40 保持手段
60 保持手段
発明を実施するための最良の形態
[0035] つぎに、図 2— 9に参照して本発明の実施形態を説明する。なお、本発明の植物形 質転換用器具は、本発明の植物形質転換用システムで用いる微多孔質体および担 体溶液にも相当するため、ここでは主として植物形質転換用システムを説明し、併せ て植物形質転換用器具および植物形質転換法ならびに植物の選抜方法を説明する
[0036] まず、図 2においては、その表面で植物種子を発芽 ·生育させる微多孔質体（1)が 示されており、ここにおいて微多孔質体は円筒形の態様で図示されており、養水分な どを十分に供給した後に端部付近の内側表面に植物種子を播種して植物種子を発 芽'生育させる。微多孔質体の内部は連通孔からなり、微多孔質体の一部分に養水 分が供給されれば、連通孔を通して微多孔質体の全体にわたって養水分が供給さ れて内部に保持される。微多孔質体の表面に播種された種子は、その微多孔質体 の内部に保持された養水分を該微多孔質体の表面力 吸収することにより発芽-生 育する。
[0037] すなわち、必ずしもこの理論に拘束されるものではないが、植物までの養水分の移 動は、養水分と微多孔質体、微多孔質体と植物、それぞれの接点での吸引力の差に 基づいて生じ、植物が利用した分だけ微多孔質体が保持する養水分が乾燥し、微多 孔質体が乾燥した分だけ毛管力が回復し、再び微多孔質体が養水分を吸収 ·保持 すると考えられ、常に植物に養水分が過不足なく供給される。これにより、乾燥や多 湿潤に弱い植物も安定かつ簡便に発芽 ·生育させることができる。
[0038] また、図 2には、複数の上記微多孔質体（1)を着脱可能に保持し得る保持手段 (2) が示されており、ここにおいて保持手段（2)には、円筒形の微多孔質体を着脱可能 に保持することができるように、微多孔質体の外径と略同じ径を有する孔 (3)が設け られており、一方、微多孔質体の 1の端部にはテーパ (4)およびリング (5)が設けられ ている。これらのテーパ (4)およびリング（5)を設けることにより、微多孔質体の外径 および保持手段の孔の径が高 、寸法誤差で作成されて!、な 、場合でも、微多孔質 体（1)を孔（3)に挿嵌して両者を一定の位置で確実に保持することができる。さらに、 挿嵌後、保持手段（2)の下側力も図示していないもう 1のリングを微多孔質体の下端 力も通してリング (5)と共に保持手段 (2)を挟持することにより、微多孔質体（1)の保 持手段 (2)上の位置がずれることなぐ確実に保持し、複数の植物体の縦方向の位 置を一定に合せることができる。これらのテーパおよびリングは、微多孔質体（1)と同 じ材料力もなるものであってもよぐ榭脂などの材質力もなるものであってもよぐある いはテーパ (4)およびリング（5)につ 、ては微多孔質体自体をこれらの形状に一体 成型してもよい。本発明の植物形質転換用システムは、少なくともこれらの微多孔質 体と保持手段とからなる。
[0039] つぎに、図 3に図示するように、前記のように保持手段（2)の孔（3)に挿嵌した複数 の微多孔質体（1)の一部分を貯溜タンク (6)に貯めたの養水分 (7)に浸漬して、微 多孔質体の全体にわたって養水分を供給させた後に、微多孔質体（1)の上端付近 の内側表面に植物種子を播種し、その植物の通常の発芽 ·生育条件下でインキュべ ートすることにより発芽 '生育させる。なお、この実施形態においては、保持手段（2) のサイズと貯溜タンク (6)のサイズとを略合致させることによって、微多孔質体を保持 手段に安定して設置している。なお、本発明の 1の実施形態においては、植物体の 特定の部分のみに担体溶液を塗布する目的で、該部分のみが開口するように遮蔽 手段を設けることができるが、図 3においては、貯溜タンク（6)が遮蔽手段となってそ の上面を開口させ、生育した植物体の上部のみに担体溶液が塗布されるように、貯 溜タンク（6)の側方力 担体溶液を噴霧することができる。
[0040] また、もう 1の実施形態として、図 4に図示するように、微多孔質体（1)に係止手段（ 8)と共に養水分供給手段 (9)を付設して、その養水分供給手段を介して養水分を間 接的に微多孔質体に供給することもできる。かかる係止手段 (8)は、好ましくは、発泡 スチロール、発泡ポリウレタン、発泡ポリエチレンなどの収縮 ·反発力を有する素材、 またはポリプロピレン、ポリエチレンなどの素材で構成され、養水分供給手段の養水 分供給能力を低下せずに養水分供給手段を微多孔質体に係止し得る素材、構造を 有する。また、養水分供給手段 (9)は、略垂直に微多孔質体力も懸架してその他端 を養水分に浸潰した場合にも養水分を微多孔質体に供給し得る材質、形状力もなり 、好ましくは、紐形のポリビニルアルコールのような連続気泡型発泡プラスチックや、 グラスファイバー、炭素繊維、アクリル繊維などの繊維束ゃ不織布力もなる。
[0041] また、もう 1の実施形態として、図 5に示す植物形質転換用システムにおいては、微 多孔質体（1)の下端を圧入することにより着脱可能に保持することができる形態の保 持手段 (30)に保持された複数の微多孔質体が示されており、ここにおいて保持手 段にはテーパ状凹部（10)が設けられており、そこに一端を圧入することによって微 多孔質体（1)が保持される。また、保持手段 (30)のテーパ状凹部（10)に養水分を 貯溜することにより養水分が直接的に微多孔質体に供給され、微多孔質体 (1)およ び保持手段（30)のみ力もなる植物形質転換システムを構成することができる。ある!/ヽ は、テーパ状凹部の底部が開口され、微多孔質体を保持した保持手段を、ここに図 示しない一定量の養水分が貯溜された貯溜タンクに浸漬または浮遊させることもでき る。
[0042] つぎに、前記したような実施形態で植物種子を播種し、発芽させ、形質転換に好適 な段階まで生育した植物体を選抜し、イン'プランタ法による形質転換に付すまでの 一連の工程を説明する。
図 6に示す一連の植物形質転換工程には、複数の微多孔質体を保持手段に着脱 可能に圧入して保持手段のテーパ状凹部に養水分を分注する工程 (I)、養水分が 全体に供給された各微多孔質体表面に植物種子を播種する工程 (π)、植物種子を 発芽 *生育させる工程 (ΠΙ)、一定期間経過後、植物体を成長段階に応じてグループ 別けする工程 (IV)、形質転換に好適なグループのみを選抜する工程 (V)、ついで 選抜したグループの植物体に担体溶液を塗布して形質転換する工程 (VI)が含まれ る。ここにおいては、保持手段として前記したテーパ状凹部を有するものを用いた形 態を示して!/、るが、保持手段は複数の微多孔質体を保持し得るものであれば 、ずれ の形態であってもよい。また、（I)一 (ΠΙ)の工程の間に微多孔質体に遮蔽手段を設 けて、工程 (VI)の塗布時に担体溶液を噴霧しても植物体の特定の部分にのみ担体 溶液が塗布されるようにすることもできる。また、担体溶液が塗布された後に、減圧条 件下に植物体を置いて担体の感染効率を高めることもできる。
[0043] なお、形質転換された植物の確認は、遺伝子工学の分野の当業者によく知られて いるいずれの方法によっても確認することもできる力 好ましくは、ある種の薬剤選択 マーカーを予め担体に含ませ、っ ヽで植物体から得られた種子をその薬剤を含有す る培地で生育する能力について選抜したり、その後、その選抜した植物を交配し、そ の種子を採取し、生育し、選抜して、最終的に導入を目的とした異種遺伝子の発現（ 植物の形態、酵素活性、特定の物質の生産、病害抵抗性など)を確認することができ る。
[0044] 力かる本発明に用いる微多孔質体は、前記したようにその一部に接触した養水分 を内部の連通孔を介してその全体の内部に供給して保持し得るものであれば、特に 限定されるものではないが、 20°Cにおいて通常 0.05— 0.5 (重量 Z重量)倍量、好ま しくは 0.05— 0.3倍量、より好ましくは 0.1— 0.2倍量の水を保持し得る吸水能を有し 、通常 0.2— 900 μ m、好ましくは 0.2— 80 μ m、さらに好ましくは 0.2— 9 μ m、最も 好ましくは 0.2— 3 /z mの孔隙径の連通する孔を、通常 0.05—1、好ましくは 0.1— 0. 4、より好ましくは 0.2— 0.3の孔隙率 (体積 Z体積)で有する微多孔質体が好ましい。
[0045] このような微多孔質体は、例えば 10号土、磁器 2号土 (城山セラポット株式会社)、 村上粘土 (新潟県産)などの非金属無機質固体原料などを通常の方法に従って混練 、成型、焼成することによって得られる微多孔質体や、ポリビニルアルコールフォーム 、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、塩化ビュル榭脂フォーム、ポリエチレン フォーム、ポリプロピレンフォーム、フエノール榭脂フォーム、ユリア榭脂フォームなど の連続気泡型プラスチックフォーム材料を材質とするものが挙げられる。特に、非金 属無機質固体原料を、微多孔質であって、水分を吸収および放出し易い微多孔質 体とする場合には、例えば、ぺタライト、アルミナなどを 50— 60重量％含有させて焼 成することが好ましい。なお、一般的に、前記のぺタライトとしては、通常 70— 90重量 %、好ましくは 75— 85重量0 /0、より好ましくは 75— 80重量0 /0の SiO、通常 10— 20
2
重量％、好ましくは 12— 18重量％、より好ましくは 15— 17重量％の Al O、通常 2
2 3 一 5重量％、好ましくは 3— 4.5重量％、より好ましくは 3.5— 4.2重量％の1^0、通常
2
0.1— 0.5重量％、好ましくは 0.2— 0.5重量％、より好ましくは 0.3— 0.45重量％の1^ 0、および通常 0.5— 2重量％、好ましくは 0.7— 1.8重量％、より好ましくは 0.8—1.
2
6重量％の不可避的不純物を含むものが好ましい。また、非金属無機質固体原料に は、粉状無機質発泡体を含有させておいてもよい。さら〖こ、本発明に用いる微多孔 質体は、吸水した場合においても実質的にその強度が低下しない非金属無機質か らなっていてもよい。
[0046] 非金属無機質固体原料の成型方法としては、例えば、铸込み成型、押し出し成型 、プレス成型、ろくろ成型などの当該技術分野で知られている成型方法が挙げられる 1S 特に大量生産およびコスト削減の見地力 押し出し成型が好ましい。また、成型 後の乾燥は、当該技術分野で知られている通常の方法および条件を用いて行うこと ができる。つづく成型体の焼成は、通常行われている条件および方法であれば特に 限定されるものではないが、例えば、所望の孔隙が得られやすい酸ィ匕焼成などを選 択し得、焼成温度は 1000°C— 2000°C、好ましくは 1100°C— 1500°C、より好ましく は 1150— 1300°C、最も好ましくは 1200°C付近である。非金属無機質固体原料の 焼成温度が 1000°C未満である場合には硫黄成分が残留し易ぐ一方、 2000°Cを 超える場合には所望の吸水性が得られな 、。
[0047] 一方、連続気泡型プラスチックフォームを材質とする微多孔質体の成型方法として は、例えば、溶融発泡成型、固相発泡成型、注型発泡成型などの方法が挙げられる 溶融発泡成型の主な工程は、溶融混練、未発泡シート成型、加熱発泡または押し 出し発泡、冷却、裁断およびカ卩ェである。固相発泡成型では、ポリマーを固相または 固相に近い状態で発泡させる。また、注型発泡成型では、液体原料 (モノマーまたは オリゴマー）を使用して大気中で反応させながら注型して発泡させる。また、連続気 泡型プラスチックフォームを発泡させるためには、一般的に発泡剤が用いられる。
[0048] また、微多孔質体は、対象となる植物の種類や使用状況に応じて!/ヽずれの形状と することもできるが、好ましくは、円筒形、平板形、柱状形、有底円筒形、蜂の巣状断 面を有する柱状体、多角形断面を有する筒形 (例えば、六角筒や四角筒）のような形 状とすることができる。
[0049] つぎに、本発明に用いる保持手段は、前記微多孔質体を揷嵌または圧入などによ り保持して、前記したように植物体に担体溶液を塗布してイン'プランタ法により形質 転換し得るものであれば 、ずれの材料および形状力 なるものであってもよ 、が、好 ましくは、前記したように孔またはテーパ状凹部を有する板状の発泡スチロール、発 泡ポリエチレン、発泡ポリウレタン力もなるものとし得る。また、保持手段は、弾力性を 有して微多孔質体を繰返して着脱可能に保持し得る材質のものが好ましい。
[0050] し力しながら、本発明の植物形質転換用システムにおいては、ここに図示していな い別の輸送手段によって微多孔質体を保持する保持手段が所定の位置まで運動さ れ、そこで塗布手段によって担体溶液が複数の植物体に略同時に塗布されることも 意図する。
さらに、別の実施形態において、本発明に用いる保持手段は、図 7に示すように微 多孔質体を側方力 装着し得る部分円筒状凹部を有する保持手段 (40)とすることが できる。この実施形態においては、微多孔質体を揷嵌した保持手段で、複数の植物 体に略同時に担体溶液を塗布することができる。
[0051] また、別の実施形態において、本発明に用いる保持手段は、図 8に示すように、複 数の微多孔質体の側部を拘持する保持手段 (60)とすることができる。この実施形態 の保持手段には微多孔質体（1)が抜け落ちないように拘持し得る波状のッメが設け られている。また、この実施形態の保持手段には微多孔質体を支持する労力を軽減 し、また植物体を養水分に浸漬する際には貯溜タンクの側壁に載置できるような翼部 (21)が設けられている。 [0052] また、本発明においては、図 9に示すように、イン'プランタ法による形質転換に適 当な段階まで微多孔質体上で生育した植物体の周囲をスリーブ等の遮蔽手段 (24) で覆うこともできる。それにより、植物体の特定の部分のみを暴露させて、噴霧等によ つて担体溶液を該部分のみに塗布してその部分のみを形質転換することができる。 また、該遮蔽手段は、複数の微多孔質体および植物体が高密度で配置された場合 にも単体で扱い易ぐまた隣接した植物体同士の接触による損傷から植物体を保護 することができる。また、植物体を高密度で栽培すると隣接する植物体の葉同士が接 着し、単体で取り扱う際に葉を損傷することや、輸送時の震動により隣接する植物体 が損損することも想定されるが、スリーブ等の遮蔽手段で覆うことによって防止するこ とがでさる。
[0053] 遮蔽手段は、植物体の周囲を覆うことができるものであればいずれの形状および材 質のものであってもよ!/、が、植物体の状態を観察し得る透明な材質のものが好ましく 、セロハンフィルムなどのプラスチックフィルムからなるものがさらに好ましい。また、ス リーブは、図 9に示すように微多孔質体の上部のほか、保持手段に紐、輪ゴム等で固 定してちよい。
[0054] このように本発明の植物形質転換用システムの対象となる植物の例としては、イン' プランタ法または減圧浸潤法により形質転換し得る植物であれば特に限定されるも のではないが、好ましくは、ドクゼリモドキ（Ammi majus)、タマネギ（Allium cepa)、- 、ノユウ (Allium sativum)、セロリ (Apium graveolens)、 Zスノヽフガス (Asparagus officinalis)、アンサイ (Beta vulgaris)、カリフフワ ~~ (Brassica oleracea var. botrytis)、 ャべッ (Brassica oleracea var. gemmifera)ゝキャベツ (Brassica oleracea var. capitata)、セィヨウアブラナ (Brassica napus)、ヒメウイキヨウ (Carum carvi)、キク ( し nrysanthemum morifolium)、トクニンンン (し onium maculatum)、ォゥレン (し optis japonica)、キク二カナ (Cichorium intybus)、カザリカボチヤ (Curcurbita pepo)、ァメリ 力チョウセンアサガオ (Datura meteloides)、ニンジン (Daucus carota)、カーネーショ ン (Dianthus caryophyllus)、ソノ (Fagopyrum esculent um)、ウイャヨウ (Foeniculum vulgareノ、ィチコ (Fragaria chiloensis;、タ ズ glycine max)、ヒャンンス (Hyacinthus orientalist、サッマイモ (Ipomoea batatas)、レタス (Lactuca sativa)、セィヨウミヤコグ サ (Lotus corniculatus)、ミヤコグサ (Lotus japonicus)、トマト (Lycopersicon esculentum)、ムフサキゥマゴャシ (Medicago sativa)、タバコ (Nicotiana tabacum)、ィ ネ (Oryza sativa)、ノ セリ (Petroselinum hortense)、エンドゥ (Pisum sativum)、セィョ ウノ フ (Rosa hybrida)、ナス (Solanum melongena)、ンャガイモ (Solanum tuberosum) 、コムャ (Triticum aestivum)、トウモロコシ、 ea mays)、サトウグイコン (Beta vulgarisノ 、ヮグ (Gossypium indicum)、 スフナ (Brassica campestns)、ズマ (Linum
usitatissimum)、サトウキヒ、 (Saccharum officinarum)、ノヽノヽ "T (Canca papaya)、二 ホンカホチヤ (Cucurbita moschata)、キユウリ (Cucumis sativus)、スィ力 (Citrullus vulgaris)、メロン (Cucumis melo)、セィヨウカ チヤ (Cucurbita maxima)などの ¾用植 物、キンギヨソゥ (Antirrhinum majus)、シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana)、クロトン (Codiaeum vanegatum)、ングフメン (し yclamen persicum)、ポインセチ/ (Euphorbia pulchernma)、 7J べフ ( erbera jamesonn 、ヒマヮリ (Helianthus annuus)、セフニゥ ム (Pelargonium hortorum)、へチュニァ (Petunia hybrida)、セントポーリア、 Saintpaulia lonatha)、セ ウタンホホ (Taraxacum officinale)、トレニァ i，orenia fournieri)、シロッメクサ (Trifolium repens)、シンビジゥム属 (Cymbidium)などの観賞 植物、インドセンダン (Azadirachta indica)、ミカン属（Citrus)、アラビアコーヒーノキ（ Coffea arabica)、ユーカリ属 (Eucalyptus)、ハフコムノヤ (Hevea brasiliensis)、セィヨウ ヒ フ^" (Ilex aquifolium)、カフタチ (Poncirus trifoliata)、 ~モンド (Prunus amygdalus)、カナグポプフ (Populus canadensis)、コノア 7ンヮ (Biota orientahs)、ス ^ (Cryptomeria japonica)、ドイツトウヒ（Picea abiesリ、マツ属 (Pinus)、ブドウ (Vitis viniferaノ、リンコ (Malus pumila)、 ,ンズ (Prunus armeniaca)、 ^=^ (Diospyros kaki)、 イチジク (Ficus carica)、二ホングリ (Castanea crenata)、セィヨウハコャナギ (Populus nigra)、ェゾゥコギ（Acanthopanax senticosus)などの木本類などが挙げられる。
また、本発明で用いる養水分とは、水、または植物種子を発芽，生育させるために 必要な硝酸態窒素、アンモニア態窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄 およびマンガン、銅、亜鉛、モリブデン、ホウ素などの無機要素、チアミン、ピリドキシ ン、ニコチン酸、ピオチン、葉酸などの各種ビタミン、ココナットミルク、カゼイン加水分 解物、酵母抽出物などの天然物質、グルタミン酸、ァスパラギン酸、ァラニンなどの有 機窒素源、オーキシン、サイト力イン、ジベレリンなどの植物生長調節物質、ブドウ糖 、ショ糖、果糖、麦芽糖などの炭素源、カナマイシン、ハイグロマイシンなどの抗生物 質、ノ スタなどの農薬などを含有する水溶液である。
[0056] また、本発明で用いるイン'プランタ法および減圧浸潤法は、例えば、 Bechtold N, Ellis J, Pelletier (1993) In planta Agrobactenum mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris, Life sciences 316:1194-1199.や"モデル植物ラボマニュアル"、編者 岩渕雅榭、岡田清孝、島本 功、シュプリンガー 'フエアラーク東京株式会社、 2000年 4月 13日発行に記載されて いるごとく行うことができる。減圧浸潤法の場合、簡単には、例えば、本発明による微 多孔質体上で生育させた植物体を形質転換に好適な形態に整えた後、形質転換用 の担体溶液を塗布して減圧用チャンバ一に入れ、減圧下にて所定時間（例えば、対 象植物がシロイヌナズナの場合には、約 400mmHg (約 50kPa)にて 4一 12分）置き 、その後、減圧を徐々に解除する。処理後、植物体は適当な順化条件に付して生育 させ、常法により抗生物質などを含有する培地上で形質転換体を選抜し、所望により 種子などを収獲し得る。
産業上の利用可能性
[0057] 本発明によれば、健全で高品質の植物体を質的および量的に安定して供給し得る 、より厳密 '簡便、かつより高速 '効率的な実験、研究および開発に用いることができ る植物形質転換方法、植物形質転換用器具、植物形質転換用システムならびに親 形質転換植物体からの異種遺伝子を保有する植物種子および植物体の選抜方法 が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 微多孔質体の表面で植物種子を発芽 ·生育させ、ここに植物種子は微多孔質体が 有する連通孔により保持された養水分を該微多孔質体の表面から吸収して生育し； ついで
該微多孔質体の表面に生育した植物体に形質転換用遺伝子を保持する担体溶液 を塗布してイン'プランタ法により形質転換することを含む植物形質転換方法。
[2] イン'プランタ法が減圧浸潤法であることを特徴とする請求項 1記載の植物形質転 換方法。
[3] 複数の微多孔質体を保持手段に着脱可能に保持し；
各微多孔質体の表面に植物種子を播種し、ここに植物種子は微多孔質体内部が 有する連通孔により保持された養水分を該微多孔質体の表面から吸収して発芽 '生 育し；ついで
該保持手段に保持された複数の微多孔質体の表面に生育した複数の植物体に形 質転換用遺伝子を保持する担体溶液を略同時に塗布してイン'プランタ法により形 質転換することを含む植物形質転換方法。
[4] イン'プランタ法が減圧浸潤法であることを特徴とする請求項 3記載の植物形質転 換方法。
[5] さらに、担体溶液を塗布する前に、形質転換に好適な段階まで生育した植物体を 有する微多孔質体のみを選抜して 1の保持手段に保持して、形質転換に付すことを 含む請求項 3または 4記載の植物形質転換方法。
[6] 開口を有する遮蔽手段によって植物体を覆った後に、担体溶液を噴霧して該開口 を通じて植物体の一部分のみに担体溶液を塗布することを特徴とする請求項 1一 5
V、ずれか 1項に記載の植物形質転換方法。
[7] 該植物体がシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana)であって、該植物体の一部分が 抽台した花芽であることを特徴とする請求項 6記載の植物形質転換方法。
[8] (i)微多孔質体の一部分を 1以上の第 1の選抜用薬剤を含有する養水分に浸潰し；
(ii)請求項 1一 7に記載の植物形質転換方法により得られた形質転換植物体から 得られた植物種子を該微多孔質体の表面に播種し、ここに形質転換植物体は該第 1 の選抜用薬剤に対する耐性遺伝子を含む少なくとも 1の異種遺伝子で形質転換され ており、ここに植物種子は微多孔質体内部が有する連通孔により保持された選抜用 薬剤を含有する養水分を該微多孔質体の表面から吸収して、親形質転換植物体の 該異種遺伝子を保有する植物種子は発芽な!/ヽし生育することができ、親形質転換植 物体の該異種遺伝子を保有しな 、植物種子は発芽な 、し生育することができず；つ いで
(iii)発芽な 、し生育することができた植物体を得る力、または、
さらに、この植物体力 得られた植物種子と第 1の選抜用薬剤またはその代わりに該 第 1の選抜用薬剤とは異なる 1以上の選抜用薬剤とを用いて (i)ないし (iii)の工程を 1回以上繰返すことを含み、ここに該形質転換植物体がその選抜用薬剤に対する耐 性遺伝子をも含むことを特徴とする親形質転換植物体の異種遺伝子を保有する植 物の選抜方法。
[9] 請求項 8の選抜方法で得られた、第 1の選抜用薬剤に対する耐性遺伝子を有する 植物種子を該微多孔質体の表面に播種し、ここに、該植物種子は微多孔質体内部 が有する連通孔により保持された該第 1の選抜用薬剤とは異なる 1以上の選抜用薬 剤もしくは養水分を該微多孔質体の表面力 吸収して、発芽ないし生育し、該第 1の 選抜用薬剤とは異なる選抜用薬剤に対する耐性遺伝子を含むこと、もしくは導入目 的とした遺伝子の形質が表現形として表現し得ることを確認する作業を少なくとも 1回 以上行うことを特徴とする親形質転換植物体の異種遺伝子を保有する植物の選抜 方法。
[10] 養水分を保持した連通孔を有し、表面で植物種子を発芽 *生育させるための微多 孔質体と、開口を有する植物体を覆うための遮蔽手段とを含み、ここに植物種子は微 多孔質体が有する連通孔により保持された養水分を該微多孔質体の表面力 吸収 して発芽'生育することを特徴とする請求項 6記載の形質転換方法に直接使用する 植物形質転換用器具。
[11] 担体溶液を噴霧する際に、該開口を通して植物体の一部分のみに担体溶液を塗 布する請求項 10記載の植物形質転換用器具。
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