Mikroskop mit evaneszenter Probenbeleuchtunα
Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit evaneszenter Probenbeleuchtung.
Aus US 2002/0097489 A1 ist ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch totalinterne Reflektion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope) bekannt.
Die z-Auflösung von TIRF-Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut. Aus DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF-Anwendungen bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von - 0,4 und - 0,1 liegt und die Gesamtbrechkraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite
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größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen - 0,5 und - 2 liegt. Aus DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF- Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes
Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n x 180 °- d)/60 °.
Aus DE 101 43 481 A1 ist ein Mikroskop zur TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden.
Aus US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das
Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar.
Aus DE 102 29 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dabei wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als
Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat
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gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere für das TIRF-Verfahren geeignet.
In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexioπs- oder Fluoreszenzlicht, zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet.
Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
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Aus DE 100 39 520 A1 ist ein konfokales Rastermikroskop mit der Möglichkeit zur simultanen Manipulation und Objektdetektion bekannt. Auch bei diesem Rastermikroskop sind zwei Strahlablenkeinrichtungen - eine für den Manipulationslichtstrahl, eine für den Beleuchtungslichtstrahl - vorgesehen. In einer besonderen Ausgestaltungsvariante dieses Rastermikroskops erfolgt die Einkopplung des Manipulationslichtstrahls in den Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahls durch den dem Beleuchtungslichtstrahl zugeordneten Ablenkspiegel hindurch. Der Ablenkspiegel ist dabei für Licht der Wellenlänge des Manipulationslichtstrahls transparent und für Licht der Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahls reflektierend ausgebildet.
Aus US 6,094,300 ist ein Laserscanningmikroskop mit mindestens zwei Lichtquellen und zwei Strahlablenkeinrichtungen bekannt. Jeder der Lichtquellen ist einer Strahlablenkeinrichtung zugeordnet. Die von den Lichtquellen emittierten Laserlichtbündel können mit den beiden Strahlablenkeinrichtungen unabhängig voneinander die Probe abscannen.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mikros mit der Möglichkeit anzugeben bei dem auf sehr flexible Weise das Spektrum der anwendbaren Probenuntersuchungsmethoden erweitert ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Mikroskop eine Vorrichtung zur optischen Manipulation der Probe aufweist.
Vorzugsweise weist die Vorrichtung zur optischen Manipulation der Probe eine einstellbare Strahlablenkeinrichtung auf. Die Strahlablenkeinrichtung beinhaltet in einer Ausgestaltungsvariante zumindest einen Galvanometerspiegel. Die Strahlablenkeinrichtung kann auch zumindest ein drehbares oder kippbares Prisma und/oder zumindest einen Kippspiegel und/oder Mikrospiegel und/oder ein akustooptisches Bauteil beinhalten.
Vorzugsweise weist das Mikroskop die Vorrichtung zur optischen Manipulation der Probe zusätzlich auf. In einer bevorzugten Ausgestaltungsform weist die Vorrichtung zur optischen Manipulation der Probe zumindest eine Lichtquelle, die ein
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Manipulationslichtstrahlenbündel emittiert, auf. Die Lichtquelle beinhaltet vorzugsweise zumindest einen Laser.
Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung zur optischen Manipulation der Probe zumindest eine Optik zur Strahlformung und/oder Strahlführung. In einer ganz besonders bevorzugten Variante ist die Vorrichtung zur optischen Manipulation der Probe als Modul ausgebildet ist, das an ein Mikroskopstativ an- und abkoppelbar ist. In dieser Variante weist die Vorrichtung zur optischen Manipulation der Probe vorzugsweise ein Gehäuse mit einem Auskoppelport auf, der an einen Einkoppelport eines Mikroskops ankoppelbar ist. Die Modul ist vorzugsweise derart ausgebildet, dass eine Nachrüstung bereits bestehender Mikroskope ermöglicht ist.
Vorzugsweise emittiert Lichtquelle ein Beleuchtungslichtstrahlenbündel zur evaneszenten Probenbeleuchtung. Alternativ oder zusätzlich kann eine eine weitere Lichtquelle vorgesehen sein, die ein Beleuchtungslichtstrahlenbündel zur evaneszenten Probenbeleuchtung emittiert. Die weitere Lichtquelle ist in einer bevorzugten Variante direkt an das Mikroskopstativ angekoppelt; sie kann auch Bestandteil der Vorrichtung zur optischen Manipulation der Probe oder eines bereits bestehenden, nachzurüstenden Mikroskops sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops weist das Beleuchtungslichtstrahlenbündel im Bereich der
Pupillenebene des Objektivs einen Fokus auf. Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass die Eindringtiefe eines evaneszenten Beleuchtungsfeldes in eine Probe von dem Winkel, unter dem die Totelreflektion an der
Deckglasgrenzfläche bzw. an der Objektträgergrenzfläche stattfindet, abhängt. Dieser Winkel ist direkt korreliert mit dem Winkel relativ zur optischen Achse, unter dem das für die evaneszente Probenbeleuchtung vorgesehene
Beleuchtungslichtstrahlenbündel das Objektiv durch die Frontlinse verlässt.
Dieser Winkel wiederum hängt davon ab, mit welchem Abstand zur optischen
Achse das Beleuchtungslichtstrahlenbündel durch die hintere Brennebene des Objektivs (Pupille) verläuft. Um ein weitgehend paralleles
Beleuchtungslichtstrahlenbündel für die evaneszente Probenbeleuchtung zur
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Verfügung zu haben, muss das Beleuchtungslichtstrahlenbündel in der hinteren Brennebene des Objektivs einen Fokus aufweisen. Letztlich bestimmt der Abstand des Fokus zur optischen Achse des Objektivs die besagten Winkel und damit die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in die zu untersuchende Probe.
Erfindungsgemäß ist der Abstand des Fokus des
Beleuchtungslichtstrahlenbündel von der optischen Achse des Objektivs einstellbar, wobei der Abstand vorzugsweise mit der Strahlablenkeinrichtung und/oder der weiteren Strahlablenkeinrichtung einstellbar ist. Vorzugsweise weist das Manipulationslichtstrahlenbündel im Bereich der Probe einen Fokus auf.
In einer Ausgestaltungsform ist zur Erzeugung eines im Bereich der Pupillenebene positionierten Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündel eine Anpassungsoptik in den Strahlengang des Mikroskops einbringbar, die zur Erzeugung eines Fokus des Manipulationslichtstrahlenbündels im Bereich der Probe entfernbar ist.
In einer anderen Ausgestaltungsform ist zur Erzeugung eines Fokus des Manipulationslichtstrahlenbündels im Bereich der Probe eine Anpassungsoptik in den Strahlengang des Mikroskops einbringbar, die zur Erzeugung eines Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündel im Bereich der Pupillenebene entfernbar ist.
Die Anpassungsoptik ist im einfachsten Fall eine Linse bzw. eine Umlenkstrecke um die Linse herum, bestehend aus einigen (vorzugsweise vier) Umleπkspiegeln. In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass dass die Strahlablenkeinrichtung das Manipulationslichtstrahlenbündel und/oder das Beleuchtungslichtstrahlenbündel ablenkt. In einer anderen Variante ist eine weitere einstellbare Strahlablenkeinrichtung vorgesehen, die das Beleuchtungslichtstrahlenbündel und/oder Manipulationslichtstrahlenbündel ablenkt.
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Das Mikroskop umfasst vorzugsweise ein Rastermikroskop, insbesondere ein konfokales Rastermikroskop. Vorrichtung zur optischen Manipulation der Probe kann derart erweitert werden, dass sie als Konfokalscanner nutzbar ist. Zusätzlich für dieses Variante zu implementierende Komponenten sind insbesondere ein dichroitischer Strahlteiler, Detektionspinhole und ein Detektor.
Vorzugsweise beinhaltet das erfindungsgemäße Mikroskop einen Detektor, der Beispielsweise als Kamera ausgebildet sein kann.
Das erfindungsgemäße Mikroskop ist insbesondere zu FRAP- Untersuchungen (Fluorecence recovery after photobleaching) und/oder für FRET-Untersuchungen (Förster-Transfer) einer Probe geeignet. Das Manipulationslichtstrahlenbündel ist insbesondere zum Freisetzen eines Markers (Caged-Combound-Release) und/oder zum Bieichen und/oder zum Aktivieren eines Markers und/oder zur Mikrodissektion verwendbar. In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 ein erfindungsgemäßes Mikroskop,
Fig. 2 ein weiteres erfindungsgemäßes Mikroskop, Fig. 3 ein weiteres erfindungsgemäßes Mikroskop und
Fig. 4 ein erfindungsgemäßes Mikroskop.
Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Mikroskop 1 mit einer optischen Vorrichtung 3 zur Manipulation einer Probe 5. Die optischen Vorrichtung 3 beinhaltet eine Lichtquelle 7, die ein Manipulationslichtstrahlenbündel 9 emittiert, und eine einstellbare Strahlablenkeinrichtung 11. Das Mikroskop 1 beinhaltet ein Objektiv 13 und eine weitere Lichtquelle 15, die als Laser 17 ausgebildet ist und die ein Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19 erzeugt. Das von der weiteren Lichtquelle 15 ausgehende Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19 dient zur evaneszenten Beleuchtung der Probe 5, die an einem
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Objektträger 21 angelagert ist. Zur Erzielung einer evaneszenten Probenbeleuchtung wird der Klappspiegel 23 in die gestrichelt eingezeichnete Position geklappt. Hierdurch wird der Strahlengang freigegeben für das Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19. Im Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 19 ist eine Ausgleichsoptik 25 zur Kompensation von Unebenheiten der Objektivpupillenebene 27 angeordnet. Die Ausgleichsoptik 25 ermöglicht auch eine Anpassung an unterschiedliche Pupillenlagen unterschiedlicher Objektive 13. Zu diesem Zweck ist die Anpassungsoptik 25 axial verschiebbar ausgebildet. Das Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19 weist in der Ebene 27 der Objektivpupille 29 einen durch einen Punkt dargestellten Fokus 31 auf, der in seiner Position innerhalb der Ebene 27 der Objektivpupille 29 mit Hilfe der weiteren einstellbaren Strahlablenkeinrichtung 32 variierbar ist.
Im Strahlengang des Mikroskops 1 sind mehrere optische Elemente zur Strahlführung und Strahlformung angeordnet. So gibt es beispielsweise eine erste Optik 33, eine zweite Optik 35 sowie die Ausgleichsoptik 25 vorgesehen, die eine erste Zwischenbildebene 37 und eine zweite Zwischenbildebene 39 erzeugen. Die einstellbare weitere Strahlablenkeiπrichtung 32 beinhaltet einen nicht dargestellten kardanisch aufgehängten Drehspiegel 41. Mit Hilfe der einstellbaren weiteren Strahlablenkeinrichtung 31 kann der Abstand des Fokus 31 zur optischen Achse 43 des Objektivs 3 eingestellt werden und damit die Eindringtiefe des Beleuchtungslichtstrahlenbündels in die Probe 5 variiert werden. Das von der Probe 5 ausgehende Detektionslicht 45 gelangt durch das Objektiv 3 sowie durch den Strahlteiler 47, der das Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19 zum Objektiv 3 lenkt, hindurch sowie durch die Tubusoptik 47 zu einem Detektor 49, der als CCD-Kamera 51 ausgebildet ist. Der Strahlteiler 47 ist als dichroitischer Strahlteiler ausgebildet und so ausgelegt, dass Licht der Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 19 reflektiert wird, während Licht der Wellenlänge des Detektionslichts 45 passieren kann.
Fig. 2 zeigt eine Variante bei die optische Vorrichtung 3 zur Manipulation einer Probe 5 sowohl ein Manipulationslichtstrahlenbündel 9 als auch ein
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Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19 erzeugt. Die Vorrichtung 3 zur Manipulation einer Probe 5 beinhaltet eine Lichtquelle 7, die einem Mehrlinienlaser 53 aus dessen Emissionslicht die Anteile der gewünschten Wellenlängen mit einem AOTF 55 auswählbar sind. Zur evaneszenten Beleuchtung der Probe 5, wird die Anpassungsoptik 57 in den Strahlengang des Mikroskops 1 eingebracht. Die Anpassungsoptik 57 gewährleistet, dass Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19 in der Ebene 27 der Objektivpupille 29 einen durch einen Punkt dargestellten Fokus 31 aufweist. Zur Probenmanipulation wird die Anpassungsoptik 57 aus dem Strahleπgang entfernt, damit das Manipulationslichtstrahlenbündel 9 in der Probe fokussiert ist. Mit der Strahlablenkeinrichtung 11 wird sowohl die Eindringtiefe des Beleuchtungslichtes in die Probe (über die Einstellung der Position des Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19 in der Ebene 27 der Objektivpupille 29), als auch die Probenmanipulation gesteuert. Fig. 3 zeigt eine Variante eines erfindungsgemäßen Mikroskops 1 bei der das Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19 durch die Ausgleichsoptik 25, die gewährleistet, dass Beleuchtungslichtstrahlenbündel 19 in der Ebene 27 der Objektivpupille 29 einen durch einen Punkt dargestellten Fokus 31 aufweist, verläuft, während das Manipulationslichtstrahlenbündel 9 über den ersten Umlenkspiegel 59, den zweiten Umlenkspiegel 61 , den dritten Umlenkspiegel 63 und den vierten Umlenkspiegel 65 an der Ausgleichsoptik 25 vorbei geführt wird.
Fig. 4 zeigt eine Variante des in Fig. 1 gezeigten Mikroskops. Die optische Vorrichtung 3 zur Manipulation einer Probe 5 beinhaltet in dieser Variante eine Beleuchtungslochblende 67, eine Detektionslochblende 69, die vor einem Multibanddetektor 71 angeordnet ist, sowie einen dichroitischen Strahlteiler 77 zur Umlenkung des von der Probe ausgehenden weiteren Detektionslichts 73 in den Detektionsstrahlengang 75. das gezeigte Mikroskop erlaubt eine konfokale Beobachtung der Probe 5, wobei die konfokale Beleuchtung mit dem Fokus des Manipulationslichtstrahlenbündels 9 erfolgt.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und
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Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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Bezugszeichenliste:
1 Mikroskop
3 optische Vorrichtung
5 Probe
7 Lichtquelle
9 Manipulationslichtstrahlenbündel
11 Strahlablenkeinrichtung
13 Objektiv
15 Lichtquelle
17 Laser
19 Beleuchtungslichtstrahlenbündel
21 Objektträger
23 Klappspiegel
25 Ausgleichsoptik
27 Objektivpupillenebene
29 Objektivpupille
31 Fokus
32 Strahlablenkeinrichtung
33 erste Optik
35 zweite Optik
37 erste Zwischenbildebene
39 zweite Zwischenbildebene
41 Drehspiegel
43 optische Achse des Objektivs 3
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45 Detektionslicht
47 Strahlteiler
49 Detektor
51 Kamera 53 Mehrlinienlaser
55 AOTF
57 Anpassungsoptik
59 erster Umlenkspiegel
61 zweiter Umlenkspiegel 63 dritter Umlenkspiegel
65 vierter Umlenkspiegel
67 Beleuchtungslochblende
69 Detektionslochblende
71 Multibanddetektor 73 Detektionslicht
75 Detektionsstrahlengang
77 dichroitischer Strahlteiler
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