WO2005030256A1 - ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することによる神経細胞死阻害および神経変性疾患の改善方法 - Google Patents

ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することによる神経細胞死阻害および神経変性疾患の改善方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005030256A1
WO2005030256A1 PCT/JP2004/014378 JP2004014378W WO2005030256A1 WO 2005030256 A1 WO2005030256 A1 WO 2005030256A1 JP 2004014378 W JP2004014378 W JP 2004014378W WO 2005030256 A1 WO2005030256 A1 WO 2005030256A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
htra2
shc3
atf6
crebl1
degradation
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/014378
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hirofumi Doi
Ken Saito
Original Assignee
Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Celestar Lexico-Sciences, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd., Celestar Lexico-Sciences, Inc. filed Critical Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to JP2005514280A priority Critical patent/JPWO2005030256A1/ja
Priority to US10/562,942 priority patent/US20060264363A1/en
Priority to EP04788406A priority patent/EP1669089A1/en
Publication of WO2005030256A1 publication Critical patent/WO2005030256A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Definitions

  • the present invention relates to SHC3 (circle homology one domain containing transforming protein Cd), src homology two domain containing transforming protein C3), ATF6 (activating transcription factor 6, 6) and at least one of CREBL1 (cyclic AMP responsive element binding protein-like 1 and cAMP responsive element binding protein-like 1) HtrA2 (reactive protein A2, high temperature requirement prot) It relates to the inhibition of degradation by ein A2). More specifically, a method for inhibiting neuronal cell death characterized by inhibiting the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CRE BL1 by Htr A2, or using one or more compounds that inhibit the degradation And a method for inhibiting neuronal cell death characterized by the following.
  • the present invention also relates to a method for preventing, treating or improving cerebral ischemic injury or neurodegenerative disease, which comprises inhibiting the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2. Further, the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2. The present invention also relates to a nerve cell death inhibitor comprising one or more compounds that inhibit the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2.
  • the present invention relates to a preventive, therapeutic or ameliorating agent for cerebral ischemic injury or neurodegenerative disease, comprising one or more compounds that inhibit the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2. Further, at least one of HtrA2, a polynucleotide encoding HtrA2 and a vector containing the polynucleotide encoding HtrA2, SH
  • Organisms protect themselves from external stress by regulating cell survival and apoptosis (cell death). Excessive cell death due to disturbances in the regulation of survival and apoptosis control mechanisms causes various diseases. (Non-Patent Document 1).
  • HtrA2 also becomes a mature form (SEQ ID NO: 4) from which the N-terminal 133 amino acid has been cleaved, and translocates from mitochondria to the cytoplasm. Mature HtrA2 has protease activity.
  • HtrA2 having protease activity may be referred to as activated HtrA2.
  • HtrA2 caspase-independent cell death depends on the nature of HtrA2 itself as a serine protease. Serine at position 306 (corresponding to position 174 in the mature form) in the amino acid sequence of its precursor protein is replaced by alanine. It has been known that caspase-independent cell death is not caused by the HtrA2 mutant substituted with (Non-patent Documents 3-5). Such HtrA2 variants have no protease activity. Hereinafter, HtrA2 having no protease activity may be referred to as inactive HtrA2. Thus, HtrA2 is a factor that plays an important role in the mechanism that induces caspase-independent cell death.
  • Non-Patent Document 1 “Cell Engineering”, 2002, Vol. 21, No. 4, p. 360-394.
  • Non-Patent Document 2 H. Yamaguchi et al., “Cancer Research", 2003, Vol. 63, p. 1483-1489.
  • Non-Patent Document 3 Y. Suzuki et al., "Molecular Cell”, 2001, Vol. 8, p. 613-621.
  • Non-Patent Document 4 Hedge (R. Hegde) et al., "The Journal of Biological Chemistry", 2002, Vol. 277, p. 432
  • Non-Patent Document 5 LM Martins et al., "The Journal of Biological Chemistry", 2002, Vol. 277, p. 439-444.
  • Non-Patent Document 6 “Experimental Medicine”, 2002, Vol. 20, No. 1, p. 73-75.
  • Non-Patent Document 7 L. Conti et al., "Nature Neuroscience", 2001, vol. 4, p. 579-586.
  • Non-Patent Document 8 “Biochemistry”, 2001, Vol. 73, No. 11, p. 1322-1325.
  • Non-Patent Document 9 R. J. Kaufman et al., "The Journal of Clinical Investigation", 2002, Vol. 110, p. 1389-1398.
  • Non-Patent Document 10 K. Haze et al., "The Biochemical Journal, 2001, Vol. 355, p. 19-28.
  • Non-Patent Document 11 K. M. Ulmer, "Science”, 1983, Vol. 219, p. 666-671.
  • Non-Patent Document 12 "Peptide Synthesis”, Maruzen Co., Ltd., 1975.
  • Non-Patent Document 13 “Peptide Synthesis”, Interscience, New York ⁇ 1996.
  • HtrA2 is thought to play an important role in the mechanism that induces caspase-independent cell death.
  • An object of the present invention is to provide a mechanism for caspase-independent cell death by HtrA2 and a protein that interacts with HtrA2 in a situation where the substrate of HtrA2 has not yet been clarified. And to provide a means for preventing and / or treating a disease based on the degradation of the protein by HtrA2.
  • the present invention was completed by experimentally proving that 3 was decomposed.
  • the present invention relates to a method for inhibiting nerve cell death, which comprises inhibiting the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting neuronal cell death, comprising using one or more compounds that inhibit the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2.
  • the present invention relates to the method for inhibiting nerve cell death, wherein the nerve cell death is nerve cell death due to cerebral ischemia.
  • the present invention provides a method for preparing at least one HtrA of SHC3, ATF6 and CREBL1.
  • the present invention relates to a method for preventing, treating or ameliorating a cerebral ischemic injury or a neurodegenerative disease characterized by inhibiting degradation by the method described in 2.
  • the present invention also relates to the method for preventing, treating or ameliorating the neurodegenerative disease, which is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, polyglutamine disease, prion disease or amyotrophic lateral sclerosis.
  • the neurodegenerative disease which is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, polyglutamine disease, prion disease or amyotrophic lateral sclerosis.
  • the present invention is a method for identifying a compound that inhibits degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2, wherein the compound is capable of degrading at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2.
  • the compound is capable of degrading at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2.
  • at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 and HtrA2 are brought into contact with the compound, and a system using a signal and a Z marker capable of detecting at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 is used. Detecting the presence or absence of this signal and the Z marker and the Z or alteration to determine whether the compound inhibits the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1.
  • the identification method To do.
  • the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2, wherein the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2 is provided.
  • the present invention relates to an identification method characterized by determining whether or not it has the ability to inhibit the degradation of at least one of ATF6 and CREBL1.
  • the present invention also relates to a nerve cell death inhibitor comprising one or more compounds that inhibit the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2.
  • the present invention relates to the above nerve cell death inhibitor, wherein the nerve cell death is nerve cell death due to cerebral ischemia.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic agent for cerebral ischemic injury or neurodegenerative disease, comprising one or more compounds that inhibit the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2. Or regarding an improving agent.
  • the present invention also provides a preventive, therapeutic or ameliorating agent for the above-mentioned neurodegenerative disease, wherein the neurodegenerative disease is Aluno-Dima disease, Parkinson disease, polyglutamine disease, prion disease or amyotrophic lateral sclerosis About.
  • the present invention relates to at least one of HtrA2, a polynucleotide encoding HtrA2 and a vector containing a polynucleotide encoding HtrA2, and SHC3, ATF6, CREBL1, and SHC3, ATF6 and
  • the present invention relates to a reagent kit comprising a polynucleotide encoding any one of CREBL1, and at least one of a vector containing a polynucleotide encoding any one of SHC3, ATF6 and CREBL1.
  • At least one HtrA2 of SHC3, ATF6 and CREBL1 is Inhibiting the degradation of the protein can inhibit the reduction or elimination of at least one of these proteins, resulting in inhibition of cell death (eg, neuronal cell death) and diseases associated with cell death (eg, Prevention, treatment or amelioration of cerebral ischemic injury or neurodegenerative disease).
  • cell death eg, neuronal cell death
  • diseases associated with cell death eg, Prevention, treatment or amelioration of cerebral ischemic injury or neurodegenerative disease.
  • SHC3 is specifically expressed in mature central nervous cells, and is thought to play an important role in the differentiation and survival of nerve cells (Non-Patent Documents 7 and 8).
  • ATF6 and CREB L1 sense ER stress and induce transcription of chaperone genes, and are thought to be involved in the recovery of ER stress in cells and their survival (Non-Patent Document 9 and Ten). It is considered that when at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 is degraded by HtrA2 and reduced or disappears, cell death due to stress or the like, for example, cell death of nerve cells is enhanced.
  • cell death eg., cell death of nerve cells
  • diseases associated with cell death e.g, cerebral ischemic injury or neurodegenerative disease
  • cerebral ischemic injury or neurodegenerative disease can be prevented, treated or ameliorated.
  • a method for identifying a compound that inhibits degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2 can be performed.
  • the compounds obtained by this identification method can be used for inhibiting, treating or ameliorating cell death (eg, cell death of nerve cells) and diseases associated with cell death (eg, cerebral ischemic injury and neurodegenerative disease). .
  • FIG. 1-A is a view explaining that CREBL1 was degraded in vitro by activated HtrA2 (mature HtrA2).
  • inactive HtrA2 did not show CREBL1 degradation.
  • FIG. 1-B is a view explaining that ATF6 was degraded in vitro by activated HtrA2 (mature HtrA2).
  • activated HtrA2 by reacting activated HtrA2 with ATF6 for 4 hours (4 h) or 1 ⁇ (OZN), the band showing ATF6 was significantly reduced.
  • no degradation of ATF6 was observed in inactive HtrA2 (mature HtrA2 (S306A)).
  • FIG. 1-C SHC3 (p64) is degraded in vitro by activated HtrA2 (mature HtrA2) FIG. By reacting activated HtrA2 with SHC3 (p64) for 4 hours (4 h) or 1 ° (O / N), the band showing SHC3 (p64) was significantly reduced. On the other hand, inactive HtrA2 (mature HtrA2 (S306A)) showed no degradation of SHC3 (p64). (Example 2)
  • FIG. 4 is a diagram illustrating that CREBL1 was degraded in cells by mature HtrA2 (GVPS) in which alanine was substituted with dalysin (upper panel). Analysis using cells in which mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) or mature HtrA2 (GVPS) and CREBL1 were co-expressed resulted in a marked decrease in the CREBL1 band (upper panel).
  • FIG. 4 is a diagram illustrating that ATF6 was degraded in cells by mature HtrA2 (GVPS) in which alanine was substituted with dalysin (upper figure). Analysis using mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) or cells in which mature HtrA2 (GVPS) and ATF6 were co-expressed resulted in a marked decrease in the ATF6 band (upper panel).
  • FIG. 4A is a diagram illustrating that SHC3 (p64) was degraded in cells by mature HtrA2 (GVPS) in which alanine was substituted with dalysin (upper panel). Analysis using cells that co-expressed mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) or mature HtrA2 (GVPS) and SHC3 (p64) revealed that SHC3 (p64) The bands shown were significantly reduced (upper panel).
  • FIG. 4 is a diagram illustrating that SHC3 (p52) was degraded in cells by mature HtrA2 (GVPS) in which alanine was substituted with dalysin (upper panel).
  • GVPS mature HtrA2
  • FIG. 3-A Activated HtrA2 (mature HtrA2) is detected by detecting biotin using CREBL1 in which a lysine residue inside the protein is biotinylated and a N-terminal tag is added.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining that CREBL1 degradation was detected.
  • the band showing biotinylated CREBL1 was significantly reduced, and a band that might show CREBL1 degradation products was detected around 50 kDa.
  • inactive HtrA2 inactive HtrA2 (mature HtrA2 (S306A)
  • no degradation of CREBL1 was observed, and the band around 50 kDa was not detected.
  • FIG. 3-B Activated HtrA2 (mature type) is detected by detecting biotin using SH C3 (p64) in which a lysine residue inside the protein is piotinylated and a tag is added to the N-terminal.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining that decomposition of SHC3 (p64) by HtrA2) was detected.
  • FIG. 3-C Activated HtrA2 (mature type) is detected by detecting biotin using SH C3 (p52) in which a lysine residue inside the protein is piotinylated and a tag is added to the N-terminal.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating that degradation of SHC3 (p52) by HtrA2) was detected.
  • a 1 ⁇ (OZN) reaction between activated HtrA2 and SHC3 (p52) markedly reduced the band showing biotinylated SHC3 (p52), but detected a band likely to show SHC3 (p52) degradation products. was not done.
  • inactive HtrA2 mature HtrA2 (S306A) showed no degradation of SHC3 (p52).
  • FIG. 4 is a diagram illustrating that CREBL1 was degraded by (mature HtrA2).
  • CREBL1 was degraded by (mature HtrA2).
  • the band showing CREBL1 with a tag added to the N-terminal was significantly reduced.
  • the band which is considered to indicate a CRE BL1 degradation product near 50 kDa and detected in FIG. 3 was not detected by the anti-Tag antibody.
  • inactive HtrA2 (mature HtrA2 (S306A)) did not show CREBLl degradation. (Example 4)
  • FIG. 4B is a diagram illustrating that SHC3 (p64) was degraded by activated HtrA2 (adult HtrA2).
  • activated HtrA2 adult HtrA2
  • SHC3 (p64) for 4 hours (4 h) or 1 ⁇ (OZN)
  • the band showing SHC3 (p64) with tag added to the C-terminal was remarkably reduced, and 70 kDa At around 40 kDa and 3 OkDa, bands thought to indicate SHC3 (p64) degradation products were detected.
  • no degradation of SHC3 (p64) was observed in inactive HtrA2 (mature HtrA2 (S306A)).
  • FIG. 4 is a diagram illustrating that SHC3 (p52) was degraded by activated HtrA2 (adult HtrA2). Active Htr When A2 is reacted with SHC3 (p52) for 1 ⁇ (OZN), the band showing SHC3 (p52) with a tag added at the C-terminal is significantly reduced, and a SHC3 (p52) degradation product appears around 40 kDa The band considered to be was detected. On the other hand, no degradation of SHC3 (p52) was observed in inactive HtrA2 (mature HtrA2 (S306A)). (Example 4 )
  • the generic term means an isolated or synthetic full-length protein; an isolated or synthetic full-length polypeptide; or an isolated or synthetic full-length oligopeptide.
  • polypeptide is sometimes used as a generic term.
  • the protein, polypeptide or oligopeptide includes two or more amino acids linked to each other by a peptide bond or a modified peptide bond.
  • amino acids when amino acids are represented, they may be represented by one or three letters.
  • HtrA2 the interaction of HtrA2 with CREBL1 and SHC1 was predicted in silico according to the method described in International Publication WO01Z67299. Furthermore, it was experimentally demonstrated for the first time that HtrA2 degrades CREBL1, ATF6, a family of CREBL1, and SHC3, a family of SHCl1.
  • SHC3, also called N-She or ShcC is specifically expressed in mature central nervous cells.
  • SHC3 transduces signals from the Trk family of receptor kinases that are activated by neurotrophic factors (such as NGF and EGF) and differentiates neurons through the PI3K-Akt-Bad pathway. And are thought to play an important role in survival.
  • neurotrophic factors such as NGF and EGF
  • CREBL1 is a member of the ATF6 family and is also called ATF6 ⁇ . It is known that CREBL1 is localized in the endoplasmic reticulum, and is processed by S1P and S2P due to endoplasmic reticulum stress, partially translocates to the nucleus, and acts as a transcription factor.
  • Non-Patent Documents 9 and 10 Both CREBL1 and ATF6 sense ER stress and are chaperone genes It is known that the induction of transcription contributes to the recovery and survival of cells against stress. In addition, the relationship between endoplasmic reticulum stress and neurodegenerative diseases has been reported in several papers (Non-Patent Document 1).
  • HtrA2 activated by excessive stress exerts on neuronal cells, whereby at least one of SHC3, ATF6 and CREBLl is decomposed and reduced or eliminated. It is believed that this leads to disruption of the neural cell differentiation 'survival signal pathway, and as a result, nerve cell death is enhanced.
  • cell death can be inhibited by inhibiting the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBLl by HtrA2.
  • inhibiting the degradation of at least one of SHC3, ATF6 or CREBL1 by HtrA2 allows prevention and Z or treatment of diseases involving cell death.
  • cell death of nerve cells for example, nerve cell death due to endoplasmic reticulum stress can be inhibited.
  • an inhibitor of degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2 is considered to be a therapeutic agent for neurodegenerative diseases and cerebral ischemic injury.
  • the present invention provides a method for inhibiting the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2. Further, the present invention provides a method for inhibiting neuronal cell death, which comprises inhibiting the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2. The method for inhibiting neuronal cell death according to the present invention can be preferably carried out in vitro. The present invention also provides a method for preventing, treating or ameliorating a disease based on the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBLl.
  • the inhibition of degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBLl by HtrA2 can be carried out by inhibiting the action of HtrA2.
  • it can be carried out by inhibiting the interaction of HtrA2 with SHC3, ATF6 or CRE BL1.
  • it can be carried out by inhibiting the enzyme activity of HtrA2.
  • the activity of HtrA2 is inhibited in an in vitro sample containing at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 and HtrA2. This can inhibit the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2.
  • SHC3, ATF6 or CREBL1 and HtrA2 interact means that SHC3, ATF6 or CREBL1 and HtrA2 interact with each other in a certain mode, and as a result, specifically, SHC3, It means that ATF6 or CREBL1 is decomposed by HtrA2.
  • the “certain mode” includes bonding, contact, proximity, and the like, and may be a different mode as long as the modes can interact with each other as a result.
  • the inhibition of degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2 can be carried out using a compound that inhibits the interaction of HtrA2 with SHC3, ATF6 or CREBL1.
  • the powerful compound include polypeptides that also have the amino acid sequence strength at the site where SHC3, ATF6 or CREBL1 interacts with HtrA2 in each amino acid sequence of SHC3, ATF6, CREBL1 or HtrA2.
  • a strong polypeptide derived from SHC3, ATF6 or CREBL1 which is a substrate of HtrA2, competitively inhibits the protein-protein interaction between SHC3, ATF6 or CREBL1 and HtrA2, and inhibits HtrA2 from degrading these proteins.
  • Such a polypeptide is designed based on the amino acid sequence of HtrA2, SHC3, ATF6 or CREBL1, and synthesized by a peptide synthesis method known per se, and inhibits the degradation of SHC3, ATF6 or CREBL1 by HtrA2. You can get it by selecting the item.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of the site degraded by HtrA2 of SHC3, ATF6 or CREBL1 is suitable as a powerful polypeptide.
  • Polypeptides obtained by introducing mutations such as deletion, substitution, addition or insertion of one or several amino acids into the thus specified polypeptide are also included in the scope of the present invention.
  • the polypeptide into which such a mutation has been introduced is preferably one that inhibits the degradation of SHC3, ATF6 or CREBL1 by HtrA2.
  • the polypeptide having a mutation may be naturally occurring or may have a mutation introduced therein.
  • Means for introducing a mutation such as deletion, substitution, addition or insertion are known per se, and can be carried out using, for example, the technique of Ulmer (Non-patent Document 11).
  • the basic For example, homologous amino acids (polar amino acids, non-polar amino acids, hydrophobic amino acids, hydrophilic amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, and aromatic Mutation between amino acids, etc.) is easily assumed.
  • these available polypeptides can be modified to such an extent that no significant change in the function is caused by, for example, modification of the constituent amino group or propyloxyl group thereof, for example, by amidation modification.
  • the polypeptide can be produced by a general method known in peptide chemistry.
  • Non-patent Documents 12 and 13 are exemplified, but not limited thereto, and known methods can be widely used. Specifically, a peptide synthesis method by a usual liquid phase method and solid phase method, for example, Fmoc method and the like can be mentioned. Alternatively, the above polypeptide can be produced using a commercially available amino acid synthesizer. Alternatively, the polypeptide can be obtained by a genetic engineering technique. For example, a recombinant expression vector capable of expressing a gene encoding a polypeptide of interest in a host cell is prepared, and this is transfected into an appropriate host cell, for example, Escherichia coli. It can be produced by culturing and then recovering the desired polypeptide from the culture obtained.
  • Inhibition of degradation of SHC3, ATF6 or CREBLl by HtrA2 is achieved by using an antibody that recognizes HtrA2, SHC3, ATF6 or CREBLl, and that inhibits degradation of SHC3, ATF6 or CREBLl by HtrA2.
  • a powerful antibody can be obtained by a known antibody production method using HtrA2, SHC3, ATF6 or CREBL1 itself, or a polypeptide having the amino acid sequence of the site where HtrA2 interacts with SHC3, ATF6 or CREBL1 as an antigen.
  • the inhibition of the degradation of SHC3, ATF6 or CREBLl by HtrA2 can be carried out by a compound that inhibits the enzyme activity of HtrA2, preferably a compound that specifically inhibits HtrA2.
  • a compound that specifically inhibits HtrA2 can be obtained by, for example, using at least one of SHC3, ATF6 and CREBLl as a substrate and identifying a compound that inhibits the degradation of the substrate by HtrA2.
  • To specifically inhibit HtrA2 means to strongly inhibit HtrA2 but not to inhibit other enzymes or weakly.
  • a compound identification method can be constructed using a drug screening system known per se. For example, a condition that allows degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2 is selected, and under such conditions at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 and a compound to be examined for Z or HtrA2. (Test compound) and the presence of this signal and Z or marker using a system that uses a signal and Z or marker capable of detecting degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1.
  • a compound that inhibits the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2 can be identified.
  • Conditions that allow the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2 may be in vitro or in vivo.
  • cells in which at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 has been co-expressed with HtrA2 can also be used.
  • Co-expression in cells is accomplished by transferring these to cells by conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing a polynucleotide encoding SHC3, ATF6 or CREBL1 and an appropriate vector containing a polynucleotide encoding HtrA2.
  • Vectors containing polynucleotides encoding SHC3, ATF6 or CREBL1 can be used alone or in combination.
  • the cells eukaryotic cells, preferably animal cells, more preferably animal cell lines, and still more preferably mammalian cell lines can be used.
  • the contact of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 and Z or HtrA2 with the test compound may be carried out before the reaction of degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2, It may be carried out by coexisting with the decomposition reaction.
  • the marker is a marker that is not itself detectable due to physical or chemical properties but generates the signal through a chemical reaction, and the physical and chemical properties of the generated signal are referred to as markers. Refers to those that can be indirectly detected using their biological or biological properties as indices.
  • a reporter gene for example, chloramfe-coal acetyltransferase gene
  • a radioisotope for example, chloramfe-coal acetyltransferase gene
  • a tag peptide for example, a tag peptide
  • Known substances such as His-tag, Myc-tag ⁇ HA-tag, FLAG-tag or Xpress-tag
  • enzymes such as GST, biotin, and fluorescent protein
  • any labeling substance generally used in a compound identification method can be used.
  • Methods for detecting these signals and Z or markers are well known to those skilled in the art.
  • degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 can be measured by detecting the presence or absence of these proteins or degradation products of these proteins and detecting a change in Z or its amount. Quantification of the amount of these proteins or the amount of degradation products of these proteins can be carried out using a known protein or peptide detection method, for example, Western blotting or the like.
  • HtrA2, SHC3, ATF6 and CREBL1 are all known proteins, and are disclosed in GenBank as accession numbers NM-0113247, NM-016848, NM-007348 and NM-100004, respectively! RU
  • HtrA2 used in this Example is shown in SEQ ID NO: 4.
  • nucleotide sequence of HtrA2 DNA encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is mature HtrA2.
  • Mature HtrA2 is a mature protein produced by cutting off 133 amino acid residues at the N-terminal from the HtrA2 precursor protein (SEQ ID NO: 2) and has protease activity.
  • HtrA2 having protease activity may be referred to as activated HtrA2.
  • HtrA2 a protein in which the N-terminal 4 residues (AVPS) of mature HtrA2 has been deleted (SEQ ID NO: 8, sometimes referred to as mature HtrA2 ( ⁇ AVPS)) or N-terminal of mature HtrA2
  • AVPS N-terminal 4 residues
  • GVPS mature HtrA2
  • HtrA2 into which such a mutation has been introduced has no change in its protease activity, it can be used as active HtrA2.
  • HtrA2 having no protease activity may be referred to as inactive HtrA2.
  • inactive HtrA2 examples include HtrA2 mutants which have a mutation in an amino acid residue at a site required for protease activity of HtrA2 in the amino acid sequence of HtrA2 and show no protease activity as a result of the mutation.
  • the site required for the protease activity of HtrA2 is a protease active domain, more preferably a serine residue at position 174 of mature HtrA2 (SEQ ID NO: 4) (corresponding to position 306 in the precursor protein (SEQ ID NO: 2)).
  • the inactive HtrA2 more specifically, the 174th position of the mature HtrA2 (precursor protein ( An HtrA2 mutant in which the serine residue of SEQ ID NO: 2) (equivalent to position 306) is substituted with alanine (SEQ ID NO: 6, referred to as mature HtrA2 (S306A)) can be exemplified.
  • inactive HtrA2 a protein in which the N-terminal 4 residues (AVPS) of mature HtrA2 (S306A) have been deleted (SEQ ID NO: 12, sometimes referred to as mature HtrA2 (S306A, ⁇ AVPS)) )
  • AVPS N-terminal 4 residues of mature HtrA2
  • a protein in which alanine of the N-terminal four residues of mature HtrA2 is substituted with glycine SEQ ID NO: 14, sometimes referred to as mature HtrA2 (S306A, GVPS)
  • SHC3 (p64) The amino acid sequence of SHC3 used in this example is shown in SEQ ID NO: 16.
  • SHC3 (p64) The amino acid sequence of SHC3 (p64) DNA is shown in SEQ ID NO: 15.
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 15 was different from the nucleotide sequence of SHC3 disclosed in Accession Number NM-016848 in six nucleotide differences (see Example 2).
  • SHC3 (p52) a splicing variant of SHC3, was used.
  • SHC3 (p52) is a protein encoded by the second ATG (360 bases downstream from the first ATG) in the coding region of the SHC3 gene.
  • the amino acid sequence of ATF6 used in this example is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the nucleotide sequence of ATF6 DNA is shown in SEQ ID NO: 19.
  • 15 nucleotides were different from the nucleotide sequence of ATF6 disclosed in Accession No. NM-007348 (see Example 2).
  • the nucleotide sequence of CREBL1 used in this Example is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the nucleotide sequence of CRE BL1 DNA is shown in SEQ ID NO: 17.
  • a difference was found in one of the nucleotides as compared to the nucleotide sequence of CREBL1 disclosed in Accession Number NM-004438 (see Example 2).
  • HtrA2, SHC3, ATF6, and CREBL1 are not limited to the proteins or genes represented by the above-described amino acid sequences or base sequences, and are generally reported. Including HtrA2, SHC3, ATF6 and CREBL 1!
  • HtrA2, SHC3, ATF6 and CREBL1 used in the present invention are prepared by preparing cells or biological samples prepared by expressing them by genetic engineering techniques, and cell-free synthetic products. Or a chemically synthesized product, or may be further purified therefrom. Cells in which any one of HtrA2, SHC3, ATF6 and CREBL1 has been expressed by a genetic method can also be used. HtrA2, SHC3, ATF6 and CREBL1 should not affect the interaction of HtrA2 with SHC3, ATF6 or CREBL1 and the function of these proteins, such as the protease activity of HtrA2 and the properties of SHC3, ATF6 and CREBL1 as enzyme substrates.
  • another protein polypeptide may be added to the N-terminal side or C-terminal side directly or indirectly via a linker peptide or the like using a genetic engineering technique or the like.
  • Other proteins and polypeptides to be added include immunoglobulin Fc fragments such as j8-galactosidase and IgG, and tag peptides (His-tag, Myc-tag, HA-tag, FLAG-tag, Xpress-tag, etc.) ) Can be exemplified.
  • a polynucleotide encoding HtrA2, SHC3, ATF6 or CREBL1 can be prepared from a human cDNA library by a genetic engineering technique known per se.
  • a vector containing a polynucleotide encoding HtrA2, SHC3, ATF6 or CREBL1 can be obtained by introducing the polynucleotide into an appropriate expression DNA vector, for example, a vector derived from a bacterial plasmid, using a genetic engineering technique known per se. .
  • test compound examples include a compound derived from a library and a natural product, and a compound obtained by drug design based on the primary structure or tertiary structure of Htr A2, SHC3, ATF6 or CREBL1. No.
  • conjugated products obtained by drug design based on the structure of the polypeptide having the amino acid sequence at the site degraded by HtrA2 of SHC3, ATF6 or CREBL1 are also suitable as test compounds.
  • the method for identifying a compound according to the present invention is carried out by, for example, testing a protease assay (Example 2) at the in-vitro mouth using at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 and HtrA2. It can be carried out by adding a compound.
  • the active mature HtrA2 can be prepared from Escherichia coli transfected with an appropriate vector containing mature HtrA2 DNA obtained from a human kidney cDNA library by a known genetic engineering technique.
  • SHC3 can be prepared from an animal cell culture (eg, HEK293T cells) transfected with an appropriate vector containing SHC3 DNA obtained from a human brain cDNA library by a genetic engineering method known per se.
  • CREBL1 is a human brain cDNA library. It can be prepared from an animal cell culture (eg, HEK293T cell) transfected with a suitable vector containing CREBL1 DNA obtained from the library by a genetic engineering technique known per se.
  • ATF6 can be prepared from an animal cell (eg, HEK293T cell) transfected with a suitable vector containing ATF6 DNA obtained from a human mammary gland cDNA library by a per se known genetic method.
  • SHC3, CREBL1, ATF6 and HtrA2 are included in the soluble fraction of the cell lysate of each cell that expressed each of these proteins.
  • SHC3, ATF6 and CREBL1 should preferably be expressed as a protein with a tag peptide or the like added to their N- or C-terminus, and purified by immunoprecipitation with an antibody against the tag peptide.
  • a resin eg, protein G sepharose
  • the protease at the in-vitro mouth is detected by Western blotting after reacting SHC3, CREBL1 or ATF6 supplemented with resin, etc. with mature HtrA2 at 37 ° C, followed by reaction at 37 ° C. It can be implemented by doing.
  • SHC3 and ATF6 are degraded by mature HtrA2 by reacting at 37 ° C for 4 hours, so that the reaction time in protease assay can be reduced to 4 hours.
  • Detection by Western blotting can be carried out using an antibody against the tag peptide exposed to SHC3, CREBL1 or ATF6. Since SHC3, CREBL1 or ATF6 is degraded by HtrA2, the amount of these proteins detected by Western blotting is reduced or eliminated as compared to when HtrA2 is not added.
  • test compound is not added to the reaction between SHC3, CREBL1 or ATF6 and mature HtrA2 and the test compound is not added, the reduction or disappearance of the amount of SHC3, CREBL1 or ATF6 is inhibited as compared to when the test compound is not added. In this case, it can be determined that the test compound inhibits the degradation of SHC3, CREBL1 or ATF6 by HtrA2.
  • the test compound can be brought into contact with SHC3, CREBL1 or ATF6 or with mature HtrA2 in advance, and then reacted with SHC3, CREBL1 or ATF6 with mature HtrA2.
  • the method for identifying a compound according to the present invention is, for example, an intracellular protease assay using a cell in which at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 is co-expressed with HtrA2. It can be carried out by adding a test compound to Example 3).
  • SHC 3.HtrA2 co-expression of HtrA2 with at least one of ATF6 and CREBL1 includes HtrA2 DNA and an appropriate vector containing SHC3 DNA, CREBL1 DNA and ATF6 DNA, respectively, prepared as described above.
  • An appropriate vector can be transfected into an animal cell culture (eg, HEK293T cell) by a gene engineering technique known per se.
  • SHC3, ATF6 and CREBL1 are preferably expressed as proteins in which a tag peptide or the like has been added to the N-terminal or C-terminal of these proteins in order to facilitate the detection of these proteins.
  • active HtrA2 active HtrA2 is used.
  • mature HtrA2 preferably mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) in which four N-terminal residues (AVPS) have been deleted or mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) in which alanine of the four N-terminal residues has been substituted with glycine
  • GVPS HtrA2
  • AVP S The four N-terminal residues (AVP S) of mature HtrA2 are binding motifs to IAPs (Inhibitor of apoptosis proteins), which act to inhibit apoptosis. It is reported to promote caspase-dependent cell death. Since this effect may affect the examination of protease in cells, it is preferable to use mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) or mature HtrA2 (GVPS), which does not bind to IAPs.
  • ⁇ AVPS mature HtrA2
  • GVPS mature HtrA2
  • New Intracellular protease Atsei is obtained by culturing cells co-expressing HtrA2 with at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 together with a test compound at 37 ° C for 48 hours, lysing the cells, and lysing the cells. It can be carried out by detecting SHC3, CREBL1 or ATF6 contained in the solution by Western blotting. Detection by Western blotting can be performed using an antibody against a tag peptide added to SHC3, CREBL1 or ATF6. Since SHC3, CREBL1 or ATF6 is degraded by HtrA2, the amount of these proteins detected by ⁇ stanblotting is reduced or eliminated as compared to when HtrA2 is not added.
  • test compound Reduction or disappearance of SHC3, CREBL1 or ATF6 when test compound is added If the test compound is more inhibited than without, the test compound is HtrA2 of SHC3, CREBL1 or ATF6 Can be determined to hinder the decomposition.
  • the method for identifying a compound according to the present invention is not limited to the specific examples using the above-mentioned in vitro protease assay and intracellular protease assay, but is generally used. It can be performed using a well-known identification method in drug screening.
  • the conjugate obtained by the method for identifying a compound according to the present invention can be used as an inhibitor of degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2.
  • the compound can be prepared as a pharmaceutical composition by selecting in consideration of the balance between biological utility and toxicity. In preparing a pharmaceutical composition, these compounds can be used alone or in combination.
  • a compound that inhibits degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2 can be used as an inhibitor of cell death based on degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2. It is preferably useful as an inhibitor of cell death due to endoplasmic reticulum stress. More preferably, it is useful as an inhibitor of nerve cell death, more preferably as an inhibitor of nerve cell death due to endoplasmic reticulum stress. Further, the above compounds can be used as inhibitors of nerve cell death due to cerebral ischemia. Furthermore, a method for inhibiting cell death due to ER stress can be performed using these inhibitors. Preferably, a method for inhibiting nerve cell death due to endoplasmic reticulum stress or cerebral ischemia can be performed.
  • the compound that inhibits the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2 is a preventive, ameliorating agent and a drug for a disease based on the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2.
  • a therapeutic agent can be prepared.
  • diseases include, for example, diseases involving neuronal cell death, more specifically, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, polyglutamine disease, prion disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and the like.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • abnormal proteins form aggregates in nerve cells of these diseases, and it has been reported that nerve cell death is associated with endoplasmic reticulum stress in these diseases.
  • Non-Patent Document 1 the above compound can be used to carry out a method for preventing, ameliorating, and treating Z or treating such diseases.
  • the agent for preventing, treating, or improving a disease or Z according to the present invention is a medicament comprising as an active ingredient at least one of the above-mentioned compound, the above-mentioned degradation inhibitor and the above-mentioned cell death inhibitor, as an effective ingredient.
  • a pharmaceutical composition usually, it is preferable to use one or two or more pharmaceutical carriers as a pharmaceutical composition.
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical preparation according to the present invention is appropriately selected from a wide range, and is usually about 0.0001 to 70% by weight, preferably about 0.0001 to 5% by weight. Is appropriate.
  • Pharmaceutical carriers include fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, lubricants, diluents, excipients, and the like, which are generally used depending on the use form of the preparation. Can be illustrated. These are appropriately selected and used depending on the administration form of the obtained preparation.
  • water a pharmaceutically acceptable organic solvent
  • collagen polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin , Xanthan gum, arabia gum, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, ratatose and the like.
  • collagen polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone
  • carboxyvinyl polymer sodium alginate
  • water-soluble dextran sodium carboxymethyl starch
  • pectin Xanthan gum
  • arabia gum casein
  • casein gelatin
  • agar glycerin
  • propylene glycol polyethylene glycol
  • petrolatum paraffin
  • stearyl alcohol stearic acid
  • a stabilizer for example, a stabilizer, a bactericide, a buffer, a tonicity agent, a chelating agent, a surfactant, and a pH adjuster are appropriately used. Talk about doing things.
  • the stabilizer examples include human serum albumin, ordinary L amino acids, saccharides, cellulose derivatives and the like. These can be used alone or in combination with a surfactant or the like. In particular, this combination may improve the stability of the active ingredient in some cases.
  • the L-amino acid is not particularly limited and may be, for example, glycine, cysteine, glutamic acid and the like.
  • the saccharides are not particularly limited, for example, monosaccharides such as glucose, mannose, galactose and fructose, sugar alcohols such as mannitol, inositol and xylitol, sucrose and maltose.
  • disaccharides such as lactose, polysaccharides such as dextran, hydroxypropyl starch, chondroitin sulfate, and hyaluronic acid, and derivatives thereof.
  • the cellulose derivative is also not particularly limited, such as methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropinoresenololose, hydroxypropinolemethinoresenorelose, and sodium canoleboxyl methylcellulose.
  • the surfactants are not particularly limited either, and ionic surfactants and nonionic surfactants can be used. Can be used.
  • the surfactant includes, for example, polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester type, polyoxyethylene alkyl ether type, sorbitan monoacyl ester type, fatty acid glyceride type and the like.
  • Buffers include boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, ⁇ -aminocaproic acid, glutamic acid and ⁇ or a salt thereof (for example, sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt and the like). Alkali metal salts and alkaline earth metal salts).
  • Examples of the tonicity agent include sodium salt, potassium salt, sugars, glycerin and the like.
  • Examples of the chelating agent include sodium edetate and citric acid.
  • the medicament and the pharmaceutical composition according to the present invention contain water, physiological saline, and the like at the time of use, after being frozen and dried so as to be preserved. It can also be used after dissolving in a buffer or the like to adjust to an appropriate concentration.
  • the dose range of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and the efficacy, dosage form, administration route, type of disease, and nature of the subject (body weight, age, medical condition, and use of other medicaments) of the contained components are not particularly limited. No, etc.) and according to the judgment of the doctor in charge.
  • a suitable dose is, for example, in the range of about 0.01 ⁇ g to 100 mg, preferably about 0.1 lg to 1 mg / kg body weight of the subject. Whilst, these dosages can be varied using routine routine experimentation for optimization, well known in the art.
  • the above dose can be administered once or several times a day, and may be administered intermittently once every few days or weeks!
  • the pharmaceutical composition When administering the pharmaceutical composition of the present invention, the pharmaceutical composition may be used alone or in combination with other compounds or medicaments necessary for prevention and / or treatment of a target disease. Is also good.
  • the administration route may be selected from systemic administration and local administration.
  • an appropriate administration route is selected according to the disease, symptom, and the like.
  • parenteral routes include subcutaneous, intradermal, intramuscular, etc., in addition to usual intravenous and intraarterial administration.
  • it can be administered by the oral route.
  • transmucosal or transdermal administration may be feasible.
  • Various dosage forms can be selected according to the purpose.
  • the typical ones are tablets, Solid dosage forms such as pills, powders, powders, fine granules, granules, capsules, etc., and inclusion bodies such as aqueous solutions, ethanol solutions, suspensions, fat emulsions, ribosomes, cyclodextrins, etc.
  • Liquid dosage forms such as syrups and elixirs are included.
  • These may be further administered orally, parenterally (intravenous, injectable), nasal, inhalant, vaginal, suppository, sublingual, eye drops, ear drops, ointments, ointments, depending on the route of administration. They are classified into creams, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, etc., and can be prepared, molded and prepared according to the usual methods.
  • the present invention relates to HtrA2, at least one of a polynucleotide encoding HtrA2 and a vector containing a polynucleotide encoding HtrA2, and SHC3, ATF6, CREBL, SHC3 or ATF6 or CREBL1.
  • a kit comprising a polynucleotide that encodes, and at least one of a vector containing a polynucleotide that encodes SHC3 or ATF6 or CREBL1.
  • the kit can be used, for example, in the identification method according to the present invention.
  • the kit can contain a signal for detecting the degradation of SHC3, ATF6 or CREBL1 by HtrA2 and a required substance such as Z or a marker, a buffer, and a salt. It may also contain substances such as flour, stabilizers and Z or preservatives. In formulating, it is only necessary to introduce a formulation method corresponding to each substance to be used.
  • a protein having a function of interacting with HtrA2 was predicted according to the prediction method described in the pamphlet of WO01Z67299. That is, the amino acid sequence of HtrA2 is decomposed into oligopeptides of a certain length, the amino acid sequence of each oligopeptide or a protein having an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence is searched in a database, and the obtained protein and We performed a local alignment with HtrA2 and predicted that a high local alignment score would interact with HtrA2.
  • mature HtrA2 (SEQ ID NO: 4) and mature HtrA2 (S306A) (SEQ ID NO: 4) were prepared by adding histidine (His) as a C-terminal tag as active HtrA2 and inactive HtrA2, respectively. Number 6) was used.
  • His histidine
  • SHC3 (p64) (SEQ ID NO: 16) and SHC3 (p52), all of which have c Myc as the C-terminal tag, and c- CR EBL1 (SEQ ID NO: 18) and ATF6 (SEQ ID NO: 20) to which Myc was added were used.
  • HtrA2 134 to 458 amino acid residues of precursor HtrA2 (the DNA base sequence and the amino acid sequence encoded by the DNA are described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2)
  • Human Kidney QUICK-Clone cDNA (Clontech), type I
  • HtrA2-Fl primer with Ndel site and ATG on 5 'side, SEQ ID NO: 21
  • HtrA2-RS primer Xhol excluding stop codon
  • the mature HtrA2 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using KOD-plus (manufactured by Toyobo) as a DNA polymerase and a pCR-Bluntl I TOPO vector (Invitrogen).
  • the nucleotide sequence was determined using Sequencer-1 (Applied Biosystems ZHitachi: ABI3100).
  • the nucleotide sequence of the mature HtrA2 DNA obtained in this example and the amino acid sequence encoded by the DNA are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively.
  • the mature HtrA2 Escherichia coli expression plasmid was obtained by digesting the cloned mature HtrA2 gene with Ndel and Xhol, and integrating it into the pET24b vector (Novagen).
  • a mutant (mature HtrA2 (S306A)) in which serine at position 174 (corresponding to position 306 in the precursor protein (SEQ ID NO: 2)) of mature HtrA2 is substituted with alanine does not show protease activity
  • the inactive E. coli expression plasmid of mature HtrA2 (S306A) was changed to the mature HtrA2 expression plasmid, and the HtrA2-MF primer (SEQ ID NO: 23) and the HtrA2-MR primer (SEQ ID NO: 24) were used.
  • the HtrA2-MF primer SEQ ID NO: 23
  • HtrA2-MR primer SEQ ID NO: 24
  • the nucleotide sequence was determined by the sequencer.
  • the nucleotide sequence of the mature HtrA2 (S306A) DNA obtained in this example and the amino acid sequence encoded by the DNA are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the transformant was cultured in 100 ml of LB medium at 26 ° C, and when the absorbance (OD) reached 0.68-0.81, isopropyl 1thio ⁇ -D-galactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 0. ImM to induce the expression of mature HtrA2 protein. After overnight culture, Escherichia coli expressing mature HtrA2 was separated and recovered by centrifugation.
  • the obtained Escherichia coli was suspended in lysis buffer-A (Lysis buffer: phosphate buffered saline (PBS) Zl% Triton X-100, 1 ⁇ & / ml pepstatin, 5 M E64), and the suspension was cooled on ice.
  • the cells were disrupted by a socketer (15 seconds ⁇ 10 times).
  • the cell lysate was centrifuged (15,000 rpm, 30 minutes, 4 ° C) to separate a soluble fraction (supernatant) and an insoluble fraction.
  • the soluble fraction containing the mature HtrA2 was applied to a pro-bond resin (Invitrogen: lml prepacked) preliminarily equilibrated with 1% Triton X-100 and phosphate buffered saline (PBS)! After mixing at 4 ° C for 30 minutes, the mixture was washed three times with a washing buffer (20 mM sodium phosphate (pH 6.0), 500 mM NaCl). The mature HtrA2 adsorbed on the resin was eluted stepwise with an elution buffer (20 mM sodium phosphate (pH 6.0), 500 mM NaCl) containing 50, 100, 200, 350, and 500 mM imidazole, respectively.
  • a pro-bond resin Invitrogen: lml prepacked
  • PBS phosphate buffered saline
  • SHC3 Human Brain QUICK-Clone cDNA (Clontech) was used as type II, and SHC3F1 primer (BamHI site and GCC were added immediately before ATG, SEQ ID NO: 25) and SHC3R1 primer (excluding the stop codon). An Xhol site was added, the SHC3 (p64) gene was amplified by a PCR method using KOD-plus as a DNA polymerase and KOD-plus, and cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector (Invitrogen). The nucleotide sequence was determined by the sequencer.
  • nucleotide sequence of SHC 3 (p64) DNA obtained in this example six nucleotide differences were recognized as compared with the nucleotide sequence already registered in GenBank as accession number NM-016848. Of the six different bases, four were found to match the genomic sequence: T173 A (with amino acid change from Val to Asp); G789A (no amino acid change); A811G (Thr to Ala A1661G (with an amino acid change from Gin to Arg). The other two different bases were G291C and A1338G, which did not change these amino acids.
  • the nucleotide sequence of SHC3 DNA obtained in this example and the amino acid sequence encoded by the DNA are shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, respectively.
  • SHC3 animal cell expression plasmid was obtained by digesting the cleaved SHC3 gene with BamHI and Xhol and recombining it with pCMV-Tag5.
  • SHC3 (p52), a splicing variant of SHC3, is a protein encoded by the second ATG (360 base downstream from the first ATG) in the coding region of the SHC3 gene.
  • SHC3 (p52) the SHC3 (p64) plasmid cloned in pCMV-Tag5A was digested with SacII and Xhol, and the SacII-Xhol fragment was inserted into the pCMV-Tag5A vector to construct an expression plasmid.
  • the SHC3 (p52) gene was inserted into the expression plasmid by digestion with a restriction enzyme.
  • CREBL1 the Human Brain cDNA was first used for type I, the 83-F primer (EcoRI site and GCC were added immediately before ATG, SEQ ID NO: 27) and the 83-R primer (Xhol site excluding the stop codon).
  • CREBL1 gene was amplified by PCR using SEQ ID NO: 28) and KOD-plus as a DNA polymerase, and cloned into pCMV-Tag5.
  • the CREBL1 gene incorporated into pCMV-Tag5 was designated as type I, and the ATF6-NF1 primer (excluding ATG, adding a BamHI site; SEQ ID NO: 29) and the ATF6-NR1 primer (the termination codon Thereafter, an Xhol site was added, the CREBL1 gene was amplified by PCR using KOD-plus as a DNA polymerase and SEQ ID NO: 30), and cloned into a pCR-Bluntll-TOPO vector. The nucleotide sequence was determined by the sequencer.
  • nucleotide sequence of CREBL1 DNA obtained in this example a difference was found in one of the nucleotides as compared to the nucleotide sequence already registered in GenBank as accession number NM-00438 (T450C). Changes in amino acids due to this difference were powerful. Also, the stop codon changed the TGA force to TAA. These differences confirmed that they were not PCR errors.
  • the nucleotide sequence of the CREBL1 DNA obtained in this example and the amino acid sequence encoded by the DNA are shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, respectively.
  • the CREBL1 animal cell expression plasmid was obtained by digesting the cloned CREBL1 gene with BamHI and Xhol, and integrating it into pCM V-Tag3.
  • ATF6 For ATF6, first, a Mammary Gland QUICK-Clone cDNA (Clontech) was used as type II, and ATF6Fn primer (SEQ ID NO: 31) and ATF6Rn primer (SEQ ID NO: 32) and KOD-plus as a DNA polymerase were used. was used to amplify the ATF6 gene by PCR.
  • the amplified ATF6 gene was designated as type II, and the ATF6F1L primer (EcoRV site was added immediately before ATG, SEQ ID NO: 33) and the ATF6R1L primer (Xhol site was added immediately after the stop codon, SEQ ID NO: 34)
  • the ATF6 gene was further amplified by PCR using KOD-plus as a DNA polymerase and cloned into the pCR4Blunt TOPO vector (Invitrogen).
  • the nucleotide sequence was determined by the sequencer (SEQ ID NO: 19).
  • the nucleotide sequence of ATF6 DNA obtained in this example is a nucleotide sequence already registered in GenBank as accession number NM007348.
  • T105C no amino acid change
  • T199A with an amino acid change from Leu to Met
  • A201G an amino acid change from Leu to Met
  • the nucleotide sequence of ATF6 DNA obtained in this example and the amino acid sequence encoded by the DNA are shown in SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20, respectively.
  • the ATF6 gene cloned into the above pCR4Blunt-TOPO vector was designated as type II, and an ATF6F2L primer (a Bglll site was added immediately before ATG, SEQ ID NO: 35) and The ATF6 gene was amplified by PCR using the ATF6R1L primer (SEQ ID NO: 34) and KOD-plus as a DNA polymerase, and cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector.
  • the nucleotide sequence was determined by the sequencer (SEQ ID NO: 19).
  • the cleaved ATF6 gene was digested with Bglll and Xhoi, and inserted into pCMV-Tag3, an animal cell expression vector digested with BamHI and Xhol.
  • lysis buffer B 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM Na CI, 1% Triton X— 100, 1% N-Dead P-40 (NP-40), Complete Mini (excluding Complex Mini, EDTA)
  • the cells were then collected with a scraper, placed in a 1.5 ml tube, and treated with a solution under ice-cooling (15 sec X 6 The mixture was left standing on ice for 20 minutes, suspended by pipetting, and centrifuged (15,000 rpm, 30 minutes, 4 ° C) to separate the soluble and insoluble fractions. The soluble fraction was used as a test sample.
  • the activity of mature HtrA2 and mature HtrA2 was examined by casein zymography and caseinate sodium protease assay.
  • Casein zymography was performed according to a protocol (manufactured by Invitrogen). Specifically, mature HtrA2 and mature HtrA2 (S306A) are mixed in equal volume with 2X SDS sample buffer under non-reducing conditions, allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then mixed with 4% 16% zymogram (Blue casein) gel. (Zymogram Gel, manufactured by Invitrogen). After completion of the electrophoresis, the mixture was relined with 2.5% Triton X-100, and then subjected to a casein digestion reaction at 37 ° C. in a developing buffer.
  • a protease ATSEY using sodium caseinate as a substrate was prepared by adding 200 ⁇ g of mature HtrA2 or mature HtrA2 (S306A) in a reaction buffer (15 OmM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)). / ml and sodium caseinate were mixed to a concentration of 400 ⁇ g Zml, and incubated at 37 ° C to react. A portion of the reaction solution is collected 3 hours and overnight after the start of the reaction, mixed in an equal volume with 2X SDS sample buffer, boiled, subjected to SDS-PAGE, and stained with Coomassie brilliant blue (CBB). The presence or absence of sodium caseinate degradation was detected.
  • a reaction buffer 15 OmM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
  • protein G Sepharose 4 FF containing SHC3 (p64), SHC3 (p52), CREBL1 or ATF6 was added to 500 1 wash buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Triton X After washing 5 times with No. 100, No. 1 and No. 2 tubes were filled with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Triton X-100, and No. 3 and No. 4 tubes. 100 ⁇ l of a 50 ⁇ g Zml solution of mature HtrA2 (100 ⁇ l) was added to tubes No.
  • An anti-c Myc antibody (9E10) (manufactured by Santa Cruz) was used as a primary antibody for detection, and an anti-mouse IgG antibody (Cell Signaling) labeled with horseradish peroxidase (HRP) was used as a secondary antibody. .
  • the detection was performed using the ECL Western Blotting Detection System (Amersham).
  • CREBL1, ATF6 and SHC3 were all degraded in vitro by mature HtrA2.
  • FIG. 1A the band showing CREBL1 was remarkably reduced by reacting activated HtrA2 with CREBL1 for 1 ⁇ (O / N).
  • FIG. 1B active HtrA2 and ATF6 were allowed to react for 4 hours (4h) or 1 ⁇ (O / N).
  • the band indicating ATF6 was significantly reduced.
  • SHC3 (p64) was significantly reduced by reacting activated HtrA2 with SHC3 (p64) for 4 hours (4 h) or 1 ⁇ ⁇ ⁇ (OZN). It was also found that SHC3 (p52) was similarly degraded in vitro by mature HtrA2.
  • HtrA2 The interaction of HtrA2 with CREBL1, ATF6, SHC3 (p64) or SHC3 (p52) was examined by intracellular protease assay.
  • AVPS N-terminal four residues of mature HtrA2 are binding motifs to IAPs (Inhibitor of apoptosis proteins) family proteins that act to inhibit apoptosis. It is reported to promote caspase-dependent cell death. This effect may affect the examination of protease in cells. Therefore, in order to inhibit the interaction between mature HtrA2 or mature HtrA2 (S306A) and IAPs, N-terminal four residues (AVPS) were deleted ( ⁇ AVPS) or Those in which alanine was substituted with glycine (AVPS ⁇ GVPS) were produced for mature HtrA2 and mature HtrA2 (S306A), respectively. These various HtrA2 m, the deviation also used the thing which added FLAG as a C-terminal Tag.
  • mature HtrA2 was designated as type ⁇ , and F1 and F2 primers (Sacl site was added immediately before ATG, SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37, respectively) were used as sense primers.
  • HtrA2-RS primer SEQ ID NO: 22
  • mature HtrA2 ⁇ AVPS
  • mature HtrA2 ⁇ AVPS
  • ⁇ AVPS mature HtrA2
  • the mature HtrA2 (AAVPS) and mature HtrA2 (GVPS) animal cell expression plasmids are obtained by digesting each of the cloned mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) and mature HtrA2 (GVPS) genes with Sacl and Xhol, and pCMV -Acquired by incorporating into Tag4.
  • the nucleotide sequence of the mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) DNA obtained in this example and the amino acid sequence encoded by the DNA are shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively.
  • the nucleotide sequence of mature HtrA2 (GVPS) DNA and the amino acid sequence encoded by the DNA are shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, respectively.
  • mature HtrA2 (S306A) was designated as type III, and mature HtrA2 (S306A, ⁇ AVPS) and mature HtrA2 were (S306A, GVPS) each gene was amplified and cloned into pCR-Bluntll-TOPO vector.
  • the mature HtrA2 (S306A, AAVPS) and mature HtrA2 (S306A, GVPS) animal cell expression plasmids are used to transfer the cleaved mature HtrA2 (S306A, AAVPS) and mature HtrA2 (S306A, GVPS) genes. It was obtained by digesting with Sacl and Xhol, and incorporating each into pCMV-Tag4.
  • the nucleotide sequence of the mature HtrA2 (S306A, AAVPS) DNA used in this example and the amino acid sequence encoded by the DNA are shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively.
  • the nucleotide sequence of mature HtrA2 (S306A, GVPS) DNA and the amino acid sequence encoded by the DNA are shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, respectively.
  • HtrA2 For various HtrA2 expressed in cultured cells, their enzyme activities were measured by protease assay using sodium caseinate as a substrate (see Example 2). As a result, mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) and mature HtrA2 (GVPS) were found to be active forms having protease activity, and mature HtrA2 (S306A, AAVPS) and mature HtrA2 (S306A) , GVPS) were all inactive forms having no protease activity.
  • ⁇ AVPS mature HtrA2
  • GVPS mature HtrA2
  • S306A, AAVPS mature HtrA2
  • S306A mature HtrA2
  • Each candidate protein and various HtrA2 (SHC3 (p64), SHC3 (p52), ATF6 and CREB L1)
  • Various HtrA2 expression plasmids were combined with any of the candidate protein expression plasmids, and all were supplemented with 1 gZ dish.
  • CREBL1, ATF6, SHC3 (p64), and SHC3 (p52) are all intracellularly activated by active mature HtrA2 ( ⁇ AVPS) or active mature HtrA2 (GVPS). It was found to be decomposed. On the other hand, none of CREBL1, ATF6, SHC3 (p64) and SHC3 (p52) were degraded by inactive mature HtrA2 (S306A, AAVPS) or inactive mature HtrA2 (S306A, GVPS). Was.
  • the CREBL1 animal cell expression plasmid was obtained by digesting CREBL1 cloned in the pCR-Bluntll-TOPO vector in the same manner as in Example 2 with BamHI and Xhol, and incorporating it into pcDNA3.1 / His.
  • the SHC3 (p64) animal cell expression plasmid was obtained by digesting SHC3 (p64), which had been cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector in the same manner as in Example 2, with EcoRI and Xhol, and incorporating it into pcDNA3.1ZV5-His.
  • the SHC3 (p52) animal cell expression plasmid was obtained by digesting SHC3 (p52), which was incorporated into pCMV-Tag5 in the same manner as in Example 2, with PvuII and Xhol, and digesting it with EcoRV and Xhol. Acquired by ligation.
  • Preparation of PRE-labeled CREBL1, SHC3 (p64) and SHC3 (p52) was performed using an in vitro translation reaction thread (TT TranscriDtion / Translation System; Promega) using rabbit reticulocyte lysate.
  • TT TranscriDtion / Translation System Promega
  • CREBL1, SHC3 (p64) and SHC3 (p52) labeled with biotin was detected using streptavidin HRP (manufactured by Promega), Transcend Chemilumine scent substrate (Transcend T Non-Radioactive Translation). detection system; manufactured by Promega) .As a result, it was confirmed that V and the shift were also converted into biotin.
  • the above reaction solution was used as a protease assay sample.
  • the reaction solution was dispensed into 3 tubes (Nos. 2 to 4) at 12.5 1 each.
  • the No. 2 tube contains 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% TritonX-100, and the No. 3 tube contains 200 gZml of mature HtrA2 solution.
  • 251 and No. 4 tube were mixed with 25 ⁇ l of 200 ⁇ g Zml of mature HtrA2 (S306A) solution and mixed.
  • Each tube (No. 2-4) was further dispensed in half, and one tube was reacted at 37 ° C.
  • streptavidin HRP was removed from the membrane used for Western blotting, and antibodies against the Tag added to each protein were used for biotinylated CREBL1, SHC3 (p64) and SHC3 ( The decomposition pattern of p52) was detected.
  • an anti-V5 antibody manufactured by Invitrogen
  • an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody manufactured by Cell Signaling
  • an anti-Xpress antibody manufactured by Invitrogen
  • an HRP-labeled mouse anti-mouse IgG antibody manufactured by Cell Signaling
  • Degradation detection is performed using the ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham) 7).
  • SHC3 (p64) in examining the degradation pattern using a lysine residue subjected to piotinylation as an index, a remarkable decrease in the band showing photinated SHC3 (p64) was observed, and further, at 70 kDa, 40 kDa, Approximately 30 kDa, nondegradable ⁇ was detected as a SHC3 (p64) degradation product (Fig. 3-B). Similar bands were detected in the analysis of the degradation pattern by the anti-Tag antibody (Fig. 4B). This suggests that SHC3 (p64) may be degraded by mature HtrA2 at two or more sites.
  • the present invention relates to the inhibition of cell death based on the degradation of at least one of SHC3, ATF6 and CREBL1 by HtrA2, for example, the inhibition of neuronal cell death, and a disease associated with neuronal death, for example, a neurodegenerative disease And is very useful in the pharmaceutical field. Furthermore, it can also be used in research fields such as elucidation of cell death by HtrA2, for example, cell death by ER stress, for example, neuronal cell death. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 1 DNA encoding HtrA2 precursor protein.
  • SEQ ID NO: 2 HtrA2 precursor protein SEQ ID NO: 2 HtrA2 precursor protein.
  • SEQ ID NO: 3 DNA encoding mature HtrA2
  • SEQ ID NO: 4 mature HtrA.
  • SEQ ID NO: 5 Polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having the same nucleotide sequence as SEQ ID NO: 3 and having a basic strength at position 520; DNA encoding mature HtrA2 (S306A).
  • SEQ ID NO: 6 Polypeptide having the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 4 and having the amino acid sequence in which amino acid residue at position 174 has been substituted with Ala; mature HtrA2 (S306A).
  • SEQ ID NO: 7 Polynucleotide consisting of the same nucleotide sequence as SEQ ID NO: 3 and having a deletion of the nucleotide at position 415 thereof; DNA encoding mature HtrA2 ( ⁇ AVPS).
  • SEQ ID NO: 8 Polypeptide having the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 4 and having the second to fifth amino acid residues deleted; mature HtrA2 ( ⁇ AVPS).
  • SEQ ID NO: 9 Polynucleotide having the same nucleotide sequence as that of SEQ ID NO: 3 and having the 5th-position nucleotide; DNA encoding mature HtrA2 (GVPS).
  • SEQ ID NO: 10 Polypeptide having the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 4, but having a second amino acid residue replaced with Gly; amino acid sequence; mature HtrA2 (GVPS).
  • SEQ ID NO: 11 Polynucleotide consisting of the same nucleotide sequence as SEQ ID NO: 5 but having the nucleotide at position 415 deleted; encoding mature HtrA2 (S306A, ⁇ AVPS)
  • SEQ ID NO: 12 Polypeptide having the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 6 and having the second to fifth amino acid residues deleted; mature HtrA2 (S306A, ⁇ AVPS).
  • SEQ ID NO: 13 Polynucleotide mature form having the same nucleotide sequence as that of SEQ ID NO: 5 and having the 5th-position base; DNA encoding HtrA2 (S306A, GVPS).
  • SEQ ID NO: 14 Polypeptide having the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 6, but having the second amino acid residue replaced with Gly; mature HtrA2 (S306A, GVPS).
  • SEQ ID NO: 15 DNA encoding SHC3.
  • SEQ ID NO: 16 SHC3.
  • SEQ ID NO: 17 DNA encoding CREBL1.
  • SEQ ID NO: 18 CREBL1.
  • SEQ ID NO: 19 DNA encoding ATF6.
  • SEQ ID NO: 20 ATF6.
  • SEQ ID NO: 21 Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, a mature HtrA2 DNA was A polynucleotide for a primer designed to obtain.
  • SEQ ID NO: 22 Polynucleotide for a primer designed to obtain mature HtrA2 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3!
  • SEQ ID NO: 23 Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, mature HtrA2 (S306A)
  • SEQ ID NO: 24 Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, mature HtrA2 (S306A)
  • SEQ ID NO: 25 A primer polynucleotide designed to obtain SHC3 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15.
  • SEQ ID NO: 26 A primer polynucleotide designed to obtain SHC3 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15.
  • SEQ ID NO: 27 Primer polynucleotide designed to obtain CREBL1 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17.
  • SEQ ID NO: 28 A primer polynucleotide designed to obtain CREBL1 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17!
  • SEQ ID NO: 29 A primer polynucleotide designed to obtain CREBL1 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17!
  • SEQ ID NO: 30 Designed polynucleotide based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 for use as a primer to obtain CREBL1 DNA.
  • SEQ ID NO: 31 A primer polynucleotide designed to obtain ATF6 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19!
  • SEQ ID NO: 32 A polynucleotide for primer designed to obtain ATF6 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19!
  • SEQ ID NO: 33 A primer polynucleotide designed to obtain ATF6 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19!
  • SEQ ID NO: 34 A primer polynucleotide designed to obtain ATF6 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19!
  • SEQ ID NO: 35 obtains ATF6 DNA based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 Polynucleotide for primer designed for
  • SEQ ID NO: 36 Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3! /, Mature HtrA2 ( ⁇ AVPS)
  • SEQ ID NO: 37 Designed polynucleotide based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 for use as a primer to obtain mature HtrA2 (GVPS) DNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

　ＨｔｒＡ２と相互作用するＣＲＥＢＬ１およびＳＨＣ１を見出し、さらに活性型ＨｔｒＡ２により、ＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６、およびＳＨＣ１のファミリーであるＳＨＣ３が分解されることを初めて明らかにした。 　そして、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＳＨＣ３のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする神経細胞の細胞死の阻害手段、前記分解の阻害を特徴とする神経細胞の細胞死を伴う疾患（例えば神経変性疾患または脳虚血障害）の防止、治療または改善のための手段、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法、並びに試薬キットを提供した。

Description

明 細 書
SHC3、 ATF6または CREBL1の HtrA2による分解を阻害することによ る神経細胞死阻害および神経変性疾患の改善方法
技術分野
[0001] 本発明は、 SHC3 (サーク ホモロジ一 2 ドメイン コンテイニング トランスフォー ング フ—ロアイン Cd、 src homology 2 domain containing transforming protein C3)、 ATF6 (ァクティべ一ティング トランスクリプション ファクター 6、 a ctivating transcription factor 6)および CREBL1 (サイクリック AMP レスポ ンシブ エレメント ノインディング プロテイン ライク 1、 cAMP responsive ele ment binding protein-like 1)のうちの少なくとも 1の HtrA2 (ノヽィ テンパレィ チヤ一 リクワイアメント プロテイン A2、 high temperature requirement prot ein A2)による分解の阻害に関する。より具体的には、 SHC3、 ATF6および CRE BL 1のうちの少なくとも 1の Htr A2による分解を阻害することを特徴とする神経細胞 死阻害方法、あるいは該分解を阻害する化合物を 1つ以上用いることを特徴とする神 経細胞死阻害方法に関する。また、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくと も 1の HtrA2による分解を阻害することを特徴とする脳虚血障害または神経変性疾 患の防止方法、治療方法または改善方法に関する。さらに、 SHC3、 ATF6および C REBL 1のうちの少なくとも 1の Htr A2による分解を阻害する化合物の同定方法に関 する。また、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解 を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる神経細胞死阻害剤に関する。さらに、 SHC 3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合 物を 1つ以上含んでなる脳虚血障害または神経変性疾患の防止剤、治療剤または 改善剤に関する。また、 HtrA2、 HtrA2をコードするポリヌクレオチドおよび HtrA2 をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれ力 1と、 SH
C3、 ATF6、 CREBL1、並びに SHC3、 ATF6および CREBL1のいずれ力 1をコー ドするポリヌクレオチド、並びに SHC3、 ATF6および CREBL1のいずれか 1をコード するポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれ力 1とを含んでなる 試薬キットに関する。
背景技術
[0002] 生物は、細胞の生存とアポトーシス (細胞死）を調節することにより外界のストレスか ら身を守るが、生存とアポトーシス制御機構の調節の乱れによる過剰な細胞死は、種 々の疾患を招く可能性がある (非特許文献 1)。
[0003] 近年、ストレスを感知し調節する場としてミトコンドリアや小胞体の研究が進み、ミトコ ンドリア膜に局在する HtrA2蛋白質 (以下、 HtrA2と称する）は、 UVや熱ショック等 のストレスによりミトコンドリア膜から細胞質へ移行し (非特許文献 2— 5)、カスパーゼ 依存的な細胞死とカスパーゼ非依存的な細胞死の二つの細胞死を誘導することが 報告された (非特許文献 6)。 HtrA2は、前駆体蛋白質 (配列番号 2)力も N末 133ァ ミノ酸が切り離された成熟型 (配列番号 4)になり、ミトコンドリアから細胞質に移行する 。成熟型 HtrA2はプロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有する Ht rA2を活性型 HtrA2と称することもある。
[0004] カスパーゼ非依存的な細胞死は、 HtrA2自身のセリンプロテアーゼとしての性質 に依存し、その前駆体蛋白質のアミノ酸配列中 306番目（成熟型においては 174番 目に相当する）のセリンをァラニンに置換した HtrA2変異体によりカスパーゼ非依存 的な細胞死は引き起こされないことが知られている（非特許文献 3— 5)。かかる HtrA 2変異体はプロテアーゼ活性を有さない。以下、プロテアーゼ活性を有さない HtrA2 を不活性型 HtrA2と称することもある。このように HtrA2は、カスパーゼ非依存的な 細胞死を誘導する機構において重要な役割を担う因子である。
[0005] 以下に本明細書において引用した文献を列記する。
非特許文献 1 :「細胞工学」、 2002年、第 21卷、第 4号、 p. 360-394。
非特許文献 2 :ャマダチ（H. Yamaguchi)ら、「キャンサー リサーチ（Cancer Res earch)」、 2003年、第 63卷、 p. 1483—1489。
非特許文献 3 :スズキ（Y. Suzuki)ら、「モレキュラー セル（Molecular Cell)」、 20 01年、第 8卷、 p. 613—621。
非特許文献 4:ヘッジ (R. Hegde)ら、「ザ ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミス トリー（The Journal of Biological Chemistry)」、 2002年、第 277卷、 p. 432 非特許文献 5 :マーチンズ（L. M. Martins)ら、「ザ ジャーナノレ ォブ バイオロジ カル ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry)」、 2002年、第 277 卷、 p. 439—444。
非特許文献 6 :「実験医学」、 2002年、第 20卷、第 1号、 p. 73-75。
非特許文献 7 :コンティ（L. Conti)ら、「ネイチヤー ニューロサイエンス（Nature N euroscience)」、 2001年、第 4卷、 p. 579—586。
非特許文献 8 :「生化学」、 2001年、第 73卷、第 11号、 p. 1322— 1325。
非特許文献 9 :カウフマン (R. J. Kaufman)ら、「ザ ジャーナル ォブ タリ-カル インべスティゲーシヨン（The Journal of Clinical Investigation)」、 2002年、 第 110卷、 p. 1389—1398。
非特許文献 10 :ハゼ（K. Haze)ら、「ザ バイオケミカル ジャーナル（The Bioche mical Journal)、 2001年、第 355卷、 p. 19—28。
非特許文献 11 :ウルマー（K. M. Ulmer)、 「サイエンス（Science)」、 1983年、第 2 19卷、 p. 666—671。
非特許文献 12 :「ペプチド合成」、丸善株式会社、 1975年。
非特許文献 13：「ペプチド シンテシス (Peptide Synthesis)」、インターサイエンス (Interscience)、ニューヨーク (New York) ^ 1996年。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] これまでに神経変性疾患におけるカスパーゼ非依存的な細胞死につ!/、ての報告 が多数公表されている。一方、脳虚血においては、小胞体ストレスを介して神経細胞 死が引き起こされることが報告されて 、る。カスパーゼ非依存的な細胞死を誘導する 機構において、 HtrA2が重要な役割を担うと考えられている。これらから HtrA2が、 神経変性疾患の新たな標的となる可能性が高ぐまた小胞体ストレスによる神経細胞 死を阻害することは、新規な創薬標的になると考えられる。
[0007] 本発明の課題は、 HtrA2によるカスパーゼ非依存的な細胞死の機構および HtrA 2の基質が未だ明らかになつていない状況において、 HtrA2と相互作用する蛋白質 を見出し、 HtrA2による該蛋白質の分解に基づく疾患の防止および Zまたは治療を 可能にする手段を提供することである。
課題を解決するための手段
[0008] 上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、 HtrA2が CREBL1および SHC
1と相互作用することをインシリコ（in silico)で予測し、さらに活性型 HtrA2により C
REBL1、 CREBL1のファミリーである ATF6、および SHC1のファミリーである SHC
3が分解されることを実験的に証明して本発明を完成した。
[0009] すなわち本発明は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2 による分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法に関する。
[0010] また本発明は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2によ る分解を阻害する化合物を 1つ以上用いることを特徴とする神経細胞死阻害方法に 関する。
[0011] さらに本発明は、神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である前記神経細胞死阻 害方法に関する。
[0012] さらにまた本発明は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA
2による分解を阻害することを特徴とする脳虚血障害または神経変性疾患の防止方 法、治療方法または改善方法に関する。
[0013] また本発明は、神経変性疾患がアルッノヽイマ一病、パーキンソン病、ポリグルタミン 病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である前記防止方法、治療方法または改 善方法に関する。
[0014] さらに本発明は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2に よる分解を阻害する化合物の同定方法であって、 SHC3、 ATF6および CREBL1の うちの少なくとも 1の HtrA2による分解を可能にする条件下、 SHC3、 ATF6および C REBL1のうちの少なくとも 1と HtrA2とを化合物と接触させ、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1を検出することができるシグナルおよび Zマーカーを 使用する系を用いて、このシグナルおよび Zマーカーの存在若しくは不存在および Zまたは変化を検出することにより、化合物が、 SHC3、 ATF6および CREBL1のう ちの少なくとも 1の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関 する。
[0015] さらにまた本発明は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA 2による分解を阻害する化合物の同定方法であって、 SHC3、 ATF6および CREBL 1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を可能にする条件下、 SHC3、 ATF6およ び CREBL1のうちの少なくとも 1と HtrA2とを化合物と接触させ、 SHC3、 ATF6お よび CREBL 1のうちの少なくとも 1の存在若しくは不存在の検出および Zまたはその 量の変化の測定により、あるいは、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくと も 1の分解物の存在若しくは不存在の検出および Zまたはその量の変化の測定によ り、化合物が、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の分解を阻害す る力否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
[0016] また本発明は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2によ る分解を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる神経細胞死阻害剤に関する。
[0017] さらに本発明は、神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である前記神経細胞死阻 害剤に関する。
[0018] さらにまた本発明は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA 2による分解を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる脳虚血障害または神経変性疾 患の防止剤、治療剤または改善剤に関する。
[0019] また本発明は、神経変性疾患がアルッノヽイマ一病、パーキンソン病、ポリグルタミン 病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である前記神経変性疾患の防止剤、治療 剤または改善剤に関する。
[0020] さらに本発明は、 HtrA2、 HtrA2をコードするポリヌクレオチドおよび HtrA2をコー ドするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれ力 1と、 SHC3、 A TF6、 CREBL 1,並びに SHC3、 ATF6および CREBL1のいずれか 1をコードする ポリヌクレオチド、並びに SHC3、 ATF6および CREBL 1のいずれか 1をコードする ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1とを含んでなる試薬 キットに関する。
発明の効果
[0021] 本発明によれば、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2に よる分解を阻害することにより、これら蛋白質のうちの少なくとも 1の減少または消失を 阻害することができ、その結果、細胞死 (例えば神経細胞の細胞死）の阻害並びに細 胞死を伴う疾患 (例えば脳虚血障害や神経変性疾患)の防止、治療または改善が可 會 になる。
[0022] SHC3は成熟した中枢神経細胞に特異的に発現し、神経細胞の分化と生存に重 要な役割を果たして ヽると考えられる（非特許文献 7および 8)。 ATF6および CREB L1は、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導し、細胞における 小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献 9およ び 10)。これら力ら、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1が HtrA2に より分解されて減少または消失することにより、ストレス等による細胞死、例えば神経 細胞の細胞死が亢進すると考えられる。したがって、 SHC3、 ATF6および CREBL 1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害してその減少または消失を阻害す ることにより、細胞死 (例えば神経細胞の細胞死）の阻害並びに細胞死を伴う疾患（ 例えば脳虚血障害や神経変性疾患)の防止、治療または改善が可能になる。
[0023] また本発明により、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2に よる分解を阻害する化合物の同定方法を実施できる。本同定方法で得られた化合物 は、細胞死 (例えば神経細胞の細胞死）の阻害糖尿病の並びに細胞死を伴う疾患（ 例えば脳虚血障害や神経変性疾患)の防止、治療または改善に使用できる。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1-A]活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)により CREBL1がインビトロで分解されたこ とを説明する図である。活性型 HtrA2と CREBL1を 1晚 (OZN)反応させることによ り、 CREBL1を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA 2 (S306A) )では CREBL1の分解が認められなかった。（実施例 2)
[0025] [図 1-B]活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)により ATF6がインビトロで分解されたことを 説明する図である。活性型 HtrA2と ATF6を 4時間（4h)または 1晚 (OZN)反応さ せることにより、 ATF6を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型 HtrA2 (成熟 型 HtrA2 (S306A) )では ATF6の分解が認められなかった。（実施例 2)
[0026] [図 1-C]活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)により SHC3 (p64)がインビトロで分解され たことを説明する図である。活性型 HtrA2と SHC3 (p64)を 4時間（4h)または 1晚（ O/N)反応させることにより、 SHC3 (p64)を示すバンドが著しく減少した。一方、不 活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )では SHC3 (p64)の分解が認められなか つた。（実施例 2)
[0027] [図 2-A]活性型 HtrA2変異体 (活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)の N末 4アミノ酸残基 を欠失させた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または活性型 HtrA2の N末のァラニンをダリ シンに置換した成熟型 HtrA2 (GVPS) )により、 CREBL1が細胞内で分解されたこ とを説明する図である（上図）。成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 (GV PS)と CREBL1とを共発現させた細胞を用いた解析では、 CREBL1を示すバンドが 著しく減少した（上図）。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 HtrA2 S306 ( Δ A VPS)または成熟型 HtrA2 S306 (GVPS) )と CREBL1とを共発現させた細胞を 用いた解析では、 CREBL1を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内 における各 HtrA2変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がな力つた（下図）。（実 施例 3)
[0028] [図 2-B]活性型 HtrA2変異体 (活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)の N末 4アミノ酸残基 を欠失させた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または活性型 HtrA2の N末のァラニンをダリ シンに置換した成熟型 HtrA2 (GVPS) )により、 ATF6が細胞内で分解されたことを 説明する図である（上図）。成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 (GVPS) と ATF6とを共発現させた細胞を用いた解析では、 ATF6を示すバンドが著しく減少 した（上図）。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 HtrA2 S306 ( Δ AVPS)また は成熟型 HtrA2 S306 (GVPS) )と ATF6とを共発現させた細胞を用いた解析で は、 ATF6を示すバンドの減少は認められなカゝつた（上図）。細胞内における各 HtrA 2変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がな力つた (下図)。（実施例 3)
[0029] [図 2-C]活性型 HtrA2変異体 (活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)の N末 4アミノ酸残基 を欠失させた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または活性型 HtrA2の N末のァラニンをダリ シンに置換した成熟型 HtrA2 (GVPS) )により、 SHC3 (p64)が細胞内で分解され たことを説明する図である（上図）。成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 ( GVPS)と SHC3 (p64)とを共発現させた細胞を用いた解析では、 SHC3 (p64)を 示すバンドが著しく減少した (上図)。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 HtrA2 S306 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 S306 (GVPS) )と SHC3 (p64)とを共発 現させた細胞を用いた解析では、 SHC3 (p64)を示すバンドの減少は認められなか つた（上図）。細胞内における各 HtrA2変異体の発現は、各細胞間でほとんど差が なかった (下図)。（実施例 3)
[0030] [図 2-D]活性型 HtrA2変異体 (活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)の N末 4アミノ酸残基 を欠失させた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または活性型 HtrA2の N末のァラニンをダリ シンに置換した成熟型 HtrA2 (GVPS) )により、 SHC3 (p52)が細胞内で分解され たことを説明する図である（上図）。成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 ( GVPS)と SHC3 (p52)とを共発現させた細胞を用いた解析では、 SHC3 (p52)を 示すバンドが著しく減少した (上図)。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 HtrA2 S306 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 S306 (GVPS) )と SHC3 (p52)とを共発 現させた細胞を用いた解析では、 SHC3 (p52)を示すバンドの減少は認められなか つた（上図）。細胞内における各 HtrA2変異体の発現は、各細胞間でほとんど差が なかった (下図)。（実施例 3)
[0031] [図 3-A]蛋白質内部のリジン残基がピオチン化され且つ N末に Tagが付加された CR EBL1を用いて、ピオチンを検出することにより、活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)によ る CREBL1の分解が検出されたことを説明する図である。活性型 HtrA2と CREBL 1を 4時間（4h)または 1晚（OZN)反応させることにより、ピオチン化 CREBL1を示 すバンドが著しく減少し、 50kDa近辺に CREBL1分解産物を示すと考えられるバン ドが検出された。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )では CREBL1 の分解が認められず、上記 50kDa近辺のバンドも検出されなカゝつた。（実施例 4)
[0032] [図 3-B]蛋白質内部のリジン残基がピオチンィ匕され且つ N末に Tagが付加された SH C3 (p64)を用いて、ピオチンを検出することにより、活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2) による SHC3 (p64)の分解が検出されたことを説明する図である。活性型 HtrA2と S HC3 (p64)を 4時間（4h)または 1晚（OZN)反応させることにより、ピオチン化 SHC 3 (p64)を示すノンドカ S著しく減少し、 70kDa、 40kDaおよび 30kDa近辺に SHC3 ( p64)分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型 HtrA2 (成 熟型 HtrA2 (S306A) )では SHC3 (p64)の分解が認められず、上記 70kDa、 40k Daおよび 30kDa近辺のバンドも検出されなかった。（実施例 4)
[0033] [図 3-C]蛋白質内部のリジン残基がピオチンィ匕され且つ N末に Tagが付加された SH C3 (p52)を用いて、ピオチンを検出することにより、活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2) による SHC3 (p52)の分解が検出されたことを説明する図である。活性型 HtrA2と S HC3 (p52)を 1晚（OZN)反応させることにより、ピオチン化 SHC3 (p52)を示すバ ンドが著しく減少したが、 SHC3 (p52)分解産物を示すと考えられるバンドは検出さ れなかった。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )では SHC3 (p52) の分解が認められな力つた。（実施例 4)
[0034] [図 4-A]蛋白質内部のリジン残基がピオチン化され且つ N末に Tagが付加された CR EBL1を用いて、 N末に付加された Tagを検出することにより、活性型 HtrA2 (成熟 型 HtrA2)により CREBLlが分解されたことを説明する図である。活性型 HtrA2と C REBL1を 4時間（4h)または 1晚（OZN)反応させることにより、 N末に Tagが付加さ れた CREBLlを示すバンドが著しく減少した。図 3で検出された 50kDa近辺の CRE BL1分解産物を示すと考えられるバンドは、抗 Tag抗体では検出されなカゝつた。一方 、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )では CREBLlの分解が認められなか つた。（実施例 4)
[0035] [図 4-B]蛋白質内部のリジン残基がピオチンィ匕され且つ C末に Tagが付加された SH C3 (p64)を用いて、 C末に付加された Tagを検出することにより、活性型 HtrA2 (成 熟型 HtrA2)により SHC3 (p64)が分解されたことを説明する図である。活性型 Htr A2と SHC3 (p64)を 4時間（4h)または 1晚（OZN)反応させることにより、 C末に Ta gが付カ卩された SHC3 (p64)を示すバンドが著しく減少し、 70kDa、 40kDaおよび 3 OkDa近辺に SHC3 (p64)分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、 不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )では SHC3 (p64)の分解は認められな かった。（実施例 4)
[0036] [図 4-C]蛋白質内部のリジン残基がピオチンィ匕され且つ C末に Tagが付加された SH C3 (p52)を用いて、 C末に付加された Tagを検出することにより、活性型 HtrA2 (成 熟型 HtrA2)により SHC3 (p52)が分解されたことを説明する図である。活性型 Htr A2と SHC3 (p52)を 1晚（OZN)反応させることにより、 C末に Tagが付加された SH C3 (p52)を示すバンドが著しく減少し、 40kDa近辺に SHC3 (p52)分解産物を示 すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306 A) )では SHC3 (p52)の分解は認められなかった。（実施例4)
発明を実施するための最良の形態
[0037] 本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第 2003— 342 588号力 の優先権を主張するものである。
[0038] 本明細書にぉ 、ては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは 合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチド を意味する総称的用語として「ポリペプチド」という用語を使用することがある。ここで 蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたぺプ チド結合により互いに結合している 2個以上のアミノ酸を含むものである。以降、ァミノ 酸を表記する場合、 1文字または 3文字にて表記することがある。
[0039] 本発明においては、 HtrA2が CREBL1および SHC1と相互作用することを、国際 公開 WO01Z67299号パンフレット記載の方法に従ってインシリコで予測した。さら に実験的に、 HtrA2により CREBL1、 CREBL1のファミリーである ATF6、および S HC1のファミリーである SHC3が分解されることを初めて明らかにした。
[0040] SHC3は、 N— Sheあるいは ShcCとも称され、成熟した中枢神経細胞に特異的に 発現している。 SHC3は、神経栄養因子 (NGFや EGF等）により活性ィ匕されたレセプ ターチ口シンキナーゼである Trkファミリー（Trk family)からのシグナルを伝達し、 P I3K— Akt— Bad経路を通じて神経細胞の分化と生存に重要な役割を果たしていると 考えられている。また SHC3の SHドメインのみ（dominant negative)を発現させた 細胞では、細胞死が引き起こされ、神経突起の伸長が妨げられることが報告されてい る（非特許文献 7および 8)。
[0041] CREBL1は、 ATF6ファミリーの 1つであり、 ATF6 βとも称される。 CREBL1は小 胞体に局在し、小胞体ストレスにより S1P、 S2Pによりプロセッシングを受けて一部が 核移行し、転写因子として働くことが知られている。
[0042] CREBL1および ATF6はいずれも、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群 の転写を誘導することによりストレスに対する細胞の回復と生存に寄与することが知ら れている（非特許文献 9および 10)。また、小胞体ストレスと神経変性疾患の関連性 カ^、くつかの論文で報告されて 、る（非特許文献 1)。
[0043] これらから、神経細胞にお!/、て過剰なストレス（例えば小胞体ストレス）により活性ィ匕 された HtrA2により、 SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1が分解され て減少または消失することにより、神経細胞の分化'生存シグナル経路の破綻が生じ 、その結果、神経細胞死が亢進されると考える。
[0044] したがって、 SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1の HtrA2による分 解を阻害することにより細胞死を阻害できる。さらに、 SHC3、 ATF6または CREBL 1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害することにより細胞死を伴う疾患の 防止および Zまたは治療が可能になる。例えば、 SHC3、 ATF6または CREBLlの うちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害することにより、神経細胞の細胞死、例 えば小胞体ストレスによる神経細胞死を阻害できる。さらには神経細胞死を伴う疾患 、例えば神経変性疾患や脳虚血障害の防止、治療または改善が可能になる。また、 SHC3、 ATF6または CREBL 1のうちの少なくとも 1の Htr A2による分解の阻害剤は 、神経変性疾患や脳虚血障害の治療薬になる可能性が考えられる。
[0045] これら知見に基づいて本発明においては、 SHC3、 ATF6および CREBLlのうち の少なくとも 1の HtrA2による分解の阻害方法を提供する。さら〖こ、 SHC3、 ATF6 および CREBL 1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害することを特徴とす る神経細胞死阻害方法を提供する。本発明に係る神経細胞死阻害方法は、好ましく はインビトロで実施することができる。本発明においてはまた、 SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1の分解に基づく疾患の防止方法、治療方法または改 善方法を提供する。
[0046] SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解の阻害は HtrA2の作用を阻害することにより実施できる。例えば、 SHC3、 ATF6または CRE BL1と HtrA2の相互作用を阻害することにより実施できる。あるいは、 HtrA2の酵素 活性を阻害することにより実施できる。好ましくは、 SHC3、 ATF6および CREBLlの うちの少なくとも 1と HtrA2とを含む生体外試料において、 HtrA2の作用を阻害する ことにより SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を 阻害できる。ここでは、このような阻害効果を有する物質 (後述する例として競合阻害 効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる)を阻害剤と 称する。また、本明細書中で、「SHC3、 ATF6または CREBL1と HtrA2が相互作 用する」とは、 SHC3、 ATF6または CREBL1と HtrA2がある様式により互いに作用 を及ぼし、その結果、具体的には SHC3、 ATF6または CREBL1が HtrA2により分 解されることを意味する。前記「ある様式」とは、結合、接触あるいは近接等を含むも のであり、結果として互 ヽに作用を及ぼし得る様式であれば 、ずれのものであっても よい。
SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解の阻害は 具体的には、 SHC3、 ATF6または CREBL1と HtrA2の相互作用を阻害する化合 物を用いて実施できる。力かる化合物として、 SHC3、 ATF6、 CREBL1または Htr A2の各アミノ酸配列において SHC3、 ATF6または CREBL1と HtrA2が相互作用 する部位のアミノ酸配列力もなるポリペプチドを例示できる。特に、 HtrA2の基質とな る SHC3、 ATF6または CREBL1由来の力かるポリペプチドは、 SHC3、 ATF6また は CREBL1と HtrA2の蛋白質間相互作用を競合的に阻害し、 HtrA2によるこれら 各蛋白質の分解を阻害できる。このようなポリペプチドは、 HtrA2、 SHC3、 ATF6ま たは CREBL1のアミノ酸配列カゝら設計し、自体公知のペプチド合成法により合成し たものから、 SHC3、 ATF6または CREBL1の HtrA2による分解を阻害するものを 選択すること〖こより取得できる。 SHC3、 ATF6または CREBL1の HtrA2により分解 される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、力かるポリペプチドとして好適であ る。このように特定されたポリペプチドに、 1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付カロ または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を 導入したポリペプチドは、 SHC3、 ATF6または CREBL1の HtrA2による分解を阻 害するものが好ま 、。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく 、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を 導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー (Ulmer)の技術 (非特許文献 11) を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的 な性質 (物性、機能または免疫学的活性等)を変化させないという観点から、例えば、 同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性 荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容 易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基または力 ルポキシル基等を、例えばアミドィ匕修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度 に改変できる。
[0048] 上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。
例えば、成書 (非特許文献 12および 13)に記載の方法が例示されるが、これらに限 らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法による ペプチド合成法、例えば Fmoc法等が挙げられる。または市販のアミノ酸合成装置を 用いて上記ポリペプチドを製造できる。あるいは遺伝子工学的手法により上記ポリべ プチドを取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を 宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例 えば大腸菌にトランスフエクシヨンして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次 いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造できる。
[0049] SHC3、 ATF6または CREBLlの HtrA2による分解の阻害は、 HtrA2、 SHC3、 ATF6または CREBLlを認識する抗体であって、 SHC3、 ATF6または CREBLlの HtrA2による分解を阻害する抗体を用いることによつても実施できる。力かる抗体は 、 HtrA2、 SHC3、 ATF6または CREBLl自体、あるいは SHC3、 ATF6または CR EBL1と HtrA2が相互作用する部位のアミノ酸配列力もなるポリペプチドを抗原とし て自体公知の抗体作製法により取得できる。
[0050] SHC3、 ATF6または CREBLlの HtrA2による分解の阻害は、 HtrA2の酵素活 性を阻害する化合物、好ましくは特異的に阻害する化合物により実施できる。かかる 化合物は、例えば、 SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1を基質として 、 HtrA2による当該基質の分解を阻害するものを同定することにより取得できる。 Ht rA2を特異的に阻害するとは、 HtrA2を強く阻害するが、他の酵素は阻害しないか、 弱く阻害することを意味する。
[0051] SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害す る化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築 できる。例えば、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による 分解を可能にする条件を選択し、当該条件下で SHC3、 ATF6および CREBL1のう ちの少なくとも 1および Zまたは HtrA2を、調べようとする化合物 (被検化合物）と接 触させ、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の分解を検出し得るシ グナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまた はマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、 SHC3、 ATF6 および CREBL 1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物を同定 できる。 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を 可能にする条件は、インビトロのものであってよぐインビボのものであってもよい。例 えば、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1と HtrA2とを共発現させ た細胞を用いることもできる。細胞における共発現は、 SHC3、 ATF6または CREBL 1をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターと HtrA2をコードするポリヌクレ ォチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細胞に トランスフエクシヨンすることにより達成できる。 SHC3、 ATF6または CREBL 1をコー ドするポリヌクレオチドを含むベクターは、単独で用いることができるし、組合せて用い ることもできる。細胞は、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは動物培養細 胞株、さらに好ましくは哺乳動物培養細胞株を用いることができる。 SHC3、 ATF6お よび CREBL1のうちの少なくとも 1および Zまたは HtrA2と被検化合物との接触は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解の反応以 前に行なってもよいし、該分解の反応に共存させることにより行なってもよい。ここで マーカーとは、それ自体は物理的または化学的性質により検出され得ないが、化学 的反応を経ることにより前記シグナルを生成させるものであって、該生成されるシグナ ルの物理的、化学的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを 指す。シグナルおよび Zまたはマーカーとして、レポーター遺伝子 (例えばクロラムフ ェ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子等）、放射性同位体、タグペプチド類（
His— tag、 Myc— tagゝ HA— tag、 FLAG— tagまたは Xpress— tag等）、 GST等の酵 素類、ピオチン、および蛍光蛋白質等、公知のものが利用できるが、これら例示に限 らず、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれも利 用できる。これらシグナルおよび Zまたはマーカーの検出方法は当業者には周知で ある。簡便には、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の分解は、これ ら蛋白質またはこれら蛋白質の分解物の存在若しくは不存在の検出および Zまたは その量の変化の検出により測定できる。これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解 物量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブ ロッテイング等を用いて実施できる。
[0052] HtrA2、 SHC3、 ATF6および CREBL1はいずれも公知蛋白質であり、ジェンバ ンク（GenBank)にそれぞれァクセッションナンバー NM— 013247、 NM— 01684 8、 NM一 007348および NM一 00438として開示されて!、る。
[0053] 本実施例にお!、て用いた HtrA2のアミノ酸配列を配列番号 4に示す。また、配列 番号 4に記載のアミノ酸配列をコードする HtrA2 DNAの塩基配列を配列番号 3に 示す。配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、成熟型 HtrA2で ある。成熟型 HtrA2とは、 HtrA2前駆体蛋白質 (配列番号 2)から N末 133アミノ酸 残基が切り離されて生じた成熟型蛋白質であり、プロテアーゼ活性を有する。以下、 プロテアーゼ活性を有する HtrA2を活性型 HtrA2と呼称することがある。また、活性 型 HtrA2として、成熟型 HtrA2の N末の 4残基 (AVPS)を欠失させた蛋白質（配列 番号 8、成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)と称することがある）または成熟型 HtrA2の N末 の 4残基のうちのァラニンをグリシンに置換した蛋白質 (配列番号 10、成熟型 HtrA2 (GVPS)と称することがある）を用いることができる。このような変異を導入した HtrA2 は、そのプロテアーゼ活性には変化がないため、活性型 HtrA2として用いることがで きる。一方、プロテアーゼ活性を有さない HtrA2を不活性型 HtrA2と呼称することが ある。不活性型 HtrA2として、 HtrA2のアミノ酸配列において HtrA2のプロテア一 ゼ活性に必要な部位のアミノ酸残基に変異を有し、該変異の結果プロテアーゼ活性 を示さな 、HtrA2変異体が例示できる。 HtrA2のプロテアーゼ活性に必要な部位と して、プロテアーゼ活性ドメイン、より好ましくは成熟型 HtrA2 (配列番号 4)の 174番 目（前駆体蛋白質 (配列番号 2)では 306番目に相当）のセリン残基が挙げられる。不 活性型 HtrA2として、より具体的には、成熟型 HtrA2の 174番目（前駆体蛋白質（ 配列番号 2)では 306番目に相当）のセリン残基がァラニンに置換した HtrA2変異体 (配列番号 6、成熟型 HtrA2 (S306A)と呼称する）が例示できる。また、不活性型 H trA2として、成熟型 HtrA2 (S306A)の N末の 4残基 (AVPS)を欠失させた蛋白質 (配列番号 12、成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)と称することがある）または成熟 型 HtrA2の N末の 4残基のうちのァラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号 14 、成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)と称することがある）を用いることができる。
[0054] 本実施例において用いた SHC3のアミノ酸配列を配列番号 16に示す。以下、配列 番号 16に記載のアミノ酸配列で表される SHC3蛋白質を、 SHC3 (p64)と称すること がある。また、 SHC3 (p64) DNAの塩基配列を配列番号 15に示す。配列番号 15 に記載の塩基配列は、ァクセッションナンバー NM— 016848に開示された SHC3 の塩基配列と比較して 6つの塩基に相違が認められた (実施例 2参照)。また、本発 明においては、 SHC3のスプライシングバリアントである SHC3 (p52)を使用した。 S HC3 (p52)は、 SHC3遺伝子のコード領域内の 2番目の ATG (1番目の ATGより 3 60base下流）からコードされる蛋白質である。
[0055] 本実施例にお!、て用いた ATF6のアミノ酸配列を配列番号 20に示す。また、 ATF 6 DNAの塩基配列を配列番号 19に示す。配列番号 19に記載の塩基配列は、ァク セッションナンバー NM— 007348に開示された ATF6の塩基配列と比較して 15個 の塩基に相違が認められた (実施例 2参照)。
[0056] 本実施例にお!、て用いた CREBL1の塩基配列を配列番号 18に示す。また、 CRE BL1 DNAの塩基配列を配列番号 17に示す。配列番号 17に記載の塩基配列は、 ァクセッションナンバー NM— 00438に開示された CREBL1の塩基配列と比較して 塩基の 1つに相違が認められた (実施例 2参照)。
[0057] 本発明において HtrA2、 SHC3、 ATF6および CREBL1並びにこれら各蛋白質 をコードする各遺伝子は、上記例示したアミノ酸配列または塩基配列で表される蛋白 質または遺伝子に限定されず、一般的に報告されている HtrA2、 SHC3、 ATF6お よび CREBL 1を!、ずれも含む。
[0058] 本発明において使用する HtrA2、 SHC3、 ATF6および CREBL1は、これらを遺 伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料力 調製したもの、無細胞系合成産 物または化学合成産物であってよぐあるいはこれらからさらに精製されたものであつ てもよい。また、 HtrA2、 SHC3、 ATF6および CREBL1のいずれか 1を遺伝子ェ 学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。 HtrA2、 SHC3、 ATF6および CREBL1は、 SHC3、 ATF6または CREBL1と HtrA2との相互作用、およびこれら 蛋白質の機能、例えば HtrA2のプロテアーゼ活性や SHC3、 ATF6および CREBL 1の酵素基質としての性質等に影響がなければ、 N末側や C末側に別の蛋白質ゃポ リペプチドを、直接的にまたはリンカ一ペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的 手法等を用いて付加したものであってもよ 、。付加する別の蛋白質やポリペプチドと して、 j8—ガラクトシダーゼ、 IgG等の免疫グロブリン Fc断片、 tagペプチド類 (His— ta g、 Myc— tag、 HA— tag、 FLAG— tag、または Xpress— tag等）を例示できる。
[0059] HtrA2、 SHC3、 ATF6または CREBL1をコードするポリヌクレオチドは、ヒト cDN Aライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。 HtrA2、 SHC3 、 ATF6または CREBL1をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、当該ポ リヌクレオチドを適当な発現 DNAベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに 自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。
[0060] 被検化合物として、例えばィ匕学ライブラリーや天然物由来の化合物、あるいは Htr A2、 SHC3、 ATF6または CREBL 1の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデ ザインして得られた化合物等が挙げられる。その他、 SHC3、 ATF6または CREBL1 の HtrA2により分解される部位のアミノ酸配列力 なるポリペプチドの構造に基づい てドラッグデザインして得られたィ匕合物等も被検化合物として好適である。
[0061] 本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、 SHC3、 ATF6および C REBL1のうちの少なくとも 1と HtrA2とを用いたインビト口におけるプロテアーゼアツ セィ（実施例 2)に被検化合物を添加することにより実施できる。活性型である成熟型 HtrA2は、ヒト腎臓 cDNAライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得 した成熟型 HtrA2 DNAを含む適当なベクターをトランスフエクシヨンした大腸菌か ら調製できる。 SHC3は、ヒト脳 cDNAライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手 法により取得した SHC3 DNAを含む適当なベクターをトランスフエクシヨンした動物 細胞培養株（例えば HEK293T細胞）から調製できる。 CREBL1は、ヒト脳 cDNAラ イブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得した CREBL1 DNAを含 む適当なベクターをトランスフエクシヨンした動物細胞培養株（例えば HEK293T細 胞)から調製できる。 ATF6は、ヒト乳腺 cDNAライブラリーから自体公知の遺伝子ェ 学的手法により取得した ATF6 DNAを含む適当なベクターをトランスフエクシヨンし た動物細胞（例えば HEK293T細胞）から調製できる。 SHC3、 CREBL1、 ATF6 および HtrA2は、これら蛋白質をそれぞれ発現させた各細胞の細胞溶解液の可溶 性画分に含まれる。 SHC3、 ATF6および CREBL1は、好ましくは、それらの N末ま たは C末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させ、該タグペプチドに対 する抗体で免疫沈降することにより精製して用いることが適当である。例えば、タグべ プチドに対する抗体で免疫沈降した後、榭脂 (プロテイン G セファロース等)等に補 足したものを使用できる。インビト口におけるプロテアーゼアツセィは、榭脂等に補足 した SHC3、 CREBL1または ATF6に、成熟型 HtrA2を添カ卩して 37°Cでー晚反応 させた後、これら蛋白質をウェスタンブロッテイングで検出することにより実施できる。 SHC3および ATF6については、 37°Cで 4時間反応させることにより成熟型 HtrA2 により分解されるため、プロテアーゼアツセィにおける反応時間を 4時間にすることも できる。ウェスタンブロッテイングによる検出は、 SHC3、 CREBL1または ATF6に付 カロさせたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。 SHC3、 CREBL1または A TF6は HtrA2により分解されるため、ウェスタンブロッテイングにより検出されるこれら 蛋白質の量は、 HtrA2を添カ卩しないときと比較して減少または消失する。 SHC3、 C REBL1または ATF6と成熟型 HtrA2との反応に被検化合物を添加し、被検化合物 を添カ卩しな 、ときと比較して SHC3、 CREBL1または ATF6の量の低減または消失 が阻害される場合、該被検化合物は SHC3、 CREBL1または ATF6の HtrA2によ る分解を阻害すると判定できる。被検化合物は予め SHC3、 CREBL1または ATF6 と、あるいは成熟型 HtrA2と接触させ、その後、 SHC3、 CREBL1または ATF6と成 熟型 HtrA2を反応させることもできる。
また、本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、 SHC3、 ATF6お よび CREBL 1のうちの少なくとも 1と Htr A2とを共発現させた細胞を用 、た細胞内プ 口テアーゼアツセィ (実施例 3)に被検化合物を添加することにより実施できる。 SHC 3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1と HtrA2との細胞での共発現は、上 記のように作製した SHC3 DNA、CREBL1 DNAおよび ATF6 DNAのそれぞ れを含む適当なベクターと HtrA2 DNAを含む適当なベクターとを、自体公知の遺 伝子工学的手法で動物細胞培養株 (例えば HEK293T細胞）にトランスフエクシヨン すること〖こより実施できる。 SHC3、 ATF6および CREBL1は、これら蛋白質の N末 または C末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させることが、これら蛋白 質の検出を容易にするため、好ましい。 HtrA2は、活性型 HtrA2を用いる。活性型 HtrA2として、成熟型 HtrA2、好ましくは N末の 4残基 (AVPS)を欠失させた成熟 型 HtrA2 ( Δ AVPS)または N末の 4残基のうちのァラニンをグリシンに置換した成熟 型 HtrA2 (GVPS)を用いることが適当である。成熟型 HtrA2の N末の 4残基 (AVP S)は、アポトーシスの阻害に働く IAPs (Inhibitor of apoptosis proteins)フアミ リー蛋白質との結合モチーフであり、 IAPsと結合してその作用を阻害することにより カスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内での プロテアーゼアツセィの検討に影響を与える可能性が考えられるため、 IAPsと結合し な 、成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 (GVPS)を使用することが好ま しい。細胞内プロテアーゼアツセィは、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少な くとも 1と HtrA2とを共発現させた細胞を被検化合物と共に 37°Cで 48時間培養後、 該細胞を溶解し、その溶解液中に含まれる SHC3、 CREBL1または ATF6をウェス タンブロッテイングで検出することにより実施できる。ウェスタンブロッテイングによる検 出は、 SHC3、 CREBL1または ATF6に付加させたタグペプチドに対する抗体を用 いて実施できる。 SHC3、 CREBL1または ATF6は HtrA2により分解されるため、ゥ エスタンブロッテイングにより検出されるこれら蛋白質の量は、 HtrA2を添カ卩しないと きと比較して減少または消失する。被検化合物を添加した場合の SHC3、 CREBL1 または ATF6の量の低減または消失力 被検化合物を添加しな 、ときと比較して阻 害される場合、該被検化合物は SHC3、 CREBL1または ATF6の HtrA2による分 解を阻害すると判定できる。
本発明に係る化合物の同定方法は、上記インビトロにおけるプロテアーゼアツセィ や細胞内プロテアーゼアツセィを用いた具体的例示に限定されず、一般的に用いら れて 、る医薬品スクリーニングにお 、てよく知られて 、る同定方法を用いて実施でき る。
[0064] 本発明に係る化合物の同定方法で得られたィ匕合物は、 SHC3、 ATF6および CR EBL 1のうちの少なくとも 1の Htr A2による分解の阻害剤として利用できる。当該化合 物は、生物学的有用性と毒性のノ ランスを考慮して選別することにより、医薬組成物 として調製できる。医薬組成物の調製において、これら化合物は、単独で使用するこ ともできるし、組合せて使用することもできる。
[0065] SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害す る化合物は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分 解に基づく細胞死の阻害剤に利用できる。好ましくは小胞体ストレスによるの細胞死 の阻害剤として有用である。より好ましくは、神経細胞死の阻害剤、さらに好ましくは 小胞体ストレスによる神経細胞死の阻害剤として有用である。また、上記化合物は、 脳虚血による神経細胞死の阻害剤に利用できる。さらに、これら阻害剤を用いて、小 胞体ストレスによる細胞死の阻害方法を実施できる。好ましくは、小胞体ストレスや脳 虚血による神経細胞死の阻害方法を実施できる。
[0066] SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害す る化合物は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分 解に基づく疾患の防止剤、改善剤および Zまたは治療剤を調製できる。かかる疾患 としては、例えば神経細胞死を伴う疾患、より具体的にはアルツハイマー病、パーキ ンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)等を挙げること ができる。これら疾患は多くの場合、神経細胞内に異常な蛋白質が凝集体を形成し て!、ることが認められており、またこれら疾患における神経細胞死と小胞体ストレスと の関連が報告されている (非特許文献 1)。また、上記化合物を用いて、このような疾 患の防止方法、改善方法および Zまたは治療方法を実施できる。
[0067] 本発明に係る疾患の防止剤、治療剤および Zまたは改善剤は、上記化合物、上記 分解阻害剤および上記細胞死阻害剤のうち少なくともいずれか 1を有効成分としてそ の有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、 1種または 2種以上の医薬用担体を用 V、て医薬組成物として製造することが好ま U、。 [0068] 本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される 力 通常約 0. 00001— 70重量％、好ましくは 0. 0001— 5重量％程度の範囲とする のが適当である。
[0069] 医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、 結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等を例示できる。これらは得 られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。
[0070] より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコ ール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビ-ルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性 デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、ァラビ ァゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリ コール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン 、マン-トール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられる。これらは、本医薬組成物の 剤形に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組合せて使用される。
[0071] 所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺 菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、および pH調整剤等を適宜使用 することちでさる。
[0072] 安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常の L アミノ酸、糖類、セルロース誘 導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特 にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。 Lーァミノ 酸は、特に限定はなぐ例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等のいずれでもよい
。糖類も特に限定はなぐ例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単 糖類、マン-トール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース
、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒ アルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等の 、ずれでもよ 、。セルロース誘 導体も特に限定はなぐメチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシェチルセル ロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、カノレボキ シメチルセルロースナトリウム等の!/、ずれでもよ!/、。
[0073] 界面活性剤も特に限定はなぐイオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤 のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソル ビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノ ァシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
[0074] 緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クェン酸、 ε アミノカプロン酸、グルタミン酸およ び Ζまたはそれらに対応する塩 (例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム 塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)等を例示できる。
[0075] 等張化剤は、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。
[0076] キレート剤は、例えばェデト酸ナトリウム、クェン酸等を例示できる。
[0077] 本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍 結乾燥ィ匕し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等 で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
[0078] 医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、 投与経路、疾患の種類、対象の性質 (体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有 無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は 、例えば対象の体重 lkgあたり約 0. 01 μ g乃至 lOOmg程度、好ましくは約 0. l ^ g 乃至 lmg程度の範囲であることが好ましい。し力しながら、当該分野においてよく知 られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うこと ができる。上記投与量は 1日 1回乃至数回に分けて投与することができ、数日または 数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよ!、。
[0079] 本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよぐ あるいは目的の疾患の防止および Zまたは治療に必要な他の化合物または医薬と 共に使用してもよい。
[0080] 投与経路は、全身投与または局所投与の!/ヽずれも選択できる。この場合、疾患、症 状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈 内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは 経口経路で投与することができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施可能で める。
[0081] 投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、 丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製 剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リボソーム製剤、シクロデキストリン等 の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経 路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、 舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分 類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
[0082] さらに本発明は、 HtrA2、 HtrA2をコードするポリヌクレオチドおよび HtrA2をコー ドするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれ力 1と、 SHC3、 A TF6、 CREBL、 SHC3または ATF6または CREBL1をコードするポリヌクレオチド、 および SHC3または ATF6または CREBL1をコードするポリヌクレオチドを含有する ベクターのうちの少なくともいずれか 1とを含んでなるキットを提供する。当該キットは、 例えば本発明に係る同定方法に使用できる。
[0083] 上記キットは、 SHC3、 ATF6または CREBL1の HtrA2による分解を検出するため のシグナルおよび Zまたはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含 むことができる。さら〖こ、安定化剤および Zまたは防腐剤等の物質を含んでいてもよ い。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すれ ばよい。
[0084] 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に 限定されない。
実施例 1
[0085] (HtrA2と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
HtrA2と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第 WO01Z67299号パ ンフレットに記載の予測方法に従って予測した。すなわち、 HtrA2のアミノ酸配列を ある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミ ノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた 蛋白質と HtrA2との間でローカルァライメントを行い、ローカルァライメントのスコアの 高 、ものを HtrA2と相互作用すると予測した。
[0086] 解析の結果、 HtrA2と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、 CR EBL1および SHC1を見出した。
実施例 2
[0087] (インビトロ プロテアーゼアツセィ）
CREBL1、 CREBL1のファミリーである ATF6、または SHC1のファミリーである S HC3と HtrA2の相互作用を実験的に検証するために、インビト口におけるプロテア ーゼアツセィを実施した。
[0088] <材料およびその調製 >
本実施例においては、活性型 HtrA2および不活性型 HtrA2としてそれぞれ、い ずれも C末 Tagとしてヒスチジン (His)を付カ卩した成熟型 HtrA2 (配列番号 4)および 成熟型 HtrA2 (S306A) (配列番号 6)を用いた。また、 HtrA2と相互作用すると予 想した蛋白質として、いずれも C末 Tagとして c Mycを付カ卩した SHC3 (p64) (配列 番号 16)および SHC3 (p52)、並びにいずれも N末 Tagとして c— Mycを付カ卩した CR EBL1 (配列番号 18)および ATF6 (配列番号 20)を用いた。
[0089] 1.成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)のクローユングおよび発現プラスミ ドの作製
成熟型 HtrA2 (前駆体 HtrA2 (その DNA塩基配列および該 DNAによりコードさ れるアミノ酸配列は配列番号 1および配列番号 2に記載)のアミノ酸残基 134— 458部 分）をコードする遺伝子を得るために、 Human Kidney QUICK— Clone cDNA (Clontech社製）を铸型とし、 HtrA2—Flプライマー（5'側に Ndel部位と ATGを付 カロ、配列番号 21)と HtrA2— RSプライマー（終止コドンを除いて Xhol部位を付加、 配列番号 22)および DNAポリメラーゼとして KOD— plus (Toyobo社製）を用いてポ リメラーゼ連鎖反応法 (PCR法）により成熟型 HtrA2遺伝子を増幅し、 pCR - Bluntl I TOPOベクター（Invitrogen社製）にクローユングした。また、シークェンサ一（Ap plied BiosystemsZHitachi:ABI3100)により塩基配列を決定した。本実施例で 得られた成熟型 HtrA2 DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸 配列をそれぞれ配列番号 3および配列番号 4に記載した。成熟型 HtrA2大腸菌発 現プラスミドは、クローユングした成熟型 HtrA2の遺伝子を Ndelと Xholで消化し、 p ET24bベクター（Novagen社製）に組込むことにより取得した。 [0090] 成熟型 HtrA2の 174番目（前駆体蛋白質 (配列番号 2)では 306番目に相当）のセ リンをァラニンに置換した変異体 (成熟型 HtrA2 (S306A) )は、プロテアーゼ活性を 示さないことが報告されている。そこで、不活性型である成熟型 HtrA2 (S306A)の 大腸菌発現プラスミドを、成熟型 HtrA2発現プラスミドを铸型とし、 HtrA2— MFブラ イマ一（配列番号 23)と HtrA2— MRプライマー（配列番号 24)を用いて QuikChang e XL Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene社製）により作製した。ま た、シークェンサ一により塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型 HtrA2 ( S306A) DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞ れ配列番号 5および配列番号 6に記載した。
[0091] 2.成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)の発現および精製
成熟型 HtrA2大腸菌発現プラスミドを大腸菌 BL21 Star (DE3)コンビテントセル (Invitrogen社製）に導入した形質転換体を取得した。この形質転換体を、 26°Cに て 100mlの LB培地で培養し、吸光度（OD)が 0. 68-0. 81に達したときにイソプロ ピル 1 チォー β—D ガラクトピラノシド (IPTG)を最終濃度 0. ImM添加することに より成熟型 HtrA2蛋白質の発現誘導を行い、一晩培養した後、成熟型 HtrA2を発 現している大腸菌を遠心処理により分離回収した。得られた大腸菌を、リシスバッファ 一 A (Lysis buffer：リン酸緩衝生理食塩水（PBS) Zl% トライトン X— 100、 1 μ & /ml ぺプスタチン、 5 M E64)に懸濁し、氷冷下でソ-ケ一ター（15秒 X 10回） により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心処理し（15, 000rpm、 30分、 4°C)、可溶 性画分 (上清)と不溶性画分に分離した。成熟型 HtrA2の含まれる可溶性画分を、 あらかじめ 1% トライトン X— 100、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)にて平衡ィ匕したプロ ボンドレジン（Invitrogen社製： lml prepacked)に力！]え、 4°Cで 30分間混和した後 、洗浄バッファー（20mM リン酸ナトリウム（pH6. 0)、 500mM NaCl)にて 3回洗 浄した。レジンに吸着した成熟型 HtrA2は、 50、 100、 200、 350、 500mM イミダ ゾールをそれぞれ含む溶出バッファー（20mM リン酸ナトリウム（pH6. 0)、 500m M NaCl)にて段階的に溶出した。各溶出液について SDS— PAGEを行い、成熟型 HtrA2を含む画分を特定した。その結果、 350-500mM イミダゾールで成熟型 H trA2が溶出された。成熟型 HtrA2を含む画分を 150mM NaCl, 50mM Tris— HCl (pH7. 5)に対して透析した後、遠心処理にて不溶物を除去した上清を濃縮し、 牛血清アルブミン（BSA)を標準蛋白質としてクマシ一プラスプロテインアツセィ（Coo massie Plus Protein Assay、 PIERCE社製）により蛋白質を定量した。また成 熟型 HtrA2 (S306A)の発現および精製についても同様に行った。
[0092] 3. SHC3 (p64)、 SHC3 (p52)、 ATF6および CREBL1のクローユングおよび発現 プラスミドの作製
SHC3 (p64)については、 Human Brain QUICK— Clone cDNA (Clontech 社製）を铸型とし、 SHC3F1プライマー (ATGの直前に BamHI部位と GCCを付加、 配列番号 25)と SHC3R1プライマー（終止コドンを除いて Xhol部位を付加、配列番 号 26)および DNAポリメラーゼとして KOD— plusを用いて PCR法により SHC3 (p64 )遺伝子を増幅させ、 pCR4Blunt— TOPOベクター（Invitrogen社製）にクローニン グした。また、シークェンサ一により塩基配列を決定した。本実施例で得られた SHC 3 (p64) DNAの塩基配列は、 GenBankにァクセッションナンバー NM— 016848 として既に登録された塩基配列と比較して 6つの塩基に相違が認められた。相違する 6塩基のうち、次の 4つはゲノム配列と一致することが判明した: T173 A ( Valから Asp へのアミノ酸の変化を伴う）； G789A (アミノ酸の変化なし）； A811G (Thrから Alaへ のアミノ酸の変化を伴う）；および A1661G (Ginから Argへのアミノ酸の変化を伴う）。 他の 2つの相違する塩基は、 G291Cおよび A1338Gであり、これら〖こよるアミノ酸の 変化はなかった。本実施例で得られた SHC3 DNAの塩基配列および該 DNAにコ ードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 15および配列番号 16に記載した。 SH C3動物細胞発現プラスミドは、クローユングした SHC3遺伝子を BamHIと Xholで消 化し、 pCMV— Tag5に組み換えることにより取得した。
[0093] SHC3のスプライシングバリアントである SHC3 (p52)は、 SHC3遺伝子のコード領 域内の 2番目の ATG (1番目の ATGより 360base下流）力 コードされる蛋白質であ る。 SHC3 (p52)については、 pCMV— Tag5Aにクローユングされている SHC3 (p6 4)プラスミドを SacIIと Xholで消化し、 SacII— Xhol断片を pCMV— Tag5Aベクター に挿入し、発現プラスミドを構築した。また発現プラスミドに SHC3 (p52)遺伝子が挿 入されていることを制限酵素で消化することにより確認した。 [0094] CREBL1については、まず Human Brain cDNAを铸型とし、 83— Fプライマー (ATGの直前に EcoRI部位と GCCを付加、配列番号 27)と 83— Rプライマー（終止コ ドンを除いて Xhol部位を付加、配列番号 28)および DNAポリメラーゼとして KOD— plusを用いて PCR法により CREBL1遺伝子を増幅させ、 pCMV— Tag5にクロー- ングした。
[0095] 次に、 pCMV— Tag5に組込んだ CREBL1遺伝子を铸型とし、 ATF6— NF1プライ マー（ATGを除!、て BamHI部位を付加、配列番号 29)と ATF6— NR1プライマー（ 終止コドンの後に Xhol部位を付加、配列番号 30)および DNAポリメラーゼとして K OD— plusを用いて PCR法により CREBL1遺伝子を増幅させ、 pCR— Bluntll— TO POベクターにクローユングした。また、シークェンサ一により塩基配列を決定した。本 実施例で得られた CREBL1 DNAの塩基配列は、 GenBankにァクセッションナン バー NM— 00438として既に登録された塩基配列と比較して塩基の 1つに相違が認 められた (T450C)。この相違によるアミノ酸の変化はな力 た。また、終止コドンが T GA力も TAAに変化した。これらの相違は PCRエラーではないことを確認した。本実 施例で得られた CREBL1 DNAの塩基配列および該 DNAにコードされるアミノ酸 配列をそれぞれ配列番号 17および配列番号 18に記載した。 CREBL1動物細胞発 現プラスミドは、クローユングした CREBL1遺伝子を BamHIと Xholで消化し、 pCM V— Tag3に組込むことにより取得した。
[0096] ATF6については、まず、 Mammary Gland QUICK— Clone cDNA(Clonte ch社製）を铸型とし、 ATF6Fnプライマー（配列番号 31)と ATF6Rnプライマー（配 列番号 32)および DNAポリメラーゼとして KOD— plusを用いて PCR法により ATF6 遺伝子を増幅させた。次に、この増幅された ATF6遺伝子を铸型とし、 ATF6F1Lプ ライマー（ATGの直前に EcoRV siteを付加、配列番号 33)と ATF6R1Lプライマ 一（終止コドンの直後に Xhol siteを付加、配列番号 34)および DNAポリメラーゼと して KOD— plusを用いて PCR法により ATF6遺伝子をさらに増幅させ、 pCR4Blunt TOPOベクター（Invitrogen社製）にクローユングした。また、シークェンサ一により 塩基配列を決定した (配列番号 19)。本実施例で得られた ATF6 DNAの塩基配列 は、 GenBankにァクセッションナンバー NM 007348として既に登録された塩基 配列と比較して 15個の塩基に相違が認められた。相違する 15塩基は全てゲノム配 列と一致することが判明した: T105C (アミノ酸の変化なし）； T199A (Leuから Met へのアミノ酸の変化を伴う）； A201G (Leuから Metへのアミノ酸の変化を伴う）； C27 0T (アミノ酸の変化なし）； A309G (アミノ酸の変化なし）； C433G (Proから Alaへの アミノ酸の変化を伴う）； T469C (Serから Proへのアミノ酸の変化を伴う） ;G1228A( Glyから Serへのアミノ酸の変化を伴う）； A1230C (Glyから Serへのアミノ酸の変化 を伴う）； C1389T (アミノ酸の変化なし）； T1416C (アミノ酸の変化なし）； T1491A( アミノ酸の変化なし）； T1538C (Valから Alaへのアミノ酸の変化を伴う）； G1540C ( Valから Leuへのアミノ酸の変化を伴う）；および G1896A (アミノ酸の変化なし）。また 、全てのアミノ酸の変化に関して SWISS— PROTではコンフリクトで記載がある。本実 施例で得られた ATF6 DNAの塩基配列および該 DNAにコードされるアミノ酸配列 をそれぞれ配列番号 19および配列番号 20に記載した。
[0097] ATF6遺伝子を動物細胞発現ベクターに組込むために、上記の pCR4Blunt— TO POベクターにクローユングした ATF6遺伝子を铸型とし、 ATF6F2Lプライマー（AT Gの直前に Bglll siteを付加、配列番号 35)と ATF6R1Lプライマー（配列番号 34) および DNAポリメラーゼとして KOD— plusを用いて PCR法により ATF6遺伝子を増 幅し、 pCR4Blunt— TOPOベクターにクローユングした。また、シークェンサ一により 塩基配列を決定した (配列番号 19)。このクローユングした ATF6遺伝子を Bglllと X hoiで消化し、 BamHIと Xholで消化した動物細胞発現ベクターである pCMV— Tag 3に糸且込んだ。
[0098] 4. SHC3 (p64)、 SHC3 (p52)、 ATF6および CREBL1の発現
トランスフエクシヨン前日に細胞数 1. 5 X 106/10cm ディッシュ（Dish)とした HE K293T細胞に、 SHC3 (p64)、 SHC3 (p52)、 CREBL1、 ATF6の各発現プラスミ ドを FuGene6 (Roche社製）にて導入した（10 μ g/Dish) G 48時間後、細胞を PB Sで洗浄し、 lmlのリシスバッファー B (50mM Tris— HCl(pH7. 6)、 150mM Na CI, 1% トライトン X— 100、 1% ノ-デット P— 40 (NP— 40)、コンプリートミニ（Com plete Mini, EDTA不含））を添力卩し氷上で 10分間静置した。その後、スクレーバ 一で細胞を集め、 1. 5mlのチューブに入れ、氷冷下でソ-ケーシヨン処理（15秒 X 6 回）を行い、氷中で 20分静置後、ピペッティングで懸濁し、遠心処理（15, 000rpm、 30分間、 4°C)により可溶性画分と不溶性画分を分離した。検討用試料として、可溶 性画分を用いた。
[0099] 5.成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)の活性の検討
カゼインザィモグラフィーおよびカゼインナトリウムのプロテアーゼアツセィにより成 熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)の活性の検討を行った。カゼインザィモ グラフィ一はプロトコール (Invitrogen社製）に従って実施した。具体的には、成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)を非還元下で 2 X SDS サンプルバッファー と等量混合し、室温で 10分静置した後、 4一 16% ザィモグラム（Blue casein)ゲ ル（Zymogram Gel、 Invitrogen社製）による分離を行った。泳動終了後、 2. 5% トライトン X— 100にてリネーチヤ一（renature)した後、ディべロビングバッファー（De veloping buffer)中で 37°C、ー晚カゼイン分解反応を行った。
[0100] 一方、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアツセィは、反応バッファー（15 OmM NaCl、 50mM Tris— HCl (pH7. 5) )中で成熟型 HtrA2あるいは成熟型 H trA2 (S306A)を 200 μ g/ml,カゼインナトリウムを 400 μ gZmlの濃度となるよう に混合し、 37°Cでインキュベーションして反応させることにより行った。反応開始 3時 間後および一晩後に反応液の一部を採取して、 2 X SDS サンプルバッファーと等 量混合し煮沸処理後、 SDS-PAGEを行い、クマシ一ブリリアントブルー（CBB)染 色によりカゼインナトリウムの分解の有無を検出した。
[0101] 上記検討の結果、成熟型 HtrA2によるカゼインの分解が認められたが、成熟型 Ht rA2 (S306A)ではカゼインの分解が認められなかった。このことから、成熟型 HtrA 2はプロテアーゼ活性を有する活性型である力 成熟型 HtrA2 (S306A)はプロテア ーゼ活性を示さない不活性型であることが確認できた。
[0102] <方法 >
可溶性画分に含まれる夾雑蛋白質の影響を除くために免疫沈降にて榭脂にそれ ぞれ捕捉した SHC3 (p64)、 SHC3 (p52)、 ATF6および CREBLlを実験に用いた 。 SHC3 (p64)、 SHC3 (p52)、 ATF6および CREBLlの各可溶性画分 300 μ 1を 6 本のチューブ（No. 1— 6)〖こ分注し、各チューブに BSAでブロッキングした 50%スラ リーのプロテイン G セファロース 4 FF (Amersham社製）を 20 1添カ卩し、 4°Cで 1 時間転倒混和後、遠心処理（10, OOOrpm、 10秒間、 4°C)にて上清を回収し前処 ¾ (pre— clean) 行った。
[0103] 得られた上清に抗 Myc抗体 (Invitrogen社製）を 1. 7 1 (2 g)添加し、 4°Cで 3 時間転倒混和後に、 BSAでブロッキングしたプロテイン G セファロース 4 FFを 20 1添カ卩し 4°Cで 1晚転倒混和し、プロテイン G セファロース 4 FFに SHC3 (p64) 、 SHC3 (p52)、 ATF6および CREBL1をそれぞれ捕捉した。つぎに SHC3 (p64) 、 SHC3 (p52)、 CREBL1または ATF6が捕捉されたプロテイン G セファロース 4 FFを 500 1の洗浄バッファー（50mM Tris— HCl (pH7. 5)、 150mM NaCl、 0. 01% トライトン X— 100)で 5回洗浄した後、 No. 1および 2のチューブには 50m M Tris— HCl(pH7. 5)、 150mM NaCl、 0. 01% 卜ライトン X— 100を、 No. 3お よび 4のチューブには 50 μ gZmlの成熟型 HtrA2溶液 100 μ 1を、 No. 5および 6の チューブには 50 μ gZmlの成熟型 HtrA2 (S306A)溶液 100 μ 1をそれぞれ加えた 。 No. 1、 3および 5のチューブは 37°Cで 4時間、 No. 2、 4および 6のチューブは一 晚反応させた後、遠心処理により上清を除去して 500 1の洗浄バッファ一にて 3回、 遠心洗浄を行 、、 2 X SDS サンプルバッファー（ β メルカプトエタノール 0. 1%含 む）を 80 μ 1加え煮沸処理した。得られた試料 80 μ 1のうち 10 μ 1を使用し、 SDS— ΡΑ GE後、 PVDF膜へ転写し、ウェスタンブロッテイングにより、 SHC3 (p64)、 SHC3 ( p52)、 ATF6および CREBL1を検出した。検出用の 1次抗体として抗 c Myc抗体（ 9E10) (Santa cruz社製）を、 2次抗体としてホースラディッシュパーォキシダーゼ（ HRP)標識した抗マウス IgG抗体 (Cell Signaling社製)を用 、た。また、検出は EC L Western Blotting Detection System (Amersham社製）を用いて実施し た。
[0104] <結果 >
CREBL1、 ATF6および SHC3 (p64)がいずれも、成熟型 HtrA2によりインビトロ で分解されることを認めた。図 1 Aに示すように、活性型 HtrA2と CREBL1を 1晚（ O/N)反応させることにより、 CREBL1を示すバンドが著しく減少した。図 1 Bに示 すように、活性型 HtrA2と ATF6を 4時間（4h)または 1晚 (O/N)反応させることに より、 ATF6を示すバンドが著しく減少した。図 1 Cに示すように、活性型 HtrA2と S HC3 (p64)を 4時間（4h)または 1晚（OZN)反応させることにより、 SHC3 (p64)を 示すバンドが著しく減少した。また、 SHC3 (p52)も同様に成熟型 HtrA2によりイン ビトロで分解されることを認めた。
[0105] 一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )による CREBL1、 ATF6および SHC3 (p64)の分解は認められなかった（図 1 A、図 1— Bおよび図 1 C)。また、不 活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )による SHC3 (p52)の分解も認められな かった。
実施例 3
[0106] (細胞内におけるプロテアーゼアツセィ）
CREBL1、 ATF6、 SHC3 (p64)または SHC3 (p52)と HtrA2の相互作用を細胞 内におけるプロテアーゼアツセィにより検討した。
[0107] <材料およびその調製 >
成熟型 HtrA2の N末の 4残基 (AVPS)は、アポトーシスの阻害に働く IAPs (Inhibi tor of apoptosis proteins)ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、 IAPsと結 合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告さ れている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアツセィの検討に影響を与える可能 性が考えられる。そこで成熟型 HtrA2または成熟型 HtrA2 (S306A)と IAPsとの相 互作用を阻害するために、 N末の 4残基 (AVPS)を欠失させたもの（ Δ AVPS)また は該 4残基のうちのァラニンをグリシンに置換したもの（AVPS→GVPS)を成熟型 Ht rA2および成熟型 HtrA2 (S306A)についてそれぞれ作製した。これら各種 HtrA2 m、ずれも C末 Tagとして FLAGを付カロしたものを用いた。
[0108] 1.各種 HtrA2の調製
成熟型 HtrA2の変異体を作製するために、成熟型 HtrA2を铸型とし、センスブラ イマ一として F1および F2プライマー（ATGの直前に Sacl siteを付加、それぞれ配 列番号 36および配列番号 37)を、アンチセンスプライマーには、 HtrA2— RSプライ マー（配列番号 22)を用い、また DNAポリメラーゼとして Pfu turbo (STRATAGE NE社製）を用いて PCR法により、成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)および成熟型 HtrA2 ( GVPS)の各遺伝子を増幅させ、 pCR— Bluntll— TOPOベクターにクローユングした 。また、シークェンサ一により塩基配列を決定した。成熟型 HtrA2 ( AAVPS)および 成熟型 HtrA2 (GVPS)の各動物細胞発現プラスミドは、クローユングした成熟型 Ht rA2 ( Δ AVPS)および成熟型 HtrA2 (GVPS)の各遺伝子を Saclと Xholで消化し、 pCMV-Tag4に組込むことにより取得した。本実施例で得られた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS) DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞ れ配列番号 7および配列番号 8に記載した。また、成熟型 HtrA2 (GVPS) DNAの 塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 9および 配列番号 10に記載した。
[0109] 成熟型 HtrA2 (S306A)の変異体を作製するために、同様に、成熟型 HtrA2 (S3 06A)を铸型とし、 PCR法により、成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)および成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)の各遺伝子を増幅させ、 pCR— Bluntll— TOPOベクター にクロー-ングした。成熟型 HtrA2 (S306A、 AAVPS)および成熟型 HtrA2 (S30 6A、 GVPS)の各動物細胞発現プラスミドは、クローユングした成熟型 HtrA2 (S30 6A、 AAVPS)および成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)の各遺伝子を Saclと Xhol で消化し、それぞれ pCMV— Tag4に組込むことにより取得した。本実施例で用いた 成熟型 HtrA2 (S306A、 AAVPS) DNAの塩基配列および該 DNAによりコード されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 11および配列番号 12に記載した。また、成 熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS) DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされる アミノ酸配列をそれぞれ配列番号 13および配列番号 14に記載した。
[0110] 2.各種 HtrA2の酵素活性の検討
培養細胞で発現した各種 HtrA2に関して、カゼインナトリウムを基質としたプロテア ーゼアツセィにより、その酵素活性を測定した (実施例 2参照)。その結果、成熟型 Ht rA2 ( Δ AVPS)および成熟型 HtrA2 (GVPS)は!、ずれもプロテアーゼ活性を有す る活性型であること、成熟型 HtrA2 (S306A、 AAVPS)および成熟型 HtrA2 (S30 6A、 GVPS)はいずれもプロテアーゼ活性を持たない不活性型であることが判明し た。
[0111] 3. SHC3 (p64)、 SHC3 (p52)、 ATF6および CREBL1の動物細胞用発現べクタ 一の作製
実施例 2と同様の方法で作製したものを用いた。
[0112] <方法 >
各種 HtrA2と各候補蛋白質（SHC3 (p64)、 SHC3 (p52)、 ATF6および CREB L1)の発現プラスミドとは、トランスフエクシヨン前日に細胞数 5 X 105/6cm Dishと した HEK293T細胞に FuGene6 (Roche社製）を用いて導入した。各種 HtrA2発 現プラスミドは各候補蛋白質発現プラスミドのいずれかと組合せて、いずれも 1 gZ Dish添カロした。 48時間後、各種 HtrA2と SHC3 (p64)または SHC3 (p52)とを共 発現させた細胞は、 400 1のリシスバッファー Bにより溶解し、遠心処理後、上清に 2 X SDS サンプルバッファー（ β メルカプトエタノール 0. 1 %含む）を等量加え検討 用試料として用いた。一方、各種 HtrA2と CREBL1または ATF6とを共発現させた 細胞は、 200 μ 1のリシスバッファー Βに 2 X SDS サンプルバッファー（ 13ーメノレカプト エタノール 0. 1 %含む）を等量加え、ソ-ケーシヨン後、煮沸処理した後に検討用試 料として用いた。
[0113] 上記各検討用試料 10 1を用いてウェスタンブロッテイングにより、 SHC3 (p64)、 SHC3 (p52)、 ATF6および CREBL1の発現、並びにこれら蛋白質の分解の有無 を検出した。検出用の 1次抗体として抗 c Myc (9E10)抗体を、 2次抗体としてホー スラディッシュパーォキシダーゼ（HRP)標識した抗マウス IgG抗体（Cell Signaling 社製）を用いた。検出は、 ECL Western Blotting Detection Systemを用い て実施した。
[0114] <結果>
プロテアーゼ活性を有する活性型変異体 (成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟 型 HtrA2 (GVPS) )と CREBL1とを共発現させた細胞を用いた解析では、 CREBL 1を示すバンドが著しく減少した（図 2-Aの上図)。該活性型変異体と ATF6とを共発 現させた細胞を用いた解析では、 ATF6を示すバンドが著しく減少した（図 2— Bの上 図)。該活性型変異体と SHC3 (p64)とを共発現させた細胞を用いた解析では、 SH C3 (p64)を示すバンドが著しく減少した（図 2— Cの上図）。該活性型変異体と SHC3 (p52)とを共発現させた細胞を用いた解析では、 SHC3 (p52)を示すバンドが著しく 減少した（図 2— Dの上図）。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 HtrA2 S306 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 S306 (GVPS) )と CREBL1とを共発現させた細 胞を用いた解析では、 CREBL1を示すバンドの減少は認められなかった（図 2— Aの 上図)。該不活性型 HtrA2変異体と ATF6とを共発現させた細胞を用いた解析では 、 ATF6を示すバンドの減少は認められなカゝつた（図 2— Bの上図）。該不活性型 Htr A2変異体と SHC3 (p64)とを共発現させた細胞を用いた解析では、 SHC3 (p64) を示すバンドの減少は認められなカゝつた（図 2— Cの上図）。該不活性型 HtrA2変異 体と SHC3 (p52)とを共発現させた細胞を用いた解析では、 SHC3 (p52)を示すバ ンドの減少は認められなかった（図 2— Dの上図）。細胞内における各 HtrA2変異体 の発現は、各細胞間でほとんど差がな力つた（図 2— Aおよび Bの下図）。
[0115] このように、 CREBL1、 ATF6、 SHC3 (p64)および SHC3 (p52)はいずれも、活 性型の成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または活性型の成熟型 HtrA2 (GVPS)により細 胞内で分解されることが明らかになった。一方、 CREBL1、 ATF6、 SHC3 (p64)お よび SHC3 (p52)はいずれも、不活性型の成熟型 HtrA2 (S306A、 AAVPS)また は不活性型の成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)では分解されなかった。
実施例 4
[0116] (HtrA2による分解パターンの検討）
CREBL1、 SHC3 (p64)または SHC3 (p52)の HtrA2による分解パターンを検討 した。検討は、ピオチン化した CREBL1、 SHC3 (p64)または SHC3 (p52)を用い て、 HtrA2によるインビトロ プロテアーゼアツセィにより行った。
[0117] <材料およびその調製 >
1.成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)
成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)は、実施例 2と同様の方法で調製し たものを用いた。
[0118] 2. CREBL1、 SHC3 (p64)および SHC3 (p52)の各動物細胞発現プラスミド
CREBL1動物細胞発現プラスミドは、 pCR— Bluntll— TOPOベクターに実施例 2 と同様の方法でクローユングした CREBL1を BamHIと Xholで消化し、 pcDNA3. 1 /Hisに組込むことにより取得した。 SHC3 (p64)動物細胞発現プラスミドは、 pCR4Blunt— TOPOベクターに実施例 2と同様の方法でクローユングした SHC3 (p64)を EcoRIと Xholで消化し、 pcDNA 3. 1ZV5— Hisに組込むことにより取得した。
SHC3 (p52)動物細胞発現プラスミドは、 pCMV— Tag5に実施例 2と同様の方法 で組込んだ SHC3 (p52)を PvuIIと Xholで消化し、 EcoRVと Xholで消化した pcD NA3. 1ZV5— Hisにライゲーシヨンすることにより取得した。
[0119] 3.インビトロ翻訳反応系を用いたピオチン化 CREBL1、 SHC3 (p64)および SHC3
(p52)の調製
ピオチンで標識された CREBL1、 SHC3 (p64)および SHC3 (p52)の調製は、ゥ サギ網状赤血球ライセート（rabbit reticulocyte lysate)を用いたインビトロ翻訳 反応糸（T T TranscriDtion/ Translation System； Promega社製)で行
N
つ 7こ。
具体的にはまず、インビトロ翻訳反応溶液 (T T¾ftffi Quick Master Mix) 40
N
μ 1に各発現プラスミド（1 1. 1、 ImM メチォニン 1 μ 1、ピオチン化リジ ン tRNA (Promega社製） 1 1、ヌクレアーゼを含まな 、水（Nuclease free water ) 6. 5 1をカ卩えて全量 50 /z lとし、 30°Cで 1. 5時間反応させた。その後、反応液 50 μ 1から 12. 5 μ 1を採取し、 2 X SDS サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウェス タンブロッテイングにより、ピオチンでラベルされた CREBL1、 SHC3 (p64)および S HC3 (p52)の発現を検出した。検出は、ストレプトアビジン HRP (Promega社製）、 Transcend Chemilumine sc ent substrate (TranscendT Non— Radioact ive Translation detection system; Promega社製)を用いて行った。その結果 、 V、ずれもピオチン化されて 、ることが確認できた。
[0120] <方法 >
上記反応液をプロテアーゼアツセィの試料として用いた。反応液を 12. 5 1ずつ 3 本のチューブ（No. 2— 4)に分注した。 No. 2のチューブにはコントロールとして、 50 mM Tris-HCl(pH7. 5)、 150mM NaCl、 0. 01% TritonX— 100を 25 1、 N o. 3のチューブには 200 gZmlの成熟型 HtrA2溶液を 25 1、 No. 4のチューブ には 200 μ gZmlの成熟型 HtrA2 (S306A)溶液 25 μ 1をそれぞれ加え混合した。 各チューブ（No. 2— 4)をさらに半量ずつ分注し、 1つのチューブは 37°Cで 4時間反 応し、もう一方のチューブは、 37°Cで一晩反応させた。反応後、各チューブに 2 X S DS サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウェスタンブロッテイングにより、ビォチ ン化 CREBL1、 SHC3 (p64)、 SHC3 (p52)の分解パターンを検出した。
[0121] 分解の検出は、各蛋白質内部のピオチンィ匕されたリジン残基を指標にして、ストレ プトアビシン一 HRPおよび Transcend Chemiluminescent substrate 用い て行った。
[0122] さらに分解箇所を調べる為、ウェスタンブロッテイングに用いたメンブレンから、スト レプトアビジン HRPを除去し、各蛋白質に付加された Tagに対する抗体で、ビォチ ン化 CREBL1、 SHC3 (p64)および SHC3 (p52)の分解パターンを検出した。 SH C3の検出には、 1次抗体として抗 V5抗体 (Invitrogen社製)を、 2次抗体として HR P標識ィ匕抗マウス IgG抗体 (Cell Signaling社製)を用いた。 CREBL1の検出には 、 1次抗体として抗 Xpress抗体 (Invitrogen社製）を、 2次抗体として HRP標識ィ匕抗 マウス IgG抗体（Cell Signaling社製）を用いた。分解の検出は、 ECL Western Blotting Detection Reagents Amersham社製) 用 Vヽて行つ 7こ。
[0123] <結果>
蛋白質内部のピオチンィ匕されたリジン残基を指標に、成熟型 HtrA2〖こよる CREBL 1、 SHC3 (p64)または SHC3 (p52)の分解パターンを検討した結果を、それぞれ図 3— A、図 3— Bおよび図 3— Cに示した。また、それぞれの蛋白質の N末または C末に 付カロされた Tagを指標として、 CREBL1、 SHC3 (p64)および SHC3 (p52)の分解 パターンを検討した結果を、それぞれ図 4 A、図 4 Bおよび図 4 Cに示した。
[0124] CREBL1については、ピオチン化されたリジン残基を指標にした分解パターンの 検討において、ピオチン化 CREBL1を示すバンドの著しい減少が認められ、さらに 5 OkDa近辺に CREBL 1分解産物と考えられるバンドが検出された（図 3— A)。しかし、 抗 Tag抗体による分解パターンの検討では、図 3— Aで認められた 50kDa近辺の CR EBL1分解産物と考えられるバンドだけでなぐ別のサイズの CREBL1分解産物を 示すバンドも全く検出できなかった（図 4 A)。このこと力ら、 CREBL1は HtrA2によ り数箇所で分解されたと考えられる。 [0125] SHC3 (p64)については、ピオチンィ匕されたリジン残基を指標にした分解パターン の検討において、ピオチン化 SHC3 (p64)を示すバンドの著しい減少が認められ、さ らに 70kDa、 40kDa、 30kDa近辺に SHC3 (p64)分解産物と考えられるノ ンドカ ^検 出された（図 3— B)。抗 Tag抗体による分解パターンの検討においても、同様のバンド が検出された（図 4 B)。このことから、 SHC3 (p64)は、 2箇所以上で成熟型 HtrA2 により分解された可能性がある。
[0126] SHC3 (p52)については、ピオチンィ匕されたリジン残基を指標にした分解パターン の検討において、ピオチン化 SHC3 (p52)を示すバンドの著しい減少が認められた 力 SHC3 (p52)分解産物と考えられるバンドは検出できなかった（図 3— C)。しかし 、抗 Tag抗体による分解パターンの検討において、 40kDa近辺に SHC3 (p52)分解 産物と考えられるバンドが検出された（図 4 C)。このこと力ら、 SHC3 (p52)は HtrA 2により数箇所で分解されたと考えられる。
[0127] このように、蛋白質内部を標識化して標識物質を検出することにより、 HtrA2による 上記蛋白質の分解が検出された。このことから、各蛋白質の N末または C末に付加し た Tagの検出により明らかになった HtrA2による蛋白質の分解 (実施例 2および 3)は 、 Tagが切断分離されたことによる見かけ上の分解ではなぐ HtrA2が各蛋白質の 内部に作用した結果生じた分解であることが判明した。
産業上の利用可能性
[0128] 本発明は、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分 解に基づく細胞死の阻害、例えば神経細胞の細胞死の阻害、並びに神経細胞死を 伴う疾患、例えば神経変性疾患の防止、治療または改善のために利用可能であり、 医薬分野において非常に有用性が高い。さらに HtrA2による細胞死、例えば小胞 体ストレスによる細胞死、例えば神経細胞死の解明等の研究分野にも利用できる。 配列表フリーテキスト
[0129] 配列番号 1 HtrA2前駆体蛋白質をコードする DNA。
配列番号 2 HtrA2前駆体蛋白質。
配列番号 3成熟型 HtrA2をコードする DNA。
配列番号 4成熟型 HtrA。 配列番号 5：配列番号 3と同じ塩基配列であってその 520位の塩基力 ½である塩基配 列からなるポリヌクレオチド；成熟型 HtrA2 (S306A)をコードする DNA。
配列番号 6：配列番号 4と同じアミノ酸配列であって 174番目のアミノ酸残基が Alaに 置換したアミノ酸配列力もなるポリペプチド;成熟型 HtrA2 (S306A)。
配列番号 7：配列番号 3と同じ塩基配列であってその 4 15位の塩基を欠失させた塩 基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)をコードする DNA。 配列番号 8：配列番号 4と同じアミノ酸配列であって 2— 5番目のアミノ酸残基を欠失さ せたアミノ酸配列力 なるポリペプチド；成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)。
配列番号 9 :配列番号 3に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその 5位の塩基 力 ½であるポリヌクレオチド；成熟型 HtrA2 (GVPS)をコードする DNA。
配列番号 10：配列番号 4と同じアミノ酸配列であって 2番目のアミノ酸残基が Glyに置 換したアミノ酸配列力 なるポリペプチド；成熟型 HtrA2 (GVPS)。
配列番号 11：配列番号 5と同じ塩基配列であってその 4 15位の塩基を欠失させた 塩基配列からなるポリヌクレオチド;成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)をコードする
DNA0
配列番号 12：配列番号 6と同じアミノ酸配列であって 2— 5番目のアミノ酸残基を欠失 させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)。 配列番号 13：配列番号 5に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその 5位の塩基 力 ½であるポリヌクレオチド成熟型； HtrA2 (S306A、 GVPS)をコードする DNA。 配列番号 14：配列番号 6と同じアミノ酸配列であって 2番目のアミノ酸残基が Glyに置 換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)。
配列番号 15： SHC3をコードする DNA。
配列番号 16 : SHC3。
配列番号 17 : CREBL1をコードする DNA。
配列番号 18 : CREBL1。
配列番号 19： ATF6をコードする DNA。
配列番号 20 :ATF6。
配列番号 21：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ 、て、成熟型 HtrA2 DNAを取 得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 22：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ!/、て成熟型 HtrA2 DNAを取 得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 23：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ 、て、成熟型 HtrA2 (S306A)
DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 24：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ 、て、成熟型 HtrA2 (S306A)
DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 25：配列番号 15に記載の塩基配列に基づ!/、て、 SHC3 DNAを取得す るために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 26：配列番号 15に記載の塩基配列に基づ!/、て、 SHC3 DNAを取得す るために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 27 :配列番号 17に記載の塩基配列に基づいて、 CREBL1 DNAを取得 するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 28：配列番号 17に記載の塩基配列に基づ!/、て、 CREBL1 DNAを取得 するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 29：配列番号 17に記載の塩基配列に基づ!/、て、 CREBL1 DNAを取得 するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 30 :配列番号 17に記載の塩基配列に基づいて、 CREBL1 DNAを取得 するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 31：配列番号 19に記載の塩基配列に基づ!/、て、 ATF6 DNAを取得する ために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 32：配列番号 19に記載の塩基配列に基づ!/、て、 ATF6 DNAを取得する ために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 33：配列番号 19に記載の塩基配列に基づ!/、て、 ATF6 DNAを取得する ために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 34：配列番号 19に記載の塩基配列に基づ!/、て、 ATF6 DNAを取得する ために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 35：配列番号 19に記載の塩基配列に基づ!/、て、 ATF6 DNAを取得する ために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 36：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ!/、て、成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)
DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号 37：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ 、て、成熟型 HtrA2 (GVPS) DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

Claims

請求の範囲
[1] SHC3 (サーク ホモロジ一 2 ドメイン コンテイニング トランスフォーミング プロテ イン し 3、 src homology 2 domain containing transiormmg protein C 3)、 ATF6 (ァクティべ一ティング トランスクリプション ファクター 6、 activating t ranscription factor 6)および CREBL1 (サイクリック AMP レスポンシブ エレメ ント ノインァイング プロテイン ライク 1、 cAMP responsive element bindin g protein-like 1)のうちの少なくとも 1の HtrA2 (ハイ テンパレイチヤー リクワイ 7メント プロァイン A2、 high temperature requirement protein A2Jによ る分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法。
[2] SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する 化合物を 1つ以上用いることを特徴とする神経細胞死阻害方法。
[3] 神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である請求項 1または 2に記載の神経細胞死 阻害方法。
[4] SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する ことを特徴とする脳虚血障害または神経変性疾患の防止方法、治療方法または改善 方法。
[5] 神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病ま たは筋萎縮性側索硬化症である請求項 4に記載の防止方法、治療方法または改善 方法。
[6] SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する 化合物の同定方法であって、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を可能にする条件下、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少 なくとも 1と HtrA2とを化合物と接触させ、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの 少なくとも 1を検出することができるシグナルおよび Zマーカーを使用する系を用いて 、このシグナルおよび Zマーカーの存在若しくは不存在および Zまたは変化を検出 することにより、化合物が、 SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の分 解を阻害するカゝ否かを決定することを特徴とする同定方法。
[7] SHC3、 ATF6および CREBL1のうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する 化合物の同定方法であって、 SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を可能にする条件下、 SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少 なくとも 1と HtrA2とを化合物と接触させ、 SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの 少なくとも 1の存在若しくは不存在の検出および Zまたはその量の変化の測定により 、あるいは、 SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1の分解物の存在若 しくは不存在の検出および Zまたはその量の変化の測定により、化合物が、 SHC3、 ATF6および CREBL 1のうちの少なくとも 1の分解を阻害するか否かを決定すること を特徴とする同定方法。
[8] SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する 化合物を 1つ以上含んでなる神経細胞死阻害剤。
[9] 神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である請求項 8に記載の神経細胞死阻害剤
[10] SHC3、 ATF6および CREBLlのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する 化合物を 1つ以上含んでなる脳虚血障害または神経変性疾患の防止剤、治療剤ま たは改善剤。
[11] 神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病ま たは筋萎縮性側索硬化症である請求項 10に記載の神経変性疾患の防止剤、治療 剤または改善剤。
[12] HtrA2、 HtrA2をコードするポリヌクレオチドおよび HtrA2をコードするポリヌクレオ チドを含有するベクターのうちの少なくともいずれ力 1と、 SHC3、 ATF6、 CREBLl 、並びに SHC3、 ATF6および CREBLlのいずれ力 1をコードするポリヌクレオチド、 並びに SHC3、 ATF6および CREBLlのいずれ力 1をコードするポリヌクレオチドを 含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1とを含んでなる試薬キット。
PCT/JP2004/014378 2003-09-30 2004-09-30 ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することによる神経細胞死阻害および神経変性疾患の改善方法 WO2005030256A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005514280A JPWO2005030256A1 (ja) 2003-09-30 2004-09-30 ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することによる神経細胞死阻害および神経変性疾患の改善方法
US10/562,942 US20060264363A1 (en) 2003-09-30 2004-09-30 Inhibition of nerve cell death by inhibiting degradation of shc3, atf6 or crebl1 by htra2 and method of ameliorating neurodegenerative diseases
EP04788406A EP1669089A1 (en) 2003-09-30 2004-09-30 INHIBITION OF NERVE CELL DEATH BY INHIBITING DEGRADATION OF SHC3, ATF6 OR CREBL1 BY HtrA2 AND METHOD OF AMELIORATING NEURODEGENERATIVE DISEASES

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003342588 2003-09-30
JP2003-342588 2003-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005030256A1 true WO2005030256A1 (ja) 2005-04-07

Family

ID=34386250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/014378 WO2005030256A1 (ja) 2003-09-30 2004-09-30 ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することによる神経細胞死阻害および神経変性疾患の改善方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20060264363A1 (ja)
EP (1) EP1669089A1 (ja)
JP (1) JPWO2005030256A1 (ja)
WO (1) WO2005030256A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101794313B1 (ko) 2016-05-23 2017-11-07 재단법인대구경북과학기술원 CrebA/CREB3L1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101712695B1 (ko) 2013-05-22 2017-03-07 가톨릭대학교 산학협력단 Ｐｉｎｋ 1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR102277471B1 (ko) * 2019-10-22 2021-07-14 주식회사 지니스 '혈관내 혈전' 용해제

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003027145A1 (fr) * 2001-09-26 2003-04-03 Riken Inducteur de mort cellulaire, cellules et animaux exprimant cet inducteur, et procede de criblage de medicament anti-mort cellulaire

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003027145A1 (fr) * 2001-09-26 2003-04-03 Riken Inducteur de mort cellulaire, cellules et animaux exprimant cet inducteur, et procede de criblage de medicament anti-mort cellulaire

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CONTI L. ET AL: "Shc signaling in differentiating neural progenitor cells", NATURE NEUROSCIENCE, vol. 4, no. 6, 2001, pages 579 - 586, XP002987099 *
HAZE K. ET AL: "Identification of the G13 (cAMP-response-element-binding protein-related protein) gene product related to activating transcription factor 6 as a transcriptional activator of the mammalian unfolded protein response", BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 355, 2001, pages 19 - 28, XP002987098 *
KAUFMAN R.J. ET AL: "Orchestrating the unfolded protein response in health and disease", THE JOURNAL OF CLINICAL INVENTION, vol. 110, no. 10, 2002, pages 1389 - 1398, XP002987096 *
KUDO T. ET AL: "Shohotai Stress to Shinkei Hensei Shikkan", NIHON SHINKEI SEISHIN YAKURI GAKKAI ZASSHI, vol. 23, 2003, pages 105 - 109, XP002987097 *
MARTINS L.M. ET AL: "The Serine Protease Omi/HtrA2 Regulates Apoptosis by Binding XIAP through a Reaper-like Motif", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 1, 2002, pages 439 - 444, XP002957688 *
NAKAMURA T. ET AL: "Rinsanka Tylosin Keiro no Adapter Bunshi Shc Family no Tayo na Kino to Shinkeikei deno Aratana Tenkai", SEIKAGAKU, vol. 73, no. 11, 2001, pages 1322 - 1325, XP002987100 *
RAMESH HEGDE ET AL: "Identification of Omi/HtrA2 as a Mitochondrial Apoptotic Serine Protease That Disrupts Inhibitor of Apoptosis Porotein-Caspase Interaction", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 1, 2002, pages 432 - 438, XP002957690 *
SUZUKI Y. ET AL: "A Serine Protease, HtrA2, Is Released from the Mitochondria and Interacts with XIAP, Inducing Cell Death", MOLECULAR CELL, vol. 8, 2001, pages 613 - 621, XP002957687 *
SUZUKI Y. ET AL: "Mitochondria Yurai no Shinki Saiboshi Yudo Inshi: HtrA2/Omi", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 20, no. 1, 2002, pages 73 - 75, XP002987095 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101794313B1 (ko) 2016-05-23 2017-11-07 재단법인대구경북과학기술원 CrebA/CREB3L1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2005030256A1 (ja) 2007-11-29
US20060264363A1 (en) 2006-11-23
EP1669089A1 (en) 2006-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ozaki et al. Mitochondrial m-calpain plays a role in the release of truncated apoptosis-inducing factor from the mitochondria
Faou et al. Tom34: a cytosolic cochaperone of the Hsp90/Hsp70 protein complex involved in mitochondrial protein import
JP4205165B2 (ja) Ｃｄｋ４活性の阻害のための方法と手段
Matsuo et al. TMX, a human transmembrane oxidoreductase of the thioredoxin family: the possible role in disulfide-linked protein folding in the endoplasmic reticulum
US8816046B2 (en) Compositions and methods for CaMKII inhibitors and uses thereof
CA2458565A1 (en) New angiogenesis inhibitors based on soluble cd44 receptor hyaluronic acid binding domain
Gibson et al. Functional characterisation of the regulatory subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase A homologue of Giardia lamblia: Differential expression of the regulatory and catalytic subunits during encystation
WO2005030256A1 (ja) ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することによる神経細胞死阻害および神経変性疾患の改善方法
KR101966246B1 (ko) FCHo1 조절제를 포함하는 세포 분열 조절용 조성물 및 이를 이용한 세포 분열 조절 방법
WO2005030255A1 (ja) CREBL1、ATF6およびHNF-4αのうちの少なくとも１のHｔｒA2による分解を阻害することによる糖尿病の治療方法
KR102135954B1 (ko) 바소프레신-2 수용체의 펩티드 길항제
KR102111030B1 (ko) Jab1을 포함하는 신경세포 분화 탐지용 바이오마커 또는 신경세포 분화 촉진용 조성물
US10300107B2 (en) Compositions and methods for CaMKII inhibitors and uses thereof
US8685926B2 (en) Compositions and method for CaMKII inhibitors and uses thereof
KR101634612B1 (ko) 소포체 스트레스로 인한 세포사멸을 약화시키는 agr2 호모-다이머
Lei et al. The processing of human rhomboid intramembrane serine protease RHBDL2 is required for its proteolytic activity
WO2006070804A1 (ja) テロメレース活性阻害方法および阻害剤
GB2493982A (en) Disease treatments involving histone deacetylases
JPWO2004002532A1 (ja) Ｍｋｋ７活性化阻害剤
US20100113557A1 (en) Method for prevention of tumor
EP2046958B1 (en) Cleavage of bip by subtilase cytotoxin
KR20200042389A (ko) Fgf2 또는 api5 유래 펩타이드 및 그의 용도
CA2496745A1 (en) Method of degrading transcriptional factors of saccharometabolism-associated gene, method of inhibiting the degradation and degradation inhibitor
JP2007056008A (ja) ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解を阻害することを特徴とする虚血性脳疾患の治療方法
WO2004030688A1 (ja) 蛋白間相互作用を調節することによる新規アポトーシス調節方法と、それを用いる医薬

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005514280

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004788406

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004788406

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006264363

Country of ref document: US

Ref document number: 10562942

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10562942

Country of ref document: US