WO2005030255A1

WO2005030255A1 - CREBL1、ATF6およびHNF-4αのうちの少なくとも１のHｔｒA2による分解を阻害することによる糖尿病の治療方法

Info

Publication number: WO2005030255A1
Application number: PCT/JP2004/014377
Authority: WO
Inventors: Hirofumi Doi; Ken Saito
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2005-04-07
Also published as: US20070196354A1; EP1669088A1; JPWO2005030255A1

Abstract

　ＨｔｒＡ２と相互作用するＣＲＥＢＬ１およびＨＮＦ−４αを見出し、さらに活性型ＨｔｒＡ２によりＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αが分解されることを初めて明らかにした。　そして、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することを特徴とするＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害手段、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止手段および／または治療手段、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害手段（例えば膵臓β細胞の細胞死阻害手段）、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする２型糖尿病の防止手段および／または治療手段、並びに試薬キットを提供した。

Description

CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害することによる糖尿病の治療方法

技術分野

[0001] 本発明は、 CREBL1 (サイクリック AMP レスポンシブエレメントバインディングプロテインフイク 1、 cAMP responsive element binding protein— like 1) 、 ATF6 (ァクティべ一ティングトランスクリプションファクター 6、 activating tra nscription factor 6)および HNF— 4 a (へパトサイトヌクレア一ファクター 4 a 、hepatocyte nuclear factor 4 α )のうちの少なくとも 1の分解阻害方法、並びに CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2 (ハイテンパレ Λナヤ一リクワイアメントプロテイン A2、 high temperature requirement pr otein A2)による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法に関する。より具体的には、 HtrA2の機能を阻害すること (例えば、 CRE BL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断を阻害すること、または CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1と HtrA2の相互作用を阻害すること）を特徴とする CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法に関する。また、前記分解方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法に関する。さらに、 CREBL1、 ATF6および HNF-4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上用 V、ることを特徴とする糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法、並びに該化合物を 1つ以上含んでなる糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤に関する。また、 CRE BL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解を阻害する化合物の同定方法に関する。さらに、糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤の有効成分である化合物の同定方法に関する。また、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害方法に関する。さらに、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上用いることを特徴とする細胞死阻害方法、並びに該化合物を 1つ以上含んでなる細胞死阻害剤に関する。また、 HNF— 4 αの HtrA2による分解を阻害することを特徴とする 2型糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法に関する。さらに、 HNF— 4 αの HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる 2型糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤に関する。また、 HtrA2、 HtrA2をコードするポリヌクレオチドおよび HtrA2をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれ力 1と、 CREB Ll、 ATF6、 HNF-4 a、 CREBL1または ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチド、および CREBL1または ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレォチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1とを含んでなる試薬キットに関する。

背景技術

[0002] 生物は、細胞の生存とアポトーシス (細胞死）を調節することにより外界のストレスから身を守るが、生存とアポトーシス制御機構の調節の乱れによる過剰な細胞死は、種々の疾患を招く可能性がある (非特許文献 1)。

[0003] 近年、ストレスを感知し調節する場としてミトコンドリアや小胞体の研究が進み、ミトコンドリア膜に局在する HtrA2蛋白質 (以下、 HtrA2と称する）は、 UVや熱ショック等のストレスによりミトコンドリア膜から細胞質へ移行し (非特許文献 2— 5)、カスパーゼ依存的な細胞死とカスパーゼ非依存的な細胞死の二つの細胞死を誘導することが報告された (非特許文献 6)。 HtrA2は、前駆体蛋白質 (配列番号 2)力も N末 133ァミノ酸が切り離された成熟型 (配列番号 4)になり、ミトコンドリア力も細胞質に移行する。成熟型 HtrA2はプロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有する Ht rA2を活性型 HtrA2と称することもある。

[0004] カスパーゼ非依存的な細胞死は、 HtrA2自身のセリンプロテアーゼとしての性質に依存し、その前駆体蛋白質のアミノ酸配列中 306番目（成熟型においては 174番目に相当する）のセリンをァラニンに置換した HtrA2変異体によりカスパーゼ非依存的な細胞死は引き起こされないことが知られている（非特許文献 3— 5)。かかる HtrA 2変異体はプロテアーゼ活性を有さない。以下、プロテアーゼ活性を有さない HtrA2 を不活性型 HtrA2と称することもある。このように HtrA2は、カスパーゼ非依存的な細胞死を誘導する機構において重要な役割を担う因子である。以下に本明細書において引用した文献を列記する。

非特許文献 1 :「細胞工学」、 2002年、第 21卷、第 4号、 p. 360-394。

非特許文献 2 :ャマダチ（H. Yamaguchi)ら、「キャンサーリサーチ（Cancer Res earch)」、 2003年、第 63卷、 p. 1483—1489。

非特許文献 3 :スズキ（Y. Suzuki)ら、「モレキュラーセル（Molecular Cell)」、 20 01年、第 8卷、 p. 613—621。

非特許文献 4:ヘッジ (R. Hegde)ら、「ザジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry)」、 2002年、第 277卷、 p. 432 —438。

非特許文献 5 :マーチンズ（L. M. Martins)ら、「ザジャーナノレォブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry)」、 2002年、第 277 卷、 p. 439—444。

非特許文献 6 :「実験医学」、 2002年、第 20卷、第 1号、 p. 73-75。

非特許文献 7 :「内科」、 2003年、第 91卷、第 1号、 p. 63-67。

非特許文献 8 :カウフマン (R. J. Kaufman)ら、「ザジャーナルォブタリ-カルインべスティゲーシヨン（The Journal of Clinical Investigation)」、 2002年、第 110卷、 p. 1389—1398。

非特許文献 9 :ハゼ（K. Haze)ら、「ザバイオケミカルジャーナル（The Biochem ical Journal) , 2001年、第 355卷、 p. 19—28。

非特許文献 10 :「ジャーナルォブモレキュラーエンドクリノロジー (Journal of

Molecular Endocrinology)」、 2001年、第 27卷、第 1号 p. 11—29。

非特許文献 11 :「臨床病理」、 2001年、第 49卷、第 2号、 p. 161— 164。

非特許文献 12 :ウルマー（K. M. Ulmer)、「サイエンス（Science)」、 1983年、第 2

19卷、 p. 666—671。

非特許文献 13 :「ペプチド合成」、丸善株式会社、 1975年。

非特許文献 14：「ペプチドシンテシス (Peptide Synthesis)」、インターサイエンス (Interscience)、ニューヨーク (New York；)、 1996年。

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0006] 近年、小胞体ストレスにより脾臓の β細胞が細胞死を起こし、糖尿病を発症することが報告されている。脾臓 )8細胞はインスリンの産生分泌を行う細胞で、小胞体が非常に発達しており、小胞体ストレスに感受性が高い。すなわち、小胞体ストレス応答における防御機構の破綻が引き起こす細胞死により β細胞が脱落し、その結果インスリン分泌不全により糖尿病が亢進すると考えられている (非特許文献 7)。一方、小胞体ストレスにより HtrA2の発現が亢進することが報告されている。これらから、 HtrA2が、糖尿病の新たな標的となる可能性が高ぐまた小胞体ストレスによる細胞死を阻害することは、新規な創薬標的になると考えられる。

[0007] 本発明の課題は、 HtrA2によるカスパーゼ非依存的な細胞死の機構および HtrA 2の基質が未だ明らかになつていない状況において、 HtrA2と相互作用する蛋白質を見出し、 HtrA2による該蛋白質の分解に基づく疾患の防止および Zまたは治療を可能にする手段を提供することである。

課題を解決するための手段

[0008] 上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、 HtrA2が CREBL1および HNF

4 aと相互作用することをインシリコ（in silico)で予測し、さらに活性型 HtrA2により CREBL1、 CREBL1のファミリーである ATF6および HNF— 4 aが分解されることを実験的に証明して本発明を完成した。

[0009] すなわち本発明は、 HtrA2の機能を阻害することを特徴とする CREBL1、 ATF6 および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法に関する。

[0010] また本発明は、 HtrA2の機能を阻害することが CREBL1、 ATF6および HNF— 4

aのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断を阻害することであり、ここで CREBL1の HtrA2による切断を阻害することにより CREBL 1の分解が阻害され、 ATF6の Htr A 2による切断を阻害することにより ATF6の分解が阻害され、および、 HNF— 4 αの H trA2による切断を阻害することにより HNF— 4 aの分解が阻害される前記 CREBL1 、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法に関する。

[0011] さらに本発明は、 HtrA2の機能を阻害することが CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2の相互作用を阻害することであり、ここで CREBL1 と HtrA2の相互作用を阻害することにより CREBL1の分解が阻害され、 ATF6と Ht rA2の相互作用を阻害することにより ATF6の分解が阻害され、および、 HNF— 4 α と HtrA2の相互作用を阻害することにより HNF— 4 aの分解が阻害される前記 CRE BL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法に関する。

[0012] さらにまた本発明は、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の Ht rA2による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0013] また本発明は、前記 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0014] さらに本発明は、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA

2による分解を阻害する化合物を 1つ以上用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0015] さらにまた本発明は、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の Ht rA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0016] また本発明は、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2 による分解を阻害する化合物の同定方法であって、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を可能にする条件下、 CREBL1、 ATF 6および HNF 4 aのうちの少なくとも 1および Zまたは HtrA2をある化合物（被検化合物）と接触させ、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1を検出し得るシグナルおよび Zマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zマーカーの存在若しくは不存在および Zまたは変化を検出することにより、被検化合物が CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。

[0017] さらに本発明は、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA 2による分解を阻害する化合物の同定方法であって、 CREBL1、 ATF6および HNF 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を可能にする条件下、 CREBL1、 AT F6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1および Zまたは HtrA2をある化合物（被検化合物）と接触させ、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の存在若しくは不存在の検出および Zまたはその量の変化の測定により、あるいは CREBL 1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解物の存在若しくは不存在の検出および Zまたはその量の変化の測定により、被検化合物が CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。

[0018] さらにまた本発明は、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の Ht rA2による分解を阻害する化合物の同定方法が、糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤の有効成分である化合物の同定方法である、前記同定方法に関する。

[0019] また本発明は、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害方法に関する。

[0020] さらに本発明は、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上用いることを特徴とする細胞死阻害方法に関する。

[0021] さらにまた本発明は、細胞死が脾臓 β細胞の細胞死である前記細胞死阻害方法に関する。

[0022] また本発明は、 CREBL1および Ζまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる細胞死阻害剤に関する。

[0023] さらに本発明は、細胞死が脾臓 β細胞の細胞死である前記細胞死阻害剤に関する。

[0024] さらにまた本発明は、前記細胞死阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および Ζまたは治療方法に関する。

[0025] また本発明は、 HNF— 4 aの HtrA2による分解を阻害することを特徴とする 2型糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0026] さらに本発明は、 HNF— 4 aの HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる 2型糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0027] さらにまた本発明は、 HtrA2、 HtrA2をコードするポリヌクレオチドおよび HtrA2をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれ力 1と、 CRE BL1、 ATF6、 HNF-4 a、 CREBLlまたは ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチド、および CREBLlまたは ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくとも、ずれか 1とを含んでなる試薬キットに関する。

発明の効果

[0028] 本発明によれば、 CREBLl, ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA 2による分解を阻害することにより、これら蛋白質のうちの少なくとも 1の減少または消失を阻害することができ、その結果、糖尿病の防止および Zまたは治療が可能になる。

[0029] CREBLlおよび ATF6はいずれも、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導し、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献 8および 9)。また、小胞体ストレスにより脾臓の j8細胞が細胞死を起こし、糖尿病を亢進することが報告されている（非特許文献 7)。これら力、 CREBLlおよび Zまたは ATF6が HtrA2により分解されて減少または消失することにより、ストレス等による細胞死、例えば脾臓 j8細胞の細胞死が亢進し、その結果、糖尿病が亢進すると考える。したがって、 CREBLlおよび Zまたは ATF6の HtrA2 による分解を阻害してこれら蛋白質の減少または消失を阻害することにより細胞死（例えば脾臓の β細胞の細胞死）を阻害でき、その結果、糖尿病の防止および Ζまたは治療が可能になる。

[0030] HNF-4 aは、その機能欠損が糖代謝の異常を招くこと、および遺伝子 2型糖尿病 MODY1の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献 10および 11) 。これらから、 HNF— 4ひの減少または消失によっても糖代謝の異常が生じ、糖尿病（例えば 2型糖尿病）が亢進すると考えられる。すなわち、 HNF-4 aが HtrA2により分解されて減少または消失することにより、糖代謝の異常が生じ、その結果、糖尿病 (例えば 2型糖尿病）が亢進すると考える。したがって、 HNF-4 aの HtrA2による分解を阻害して HNF— 4 aの減少または消失を阻害することにより糖代謝を正常化することができ、糖尿病（例えば 2型糖尿病）の防止および Zまたは治療が可能になる。

[0031] CREBLlおよび/または ATF6の HtrA2による分解の阻害と HNF— 4 aの HtrA 2による分解の阻害とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および Zまたは治療に効果を示すと考える。したがって、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2 による分解と HNF— 4 aの HtrA2による分解とをいずれも阻害することにより、異なつたメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および Zまたは治療が達成できるため、高!、効果が得られると考える。

[0032] また本発明により、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の Htr A2による分解を阻害する化合物の同定方法を実施できる。本同定方法で得られた化合物は、糖尿病の防止および Zまたは治療に使用できる。

図面の簡単な説明

[0033] [図 1-A]活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)により CREBL1がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型 HtrA2と CREBL1を 1晚 (OZN)反応させることにより、 CREBL1を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA 2 (S306A) )では CREBL1の分解が認められなかった。（実施例 2)

[0034] [図 1-B]活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)により ATF6がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型 HtrA2と ATF6を 4時間（4h)または 1晚 (OZN)反応させることにより、 ATF6を示すバンドが著しく減少した。一方不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )では ATF6の分解が認められなかった。（実施例 2)

[0035] [図 2-A]活性型 HtrA2変異体 (活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)の N末 4アミノ酸残基を欠失させた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または活性型 HtrA2の N末のァラニンをダリシンに置換した成熟型 HtrA2 (GVPS) )により、 CREBL1が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 (GV PS)と CREBL1とを共発現させた細胞を用いた解析では、 CREBL1を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 HtrA2 S306 ( Δ A VPS)または成熟型 Htr A2 S306 (GVPS) )と CREBL1とを共発現させた細胞を用いた解析では、 CREBL1を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各 HtrA2変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がな力つた（下図）。（実施例 3)

[0036] [図 2-B]活性型 HtrA2変異体 (活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)の N末 4アミノ酸残基を欠失させた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または活性型 HtrA2の N末のァラニンをダリシンに置換した成熟型 HtrA2 (GVPS) )により、 ATF6が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 (GVPS) と ATF6とを共発現させた細胞を用いた解析では、 ATF6を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 HtrA2 S306 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 S306 (GVPS) )と ATF6とを共発現させた細胞を用いた解析では、 ATF6を示すバンドの減少は認められなカゝつた（上図）。細胞内における各 HtrA 2変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がな力つた (下図)。（実施例 3)

[0037] [図 3]蛋白質内部のリジン残基がピオチンィ匕され且つ N末に Tagが付加された CREB L1を用いて、ピオチンを検出することにより、活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)による C REBL1の分解が検出されたことを説明する図である。活性型 HtrA2と CREBL1を 4 時間（4h)または 1晚 (OZN)反応させることにより、ピオチンィ匕 CREBL1を示すバンドが著しく減少し、 50kDa近辺に CREBL1分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )では CREBL1の分解が認められず、上記 50kDa近辺のバンドも検出されな力つた。（実施例 4)

[0038] [図 4]蛋白質内部のリジン残基がピオチンィ匕され且つ N末に Tagが付加された CREB L1を用いて、 N末に付加された Tagを検出することにより、活性型 HtrA2 (成熟型 Ht rA2)により CREBL1が分解されたことを説明する図である。活性型 HtrA2と CREB L1を 4時間（4h)または 1晚 (OZN)反応させることにより、 N末に Tagが付加された CREBL1を示すバンドが著しく減少した。図 3で検出された 50kDa近辺の CREBL1 分解産物を示すと考えられるバンドは、抗 Tag抗体では検出されな力つた。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) )では CREBL1の分解は認められなかった。（実施例 4)

[図 5]活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)により CREBL1がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型 HtrA2と CREBL1を 1晚 (OZN)反応させることにより、 CREBL1を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S 306A) )では CREBL1の分解が認められなかった。（実施例 6)

[図 6]活性型 HtrA2変異体 (活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2)の N末 4アミノ酸残基を欠失させた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または活性型 HtrA2の N末のァラニンをグリシンに置換した成熟型 HtrA2 (GVPS) )により、 CREBL1が細胞内で分解されたことを説明する図である。成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 (GVPS)と CR EBL1とを共発現させた細胞を用いた解析では、 CREBL1を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 HtrA2 S 306 ( Δ AVPS) ¾ たは成熟型 HtrA2 S306 (GVPS) )と CREBL1とを共発現させた細胞を用いた解析では、 CREBL1を示すバンドの減少は認められな力つた。（実施例 7)

発明を実施するための最良の形態

[0039] 本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第 2003— 342 587号力の優先権を主張するものである。

[0040] 本明細書にぉ、ては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「ポリペプチド」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたぺプチド結合により互いに結合している 2個以上のアミノ酸を含むものである。以降、ァミノ酸を表記する場合、 1文字または 3文字にて表記することがある。

[0041] 本発明においては、 HtrA2と CREBL1および HNF— 4 aとが相互作用することを、国際公開 WO01Z67299号パンフレット記載の方法に従ってインシリコで予測した。さらに実験的に、 CREBL1、 CREBL1のファミリー蛋白質である ATF6、および H NF-4 aが活性型 HtrA2により分解されることを初めて明らかにした。

[0042] CREBL1は ATF6ファミリーの 1つであり、 ATF6 βとも称される。 CREBL1は小胞体に局在し、小胞体ストレスにより S 1P、 S2Pによりプロセッシングを受けて一部が核移行し、転写因子として働くことが知られている。 CREBL1および ATF6はいずれも、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導し、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献 8および 9 )。また、小胞体ストレスにより脾臓の β細胞が細胞死を起こし、糖尿病を亢進することが報告されている（非特許文献 7)。これらから、 CREBL1および Ζまたは ATF6が HtrA2により分解されて減少または消失することにより、ストレス等による細胞死、例えば脾臓 j8細胞の細胞死が亢進し、その結果、糖尿病が亢進すると考える。

[0043] したがって、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害することにより、これら蛋白質のうちの少なくとも 1の減少または消失を阻害でき、その結果、ストレス等による細胞死、例えば脾臓 j8細胞の細胞死を阻害できる。さらには、糖尿病の防止および Zまたは治療を実施できる。

[0044] HNF-4 aは、その機能欠損が糖代謝の異常を招くこと、および遺伝子 2型糖尿病 MODY1の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献 10および 11) 。これらから、 HNF— 4ひの減少または消失によっても糖代謝の異常が生じ、糖尿病（例えば 2型糖尿病）が亢進すると考えられる。すなわち、 HNF-4 aが HtrA2により分解されて減少または消失することにより、糖代謝の異常が生じ、その結果、糖尿病 (例えば 2型糖尿病）が亢進すると考える。

[0045] したがって、 HNF-4 aの HtrA2による分解を阻害することにより、 HNF— 4 aの減少または消失を阻害でき、その結果、糖代謝を正常化することができる。さらには、糖尿病、例えば 2型糖尿病の防止および Zまたは治療を実施できる。

[0046] このように、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害し、これら蛋白質のうちの少なくとも 1の減少または消失を阻害することにより、糖尿病の防止および Zまたは治療を実施できる。これら蛋白質のうちのいずれカ 1の分解を阻害することにより得られる糖尿病の防止および Zまたは治療の効果と比較して、これら蛋白質のうちの 2つまたは 3つの HtrA2による分解を阻害することにより、より高い効果が得られると考える。

[0047] CREBL1および/または ATF6の HtrA2による分解の阻害と HNF— 4 aの HtrA 2による分解の阻害とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および Zまたは治療に効果を示すと考える。 CREBL1および/または ATF6の HtrA2による分解の阻害は、脾臓 β細胞の細胞死の阻害を介して糖尿病の防止および Ζまたは治療に効果を示すと考える。他方、 HNF— 4 aの HtrA2による分解の阻害は、糖代謝の正常化を介して糖尿病 (例えば 2型糖尿病)の防止および Zまたは治療に効果を示すと考える。したがって、 CREBL1および/または ATF6の HtrA2による分解と HNF 4 aの HtrA2による分解とをいずれも阻害することにより、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および zまたは治療が達成できるため、高い効果が得られると考える。

[0048] これら知見に基づいて本発明においては、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解の阻害方法を提供する。さらに、 CREBL1、 A TF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解に基づく疾患、例えば糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法を提供する。

[0049] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法は HtrA2 の機能を阻害することにより実施できる。

[0050] HtrA2の機能として、例えば、そのプロテアーゼ活性による CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の切断が挙げられる。プロテアーゼによる蛋白質分解においては一般的に、プロテアーゼが蛋白質に作用して蛋白質のペプチド結合を 1箇所または 2箇所以上で切断することにより蛋白質分解が行われる。実際に、 HtrA 2は CREBL1のペプチド結合を数箇所で切断することにより CREBL1を分解した（実施例 4)。同様に、 HtrA2は、 ATF6および HNF— 4 aのペプチド結合を 1箇所または 2箇所以上で切断することによりこれら蛋白質を分解すると考える。

[0051] したがって、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断を阻害することにより、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法を実施できる。本分解阻害方法においては、 CREBL1の HtrA2 による切断を阻害することにより CREBL1の分解が阻害され、 ATF6の HtrA2による切断を阻害することにより ATF6の分解が阻害され、および、 HNF— 4 αの HtrA2による切断を阻害することにより HNF— 4 aの分解が阻害される。

[0052] HtrA2の機能としてまた、例えば、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1との相互作用が挙げられる。本明細書中で「CREBL1、 ATF6および HNF 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2が相互作用する」とは、 CREBL1、 ATF6および HNF-4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2がある様式により互いに作用を及ぼし、その結果、具体的には CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1が HtrA2 により分解されることを意味する。前記「ある様式」とは、結合、接触あるいは近接等を含むものであり、結果として互ヽに作用を及ぼし得る様式であれば、ずれのものであつてもよい。

[0053] したがって、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1との HtrA2との相互作用を阻害することにより、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法を実施できる。

[0054] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法は、好ましくは、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1と HtrA2とを少なくとも含む生体外試料において、 HtrA2の機能を阻害することにより実施できる。

[0055] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法は具体的には、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、 HtrA2のプロテアーゼ活性を阻害する化合物が挙げられる。好ましくは、 HtrA2のプロテアーゼ活性を特異的に阻害する化合物が挙げられる。 HtrA2のプロテアーゼ活性を特異的に阻害する化合物とは、 HtrA2のプロテアーゼ活性を強く阻害する力他の酵素の活性は阻害しないか、弱く阻害する化合物を意味する。 HtrA2のプロテアーゼ活性を阻害する化合物は、例えば、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 αを基質として用いて HtrA2による当該基質の分解を検出する系にある化合物（以下、被検化合物と称する）を添加し、被検化合物が当該基質の分解を阻害するか否かを判定することにより同定し取得できる。 HtrA2のプロテアーゼ活性を特異的に阻害する化合物は、他の酵素活性に対する阻害効果と比較して、 HtrA2のプロテアーゼ活性を強く阻害するものを、上記のように同定された化合物力も選択することにより取得できる。また、 C REBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断を阻害する化合物として、 CREBL1、 ATF6、 HNF— 4 αまたは HtrA2の各アミノ酸配列において、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aと HtrA2とが相互作用する部位のァミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。特に、 HtrA2の基質となる CREBL1、 A TF6または HNF— 4 α由来の力かるポリペプチドは、 CREBL1、 ATF6または HNF 4 aと HtrA2との相互作用を競合的に阻害し、 HtrA2によるこれら各蛋白質の切断を阻害できる。このようなポリペプチドであって、さらに CREBL1、 ATF6または H NF-4 aと HtrA2との相互作用を特異的に阻害するポリペプチドがより好ましく本分解阻害方法に用いられる。 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1 と HtrA2との相互作用を特異的に阻害するポリペプチドとは、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2との相互作用を強く阻害する力他の蛋白質間相互作用は阻害しないか、弱く阻害するポリペプチドを意味する。また、 CRE BL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断を阻害する化合物として、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aの HtrA2により分解される部位のアミノ酸配列力もなるポリペプチドは、力かるポリペプチドとして好適である。このようなポリペプチドであって、さらに CREBL1、 ATF6または HNF— 4 αの HtrA2による分解を特異的に阻害するポリペプチドがより好ましく本分解阻害方法に用いられる。

CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aの HtrA2による分解を特異的に阻害するポリべプチドとは、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を強く阻害するが、 HtrA2による他の蛋白質の分解は阻害しないか、弱く阻害するポリペプチドを意味する。

[0056] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法はまた、 C REBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2との相互作用を阻害する化合物を用いて実施できる。 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2との相互作用を阻害する化合物であって、さらに該相互作用を特異的に阻害する化合物がより好ましく本分解阻害方法に用いられる。 CREBL1、 ATF6 および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2との相互作用を特異的に阻害するィ匕合物とは、該相互作用を強く阻害するが、他の蛋白質間相互作用は阻害しないか、弱く阻害する化合物を意味する。このような化合物として、 CREBL1、 ATF6、 HNF 4 aまたは HtrA2の各アミノ酸配列において、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 a と HtrA2とが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。特に、 HtrA2の基質となる CREBL1、 ATF6または HNF— 4 α由来の力かるポリべプチドは、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aと HtrA2との相互作用を競合的に阻害し、ひいては HtrA2によるこれら各蛋白質の分解を阻害できる。

[0057] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法に用い得るポリペプチドは、 CREBL1、 ATF6、 HNF— 4 αまたは HtrA2のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害するものを選択することにより取得できる。 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのアミノ酸配列において、 Ht rA2と相互作用する部位または HtrA2により分解される部位のアミノ酸配列力なるポリペプチドは、力かるポリペプチドとして好適である。このように特定されたポリぺプチドに、 1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、 CREB Ll、 ATF6または HNF— 4 αの HtrA2による分解を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよぐ人工的に変異を導入したものであってもよい。このような変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマ一 (Ulmer)の技術 (非特許文献 12)を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質 (物性、機能または免疫学的活性等)を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族ァミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリべプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミドィ匕修飾する等、機能の著、変更を伴わな、程度に改変できる。

[0058] 上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。

例えば、成書 (非特許文献 13および 14)に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えば Fmoc法等が挙げられる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて上記ポリペプチドを製造できる。あるいは遺伝子工学的手法により上記ポリべプチドを取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフエクシヨンして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造できる。

[0059] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法は、 CRE BL1、 ATF6、 HNF— 4 αまたは HtrA2を認識する抗体であって、 CREBL1、 ATF 6または HNF— 4 aの HtrA2による分解を阻害する抗体を用いることによつても実施できる。かかる抗体は、 CREBL1、 ATF6、 HNF— 4 αまたは HtrA2自体、あるいは CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aと HtrA2とが相互作用する部位のアミノ酸配列力もなるポリペプチド等を抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。

CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断を阻害する化合物は、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2 による分解を指標にして、医薬品スクリーニングにおいてよく知られている同定方法を用いて取得できる。 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1の Htr A2による切断を阻害することによりこれら蛋白質の分解が阻害されることから、これら蛋白質の切断を阻害する化合物はこれら蛋白質の分解を阻害すると考える。したがつて、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断を阻害する化合物の同定方法により、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物も取得できる。 CREBL1、 ATF6 および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断および分解を阻害する化合物の同定方法は、例えば、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1の Htr Α2〖こよる切断および分解を可能にする条件を選択し、当該条件下で CREB Ll、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1および Zまたは HtrA2とを調べようとする化合物（以下、被検化合物と称する）と接触させ、 CREBL1、 ATF6および H NF-4 aのうちの少なくとも 1の切断および分解を検出し得るシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 α のうちの少なくとも 1の HtrA2による切断および分解を阻害する化合物を同定できる。 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断および分解を可能にする条件は、インビトロのものであってよぐインビボのものであってもよい。例えば、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1と HtrA2とを共発現させた細胞を用いて、上記化合物の同定方法を実施できる。細胞における共発現は、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターと HtrA2をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的方法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。 CREBL1、 ATF6、 HNF— 4 αまたは HtrA2をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、単独で、または組合せて細胞のトランスフエクシヨンに使用できる。細胞は、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは動物培養細胞株、さらに好ましくは哺乳動物培養細胞株を使用できる。 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1および Zまたは HtrA2と被検化合物との接触は、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断および分解の反応以前に行なってもよいし、該切断および分解の反応に共存させることにより行なってもよい。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指す。ここでマーカーとは、それ自体は物理的または化学的性質により検出され得ないが、化学的反応を経ることにより前記シグナルを生成させるものであつて、該生成されるシグナルの物理的、化学的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルおよび/またはマーカーとして、レポータ一遺伝子 (例えばクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子等）、放射性同位体、タグペプチド類（His— tag、 Myc— tag、 HA— tag、 FLAG— tagまたは Xpr ess - tag等）、 GST等の酵素類、ピオチン、および蛍光蛋白質等、公知のものが利用できるが、これら例示に限らず、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれも利用できる。これらシグナルおよび Zまたはマーカーの検出方法は当業者には周知である。簡便には、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の切断および分解は、これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解物量の存在若しくは不存在および Zまたは変化の検出により測定できる。これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッテイング等を用いて実施できる。

[0061] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2との相互作用を阻害する化合物は、上記同定方法により取得できる。

[0062] HtrA2、 CREBL1および ATF6はいずれも公知蛋白質であり、ジェンバンク（Gen Bank)にそれぞれァクセッションナンバー NM— 013247、 NM— 00438および N M 007348として開示されている。また、 HNF— 4 αも公知蛋白質であり、スイスプロットデータベース（Swiss— Prot database)にァクセッションナンバー P41235 (登録遺伝子名は HNF4A)として開示されて、る。

[0063] 本実施例にお!、て用いた HtrA2のアミノ酸配列を配列番号 4に示す。また、配列番号 4に記載のアミノ酸配列をコードする HtrA2 DNAの塩基配列を配列番号 3に示す。配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、成熟型 HtrA2である。成熟型 HtrA2とは、 HtrA2前駆体蛋白質 (配列番号 2)から N末 133アミノ酸残基が切り離されて生じた成熟型蛋白質であり、プロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有する HtrA2を活性型 HtrA2と呼称することがある。また、活性型 HtrA2として、成熟型 HtrA2の N末の 4残基 (AVPS)を欠失させた蛋白質（配列番号 8、成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)と称することがある）または成熟型 HtrA2の N末の 4残基のうちのァラニンをグリシンに置換した蛋白質 (配列番号 10、成熟型 HtrA2 (GVPS)と称することがある）を用いることができる。このような変異を導入した HtrA2 は、そのプロテアーゼ活性には変化がないため、活性型 HtrA2として用いることができる。一方、プロテアーゼ活性を有さない HtrA2を不活性型 HtrA2と呼称することがある。不活性型 HtrA2として、 HtrA2のアミノ酸配列において HtrA2のプロテア一ゼ活性に必要な部位のアミノ酸残基に変異を有し、該変異の結果プロテアーゼ活性を示さな、HtrA2変異体が例示できる。 HtrA2のプロテアーゼ活性に必要な部位として、プロテアーゼ活性ドメイン、より好ましくは成熟型 HtrA2 (配列番号 4)の 174番目（前駆体蛋白質 (配列番号 2)では 306番目に相当）のセリン残基が挙げられる。不活性型 HtrA2として、より具体的には、成熟型 HtrA2の 174番目（前駆体蛋白質（配列番号 2)では 306番目に相当）のセリン残基がァラニンに置換した HtrA2変異体 (配列番号 6、成熟型 HtrA2 (S306A)と呼称する）が例示できる。また、不活性型 H trA2として、成熟型 HtrA2 (S306A)の N末の 4残基 (AVPS)を欠失させた蛋白質 (配列番号 12、成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)と称することがある）または成熟型 HtrA2の N末の 4残基のうちのァラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号 14 、成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)と称することがある）を用いることができる。

[0064] 本実施例にお!、て用いた CREBL1のアミノ酸配列を配列番号 16に示す。また、配列番号 16に記載のアミノ酸配列をコードする CREBL1 DNAの塩基配列を配列番号 15に示す。配列番号 15に記載の塩基配列は、ァクセッションナンバー NM— 004 38に開示された CREBL1の塩基配列と比較して塩基の 1つに相違が認められた（実施例 2参照)。

[0065] 本実施例にお!、て用いた ATF6のアミノ酸配列を配列番号 18に示す。また、配列番号 18に記載のアミノ酸配列をコードする ATF6 DNAの塩基配列を配列番号 17 に示す。配列番号 17に記載の塩基配列は、ァクセッションナンバー NM— 007348 に開示された ATF6の塩基配列と比較して 15個の塩基に相違が認められた (実施例 2参照)。

[0066] 本実施例にお!、て用いた HNF— 4 aのアミノ酸配列を配列番号 35に示す。また、配列番号 35に記載のアミノ酸配列をコードする HNF— 4 a DNAの塩基配列を配列番号 34に示す。配列番号 35に記載のアミノ酸配列は、スイスプロットデータベース (Swiss— Prot database)のァクセッションナンバー P41235 (登録遺伝子名は HN F4A)に開示された HNF— 4 aのアミノ酸配列と同一であった（実施例 6参照）。

[0067] 本発明において HtrA2、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 a並びにこれら各蛋白質をコードする各遺伝子は、上記例示したアミノ酸配列または塩基配列で表される蛋白質または遺伝子に限定されず、一般的に報告されている HtrA2、 ATF6および C REBL 1を!ヽずれも含む。

[0068] 本発明において使用する HtrA2、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよぐあるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、 HtrA2、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのいずれか 1っ以上を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。 HtrA2、 CREBL 1、 ATF6および HNF— 4 aは、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aと HtrA2との相互作用、およびこれら蛋白質の機能、例えば HtrA2のプロテアーゼ活性や CREBL 1、 ATF6および HNF— 4 aの酵素基質としての性質等に影響がなければ、 N末側や C末側に別の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカ一ペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加したものであってもよい。付加する別の蛋白質やポリペプチドとして、 j8—ガラクトシダーゼ、 IgG等の免疫グロブリン Fc 断片、 tagペプチド類（His—tag、 Myc— tag、 HA— tag、 FLAG— tag、または Xpress tag等）を例示できる。

[0069] HtrA2、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチドは、ヒト c DNAライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。 HtrA2、 CR EBL1、 ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、当該ポリヌクレオチドを適当な発現ベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。

[0070] 被検化合物として、例えばィ匕学ライブラリーや天然物由来の化合物、あるいは Htr A2、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られたィ匕合物等が挙げられる。その他、 CREBL1、 ATF6および H NF-4 aのうちの少なくとも 1のアミノ酸配列において、 HtrA2と相互作用する部位または HtrA2により切断される部位のアミノ酸配列力なるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。

[0071] 本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、 CREBL1、 ATF6および HNF-4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2とを用いたインビト口におけるプロテアーゼァッセィ（実施例 2および 6)に被検化合物を添加することにより実施できる。活性型である成熟型 HtrA2は、ヒト腎臓 cDNAライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得した成熟型 Htr A2 DNAを含む適当なベクターをトランスフエクシヨンした大腸菌から調製できる。 CREBL1は、ヒト脳 cDNAライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得した CREBL1 DNAを含む適当なベクターをトランスフエクシヨンした動物細胞培養株（例えば HEK293T細胞）から調製できる。 ATF6は、ヒト乳腺 cDNAライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得した ATF6 D NAを含む適当なベクターをトランスフエクシヨンした動物細胞（例えば HEK293T細胞）力も調製できる。 HNF-4 aは、ヒト脳 polyA+RNAから自体公知の遺伝子工学的手法により取得した HNF— 4 a DNAを含む適当なベクターをトランスフエクシヨンした動物細胞培養株（例えば HEK293T細胞）から調製できる。 CREBL1、 ATF6、 HNF-4 aおよび HtrA2は、これら蛋白質をそれぞれ発現させた各細胞の細胞溶解液の可溶性画分に含まれる。 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aは、好ましくは、それらの N末または C末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させ、該タグペプチドに対する抗体で免疫沈降することにより精製して用いることが適当である。例えば、タグペプチドに対する抗体で免疫沈降した後、榭脂（プロテイン G セファロース等)等に補足したものを使用できる。インビト口におけるプロテアーゼアツセィは、榭脂等に補足した CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aに、成熟型 HtrA2を添カロして 37°Cで一晩反応させた後、これら蛋白質をウェスタンブロッテイングで検出することにより実施できる。 ATF6については、 37°Cで 4時間反応させることにより成熟型 Htr A2により分解されるため、プロテアーゼアツセィにおける反応時間を 4時間にすることもできる。ウェスタンブロッテイングによる検出は、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aに付加させたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。 CREBL1、 ATF6 または HNF— 4 αは HtrA2により分解されるため、ウェスタンブロッテイングにより検出されるこれら蛋白質の量は、 HtrA2を添加しないときと比較して減少または消失する。 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aと成熟型 HtrA2との反応に被検化合物を添加し、被検化合物を添カ卩しないときと比較して CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aの量の低減または消失が阻害される場合、該被検化合物は CREBL1、 ATF6または HNF-4 aの HtrA2による分解を阻害すると判定できる。被検化合物は予め CREB Ll、 ATF6または HNF— 4 aと、あるいは成熟型 HtrA2と接触させ、その後、 CREB Ll、 ATF6または HNF— 4 aと成熟型 HtrA2を反応させることもできる。

また、本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、 CREBL1、 ATF6 および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2とを共発現させた細胞を用いた細胞内プロテアーゼアツセィ（実施例 3および 7)に被検化合物を添加することにより実施できる。 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1と HtrA2との細胞での共発現は、上記のように作製した CREBL1 DNA、ATF6 DNAおよび HNF— 4 a DNAのそれぞれを含む適当なベクターと HtrA2 DNAを含む適当なベクターとを、自体公知の遺伝子工学的手法で動物細胞培養株 (例えば HEK293T細胞）にトランスフエクシヨンすることにより実施できる。 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aは、これら蛋白質の N末または C末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させることが、これら蛋白質の検出を容易にするため、好ましい。 HtrA2は、活性型 Ht rA2を用いる。活性型 HtrA2として、成熟型 HtrA2、好ましくは N末の 4残基 (AVP S)を欠失させた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または N末の 4残基のうちのァラニンをグリシンに置換した成熟型 HtrA2 (GVPS)を用いることが適当である。成熟型 HtrA2 の N末の 4残基（AVPS)は、アポトーシスの阻害に働く IAPs (Inhibitor of apopt osis proteins)ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、 IAPsと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアツセィの検討に影響を与える可能性が考えられるため、 IAPsと結合しない成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 (GVPS) を使用することが好ましい。細胞内プロテアーゼアツセィは、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2とを共発現させた細胞を被検化合物と共に 37°Cで 48時間培養後、該細胞を溶解し、その溶解液中に含まれる CREBL1、 A TF6または HNF— 4 aをウェスタンブロッテイングで検出することにより実施できる。ゥエスタンブロッテイングによる検出は、 CREBL1、 ATF6または HNF— 4 αに付カロさせたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。 CREBL1、 ATF6または HNF 4 αは HtrA2により分解されるため、ウェスタンブロッテイングにより検出されるこれら蛋白質の量は、 HtrA2を添加しないときと比較して減少または消失する。被検化合物を添カ卩した場合の CREBL1、 ATF6または HNF— 4 aの量の低減または消失力被検化合物を添加しないときと比較して阻害される場合、該被検化合物は CRE BL1、 ATF6または HNF— 4 aの HtrA2による分解を阻害すると判定できる。

[0073] 本発明に係る化合物の同定方法は、上記インビトロにおけるプロテアーゼアツセィや細胞内プロテアーゼアツセィを用いた具体的例示に限定されず、一般的に用いられて、る医薬品スクリーニングにお、てよく知られて、る同定方法を用いて実施できる。

[0074] 本発明に係る化合物の同定方法で得られたィ匕合物は、 CREBL1、 ATF6および H NF-4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解の阻害剤として利用できる。当該化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら化合物は、単独で使用することもできるし、組合せて使用することもできる。 [0075] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物は、糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤の有効成分として使用できる。すなわち、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上用いて、糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤を調製できる。このような化合物は上記化合物の同定方法により取得できる。 CREB L 1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害する化合物は、過剰な小胞体ストレス等により引き起こされる細胞死 (例えば脾臓の β細胞の細胞死）を阻害でき、その結果、糖尿病の防止および Ζまたは治療に効果を示すと考える。また、 HNF— 4 αの HtrA2による分解を阻害する化合物は、糖代謝を正常化することができ、糖尿病（例えば 2型糖尿病）の防止および Zまたは治療に効果を示すと考える。このように、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害する化合物と、 HNF— 4 aの HtrA2による分解を阻害する化合物とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および Zまたは治療に効果を示すと考える。したがって、 CREBL1および Z または ATF6の HtrA2による分解を阻害する化合物と、 HNF— 4 aの HtrA2による分解を阻害する化合物とを組合せて含む糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤は、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および Zまたは治療に効果を示すため、これら化合物のヽずれかを含む糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤と比較してより効果が高ぐより好ましい。

[0076] 本発明に係る糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法は、 CREBL1、 ATF6 および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害することにより実施できる。 CREBL1および/または ATF6の HtrA2による分解を阻害することにより、過剰な小胞体ストレス等により引き起こされる細胞死 (例えば脾臓の β細胞の細胞死 )を阻害でき、その結果、糖尿病の防止および Ζまたは治療の効果が得られると考える。また、 HNF— 4ひの HtrA2による分解を阻害することにより糖代謝を正常化することができ、糖尿病（例えば 2型糖尿病）の防止および Zまたは治療の効果が得られると考える。このように、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解の阻害と、 HNF— 4ひの HtrA2による分解の阻害とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および Zまたは治療に効果を示すと考える。したがって、 CREBL1および Z または ATF6の HtrA2による分解と HNF— 4 aの HtrA2による分解とをいずれも阻害することによる糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法は、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および Zまたは治療に効果を示すため、これら蛋白質の分解の一方を阻害することによる糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法と比較してより効果が高ぐより好ましい。

[0077] 本発明に係る糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法は、上記した CREBL1 、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物を用いて実施できる。また、本糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法は、上記した CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法を用いて実施できる。

[0078] CREBL1および ATF6はいずれも、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献 8および 9)ことから、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害することにより、細胞死阻害方法を実施できる。また、 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害する化合物は、細胞死阻害剤として使用できる。すなわち、 CREBL1および Zまたは ATF 6の HtrA2による分解を阻害する化合物の 1つ以上を用いて細胞死阻害剤を調製できる。さらに、小胞体ストレスにより脾臓の )8細胞が細胞死を起こすことが報告されて Vヽる（非特許文献 7)ことから、本発明に係る細胞死阻害方法および細胞死阻害剤は、好ましくは脾臓 |8細胞の細胞死阻害方法および細胞死阻害剤に使用できる。より好ましくは小胞体ストレスによる脾臓 β細胞の細胞死阻害方法および細胞死阻害剤に使用できる。

[0079] 本発明に係る細胞死阻害方法は、 CREBL1および Ζまたは ATF6の HtrA2による分解の阻害方法を用いて実施できる。 CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2 による分解を阻害する化合物は上記化合物の同定方法により取得できる。さらに、本細胞死阻害方法および本細胞死阻害剤を用いて、糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法を実施できる。本細胞死阻害方法は、好ましくは、 CREBL1および Zまたは ATF6と HtrA2とを少なくとも含む生体外試料において CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害することにより実施できる。 [0080] HNF-4 aの機能欠損は糖代謝の異常を招くこと、および遺伝子 2型糖尿病 MOD Y1の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献 10および 11)ことから、 HNF— 4ひの HtrA2による分解を阻害することにより、 2型糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法を実施できる。また、 HNF— 4 αの HtrA2による分解を阻害する化合物は、 2型糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤の有効成分として使用できる。すなわち、 HNF— 4 αの HtrA2による分解を阻害する化合物の 1つ以上を用いて、 2型糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤を調製できる。

[0081] 本発明に係る 2型糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法は、 HNF-4 aの H trA2による分解の阻害方法を用いて実施できる。 HNF-4 aの HtrA2による分解を阻害する化合物は上記化合物の同定方法により取得できる。

[0082] 本発明に係る糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤は、上記化合物の 1つ以上を有効成分としてその有効量含む医薬として製造できる。通常は、 1種または 2種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。

[0083] 本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される力通常約 0. 00001— 70重量％、好ましくは 0. 0001— 5重量％程度の範囲とするのが適当である。

[0084] 医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。

[0085] より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビ-ルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、ァラビァゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マン-トール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組合せて使用される。

[0086] 所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、および pH調整剤等を適宜使用することちでさる。

[0087] 安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常の L アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。 Lーァミノ酸は、特に限定はなぐ例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等のいずれでもよい

。糖類も特に限定はなぐ例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン-トール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース

、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等の、ずれでもよ、。セルロース誘導体も特に限定はなぐメチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、カノレボキシメチルセルロースナトリウム等の!/、ずれでもよ!/、。

[0088] 界面活性剤も特に限定はなぐイオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノァシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。

[0089] 緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クェン酸、 ε アミノカプロン酸、グルタミン酸および Ζまたはそれらに対応する塩 (例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)等を例示できる。

[0090] 等張化剤は、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。

[0091] キレート剤は、例えばェデト酸ナトリウム、クェン酸等を例示できる。

[0092] 本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥ィ匕し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。

[0093] 医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質 (体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重 lkgあたり約 0. 01 μ g乃至 lOOmg程度、好ましくは約 0. l ^ g 乃至 lmg程度の範囲であることが好ましい。し力しながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量を変更できる。上記投与量は 1日 1回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよ、。

[0094] 本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよぐあるいは目的の疾患の防止および Zまたは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。

[0095] 投与経路は、全身投与または局所投与の!/ヽずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与することができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施可能である。

[0096] 投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リボソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。

[0097] さらに本発明は、 HtrA2、 HtrA2をコードするポリヌクレオチドおよび HtrA2をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれ力 1と、 CREBL1 、 ATF6、 HNF-4 a、 CREBL1または ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチド、および CREBL1または ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1とを含んでなる試薬キットを提供する。当該試薬キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。

[0098] 上記試薬キットは、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の Htr A2による分解を検出するためのシグナルおよび Zまたはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および Zまたは防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればょヽ。

[0099] 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

実施例 1

[0100] (HtrA2と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）

HtrA2と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第 WO01Z67299号パンフレットに記載の予測方法に従って予測した。すなわち、 HtrA2のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質と HtrA2との間でローカルァライメントを行い、ローカルァライメントのスコアの高、ものを HtrA2と相互作用すると予測した。

[0101] 解析の結果、 HtrA2と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、 CR EBL1を見出した。

実施例 2

[0102] (インビトロプロテアーゼアツセィ）

CREBL1または CREBL1のファミリーである ATF6と HtrA2の相互作用を実験的に検証するために、インビト口におけるプロテアーゼアツセィを実施した。

[0103] <材料およびその調製 >

本実施例においては、活性型 HtrA2および不活性型 HtrA2としてそれぞれ、いずれも C末 Tagとしてヒスチジン (His)を付カ卩した成熟型 HtrA2 (配列番号 4)および成熟型 HtrA2 (S306A) (配列番号 6)を用いた。また、 HtrA2と相互作用すると予想した蛋白質として、いずれも N末 Tagとして c Mycを付カ卩した CREBL1 (配列番号 16)および ATF6 (配列番号 18)を用いた。

[0104] 1.成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)のクロー-ングおよび発現プラスミドの作製

成熟型 HtrA2 (前駆体 HtrA2 (その DNA塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列は配列番号 1および配列番号 2に記載)のアミノ酸残基 134— 458部分）をコードする遺伝子を得るために、 Human Kidney QUICK— Clone cDNA (Clontech社製）を铸型とし、 HtrA2—Flプライマー（5'側に Ndel部位と ATGを付カロ、配列番号 19)と HtrA2— RSプライマー（終止コドンを除いて Xhol部位を付加、配列番号 20)および DNAポリメラーゼとして KOD— plus (Toyobo社製）を用いてポリメラーゼ連鎖反応法 (PCR法）により成熟型 HtrA2遺伝子を増幅し、 pCR - Bluntl I TOPOベクター（Invitrogen社製）にクローユングした。また、シークェンサ一（Ap plied BiosystemsZHitachi:ABI3100)により塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型 HtrA2 DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 3および配列番号 4に記載した。成熟型 HtrA2大腸菌発現プラスミドは、クローユングした成熟型 HtrA2遺伝子を Ndelと Xholで消化し、 pE T24bベクター（Novagen社製）に組込むことにより取得した。

[0105] 成熟型 HtrA2の 174番目（前駆体蛋白質 (配列番号 2)では 306番目に相当）のセリンをァラニンに置換した変異体 (成熟型 HtrA2 (S306A) )は、プロテアーゼ活性を示さないことが報告されている。そこで、不活性型である成熟型 HtrA2 (S306A)の大腸菌発現プラスミドを、成熟型 HtrA2発現プラスミドを铸型とし、 HtrA2— MFブライマ一（配列番号 21)と HtrA2— MRプライマー（配列番号 22)を用いて QuikChang e XL Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene社製）により作製した。また、シークェンサ一により塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型 HtrA2 ( S306A) DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 5および配列番号 6に記載した。

[0106] 2.成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)の発現および精製

成熟型 HtrA2大腸菌発現プラスミドを大腸菌 BL21 Star (DE3)コンビテントセル (Invitrogen社製）に導入した形質転換体を取得した。この形質転換体を、 26°Cにて 100mlの LB培地で培養し、吸光度（OD)が 0. 68-0. 81に達したときにイソプロピル 1 チォー β—D ガラクトピラノシド (IPTG)を最終濃度 0. ImM添加することにより成熟型 HtrA2蛋白質の発現誘導を行い、一晩培養した後、成熟型 HtrA2を発現している大腸菌を遠心処理により分離回収した。得られた大腸菌を、リシスバッファ一 A (Lysis buffer：リン酸緩衝生理食塩水（PBS) Zl% トライトン X— 100、 1 μ _& /ml ぺプスタチン、 5 M E64)に懸濁し、氷冷下でソ-ケ一ター（15秒 X 10回）により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心処理し（15, OOOrpm、 30分、 4°C)、可溶性画分 (上清)と不溶性画分に分離した。成熟型 HtrA2の含まれる可溶性画分を、あらかじめ 1% トライトン X— 100、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)にて平衡ィ匕したプロボンドレジン（Invitrogen社製： lml prepacked)に力！]え、 4°Cで 30分間混和した後、洗浄バッファー（20mM リン酸ナトリウム（pH6. 0)、 500mM NaCl)にて 3回洗浄した。レジンに吸着した成熟型 HtrA2は、 50、 100、 200、 350、 500mM イミダゾールをそれぞれ含む溶出バッファー（20mM リン酸ナトリウム（pH6. 0)、 500m M NaCl)にて段階的に溶出した。各溶出液について SDS— PAGEを行い、成熟型 HtrA2を含む画分を特定した。その結果、 350-500mM イミダゾールで成熟型 H trA2が溶出された。成熟型 HtrA2を含む画分を 150mM NaCl, 50mM Tris— HCl (pH7. 5)に対して透析した後、遠心処理にて不溶物を除去した上清を濃縮し、牛血清アルブミン（BSA)を標準蛋白質としてクマシ一プラスプロテインアツセィ（Coo massie Plus Protein Assay、 PIERCE社製）により蛋白質を定量した。また成熟型 HtrA2 (S306A)の発現および精製を同様に行った。

[0107] 3. CREBL1および ATF6のクローユングおよび発現プラスミドの作製

CREBL1については、まず Human Brain cDNAを铸型とし、 83— Fプライマー (ATGの直前に EcoRI部位と GCCを付加、配列番号 23)と 83— Rプライマー（終止コドンを除いて Xhol部位を付加、配列番号 24)および DNAポリメラーゼとして KOD— plusを用いて PCR法により CREBL1遺伝子を増幅させ、 pCMV— Tag5にクロー- ングした。

[0108] 次に、 pCMV— Tag5に組込んだ CREBL1遺伝子を铸型とし、 ATF6— NF1プライマー（ATGを除!、て BamHI部位を付加、配列番号 25)と ATF6— NR1プライマー（終止コドンの後に Xhol部位を付加、配列番号 26)および DNAポリメラーゼとして K OD— plusを用いて PCR法により CREBL1遺伝子を増幅させ、 pCR— Bluntll— TO POベクターにクローユングした。また、シークェンサ一により塩基配列を決定した。本実施例で得られた CREBL1 DNAの塩基配列は、 GenBankにァクセッションナンバー NM 00438として既に登録された塩基配列と比較して塩基の 1つに相違が認められた (T450C)。この相違によるアミノ酸の変化はな力た。また、終止コドンが T GA力も TAAに変化した。これらの相違は PCRエラーではないことを確認した。本実施例で得られた CREBL1 DNAの塩基配列および該 DNAにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 15および配列番号 16に記載した。 CREBL1動物細胞発現プラスミドは、クローユングした CREBL1遺伝子を BamHIと Xholで消化し、 pCM V— Tag3に組込むことにより取得した。

ATF6については、まず、 Mammary Gland QUICK— Clone cDNA(Clonte ch社製）を铸型とし、 ATF6Fnプライマー（配列番号 27)と ATF6Rnプライマー（配列番号 28)および DNAポリメラーゼとして KOD— plusを用いて PCR法により ATF6 遺伝子を増幅させた。次に、この増幅された ATF6遺伝子を铸型とし、 ATF6F1Lプライマー（ATGの直前に EcoRV siteを付加、配列番号 29)と ATF6R1Lプライマ一（終止コドンの直後に Xhol siteを付加、配列番号 30)および DNAポリメラーゼとして KOD— plusを用いて PCR法により ATF6遺伝子をさらに増幅させ、 pCR4Blunt TOPOベクター（Invitrogen社製）にクローユングした。また、シークェンサ一により塩基配列を決定した (配列番号 17)。本実施例で得られた ATF6 DNAの塩基配列は、 GenBankにァクセッションナンバー NM— 007348として既に登録された塩基配列と比較して 15個の塩基に相違が認められた。相違する 15塩基は全てゲノム配列と一致することが判明した: T105C (アミノ酸の変化なし）； T199A (Leuから Met へのアミノ酸の変化を伴う）； A201G (Leuから Metへのアミノ酸の変化を伴う）； C27 0T (アミノ酸の変化なし）； A309G (アミノ酸の変化なし）； C433G (Proから Alaへのアミノ酸の変化を伴う）； T469C (Serから Proへのアミノ酸の変化を伴う） ;G1228A( Glyから Serへのアミノ酸の変化を伴う）； A1230C (Glyから Serへのアミノ酸の変化を伴う）； C1389T (アミノ酸の変化なし）； T1416C (アミノ酸の変化なし）； T1491A( アミノ酸の変化なし）； T1538C (Valから Alaへのアミノ酸の変化を伴う）； G1540C ( Valから Leuへのアミノ酸の変化を伴う）；および G1896A (アミノ酸の変化なし）。また、全てのアミノ酸の変化に関して SWISS— PROTではコンフリクトで記載がある。本実施例で得られた ATF6 DNAの塩基配列および該 DNAにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 17および配列番号 18に記載した。 [0110] ATF6遺伝子を動物細胞発現ベクターに組込むために、上記の pCR4Blunt— TO POベクターにクローユングした ATF6遺伝子を铸型とし、 ATF6F2Lプライマー（AT Gの直前に Bglll siteを付加、配列番号 31)と ATF6R1Lプライマー（配列番号 30) および DNAポリメラーゼとして KOD— plusを用いて PCR法により ATF6遺伝子を増幅し、 pCR4Blunt— TOPOベクターにクローユングした。また、シークェンサ一により塩基配列を決定した (配列番号 19)。このクローユングした ATF6遺伝子を Bglllと X hoiで消化し、 BamHIと Xholで消化した動物細胞発現ベクターである pCMV— Tag 3に糸且込んだ。

[0111] 4. CREBL1および ATF6の発現

トランスフエクシヨン前日に細胞数 1. 5 X 10⁶/10cm ディッシュ（Dish)とした HE K293T細胞に、 CREBL1または ATF6の発現プラスミドを FuGene6 (Roche社製）にてトランスフエクシヨンした（lO /z

48時間後、細胞を PBSで洗浄し、 lm 1のリシスバッファー B (50mM Tris— HCl (pH7. 6)、 150mM NaCl、 1% トライトン X— 100、 1% ノ-デット P— 40 (NP— 40)、コンプリートミ - (Complete Mini, E DTA (ethylenediamine tetra— acetate)不含） )を添力卩し氷上で 10分間静置した。その後、スクレーパーで細胞を集め、 1. 5mlのチューブに入れ、氷冷下でソ-ケ一シヨン処理（15秒 X 6回）を行い、氷中で 20分静置後、ピペッティングで懸濁し、遠心処理（15, 000rpm、 30分間、 4°C)により可溶性画分と不溶性画分を分離した。検討用試料として、可溶性画分を用いた。

[0112] 5.成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)の活性の検討

カゼインザィモグラフィーおよびカゼインナトリウムのプロテアーゼアツセィにより成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)の活性の検討を行った。カゼインザィモグラフィ一はプロトコール (Invitrogen社製）に従って実施した。具体的には、成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)を非還元下で 2 X SDS サンプルバッファーと等量混合し、室温で 10分静置した後、 4一 16% ザィモグラム（Blue casein)ゲル（Zymogram Gel、 Invitrogen社製）による分離を行った。泳動終了後、 2. 5% トライトン X— 100にてリネーチヤ一（renature)した後、ディべロビングバッファー（De veloping buffer)中で 37°C、ー晚カゼイン分解反応を行った。 [0113] 一方、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアツセィは、反応バッファー（15 OmM NaCl、 50mM Tris— HCl (pH7. 5) )中で成熟型 HtrA2あるいは成熟型 H trA2 (S306A)を 200 μ g/ml,カゼインナトリウムを 400 μ gZmlの濃度となるように混合し、 37°Cでインキュベーションして反応させることにより行った。反応開始 3時間後および一晩後に反応液の一部を採取して、 2 X SDS サンプルバッファーと等量混合し煮沸処理後、 SDS-PAGEを行い、クマシ一ブリリアントブルー（CBB)染色によりカゼインナトリウムの分解の有無を検出した。

[0114] 上記検討の結果、成熟型 HtrA2によるカゼインの分解が認められたが、成熟型 Ht rA2 (S306A)ではカゼインの分解が認められなかった。このことから、成熟型 HtrA 2はプロテアーゼ活性を有する活性型である力成熟型 HtrA2 (S306A)はプロテアーゼ活性を示さない不活性型であることが確認できた。

[0115] <方法 >

CREBLlまたは ATF6の発現プラスミドをトランスフエクシヨンした細胞から調製した可溶性画分に含まれる夾雑蛋白質の影響を除くために免疫沈降にて榭脂にそれぞれ捕捉した CREBLlおよび ATF6を実験に用いた。 CREBLlおよび ATF6の各可溶性画分 300 μ 1を 6本のチューブ（No. 1-6)に分注し、各チューブに BSAでブロッキングした 50%スラリーのプロテイン G セファロース 4 FF (Amersham社製）を 2 0 μ 1添加し、 4°Cで 1時間転倒混和後、遠心処理（10, 000rpm、 10秒間、 4°C)にて上清を回収し前処理 (pre— clean)を行った。得られた上清に抗 Myc抗体 (Invitrog en社製）を 1. 7 1 (2 g)添加し、 4°Cで 3時間転倒混和後に、 BSAでブロッキングしたプロテイン G セファロース 4 FFを 20 1添カ卩し 4°Cで 1晚転倒混和し、プロテイン G セファロース 4 FFに CREBLlおよび ATF6をそれぞれ捕捉した。

[0116] 次に CREBLlまたは ATF6が捕捉されたプロテイン G セファロース 4 FFを 500

1の洗浄バッファー（50mM Tris— HCl (pH7. 5)、 150mM NaCl、 0. 01% トライトン X— 100)で 5回洗浄した後、 No. 1および 2のチューブには 50mM Tris— H Cl(pH7. 5)、 150mM NaCl、 0. 01% 卜ライトン X— 100を、 No. 3および 4のチュ一ブには 50 μ gZmlの成熟型 HtrA2溶液 100 μ 1を、 No. 5および 6のチューブには 50 μ gZmlの成熟型 HtrA2 (S306A)溶液 100 μ 1をそれぞれ加えた。 No. 1、 3 および 5のチューブは 37°Cで 4時間、 No. 2、 4および 6のチューブはー晚反応させた後、遠心処理により上清を除去して 500 1の洗浄バッファ一にて 3回、遠心洗浄を行!ヽ、 2 X SDS サンプルバッファー（ 13 メルカプトエタノール 0. 1 %含む）を 80 μ 1 加え煮沸処理した。得られた試料 80 1のうち 10 1を使用し、 SDS— PAGE後、 PV DF膜へ転写し、ウェスタンブロッテイングにより、 CREBL1および ATF6を検出した。検出用の 1次抗体として抗 c Myc抗体（9E10) (Santa cruz社製）を、 2次抗体としてホースラディッシュパーォキシダーゼ (HRP)標識した抗マウス IgG抗体 (Cell S ignaling社製）を用いた。また、検出は ECL Western Blotting Detection Sy stem (Amersham社製）を用いて実施した。

[0117] <結果>

CREBL1および ATF6が!、ずれも、成熟型 HtrA2によりインビトロで分解されることを認めた。図 1-Aに示すように、活性型 HtrA2と CREBL1を 1晚（OZN)反応させることにより、 CREBL1を示すバンドが著しく減少した。また、図 1 Bに示すように、活性型 HtrA2と ATF6を 4時間（4h)または 1晚（OZN)反応させることにより、 AT F6を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A ) )による CREBL1および ATF6の分解は認められなかった（図 1 Aおよび図 1—B) 実施例 3

[0118] (細胞内におけるプロテアーゼアツセィ）

CREBL1または ATF6と HtrA2の相互作用を細胞内におけるプロテアーゼアツセィにより検討した。

[0119] <材料およびその調製 >

成熟型 HtrA2の N末の 4残基 (AVPS)は、アポトーシスの阻害に働く IAPs (Inhibi tor of apoptosis proteins)ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、 IAPsと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアツセィの検討に影響を与える可能性が考えられる。そこで成熟型 HtrA2または成熟型 HtrA2 (S306A)と IAPsとの相互作用を阻害するために、 N末の 4残基 (AVPS)を欠失させたもの（ Δ AVPS)または該 4残基のうちのァラニンをグリシンに置換したもの（AVPS→GVPS)を成熟型 Ht rA2および成熟型 HtrA2 (S306A)についてそれぞれ作製した。これら各種 HtrA2 m、ずれも C末 Tagとして FLAGを付カロしたものを用いた。

[0120] 1.各種 HtrA2の調製

成熟型 HtrA2の変異体を作製するために、成熟型 HtrA2を铸型とし、センスブライマ一として F1および F2プライマー（ATGの直前に Sacl siteを付加、それぞれ配列番号 32および配列番号 33)を、アンチセンスプライマーとして HtrA2— RSプライマー（配列番号 20)を用い、また DNAポリメラーゼとして Pfu turbo (STRATAGE NE社製）を用いて PCR法により、成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)および成熟型 HtrA2 ( GVPS)の各遺伝子を増幅させ、 pCR— Bluntll— TOPOベクターにクローユングした。また、シークェンサ一により塩基配列を決定した。成熟型 HtrA2 ( AAVPS)および成熟型 HtrA2 (GVPS)の各動物細胞発現プラスミドは、クローユングした成熟型 Ht rA2 ( Δ AVPS)および成熟型 HtrA2 (GVPS)の各遺伝子を Saclと Xholで消化し、 pCMV-Tag4に組込むことにより取得した。本実施例で得られた成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS) DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 7および配列番号 8に記載した。また、成熟型 HtrA2 (GVPS) DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 9および配列番号 10に記載した。

[0121] 成熟型 HtrA2 (S306A)の変異体を作製するために、同様に、成熟型 HtrA2 (S3 06A)を铸型とし、 PCR法により、成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)および成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)の各遺伝子を増幅させ、 pCR— Bluntll— TOPOベクターにクロー-ングした。成熟型 HtrA2 (S306A、 AAVPS)および成熟型 HtrA2 (S30 6A、 GVPS)の各動物細胞発現プラスミドは、クローユングした成熟型 HtrA2 (S30 6A、 AAVPS)および成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)の各遺伝子を Saclと Xhol で消化し、それぞれ pCMV— Tag4に組込むことにより取得した。本実施例で用いた成熟型 HtrA2 (S306A、 AAVPS) DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 11および配列番号 12に記載した。また、成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS) DNAの塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 13および配列番号 14に記載した。

[0122] 2.各種 HtrA2の酵素活性の検討

培養細胞で発現した各種 HtrA2に関して、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアツセィにより、その酵素活性を測定した (実施例 2参照)。その結果、成熟型 Ht rA2 ( Δ AVPS)および成熟型 HtrA2 (GVPS)は!、ずれもプロテアーゼ活性を有する活性型であること、成熟型 HtrA2 (S306A、 A AVPS)および成熟型 HtrA2 (S30 6A、 GVPS)はいずれもプロテアーゼ活性を有さない不活性型であることが判明した

[0123] 3. CREBL1および ATF6の動物細胞用発現ベクターの作製

実施例 2と同様の方法で作製したものを用いた。

[0124] <方法 >

各種 HtrA2発現プラスミドと CREBL1または ATF6の発現プラスミドとは、トランスフエクシヨン前日に細胞数 5 X 10⁵/6cm Dishとした HEK293T細胞に FuGene6 (Roche社製）を用いて導入した。各種 HtrA2発現プラスミドはそれぞれ、 CREBL1 発現プラスミドまたは ATF6発現プラスミドと組合せて、いずれも 1 g/Dish添加した。 48時間後、各種 HtrA2と CREBL1または ATF6とを共発現させた細胞に、 200 μ 1のリシスバッファー Βに 2 X SDS サンプルバッファー（ 13 メルカプトエタノール 0 . 1 %含む)を等量加え、ソ-ケーシヨン後、煮沸処理したものを検討用試料とした。

[0125] 上記各検討用試料 10 1を用いてウェスタンブロッテイングにより、 CREBL1および ATF6の発現並びにこれら蛋白質の分解の有無を検出した。検出用の 1次抗体として抗 c—Myc (9E10)抗体を、 2次抗体としてホースラディッシュパーォキシダーゼ（H RP)標識した抗マウス IgG抗体 (Cell Signaling社製)を用いた。検出は、 ECL W e stern Blotting Detection Systemを用ヽて施しに。

[0126] <結果>

プロテアーゼ活性を有する活性型変異体 (成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 (GVPS) )と CREBL1とを共発現させた細胞を用いた解析では、 CREBL 1を示すバンドが著しく減少した（図 2— Aの上図)。また、該活性型変異体と ATF6とを共発現させた細胞を用いた解析では、 ATF6を示すバンドが著しく減少した（図 2- Bの上図）。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 HtrA2 S306 ( AAVPS)または成熟型 HtrA2 S306 (GVPS) )と CREBL1とを共発現させた細胞を用いた解析では、 CREBL1を示すバンドの減少は認められなかった（図 2— Aの上図）。また、該不活性型 HtrA2変異体と ATF6とを共発現させた細胞を用いた解析では、 ATF6を示すバンドの減少は認められな力つた（図 2— Bの上図）。細胞内における各 HtrA2 変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がな力つた（図 2— Aおよび Bの下図）。

[0127] このように、 CREBL1および ATF6はいずれも、活性型の成熟型 HtrA2 ( Δ AVP S)または活性型の成熟型 HtrA2 (GVPS)により細胞内で分解されることが明らかになった。一方、 CREBL1および ATF6はいずれも、不活性型の成熟型 HtrA2 (S30 6A、 AAVPS)または不活性型の成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)では分解されなかった。

実施例 4

[0128] (HtrA2による分解パターンの検討）

HtrA2による CREBL1の分解パターンを検討した。検討は、ピオチン化した CRE BL1を用いて、 HtrA2によるインビトロプロテアーゼアツセィにより行った。

[0129] <材料およびその調製 >

1.成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)

成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)は、実施例 2と同様の方法で調製したものを用いた。

[0130] 2. CREBL1動物細胞発現プラスミド

CREBL1動物細胞発現プラスミドは、 pCR— Bluntll— TOPOベクターに実施例 2 と同様の方法でクローユングした CREBL1を BamHIと Xholで消化し、 pcDNA3. 1 /Hisに組込むことにより取得した。

[0131] 3.インビトロ翻訳反応系を用いたピオチンィ匕 CREBL1の調製

ピオチンで標識された CREBL1の調製は、ゥサギ網状赤血球ライセート (rabbit r eticulocyte lvsate)を用いたインビトロ翻訳反応系（T T^¾ftffi Transcription/

N

Translation System； Promega社:^)で？ Tつ 7こ。

具体的にはまず、インビトロ翻訳反応溶液 (T T^¾ftffi Quick Master Mix) 40 μ 1に CREBL1動物細胞発現プラスミド（1 gZ 1) 1. 5 1、 ImM メチォニン 1 μ 1、ビォチン化リジン tRNA (Promega社製） 1 1、ヌクレアーゼを含まない水（Nucle ase free water) 6. 5 1をカ卩えて全量 50 1とし、 30°Cで 1. 5時間反応させた。その後、反応液 50 1から 12. 5 1を採取し、 2 X SDS サンプルバッファーを力卩ぇ煮沸処理後、ウェスタンブロッテイングにより、ピオチンでラベルされた CREBL1の発現を検出した。検出は、ストレプトアビジン HRP (Promega社製）、 Transcend™ Ch emiluminescent substrate (Transcend Non— Radioactive Translation detection system; Promega社製）を用いて行った。その結果、いずれもピオチン化されて!/ヽることが確認できた。

[0132] <方法 >

上記反応液をプロテアーゼアツセィの試料として用いた。反応液は 12. 5 1ずつ 3 本のチューブ（No. 2— 4)に分注した。 No. 2のチューブにはコントロールとして、 50 mM Tris-HCl(pH7. 5)、 150mM NaCl、 0. 01% TritonX— 100を 25 1、 N o. 3のチューブには 200 gZmlの成熟型 HtrA2溶液を 25 1、 No. 4のチューブには 200 μ gZmlの成熟型 HtrA2 (S306A)溶液 25 μ 1をそれぞれ加え混合した。各チューブ（No. 2— 4)をさらに半量ずつ分注し、 1つのチューブは 37°Cで 4時間反応し、もう一方のチューブは、 37°Cで一晩反応させた。反応後、各チューブに 2 X S DS サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウェスタンブロッテイングにより、ビォチン化 CREBL1の分解パターンを検出した。

[0133] 分解の検出は、 CREBL1内部のピオチンィ匕されたリジン残基を指標にして、ストレプトアビジン一 HRPおよび Transcend. Chemiluminescent substrateを用いて行った。

[0134] さらに分解箇所を調べる為、ウェスタンブロッテイングに用いたメンブレンから、ストレプトアビジン HRPを除去し、 CREBL1の N末に付カ卩された Tagに対する抗体で、ピオチンィ匕 CREBL1の分解パターンを検出した。抗体は、 1次抗体として抗 Xpress 抗体 (Invitrogen社製)を、 2次抗体として HRP標識ィ匕抗マウス IgG抗体 (Cell Sig naling社製）を用いた。分解の検出は、 ECL Western Blotting Detection R eagents (Amersham社製)を用いて行った。 [0135] <結果>

CREBL1内部のピオチンィ匕されたリジン残基を指標に、成熟型 HtrA2による CRE BL1の分解パターンを検討した結果を図 3に示した。また、 CREBL1の N末に付カロされた Tagを指標として、 CREBL1の分解パターンを検討した結果を図 4に示した。

[0136] ピオチンィ匕されたリジン残基を指標にした分解パターンの検討において、ピオチン化 CREBL 1を示すバンドの著、減少が認められ、さら〖こ 50kDa近辺〖こ CREBL 1 分解産物と考えられるバンドが検出された（図 3)。しかし、抗 Tag抗体による分解バターンの検討では、図 3で認められた 50kDa近辺の CREBL1分解産物と考えられるバンドだけでなぐ別のサイズの CREBL1分解産物を示すバンドも全く検出できなかつた（図 4)。このことから、 CREBL1は HtrA2により数箇所で切断されて分解されたと考えられる。

[0137] このように、 CREBL1内部を標識ィ匕して標識物質を検出することにより、 HtrA2による CREBL1の分解が検出された。このことから、 CREBL1の N末に付カ卩した Tagの検出により明らかになった HtrA2による CREBL1の分解（実施例 2および 3)は、 Ta gが切断分離されたことによる見かけ上の分解ではなぐ HtrA2が CREBL1に作用してそのペプチド結合を切断した結果生じた分解であることが判明した。

実施例 5

[0138] (HtrA2と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）

[0139] 解析の結果、 HtrA2と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、 HN F— 4 αを見出した。

実施例 6

[0140] (インビトロプロテアーゼアツセィ） HNF-4 aと HtrA2の相互作用を実験的に検証するために、インビト口におけるプ口テアーゼアツセィを実施した。

[0141] <材料およびその調製 >

本実施例においては、活性型 HtrA2および不活性型 HtrA2としてそれぞれ、いずれも C末 Tagとしてヒスチジン (His)を付カ卩した成熟型 HtrA2 (配列番号 4)および成熟型 HtrA2 (S306A) (配列番号 6)を用いた。また、 HNF— 4 αとして、 Ν末に（6 X His) Xpress— tagを付カ卩した HNF— 4 a (配列番号 35)を用いた。

[0142] 1.成熟型 HtrA2および成熟型 HtrA2 (S306A)

[0143] 2. HNF-4 a発現プラスミドの作製

HNF— 4 αについては、まず Human Brain polyA^TRNAを铸型として PCR法により HNF— 4 α遺伝子を増幅させた。 PCRエラーと思われる塩基置換は、 QuickC hange Site-Directed Mutagenesis kit (STRATAGENE社製）により修正した。その後、 N末に（6 X His)— Xpress— tagを付加させる動物細胞用発現プラスミド pcDNA3. 1/His (Invitrogen社製）に糸且込み、 HNF— 4 a発現プラスミド（HNF— 4 a /pcDNA3. l/His)を構築した。なお、クロー-ングした HNF— 4 a DNAによりコードされる推定アミノ酸配列は、スイスプロットデータベース（Swiss— Prot dat abase)のァクセッションナンバー P41235 (登録遺伝子名は HNF4A)に開示された HNF-4 aのアミノ酸配列と同一であつた。本実施例で得られた HNF— 4 a DNA の塩基配列および該 DNAによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 34および配列番号 35に記載した。

[0144] 上記 HNF— 4 a発現プラスミドを用いて、 EcoRIサイトで、 HNF— 4 aの DNA配列を N末に FLAG— tagを付加させる動物細胞用発現プラスミド pCMV— Tag2 (STRA TAGENE社製）に糸且換えを行ヽ、 HNF-4 a発現プラスミド（HNF—4 a /pCMV— Tag2)を構築した。

[0145] 3. HNF— 4 αの調製

トランスフエクシヨン前日に細胞数 1. 5X 10Vl0cm ディッシュ（Dish)とした HE K293T細胞に、 HNF— 4 a発現プラスミドを FuGene6 (Roche社製）にて導入した（ lO

o 48時間後、細胞を PBSで洗浄し、 1mlのリシスバッファー B (50m M Tris— HCl (pH7. 6)、 150mM NaCl、 1% トライトン X— 100、 1% ノ-デット P— 40 (NP-40)、コンプリートミニ (Complete Mini, EDTA不含）を添加し氷上で 10分間静置した。その後、スクレーパーで細胞を集め、 1. 5mlのチューブに入れ、氷冷下でソ-ケーシヨン処理（15秒 X 6回）を行い、氷中で 20分静置後、ピベッティングで懸濁し、遠心処理（15, 000rpm、 30分間、 4°C)により可溶性画分と不溶性画分を分離した。検討用試料として、可溶性画分 (以下、 HNF - 4 α可溶性画分と称する）を用いた。

[0146] <方法 >

HNF-4 a可溶性画分に含まれる夾雑蛋白質の影響を除くために免疫沈降にて榭脂に捕捉した HNF— 4 aを実験に用いた。具体的には、まず、 HNF— 4 a可溶性画分 300 μ 1を 6本のチューブ（No. 1-6)に分注し、各チューブに BSAでブロッキングした 50%スラリーのプロテイン G セファロース 4 FF (Amersham社製）を 20 1 添加し、 4°Cで 1時間転倒混和後、遠心処理（10, 000rpm、 10秒間、 4°C)にて上清を回収し前処理 (pre— clean)を行った。得られた上清に抗 FLAG抗体（Sigma社製)を 0. 4 1 (2 g)添加し、 4°Cで 3時間転倒混和後に、 BSAでブロッキングしたプ口ティン G セファロース 4 FFを 20 1添カ卩し 4°Cで 1晚転倒混和し、プロテイン G セファロース 4 FFに HNF— 4 αを捕捉した。

[0147] 次に HNF— 4 αが捕捉されたプロテイン G セファロース 4 FFを 500 1の洗浄バッファー（50mM Tris— HCl (pH7. 5)、 150mM NaCl、 0. 01 % トライトン X— 100)で 5回洗浄した後、 No. 1および 2のチューブには 50mM Tris— HCl (pH7. 5)、 150mM NaCl、0. 01% トライトン X— 100を、 No. 3および 4のチューブには 50 μ gZmlの成熟型 HtrA2溶液 100 μ 1を、 No. 5および 6のチューブには 50 μ g Zmlの成熟型 HtrA2 (S306A)溶液 100 /z lをそれぞれ加えた。 No. 1、 3および 5 のチューブは 37°Cで 4時間、 No. 2、 4および 6のチューブはー晚反応させた後、遠心処理により上清を除去して 500 1の洗浄バッファ一にて 3回、遠心洗浄を行い、 2 X SDS サンプルバッファー（j8—メルカプトエタノール 0. 1 %含む）を 80 1加え煮沸処理した。得られた試料 80 1のうち 1を使用し、 SDS-PAGE後、 PVDF膜へ転写し、ウェスタンブロッテイングにより、 HNF— 4 αを検出した。検出用の 1次抗体として抗 FLAG抗体（Sigma社製）を、 2次抗体としてホースラディッシュパーォキシダーゼ (HRP)標識した抗マウス IgG抗体 (Cell Signaling社製)を用、た。また、検出は ECL Western Blotting Detection System (Amersham社製）を用いて実施した。

[0148] <結果>

HNF-4 aが成熟型 HtrA2によりインビトロで分解されることを認めた。図 5に示すように、活性型 HtrA2と HNF— 4 aを 1晚（OZN)反応させることにより、 HNF— 4 a を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型 HtrA2 (成熟型 HtrA2 (S306A) ) による HNF— 4 aの分解は認められなかった（図 5)。

実施例 7

[0149] (細胞内におけるプロテアーゼアツセィ）

HNF-4 aと HtrA2の相互作用を細胞内におけるプロテアーゼアツセィにより検討した。

[0150] <材料およびその調製 >

HNF-4 a発現用プラスミドとして、実施例 6で作製した HNF— 4 a動物細胞発現用プラスミド（HNF— 4 a ZpCMV— Tag2)を用いた。また、 HtrA2発現用プラスミドとして、実施例 3で作製した成熟型 HtrA2 ( A AVPS)発現用プラスミド、成熟型 Htr A2 (GVPS)発現用プラスミド、成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)発現用プラスミドおよび成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)発現用プラスミドを用いた。

[0151] <方法 >

各種 HtrA2発現プラスミドと HNF— 4 α発現プラスミドは、トランスフエクシヨン前日に細胞数 5 X 10⁵/6cm Dishとした HEK293T細胞に FuGene6 (Roche社製）を用いて導入した。各種 HtrA2発現プラスミドはそれぞれ、 HNF— 4 α発現プラスミドと組合せて、いずれも 1 μ gZDish添カ卩した。 48時間後、各種 HtrA2と HNF— 4 aとを共発現させた細胞に、 200 μ 1のリシスバッファー Βと 2 X SDS サンプルバッファー（ j8—メルカプトエタノール 0. 1%含む）を等量カ卩え、ソ-ケーシヨン後、煮沸処理したものを検討用試料とした。

[0152] 上記各検討用試料 10 1を用いてウェスタンブロッテイングにより、 HNF-4 aの発現並びに HNF— 4 aの分解の有無を検出した。検出用の 1次抗体として抗 FLAG抗体 (Sigma社製)を、 2次抗体としてホースラディッシュパーォキシダーゼ (HRP)標識した抗マウス IgG抗体（Cell Signaling社製）を用いた。検出は、 ECL Western Blotting Detection Systemを用ヽて実；した。

[0153] <結果>

プロテアーゼ活性を有する活性型変異体 (成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または成熟型 HtrA2 (GVPS) )と HNF— 4 aとを共発現させた細胞を用いた解析では、 HNF— 4 αを示すバンドが著しく減少した（図 6)。一方、不活性型 HtrA2変異体 (成熟型 Ht rA2 3306 ( 八¥?3)または成熟型1¾八2 S 306 (GVPS) )と HNF— 4 αとを共発現させた細胞を用いた解析では、 HNF— 4 aを示すバンドの減少は認められなかつた（図 6)。

[0154] このように、 HNF— 4 aは活性型の成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)または活性型の成熟型 HtrA2 (GVPS)により細胞内で分解されることが明らかになった。一方、 HNF— 4 aは不活性型の成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)または不活性型の成熟型 Htr A2 (S306A、 GVPS)では分解されなかった。

産業上の利用可能性

[0155] 本発明は、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解に基づく糖尿病の防止および Zまたは治療、並びに CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解に基づく細胞死（例えば脾臓 β細胞の細胞死）の阻害のために利用可能であり、医薬分野において非常に有用性が高い。

配列表フリーテキスト

[0156] 配列番号 1 : HtrA2前駆体蛋白質をコードする DNA。

配列番号 2： HtrA2前駆体蛋白質。

配列番号 3：成熟型 HtrA2をコードする DNA。

配列番号 4 :成熟型 HtrA。

配列番号 5：配列番号 3と同じ塩基配列であってその 520位の塩基力 ½である塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型 HtrA2 (S306A)をコードする DNA。

配列番号 6：配列番号 4と同じアミノ酸配列であって 174番目のアミノ酸残基が Alaに置換したアミノ酸配列力もなるポリペプチド;成熟型 HtrA2 (S306A)。

配列番号 7：配列番号 3と同じ塩基配列であってその 4 15位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)をコードする DNA。配列番号 8：配列番号 4と同じアミノ酸配列であって 2— 5番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列力なるポリペプチド；成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)。

配列番号 9 :配列番号 3に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその 5位の塩基力 ½であるポリヌクレオチド；成熟型 HtrA2 (GVPS)をコードする DNA。

配列番号 10：配列番号 4と同じアミノ酸配列であって 2番目のアミノ酸残基が Glyに置換したアミノ酸配列力なるポリペプチド；成熟型 HtrA2 (GVPS)。

配列番号 11：配列番号 5と同じ塩基配列であってその 4 15位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド;成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)をコードする

DNA₀

配列番号 12：配列番号 6と同じアミノ酸配列であって 2— 5番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型 HtrA2 (S306A、 Δ AVPS)。配列番号 13：配列番号 5に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその 5位の塩基力 ½であるポリヌクレオチド成熟型； HtrA2 (S306A、 GVPS)をコードする DNA。配列番号 14：配列番号 6と同じアミノ酸配列であって 2番目のアミノ酸残基が Glyに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型 HtrA2 (S306A、 GVPS)。

配列番号 15 : CREBL1をコードする DNA。

配列番号 16 : CREBL1。

配列番号 17： ATF6をコードする DNA。

配列番号 18 :ATF6。

配列番号 19：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ!/、て、成熟型 HtrA2 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 20：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ!/、て成熟型 HtrA2 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。配列番号 21：配列番号 3に記載の塩基配列に基づいて、成熟型 HtrA2 (S306A) DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 22：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ、て、成熟型 HtrA2 (S306A) DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 23：配列番号 15に記載の塩基配列に基づ、て. CREBL1 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 24：配列番号 15に記載の塩基配列に基づヽて. CREBL1 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 25：配列番号 15に記載の塩基配列に基づヽて. CREBL1 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 26：配列番号 15に記載の塩基配列に基づヽて. CREBL1 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 27：配列番号 17に記載の塩基配列に基づヽて. ATF6 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 28：配列番号 17に記載の塩基配列に基づヽて. ATF6 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 29：配列番号 17に記載の塩基配列に基づヽて. ATF6 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 30：配列番号 17に記載の塩基配列に基づヽて. ATF6 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 31：配列番号 17に記載の塩基配列に基づ!/、て、 ATF6 DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 32：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ!/、て、成熟型 HtrA2 ( Δ AVPS)

DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 33：配列番号 3に記載の塩基配列に基づ、て、成熟型 HtrA2 (GVPS) DNAを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。

配列番号 34： HNF-4 aをコードする DNA。

配列番号 35： HNF-4 a。

Claims

請求の範囲

[1] HtrA2 (ハイテンパレイチヤーリクワイアメントプロテイン A2、high temperat ure requirement protein A2)の機能を阻害することを特徴とする、 CREBL1 ( サイクリック AMP レスポンシブエレメントノインディングプロテインライク l、c AMP responsive element binding protein— like 1)、 ATF6、クアィベーティングトランスクリプションファクター 6、 activating transcription factor 6 )および HNF— 4 α (へパトサイトヌクレア一ファクター 4 , hepatocyte nucle ar factor 4 a )のうちの少なくとも 1の分解阻害方法。

[2] HtrA2の機能を阻害することが CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による切断を阻害することであり、ここで CREBL1の HtrA2による切断を阻害することにより CREBL1の分解が阻害され、 ATF6の HtrA2による切断を阻害することにより ATF6の分解が阻害され、および、 HNF— 4 aの HtrA2による切断を阻害することにより HNF— 4 aの分解が阻害される請求項 1に記載の CREBL1、 A TF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法。

[3] HtrA2の機能を阻害することが CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1と HtrA2の相互作用を阻害することであり、ここで CREBL 1と HtrA2の相互作用を阻害することにより CREBL1の分解が阻害され、 ATF6と HtrA2の相互作用を阻害することにより ATF6の分解が阻害され、および、 HNF— 4 αと HtrA2の相互作用を阻害することにより HNF— 4 aの分解が阻害される請求項 1に記載の CREBL1、 A TF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法。

[4] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法。

[5] 請求項 1から 3のいずれか 1項に記載の CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法。

[6] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法。

[7] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤。

[8] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物の同定方法であって、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を可能にする条件下、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1および Zまたは HtrA2をある化合物 (被検化合物）と接触させ、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1を検出することができるシグナルおよび Ζマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Ζマーカーの存在若しくは不存在および Ζまたは変化を検出することにより、被検化合物が CREB Ll、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。

[9] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物の同定方法であって、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を可能にする条件下、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1および Zまたは HtrA2をある化合物 (被検化合物）と接触させ、 CREBL1、 ATF6および HNF— 4 αのうちの少なくとも 1の存在若しくは不存在の検出および Ζまたはその量の変化の測定により、あるいは CREBL1、 ATF6および HNF-4 aのうちの少なくとも 1の分解物の存在若しくは不存在の検出および Zまたはその量の変化の測定により、被検化合物が CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の分解を阻害するカゝ否かを決定することを特徴とする同定方法。

[10] CREBL1、 ATF6および HNF— 4 aのうちの少なくとも 1の HtrA2による分解を阻害する化合物の同定方法が、糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤の有効成分である化合物の同定方法である、請求項 8または 9に記載の同定方法。

[11] CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害方法。

[12] CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上用いることを特徴とする細胞死阻害方法。

[13] 細胞死が脾臓 β細胞の細胞死である請求項 11または 12に記載の細胞死阻害方法

[14] CREBL1および Zまたは ATF6の HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる細胞死阻害剤。

[15] 細胞死が脾臓 β細胞の細胞死である請求項 14に記載の細胞死阻害剤。

[16] 請求項 11から 13のいずれ力 1項に記載の細胞死阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および Ζまたは治療方法。

[17] HNF-4 aの HtrA2による分解を阻害することを特徴とする 2型糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法。

[18] HNF-4 aの HtrA2による分解を阻害する化合物を 1つ以上含んでなる 2型糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤。

[19] HtrA2、 HtrA2をコードするポリヌクレオチドおよび HtrA2をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1と、 CREBL1、 ATF6、 HNF—

4 a、 CREBL1または ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチド、および

CREBL1または ATF6または HNF— 4 aをコードするポリヌクレオチドを含有するべクタ一のうちの少なくともいずれか 1とを含んでなる試薬キット。