WO2005014147A2 - Verfahren zur isolierung von metall-cofaktoren aus biologisch-organischen systemen unter anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen polyacrylamid-gelelektrophorese (pnc-page) - Google Patents

Verfahren zur isolierung von metall-cofaktoren aus biologisch-organischen systemen unter anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen polyacrylamid-gelelektrophorese (pnc-page) Download PDF

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture

Definitions

  • the invention relates to a method for isolating metal cofactors from biological-organic systems using preparative native continuous (PNC) polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • PNC preparative native continuous
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • the preparative purification and isolation of proteins from biological-organic samples is particularly problematic.
  • the soluble fractions must first be extracted from this matrix by cell disruption in an aqueous medium. The biological activity of the molecules is preserved through sample cooling.
  • the dissolved substances which are in the cytosol, are stored over liquid nitrogen in order to exclude a chemical change of the present species and to ensure permanent preservation.
  • the cytosols are usually first subjected to a chromatographic purification step.
  • GPC gel permeation chromatography
  • the sample is separated according to molecular mass.
  • element contents are determined in the individual GPC fractions using element-analytical methods (for example atomic absorption spectrometry) in order to make a statement about the distribution of individual elements via the detected to reach ten molecular mass ranges (element species analysis).
  • element-analytical methods for example atomic absorption spectrometry
  • element-analytical methods for example atomic absorption spectrometry
  • element-analytical methods for example atomic absorption spectrometry
  • element-analytical methods for example atomic absorption spectrometry
  • elute in the high molecular weight range > 10 kDa
  • This analytical step is very important because in the realm of proteins there are enzymes whose active center is a metal ion.
  • proteins are amphoteric compounds, the charged groups in the molecule are arranged differently at different isoelectric points. With PNC-PAGE, the molecules are separated according to their isoelectric points. Native means that the proteins in this process may neither be changed structurally nor in their elemental composition. Continuously refers to the buffer system used in the PNC-PAGE. This means that both the cathode and the ano- the buffers have the same composition and the same pH value. The same buffer is also used to make the gel.
  • the PNC-PAGE method is generally used to purify the high molecular weight cadmium species after charging. This can be carried out, for example, using the "Model 491 Prep Cell” (U.S. patent number 4,877,510) from Bio Rad [2,3].
  • the object of the invention is therefore to develop a new PNC-PAGE method compared to the prior art, which makes it possible to isolate proteins containing cofactor from biological-organic systems.
  • cofactors from the group of cadmium, zinc, palladium, iron, copper, nickel, cobalt, manganese, chromium, molybdenum and platinum are to be isolated.
  • the further advantageous embodiment of the electrophoresis buffer with a pH of 10.00 according to claim 1 has the effect that all proteins with isoelectric points below 10.00 (pl ⁇ 10.00) are negatively charged and migrate to the anode.
  • the advantageous period of 69 hours for the polymerization of the gel according to claim 1 means that no reactive monomers are present in the gel during the electrophoretic purification of the proteins. This prevents the metal cofactors of the biological-organic systems to be examined from undergoing a chemical reaction with residual monomers or other substances involved in the reaction in the gel, which can lead to denaturation of the proteins.
  • Tris-HCl buffer stock solution 200 mmol / L Tris, pH 10.00; 10 mmol / L NaN 3 ) and 32 mL ultrapure water
  • the gel solution After pouring the gel to a height of 4 cm, the gel solution is covered with an airtight layer of 3 mL 2-propanol for 60 minutes. After about an hour, the isopropanol is stripped off and the gel surface is rinsed with 8 ⁇ 4 ml of Tris-HCl buffer (pH 10.00; 20 mM Tris; 1 mM NaN 3 ) and then covered with a layer of 4 ml of this buffer. Under these conditions, the gel was completely polymerized at room temperature over a period of 69h00 " Siert. The electrophoretic lead was then carried out immediately.
  • Tris-HCl buffer pH 10.00; 20 mM Tris; 1 mM NaN 3
  • the gel column diameter is, for example, 28 mm.
  • a Tris-HCl buffer (20 mM Tris, 1 mM NaN 3 , pH 10.00) can be selected as the electrophoresis buffer of the continuous buffer system.
  • the electrolyte concentration is selected so that the proteins do not have to be used to conduct the current.
  • the volume of the cathode buffer is 500 mL, that of the anode buffer is 2000 mL.
  • the "Model 491 Prep Cell” from Bio Rad with its components, consisting of the upper and lower buffer chamber, the cooling finger, the gel column, the elution chamber with a dialysis membrane (molecule exclusion: 6000 Da) and the gel pouring stand can be used for electrophoresis become.
  • a DC voltage source e.g. PowerPAC 1000, BioRad
  • a peristaltic pump e.g. Model EP-1 Econo Pump, BioRad
  • a fraction collector e.g. Model 2110, BioRad
  • a UV -Detector e.g. Model EM-1 Econo UV Monitor, BioRad
  • a recorder e.g. Model 1327 Econo Recorder, BioRad
  • an um- roller pump e.g. Buffer Recirculation Pump, BioRad
  • the system should be cooled, e.g. B. in a refrigerator at 4 ° C.
  • Circulation pump flow rate (95 mL / min)
  • the electrophoretic lead can last for example 80 minutes. After 75 minutes of the lead, the electrophoretic process can be interrupted by turning off the power. The sample can now be carefully underlaid within 5 minutes. When the 80 minute limit is reached, the actual electrophoretic purification of the proteins can be started.
  • the method according to the invention represents a very sensitive analytical system.
  • the cofactor of the corresponding enzyme transports the complexed metal species from the cell to the organ's excretory organs.
  • the remaining apoenzyme is denatured.
  • a suitable chelating agent already used in metal poisoning is "Berliner Blau". This substance is, for example, able to complex thallium ions in vivo, which are then further excreted via the gastrointestinal tract. Günther and Kastenholz have an overview of the speciation of thallium in book contributions [8 ] and zinc [9] in clinical samples.
  • the biochemical behavior and the effect of elements in biological organisms are determined by the present element species. Therefore, elemental species analysis of clinical matrices plays an important role in the differential diagnosis of diseases.
  • the qualitative determination of the metal cofactor and its stoichiometry represents an important step in the classification of metal enzymes and metal proteins [10]. Equally important in PNC-PAGE is the question of whether, after the purification and isolation of an enzyme, not only a certain metal ion is bound by this substance, but whether other metals can also be present in the active center of a molecule.
  • a buffer system that maintains enzyme activity under these conditions is, for example, a HEPES buffer (N-2-hydroxyethylpiperazine-N ⁇ - 2-ethanesulfonic acid).
  • Isolation of an Iron Cofactor from Plant Cells Medically active enzymes are to be isolated from plant cells. The leaves of the plant are prepared according to the method known to the person skilled in the art and the resulting cytosols are stored in polypropylene tubes in cryoracks in a container for storing samples at low temperatures [5].
  • the GPC fractions are measured using a multi-element analysis method (eg ICP-MS, TXRF). Different forms of element bonding, which are distributed over different molecular weight ranges, are analyzed in the individual fractions. For example, there are 3 iron species with a molecular mass of 20, 50 and 70 kDa at the elution maximum and 2 copper species as well as other element bonding forms (multi-element species analysis).
  • the cytosols are incubated with a proteinase and then separated using a GPC method.
  • the fractions are again analyzed using ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy). It turned out that the smallest iron species is no longer visible in the chromatogram after protease treatment of the cytosol. This verifies that the 20 kDa iron bond form is a protein.
  • the GPC fraction with the highest iron content of this iron species is further purified and isolated using the PNC-PAGE method according to the invention. An iron peak is shown in the electropherogram.
  • the associated fraction with the highest iron content, which contains the isolated iron protein, can now be used for identification and structural analysis.
  • MALDI-TOF-MS atrix-assisted laser desorption i-onization - time of flight mass spectroscopy
  • iron in this case acts as a co-factor of an enzyme which is said to have a positive effect on metabolic processes in the human organism, it can now be produced in large quantities in an industrial-pharmaceutical manner because of its precise genetic identification made possible by the method according to the invention. For example, there is the possibility here of having biotechnological production of the enzyme carried out by microorganisms.
  • a zinc protein that elutes in the range of 180 kDa is also with the PNC-PAGE- according to the invention

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen unter Anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PNC-PAGE), dadurch gekennzeichnet, dass ein Acrylamidgel mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4 % (w/v) eingesetzt wird, ein Elektrophoresepuffer mit einem pH-Wert von 10,00 eingesetzt wird, sowie 0,5 µl TEMED/ml Gel und 5µl APS/ml Gel eingesetzt werden, wobei das Gel über einen Zeitraum von 69 Stunden auspolymerisiert wird.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur Isolierung von Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen unter Anwendung der präpa- rativen nativen kontinuierlichen Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PNC-PAGE)
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen unter Anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen (Preparative Native Continuous = PNC) Poly- Acrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) .
Die Protein- und Enzymforschung hat im Rahmen der aktuellen wissenschaftlichen Diskussionen eine überragende Bedeutung. Zum Beispiel ergeben sich auf den Gebieten der pharmazeutischen, medizinischen, biochemischen und biologischen Grundlagenforschung häufig Fragestellungen, die versuchen, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion von Proteinen und Enzymen in biologischen Systemen zu klären.
Bei der Lösung dieser lebenswissenschaftlichen Fragen spielt die Entwicklung und Anwendung von Methoden oder Verbundverfahren, die aus dem Gebiet der analytischen Chemie kommen, eine entscheidende Rolle. Um die Bedeutung eines Proteins oder Enzyms, das aus einem pflanz- liehen, tierischen, menschlichen oder einem Mikroorganismus stammt, zu bewerten, muss das Protein zunächst mit Hilfe analytischer Methoden aufgereinigt und isoliert werden. Dieser Prozess darf nicht einhergehen mit einer chemischen Veränderung der Proteinstruktur. Ebenso muss die elementare Zusammensetzung des Moleküls erhalten bleiben, da ansonsten keine gültige Aussage im Hinblick auf die Funktion eines Proteins getroffen wer- den kann.
Als besonders problematisch stellt sich in diesem Zusammenhang die präparative Aufreinigung und Isolierung von Proteinen aus biologisch-organischen Proben dar. Bei festen Biomatrices, wie z. B. Pflanzen, müssen zunächst die löslichen Anteile aus dieser Matrix durch einen Zellaufschluss in einem wässrigen Medium extrahiert werden. Durch Probenkühlung bleibt die biologische Aktivität der Moleküle gewahrt.
Nach Trennung der festen und flüssigen Fraktionen, z. B. durch Zentrifugation in einer KühlZentrifuge, werden die gelösten Substanzen, die sich im Cytosol befinden, über flüssigem Stickstoff gelagert, um eine chemische Veränderung der vorliegenden Spezies auszuschließen und eine dauerhafte Konservierung zu gewährleisten.
Die Cytosole werden üblicherweise zunächst einem chro- matographischen Aufreinigungsschritt unterworfen. Idealerweise wird zu diesem Zweck die Gelpermeationschro- matographie (GPC) eingesetzt. Dabei wird die Probe nach Molekularmasse aufgetrennt. Als weiterer Schritt werden in den einzelnen GPC-Fraktionen Elementgehalte mit ele- ment-analytischen Methoden (z. B. der Atomabsorpti- onsspektrometrie) bestimmt, um eine Aussage über die Verteilung von einzelnen Elementen über die detektier- ten Molekularmassenbereiche zu erreichen (Elementspeziesanalytik) . Häufig eluieren im hochmolekularen Bereich (> 10 kDa) nach einer GPC Proteine, die beispielsweise Metalle enthalten. Dieser analytische Schritt ist sehr bedeutend, weil im Reich der Proteine Enzyme vorkommen, deren aktives Zentrum ein Metallion ist. Die qualitative Ermittlung dieser Metall-Cofak- toren und deren Stöchiometrie stellt einen wichtigen Schritt bei der Klassifizierung von Metall-Enzymen und Metall-Proteinen dar.
Nach einer GPC ist es wichtig, eine weitere Dimension zur Trennung von Molekülen einzusetzen, um ein bestimmtes Protein aufzureinigen und zu isolieren. Ist in einer hochmolekularen Fraktion mit der höchsten Konzentration eines bestimmten Metalls ein Protein nachgewiesen worden, so besteht die Möglichkeit, diese Fraktion mit Hilfe der präparativen nativen kontinuierlichen (Preparative Native Continuous = PNC) Poly- Acrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) weiter aufzutrennen.
Da es sich bei Proteinen um amphotere Verbindungen handelt, sind die geladenen Gruppen im Molekül bei unter- schiedlichen isoelektrischen Punkten verschieden angeordnet. Bei der PNC-PAGE erfolgt somit eine Trennung der Moleküle nach ihren isoelektrischen Punkten. Nativ bedeutet, dass die Proteine bei diesem Prozess weder strukturell, noch in ihrer elementaren Zusammensetzung verändert werden dürfen. Kontinuierlich bezieht sich auf das bei der PNC-PAGE verwendete Puffersystem. Das bedeutet, dass sowohl der Kathoden- als auch der Ano- denpuffer die gleiche Zusammensetzung und den gleichen pH-Wert aufweisen. Der gleiche Puffer wird ebenfalls für die Herstellung des Gels verwendet.
Aus dem Stand der Technik [1] , ist eine analytische Methode bekannt, die sich mit der Aufreinigung und Charakterisierung von hochmolekularen Cadmiumbindungsfor- men aus pflanzlichen Lebensmitteln beschäftigt. Nach einer GPC der Pflanzencytosole wurden in den Pflanzen hochmolekulare Cadmiumspezies (HM-Cd-SP) de- tektiert, die ein Molekulargewicht von ungefähr 200 kDa aufwiesen. Es wurde festgestellt, dass es sich bei diesen Cadmiumspezies um Proteine handelt .
Um eine Veränderung der hochmolekularen Cadmiumspezies nach der GPC sicher auszuschließen, werden üblicherweise vor einer elektrophoretischen Aufreinigung dieser Substanzen keine weiteren Aufkonzentrierungsschritte, z. B. durch Ultrafiltration oder Lyophilisation der entsprechenden GPC-Fraktionen, durchgeführt. Mögliche Kontaminationen oder Veränderungen der vorliegenden Speziesgleichgewichte durch weitere analytische Schritte sind ebenso ausgeschlossen.
Für die Aufreinigung der hochmolekularen Cadmiumspezies nach Ladung wird im allgemeinen die PNC-PAGE-Methode eingesetzt. Diese kann beispielsweise mit Hilfe der „Model 491 Prep Cell" (U.S. patent number 4,877,510) der Firma Bio Rad [2,3] durchgeführt werden.
Die mit der PNC-PAGE aufgetrennten hochmolekularen Cadmiumbindungsformen wurden zwar stets an der gleichen Stelle im Elektropherogramm detektiert, jedoch wies die Methode den Nachteil auf, dass die Metall-Cofaktoren bzw. Cadmium-Konzentrationen in diesen Fraktionen so gering waren, dass die Ergebnisse dieser Versuche als halb quantitativ eingestuft wurden [1] .
Aufgabe der Erfindung ist es daher, im Vergleich zum Stand der Technik eine neue PNC-PAGE-Methode zu entwickeln, die es ermöglicht, Metall-Cofaktorhaltige- Proteine aus biologisch-organischen Systemen zu isolieren. Dabei sollen insbesondere Cofaktoren aus der Gruppe Cadmium, Zink, Palladium, Eisen, Kupfer, Nickel, Co- balt, Mangan, Chrom, Molybdän und Platin isoliert werden.
Mit dem vorliegenden Verfahren ist es nunmehr möglich, niedermolekular (< 10 kDa) gebundene und hochmolekular (> 10 kDa) gebundene Metall-Cofaktoren aus biologischorganischen Systemen, wie z. B. aus Pflanzenzellen, tierischen Zellen, humanen Zellen oder Zellen von Mikroorganismen quantitativ nachzuweisen. Die nachzuweisenden Metall-Cofaktoren bleiben mit dem erfindungsgemäßen Verfahren stabil und können nahezu vollständig eluiert werden.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
Die vorteilhafte Ausgestaltung des Acrylamidgels mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4% (w = weight/v = vo- lume) gemäß Anspruch 1 bewirkt, dass Proteine bis zu einem Molekulargewicht von ca. 200 kDa ungehindert durch das Gel wandern können und nach ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt aufgetrennt werden.
Die weitere vorteilhafte Ausgestaltung des Elektropho- resepuffers mit einem pH-Wert von 10,00 gemäß Anspruch 1 bewirkt, dass alle Proteine mit isoelektrischen Punkten unter 10,00 (pl < 10,00) negativ geladen sind und zur Anode wandern.
Der vorteilhafte Zeitraum von 69 Stunden für die Auspo- lymerisation des Gels gemäß Anspruch 1 bewirkt, dass bei der elektrophoretischen Aufreinigung der Proteine keine reaktiven Monomere mehr im Gel vorliegen. Dadurch wird verhindert, dass die Metall-Cofaktoren der zu untersuchenden biologisch-organischen Systeme eine chemi- sehe Reaktion mit Restmonomeren oder anderen an der Reaktion im Gel beteiligten Substanzen eingehen können, was zur Denaturierung der Proteine führen kann.
Durch die Beschwerung der zu untersuchenden Probe mit Glycerin mit einem Volumenanteil von 10 % (v = volume/ v = volume) bezogen auf das Gesamtvolumen des eingesetzten biologisch-organischen Systems gemäß Anspruch 2, wird eine optimierte Probenkomprimierung erreicht, die zu einer verbesserten Auflösung von Proteinbanden in der erfindungsgemäßen PNC-PAGE führt. Die Peakbreite einzelner Substanzen im Elektropherogramm wird so beispielsweise minimiert.
Weitere vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben. Im Folgenden soll das erfindungsgemäße Verfahren beispielhaft beschrieben werden.
Bei der PNC-PAGE-Methode ist u. a. die Zusammensetzung des Elektrophoresegels sowie die Polymerisationsdauer dieses Gels von Bedeutung [4] .
Zur Herstellung von 40 mL eines Gels mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4 % (w/v) (= 4 % T) wurden folgende Chemikalien eingesetzt:
4 mL Acrylamid/Bis-Stammlδsung (40 %, [g/lOOmL] , Acry- lamid/Bis = 37,5:1)
4 mL Tris-HCl Pufferstammlösung (200 mmol/L Tris, pH 10,00; 10 mmol/L NaN3) und 32 mL Reinstwasser,
20 μL TEMED als Katalysator und
200 μL APS (10 %) als Starter.
Alle Chemikalien haben zum Zeitpunkt der Gelherstellung
Raumtemperatur und werden mit einem Magnetrührer für 1 Minute bei geringer Drehzahl in einem Becherglas homogenisiert. Die APS-Lösung (0,1 g Ammoniumpersulfat gelöst in 1 mL Wasser) wird jeweils frisch angesetzt.
Nach Gießen des Gels auf eine Höhe von 4 cm wird die Gellösung für 60 Minuten mit 3 mL 2-Propanol luftdicht überschichtet. Nach ca. einer Stunde wird das Isopropa- nol abgezogen und die Geloberfläche mit 8 x 4 mL Tris- HCl-Puffer (pH 10,00; 20 mM Tris; 1 mM NaN3) gespült und anschließend mit 4 mL dieses Puffers überschichtet. Unter diesen Bedingungen wurde das Gel bei Raumtemperatur über eine Zeit von 69h 00" vollständig auspolymeri- siert. Danach erfolgte unmittelbar der elektrophoreti- sche Vorlauf.
Da die Gele bei allen PAGE-Versuchen thermisch stark beansprucht sind, werden sie unter den genannten Bedin- gungen für jeden Versuch neu gegossen. Der Gelsäulendurchmesser beträgt beispielsweise 28 mm.
Als Elekrophoresepuffer des kontinuierlichen Puffersystems kann beispielsweise ein Tris-HCl-Puffer (20 mM Tris, 1 mM NaN3, pH 10,00) gewählt werden. Die Elektrolytkonzentration ist so gewählt, dass die Proteine nicht für die Leitung des Stroms in Anspruch genommen werden müssen. Das Volumen des Kathodenpuffers beträgt 500 mL, das des Anodenpuffers 2000 mL.
Als Elutionspuffer kann der gleiche Puffer (20 mM Tris, 1 mM NaN3, pH 8,00), V = 700 mL wie beim Stand der Technik [1] verwendet werden.
Für die Elektrophorese kann beispielsweise die „Model 491 Prep Cell" von Bio Rad mit ihren Komponenten, bestehend aus der oberen und unteren Pufferkammer, dem Kühlfinger, der Gelsäule, der Elutionskammer mit einer Dialysemembran (Molekül-Ausschluss : 6000 Da) und dem Gelgießstand eingesetzt werden.
Weiterhin wird eine Gleichspannungsquelle (z. B. Power- PAC 1000, BioRad) , eine peristaltische Pumpe (z. B. Model EP-1 Econo Pump, BioRad) , ein Fraktionssammler (z. B. Model 2110, BioRad), ein UV-Detektor (z. B. Model EM-1 Econo UV Monitor, BioRad) , ein Schreiber (z. B. Model 1327 Econo Recorder, BioRad) und eine Um- wälzpumpe (z. B. Buffer Recirculation Pump, BioRad) eingesetzt. Das System sollte gekühlt werden wie z. B. in einem Kühlschrank bei 4 °C.
Folgende Parameter wurden beispielhaft eingestellt :
- Peristaltische Pumpe: Fließgeschwindigkeit des Eluenten (1 mL/min) ; Fraktionsgröße (5 mL) ; Anzahl Fraktionen (80) ; Gesamtvolumen Eluent (480 mL) ; Wait-Volumen (80 mL)
- Detektor: AUFS (1.0) Absorption unit füll scale; λ = 254 nm - Gleichspannungsquelle : Constant Power (5 W) ; Time (8 h)
Schreiber: Range (100 mV) ; Paper Speed Dial (6 cm/h)
Umwälzpumpe : Flow Rate (95 mL /min)
- Probe (2,7 mL + 0,3 mL Glycerin)
Der elektrophoretische Vorlauf kann bespielsweise 80 Minuten dauern. Nach 75 Minuten des Vorlaufs kann der elektrophoretische Prozess durch Abstellen des Stroms unterbrochen werden. Innerhalb von 5 Minuten kann nun die Probe vorsichtig unterschichtet werden. Mit Errei- chen der 80 Minuten-Grenze kann die eigentliche elektrophoretische Aufreinigung der Proteine gestartet werden .
Mit Hilfe der neu entwickelten PNC-PAGE-Methode konnten erstmals mehr als 90 % einer hochmolekularen Cadmium- spezies nach einer elektrophoretischen Aufreinigung eines Pflanzencytosols wiedergefunden werden. Dies ist ein Hinweis dafür, dass diese aufzutrennenden Cadmium- bindungsformen sich in diesem System stabil verhalten und nahezu vollständig eluiert werden können. Weiterhin wurde durch eine chromatographische Aufreini- gung der PAGE-Fraktion mit dem höchsten Cadmiumgehalt nachgewiesen, dass diese Cadmiumspezies nach einer GPC im Molekulargewichtsbereich von 200 kDa eluieren. Dies spricht ebenfalls für die Stabilität der zu untersu- chenden hochmolekularen Cadmiumspezies bei einer Auftrennung mit Hilfe der erfindungsgemäßen PNC-PAGE- Methode .
Hochmolekulare Cadmium-Proteine, die im Molekularmas- senbereich von ungefähr 200 kDa eluieren, wurden nach einer GPC eines Pflanzencytosols weiter mit der erfindungsgemäßen PNC-PAGE-Methode aufgereinigt . Als Ergebnis zeigte sich, dass diese hochmolekularen Cadmiumspezies in einem von der Basislinie getrennten und spitz zulaufenden Peak in wenigen Fraktionen im Elektropherogramm eluiert werden konnten. Dieses Ergebnis wurde reproduziert. Es deutet darauf hin, dass es sich bei den hochmolekularen Cadmiumspezies um ein bestimmtes Cadmium-Protein handelt.
Nach Auftrennung von pflanzlichen Cytosolen an einer GPC-Säule sind bestimmte Elementspezies bereits sehr hoch aufgereinigt . Somit werden nach Anwendung einer ersten Trennung nach Molekülgröße positive Ergebnisse bei der Strukturaufklärung bestimmter Substanzen erhalten. Da Proteine nicht nur als Monomer, sondern auch als polymere Proteine in biologischen Proben vorkommen, wird postuliert, dass z. B. die hochmolekularen Cadmiumspezies nach einer GPC als Polymere (* 200 kDa) vorliegen. Nach einer weiteren Auftrennung der entsprechenden GPC-Fraktion mit der PNC-PAGE werden diese Spe- zies als Monomer (« 67 kDa) detektiert. In diesem Fall würde es sich bei den hochmolekularen Cadmiumspezies um ein Trimer handeln, das einen unterschiedlichen isoelektrischen Punkt (pl) im Vergleich zum zugehörigen Monomer hat .
Sowohl bei der in der Literatur [1] beschriebenen Probenvorbereitung der Pflanzen als auch bei den folgenden Aufreinigungsschritten zur Isolierung von Metall- Proteinen können die jeweils vorliegenden Spezies- gleichgewichte stark vom jeweiligen Puffer und dem pH- Wert beeinflusst werden. Deshalb werden die Pflanzenextraktion und die eingesetzten Aufreinigungs ethoden mit einem Puffer (pH 8,00) durchgeführt, dessen pH-Wert nahe am natürlichen pH-Wert innerhalb einer Pflanze im leicht alkalischen pH-Bereich liegt [6] . Verändert man jedoch bei einer Wurzelextraktion den pH-Wert z. B. im Bereich von pH 7 bis 9, so verändern sich auch die Metallspezies deutlich in ihrem Elutionsverhalten nach einer Aufreinigung mit der HPLC [7] .
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein sehr empfindlich reagierendes analytisches System dar. Es ist bei- spielsweise anwendbar zur Analyse hochmolekularer Cad- miumbindungsformen aus pflanzlichen Proben, die sich unter den gegebenen vorgenannten Bedingungen und insbesondere bei einem pH-Wert von 10,00 stabil verhalten.
Bei genauer Kenntnis der vorliegenden Elementbindungs- formen der Metall-Cofaktoren in biologisch-organischen Systemen ist die Entwicklung neuartiger Medikamente für die Behandlung von Vergiftungen und schweren Erkrankun- gen möglich. Neben der Durchführung einer chemischen Synthese können die entsprechenden Wirkstoffe auch aus Heilpflanzen, Algen, Pilzen und anderen Organismen gewonnen werden. Insbesondere bei der Isolierung von Arzneistoffen aus Phytosystemen spielt die PNC-PAGE daher eine sehr wichtige Rolle.
So können zum Beispiel durch Komplexierung der Metall- ionen durch Zugabe von z. B. Komplexbildnern Enzyme inaktiviert und damit ihre Wirkung im Organismus blockiert bzw. reguliert werden. Nach einer chemischen Re- aktion des Komplex- bzw. Chelatbildners mit dem Metall-
Cofaktor des entsprechenden Enzyms wird die komplexier- te Metallspezies aus der Zelle zu den Ausscheidungsorganen des Organismus transportiert. Das verbleibende Apoenzym wird denaturiert . Ein geeigneter bereits bei Metallvergiftungen eingesetzter Chelatbildner ist „Berliner Blau". Diese Substanz ist beispielsweise in der Lage, Thalliumionen in vivo zu komplexieren, die dann weiter über den Gastrointestinaltrakt ausgeschieden werden. Günther und Kastenholz haben in Buchbeiträgen eine Übersicht zur Speziation von Thallium [8] und Zink [9] in klinischen Proben verfasst . Das biochemische Verhalten und die Wirkung von Elementen in biologischen Organismen werden von den vorliegenden Elementspezies bestimmt. Daher spielt die Elementspeziesanalytik von klinischen Matrices eine bedeu- tende Rolle bei der Differential-Diagnose von Krankheiten.
Die qualitative Ermittlung des Metall-Cofaktors und dessen Stöchiometrie stellt einen wichtigen Schritt bei der Klassifizierung von Metall-Enzymen und Metall- Proteinen dar [10] . Ebenso wichtig bei einer PNC-PAGE ist die Frage, ob nach der Aufreinigung und Isolierung eines Enzyms nicht nur ein bestimmtes Metallion von dieser Substanz gebunden wird, sondern ob auch andere Metalle im aktiven Zentrum eines Moleküls vorhanden sein können.
Daher ist es sinnvoll, eine Multielement-Spezies- analytik für das erfindungsgemäße Verfahren unter Anwendung der PNC-PAGE in den einzelnen PNC-PAGE- Fraktionen der aufgereinigten Proben durchzuführen.
Kommen z. B. in Nickel-Fraktionen Zink oder weitere Metalle vor, deren Konzentrationen oberhalb der vorher ermittelten Blindwertkonzentrationen liegen, so erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass neben Nickel weitere Elemente als Co-Faktoren des isolierten Protein-Metall- Komplexes existieren.
Weiterhin muss bei der Bestimmung von Ele entbindungs- formen in den verschiedenen Matrices berücksichtigt werden, dass bestimmte Elemente ubiquitär in der Umwelt vorkommen. Daher ist bei allen analytischen Schritten darauf zu achten, dass keine Kontaminationen in die verschiedenen Systeme eingetragen werden. Bei allen Prozessen eines Analysengangs besteht die Gefahr, dass organische und anorganische Spezies durch Änderungen des pH-Wertes in einer Probe irreversibel verändert werden. Werden Puffer verwendet, können die Puffersubstanzen Wechselwirkungen mit der Probe eingehen.
Um dies auszuschließen, ist es bei der PNC-PAGE wichtig, die Eigenschaften der verwendeten Puffer zu über- prüfen. So existieren beispielsweise Substanzen, die z. B. den pH-Wert von wässrigen gefrorenen Enzymlösun- gen stabilisieren. Ein Puffersystem, das die Enzymaktivität unter diesen Bedingungen bewahrt, ist beispielsweise ein HEPES-Puffer (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N^- 2-ethanesulfonic acid) .
Um eine genaue Aufklärung der Struktur von Metall- Enzymen nach einer Isolierung mit der PNC-PAGE durchzuführen, ist es erforderlich, die Metallspezies, die sich in einer bestimmten PNC-PAGE-Fraktion befindet, zu kristallisieren.
Die dreidimensionalen Strukturen von Protein-Cofaktor- Komplexen können dann beispielsweise durch Röntgenkris- tallographie [11] aufgeklärt werden. Die Verfügbarkeit wohlgeordneter dreidimensionaler Kristalle ist Voraussetzung für eine hochauflösende Röntgenstrukturanalyse . Sie ist die einzige Methode, um detaillierte Kenntnisse über die Struktur von großen biologischen Makromolekülen zu erhalten [12] . Ausführungsbeispiele :
1. Isolation eines Eisencofaktors aus Pflanzenzellen Aus Pflanzenzellen sollen medizinisch wirksame Enzyme isoliert werden. Die Blätter der Pflanze werden entsprechend der dem Fachmann bekannten Methode vorbereitet und die resultierenden Cytosole in Polypropylen- Röhrchen in Cryoracks in einem Behälter zur Lagerung von Proben bei tiefen Temperaturen [5] gelagert.
Nach einer Aufreinigung der Cytosole an einer GPC-Säule mit einem Trennbereich von 20 bis 8000 kDa für globulä- re Proteine, werden die GPC-Fraktionen mit einer Multi- elementanalysenmethode (z. B. ICP-MS, TXRF) vermessen. Dabei werden in den einzelnen Fraktionen unterschiedliche Elementbindungsformen analysiert, die sich auf unterschiedliche Molekulargewichtsbereiche verteilen. So liegen beispielsweise 3 Eisenspezies mit einer Molekularmasse von 20, 50 und 70 kDa im Elutionsmaximum und 2 Kupferspezies sowie weitere Elementbindungsformen vor (Multielement-Speziesanalytik) .
Um festzustellen, welche der detektierten Element- Spezies Proteine sind, werden die Cytosole mit einer Proteinase inkubiert und anschließend mit einer GPC- Methode aufgetrennt . Die Fraktionen werden wieder mit der ICP-MS (inductively coupled plasma Massenspektroskopie) analysiert. Es stellte sich heraus, dass die kleinste Eisenspezies nach einer Proteasebehandlung des Cytosols nicht mehr im Chromatogramm sichtbar ist. Damit ist verifiziert, dass es sich bei der 20 kDa Eisenbindungsform um ein Protein handelt . Die GPC-Fraktion mit dem höchsten Eisengehalt dieser Eisenspezies wird unter Anwendung der erfindungsgemäßen PNC-PAGE-Methode weiter aufgereinigt und isoliert. Im Elektropherogramm wird ein Eisenpeak dargestellt. Die zugehörige Fraktion mit dem höchsten Eisengehalt, die das isolierte Eisenprotein enthält, kann nun einer Identifizierung und Strukturanalyse zugeführt werden. Dazu eignet sich besonders die MALDI-TOF-MS ( atrix as- sisted laser desorption i-onization - time of flight Massenspektroskopie) .
Da das Genom der untersuchten Arzneipflanze, die diese Substanz produziert, bekannt ist, kann das Gen, das für dieses Protein codiert, mit Hilfe von Datenbankrecherchen genau zugeordnet werden.
Da Eisen in diesem Fall als Co-Faktor eines Enzyms fungiert, dem bei StoffWechselprozessen im menschlichen Organismus eine positive Wirkung zugeschrieben wird, kann es nunmehr aufgrund seiner durch das erfindungsge- mäße Verfahren ermöglichten genauen genetischen Identifizierung gezielt in größeren Mengen industriell- pharmazeutisch produziert werden. So besteht hier beispielsweise die Möglichkeit eine biotechnologische Produktion des Enzyms von Mikroorganismen durchführen zu lassen.
2. Beispiel :
Ein Zinkprotein, das im Bereich von 180 kDa eluiert, wird ebenfalls mit der erfindungsgemäßen PNC-PAGE-
Methode weiter aufgetrennt . Es wird bei einem pH-Wert von 10,00 nicht denaturiert und wandert während der elektrophoretischen Trennung zur Anode. Zink eluiert in mehreren Fraktionen, wobei zwei Zink-Peaks an unterschiedlichen Stellen im Elektropherogramm sichtbar sind.
Strukturuntersuchungen ergaben, dass es sich bei den Zinkbindungsformen um Substitutionsisomere mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten handelt, von denen nur ein Isomer das medizinisch wirksame ist. Um diesen Unterschied herauszufinden, besteht mittels einer isoelektrischen Fokussierung unter Anwendung von Proteinstandards die Möglichkeit, die isoelektrischen Punkte, die tatsächliche Molekularmasse und Reinheit der isolierten Zinkspezies zu bestimmen.
Literatur [1] K. Günther, G. Ji and B. Kastenholz, Fresenius J. Anal. Chem. (2000) 368: 281 - 287, „Characterization of high molecular weight cadmium species in contaminated vegetable food" .
[2] Gang Ji, „Charakterisierung hochmolekularer Cadmiumspezies in kontaminierten pflanzlichen Lebensmit- teln", Cuvillier Verlag Göttingen, 1997, pp. 1 - 113.
[3] BioRad, „Model 491 Prep Cell, Instruction Manual", pp. 1 - 47. [4] BioRad, „Acrylamide Polymerization - A Practical Approach", US/EG Bulletin 1156, pp. 1 - 8 (1989) . [5] DPMA, „Behälter zur Lagerung von Proben bei tiefen Temperaturen", Offenlegungschrift DE 197 25 768 A 1, 1998, Erfinder: B. Kastenholz. [6] G. Weber and J. Messerschmidt, Fresenius J. Anal. Chem. (2000) 367: 356 - 358, „Total determination of metal-binding carbohydrates in plant extracts by using FIA with electrochemical detection" . [7] G. Weber, J. Messerschmidt, A. von Bohlen and F. Alt, Fresenius J. Anal. Chem. (2001) 371: 921 - 926, „Effect of extraction pH on metal speciation in plant root extracts". [8] K. Guenther and B. Kastenholz, , Handbook of Elemen- tal Speciation' , Rita Cornelis (Chief Editor) , Wiley, „Speciation of Thallium (Environment, Food, Clinical, Occupational Health) ", zur Begutachtung eingereicht in 2002.
[9] K. Guenther and B. Kastenholz, , Handbook of Elemen- tal Speciation', Rita Cornelis (Chief Editor), Wiley, „Speciation of Zinc (Environment, Food, Clinical, Occupational Health)", zur Begutachtung eingereicht in 2003.
[10] A. Wittershagen, P. Rostam-Khani, C. Rittmeyer, D. Bublak, G. Stahl, H. Rüterjans und B.O. Kolbesen, „De- tektion von Metall-Cofaktoren in biologisch-organischen Systemen. Ein Vergleich zwischen ICP-OES und Total - reflexions-Rδntgenfluoreszensanalyse (TXRF)", in , CANAS ^95 Colloquium Analytische Atomspektroskopie" , Bernhard Welz (Hrsg.), Bodenseewerk Perkin-Elmer GmbH, 1996.
[11] R. Huber, Angewandte Chemie 101, 849-871 (1989) .
[12] J. Deisenhofer, H. Michel, Angewandte Chemie 101, 872-892 (1989) .

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Isolierung von Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen unter Anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PNC-PAGE) , dadurch gekennzeichnet, dass ein Acrylamidgel mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4 % (w/v) eingesetzt wird, ein Elektrophoresepuffer mit einem pH-Wert von 10,00 eingesetzt wird, sowie 0 , 5 μl TEMED/ml Gel und 5 μl APS /ml Gel eingesetzt werden, wobei das Gel über einen Zeitraum von 69 Stunden auspolymerisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass bei der elektrophoretischen Auftrennung Glyce- rin mit einem Volumenanteil von 10 % (v/v) bezogen auf das Volumen des biologisch-organischen Systems eingesetzt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zu isolierenden Metall-Cofaktoren vor Einsatz in der PNC-PAGE mit einer Gelpermeationschroma- tographie (GPC) aufgereinigt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Acrylamidgel nach dem Giessen für 60 min mit Isopropanol überschichtet wird und anschließend mit Elektrophoresepuffer gespült wird.
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