WO2004097415A1

WO2004097415A1 - バイオチップおよびバイオチップキットならびにその製造方法および使用方法

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Publication number: WO2004097415A1
Application number: PCT/JP2004/005878
Authority: WO
Inventors: Katsuya Okumura; Makoto Mihara; Mutsuhiko Yoshioka
Original assignee: Jsr Corporation; Octec Inc.
Priority date: 2003-04-25
Filing date: 2004-04-23
Publication date: 2004-11-11
Also published as: US20060252044A1; EP1619500A4; EP1619500A1; AU2004235238A1; CA2523749A1; KR20060004958A

Abstract

　高効率に短時間で被検体中の標的物質とプローブが反応し、Ｂ／Ｆ分離効率が高く、高感度での定量検出が可能であるバイオチップおよびバイオチップキットならびにその製造方法、当該バイオチップキットを用いた、被検体中の標的物質とプローブとの反応方法、被検体中の標的物質の分離分画方法および検出・同定方法等を提供する。本発明のバイオチップは、均一な孔径を有するストレートな細孔が均一な孔間隔で形成されたフィルターが設けられたウエルを備えている。このウエルに、プローブ担持粒子が分散された分散液が収容され、ウエルへ被検体を投入してプローブ担持粒子と反応させる。被検体溶液などの溶液は、フィルターを通してウエルへ導入し、あるいはウエルから排出させることができる。

Description

明細書パイォチップぉよぴバイォチップキットならぴ.にその製造方法および使用方法 . 技術分野

本発明は、均一な孔径を有するストレートな細孔からなるフィルターが底部に設けられたゥエルを備えるバイォチップ、および該バイォチップと容器からなるバイオチップキット、プローブ担持粒子と相互作用する被検体物質中の標的物質とプローブとの反応もしくは相互作用方法、被検体から標的物質を B Z F分離する方法、標的物質を被検体から分離分画する方法、およぴ被検物質中の標的物質とバイォプローブとの反応相互作用の検出 ·同定方法に関する。背景技術

二本鎖 D N Aは、例えば加熱により一本鎖 D NAとした場合でも、これらの構造が相補的であるため相互に結合するという性質を有し、この性質を利用して、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法が確立された。そして、従来、適当な長さの特定の配列を有する D N Aを制限酵素などでフラグメント化したもの、あるいは合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、これらと相補的な配列を有する D N Aフラグメントゃオリゴヌクレオチド等を検索することが標準的な手法として行われてきた。

しかしながら、ノーザンハイプリダイゼーシヨン法は、操作が煩雑であり、少数の被検体を処理する場合であっても、短時間にこれらを処理することができないという問題点があった。このため、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法を応用した簡便な処理方法として、スライドグラス等の基板上に上記のようなオリゴヌクレオチド等を高密度に固定化し、短時間で分析を行うことができる D N Aチップが開発され、現在、汎用に使用されている。

この D N Aチップの代表的な例として、シリコン等の平面基板上にオリゴヌクレオチドが固定されたものがある。このチップは、基板上に 1塩基を固した後、この塩基と他の塩基とを 1塩基ずつ結合させて、 2 0〜3 0塩基程度の長さまで伸張させて作成することができ、光照射下または酸の存在下で所定の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを直接チップ上で合成して D N Aチップを製造することができる。例えば特開昭 6 3— 2 7 0 0 0号公報には、シリコン等の基板上にオリゴヌクレオチド等を In Situ 合成した D N Aチップが記載されている。

あるいは、 c D N Aあるいは予め合成しておいた適当な長さのオリゴヌクレオチド等の核酸を基板上に結合させて作成することができ、この方法では、別途用意した核酸を粒子担体から分離し、これをスポッターにより所定位置にスポットする、いわゆるブラウン法が用いられる。

しがし、前者の方法では、塩基配列をチップ上で合成するため、一部の塩基配列で合成ミスが生じると、そのチップ全体が不良品となってしまう。この結果、チップの歩留まりは y ^4npとなる。ここで、 yは 1回の塩基合成工程における正合成確率、 nは塩基数、 pはプローブ数である。したがつて、プローブ数が増えると歩留まりが幾何級数に低下することになる。そこで、予備のプローブを設けて不良プローブの代替プローブを設けることが行われているが、基板面積が大きくなる。一方、後者の方法では、 D N Aのスポット量とスポット位置は、スポッターの精度などに大きく依存し、良好な再現性を得ることが難しい。

また、これらのマイクロアレ一あるいは D N. Aチップでは 1被検体について数万項目の核酸等のプローブが搭載可能であり、数万項目の同時他項目検査が可能である一方、プローブは基板に固定されており、被検体とプローブとの反応は固定されたプローブと液体中の被検体との反応、いわゆる固液反応と称される反応となる。一般に固液反応は反応効率が悪く、被検体とのいわゆるハイブリダィズ反応は数時間を要する。

また、目的とする塩基配列を有する核酸を精度良く検出するためには、狭いスペースに効率よく、この核酸と相補的な配列を有する核酸（以下、「プローブ」ともいう。）を固定する必要がある。このようなプローブを基板上に固定できる数は、個々のプローブの占有面積と D N Aチップ自体の大きさから定まり、一定数以上を固定することは物理的に不可能である。そして、現在使用されている D N Aチップのような、被検体に浸漬して反応させるスタイルのチップでは、使用可能な被検体溶液の量が非常に少ない場合もあることから、チップ自体は小さい方がよい。

しかし、チップの大きさを小さくしていくと、プローブを固定できる面積が小さくなることから、狭いスペースのために検出信号が弱くなり、検出感度が低下する。

こうした点を改良すべく、最近では、三次元ゲル上に上記のようなプローブを固定したチップが製造され、市販されている（例えば、 Analytical Clinica Acta 第 4 4 4卷 p . 6 9— 7 8 ( 2 0 0 1年）を参照）。これらのチップでは、プローブが三次元ゲル上に三次元的に固定され、プロ一ブ密度が高いために検出信号の強度は高くなるが、ノイズの信号強度も高くなるために S ZN比が上がらず、検出精度の大幅な改善は難しい。ここでノイズの信号強度が上がってしまう要因としては、三次元ゲル上に固定されたプローブと被検体との非特異的反応によって形成された生成物の除去が難しいことが考えられる。

一方、中空糸を束ねて、これらの中空糸の内面側壁にプローブを結合させて三次元化プローブを形成し、これによりプローブ密度を向上させたチップも開発されている（特開 2 0 0 0 - 1 8 1 0 7 4号公報を参照）。また、垂直異方性の細孔を有する多孔質アルミナ基板を用い、この垂直な孔の内壁にプローブを固定して三次元構造とすることでプローブ密度を上げ、さらに孔が垂直に空いたフローダウン構造を利用して、被検体とプローブとを反応させた後に非標的物質を洗浄除去することが可能なバイォチップも近年開発されている（特表平 9— 5 0 4 8 6 4号公報（国際公開第 0 1ノ 1 2 8 4 6号公報）を参照）。

このようにプローブを中空糸の内面側壁あるいは多孔質アルミナの細孔内壁と結合する上記したいずれの方法においても、プローブは固定壁に固定されているために、被検体とプローブとが反応する際には、被検体が固定されたプローブへ近接あるいは接触する必要がある。しかしながら、このプローブの大きさは、反応空間容積と比較すれば極めて微小であり、反応空間のスケールで見れば、プローブは固定壁からわずかに突起として飛ぴ出しているに過ぎず、被検体がプローブに近接あるいは接触する確率は極めて低い。したがって、これらの方法では反応のために長時間の攪拌を必要とする。

また、このように三次元構造の内壁にプローブを固定化した場合、孔の深さを深くすると、穴内部側壁の表面張力が大きくなり検体や洗浄液などの入排出が困難となる。

上記のように固定壁へプローブを固定する代わりに、粒子へプローブを担持して、このプロ一ブ担持粒子を含む溶液中.で、プロ一ブ担持粒子と被検体中の標的物質とを反応させる方法も行われている。この方法は、プロ一ブ担持粒子が溶液中に三次元的に分散していることと、プローブ担持粒子と被検体とが相互に移動することができることから、反応性が非常に高いというメリットがある。例えば、ラテックス粒子表面のプローブに被検体中の標的物質を特異的に反応させ、何らかの B F (Bound form / Free form) 分離によって、特異的にプローブに反応結合した標的物質の内容を解析する検出 ·同定方法が知られている。

Nucleic Acid Research 第 1 4卷 p . 5 0 3 7 - 5 0 4 8 ( 1 9 8 6年）には、被検体である標的核酸と、粒子に担持された核酸プローブとを溶液中でハイブリダィズさせた後、遠心分離して未反応の被検体を除去する方法が記載されており、この方法は現在でも広く使用されている。しかしながら、このように遠心分離を用いると、分離に時間を要し、また分離性能がそれほど高くないという問題点がある。

特開昭 6 3— 2 7 0 0 0号公報、特許第 2 9 7 5 6 0 3号公報には、プローブを坦持する粒子として磁性の粒子を使用し、磁石によりこの磁性粒子を固定して、未反応の被検体を洗浄除去する方法が記載されている。この方法も現在広く使用されている。しかし、磁性粒子は一般に磁気特性を発揮するためには 1ミクロン以上の大きさが必要であり、フェライト等の金属磁性成分を含有するため比重が大きく、沈降や凝集し易く保存性や操作性に注意が必要である。

特開昭 6 3— 2 7 0 0 0号公報には、被検体である標的核酸と、粒子に担持された核酸プローブと'を溶液中でハイプリダイズさせた後、濾紙で濾過洗浄を行い、濾紙上に濃縮された反応由来の信号を測定する方法が記載されており、この方法も広く使用されている。 .しかし、この方法では粒子として用いるラテックス粒子の量が非常に多く、濾過に時間を要するとともに、濾紙が目詰まりし易い。

また、これらの文献に記載された、プローブ坦持粒子を使用するいずれの方法においても、 1種類の被検体に対して、複数のプローブによる多項目同時検査（Multiplex Assay) あるいは多項目同時分離分画を行うことができない。

プローブ担持粒子を使用して多項目同時検査を行う方法として、複数のプローブを識別する何らかの識別ラベルを付けた粒子を用いる方法が提案されている。例えば米国特許第 5， 7 3 6 , 3 3 0号公報、特開昭 6 2— 8 1 5 6 6号公報、特公平 7— 5 4 3 2 4号公報には、蛍光着色した複数の粒子あるいは粒子径の異なる複数の粒子を用い、粒子毎に異なるプロ一ブを坦持させ、色や粒子径等でプローブの種類を特定し、被検体とプロ一ブ担持粒子との反応をフローサイトメーターで検出するする方法が記載されており、この方法も現在広く用いられている。

しかし、この方法では被検体と反応させたプロ一ブ坦持粒子をフィルタ一付き 9 6孔プレートで濾過するか、あるいは遠心分離等の方法で B / F 分離した後に、フローサイトメ一ターに分注して検出している。この場合、被検体は一度フィルター付きプレートゃ遠心分離用遠沈管で処理されその後フローサイトメーターに掛けられるために、工程が増えるとともに、プレートや管による汚染ゃ被検体の付着による減損の可能性がある。

また、色で識別する方法では、識別し得る色の種類に限度があり、一定の波長範囲と光強度の組み合わせで分光できる光は約 1 0 0種類であり、したがって、約 1 0 0種類の色と強度の組み合わせ、すなわち 1 0 0種類のプローブの同時検査が限度といわれている。

この他、特開平 1 1— 2 4 3 9 9 7号公報には、粒子サイズとその形状により粒子を識別する方法が記載されている。また、特開 2 0 0 0— 3 4 6 8 4 2号公報には、粒子を一次元あるいは二次元に配列し、種類の異なるプローブ粒子を区分するために、サイズの異なる微粒子を分離隔壁として用いる方法が記載されている。

上記した各文献に記載された、粒子を識別して多項目同時検査を行ういずれの方法においても、粒子の識別のためにフローサイトメーターによる検出が行われている。しかしながら、このフローサイトメーターによる方法では、粒子を細管中に流し、この細管の透明部分からレーザーを照射して粒子をシークェンシャルに識別するために、検出時間が掛かるという問題点がある。また、検出時間を短縮するためには 1個の粒子識別に時間が掛けられず、検出精度が低下する可能性がある。また、フローサイトメ一ターの細管は高価であり、被検体を替えるごとに細管を取り替えることはコスト的に困難である。このため、被検体を替えるごとに細管を洗浄する必要があり、洗浄を充分に行うためにはさらに時間を要する。

バイオチップには、そのプローブとして D N Aフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを固定した D N Aチップの他、抗原および抗体等のタンパクあるいはこれらのタンパクと特異的に反応するあるいは相互作用する化学物質を固定したプロティンチップ等があるが、上述してきた各問題点は、これらのプロテインチップ等においても同様に存在する。

これらの D N Aチップ、およびプロテインチップは、基板上に固定する各種のプローブによって、生物の持つ遺伝子の機能解析；各種感染症等の疾病の罹患状況を確認するための臨床検查；遺伝子多型解析；テーラーメード治療と称される、患者の遺伝子配列に応じた治療医薬の選定；医薬品開発のための化学物質あるいはたん白のスクリ一ユングあるいは化学物質の、毒性スクリーニング；その他の各種スクリーニング等に応用することができる。

しかしながら、こうした各種の用途に応用するためには、現在使用されているバイオチップでは検出感度が充分ではない。例えば、病気を極く初期で発見するためには、病気の極く初期の段階において細胞から細胞外に出てくる、極めて微量である病気由来のマーカーを検出する必要があるが、現状のバイオチップによる検出感度では、この極微量のマーカーを検出するためには不充分であるといわれており、より高感度のバイオチップが必要とされている。

また、患者の病気の状態に関する正確な情報を得て、診断誤差を最小限にするためには、単一のプローブでは不充分であり、複数の異なるプロ一ブによる多項目同時検査が望ましい。したがって、高い検出感度で多項目同時検查を行うことができるバイオチップが要望されている。

本発明は、上記した従来技術の問題点を解決するために為されたものであり、その目的は、

·高効率に短時間で被検体中の標的物質とプローブが反応し、

• B Z F分離効率が高く、 ·高感度での検出 ·同定が可能であるバイオチップおよびその製造方法を提供することにある。

また、本発明の目的は、複数のゥエルからなるバイオチップ同士、あるいは複数のゥエルからなるバイオチップと複数のゥエルからなる容器との間で、直接ゥエル間で液体め授受を行うことが可能であるバイオチップキットを提供することにある。

さらに、本発明の目的は、 .

• 当該バイオチップを用いた、一被検体からの少なくとも一種類以上の標的物質の分離分画方法

•多数の被検体から同時並行に少なくとも一種類以上の標的物質を分離分画する方法

•一被検体からの少なくとも一種類以上の標的物質のアツセィ方法 •多数の被検体からの同時並行に行う少なくとも一種類以上の標的物質のアツセィ方法を提供することにある。発明の開示

( i) 本発明のバイオチップは、均一な孔径を有するストレートな細孔が均一な孔間隔で形成されたフィルターが底部に設けられたゥエルを備えることを特徴としている。

( i i) 本発明のバイオチップは、（i)のバイオチップにおいて、前記フィルターの厚さが 1〜1 0 mであることを特徴としている。

( i i i ) 本発明のパイォチップは、（i )または（i i)のバイォチップにおいて、前記フィルターの開口率が 1 5〜6 0 %であることを特徴としている。

(iv) 本発明のバイオチップは、（i)〜（iii)のいずれかのバイオチップにおいて、前記フィルターめ表面材質がシリカ、チタニアまたはアルミナであることを特徴としている。

(V) 本発明のバイオチップは、（i)〜（iv)のいずれかのバイオチップにおいて、一体に形成された複数の前記ゥエルを備えることを特徴としている。 (vi) 本発明のバイオチップは、（i)〜（iv)のいずれかのバイオチップにおいて、単数の前記ゥエルを備えることを特徴としている。

(vi i) 本発明のバイォチップは、（i)〜（vi)の.いずれかのバイォチップにおいて、前記ゥエルにおけるフィルターの上面側または下面側に補強用リブ部が設けられていることを特徴としている。

(vi i i) 本発明のバイオチップは、（vi i)のバイオチップにおいて、前記捕強用リプ部が、複数の貫通孔が形成された一体形状であることを特徴としている。

(xi) 本発明のバイオチップは、（vi i)または（viii)のバイオチップにおいて、前記捕強用リブ部が、前記フィルターと直接に接合されていることを特徴としている。

(X) 本発明のバイオチップは、（vi i)または（vi i i)のバイオチップにおいて、前記補強用リブ部が、前記フィルターと同一材料で連続形成されていることを特徴としている。

(xi) 本発明のバイオチップは、（i)〜（x)のいずれかのバイオチップにおいて、前記ゥエルの底部に、その周縁から所定の幅で、フィルターの細孔が形成されていない無孔部が設けられていることを特徴としている。

(xi i) 本発明のバイオチップは、（i)〜（xi)のいずれかのバイオチップにおいて、第一のフィルターが底部に設けられるとともに、ゥエルを挟んで第一のフィルターとは反対側に第二のフィルターが設けられていることを特徴としている。

(xiii) 本発明のパイォチップは、 (i)〜（xii)のいずれかのパイォチップにおいて、前記ゥエルに、プローブ担持粒子が分散された分散液が収容されていることを特徴としている。 (xiv)本発明のバイオチップは前記粒子の粒子径とフィルターの孔径との比率が、粒子径 Z孔径 = 1 . 1〜2 . 5であり、且つ粒子径く孔間隔く粒子径 X 1 0であることを特徴としている。 .

(XV)本発明のパイォチップは前記粒子の粒子径、フィルターの孔径ぉよび孔間隔が、粒子径>孔径 +孔間隔 2の関係を満足することを特徴としている。

(xvi) 本発明のバイオチップは、（xi i i)のバイオチップにおいて、前記ゥエルに、プローブ識別情報を与えるための少なくとも一種の識別手段を有するプローブ担持粒子が分散された分散液が収容されていることを特徴としている。

(xvi i) 本発明のバイオチップは、（xvi)のバイオチップにおいて、前記識別手段が、プローブ担持粒子の色、形状、粒子径および遺伝子配列から選ばれる少なくとも一種であることを特徴としている。

(xvi i i) 本発明のバイォチップは、 (xvi)または（xvi i)のバイォチップにおいて、全ての前記識別手段におけるプローブ識別情報が同一である複数のプローブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプローブ担持子について、前記プローブ識別情報が同一であることを特徴としている。

(xix) 本発明のパイォチップは、 (xvi)または（xvii)のパイォチップにおいて、全ての前記識別手段におけるプローブ識別情報が同一である複数のプローブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプロ一ブ担持粒子について、前記プロ一ブ識別情報が異なっていることを特徴としている。

(xx) 本発明のバイオチップは、（xvi)または（xvi i)のバイオチップにおいて、少なくとも一種の前記識別手段におけるプローブ識別情報が異なつている複数のプローブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプローブ担持粒子について、その全ての識別手段における前記プローブ識別情報の構成が同一であることを特徴としている _c (xxi) 本発明のバイオチップは、（xvi)または（xvii)のバイオチップにおいて、少なくとも一種の前記識別手段におけるプローブ識別情報が異なつている複数のプローブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプローブ担持粒子について、その少なくとも一種の前記識別手段における前記プローブ識別情報の構成が異なっていることを特徴としている。

(xxii) 本発明のバイオチップキットは、（i)〜（xxi)のいずれかのバイオチップにおける一体に形成された複数のゥエルもしくは単数のゥエルを収鈉するか、あるいは当該ゥエルと接続される容器を備えることを特徴としている。

(xxi i i) 本発明のバイオチップキットは、（xxi i)のバイオチップキットにおいて、前記容器が、前記ゥエルと一体に形成されていることを特徴としている。

(xxiv) 本発明のバイオチップキットは、（xxi i)のバイオチップキットにおいて、前記容器が、前記ゥエルと独立に形成されていることを特徴としている。

(XXV) 本発明のバイオチップキットは、（xxii)〜（xxiv)のいずれかのノィォチップキットにおいて、前記容器が、前記バイオチップのゥエルに対応するゥエルを有することを特徴としている。

( xvi) 本発明のバイオチップキットは、（XXV)のバイオチップキットにおいて、前記容器のゥエル底部に貫通穴が形成されていることを特徴としている。

(xxvi i) 本発明のバイオチップキットは、（xx.v)または（_xxvi)のバイオチップキットにおいて、前記バイオチップと前記容器とが、対応するゥエルが互いに連結するように接続されていることを特徴としている。

(xxvii i) 本発明のバイオチップキットは、（xxi i)〜（xxvi i)のバイオチップキットにおいて、前記容器が、貫通穴が形成されたプレートと、貫通穴が形成されていないプレートの少なくともいずれかを用いて、複数の前記プレートを積層することにより形成されていることを特徴としている。

(xxix) 本発明のバイオチップキットは、（i)〜（xxi)のいずれかの複数のバイオチップ同士が、対応するゥエルが互いに連結するように接続されていることを特徴としている。

(XXX) 本発明のバイオチップキットは、（xxi i)〜（xxix)のいずれかのノィォチップキットにおいて、前記バイオチップのゥエル側部の下端に設けられた平坦部と、別途の前記容器または前記バイオチップのゥエル側部の上端に設けられた平坦部とが、ゥエルを互いに連結するように直接に接続されていることを特徴としている。

(xxxi) 本発明のバイオチップキットは、（xxi i)〜（xxix)のいずれかのバィォチップキットにおいて、前記バイオチップのゥエル側部の下端に、別途の前記容器または前記パィォチップのゥェル側部の上端に設けられた凸部と嵌合する位置合わせ用の凹部、あるいは別途の前記容器または前記バィォチップのゥエル側部の上端に設けられた凹部と嵌合する位置合わせ用の凸部が設けられていることを特徴としている。

(xxxi i) 本発明のバイオチップの製造方法は、（i)〜（xxi)のいずれかのバイオチップを製造するに際し、組成の異なる材質で形成された少なくとも 2層からなるプレートについて、片面側からパターンエッチングにより 2層の境界までエッチングを行いゥエル孔を形成するとともに、他面側からパターンエッチングにより 2層の境界までエッチングを行いフィルター孔を形成し、これによりゥエルとフィルタ一とが接合したバイオチップを得ることを特徴としている。

(xxxii i) 本発明のバイォチップの製造方法は、 (i)〜（xxi)のいずれかのバイオチップを製造するに際し、シリコンウェハーをエッチングすることによりフィルター、リブおよびゥエルをそれぞれ作製し、次いで、これらを積層することを特徴としている。

(xxxiv) 本発明のバイオチップキットの操作方法は、容器がバイオチップのゥエルと独立に形成されている（xxi i)〜（xxxi)のいずれかのバイォチップキットの当該容器に収容された溶液中でバイオチップのゥエルを上下させることにより、当該容器内の溶液と、ゥエル内のプローブ担持粒子および/または溶液とを接触させることを特徴としている。

(XXXV) 本発明のバイオチップキットの操作方法は、（xxi i)〜（xxxi)のいずれかのバイオチップキットの容器に収容された溶液の界面を上下させることにより、当該容器内の溶液と、ゥエル内のプローブ担持粒子おょぴ Z または溶液とを接触させることを特徴としている。

(xxxvi) 本発明のバイオチップキットの操作方法は、バイオチップを収納する容器を備える（xxi i)〜（xxxi)のいずれかのバイオチップキットの当該容器とチップとの間、あるいは当該チップにおける相互のゥエル間に差圧を生じさせ、これにより、ゥエル内の液体とプロ一プ担持粒子との接触、液体のゥエル間での移動、あるいはこれらの両方を行うことを特徴としてレヽる。

(xxxvi i) 本発明のバイオチップキットの操作方法は、バイオチップを接続する容器を備える（_xxi i)〜（_xxxi)のいずれかのバイオチップキットの当該容器とチップとの間、あるいは当該チップにおける相互のゥエル間に差圧を生じさせ、これにより、ゥエル内の液体とプローブ担持粒子との接触、液体のゥエル間での移動、あるいはこれらの両方を行うことを特徴としている。

(xxxvi i i) 本発明のバイオチップキットの操作方法は、（xxxiv)〜

(xxxvii)のいずれかの方法において、前記容器内の溶液と、ゥェル内のプローブ担持粒子おょぴまたは溶液とを接触させることにより、バイオチップ内の内容物の混合、拡散、反応、分離または洗浄を行うことを特徴としている。

(xxxix) 本発明のバイオチップキットの操作方法は、（xxxiv)〜

(xxxvi i i)のいずれかの方法において、前記パイォチップの各ゥエルに同一の被検体を投入することを特徴としている。

(xl) 本発明のバイオチップキットの操作方法は、（xxxiv)〜（xxxvi i i) のいずれかの方法において、前記バイオチップの各ゥエルに異なる被検体を投入することを特徴としている。

(xli) 本発明の被検体中の標的物質とプローブとの反応方法は、（xxi i) 〜（xxxi)のいずれかのキットにおけるバイオチップのゥエルに、（xvi i i) 〜（xxi)のいずれかのチップとなるように特定の粒子をゥエルに収納する工程；

前記バイオチップのゥエル内に、被検体を含む溶液を投入して、当該被検体と、全てのゥエル内の前記粒子とが接触可能な状態とする工程；およぴ

バイオチップの容器に収容された前記溶液中でゥエルを上下させるか、バイオチップの容器に収容された前記溶液の界面を上下させるか、あるいは差圧を加えることでゥエル内外の溶液を循環することにより被検体中の標的物質とプローブとの反応を行う工程を含むことを特徴としている。

(xli i)本発明の被検体中から標的物質を B Z F分離する方法は、（xxi i) 〜（xxxi)のいずれかのキットにおけるバイオチップのウエノレに、（xviii) 〜（xxii)のいずれかのチップとなるように特定の粒子をゥエルに収納する工程；

前記バイオチップのゥエル内に、被検体を含む溶液を投入して、当該被検体と、全てのゥエル内の前記粒子とが接触可能な状態とする工程；前記溶液の界面の高さを、ゥエル底部のフィルターの下面未満となるまで低下させて、前記粒子に担持したプローブと反応していない被検体を各ゥエル内から除去する工程；および

洗浄液をバイオチップのゥエルに投入し、前記容器を介して洗浄液を該バイォチップのゥエルに循環させて該バイォチップのゥエル内外へ洗浄液を出し入れさせ、洗浄液をゥエル外へ排出することにより、プローブ結合標的物質以外の物質を洗浄除去する工程を含むことを特徴としている。

(xl i i i )本発明の被検体中の標的物質の分画分離方法は、（XXX)または (xxxi)のキットにおけるバイオチップのゥエルに、（xvi ii)〜（xxi)のいずれかのチップとなるように特定の粒子をゥエルに収納する工程；

前記バイオチップのゥエル内に、被検体を含む溶液を投入して、当該被検体と、全てのゥエル内の前記粒子とが接触可能な状態とする工程；前記溶液の界面の高さを、ゥエル底部のフィルターの下面未満となるまで低下させて、前記粒子に担持したプローブと反応していなレ、被検体を各ゥエル内から除去する工程；

洗浄液をパイォチップのゥエルに投入し、前記容器を介して洗浄液を該バイォチップのゥエルに循環させて該バイォチップのゥエル内外へ洗浄液を出し入れさせ、洗浄液をゥエル外へ排出することにより、プローブ結合標的物質以外の物質を洗浄除去する工程；および

前記バイォチップのゥエル側部の下端に設けられた凹部、凸部または平滑部と、上端にこれと対応する凸部、凹部または平滑部を有する容器を嵌合させ、次いで分離剤溶液をバイオチップのゥエルに投入し、これにより前記粒子から被検体中の標的物質を分離し、前記容器のゥエルに移動させる工程を含むことを特徴としている。

(xliv) 本発明の被検体中の標的物質とプローブの相互作用の検出'同定方法は、（xxii)〜（xxxi)のいずれかのキットにおけるバイオチップのゥェルに、（xvi ii)〜（xxi)のいずれかのチップとなるように特定の粒子をゥェルに収納する工程；

前記バイオチップのゥエル内に、被検体を含む溶液を投入して、当該被検体と、全てのゥエル内の前記粒子とが接触可能な状態とする工程；前記溶液の界面の高さを、ゥエル底部のフィルターの下面未満となるまで低下させて、前記粒子に担持したプローブと反応していない被検体を各ゥエル内から除去する工程；

洗浄液をパイォチップのゥエルに投入し、前記容器を介して洗浄液を該パイォチップのゥエルに循環させて該パイォチップのゥエル内外へ洗浄液を出し入れさせ、洗浄液をゥエル外へ排出することにより、プローブ結合標的物質以外の物質を洗浄除去する工程；ゥエル内の粒子をフィルターの細孔に位置させる工程；および前記粒子に担持されたプローブと被検体の標的物質との反応または相互作用を検出 ·同定する工程を含むことを特徴と.している。

(xlv)本発明の被検体中の標的物質とプローブの相互作用の検出'同定方法は、（xliv)の方法において、粒子ごとに、粒子のプローブ識別情報と前記粒子に担持されたプローブと被検体の標的物質との反応または相互作用の情報の双方を検出することを特徴としている。

(xlvi)本発明の被検体中の標的物質とプローブの相互作用の検出 ·同定方法は、（xliv)の方法において、各ゥエルごとの粒子について、前記粒子に担持されたプローブ識別情報を識別し、次いでプローブと被検体中の標的物質との相互作用に関する状態を計測し、各粒子ごとに得られた相互作用の状態情報に基づき、ゥエル単位での相互作用情報を算出することを特徴としている。

本発明によれば、

• B Z F分離効率が高く、

•高感度での定量検出が可能であるバイオチップおよびその製造方法が提供される。

また、本発明によれば、複数のゥエルからなるバイオチップ同士、あるレ、は複数のゥエルからなるパイォチップと複数のゥエルからなる容器との間で、直接ゥエル間で液体の授受を行うことが可能であるバイオチップキットが提供される。

さらに、本発明によれば、当該バイオチップを用いた、

•一被検体から少なくとも一種類以上の標的物質の分離分画方法 •多数の被検体から同時並行に少なくとも一種類以上の標的物質を分離分画する方法

•—被検体からの少なくとも一種類以上の標的物質のアツセィ方法 •多数の被検体からの同時並行に行う少なくとも一種類以上の標的物質のアツセィ方法が提供される。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の一実施形態によるバイオチップが備えるゥエルの底部側を模式的に示した断面図である。

図 2は、フィルターの細孔の一例を模式的に示した断面図である。図 3は、捕強用リブ部を設けたゥエルの底部側を模式的に示した断面図である。

図 4は、フィルタ一面上に補強用リブ部を設けた様子を模式的に示した上面図である。

図 5は、フィルタ一面上に補強用リブ部を設けたゥエル底部の電子顕微写真である。

図 6は、補強用リプ部を設けたゥエルの底部側を模式的に示した断面図である。

図 7は、補強用リブ部を設けたゥエルの底部側を模式的に示した断面図である。

図 8は、捕強用リブ部に位置合わせ用凹部を設けたゥエルの底部側を模式的に示した断面図である。

図 9は、補強用リブ部に位置合わせ用凹部を設けたゥエルの底部側を模式的に示した断面図である。図 1 0は、ゥエルの底部上面に、その周縁から所定の幅で無孔部を設けたゥエルの底部側を模式的に示した断面図である。

図 1 1は、リブあるいはゥエルを光造型で作製する方法を説明する図である。

図 1 2は、本発明の一実施形態によるバイオチップの上面図および A— A ' 靳面図である。

図 1 3は、本発明の一実施形態によるバイオチップの上面図および A— A ' 断面図である。

図 1 4は、第一のフィルターとともに第二のフィルターを備えるバイオチップの断面図である。

図 1 5は、バイオチップと容器を接続したバイオチップキットの作製方法を説明する断面図である。

図 1 6は、バイオチップキットの容器の底部あるいは蓋部となるプレートに、光学検出用として平滑で透明なプレートを用いた例を示した断面図である。

図 1 7は、プレートを用いて容器を形成したバイオチップキットの例を示した断面図である。

図 1 8は、チップを多段に設けたバイオチップキットの例を示した断面図である。

図 1 9は、複数のゥエルからなるチップを作製する方法を説明する図である。

図 2 0は、本発明に係るバイオチップの操作方法を説明する図である。図 2 1は、本発明に係る被検体中の標的物質の分離分画方法および検出方法の一工程を説明するチップ断面図である。図 2 2は、本発明に係る被検体中の標的物質の分離分画方法および検出方法の一工程を説明するチップ断面図である。

図 2 3は、本発明に係る被検体中の標的物質の分離分画方法の一工程を説明するチップ断面図である。

図 2 4は、容器のゥエル底面に微細な貫通孔を設けたバイオチップキットの断面図である。

図 2 5は、本発明に係る被検体中の標的物質の検出方法の一工程を説明するチップ断面図である。

図 2 6は、ゥエルにプローブ担持粒子を収納した本発明のバイオチップの一例を説明する図である。

図 2 7は、本発明のバイオチップのゥエルに被検体を投入する方法を説明する図である。

図 2 8は、プローブ担持粒子をフィルタ一孔上に位置させた電子顕微写真である。

図 2 9は、チップの各ゥエルの底部を撮像した電子顕微鏡写真である。図 3 0は、牛血清希釈液を実施例 3のチップのフィルターに流し、下容器の下蓋から牛血清希釈液を排出した際における、合計の吐出量と吐出時間との関係を示したグラフである。

図 3 1は、チップの孔径と孔間隔が異なる 8種類の組み合わせについて、差圧 1 8 g f / c m ²で実施例 3と同様の試験を行った試験結果を示したグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、図面を参照しながら本発明を具体的に説明する。図 1は、本発明の一実施形態によるバイオチップが備えるゥェルの底部側を模式的に示した断面図である。

同図に示したように、このゥエル 1 6は、細.孔 1 9が形成されたフィルター 1 8が底部に設けられている。このフィルター 1 8は、被検体あるいは被検体を溶解もしくは分散した媒体などの液体を通過させるとともに、ゥエル 1 6内に収納された、被検体と相互作用するプローブ担持粒子が外側へ排出しないように構成されている。

本発明では、フィルター 1 8に、均一な孔径を有するストレートな細孔力均一な孔間隔で形成されている。なお、本明細書において「均一な孔径」とは、孔径の誤差が C V (Coefficient of Variation)値で 2 0 %以下、好ましくは 1 0 %以下であることを意味する。孔径誤差が C V値で 2 0 % 以下であるような細孔は、後述する方法によって作製可能であり、ゥエル 1 6内に収納されるプロ一ブ担持粒子と孔径との寸法差を僅少とすることができる。

従来から使用されているメンブレンフィルタ一等の孔径には 1 0倍程度のばらつきがあり、例えば 0 . 2 m孔径のフィルターを使用する場合では、確実に濾過できる粒子径は 5 程度となる。これと比較して、上記のように均一な孔径を有するフィルターを使用した場合には、フィルターの細孔の孔径は非常に均一であるため、粒子径と孔との差を小さくすることができ、そのために孔径をより大きくすることができ、フィルターの濾過性を向上するとともに、濾過圧力が低減される。

このように均一な孔径を有するフィルターにおいて、その細孔の孔径は、特に限定されないが、通常 0 . 0 1 m〜： 1 0 0 μ m、好ましくは 0 . 1 ί πι〜 5 0 /2 111、より好ましくは 0 . 5 μ m〜 1 5 μ mである。また「均一な孔間隔」 'とは、孔間隔の誤差が C V (Coefficient of Variation)値で 1 5 %以下であることを意味する。孔間隔には特に限定はないが、孔間隔があまりに狭いとフィルターの強度が弱くなり、また孔間隔があまりに広いと開口率が下がることから、通常は孔径の 2倍以下であり、且つ 0 . 5 μ πι〜1 0 ^u mであることが好ましい。なお、「孔間隔」とは隣接する各孔の間における孔が空いていない部分の最短距離のことである。

ま'た、本明細書において、「ストレート」な細孔とは、細孔が途中で分岐することなく形成されていることを意味する。例えば、一方のフィルター表面に形成された開口の中心から他方のフィルター表面への垂線と、この他方のフィルタ一表面に形成された開口の中心から前記一方のフィルター表面への垂線とがずれていても、圧力損失という点ではそれほど遜色がないため、このような細孔であってもよい。また、当該垂線が実質的にずれていない細孔であり且つフィルターの一次側（上面側）の孔径が二次側（下面側）の孔径と異なっているものであってもよい。このような細孔形状としては、例えば図 2 ( a ) 〜（d ) に示したような形状が挙げられる。貫通方向と垂直な細孔断面の形状は特に限定されず、円柱、四角錐、多角錐などヽずれであってもよいが、メニスカスを最小限にする点から鈍角形状あるいは円形であることが望ましい。但し、ゥエルの容積が所定量以上、例えば 0 . 1マイクロリツター以上の場合には、メニスカスはそれほど問題とならず、四角柱や四角錐などであっても問題ない。

このようにストレートな細孔とすることにより、フィルターを形成する細孔長さが最小となるため、細孔壁との接触面積が減少し、濾過に伴う圧送抵抗を最小限とすることができる。また、プローブ担持粒子がフィルターの一次側に堆積して目詰まりを起こした場合であっても粒子がフィルターの内部に入り込まずにフィルター表面に留まり（いわゆる完全閉塞モデルとなる）.、フィルター二次側からのフラッシングによつて粒子をフィルター表面から一次側へ容易に分散させることができる。このため、フィルターの目詰まりを再度解消して再生させることができ、フィルターの寿命を延ばすことができる。

以上のように、フィルターに均一な孔径を有するストレートな細孔を、均一孔間隔で形成することによって、プローブ担持粒子は一次側の開口上に配列され、必要に応じて被検体などの液体を二次側からフラッシングして粒子を一次側へ分散させることも可能であり、被検体とプローブ担持粒子との反応ゃ検出を容易に行うことができる。

さらに、プローブ担持粒子がフィルターの二次側に排出されることが許されず、粒子を 1 0 0 %捕捉する必要がある場合には、フィルターの孔径を粒子の最小径よりも大きくするように粒子サイズなどを考慮することで、透過係数と濾過効率を低下させることなく 1 0 0 %の粒子捕捉が可能である。

一般的な濾紙ゃメンブレンフィルタ一は孔径、孔間隔が均一ではなく、また、孔自体が三次元的に入り組んだ構造をしており、フィルター内部にフィルター表面よりもさらに細い孔が存在する。このため、濾液中に含まれる粒子の一部はフィルター内部の孔に捕捉され、中間閉塞モデルと称される目詰まりを生じ、この目詰まりを解消するために二次側から液体を送り込みフィルターに存在する粒子をフィルター内から一次側に取り出す際に、フラッシングによる効果が充分ではなく全ての粒子はフィルターから一次側に取り出せず、フィルター内に閉じ込められて検出用に使用される粒子が減少する。さらに、ブイルターの粒子捕捉効率は確率的であり、 1 0 0 %の捕捉効率とするためには「ふるい対象となる粒子径分布の最小粒子径>フィルター径分布の最大径」となるフィターを選択する必要があるが、これによつて透過係数と濾過効率が低下する。

本発明では、フィルターの厚さは好ましくは 1〜 1 0 μ m、より好ましくは 2〜7 μ πιである。フィルターの厚さが 1 0 μ πιよりも大きい場合、液体の濾過時に濾過抵抗が大きくなり、フィルターの厚さが 1 μ m未満である場合、フィルターの機械的な強度が不足する。

本発明では、フィルターの開口率は好ましくは 1 5〜 6 0 %、より好ましくは 2 0〜 5 0 %である。開口率が 1 5 %未満である場合、濾過効率が低下し、開口率が 6 0 %よりも大きい場合、フィルターの機械的な強度が不足する。

フィルタ一は、細孔を有する各種の形態のもので形成することができる。具体的には、金型によるプレス、織布、フィルムにレーザーもしくは中性子線で穿孔して形成したフィルター、樹脂もしくは金属薄膜に傷をつけて張力により孔を拡大したもの、基材をフォトエッチングにより穿孔したもの、樹脂成型によるものなどが挙げられる。

前述したような、均一な孔径を有し、均一な孔間隔で形成された細孔を有するフィルタ一は、例えばフォトリソグラフィ一による方法で作製することができ、所定の有機あるいは無機のフィルムにレジストを塗布し、ノターンエッチングすることにより所定の孔を空けてフィルターを形成する。所定の機械的強度を有する膜厚と所定の孔径を確保するためには、高ァスぺクトのエッチングが必要であるが、異方性エッチングによりこれを行うことができる。また、エキスパンドメタルによる方法で作製することも可能である。例えば、厚さ 3 0 μ πιのステンレス箔に、金型にて千鳥状に切れ目を入れ、これを押し広げてひし形状の貫通孔を形成する.。この方法によれば、ひし形孔の最大距離が 3 0 mであり、開口率が 6 0 %程度のフィルターが得られる。次いで、得られたエキスパンドメタルフィルターを、さらに凸金型でプレス処理して所定の凹面を形成することによって、一体に形成された複数のゥエルを得る。あるいは、別途に樹脂もしくは金属にて、ハニカムあるいは丸型などの上下が貫通したゥエル群を作製し、ゥエル群の底面に熱可塑性樹脂溶液を塗布乾燥して、加熱したフィルターとゥエルとを熱接着することによって上記のエキスパンドメタルフィルターとゥエル群とを接着してゥエルを形成する。

また、後述するように、ゥエル側部とフィルターとを榭脂にて一体成型する方法で作製することも可能である。

バイオチップの特に好ましい製造方法として、組成の異なる複数の材質からなるプレート、例えばアルミ/アルミナ、金属シリコン Zシリカ、あるレ、は金属チタン/チタニアなどについて、それぞれ両側からパターンェツチングを行うことにより、フィルターとゥエルを形成する方法が挙げられる。具体的には、例えばアルミナ、シリカ、チタニアなどの金属酸化物層について、この金属酸化物層と金属層との境界までをフォトエッチングしてフィルターを形成し、次いで、アルミ、金属シリコン、金属チタンなどの金属層について、この金属層と金属酸化物層との境界までフォトエツチングすることにより、ゥエルとフィルタ一とが接合したバイオチップを作製できる。

この方法によれば、予め金属と金属酸化物などが一体となった複層材料を使用することにより、フィルターとゥエルが一体接合したものを作製することができ、フィルターとゥエル間の界面からの液漏れなどの懸念がなくなる。

また、フィルタ一層としてアルミナ、シリカ、チタニアなどの透明材料を使用することができるため、光検出により検出を行う場合、フィルター層を介して直接粒子の挙動を見ることができる。

フィルターを形成する材料としては、濾過抵抗を減少する等の点から、ゥエルに収容される溶液と親和性の高い材料、具体的には、溶液が水系の場合は親水性の材料、溶液が油性の場合は親油性の材料を選択することが望ましい。

親水性の有機材料としては、例えばポリエチレンビニル樹脂、架橋ポリビュルアルコール樹脂、ポリグリコール酸樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド、セルロースアセテート樹脂、トリァセチルセルロース、硝酸セル口ース榭脂、エポキシ樹脂、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンとメタクリレートとの共重合体などの各種ァクリレートの共重合体などが挙げられる。

親油性の有機材料としては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチルメタアタリレート樹脂、液晶ポリマー、ポリカーボネート、ポリアミド樹脂、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、シクロォレフィン、ポリメチノレペンテン、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリエーテルサルホンなどが挙げられる。また、無機材料としては、例えば鉄、ニッケル、銅、亜鉛、アルミニゥム、シリコン、チタン、タンタル、マグネシウム、モリプデン、タングステン、ロジウム、パラジウム、銀、金、白金、ステンレス、真鍮、黄銅、青銅、燐青銅、アルミ銅合金、アルミマグネシウム合金、アルミマグネシゥムシリコン合金、アルミ亜鉛マグネシウム銅合金、鉄ニッケル合金等の金属；シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニァ、酸化タンタル等の金属酸化物； S i N、 T i N、 T a N等の金属窒化物； S i C、 W C等の金属炭化物；ダイヤモンド、グラフアイト、 Diamond Like Carbon (D L C )等の炭素材料；ソーダガラス、ホウ珪酸ガラス、パイレックス（R )、石英ガラス等のガラスなどが挙げられる。

また、親油性材料の表面に、プラズマ処理、コロナ処理あるいはイオン処理などを施して、ヒドロキシル基やカルボキシル基などを形成してもよい。また、メツキなどにより表面に親水性の金属あるいは金属酸化物を形成してもよく、あるいは、例えば 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンとメタタリレートとの共重合体、ポリエチレングリコール誘導体などの親水性材料をコーティングしてもよく、あるいはグリシジルメタクリレートを塗布した後にエポキシ基を開環してもよい。

これらの中でも特に、表面材質がアルミナ、シリカ、チタニアであるものがフィルターの材料として好ましい。これらは親水性であるため、バイォ検体の非特異的な吸着が低く、またフィルター内に水系の検体や洗浄液が容易に浸入する。さらに、表面だけではなく内部までこれらと同一材質とすることにより、フィルターが透明になるので、検出方法として光学的な検出方法を使用する場合、粒子プローブと検体マーカーとの反応、相互作用を透明なフィルターを通して容易に検出 ·同定することができる。表面材質がアルミナ、シリカ、チタニアである材料でフィルターを形成する場合、アルミ、金属シリコン、あるいは金属チタンを用いてフィルタ一とゥエルからなるチップを形成し、その後に酸化してアルミナ、シリカ、チタニアにしてもよく、あるいは、アルミ /アルミナ、金属シリコン //シリカ、金属チタン Zチタニアからなるプレートを用意して、このプレートを用いてゥエルとフィルターとを形成してもよい。

くゥ工ル部〉

一つのバイオチップが有するゥエルの数には特に限定は無く、収納するプローブ付き粒子の種類あるいは粒子の個数により任意に設定可能であり - 単一ゥエルからなるチップ、あるいは一体に形成された複数のゥエルからなるチップのいずれであってもよい。また、プローブ付き粒子の種類が一種類でも分離精製用など多数の粒子を収納する場合には、複数のゥエルを設けて各ゥエルに同一のプローブ粒子を分散収納することも可能である。

ゥエルは図 1 ( a )、 ( b ) に示したように、フィルターと異なる材料により形成することができ、また図 1 ( c ) に示したように、フィルターと実質的に同一の材料で一体に形成することができる。また、図 1 ( a )、（b ) ではフィルター材料とゥエル材料がこれらが異なる材料で形成されているが、同一材料でフィルターとゥエルとを別途に形成した後、これらを接合することも可能である。

ゥエルは、図 1 ( b )、 ( c ) のように、フィルタ一層におけるフィルタ一が形成されていない部分でフィルターと連結されることが、機械的な強度の面では好ましい。

ゥエル部の径と高さには特に限定はなく、必要な粒子の個数と反応容積にしたがって任意に設定可能である。ゥエルの径が大きくなる場合、フィルター面の面積も大きくなり、フィルターに掛かる総圧力によりフィルタ一が撓むか、あるいは破壌される可能性があるが、後述のリブを設けることにより、このような撓みあるいは破壊を防止することが可能である。また、複数のゥエルを持つチップでは、これらのゥエルの径は必ずしも同一である必要はなく、収納する粒子の数や反応容積を勘案して異なる径のゥエルを設けることも可能である。

ゥエル側部からなるゥエル孔の形状は、特に限定されないが、メニスカスを最小限にするために鈍角あるいは円型が望ましい。

<補強用リブ部 >

上述したような底部にフィルターを設けたゥエルでは、フィルターの厚さが薄いために、ゥエルの孔径が大きい場合や、あるいはフィルターの開口率が大きい場合にはゥエル底部の強度が充分ではなく、使用時などにフィルターが破損もしくは損傷し易くなる。そこで、このような場合には、フィルターの上面側または下面側に、リブ状の捕強手段を設けてゥエル底部を補強することが望ましい。

図 3は、このような補強用リブ部を設けたゥエルの底部側を模式的に示した断面図である。図 3 ( a ) では、フィルター 1 8の下面側に突条部位を有するリブ部 2 3が設けられている。図 3 ( b ) では、フィルター 1 8 の上面側にリブ部 2 3が設けられている。

図 4は、捕強用リブ部 2 3をフィルター 1 8の面上に設けた様子を模式的に示した上面図である。同図に示したように、その形状は複数の貫通孔 2 9が形成された一体形状として、貫通孔 2 9の間を連続したリブとすることが好ましい。貫通孔 2 9の貫通方向とほぼ垂直な断面は、円形、矩形、六角形のような多角形など特に限定されないが、メニスカス現象を低減するために円形かあるいは六角形などの鈍角多角形が好ましい。図 5に、実際にフィルター上に補強用リブ部を設けたゥエル底部の電子顕微写真を示す。補強用リブ部のリブ高さほ、ゥエルの底面積やリブの材質にもよるが、好ましくは 1 0 π！〜 2 0 0 0 _£ m、より好ましくは 1 0 0 μ π！〜 1 0 0 0 μ mである。 .

このように補強用リプ部を設けることによりフィルターの機械的強度が向上し、チップ面積が大きいものを使用することができる。また、フィルターが薄くても機械的圧力に対する耐性が得られるとともに、フィルターの孔の深さが浅いものを使用することができるだめ、濾過圧力をより低減することができる。

補強用! ブ部は、図 6 ( a ) のようにフィルターと別途に形成して接合する力 \ あるいは図 6 ( b )、 ( c ) に示したように、フィルター 1 8の細孔をリブあるいはゥエル材料をアディティプ法等で潰して埋めることにより接合するようにしてもよい。ゥエルの側壁 2 0は、フィルター 1 8を貫通させてその貫通した下端部を補強用リブ 2 3の一部とすることができる。別途に形成された捕強用リブ部もしくはゥエル側壁をフィルターと接合する場合、接着剤を使用せずに直接接合することが好ましい。直接接合は、フィルターと補強用リブ部もしくはゥエル側壁を積層法により積み上げて形成する方法など、後述する方法で行うことができる。

この方法では接着剤等を介さずに直接接合されているため、濾過に際して補強用リブ部もしくはゥエル側壁とフィルターとの界面が剥離したり、あるいは界面に濾過対象液が入り込むなどの問題点が解消される。特にゥエルの開口径が小さく、ゥエル数が多いチップの場合には、ゥエル側壁とフィルターとの接合は幾何級数的に困難となり界面で液漏れし易くなるが、接着剤を介することなくゥエルとフィルターとを直接接合することにより液漏れの懸念が解消される。また、補強用リブ部はフィルターの機械的な補強材として設置されており、フィルターとの接着が不充分の場合には機械的強度の向上が期待できない。

しかし、このように接着剤を介さずに直接接合することでフィルターとリプとが充分な強度で一体化し、機械的強度が向上する。

また、図 7 (a)、 (b) に示したように、補強用リブ部をフィルターと同一材料で連続形成することも可能であり、一体形成されているため強度的に望ましい態様である。ここで同一材料とは元の素材が同一であればよく、列えば金属シリコンの一部を酸化して酸化シリコンとしたシリコンシリ力材料、金属シリコンの一部を炭化あるいは窒化して S i Cや S i Nとしたシリコン ZS i C、シリコン ZS i N材料等も、同一材料とみなされる。ゥエルの側壁も同様にしてフィルターと連続形成することができる。その製造方法としては、あらかじめフィルターを作製するに際してゥエルやリブ部については穿孔せずに、次いでゥエルやリブを形成する際にその部分に位置合わせしてゥエルやリブを形成するなどして、フィルターと補強用リブ部もしくはゥエル側壁を同一素材から切削あるいはェツチングにて作製する方法など、後述する方法で行うことができる。

また、リブ 23あるいはゥエル側壁 20の部分におけるフィルター 18 の細孔は必要に応じて無くすることもできる。具体的には、図 1 (b)、（c) のようにフィルター 18の作製時に予め細孔の無い部分を形成しておき、リブ 23あるいはゥエル側壁 20をこの細孔が無い部分の上に位置合わせして作製するカあるいはリブ 23とフィルター 1 8をアディティブ法により作製する場合には、同時に穴埋めする方法で行うことができる。

図 8 (a)、 (b) および図 9 (a)、 (b) に示したゥエルでは、フィルターの下面あるいは上面に前記補強用リブ部 23を設けるとともに、この補強用リブ部 2 3におけるゥエル側部 2 0の下端側の位置に、別途の容器に設けられた凸部と嵌合する位置合わせ用の凹部 2 7が形成されている。凹部 2 7の具体的な形状は別途の容器に設けら.れた凸部に応じて適宜の形状とすることができる。すなわち、ゥエルに形成された凹部 2 7は所定ゥエル内の溶液を別の容器の所定ゥエルに移し替える際に、容器のコネクタ一となるメス型部分の溝であり、容器のォス型部分と嵌合させることで、 . ゥエル内の溶液を容器の所定部分以外に漏らすことなく移動させることが可能となる。位置合わせ用の凹部の溝形状は、メス型として容器に設けられたォス型の凸部に嵌合できるものであれば特に限定されない。

また、ゥエルの位置合わせ用の凹あるいは凸部を設けることなく、図 8 ( c )、図 9 ( c ) に示したように凹部 2 7を形成せずに底面を平滑とすることによつても接合を行うことができる。この平滑面は、平滑であるほど面同士の接合がより強固となる。例えば市販の半導体用のシリコンウェハ一、特に超平滑シリコンウェハーを用いることで、きわめて強固な平滑接合面を得ることができる。

上記のような位置合わせ用の凹部を設けたゥエルによる液体移動は、移動溶液を収容したゥエルと、対応する複数のゥエルを持つ容器がそれぞれ多数存在する場合に、全ての対応ゥエルの溶液を同時並行で対応するゥェル間で移し変える際に有効である。また、複数のゥエルを持つ容器から対応するゥエルを持つチップへの液体移動、あるいは複数のチップ間での液体移動にも適用可能である。

これらの溝を有するリブは後述する各種の製造方法により一般のリブと同様に作製することができる。ゥエル側部の幅や形状は、特に限定されないが、ゥエル側部の幅は好ましくは 1 0 0 μ πι以上、より好ましくは 2 0 0 μ m以上 1 0 mm以下、さらに好ましくは 3 0 0 m以上 5 m m以下である。ゥエル側部の幅が 1 0 0 μ πι未満の場合には、位置合わせ用の凹部を容器の凸部と嵌合させる事が困難となり、あ.るいは平滑面同士を接合した場合に、接合面積が位置合わせのずれによって少なくなる。ゥエル側部の幅が 1 O mmを超える場合には、所定面積中におけるゥエル部分の占める部分が過度に小さくなり、チップの作成効率が低下する。

上述した位置合わせ用の凹部は、捕強用リブ 2 3の一部であるかどうかに関わらず、ゥェルの側部 2 0の下端に形成される。このゥエルの下端に形成される凹部は、逆に凸部であってもあるいは平滑であってもよく、その場合は対応する容器あるいはチップに嵌合用の凹部あるいは平滑部を形成する必要がある。

図 1 0に示したゥエルでは、ゥエルの底部上面に、その周縁から所定の幅で、フィルター 1 8の細孔 1 9が形成されていない無？し部 2 8が設けられている。

この無孔部 2 8の所定の幅としては、ゥエル底部の周縁から好ましくは 5 μ πι〜5 0 πι、より好ましくは 1 0 μ m〜 3 0 μ mである。特に、図 1 0 ( b ) に示したように、無孔部 2 8の面が傾斜していることが好ましい。この無孔部が無く、リブゃゥエルの壁際まで細孔が設けられた場合には、粒子が壁際に滞留したり、あるいはさらに堆積するなどの現象を起こす場合がある。無孔部を設けることで、ゥエルとフィルターとの接続部における機械的な強度が増し、剥離の可能性が低減する。また、溶液はゥェルゃリブの壁際から中心部に移動する層流を起こし、粒子がゥエルやリブの壁際に滞留あるいは積層することが防止される。さらに、後述する光学的検出に際して、壁際に粒子が無いために、ゥエル壁からの光反射により壁際の粒子の検出が阻害されることを防止することができる。

この無孔部を有するゥエルは、あらかじめ特定領域に無孔帯を設けたフィルターを作製し、ゥエルあるいは補強用リブを無孔帯の部分に位置合わせして接合する方法、あるいは無孔帯にゥエルあるいは捕強用リブをアディティブ法等で積み上げる方法などによる方法で作製することができる。また図 1 0 ( b ) のような、無孔部 2 8の面が傾斜している構造は、あらかじめフィルタ一部を形成した後に、ゥエルの高さ方向にゥエツトエッチングして、エッチング残りを残すことにより形成することができる。

以下に、上述してきたゥエルの各種製法について説明する。

第一の方法は、フィルターなどを電気メツキにより積み上げる方法である。本方法では、あらかじめ導電性処理が為された基板を用意し、その上にレジスト等でパター-ングを行い、電気メツキしない部分をレジストで保護して、基板とメッキ溶液との間に電流を流すことにより基板の所定部分にのみ金属あるいはイオン性のポリマー材料を形成する。

先ず、導電性処理が為された基板を用意し、その上にレジストを塗 ίϊする。これらのレジストを導電性基板の上に膜形成した後、ブオトマスクを用意して UV光にて露光現像し、導電性シートの上にフィルターの反転パターンであるレジストのポストを形成する。これらの方法によるパターン限界はレジストの解像度に依存する力 ^s、例えば Τ Η Β— 1 1 O N (商品名： J S R株式会社製）を使用することで、パターンピッチで 5 μ ηι、ァスぺクト比で 2のレジストポストを作製することができる。

次いで、これらのポストの間に、電気メツキ法によって金属あるいはィオン性の樹脂を交流あるいは直流の電流を流して電気的に充填する。電気メツキ法により充填される金属材料としては、金、ニッケル、銅、鉄、鉄ニッケル合金等が挙げられる。ニッケル電鎳のためのメツキ液としては、スルファミン酸ニッケル浴（スルファミン酸 60%液 700g/l、臭化ニッケル 5g/l、硼酸 35g/lの混合液、浴温 50°C)などが用いられ、銅電気メツキ液としては、硫酸銅浴（硫酸銅 200g/l、硫酸 60g/l、塩素イオン 30mg/lの混合液、浴温 30°C)などが用いられ、鉄電気メツキ液としては、スルフアミン酸鉄浴（スルフアミン酸鉄 400g/l、スルファミン酸アンモニゥム 30g/l、ホルマリン 100mg/lの混合液、浴温 46°C)などが用いられる。例えば、スルファミン酸ニッケル浴の場合、電圧 6 V、電流密度 3 A/ d m²で 1 0から 2 0分程度直流を流すことによって厚さ 5 i mの電気メツキ物を得ることができる。

また、電気メツキ法により充填される榭脂材料としては、エポキシ樹脂、アクリル樹脂、ポリイミド樹脂等が挙げられる。これらの樹脂としては、例えば株式会社シミズェコート社のもの、日本ペイント株式会社のパヮ一トップ Uなどのァクリル樹脂などが使用可能である。

また金属、樹脂何れの場合も各種の添加剤を添加することができ、例えばシリカ、チタニア、アルミナ等の金属酸化物微粒子、フッ素樹脂微粒子などを添加することで、形成された膜の化学的な性質を変化させることができる。

次いで、樹脂電铸の場合には、最後に約 2 0 0 °Cの加熱により樹脂をキユア一すると同時にレジストを焼成除去する。電気メツキ法の場合には、例えばレジストストリッパー T H B— S 1 (商品名： J S R株式会社製）によりレジストを除去する。

このようにしてフィルターを作製した後、ゥエルあるいは補強用リブ部を、フィルターの形成方法と同様に、さらに電気メツキ法により形成することができる。すなわち、上記と同様にフィルターの上にレジスト膜を形成し、フォトエッチング、電気メツキ法材料の充填を行う。この場合、一般にゥエルの高さはフィルターの厚さ以上であ.るためにレジスト膜も厚くなり、このためレジストはドライフィルムレジストを積層して使用することが好ましい。一般に、線幅と厚さのァスぺクトが 2を超えるメツキ物の形成は 1回では困難であり、このような場合にはフォトエッチングと電気メツキ法によるメツキ物の形成を数回繰り返すことで所定の高さのゥエルとする。

第二の方法では、フィルター、ゥエル、補強用リブ部の少なくともいずれかをエッチング方法により作製する。エッチングの対象物は、フィルタ一を形成できるものであれば、金属、金属酸化物、有機物など特に限定されないが、特に好ましいのは、機械的強度が高い材料であり、具体的には、例えば液晶ポリマー、ポリカーボネート、ポリアミド樹脂、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリエーテルサルホンなどのエンジニアリングプラスチック；鉄、ニッケル、銅、亜鉛、アルミニウム、シリコン、チタン、タンタル、マグネシウム、モリブテン、タングステン、ロジウム、パラジゥム、銀、金、白金、ステンレス、真鍮、黄銅、青銅、燐青銅、アルミ銅合金、アルミマグネシウム合金、アルミマグネシウムシリコン合金、アルミ亜鉛マグネシウム銅合金、鉄ニッケル合金などの金属；シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコユア、酸化タンタルなどの金属酸化物； S i N、 T i N、 T a Nなどの金属窒化物； S i C、W Cなどの金属炭化物；ダイヤモンド、グラフアイト、 Diamond Like Carbon (D L C )などの炭素材料；ソーダーガラス、ホウ珪酸ガラス、パイレックス（商標）、石英ガラスなどのガラスが挙けられる。

エッチングは通常の方法によって行うことができる。但し、アスペクト比が余りに大きいエッチングはその孔径ゃ形状.が不均一になる可能性があり、実質的には、通常の化学エッチングで得られるァスぺクト比としては 5以下、好ましくは 3以下である。但し、このアスペクトの範囲で積極的に逆テーパー形状が形成されたフィルターを使用することで濾過性の良好なフィルターを得ることもできる。

また、ゥエルやリブ形状をエッチングで作製する場合には、アスペクト比が 5以上となることが望ましく、材料の異方性エッチングによりァスぺクト 5以上のエッチングを行うことができる。例えば、シリコンなどの単結晶材料で K O H水溶液ゃェチレンジアミン'ピロカテコール（EDP)、 4メチル水酸化アンモニゥム（TMAH)などのェッチング液に対して大きな結晶依存性を示すことを利用する。シリコンの場合は（1 1 1 ) 面のエッチング速度が他の結晶面に対して極端に遅く、（1 1 0 )面を表面としたシリコンウェハを用いてマスク材の開口のある辺を（1 1 1 ) 面方向と揃えて化学的エッチングを行うことでァスぺクト 1 0 0程度のエッチングを行うことが可能である。これらの方法は、精密工学会、編著：「ナノスケール加工技術」、日刊工業新聞社（1993)に記載されている。

また、必要に応じて、プラズマを用いた反応性イオンエッチング（R I E ) を行うことができる。例えば、 S F ₆にフレオン系の塩素ガスを含むガスによって基板に垂直な異方性エッチングを行うことができる。これらの方法は、「' 0 2最新半導体プロセス技術」、プレスジャーナル社 (2001)に記載されている。

特に、組成の異なる複数の材質からなるプレート、例えばアルミノアルミナ、金属シリコン zシリカ、あるいは金属チタン/チタニァなどについて、それぞれ両側からパターンエッチングを行うことによりフィルターとゥエルを形成する方法が好ましレ、。具体的には、.例えばアルミナ、シリカ、チタニアなどの金属酸化物層について、この金属酸化物層と金属層との境界までをフォトエッチングしてフィルターを形成し、次いで、アルミ、金属シリコン、金属チタンなどの金属層について、この金属層と金属酸化物層との境界までフォトエッチングすることにより、ゥエルとフィルターとが接合したバイオチップを作製できる。

この方法によれば、予め金属と金属酸化物などが一体となつた複層材料を使用することにより、フィルターとゥエルが一体接合したものを作製することができ、フィルターとゥエル間の界面からの液漏れなどの懸念がなくなる。

このような複層材料としては、例えばアルミ板の表面を所定の厚さまで酸化してアルミナとしたアルミ Zアルミナ板、金属チタンを同様に酸化した金属チタンノチタニア、酸化膜付きシリコンウェハー、あるいは s o I

(Silicone On Insulator)ウェハーなどが挙げられる。

また、エッチング法によりシリコンウェハーをエッチングしてフィルタ一、リブおょぴゥエルを個別に形成し、シリコンウェハーの平滑性を利用してこれらを積層してチップとすることも可能である。この場合、フィルター、リブおよぴゥエル用のシリコンウェハーの厚さはそれぞれに適宜設定され、エッチング方法もドライエッチングとゥエツトエッチングをそれぞれフィルター、リブおよゥエル毎に使い分けることも可能である。この方法では、フィルターとリブもしくはゥエルとを同一材料でエッチングする方法に比べて、段差のある穴を開ける必要が無く、フィルター、リブおよびゥエル毎に設定された径の貫通穴を開けた後、これらを積層して組み立てるだけであるため作製が簡便である。また、シリコンの平滑性により接合を行う、接着剤を使用しない界面接合により接合しているので、界面からの液漏れが無く、且つ剥離強度の高いチップを作製することが可能である。

フィルター、リブおよぴゥエルを所定の位置間隔で積層するためには、あらかじめこれらに位置合わせマークを設けてこのマークにより位置合わせすることが好ましい。また、液中で積層する場合、積層プレートの横ずれによる積層面の剥離を防止するために、積層面をクランプすることが望ましい。

第三の方法では、フィルターを金属の陽極酸化により作製する。対象金属としては、アルミニウム、シリコンなどが挙げられる。以下、アルミ二ゥムを例として具体例を示す。先ず、アルミニウムの板を用意する。アルミニゥム板は場合により片側にゥエルの深さよりも約 1 0 0 μ πι程度の浅い凹面をあらかじめ形成しておくが好ましい。例えばゥエルの深さを 5 m m、フィルターの厚さを 2 0 mとする場合は、アルミ板の厚さが 5 . 0 mmであり 4 . 9 mmの凹面を持つアルミ板を用意する。凹面内部に、陽極酸化工程中の機械的な強度維持を目的として、モンタン酸ワックス、ポリエチレンワックス（クラリエント株式会社製）などのワックスなどの充填物を充填しておき、フィルター形成の後に熱溶融除去することも可能である。次いで、これらの凹面とほ反対側に、フィルターの孔を空けるための先導孔を形成する。この先導孔はピッチが 1 μπι以下、好ましくは 0. 5 μ m以下であり、深さが 0. 1 m以上であることが好ましい。これらの先導孔は、金型を用いたスタンビングによる方法の他に、レジストによるフオトエッチングでも得ることができる。

次いで、これらのアルミをシュゥ酸あるいは硫酸溶液中で電圧を掛けながら陽極酸化する。その具体的な方法は、特開 2003— 1 1 09 9号公報に記載されている。陽極酸化によりフィルターを作製した後、アルミに形成された凹面の底面と、フィルタ一孔とを貫通させるために、アルミゥエルの凹面に燐酸、フッ酸、硝酸などの強酸あるいはこれらの混酸あるいは塩化第二鉄を滴下する。例えば塩化第二鉄の場合は 50°C、 20時間ェツチングすることによりゥエル底面をフィルタ一孔面まで貫通させることが可能である。これらの方法は応用物理第 6 9卷第 5号（2.000)、特開 2000— 258650号公報などに記載されている。この陽極酸化による方法によれば、孔径が 5〜450 nm、アスペクト比約 1 00、大きさが 5〜 1 Omm程度のフィルターを作製することが可能である。

第四の方法では、フィルターを樹脂のナノプリントで作製する。先ず、ナノプリントによるフィルターを形成するためのベース板を用意する。ベ一ス板は平滑な板か、あるいはゥエル孔とするためにあらかじめ約 1 00 μ m程度の底部厚さを残した凹面を有する板でもよい。この凹面も上記と同様にワックスなどを充填してもよレ、。

あらかじめナノプリント用の型を用意しておく。型の製造方法は特に限定はないが、孔径が数十 μπι以下である孔を設けた型は製造方法が限定され、一般にはシリコンの結晶異方性を利用した異方性ェツチングゃ X線リソグラフィ一による方法によるいわゆる M E M S ( Micro Electro Mechanical System ) 技術により得られる。あるいは M E M S技術により作成された型を元に金属メツキをした反転型を使用することも可能である _c この様にして用意された型は、プレス装置に装着される。このナノプリント装置としては、株式会社テクトリアの N P H T— 1、株式会社日立製作所のナノプリント装置、明昌機ェ株式会社のナノプリント装置などを使用できる。

ナノプリントによって成型する樹脂としては、流動性の良好な樹脂が好ましく、液晶ポリマーや結晶性のナイロン樹脂などが好適である。あるいはエポキシ樹脂やウレタンァクリレートなどのオリゴマーをプレスと同時に光硬化あるいは熱硬化させてもよい。エポキシ樹脂やウレタンアタリレートは液状の樹脂の他にプリプレダフィルム状のものも使用可能である。これらのナノプリントによりプレス成型されたフィルタ一は型抜きせずに底面に皮状の樹脂を残す方が成型の失敗が少なく、型が抜きやすい。また型抜きの容易性や型の損傷を考慮すると形成する孔はァスぺクト比で 1 0以下が好ましく、より好ましくは 5以下である。

また、成型時に積極的に皮部分をゥエル部分として残し、別途にこの皮部分を掘削あるいはエッチングにてゥエル形成することが可能である。フイルム残渣をゥエルとして利用する場合は、具体的にはベース板より樹脂残渣シートを剥離した後、剥離部分をドリル穿孔するか、あるいはフォトエッチングを行うことによりフィルター部分まで貫通孔を空けることが可能である。あるいは途中までを機械的に穿孔した後、最後の数 H ^〜数百 mを酸やアル力リなどによりエッチング除去することも可能である。

第五の方法では、リブあるいはゥエルを光造型で作製する。先ず、上述した電鍚、エッチング、金属の陽極酸化、樹脂のナノプリントのいずれかの方法によりフィルターを作成する。あるいはプレス加工、エキスパンドメタル法により作製されたフィルターなどを使.用することも可能である。これらのフィルターをベース板として、あるいはフィルターを別のペース板の上に固定してその上にゥエルあるいはリブを形成する。

具体的には、図 1 1 ( a ) に示したようにベース板 7 1にフィルター 1 8を固定して、光造形機バス 7 2へ設置し、ベース板 7 1を支持するエレベータ一 7 3を下降させ、フィルター 1 8側に U V硬化樹脂を 1層分流し込み、 U V光を照射して 1層分の樹脂層のリブ部 2 3 (あるいはゥエル部分）を硬ィ匕させる。エレベーター 7 3の移動と U V照射を繰り返して所定の層まで積層硬化させた後、ベース板 7 1を含む積層体を U V樹脂液から取り出し、未硬化部分を洗浄してベース板 7 1を外しポストキユア一してリブあるいはゥエル付きフィルターを得る。

この光造型による方法において、フィルター 1 8を下にしてその上に閉じられた形状のリブ部 2 3あるいはゥエルを光造形で形成する場合、これらの内部における未硬化の樹脂の排出が困難であり、内部の樹脂が表面張力で盛り上がるためにリブあるいはゥエルの形状が乱れる可能性がある。このため、図 1 1 ( b ) に示したように、フィルター 1 8を上にしてその下側に光造形によりリブ部 2 3あるいはゥエルを形成成長させる方法が好ましい。この方法を行うための光造型装置は株式会社デンケンより S L P 一 4 0 0 0として装置が市販されており、また造型の製造受託を行っている。また、現在の光造型は主としてレーザー照射により光硬化性樹脂の硬化を行っているが、上記の場合には照射パターンは一律であり、フォトマスクを通して光照射を行い U V樹脂を積層することも可能であり、造型時間を短縮することができる。

第六の方法では、ゥエルあるいはリブとフィルターとを熱接着で接合する。例えば、フィルタ一部分を加熱してゥエル.あるいはリプを非加熱の状態で接合させ熱接着させる。フィルタ一部分は熱伝導率の良い金属あるいはセラミックスで作製し、リブは熱可塑性の材料を成型加工で作製する。フィルターの端面を加熱材料と接合させ、熱導電性を利用してフィルターを加熱しゥエルとリブを熱接着する。

あるいは、電磁誘導加熱または誘電加熱を利用する。ここで使用されるゥエルあるいはリブは、電磁誘導加熱あるいは誘電加熱で発熱しなレ、低誘電率の材料である熱可塑性の樹脂で作製する。ここで使用される材料の誘電率は 3 . 5以下であることが好ましい。具体的な樹脂材料としては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチルメタァクリレート樹脂、液晶ポリマー、ポリカーボネート、ポリアミド樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、シクロォレフィン、ポリメチルペンテン、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリエーテルサルホンなどが挙げられる。

上記のような樹脂材料を何らかの方法で成型してあらかじめゥエルあるいはリブ形状にする。ゥエルは、フィルターに載置する複数のゥエルを一体に全て作製しておくことが望ましく、その方法としては射出成型、プレス成型または異型押し出し成型によって複数のゥエル孔の空いた連続パイプを作製してパイプを輪切りにする方法、板にドリルなどの方法で孔を空ける方法などが挙げられる。

また、ここで使用されるフィルター材料は誘電加熱で加熱される材料が好ましく、誘電率が 3 . 8以上であるものが好ましい。具体的には、例えば金、銀、ニッケル、銅、鉄、アルミニウム、チタン、シリコン、ステンレス、タングステン、モリプデンなどの金属；シリカ、アルミナ、チタ二ァなどの金属酸化物； S i Nなどの金属窒化物.；ソーダ一ガラス、ホウ珪酸ガラス、パイレックス（商標）、石英ガラスなどのガラスが挙げられる。あるいは、樹脂材料に無機材料のフィラーを混合したものを用いてもよレ、。ゥエルとリブとの間にフィルターを挟むなど、ゥエルとリブとの少なくともいずれかとフィルターとを重ね、固定治具で固定し、あるいは樹脂口一ラーなどで挟み込んで加圧して電磁誘導加熱あるいは誘電加熱させ、フィルター部分を発熱させてその熱によってゥエルとリブとをフィルターに熱溶着する。電磁誘導あるいは誘電加熱の周波数としては、 3 0 k H zから 3 0 O MH zが利用可能であり、好ましくは 1〜 1 0 O MH zである。第七の方法では、フィルターとゥエルを接着剤で接着する。予め接着剤をゥエルの片側端面に塗布しておき、フィルターに貼り付け、必要に応じて加熱して接着する。あるいは、クラリアントジャパン L I C OWA X L Pなどのワックスをゥエルに塗布し、フィルターを加熱して塗布冷却する方法で接着する。

第八の方法では、フィルターのィンサート成型によりゥエルあるいはリブを作製する。ィンサート成型ではあらかじめ作成したフィルターを金型に揷入して、榭脂成型を行うことでフィルターと樹脂とを一体成型することが可能である。

第九の方法では、フィルターとゥエルとをそれぞれ磁性材料を用いて磁力により結合させる。例えば、フィルターかゥエルのいずれかに強磁性体を用い、対応するゥエルあるいはフィルターを磁石で構成し、磁石で結合することによりフィルター付きのゥエルとすることができる。強磁性体としてば、ニッケル、鉄などが挙げられ、磁石としてはフェライト、サマリゥムコバルト磁石、ネオジゥム系磁石、アルミニウムコバルト系磁石などが挙げられる。

フィルターを磁石とする場合には、例えば平滑な鲖、ニッケル、クロムなどの金と接着性の良い金属板の表面に、数十オングストロームの厚さで金蒸着を行い、次いでフォトレジストを塗布した後にフィルターの細孔を形成する部分にレジストを残したパターユングを行う。次いで無電解フヱライトメツキを行い厚さ 1〜2 0 μ πιのフェライト層を形成した後、レジスト剥離液にてレジストを剥離し、最後に金蒸着層からフェライト層を剥がす。このフェライトメツキは、例えば日本応用磁気学会誌 Vol22， No9, 1998 1225-1232, 日本応用磁気学会誌 Vol 24, No4 - 2， 2000， 515-517 の条件に準じて行うことができる。

このようにフィルターを磁石として、例えば上述した電铸ニッケルメツキによりゥエルを作製し、両者を磁力により結合することでフィルター付きゥエルが作製される。

また、リブを磁石とする場合には、例えばフェライト、サマリウム系あるいはネオジゥム系の磁性粉を樹脂パインダ一にて混合してシートとしたプラマグシート（例えば株式会社マグエックス社製のもの）などにレーザ一にて厚さ 0 . 3 m m〜 1 m m程度の孔を空けた後、上述したニッケルフィルターと磁石により結合してフィルター付きゥエルとすることができる。第十の方法では、機械的な嵌合によりゥエルとフィルターとを結合させる。例えば、上述したニッケルの電気メツキ法により作製されたゥエルのレジストを剥離する前に、さらにレジストを塗布パターニングし、ゥエル壁上面中心にゥエルの幅よりち 5 0 μ m〜 1 0 0 ^ mだけ幅が狭いテーパ状のレジスト溝を設ける。この溝に、すずもしくは金などの軟らかい金属、あるいは樹脂によるメツキを行い溝を充填する。次いで、レジストを剥離液にて剥離して、ニッケルのゥエルの上に高さが幅とほぼ同等のすず、金あるいは樹脂などの櫛形の凸部が形成された凸構造のゥエルを形成する。同時に、フィルター側にもレジストで同じ位置に、メス型となるような、上記の凸型と高さと幅が同等でゥエルの凸部よりも硬いニッケル、ポリイミド樹脂などの凹型形状を形成する。次いで、両者をロールなどで加圧することで機械的に嵌合して結合させてフィルター付きゥエルを得る。また、逆にゥエル壁上面に凹形状を設け、フィルター側に凸形状を設けるようにしてもよい。

本発明のバイオチップでは、第一のフィルターをゥエルの底部に設けるとともに、その上側（ゥエルを介して反対側）に第二のフィルターを設ける構成であってもよい。第二のフィルタ一は、上述した方法により得られた底部にフィルターを有するゥエル内にプローブ担持粒子を収納し、さらに上述した方法により得られたフィルターを接着剤、磁力、機械的な嵌合、平滑面同士の平面接合、機'械的なクランプにより接合する方法などにより設けることができ、これにより上下にフィルターを有するバイオチップを得ることができる。

また、フィルターが各ゥエルの底部に形成されたバイオチップは、例えば次の方法で作製することができる。

( 1 ) 図 1 9 ( a ) に示したように、フィルター 1 8をコルゲート状にして、その凸頂部 3 2と凹頂部 3 4とを、側壁 2 0を構成する適当なフィルムあるいはフィルターで接着して各ゥエル 1 6、 1 6 · · .を形成する方法 ( 2) 図 1 9 (b) に示したように、金属、あるいは樹脂製のフィルタ一を、プレス金型を用いて、所定の間隔に凹部を有する形状に成型してこの凹部をゥエル 1 6、 1 6 · · · とする方法、 .あるいはさらにその片側を

' 別のフィルターあるいはフィルムを粘着剤、磁石や機械的な嵌合などの方法で接合して閉ざされた空間を有するゥエルを形成する方法

(3) 図 1 9 (c ) に示したように、ゥエル 1 6、 1 6 · · · の底壁 2 2に、レーザー、プレス、フォトエッチング等で貫通孔を穿設してフィルター 1 8とする方法、あるいはさらにゥエルの上をフィルターで粘着剤、磁石や機械的な嵌合により接合する方法

(4) 図 1 9 (d) に示したように、底壁 2 2の無い、側壁 2 0で形成されたものを作成し、その底部にフィルター 1 8を接着する方法、あるいはさらにゥエルの上をフィルターで粘着剤、磁石や機械的な嵌合により接合して覆う方法

(5) 金属、金属酸化物、金属 Z金属酸化物あるいは樹脂等をレーザーによる穿孔、機械プレスまたはフォトエッチングする方法

本発明のバイオチップは、一体に形成された複数のゥエルもしくは単一のゥエルを有しており、このゥエルにプローブ担持粒子が分散された分散液が収容される。ゥエルに収納する粒子はフィルター細孔よりも大きい粒子径で、チップの粒子をフィルターの孔に静置させ光学検出する場合には、プローブ担持粒子の粒子径とフィルターの細孔の孔径は、粒子径/孔径 = 1. 1〜2. 5であり、且つ、粒子径く孔間隔く粒子径 X 1 0、より好ましくは粒子径<孔間隔く粒子径 X 4である関係を有している。ここで、「孔間隔」とは隣接する各孔の間における孔が空いていない部分の最短距離のことである。粒子径 /孔径が 1 . 1未満である場合、粒子が細孔に入り込み、細孔から粒子が脱離できない確率が高くなる。粒子径孔径が 2 . 5を超える場合、粒子を含む溶液をフィルターを介して濾過.し、粒子をフィルター上に残した際に、粒子が孔上に位置せず、ランダムに、あるいは粒子同士が重なり合ってフィルター上に配列される確率が高くなる。粒子が細孔に入り込み脱離できなくなることをさらに防止するためには、上記の関係が、粒子径 Z孔径 = 1 . 1 5〜2 . 0であることがより好ましく、さらに好ましくは粒子径ノ孔径 = 1 . 2〜1 . 6である。

また、チップを分離精製用に使用する場合には、粒子の粒子径、フィルターの孔径および孔間隔は、粒子径>孔径 +孔間隔 Z 2である関係を満足するように設定される。この関係を満たしていると、粒子を含む溶液をフィルターを介して濾過し、粒子をフィルター上に静置させた際に、粒子がすべてのフィルタ一孔上に静置せず少なくとも 1つおきの孔間隔で粒子が静置するために、少なくとも 5 0 %以上の間隔で粒子により塞がれないフィルタ一孔が存在し、この結果、濾過抵抗の上昇が防止される。

1ゥエルに収納する全粒子数は用途により異なり、分離分画用途の場合はフィルター細孔数の 1 0 0倍〜 1 / 1 0 0倍、好ましくはフィルター細孔数の 1 0〜1 / 1 0倍の範囲内であり、検出 ·同定の場合は各プローブごとに粒子の絶対数で 1〜1 0 0 0個、より好ましくは 1〜5 0 0個、さらに好ましくは 1〜 2 0 0個である。 1ゥエル内の粒子数が多いと、濾過に際して濾過抵抗が大きくなり濾過性能を低下させ、あるいはフィルターが破壊される。検出 ·同定に際して有意となる粒子数は 1 0 0 0個でも充分であり、それ以上は意味がなくむしろ濾過性を困難にする。

各ゥエルへ収納するプロ一プ担持粒子の絶対数は、次の方法で制御することができる。

すなわち、粒子溶液の投入時にフローサイトメ一ターで粒子を個別に制御しながら C C Dカメラなどで個々の粒子を実際にカウントしながら投入することにより制御することができる。あるいは、あらかじめ粒子溶液の粒子濃度を測定しておき、当該溶液内の粒子濃度と粒子の比重から粒子数を計算して、この結果から逆算した粒子溶液量をスポッタ一等で投入することで、近似の粒子数をセル部屋に投入することができる。また、複数回に分けて所定数の粒子をスポットし、スポットした粒子数をその都度カウントして不足量を算出し、不足量がゼロ近似になるまでスポットを行う方法も可能である。

ここで、粒子数は、ある程度の近似的な同一性があればよいが、その誤差範囲は C V値で 2 0 %以内であることが好ましく、より好ましくは 1 0 %以内である。

プローブを担持する粒子としては、フィルターの細孔径ょりも大きな径をもつ粒子であれば特に限定されず、有機粒子、無機粒子、有機無機粒子、相転移ゲルなどのいずれも使用可能である。

有機粒子としては、具体的には、ブタジエン系、スチレン系、ジビエルベンゼン系、アクリロニトリル系、アタリレート系、メタタリレート系、アクリルアミド系、ベンゾグアナミン系、ナイロン系、ポリビニァコール系おょぴフッ素系等のモノマーを、単独であるいは 2種以上を組み合わせて用いたモノマー原料から、乳化重合あるいはサスペンション重合により得られた粒子を使用することができる。あるいは多孔質の均一孔を持つプレートから樹脂を押し出して粒子を作成する膜乳化などによる方法も可能である。これらの粒子は必要に応じて分級機にて粒子径を揃えることも可能である。

また、重合時にあるいは重合後にフェライト等の磁性体を添加して得られたもの、あるいは特開平 1 0— 8 3 902などの方法にて粒子をフェラィトメツキしたもの、あるいはセルロース、デンプン、ァガロース、ガラクトース等の天然物架橋ゲル、アクリルアミド等の合成架橋ゲルも使用することができる。

これらの粒子径の粒子径分布は、 CV値で 1 0%以内とすることが好ましく、より好ましくは 5%以内である。 CV値が 1 0%を超える場合、粒子がフィルターの孔に入り込む確率が高くなる。

スチレン系の粒子については、例えば特開昭 57- 1 68 1 6 3号公報に記載の方法により得ることが可能である。

また、磁性粒子は、例えば特開平 1 1一 1 766 22号公報に記載の方法により得ることが可能である。

無機系の粒子としては、金属酸化物粒子、金属硫化物粒子、金属粒子を使用することができる。

金属酸化物粒子として最も好ましいのは、シリカ粒子であり、市販の各種シリカ粒子を使用することができる。

また、市販されている各粒子が使用可能であり、例えば、ィムテックス (商品名： J SR)、 MC Iゲル（商品名：三菱化学）、トヨパール（商品名：東ソ一）、ダイソーゲル（商品名：ダイソ一）、ショーデッタス（商品名：昭和電工），サンスフエアー（商品名：旭硝子）、 PL- P EGA (商品名： Polymer Laboratories)、 P L - CM b> ^品名： Polymer Laboratories)、 P L-P B S (商品名： Polymer Laboratories) , P L- DMA (商品名： Polymer Laboratories)、 AM resin (商品名： Novabiochem) _N P 500 (商品名：東レ）、トレパール '(商品名：東レ）、テクポリマー（商品名：積水化成品工業）、 M P , MRシリーズ（商品名：綜研化学）、ベルパール（商品名：鐘紡）、ェポスター（商品名：日本触媒工業）、セルロースパウダー (チッソ、旭化成）、セファセル（商品名：アマ一シャムフオルマシア社）、セファロース（商品名：アマ一シャムフオルマシア社）などが使用可能である。

前記粒子表面を、アミノ基、カルボキシル基、カルポジイミド基、ェポキシ基、トシル基、 N—サクシイミド基、マレイミド基、チオール基、スルフィド基、ヒドロキシル基、トリメトキキシリル基、二トリル三酢酸基、ベンゾスルホアミド基、ポリエチレンイミン基，四級アンモニゥム基，ォクタデシル基等の各種官能基、あるいは γ—ダリシドォキシプロピルトリメトキシシランなどにより表面修飾して、プローブ結合サイトとすることができる。

また、これらの表面修飾に際して、粒子担持プローブと被検体との反応の際の立体障害を低下させるために、炭素数 1 0〜 1 0 0のアルキレン基の両端に官能基が結合した構造の化合物、例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテル誘導体、 N—k—マレイミドウンデカニック酸、メルカプトプロビルトリメトキシシラン、力リックスアレン誘導体、液晶をスぺーサ一として使用することができる。また、アミノ基、カルボキシル基、チオール基などで修飾されたオリゴヌクレオチドもスぺーサーあるいはスぺーサ一兼結合サイトとして使用可能である。

プローブを担持する粒子として、有機粒子を使用する場合、その粒子径は、 0 . 0 2 μ m〜： 1 2 0 μ mが好ましく、より好ましくは 0 . 1 m 6 0 mである。粒子径が小さい場合にはハンドリング性に難点が生じ、これらの粒子を捕捉するフィルターの作成が困難となり、またフィルター孔が小さいために被検体が目詰まりしゃすくなる。また粒子径が大きい場合には、立体障害のために反応性が低下するこ.とがある。

また、必要に応じて粒子を多孔質または中空状にすることが好ましい。これによつて、粒子径が大きい場合であっても、重量による粒子の沈降に起因する被検体との反応性の低下を防ぐことができる。

プローブを担持する粒子として、無機粒子を使用する場合、その粒子径は、 0 . 1 μ πι〜0 . 1 mmが好ましく、より好ましくは 1 m〜 0 . 0 5 mmである。粒子径が小さい場合にはハンドリング性に難点が生じ、特にフィルターの細孔による粒子の捕捉が困難となる。また粒子径が大きい場合には、沈降するために反応性が低下することがある。

また、必要に応じて粒子を多孔質にすることが好ましい。これによつて、粒子径が大きい場合であっても、重量による粒子の沈降などを防止することができる。

プローブ担持粒子を各ゥエルへ収納する方法としては、粒子にあらかじめ各ゥエルに対応した各種のプローブを別途固定化しておき、これをスポッタ一等で対応するセル内に投入する方法が挙げられる。あるいは、プロ一プ結合サイトを表面に有する粒子をスポッター等で各ゥエルに投入し、次いで、所定のゥエルに対応した、種類の異なるプローブをスポッターなどで対応するゥエルに投入する方法を用いることも可能である。

前者の方法では、粒子にプローブを結合する方法として、市販されている各社の固相合成機を使用することができ、例えば、オリゴヌクレオチドの合成機、ぺフチドの合成機、糖鎖合成機、コンビナトリアルケミストリ一による各種低分子化合物合成機などを使用することができる。固相法では反応と分離のために担体としてシリカビーズゃポリスチレンジビエルべンゼン粒子が使用されており、これらの固相合成担体ビーズとチップ 1 0 に収納する粒子担体を兼用することで、合成機で合成したプローブ担持ビーズをそのままチップ 1 0にスポットして収納することが可能である。これらの合成機、特にオリゴヌクレオチドの合成機は汎用に普及使用されており、現在では、例えば夕方に合成機をセットすれば、翌朝にはォリゴフクレオトチドを固定化した粒子を作成することもできるようになり、これをスポットするだけで任意のヌクレオチドをもつオーダーメードチップを極めて短時間に作成することができる。

粒子に担持するプローブとしては、例えば、核酸、分子量 5 0 0〜1 0 0万のタンパク質、脂質、糠鎖、細胞、タンパク質発現細胞、ァプタマ一、ウィルス、酵素、分子量 5 0〜 1 0 0万の、薬理活性を有するリード化合物、あるいは特定の生理活性作用を持つか、これを持つ可能性のある化学物質などを使用することができる。

このうち、分子量 5 0〜 1 0 0万のタンパク質としては、具体的には、合成ペプチド、膜タンパク質、酵素、輸送蛋白、サイト力イン、リンフォ力イン、 I g Aおよび I g Eなどの抗体、各種抗原、あるいはルシフェリン、ルシフヱラーゼ、ェクオリン、グリーン蛍光タンパク質等の生物発光機能を有するものなどが挙げられる。

脂質としては、具体的には、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトーマンノシド、ウルシオール、各種のガングリオシドなどが挙げられる。ァプタマ一は、タンパク質、酵素、色素、アミノ酸、ヌクレオチド、成長因子、遺伝子発現調節因子、細胞接着分子、生物個体などと結合能力のある機能性核酸であり、具体的には、トランビンアブタマ一、エラスターゼァプタマ一、活性化プティン C， C型肝炎ウィルスの N S 3プロテア一ゼァプタマ一などが挙げられる。

分子量 5 0〜 1 0 0万の、低分子リード化合^としては、具体的には、基質、補酵素、調節因子、レクチン、ホルモン、神経伝達物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザィム、ァプタマ一等のリガンド、フエ二ルビペリジン誘導体、スルホンアミド/スルホン酸誘導体、ステロイド、プロスタグランディン誘導体などの医薬候捕物質が挙げられる。

プロ一ブ担持粒子は、プローブの種類を識別するためのプロ一ブ識別情報を与えるための少なくとも一種の識別手段を有することが可能である。このような識別手段としては、プローブ担持粒子の色、形状および粒子径が挙げられる。

これらの識別手段は複数を組み合わせてもよく、例えば色と粒子径、色と形状、色と遺伝子配列などの組み合わせが可能である。識別手段を色とするためには、粒子を染料、顔料、蛍光染料などで含浸着色させる。これらの染料、顔料、蛍光体、燐光体について、異なる吸収、発光波長を持つものとその色濃度とを組み合わせることで、さらに多数のプローブ識別情報を得ることが可能である。例えば、色の種類として 2色、色濃度として 3濃度を用いることで 9種類の識別情報を得ることが可能である。染色粒子としては、例えば、 J S Rの I MMU T E Xなどが使用可能である。ま ,こ、光粒子は、 Molecular Prooes, Inc.の FluoSpheres fluorescent microspheres として販売されているカルボキシル変性、スルホン酸変性、アルデヒドースルホン酸変性、ァミン変性粒子などが使用可能である。これらの色識別情報は次のようにして検出される。先ず、色標識された粒子に光源を照射する。色素標識が蛍光体、憐光体である場合は、対応する蛍光あるいは燐光励起波長光源である必要がある。次いで C C Dカメラ、光電子増幅管などで粒子からの蛍光あるいは燐光などを光学的に検出し、得られた検出情報を統計的に処理してプローブ譁別情報を得る。

また、粒子径を識別情報とする場合には、あらかじめ粒子径の大きさを各プローブに対応して変えたものを用意する。これらの粒子径としては、検出感度の問題から、粒子径の差を 0 . 3 // m単位以上とすることが好ましく、より好ましくは 0 . 5 μ πι以上である。

このように、ゥエル内に複数の識別可能なプローブ担持粒子を収納することで、 1ゥエルで同時多項目検出が可能となり、反応時間と操作工程が短縮する。また、複数のゥエルを有するチップを用いてヴエルの位置情報と複数の識別可能なプローブ担持粒子を組み合わせることで、例えばゥェル数を 1 0 0ゥエル、識別可能なプローブ担持粒子の種類を 1 0 0とすることで 1 0 0 X 1 0 0 = 1 0 , 0 0 0種類のプローブを収納するバイオチップを得ることが可能となる。

上述したような識別手段を有するプローブ担持粒子は、以下のように各ゥエルへ収納される。

(i) 全ての識別手段における識別情報が同一である複数のプローブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収容された複数のプローブ粒子について、識別情報が同一である。すなわち、一つのゥエルに色、粒子径などのプローブ識別手段が同じであり、色の種類、粒子径のサィズなどの識別情報も同一である複数の粒子が収納され、各ゥエル間についても同じ粒子が収納されている。なお、識別情報が同一であることが予め判明している場合は、プロ一ブ識別情報とプロ一プ識別工程は無視することも可能である。 (i i) 全ての識別手段における識別情報が同一である複数のプロ一ブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプローブ粒子について、識別情報が異なっている。すなわち、つのゥェルに色、粒子径などのプローブ識別手段が同じであり、色の種類、粒子径のサイズなどの識別情報も同一である複数の粒子が収納され、各ゥエル間については、識別手段は同一であるが色の種類、粒子径のサイズなどの識別情報が異なる粒子が収納されている。

(i i i) 少なくとも一種の識別手段における識別情報が異なっている複数のプローブ粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプローブ粒子について、その全ての識別手段における前記識別情報の構成が同一である。すなわち、一つのゥエルに、色、粒子径などのプローブ識別手段の少なくとも一つについて、色の種類、粒子径のサイズなどの識別情報が異なっている複数のプロ一プ担持粒子が収納され、各ゥェル間については、この識別情報の構成は同一である。

(iv) 少なくとも一種の識別手段における識別情報が異なっている複数のプローブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプローブ粒子について、その少なくとも一種の前記識別手段における前記識別情報の構成が異なっている。すなわち、一つのゥエルに、色、粒子径などのプローブ識別手段の少なくとも一つについて、色の種類、粒子径のサイズなどの識別情報が異なっている複数のプロ一ブ担持粒子が収納され、各ゥエル間について、この識別情報の構成が異なっている。アツセィの内容に応じて、ゥエルの数およびゥエルに収納されるプロ一ブ担持粒子の構成が適宜選択される。例えば、図 2 6 ( a ) に示したように単一のゥエルに同一のプローブ担持粒子を収納する態様；図 2 6 ( b ) に示したように単一のゥエルに識別情報が異なるプローブ担持粒子を収納する態様；図 2 6 ( c ) に示したように複数のゥエルに同一のプローブ担持粒子を収納する態様；図 2 6 ( d ) に示した,ように複数のゥエルに識別情報が異なるプローブ担持粒子を収納するとともに、各ゥエル間での識別情報の構成が同一である態様；図 2 6 ( e ) に示したように複数のゥエルに識別情報が異なるプローブ担持粒子を収納するとともに、各ゥエル間での識別情報の構成が異なる態様などを挙げることができる。

例^ば、上述したプローブ担持粒子を収納したゥエルに被検体を投入する際には、図 2 7 ( a ) のようにゥエル 1 6の上部開口から投入する他、図 2 7 ( b ) のように容器 1 2に収容した一被検体と各ゥエル 1 6の底部を接触するようにしてもよく、あるいは、図 2 7 ( c ) のように各ゥエル 1 6に対応する区画を有する容器 1 2に区画ごとに異なる被検体を収容し、これに各ゥエル 1 6の底部を接触させることにより、各ゥエル 1 6ごとに異なる被検体を収容することも可能である。

<バイオチップキット >

本発明のバイオチップキットは、バイオチップと、バイオチップのゥェルを収納し、あるいはバイオチップと接続する容器とを備えている。

容器の材質は特に限定されず、有機材料および無機材料のいずれも使用することができる。有機材料としては、具体的には、ポリエチレン、ポリエチレン酢酸ビュル樹脂、ポリエチレンビニル樹脂、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリブタジエン、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリメチルメタァクリレート榭脂、 A S樹脂（ァクリロニトリルとスチレンの共重合体）、 A B S樹脂（アクリロニトリル、ブタジエンおよびスチレンの共重合体）、 AA S樹脂（アクリロニトリル、アクリル酸エステルおよびスチレンの共重合体）、ポリカーボネート'、ポリアミド樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、脂肪族ポリエステル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、脂肪族ポリアミド、脂環式ポリアミド、シクロォレフイン、ポリメチルペンテン、ポリ塩化ビエル、ポリ酢酸ビュル、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリイミド、トリァセチルセル口ース、セルロースアセテート樹脂、硝酸セルロース樹脂、エポキシ樹脂、ポリテトラフノレオ口エチレン、フツイ匕エチレンポリプロピレンコポリマー、テトラフ/レオ口エチレンパーフロォロアノレコキシビニノレエーテノレコポリマ一、ポリクロロトリフ /レオ口エチレン、エチレンテトラフノレォロエチレンコポリマー、ポリフッ化ビ-リデン、ポリフッ化ビニル、シリコーン榭脂などが挙げられる。

これらの有機材料の成形方法としては、例えば、射出成形、プレスレス成形、射出圧縮成形、射出プレス成形、圧縮成形、トランスファー成形、切削成型、光造形等が可能である。

無機林料としては、具体的には、ニッケル、銅、鉄、アルミニウム、チタン、シリコーン等の金属；シリカ、アルミナ、チタニア等の金属酸化物、ソーダ一ガラス、ホウ珪酸ガラス、パイレックス（商標）、石英ガラス等のガラスなどが挙げられる。

これらの無機材料は、プレス成型、板のエッチング、レーザー穴あけ、サンドブラスト、樹脂もしくは金属容器への表面塗布などに例示される、成型あるいは表面処理加工などの各種方法により容器形状とすることがでさる。

また孔が形成されたプレート、あるいは孔が形成されていないプレートを用い、これらのいずれか一方または両方を複数積層して所定の容器とすることができる。これらのプレートは、積層部分からの液体の漏れを防ぐために、積層する部分のプレート面同士が平滑である必要がある。そのために、プレートを研磨して平滑にする力、ある!/、はシリコンウェハーなどのように予め平滑であるプレートを使用する。これらの平滑なプレート同士を接合した場合は、接着剤などを使用しなくても非常に強固な接合を得ることができる。

プレートとしてシリコンウェハーを使用する場合、必要に応じて酸化膜を形成したものであってもよく、あるいは、プレートを積層した後に酸化このようなプレートを用いた容器は、例えば次のように作製する。まず、容器の底部用に、微小な空気入排出孔を有するプレートを用意する。空気入排出孔の深さを深くしたい場合は、必要に応じて最下層のプレートを複数枚積層する。その上に、容器を水平に切断したのと同等の形状を持つ平滑なプレートを、容器の穴が所定深さとなるように任意の数だけ積層する。容器の穴の深さは、同等の形状であるプレートを複数枚積層することで任意に制御できる。容器の形状を深さ方向に制御したい場合、例えば段差のある穴形状としたい場合は、形状の異なるプレートを積層することで任意の穴形状とすることができる。

最上部に配置される容器の蓋には、液体あるいは空気圧の入排出用としてプレートに垂直に孔を空けたものを使用する力 \ あるいはプレート面に溝を切ったものなどを用意してプレート積層体の最上部に蓋をしてもよい。また、積層体の最上部あるいは底部に位置するプレートには、光学的な検出を可能とするために透明なガラスなどの材料を使用することができる。一般に、孔径が微小で孔の深さが深い、いわゆる高ァスぺクト比の孔の作成は困難であるが、上記め方法により任意のァスぺクトの孔を有する容器を作成することが可能となる。

上記の方法により、チップのゥエルに対応した孔を有する容器とすることも可能であるし、複数のゥエルに対して 1つの穴を共有する容器とすることも可能である。

チップのゥエルに対応するゥエルを持つ容器とするためには、ゥエル水平断面と同等の孔形状である断面を持つプレートを容器の孔の深さだけ積層する。

複数のゥエルに対して 1つの穴を有する容器とするためには、複数のゥエルによる水平断面積を力パーする面積以上の孔径を有するプレートを、容器の孔の深さだけ積層する。

また、容器底部に孔を持つ容器は、前記したように、容器底部となるプレートとして、あらかじめ孔を空けたプレートを用いることにより得ることができる。容器底部に孔を設けることにより、例えば、バイオチップのゥエルと容器とを接続した際に、バイオチップのゥエルに圧力を掛け、容器底部の孔から容器の空気を排出することで、バイオチップのゥエル内の液体を容器に移動させることができる。

容器底部の孔径は、孔径が大きい場合は容器の液が漏洩するため一定以下の孔径することが必要であり、その孔径は孔の深さあるいは孔と液体との親和性により決まるが、一般には 5 0 ^ πι〜 l mm、好ましくは 0 . 1 mm〜0 . 5 mmである。孔径が 5 0 μ m以下の場合、目詰まりおよぴ濾過抵抗が大きくなり、孔径が 1 mm以上の場合は液体が漏洩する可能性がある。

バイオチップと容器とにより、相互に対応する同一径のゥエル同士を連結したバイオチップキットを構成することができる。この場合、ゥエル同士を連結する接続部において、液体の移動上流側のゥエルよりも下流側のゥエルの断面積を大きくすることにより、接続部におけるゥエルの位置合わせ誤差を最小にすることができる。

バイオチップと容器とは、接続部において凹 /凸、凸凹あるいは超平滑面同士の接合により接合することができる。これらのいずれかの接合方法により、液体が接合部から隣のゥエルに漏洩することを防止することができる。

また、バイオチップ同士を、上記と同様にして、接続部において凹/ /凸、凸 /凹あるいは超平滑面同士の接合により接合することもできる。

バイオチップと容器、あるいはバイオチップ同士の連結により、相互のゥエル間同士の溶液移動、いわゆる溶液の直接ゥエル間フローダウン移動が可能となり、移動にシリンジなどの移動手段を要しないため、シリンジ壁への付着に伴う溶液の減少、汚染などを生じることがなく、また溶液移動に要する時間を短縮できる。

バイオチップと容器を接続したバイオチップキットは、例えば以下の方法で作製することができる。ここで例示する方法では、容器を、貫通穴を有するプレートと、穴が形成されていないプレートのいずれかを用いた複数のプレートの積層により形成する。

図 1 5 ( a ) に示したバイオチップキットは、次のようにして作製される。まず、シリコンウェハーのエッチングにより貫通穴が形成された、ノくィォチップ 1 0と同等の厚さのプレート 8 7 aと、任意の厚さのプレート 8 7 bと、シリコンウェハーをエッチングして気体もしくは液体の入排出口、あるいは液体入排出溝を形成したプレート 8 7 cを用意する。次いで、プレート 8 7 c ' の上にプレート 8 7 b ' を、さらにプレート 8 7 a ' を位置合わせしながら積層することによって、二段の段差を持つ穴が設けられた積層プレートを作製する。この積層プレー.トのプレート 8 7 a ' の穴に、バイオチップ 1 0の張り合わせ前の片側チップを挿入してバイオチップと容器が複合された片半分バイオチップキットを作製する。同様に、 8

7 a , 8 7 b , 8 7 cを同様に積層して積層プレートを作製し、さらにバィォチップ 1 0の張り合わせ前の片側チップを挿入して、同様な片半分バィォチップキットを作成する。

次いで、プローブを結合した粒子を上記の片半分キット中のゥエルに、ゥエルの開放面からスポットなどの方法で収納する。この粒子の収納された片半分キットを下に、もう一方の片半分キットを上にして、ゥエル同士が相対するように接合する。これにより、容器とチップとがー体となったバイオチップキットが作製される。この際、あらかじめ設けられた位置合わせマークによって上下のキットの位置合わせすることにより、正確に位置合わせすることができる。 '

また、図 1 5 ( b ) に示したバイオチップキットのように、最外側の上下端面を広く形成したチップを用意してノィォチップ 1 0の上下端面と、シリコンウェハーをエッチングして貫通穴を形成したプレート 8 7 b ( 8 7 b ' ) の一端面とを張り合わせて積層してもよい。

図 1 6 ( a ) に示したように、容器の底部あるいは蓋部となるプレートに、光学検出用として、例えば石英ガラスなどで形成した平滑で透明なプレート 9 4を用いることも可能である。光学検出は、フィルターに充填した粒子の反応を見るために行うが、同図のように構成することにより、底部あるいは蓋部からフィルターへの距離を最小限にすることができ、光学系の開口率を向上することができる。但し、この場合、液体を収容する容器の容積が少なくなり、検体や洗浄液が収容不足となる可能性がある。その場合には、図 1 6 (b) に示したように、液体の入排出口 8 8に、ポンプ 9 0に接続されたチューブ 8 9を取り付け、チューブ 8 9を通して液体を循環させるか、あるいはキット内と上下のチューブ取り付け口の一定部分のみに液体を上下させ、チューブの一部をキット容器バッファーとして使用することで、容器の容積不足を解消することができる。

図 1 7 (a ) に示したように、プレート 8 7 b (8 7 b ') を複数枚積層することにより、容器容積を拡大することができる。また、図 1 7 (b) に示したように、プレート 8 7 b (8 7 b ') の穴径を漸次変えて、容器内面に傾斜を付与することも可能である。この場合、入排出口 8 8から容器内方へ向かって次第に容器径が大きくなるように、階段状に容器内面に傾斜を付与することで、バイオチップの各ゥエルへ溶液を均等に入排出させることができる。

図 1 7 (c) に示したように、バイオチップ 1 0のゥエル 1 6に対応する独立したゥエル 9 1を有し、これらのゥエルに対応する孔 9 2が底部に形成された容器を接続させることも可能である。この容器底部の孔 9 2の直径は、孔の高さにもよるが、好ましくは 1 0 0〜5 0 0 μ πι、より好ましくは 1 5 0〜 3 0 0 μπιである。孔径が 5 0 0 t mを超える場合、液体が容器底面から流出する可能性があり、孔径が 1 0 Ο μπι未満である場合、加減圧時における抵抗が大きくなる。

このように容器にゥエルを設けたバイオチップキットでは、粒子結合プローブにより検体中のターゲットを BZF分離した後に、何らかの分離方法により粒子からターゲットを分離させ、次いで、上容器と下容器に差圧を掛け、バイオチップ 1 0めゥエル 1 6中のターゲットを下容器のゥエル 9 1に移動させることができる。差圧を各ゥエルに均等に掛けるためには、上容器、下容器のいずれかは、バイオチップの各ゥエルに共通した収容空間を有する容器とすることが望ましい。

容器の容積は、前述したように、穴を開けたプレートを任意の枚数だけ積層することで任意の容積に調整可能である。また、容器の底部あるいは蓋部の少なくともいずれかを透明プレートとして、検出の際に透明プレートを下部にして粒子をフィルタ一孔に充填させ、透明プレートを通して光学検出し、一方バイオチップのゥエルに対応した容器のゥエルへ、粒子にトラップしたターゲット液を分離して移動させることも可能である。

図 1 8 ( a ) に示したように、バイオチップ 1 0同士を、ゥエルが対応するように接続することも可能である。また、図 1 8 ( b ) に示したように、各バイオチップ 1 0の間に、これらのゥエルに対応する孔 9 3を有する容器を設けることも可能である。

容器内に多段に配置された各バイオチップの各ゥエルに同一のプローブを有する粒子を入れて使用する場合、多段チップに収納されたプロ一ブ付き粒子による B Z F分離により B / F分離能力を向上させることができる。また、多段チップの一段目と二段目のそれぞれに異なるプローブを有する粒子を入れる場合は、いわゆる Two Step In Vitro Selection用ツールなどに使用することが可能である。

図 1 2および図 1 3は、本発明のバイオチップキットの一実施形態を示した上面図おょぴ A— A ' 断面図である。図 1 2およぴ図 1 3に示したように、バイオチップキット 1 4は、容器 1 2とバイオチップ 1 0とを有している。バイォチップ 1 0は、側壁 2 0で仕切られた複数のゥエル 1 6、 1 6 · · · からなり、これらのゥエル 1 6、 1 6 · · ·には、例えば、担持するプローブの種類が各ゥエル 1 6ごとに異なるプローブ担持粒子が収納される。

ゥエル 1 6の底壁 2 2は、フィルター 1 8で形成されている。このフィルター 1 8は、ゥエル 1 6に収納されたプローブ担持粒子を遮断するとともに、このバイオチップ 1 0を用いて分離、検出等を行う被検体、各種の緩衝液、洗浄液、分離剤、ラベル剤、二次抗体、增感剤、蛋白質分解酵素、ィォン化剤などを有する各種溶液を通過させる。

容器 1 2の内部に導入されたこれらの各種溶液は、フィルター 1 8を介して全てのセルへ入出できるようになつている。すなわち、これらの各種溶液は、フィルター 1 8を介してゥエル 1 6と隣接する、チップ 1 0と容器 1 2との間隙で構成されるこれらの各種溶液の収納室 2 6を介して、フィルター 1 8から任意のゥエル 1 6へ入出できるようになっている。

あるいは、側壁 2 0も同様にフィルター 1 8で形成されていてもよく、この側壁に形成されたフィルター 1 8を介して、隣接するゥエル 1 6、 1 6間でこれらの各種溶液を行き来させることも可能である。この場合、底壁 2 2を形成するフィルターと、側壁 2 0を形成するフィルターとは互いに同質のもので連続して形成されていてもよく、それぞれ異質のフィルタ一で構成して構成した複合フィルターとしてもよい。

容器 1 2とチップ 1 0は、図 1 2 (a)、 (b) に示したように、両者を同一材料から一体に形成するか、あるいは両者を接着して固定することにより、容器 1 2の内部において、チップ 1 0と容器 1 2とを一体化してもよい。

あるいは、図 1 3 ( a)、 (b) に示したように、バイオチップキット 1 4を、それぞれ独立した容器 1 2とチップ 1 0の二体から構成して、チップ 1 0が、容器 1 2の内部に収納されるようにしてもよレ、。この場合、容器 1 2は各操作時において常に同一である必要は無く、その単位操作に応じて当該容器および溶液収容容器を変更することも可能である。

上記のように構成されたバイオチップキット 1 4では、各ゥエル 1 6に収納されたプローブ担持粒子は、そのゥエル位置によりプローブの内容が特定され、複数のプローブをチップ上にコンタミすることなく収納することができる。

これらのバイオチップ中に収容されたプロ一ブ担持粒子溶液と被検体、各種の緩衝液、洗浄液、分離剤、ラベル剤、二次抗体、増感剤、蛋白分解酵素、イオン化剤などを有する溶液は、プローブ担持粒子が収納されたゥエル 1 6、 1 6 · · ·間を自由に行き来することができ、チップ 1 0の構造、あるいは前記溶液の攪拌条件を適宜選択することにより、全てのゥェル 1 6、 1 6 · · ·へ前記溶液を循環させることができ、前記溶液と、複数の種類の粒子坦持プローブとの接触あるいは反応の機会が与えられる。チップ 1 0と容器 1 2との間隙で構成される溶液の収納室 2 6へ、全てのゥエル 1 6、 1 6 · · ·が、底壁 2 2または側壁 2 0を形成するフィルター 1 8を介して直接に隣接していることが好ましい。

この溶液収納室 2 6は、例えば図 1 2 (a)、 (b) のようにチップ 1 0 の底部下面と容器 1 2の底部上面との間隙で構成される他、図 1 3 (a)、 (b) のように、それぞれ独立したチップ 1 0と容器 1 2との間隙で構成される。

このように構成することによって、前記溶液は、これを共通に収納する溶液収納室 2 6から、攪拌と必要に応じて加減圧を行うことにより、 1層のフィルター 1 8を通過して、それぞれ異種のプローブを担持した粒子を収納する複数のゥエル 1 6、 1 6 · · ·に並列的に到達して、並列的に接触、反応が行われる。 .

さらに、特定のゥエル 1 6内で反応しなかった未反応の被検体は、さらに攪拌あるいは加減圧により他のゥエル 1 6内に到達して接触、反応が試みられる。このように各ゥエル 1 6、 1 6 · · '間で逐次的に未反応の前記溶液とプロープ担持粒子との接触、反応が試みられる。

そして、溶液収納室 26と各ゥエル 1 6、 16 · · ' とが 1層のみのフィルター 1 8を介して隣接しているため、圧力損失は最低限で済み、また、溶液収納室 26への到達と、各ゥエル 1 6におけるプローブ担持粒子との反応が並列で行われるために接触、反応時間を最短にすることが可能となる。

さらに、フィルター 1 8の細孔径と、その深さを適当な条件に設定することで、圧力損失を極めて低減することが可能であり、前記溶液は、あたかもフィルター 1 8が無い一つのスペースを移動するかのように、プロ一ブ担持粒子を収納した全てのゥエル 1 6、 1 6 · · · と、前記溶液の共通部屋を構成する溶液収納室 26との間を自由に移動することが可能となる。あるいは、第一のフィルターが底部に設けられるとともに、ゥエルを挟んで第一のフィルターとは反対側に第二のフィルターが設けられている構造とすることも可能である。この例を図 14 (a) に示す。同図に示したように、このバイオチップの上部には第二のフィルターとして上側フィルター 1 8' が設けられている。この上側フィルター 1 8' は、プローブ担持粒子をゥエル 1 6内へ収納した後に取り付けられる。その取り付け方法としては、前述したように接着剤、磁力、機械的な嵌合、平滑部同士の面接合、機械的な加圧などが挙げられる。また図 1 4 ( b ) に示したように、予め上容器 8 1と下容器 8 2のそれぞれにフィルター 1 8 ' と底面フィルター 1 8を有するゥエル 1 6のいずれかを取り付け、上容器 8 1と下容器 8 2を接合した後に、粘着剤、磁石、クランプなどの機械的な加圧力により取り付ける方法も可能である。本方法では、機械的な加圧力のセット Z リセットにより上側フィルター 1 8 ' と底面側フィルター 1 8とを任意に切り離すことが可能である。あるいは、図 1 4 ( c ) に示したように、上容器 8 1に底面フィルター 1 8を有するゥエル 1 6を下容器 8 2とは上下逆さに取り付け、上容器 8 1と下容器 8 2とをゥエル 1 6同士が接合するように前記方法のいずれかで取り付けることも可能である。

また、図 1 6 ( a ) に示したように、ゥエルの外周部と同一形状の貫通穴を有する平滑なプレート 8 7 aと、それよりも小さい径の貫通穴を有するプレート 8 7 bとを積層し、穴の段差部分にチップを挿入し、さらにプレート 8 7 bの穴を塞ぐように、液体の入出孔を持つ透明プレート 9 4で蓋をした構造のキットも形成可能である。この場合、プレート 8 7 a、 8 7 bは、例えばシリコンウェハーで形成し、また透明プレート 9 4は、研磨石英ガラスで形成することにより、平滑性を利用した界面接合で接着剤を用いずにキットを形成することができる。

<バイオチップキットの操作方法 >

本発明のバイオチップキットの操作方法では、バイオチップのゥエルに収容されているプローブ担持粒子が分散された溶液と、容器内に収容されている、例えば被検体、各種の緩衝液、洗浄液、分離剤、ラベル剤、二次抗体、増感剤、蛋白分解酵素、イオン化剤などを有する各種溶液とを接触可能な状態にしてゥエル内の溶液と容器内の溶液を循環させることによつて、両溶液を高効率に混合、拡散、反応、洗浄または分離することができる。

これらの両者の溶液を接触可能な状態にする方法としては、バイオチップを容器内の溶液中を上下に移動させて容器内の溶液と接触させる方法 (図 2 0 (a - 1 ) → (a— 3)、図 2 0 (c— 1) → ( c一 3))、容器内の溶液を、ノズル 8 6を介した加圧/減圧や、溶液の外部からの注入排出などによる方法で溶液界面を上下させることにより、ゥエル内へ移動させて当該ゥエル内の溶液と接触させる方法（図 2 0 (b— 1 ) → (b— 2)、図 2 0 (d— 1 ) → (d- 2)) 方法が可能である。

このように容器内の溶液を、加圧/減圧や、溶液の外部からの注入排出などの方法で増減して容器内溶液の界面を上下させることで、プローブ付き粒子をバイオチップ内に残留させた状態で、ゥエル内の溶液が容器内の溶液と一体化され、ゥエル内の溶液をゥエル内外に移動させることが可能となる。この方法を繰り返すことにより、容器内の溶液とゥエル内の溶液とを高効率に混合、拡散、反応、洗浄または分離することができる。

あるいは、図 2 0 ( e - 1 ) 〜（e _ 5) に示したように、フィルター 1 8 ' を取り付けた上容器 8 1と、底部にフィルター 1 8を有するゥエル 1 6を取り付けた下容器 8 2とを接合し、上容器 8 1と下容器 8 2に加減圧おょぴ溶液の投入排出を行うノズル 8 3、 8 4を設けたものを用意し（図 2 0 (e— 1))、ノズル 8 3を介して加減圧を行うことにより、この加圧力あるいは減圧力により上容器 8 1内の溶液をゥエル 1 6内の溶液と接触させ、上容器 8 1の溶液をゥエル 1 6内の溶液と混合させ図 2 0 (e— 2)、さらに下容器 8 2に移動させる（図 2 0 (e— 3)。さらにノズル 84を介して加減圧により溶液を容器外に排出する（（図 2 0 (e— 4))。また、ゥエル内を別の溶液 8 5で充填する（（図 2 0 ( e— 5 ) )ことも可能である。この場合、上容器 8 1と下容器 8 2の容積を同量とし、投入溶液量を上下の各容器容積より僅かに多くすることが好ましく、これにより下容器 8 2に溶液を移動した場合に上容器 8 1にも溶液を残すことができ、フィルター内に空気を嚙ませることが無く加減圧力を最小とすることができる。また上述したゥエルの上下、溶液の移動に際して、移動は連続的に行なわず、 ^中に所定の時間停止するように、間欠的に移動させることが好ましく、あるいは、正方向の移動の途中、短時間負方向の移動を入れることが好ましい。この方法によりゥエル内の粒子はフィルターに張り付かず、移動の停止あるいは負方向の移動によりゥエル内を循環して、バイオチップ内の溶液と粒子との接触効率を最大限にすることができる。

<被検体の投入方法 >

バイオチップの各ゥエルには、同一または異なる被検体を投入することができる。各ゥエルに同一の被検体を投入する場合、各ゥエル上から各ゥエルに同一の被検体をスポッターなどでスポット投入するか、あるいは容器内溶液を被検体として、前述した方法によりゥエル内溶液と接触させ、ゥエル内溶液と循環、混合、拡散、反応させることができる。

チップのゥエル数が多い場合は、容器内の被検体を介する方法が好ましい。スポットによる逐次スポットではスポット時間が掛かり、並列スポットは多数のスポッターが必要となる。

また、各ゥエルにそれぞれ異なる被検体を投入する場合、各ゥエルから異なる被検体をスポッターなどでスポット投入するか、あるいはゥエルごとに独立した容器に収容されたそれぞれ異なる被検体を、前述した方法によりゥエル内溶液と接触させ、ゥエル内溶液と循環、混合、拡散、反応させることができる。

ここに用いられる被検体としては、各種の培養液、組織、菌、ウィルス、細胞、リンパ球、脂質、糖鎖、核酸、尿、血液.、血清、血球、ヒト Zマウスサイトカイン、セリンノスレオニン、キナーゼ、分子量 5 0〜 1 0 0万のタンパク質である合成ペプチド、膜タンパク質、酵素、シグナル伝達蛋白、輸送蛋白、リン酸化タンパク質等の各種タンパク質、サイト力イン、リンフォカイン、 I g Aおよび I g E等の抗体、各種抗原、転写因子、分子量 5 0〜1 0 0万の低分子リード化合物、基質、補酵素、調節因子、レクチン、ホルモン、神経伝達物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザィム、アブタマ一等のリガンド、各種の医薬候補物質、生理活性を有する力 \ あるいは生理活性を有する可能性がある各種の化学物質などを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

また、競合的ハイブリダィゼーションあるいは競合的ィムノアツセィ反応を使用する場合には、標的物質を含む被検体と共に標準物質を含む標識被検体を同時に併用して用いる。

また、被検体以外に、各ゥエルに対応して異なる材料、例えば各種の緩衝液、洗浄液、ラベル剤、二次抗体、増感剤なども上述した方法により投入可能である。

ぐ被検体中の標的物質とプローブとの反応方法 >

本発明のバイオチップキットを用いた被検体中の標的物質とプローブとの反応方法では、以下の（1 ) 〜（3 ) の工程により反応を行う。

( 1 ) バイオチップのゥエルに、前述したいずれかの方法により特定の粒子をゥエルに収納する工程。なお、この工程は、予めチップ作成時にチップ製造者にて調整されていても構わない。 (2) バイオチップのゥエル内に、被検体を含む溶液を投入して、上述した操作方法に基づき、当該被検体と、全てのゥエル内の前記粒子とが接触可能な状態とする工程。この工程では、例えばゥエルを容器内溶液中で上下させるか、あるいは容器内溶液の界面を移動させることにより、容器内溶液とゥエル内溶液とを一体化させ、被検体中の標的物質とプローブとの拡散（および反応）を行う。

(3) バイオチップの容器に収容された前記溶液中でゥエルを上下させるか'、あるいはバイォチップの容器に収容された前記溶液の界面を上下させることにより被検体中の標的物質とプローブとの反応を行う工程。この工程では、上述した操作方法に基づき、被検体とプローブとの反応を進行させる。

<BZF分離方法 >

本発明のバイオチップキットを用いた BZF分離方法は、上記の反応方法における（1 ) 〜（3) の工程と、以下の（4)、 (5) の工程により行なう。

(4) 前記溶液の界面の高さを、ゥエル底部のフィルターの下面未満となるまで低下させて、前記粒子に担持したプローブと反応していな、被検体を各ゥエル内から除去する工程。

(5) 洗浄液をバイオチップのゥエルに投入し、前記容器を介して洗浄液を該バイォチップのゥエルに循環させて該バイォチップのゥエル内外へ洗浄液を出し入れさせ、洗浄液をゥエル外へ排出することにより、プロ一ブ結合標的物質以外の物質を洗浄除去する工程。

ぐ分画分離方法 >

本発明のバイオチップを用いた被検体中の標的物質の分画分離方法は、上記の反応方法における（'1) 〜（3) の工程と、以下の（4) 〜（6) の工程により行なう。

(4) 前記溶液の界面の高さを、ゥエル底部.のフィルターの下面未満となるまで低下させて、前記粒子に担持したプローブと反応していない被検体を各ゥエル内から除去する工程。

(5) 洗浄液をバイオチップのゥエルに投入し、前記容器を介して洗浄液を該パイォチップのゥエルに循環させて、該パイォチップのゥエル内外へ洗液を出し入れすることにより、プローブ結合標的物質以外の非標的物質を除去する工程。

(6) 前記バイオチップのゥエル側部の下端に設けられた凹部、凸部または平滑部と、上端にこれと対応する凸部、凹部または平滑部を有する容器を嵌合させ、次いで分離剤溶液をバイオチップのゥエルに投入し、これにより前記粒子から被検体中の標的物質を分離し、前記容器のゥエルに移動させる工程。

以下、本発明の被検体の分画分離方法の一例について、図 21〜23に基づき具体的に説明する。最初に、バイオチップの各ゥエル 16ごとに、それぞれ異種のプローブを担持した粒子を収納する。

次いで、図 21 (a)、 (b) に示したように、バイオチップ 1 0の容器

1 2内に、被検物質 25を含む被検体溶液を投入して、被検体と、全てのゥエル 1 6内のプローブ担持粒子 24とが接触可能な状態とする。この際、ゥェル 1 6内における溶液界面の高さは、側壁 20の高さを超えないことが必要である。

このように所定の界面高さとなるまで被検体を含む溶液を投入する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。第一の方法は、図 1 3に示したバイオチップキット 1 4めように、チップ 1 0と容器 1 2が独立したものを用いて、予め容器 1 2に被検体溶液を入れておき、そこにチップ 1 0 を下に移動させて浸漬して、フィルター 1 8を介して各ゥエル 1 6内に被検体溶液を進入させる方法である。この際に、フィルター 1 8の圧力損失がある場合は、チップ 1 0と容器 1 2とが相互に接する部分をシールしてフィルター 1 8に加圧力あるいは減圧力が掛かるようにすることで、被検体溶液をフィルター 1 8を通過させて各ゥエル 1 6内に導くことができる。第二の方法は、図 1 2に示したバイオチップキット 1 4のように、あらかじめ容器 1 2の底面と、フィルター 1 8との距離を一定としたチップを用いて、容器 1 2の低壁もしくは側壁に形成した導入口から溶液収納室 2 6を介して被検体溶液を投入する方法である。

被検体溶液はゥエル開口部 1 7から投入してもよく、この場合には、スポッター等で各ゥエル 1 6ごとに均等量を投入することが好ましい。また、被検体溶液を、例えば図 2 1における 4 2のような導入口を通して投入する場合は、当該導入口から加圧して被検体溶液を送り込むか、あるいは溶液収納室 2 6側を減圧にして被検体溶液を送り込む方法のいずれの方法も可能である。

これらの方法により、被検体と、全てのゥエル 1 6内のプローブ担持粒子 2 4とを接触させることができる（図 2 1 ( a ) )。ゥエル 1 6内のプロ一プ担持粒子と被検体溶液を混合、拡散、反応させる方法としては、例えば図 1 2 ( b ) およぴ図 1 3 ( b ) のように側壁 2 0がフィルター 1 8で形成されて隣接する各ゥエルがフィルター 1 8で仕切られている場合は、被検体溶液を攪拌することで、各ゥエル 1 6内の溶液を入れ替えることができる。この攪拌方法としては、攪拌羽根の付いた攪拌機、音波あるいは超音波による振動、空気や常磁性体の移動による攪拌など、既存の方法による攪拌が可能である。これらのうちで特に好ましいのは音波あるいは超音波による振動であり、容器 1 2またはチップ.1 0を振動させるカある V、は振動子をチップ 1 0内の被検体溶液中に入れる方法などいずれも可能である。この場合、振動の適用周波数は、プローブや被検体の種類により適宜調節することができ、 1 0 0 H z〜l G H zが使用可能であり、好ましくは 1 k H z〜 3 0 O MH zである。この範囲の周波数では、インピーダンスが低く、対象物の損傷を最低限に抑えることができる。適用周波数が 1 0 0 H z未満では、攪拌能力が低く、適用周波数が 1 G H zを超えると、被検体あるいはプローブを損傷する可能性がある。また、図 1 3のように容器 1 2とチップ 1 0が独立している場合には、チップ 1 0を容器 1 2内の溶液の界面から引き上げた後に容器 1 2内の当該溶液を上述した方法のいずれかで攪拌し、次いでチップ 1 0を容器 1 2内の溶液に再度浸漬させる方法、あるいはチップ 1 0を水平面で回転するか、あるいは上下移動することにより容器 1 2とチップ 1 0とを相対移動させる方法によって各ゥエル 1 6内の溶液を入れ替えることができる。ゥェル 1 6同士がフィルター 1 8ではない側壁で仕切られている場合は、底壁 2 2のフィルター 1 8から溶液を溶液収納室 2 6に導き、次にフィルター 1 8を通して他のゥエル 1 6内に溶液を導くことにより溶液の入れ替えをすることができる。あるいは、図 1 2、 1 3の何れのチップの場合も、導入孔 4 2から加圧空気を導入して容器 1 2内における被検体溶液の界面を押し上げることによりゥエル 1 6内に被検体溶液を導入することが可能である。

次いで、図 2 2 ( a ) に示したように、被検体溶液の界面の高さを、ゥエル 1 6の底壁 2 2の下面未満となるまで低下させて、プローブ担持粒子 2 4に担持したプローブと反応していない非標的物質を除去する。ここで、溶液界面の高さをフィルター 1 8の底面以下にする方法としては、被検体溶液を、底壁 2 2のフィルター 1 8を介してポンプあるいは加減圧等により排出口 4 4から容器 1 2外へ、あるいは溶液収納室 2 6へ移す方法が挙げられる。また、容器 1 2とチップ 1 0とが独立している場合には、容器

1 2とチップ 1 0とを相対移動させてフィルター 1 8を上下させる方法、あるいはチップ 1 0を、バイオチップ 1 0と隣接する容器、あるいは独立した別の容器に移す方法が挙げられる。

上記では、片側が開放されたゥエルを用いているが、図 1 4のようなフィルターが対面したチップの場合には、ゥエルからの粒子の漏れを懸念する必要が無いため、液体面はゥエルの高さを超えて任意に移動させることができる。

さらに、本操作の前後において、必要に応じて、各種の洗浄剤や各種の緩衝液、あるいは二次抗体などの薬液を投入しても良い。これらの投入方法は被検体の投入方法と同様に行うことができる。

次いで、図 2 3に示したように、各ゥエル 1 6に対応する複数の収納ゥエル 5 2を備えた容器 5 4を用意し、各ゥエル 1 6へ、上部の開口 1 7から分離剤溶液を投入して、被検体の標的物質と反応したプローブ担持粒子からこの標的物質を分離して、容器 5 4へ標的物質を移動させる。

この容器 5 4は、図 2 4に示したように、ゥエル 5 2の底面に微細な貫通孔 5 3を設けた容器であってもよい。このように貫通孔を設けることにより、チップのゥエル 1 6と容器のゥエル 5 2との間に差圧を生成することができ、チップのゥエル 1 6内の液体を一括してフローダウン移動することができる。この一括したフローダウン移動によれば、各チップのゥェルから容器のゥエルへの液体移動を、シリンジなどを介してゥエルの数と同一回数行う方法と比べて、少ない移動回数で行うことができるとともに、シリンジなどによる汚染あるいは被検体物質のシリンジへの付着による減耗を防止できる。

この容器底面に形成した貫通孔の直径は、孔の高さにもよるが、好ましくは 1 0 0〜5 0 0 μ πι、より好ましくは 1 5 0〜3 0 0 μ πιである。孔径が 5 0 0 mを超える場合、液体が底面から流出する可能性があり、孔径が 1 0 0 μ πι未満である場合、加減圧時における抵抗が大きくなる。分離剤溶液は、スポッター等を用いてゥエル開口 1 7から、各ゥエル 1 6ごとに個別にあるいは各ゥエル 1 6へ一度に投入することができる。標的物質を分離した溶液を移動させる容器 54は、各ゥエル 1 6とそれぞれ対応した複数の標的物質収納ゥエル 5 2、 5 2 · ， ♦を設けた容器 5 4であれば特に限定されない。例えば、ゥエル 1 6、 1 6 · · · と略同一のサイズを有する標的物質収納ゥエル 5 2、 5 2 · · 'を設けた容器 5 4 を、チップ 1 0の直下に位置させて、分離剤溶液をゥエル開口 1 7から投入して標的物質を当該ゥエル 1 6内のプローブ担持粒子から分離し、その直下に位置する標的物質収納ゥェル 5 2へ収容することができる。

'ゥエル底部と上部にフィルターが存在する図 1 4 (a)、（b)、 ( c) の場合においても上述した方法に準じた工程にて行なうことができる。例えば図 1 4 (b) のチップの場合では、図 2 0 (e— 2)、 ( e - 3) に示したように、ノズル 8 3、 8 4を介して加減圧空気を出し入れすることにより、上容器 8 1内の溶液をゥエル 1 6内の溶液と一体化させて、上容器 8 1 , 下容器 8 2に漸次移動させることができる。

上記の方法により分離分画された被検体は、次の反応工程の出発物質あるいはアツセィのための精製体として使用することができる。特に質量分析計、ラマン分析計、表面プラズモン分析計、 X線分析計、電気化学検出装置、水晶発信子マイクロバランス検出装置などの各検出装置に、分離分画された被検体を投入して、いわゆるラベル剤を必要としない分析方法により、被検体の内容を解析 ·同定することも可能である。

これらの手段により解析するに際して、温度等の反応条件を変える力 \ あるいは複数回の経時検出を行うことにより、いわゆる力イネティック（K i n e t i c ) 解析を行うことが可能である。さらに、単に被検体の内容やプローブと反応したリガンドが存在するかどうかを解析するのみならず, ゥエル 1 6内の各粒子ごとに内容を解析することにより、被検体に含まれる標的物質の濃度あるいは量を求めることができる。

ぐ被検体の検出方法 >

本発明の被検体中の標的物質の光学的な検出 ·同定方法では、前述した被検体中の標的物質とプローブとの反応方法、または B / F分離方法と同様の工程を行った後、以下の（1 ) 〜（3 ) の工程を行う。

( 1 ) ラベル剤を投入し、プローブと標的物質にラベル剤を結合させ、その後未結合のラベル剤を洗浄除去する。

( 2 ) ゥエル内の溶液を底部のフィルターを介してゥエル内からゥエル外に排出し、ゥエル内の粒子をフィルターの細孔に位置させる。

( 3 ) 粒子に担持されたプローブと被検体の標的物質との反応または相互作用を検出する。

なお、 B / F分離工程は、いわゆるホモジ-ァス系のアツセィ方法の場合は省略することができる。

工程（1 ) のラベル剤としては、例えばラジオアイソトープ、有機蛍光体、希土類などの錯体系の蛍光体、蛍光蛋白、燐光体、量子効果による発光ナノ粒子、化学発光剤、酵素発光剤、金、銀のナノ粒子等が使用可能であ <ο。

さらにこれらのラベル剤を結合した二次抗などの二次プローブ、あるいはモレキュラービーコン法のための蛍光分子ノ消光分子、 F R E T (Fluorescent Resonance Energy Transfer) 法のためのド、ナー、ァクセプター分子なども使用可能である。

工程（3 ) では、粒子ごとに、粒子のプローブ識別情報と、粒子に担持されたプローブと被検体の標的物質との反応または相互作用の情報の双方を検出することができる。また、各ゥエルごとの粒子について、粒子に担持されたプローブ識別情報を識別し、次いでプローブと被検体中の標的物質との相互作用に関する状態を計測し、各粒子ごとに得られた相互作用の状態情報に基づき、ゥエル単位での相互作用情報を算出することができる。以下、本発明の被検体の検出方法の一例について、具体的に説明する。最初に、各ゥエルごとに、それぞれ異種のプローブを担持した粒子を収納する。本発明のバイオチップを被検体の検出に用いる場合、各ゥエルにおける各プローブごとの粒子数は、好ましくは 1〜1 0 0 0個、より好ましくは 1〜& 0 0個、さらに好ましくは 1〜 2 0 0個である。

次いで、バイオチップ 1 0の容器 1 2内に、被検体を含む溶液を投入して、当該被検体と、各ゥエル 1 6内のプローブ担持粒子とを接触させる（図 2 1 ( a )、（b ) )。

次いで、被検体溶液の界面の高さを、ゥエル 1 6のフィルター 1 8の下面以下となるまで低下させて、プローブ担持粒子 2 4に担持したプローブと反応していない被検体を除去する（図 2 2 ( a ) )。これらの工程は、前述した被検体の分離分画方法での操作に準じて行われる。なお、未反応の被検体を除去する工程において、図 2 2 ( b ) に示したように洗浄液を導入して粒子の洗浄を行い.、必要に応じて洗浄液の導入、攪拌、排出を繰り返して、プローブ担持粒子から未反応の被検体を除去することができる。

次いで、図 2 5に示したように、バイオチップ内の溶液を、底面フィルターを通して排出し、ゥエル 1 6内の粒子を底面フィルター 1 8の孔部分に位置させた後、各ゥエル 1 6ごとに、プローブ担持粒子と被検体との反応または相互作用を検出する。なお、実際にプローブ担持粒子をフィルタ一孔上に位置させた電子顕微写真を図 2 8に示した。

従来のように溶液中でプローブ担持粒子と被検体の反応を検出する場合では、反応に寄与した粒子の一部あるいは全部を 1つの被検体として検出 ·同定していたが、このように、溶液の界面の高さをフィルター 1 8の下面未満となるまで低下させ、プローブ付き粒子をフィルタ一孔上に位置させた状態で検出を行うことにより、反応に寄与した粒子の全てを粒子 1 個ごとに検出 .同定の対象とすることが可能であり、検出感度の向上を図ることができる。図 2 8は、プローブ担持粒子をフィルタ一孔上に位置させた電子顕微写真である。

被検体の検出方法としては、通常行われている各種の方法が適用可能であり、例えば、ラジオアイソトープ検出、蛍光検出、化学発光検出、酵素発光検出、ラマン検出等が挙げられるがこれらに限定されない。

上記した検出方法により検出を行うに際して、温度を変えるか、あるいは複数回の経時検出を行うことにより、いわゆる力イネティック（K i n e t i c ) 解析を行うことが可能である。さらに、単に被検体の内容ゃプローブと反応したリガンドが存在するかどうかを解析するのみならず、ゥエル内の各粒子ごとに内容を解析することにより、被検体に含まれるリガンドの濃度あるいは量を求めるとができる。 .

また、蛍光発光、化学発光検出、などのいわゆる光学的な検出においては、ゥエルからなるチップを収納する容器から、このチップを取り出してチップ単独で励起光の照射、検出光の検出をすることが好ましい。チップを容器から取り出した場合は、励起光はチップ上面、下面のいずれからも照射可能である。また、検出光もチップ上面、下面のいずれからも検出可能となる。

容器からチップを取り出すことで容器のゆがみや容器に由来する自家蛍光発光の影響を無くすことが可能であり、また物体との距離が近くなるため、光学検出の際の開口数 N A (Nume r i c a l Ap a r t u r e) を大きくできる。

また、図 1 6のように容器を透明とすることで、容器からチップを取り出さずに励起光、検出光のいずれもチップの上下から取り出すことができる。この場合、図 1 6の透明プレート 94の厚さと、プレート 8 7 bの厚さをできるだけ薄くすることにより、 NAを大きくできる。

また、図 14 (b) または（c) のチップでは、反応後検出のために上フィルター付きの上容器 8 1を取り外し、下フィルターに粒子が配列された下フィルター付きの下容器 8 2について、上側開放面から光照射して検出を行うことも可能である。

上記の検出工程において、各ゥエルごとに、粒子に担持されたプローブと被検体との相互作用に関する状態を計測し、各粒子ごとに得られた相互作用の状態情報に基づきゥエル単位での相互作用情報を算出する場合について説明する。まず、各ゥエルに収納されているプローブ担持粒子ごとに、プローブと被検体との相互作用に関する情報を計測する。この計測を行う手段としては、上記に記載した各種の方法が使.用可能である。例えば、蛍光検出の場合は、同一ゥエル内に配列した各粒子に検出のための U V光あるいは可視光などの励起光を照射して、その結果得られる検出光などの信号を C C Dカメラ、蛍光管などで検出する。この方法を粒子ごとに個別に行ない、さらにこの検出操作を他のゥエル内の粒子についても同様に逐次行う。次にこれらの得られたデーターを各ゥエルごとに累積処理して、ゥエル内の粒子数 Nの各データーについて統計的な標準化処理を行なう。また必要に応じてすでに存在する各種のデーターベースのデーターとの比較参照を行い、当該データーの修正処理あるいは判定処理を行うことが可能である。

この方法により、例えば従来のバイオチップにおけるゥエルあるいはセル単位での光学的な検出方法のように、 1つのゥエルあるいはセルが発する蛍光強度、蛍光スぺトクルを測定する方法に比して、ゥエル内の粒子プロープの個数 N個ごとの情報が得られるために情報量が多くなり感度が向上し、あるいは N個の粒子プローブの情報の分布を統計的に処理することにより、定量的な検出 ·同定が可能となる。

また、温度等の反応条件を変化させるか、あるいは複数回の経時検出を行う、いわゆる力イネティック（K i n e t i c ) 解析において、ゥエル内粒子ごとに、あるいは粒子の検出パターンを経時的にトレースすることにより、母数 Nが多く信頼性の高レ、解析データーを得ることが可能となる。本発明のバイオチップには、そのプローブとして核酸を粒子へ担持した

D N Aチップの他、抗原および抗体等のタンパクあるいはこれらのタンパクと反応する化学物質を粒子へ担持したプロテインチップ、低分子化合物を担持し蛋白などとの相互作用をスクリーニングするチップ、糖鎖を粒子へ担持した糖鎖チップ、細胞を粒子へ担持した.細胞チップ等も含まれる。これらの D N Aチップ、プロテインチップ、糖鎖チップおよび細胞チップは、担体上に固定する各種のプローブによって、遺伝子機能解析；遺伝子発現解析；機能プロテオミクスあるいは構造プロテオミクス；機能セローム、構造セローム、疾病解析、各種感染症等の疾病の罹患状況を確認するための臨床検查；遺伝子多型の検出；テーラーメード医療あるいはケモセラピーと称される患者の遺伝子配列に応じた治療医薬の選定；核酸、タンパク質、細胞、あるいは糖鎖と化学物質の相互作用研究、ォーファン受容体リガンド探索；トキシコゲノミックスと称される、医薬品開発のための薬理スクリ一ユングあるいは化学物質の安全性および毒性のスクリ一二ング；その他の各種スクリーニング等に応用することができる。また、特定の被検体と特定のプローブの組み合わせにより、免疫アツセィ、タンパク質一 D N A、タンパク質一タンパク質等の相互作用アツセィ、蛋白、糖鎖、細胞一リガンドアッセィ、リセプターリガンドアッセィ、キナーゼ等の酵素アツセィなどの各種ァッセィ系を組むことができる。

以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

[実施例 1 ]

電錶によるフィルターとリブの作製

1 . フイノレターの作製

ステンレス基板（SUS304、寸法 1 2 O mmX 1 2 O mm X厚さ 1 mm) 上にレジスト THB- 110N (商品名： JSR株式会社製）をスピンコーターにて膜厚 5 μ πιとなるように塗布し；ホットプレート上にて 120°C、 5分間プレベークを行った。プレベータ後、マスクァライナー M- 3LDF (商品名：ミカサ株式会社製）を用いて 4 0 O mJ/ c m²の露光量電気メツキしない部分を残すように所定のパターンを焼き付けた。現像液には PD523 (商品名： JSR 株式会社製）を用いて現像を行った後、ホットプレート上にて 90°C、 5分間ポストベータを行った。

次いで、 pHを 4. 0から 4. 5に保ち、浴温度 50°Cに維持したスルフアミン酸二ッケル浴（浴組成：スルファミン酸ニッケル 60%液 700g/l、臭化二ッケル 5g/l、硼酸 35g/l、応力調整剤 1. 5g/l、ピット防止剤 2. 5ml/l) 中にレジスト THB- 110Nでパターエングした SUS基板を投入し、 7Vの電圧で lA/dm²の電流密度となるように電圧電流を制御し、 3 0分間直流を印加して厚さ 5 μ m、最小孔径 3 μ m、最小孔間距離 7 μ mのニッケル膜を得た。

電気メツキ後、電铸試料をレジストストリッパー THB- S1 (商品名： JSR 株式会社製）に 3 0分間攪拌浸漬することによって、全てのレジストを剥離してフィルターを得た。

2 . リブの作製

電铸法によって得たニッケルフィルター上に、上記と同じ工程でリブを積み上げることによってリブ付きのフィルターが得られた。装置およぴ電铸条件は上記のフィルター作製条件とほぼ同じであるが、フィルターの厚さ 5 μ mに対してリブの厚さは 5 0 が得られるように、レジストを THB-220N (商品名： JSR 株式会社製）を用いてスピンコーターで塗布し、 6 5 O mJ/cm²の露光量で露光した。また、厚さ 5 0 μ mのニッケルメツキ膜を得るためにニッケルメツキを 5時間行った。 [実施例 2 ]

酸化膜付きシリコンウェハーのエッチングによるフィルターとリプの作製

1. フィルターの作製

レジスト 1X1 1 7 0G (商品名： JSR株式会社製）を、スピンナー（クリーントラック MARK8 (商品名）：東京エレクトロン社製）を用いて 6インチ酸化膜付きシリコンウェハー（厚さ 2 ^ m) 上に 3 3 0 0 r p mで 3 0 秒間スピンコートし、ホットプレート（クリーントラック MARK 8 (商品名）：東京エレクト口ン社製）で 9 ◦ °C、 6 0秒間乾燥して膜厚 0. 8 6 μ mのレジスト膜を得た。このレジスト膜に縮小投影露光装置 NSR- 2205il2D (商品名：ニコン社製、 NA= 0. 5 7、シグマ = 0. 6 0) を用いて 0. 4 umC/H 1000msec, 0. 8 umC/H 580msec の露光量で露光した後、現像液 PD523AD (商品名： JSR株式会社製）を用い、 2 3 °Cで 1分間パドル現像した。次いで 2 0秒間水洗し、乾燥してレジストパターンを得た。

レジストパターンを施した厚さ 2 μ mの酸化膜付きシリコンウェハーに、プラズマエツチング装置を用いて CF₄プラズマを RIEモードで照射した後、 0₂プラズマでレジストを除去して酸化膜にフィルタ一孔径の直径と孔間のスペースが 0. 4Z0. 8 μ πι、 0. 8/0. 8 , 2. 8 / 1. 0， 2. 8 2. 0 , 2. 8/2. 8 , 2. 8 /4. 0， 4. 0/ 1. 0， 4. 0 / 2. 0， 4. 0/4. 0， 4. 0/6. 0， 4. 0/ 8. 0 , 8. 0 / 2. 0， 8. 0/4. 0， 8. 0/6. 0 μ mで、高さ 2 /z mの孔が形成されたフィルターを得だ。

2. リブの作製

フィルター加工を施した面とは逆側の面に、レジスト（THB- 151N) をスピンナー（スピンコーター 1H- DX2 (商品名）：ミカサ株式会社製）を用いて、 1 7 0 0 r pmで 2 0秒間スピンコートし、ホットプレートで 1 2 0°C、 5分間乾燥して膜厚 4 0 i mのレジスト膜を得た。このレジスト膜に等倍投影露光装置 MA - 150CC (商品名：ズースマイクロテック社製）を用いて露光した後、現像液 PD523AD (商品名： JSR株式会社製）を用い、 2 3°Cで 9 0 秒間パドル現像した。ついで 3 0秒間水洗し、乾燥してレジストパターンを得た。

レジストパターンを施した酸化膜付き厚さ 44 0 μ mのシリコンウェハ一に、プラズマエッチング装置を用いて SF₆プラズマを RIEモードで照射した後、 0₂プラズマでレジストを除去してシリコンに高さ 440 μ m, 直径 5 0 0 μπιの孔が形成されたゥエルを持つシリコンウェハーを得た。これをダイシングソ一にて切断し、 1 Omm角にゥエルが 2 8個存在するチップを作成した。

[実施例 3 ]

牛血清を P B S (Phosphate Buffered Saline) で 1 0倍希釈した溶液を用意した。実施例 2で得られたフィルタ一孔径 4. O ^mで孔間隔が 2. Ο μ πιのチップを用い、図 1 6 (b) の容器にチップをセットし、上側蓋にチューブをセットして、チューブの別の端面に牛血清希釈液を入れたタンクを接続し、タンクの高さを差圧 4 g f Zcm²と 1 8 g f /cm²になるようにセットして、牛血清希釈液をチップ容器のフィルタ一部に流し、下容器の下蓋から牛血清希釈液を排出した。各時間における合計の吐出量と吐出時間との関係を図 3 0に示した。

同図に示されるように、フィルターからの吐出量はほぼ一定であり、評価時間中は目詰まりを起こすことがなく、また破壊することもなかった。

[実施例 4] 実施例 3とはチップの孔径と孔間隔が異なる 8種類の組み合わせについて、差圧 1 8 g f Zc m²で実施例 3と同様の試験を行った。その結果を図 3 1に示した。なお、同図において、 a Z r.はフィルターの開口率を示す。試験の結果、同図の領域 A (開口率が 1 0%未満）ではフィルターがまり易く、領域 B (開口率が 60%超）ではフィルターが破壌された _c このように、開口率が 1 0%〜60%のものでは目詰まりと破壌が生じなかった。

Claims

請求の範囲

1 . 均一な孔径を有するストレートな細孔が: t匀一な孔間隔で形成されたフィルターが底部に設けられたゥエルを備えることを特徴とするバイオチップ。

2 . 前記フィルターの厚さが 1〜1 0 At mであることを特徴とする請求項 1に記載のバイオチップ。

3 . ' 前記フィルターの開口率が 1 5〜6 0 %であることを特徴とする請求項 1または 2に記載のバイオチップ。

4 . 前記フィルターの表面材質がシリカ、チタニアまたはアルミナであることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれかに記載のバイォチップ。

5 . 一体に形成された複数の前記ゥエルを備えることを特徴とする請求項 1 〜 4のいずれかに記載のバイオチップ。

6 . 単数の前記ゥエルを備えることを特徴とする請求項 1〜4のいずれかに記載のバイオチップ。

7 . 前記ゥエルにおけるフィルターの上面側または下面側に補強用リブ部が設けられていることを特徴とする請求項 1〜 6のいずれかに記載のバィォチップ。

8 . 前記補強用リブ部が、複数の貫通孔が形成された一体形状であることを特徴とする請求項 7に記載のバイオチップ。

9 . 前記補強用リブ部が、前記フィルターと直接に接合されていることを特徴とする請求項 7または 8に記載のパイォチップ。

1 0 . 前記捕強用リブ部が、前記フィルターと同一材料で連続形成されていることを特徴とする請求項 7または 8に記載のバイオチップ。

1 1 . 前記ゥエルの底部に、その周縁から所定の幅で、フィルターの細孔が形成されていない無孔部が設けられていることを特徴とする請求項 1 〜 1 0のいずれかに記載のバイオチップ。 .

1 2 . 第一のフィルターが底部に設けられるとともに、ゥエルを挟んで第一のフィルターとは反対側に第二のフィルターが設けられていることを特徴とする請求項 1〜 1 1のいずれかに記載のバイオチップ。

1 3 . 前記ゥエルに、プローブ担持粒子が分散された分散液が収容されていることを特徴とする請求項 1〜 1 2のいずれかに記載のバイオチップ。

1 4 . 前記粒子の粒子径とフィルターの孔径との比率が、粒子径 Z孔径 = 1 . 1〜2 . 5であり、且つ粒子径く孔間隔く粒子径 X 1 0であることを特徴とする請求項 1 3に記載のバイオチップ。

1 5 . 前記粒子の粒子径、フィルターの孔径および孔間隔が、粒子径〉孔径 +孔間隔ノ 2の関係を満足することを特徴とする請求項 1 3に記載のバイオチップ。

1 6 . 前記ゥエルに、プローブ識別情報を与えるための少なくとも一種の識別手段を有するプローブ担持粒子が分散された分散液が収容されていることを特 ί敷とする請求項 1 3に記載のバイオチップ。

1 7 . 前記識別手段が、プローブ担持粒子の色、形状、粒子径および遺伝子配列から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項 1 6 に記載のバイオチップ。

1 8 . 全ての前記識別手段におけるプローブ識別情報が同一である複数のプローブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプ口一ブ担持粒子'について、前記プ口ーブ識別情報が同一であるこ.とを特徴とする請求項 1 6または 1 7に記載のバイオチップ。

1 9 . 全ての前記識別手段におけるプローブ識別情報が同一である複数のプローブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプロ一ブ担持粒子について、前記.プローブ識別情報が異なつていることを特徴とする請求 1 6または 1 7に記載のバイオチップ。

2 0 . 少なくとも一種の前記識別手段におけるプローブ識別情報が異なつている複数のプロープ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプロ一プ担持粒子について、その全ての識別手段における前記プローブ識別情報の構成が同一であることを特徴とする請求項 1 6または 1 7に記載のバイオチップ。

2 1 . 少なくとも一種の前記識別手段におけるプローブ識別情報が異なつている複数のプローブ担持粒子が同一ゥエルに収納されるとともに、各ゥエルに収納された複数のプローブ担持粒子について、その少なくとも一種の前記識別手段における前記プロ一ブ識別情報の構成が異なっていることを特徴とする請求項 1 6または 1 7に記載のバイオチップ。

2 2 . 請求項 1〜 2 1のいずれかに記載のバイオチップにおける一体に形成された複数のゥエルもしくは単数のゥエルを収納するか、あるいは当該ゥエルと接続される容器を備えることを特徴とするバイオチップキット。

2 3 . 前記容器が、前記ゥエルと一体に形成されていることを特徴とする請求項 2 2に記載のバイオチップキット。

2 4 . 前記容器が、前記ゥエルと独立に形成されていることを特徴とする請求項 2 2に記載のバイオチップキット。

2 5 . 前記容器が、前記バイオチップのゥエルに対応するゥエルを有することを特徴とする請求項 2 2〜2 4のいずれかに記載のバイオチップキッ卜。

2 6 . 前記容器のゥエル底部に貫通穴が形成されていることを特徴とする請求項 2 5に記載のバイオチップキット。

2 7 . 前記バイオチップと前記容器とが、対するゥエルが互いに連結するように接続されていることを特徴とする請求項 2 5または 2 6に記載のバイオチップキット。

2 8 . 前記容器が、貫通穴が形成されたプレートと、貫通穴が形成されていないプレートの少なくともいずれかを用いて、複数の前記プレートを積層することにより形成されていることを特徴とする請求項 2 2〜2 7のいずれかに記載のバイオチップキット。

2 9 . 請求項 1〜 2 1のいずれかに記載の複数のバイオチップ同士が、対応するゥエルが互いに連結するように接続されていることを特徴とするバイオチップキット。

3 0 . 前記バイオチップのゥエル側部の下端に設けられた平坦部と、另リ途の前記容器または前記バイオチップのゥエル側部の上端に設けられた平坦部とが、ゥエルを互いに連結するように直接に接続されていることを特徴とする請求項 2 2〜2 9のいずれかに記載のバイオチップキット。

3 1 . 前記バイオチップのゥエル側部の下端に、別途の前記容器または前記バイオチップのゥエル側部の上端に設けられた凸部と嵌合する位置合わせ用の凹部、あるいは別途の前記容器または前記パイォチップのゥエル側部の上端に設けられた凹部と嵌合する位置合わせ用の凸部が設けられていることを特徴とする請求項 2 2〜2 9のいずれかに記載のバイオチップキット。

3 2 . 請求項 1〜2 1のいずれかに記載のバイオチップを製造するに際し、組成の異なる材質で形成された少なくとも 2層からなるプレートについて、片面側からパターンエッチングにより 2層の境界までエッチングを行いゥエル孔を形成するとともに、他面側からパターンエッチングにより 2層の境界までエッチングを行いフィルタ一孔を形成し、これによりゥェルとフィルターとが接合したパイォチップを得ることを特徴とするバイオチップの製造方法。

3 3 . 請求項 1〜2 1のいずれかに記載のバイオチップを製造するに際し、シリコンウェハーをエッチングすることによりフィルター、リブおよぴゥエルをそれぞれ作製し、次いで、これらを積層することを特徴とするバイオチップの製造方法。

3 4 . 容器がバイオチップのゥエルと独立に形成されている請求項 2 2 〜3 1のいずれかに記載のバイオチップキットの当該容器に収容された溶液中でバイオチップのゥエルを上下させることにより、当該容器内の溶液と、ゥエル内のプロ一ブ担持粒子およびノまたは溶液とを接触させることを特徴とするバイオチップキットの操作方法。

3 5 . 請求項 2 2〜 3 1のいずれかに記載のバイオチップキットの容器に収容された溶液の界面を上下させることにより、当該容器内の溶液と、ゥエル内のプロ一ブ担持粒子および Zまたは溶液とを接触させることを特徴とするパイォチップキットの操作方法。

3 6 . バイオチップを収納する容器を備える請求項 2 2〜 3 1のいずれかに記載のバイオチップキットの当該容器とチップとの間、あるいは当該チップにおける相互のゥエル間に差圧を生じさせ、これにより、ゥエル内の液体とプローブ担持粒子との接触、液体のゥエル間での移動、あるいはこれらの両方を行うことを特徴とするバイオチップキットの操作方法。

3 7 . バイオチップを接続する容器を備える請求項 2 2〜3 1のいずれかに記載のバイオチップキットの当該容器とチップとの間、あるいは当該チップにおける相互のゥエル間に差圧を生じさせ、これにより、ゥエル内の液体とプローブ担持粒子との接触、液体のゥエル間での移動、あるいはこれらの両方を行うことを特徴とするバイオチップキットの操作方法。

3 8 . 前記容器内の溶液と、ゥエル内のプローブ担持粒子および Zまたは溶液とを接触させることによりノィォチップ内の内容物の混合、拡散、反応、分離または洗浄を行うことを特徴とする請求項 3 4〜3 7のいずれかに記載のバイオチップキットの操作方法。

3 9 . 前記バイオチップの各ゥエルに同一の被検体を投入することを特徴とする請求項 3 4〜3 8のいずれかに記載のバイオチップキットの操作方法。

4 0 . 前記バイオチップの各ゥエルに異なる被検体を投入することを特徴とする請求項 3 4〜 3 8のいずれかに記載のバイオチップキットの操作方法。 .

4 1 . 請求項 2 2〜3 1のいずれかに記載のキットにおけるバイオチップのゥエルに、請求項 1 8〜2 1のいずれかに記載のチップとなるように特定の粒子をゥエルに収納する工程；

パイォチップの容器に収容された前記溶液中でゥエルを上下させるか、パイォチップの容器に収容された前記溶液の界面を上下させるか、あるいは差圧を加えることでゥエル内外の溶液を循環することにより被検体中の標的物質とプローブとの反応を行う工程を含むことを特徴とする被検体中の標的物質とプローブとの反応方法。

4 2 . 請求項 2 2〜3 1のいずれかに記載のキットにおけるバイオチップのゥエルに、請求項 1 8〜2 1のいずれかに.記載のチップとなるように特定の粒子をゥエルに収納する工程；

洗浄液をバイオチップのゥエルに投入し、前記容器を介して洗浄液を該バイォチップのゥエルに循環させて該バイォチップのゥエル内外へ洗浄液を出し入れさせ、洗浄液をゥエル外へ排出することにより、プローブ結合標的物質以外の物質を洗浄除去する工程を含むことを特徴とする被検体中から標的物質を B / F分離する方法。

4 3 . 請求項 3 0または 3 1に記載のキットにおけるバイオチップのゥエルに、請求項 1 8〜2 1のいずれかに記載のチップとなるように特定の粒子をゥエルに収納する工程；

前記バイオチップのゥエル内に、被検体を含む溶液を投入して、当該被検体と、全てのゥエル内の前記粒子とが接触可能な状態とする工程；前記溶液の界面の高さを、ゥエル底部のフィルターの下面未満となるまで低下させて、前記粒子に担持したプローブと反応していな、被検体を各ゥエル内から除去する工程；

洗浄液をバイオチップのゥエルに投入し、前記容器を介して洗浄液を該パイォチップのゥエルに循環させて該パイォチップのゥエル内外へ洗浄液を出し入れさせ、洗浄液をゥエル外へ排出することにより、プローブ結合標的物質以外の物質を洗浄除去する工程；および

前記バイォチップのゥエル側部の下端に設け.られた囬部、凸部または平滑部と、上端にこれと対応する凸部、凹部または平滑部を有する容器を嵌合させ、次いで分離剤溶液をバイオチップのゥエルに投入し、これにより前記粒子から被検体中の標的物質を分離し、前記容器のゥエルに移動させる工程を含むことを特徴とする被検体中の標的物質の分画分離方法。

4 4 . 請求項 2 2〜3 1のいずれかに記載のキットにおけるバイオチップのゥエルに、請求項 1 8〜2 1のいずれかに記載のチップとなるように特定の粒子をゥエルに収納する工程；

洗浄液をバイオチップのゥエルに投入し、前記容器を介して洗浄液を該パイォチップのゥエルに循環させて該パイォチップのゥエル内外へ洗浄液を出し入れさせ、洗浄液をゥエル外へ排出することにより、プローブ結合標的物質以外の物質を洗浄除去する工程；

ゥエル内の粒子をフィルターの細孔に位置させる工程；および前記粒子に担持されたプローブと被検体の標的物質との反応または相互作用を検出 ·同定する工程を含むことを特徴とする被検体中の標的物質とプローブの相互作用の検出 ·同定方法。

4 5 . 粒子ごとに、粒子のプローブ識別情報と前記粒子に担持されたプローブと被検体の標的物質との反応または相互作用の情報の双方を検出することを特徴とする請求項 4 4に記載の被検体中の標的物質の検出 ·同定方法。

4 6 . 各ゥエルごとの粒子について、前記粒子に担持されたプローブ識別情報を識別し、次いでプローブと被検体中の標的物質との相互作用に関する状態を計測し、各粒子ごとに得られた相互作用の状態情報に基づき、ゥエル単位での相互作用情報を算出することを特徴とする請求項 4 4に記载のネ皮検体中の標的物質の検出 '同定方法。