WO2004091663A1 - 神経再生薬 - Google Patents

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WO2004091663A1
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benzazepine
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PCT/JP2004/005503
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Tsuyoshi Morishita
Kazuhiro Sakurada
Keiko Suzuki
Shun-Ichi Ikeda
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a nerve regenerating agent containing a substance that inhibits the activity of glycogencin zekinase-1 (hereinafter abbreviated as GSK-3) as an active ingredient, a substance that inhibits the activity of GSK-3.
  • GSK-3 glycogencin zekinase-1
  • the present invention relates to a neurogenesis promoting agent contained as an active ingredient, a neuron obtained by culturing a neural stem cell in the presence of the neurogenesis promoting agent, and a method for producing the neuron.
  • Neurological diseases include neurodegenerative diseases in which brain and peripheral neurons are damaged by genetic factors, environmental factors, aging factors, etc., as well as depression and manic depression that do not involve nerve degeneration. Collectively. Specific examples of neurodegenerative diseases include Parkinson's disease, Alheimer's disease, polyglutamic acid disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple neurobati, spinal cord injury, cerebrovascular disease and the like. A common treatment for these neurodegenerative diseases is to replace neurotransmitters lost due to neuronal injury, but the improvement of symptoms is limited to Parkinson's disease, Alzheimer's disease, etc. . Neurotransmitter replacement therapy does not stop neuronal cell death.
  • Regenerative medicine that regenerates the central nervous system has been studied as a treatment to positively restore the function of dopaminergic neurons lost in Parkinson's disease. Due to various problems, it is not used for general use.
  • neural stem cells obtained from fetal brain ES ES cells obtained from fertilized human eggs are cultured in large quantities in vitro, and then converted to target neurons and used for transplantation.
  • There is no established technology for accurately differentiating into neurons and there is a problem arising from the use of fetal neural stem cells ⁇ human ES cells, and clinical application has not progressed.
  • neural stem cells are isolated from adult brain and that neurogenesis occurs in human adult brain over a lifetime.
  • Methods for treating neurodegenerative diseases by inducing regeneration by stimulation with a drug or the like are being studied.
  • Insulin-like growth factor-1 1 [J. Neuroscience, 20; 2896-2903 (2000)], fibroblast growth factor-1 2 [Pro. Nat. Acad. Sci. USA, 98, 5874-5879 (2001)], Stem cell factor [J. Clin. Invest., 110, 311-319 (2002)], erythropoietin [J. Neuroscience, 21, 9733-9743 (2001)], global cerebral ischemia [J. Neuroscience, 18, 7768-7778 (1998)], epilepsy stimulation [J. Neuroscience, 22, 3174-3188 (2002)], etc. It has been reported that intracerebral administration of cytokines and disease models promote neurogenesis in the hippocampus and olfactory bulb. ing.
  • Peripherally administrable low molecular compounds that can induce neurogenesis include antidepressants such as monoamine oxidase inhibitors, serotonin-specific transporter inhibitors, and phosphodiesterase IV inhibitors. It has been reported [Neuropsychopharmacology, 25, 836-844 (2001)]. The mechanism by which these drugs induce nerve regeneration in the brain is that they act directly or indirectly on serotonergic receptor signals of serotonergic neurons to produce neurotrophic factors, It is thought to promote peripheral neurogenesis. Therefore, these drugs may not be available as nerve regenerating agents in most neurological disorders that are not associated with degeneration of serotonergic neurons.
  • lithium a mood stabilizing drug, induces the expression of the cell death suppressor gene bcl-2, thereby protecting neonatal neurons, which are constantly growing in the hippocampus, from neuronal death and preventing neurogenesis in the hippocampus. Apparent increase has been reported [J. Neurochemis try, 75, 1729-1734 (2000)].
  • Lithium is the neurotrophic factor BDNF. It has also been reported to induce actuality '[Neuropharmacology, 43, 1173-1179 (2002)]. However, it has not been reported that lithium acts directly on neural stem cells to promote neuronal differentiation, thereby promoting neurogenesis, nor has it been reported that lithium promotes neurogenesis outside of the hippocampus. . It is also unknown why lithium has a therapeutic effect on depression and manic depression without neurodegeneration.
  • GSK-3 darikogen synthase kinase-3 (hereinafter abbreviated as GSK-3) excessively phosphorylates the tau protein, a small ⁇ -associated protein, to form neurofibrillary tangles, resulting in neuronal cell death.
  • GSK-3 darikogen synthase kinase-3
  • a hypothesis of induction has been proposed [Trends in Molecular Medicine, 8, 126-132 (2002)].
  • the substance that inhibits the activity of GSK- 3 is reported to be active to protect the mature neuronal cells in in vitro [J.
  • An object of the present invention is to provide a nerve regenerating agent containing a substance that inhibits the activity of GSK-3 as an active ingredient, an agent for promoting neurogenesis of neural stem cells containing the substance as an active ingredient,
  • An object of the present invention is to provide a neuron obtained by culturing a neural stem cell in the presence of an agent and a method for producing the neuron.
  • the present invention relates to the following (1) to (41).
  • a nerve regeneration drug containing, as an active ingredient, a substance that inhibits the activity of glycogen synthase kinase 13 (hereinafter abbreviated as GSK-3).
  • Neurological disorders include Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Down's syndrome, cerebrovascular disease Is a neurological disease selected from the group consisting of harm, stroke, spinal cord injury, Huntington's chorea, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, epilepsy, anxiety disorder, schizophrenia, depression and manic depression (2) The medicament.
  • the substances that inhibit the activity of GSK-3 are bis-indolylmaleimide derivatives, 3-aryl-4-indolylmaleimide derivatives, indole-active rubazole derivatives, and indolo [3,2-d] [1] benzazepine- 6 Any one of the above (1) to (3) ′, which is a (5H) -one derivative, an indirubin derivative, or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • n and m are the same or different and each represents an integer of 1 to 3
  • RR 3 and R 4 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted lower alkyl.
  • R 6 is a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted lower alkenyl, a substituted or unsubstituted aryl or a substituted or unsubstituted cycloalkyl represented), -C00R 7 (wherein, R 7 represents hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted Ariru or substitution or unsubstituted cycloalkyl) or - oR 8 (wherein , R 8 represents a hydrogen atom, substitution or unsubstituted lower alkyl, Ku substituted or unsubstituted Ariru or if substituted an unsubstituted cycloalkyl), R 2 and R 5 are the same or Hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, a substituted or unsubsti
  • na, ma, R 1A , R 2A , R 3A and R 5A have the same meanings as n, m, RR 2 , R 3 and above) or a compound of formula (III) ′
  • nb, mb, R 1B , R 2B and have the same meanings as n, m, RR z and R 5 , respectively, and R 3B and R 4B are the same or different and are each a hydrogen atom, substituted or unsubstituted. of lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, -C0R 6 (wherein, R 6 is as defined above), -C00R 7 (wherein R 7 is as defined above) or - oR 8 ( Wherein R 8 is as defined above, or R 3B and R 4B are taken together,
  • k 1 or 2
  • X represents C3 ⁇ 4, NH, an oxygen atom or a sulfur atom
  • R 9 represents hydroxy, carbonyl, carbamoyl or lower alkoxycarbonyl. Or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • R 2 a is a hydrogen atom, lower alkoxy, lower alk snow deer Lupo alkenyl represents Ariru or nitro
  • R 3 a and R 4 a are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted lower alkyl
  • R 9 has the same meaning as described above
  • R 9 has the same meaning as described above
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof or the pharmaceutically acceptable salt of any one of the above (1) to (3).
  • the substances that inhibit the activity of GSK-3 are 3,4-bis (1-methylindole-13- ⁇ -per) -1H-pyrroyl-2,5-dione, 3- (1-methylindole 1-4- (1-propylindole-3-yl)-1H-pyrrolyl 1, 2, 5-dione, 3-[1-(3-cyanopropyl) indole-3- -]
  • R 1 consists of a hydrogen atom, aryl, lower aliphatic substituent, especially alkyl and lower alkyl ester
  • R "to R 14 are alkoxy, amino, acyl, aliphatic substituents, especially alkyl, alkenyl and alkynyl substituents, aliphatic alcohols, especially alkyl alcohols, aliphatic nitriles, especially alkyl nitriles
  • R 15 to R 18 are independently selected from the group consisting of cyano, nitro, carboxyl, halogen, hydrogen, hydroxyl, imino and ⁇ -unsaturated ketone, wherein R 15 to R 18 are aliphatic substituents, especially alkenyl and alkynyl substituents, Especially lower aliphatic substituents, aliphatic alcohols, especially alkyl alcohols, alkoxy, acyl, cyano
  • R 19 is individually selected from
  • benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-7,12-dihydro-2,3-dimethoxy-indolo [3,2_d] [1] benzazepine_6 (5H)- On, 9_bromo-7,12-dihydro-2,3-dihydroxy-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-2,3-dimethoxy- Indro [3, 2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-9-trifluoromethyl-indro [3, 2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -One, 7,12-di'hydro-2,3-dimethoxy-9-trifluoromethyl-indro [3,2-d] [1] benzazepin-6 (5H) -one, 2-bromo-7 , 12-D
  • Substances that inhibit GSK-3 are 9-cyano-7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [1] benzazepin-6 (5H) -one, 9-bromo_7,12- Dihydro-2,3-dimethoxy-indolo [3,2-d] [1] benzazepin-6 (5H) -one, 2_bromo-7,12-dihydro-9-trifluoromethyl-indro [3,2-d ] [1] Benzazepine-6 (5H) -one ..
  • benzazepine-6 (5H) -one, 2-bromo-7,12-dihydro-9-trifluoromethyl-indro [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-2,3-dimethoxy-9-trifluoromethyl-ind [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 2, 9 -Dibromo-7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-9-trifluoromethyl-indolo [3,2-d] [l] benzazepine-6 (5H) -one, 9-chloro-7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 8-bromo-6, 11-d
  • the substance that inhibits GSK-3 is 9_bromo-7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [1] benzazepin-6 (5H) -one or its pharmacologically acceptable
  • R 20 and R 25 may be the same or different; a hydrogen atom; a halogen; a hydroxy group; a methylenehydroxy group; a linear or branched C ⁇ ds-alkyl or alkoxy or a methylenealkoxy group; A cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, including one or more heteroatoms; optionally substituted or unsubstituted aryl, aralkyl or aryloxy having one or more heteroatoms.
  • a straight or branched chain C ⁇ ds alkyl group, substituted or unsubstituted, if necessary, represents an aryl group containing one or more hetero
  • R 2 o and R 24 and R 25 and R 29 each together form, independently of each other, a ring having from 1 to 4 optionally substituted CH 2 groups; May be the same or different Y and Z are oxygen; O ⁇ ; selenium; tellurium atom; NR 33 group (where R 33 is a hydrogen atom, one if necessary or force Lupo A straight-chain or branched ( ⁇ -di) ⁇ alkyl group substituted with a xyl, phosphoryl or sulfonate group, a substituted or unsubstituted aryl group containing one or more heteroatoms, if necessary, an aralkyl group or represents a sulfonate group); or single NOR 33 (wherein the R 33 groups are acceptable salt compound represented by or their pharmacologically and represented] a have) the meanings of (1) to ( 3) The pharmaceutical of any one of the above.
  • Substances that inhibit GSK-3 are: indirubin, 5-iodo-indirubin, 5-bromo-indirubin, 5-chloro-indirubin, 5-fluoro-indirubin, 5-methyl-indirubin, 5-12-troindiene Rubin, 5- S_ ⁇ 3 H- indirubin, 5'-bromo-one ⁇ gamma Njirubin, 5-5 '- dibromo - Injirubi emissions and 5' - selected from the group consisting Promoted indirubine 5-sulfonic acid compound or a Any one of the above (1) to (3), which is a pharmacologically acceptable salt
  • An agent for promoting neural stem cell neurogenesis comprising as an active ingredient a substance that inhibits the activity of GSK-3.
  • Substances that inhibit the activity of GSK-3 are bis-indolylmaleimide derivatives, 3-aryl-41-indolylmaleimide derivatives, indole-active rubazole derivatives, and indolo [3,2-d] [1]
  • the neurogenesis-promoting agent according to the above (20) which is a benzazepine-6 (5H) -one derivative or an indirubin derivative or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • n and m are the same or different and each represents an integer of 1 to 3, and RR 3 and R 4 are the same or different and are a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted Lower alkenyl, -C0R 6 (wherein R 6 represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted aryl, or substituted or unsubstituted cycloalkyl ), -C00R 7 (wherein R 7 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted aryl or a substituted or unsubstituted cycloalkyl) or -OR 8 (wherein R 8 represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or
  • na, ma, R 1A , R 2A , R 3A and R 5A have the same meanings as n, m, RR 2 , R 3 and R 5 respectively
  • nb, mb, R 1B , R 2B and R 5B have the same meanings as n, m, RR 2 and R 5 , respectively, and R 3B and R 4B are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or # lower alkyl substituted, substituted or unsubstituted lower alkenyl, - C0R 6 (wherein, R 6 is as defined above), -C00R 7 (wherein, R 7 is as defined above) or - OR 8 (wherein R 8 is as defined above), or R 3B and R 4B together
  • k 1 or 2
  • X represents CH 2 , NH, an oxygen atom or a sulfur atom
  • R 9 represents hydroxy, .carboxy., Carbamoyl or lower alkoxycarbonyl.
  • la A compound represented by the above formula (la), which is a compound represented by the formula:
  • R 2a represents a hydrogen atom, lower alkoxy, lower alkoxy force Ruponiru, a nitro were Ariru or, R 3a and R 4 a are the same or different and each represents a lower alkyl substituted or unsubstituted
  • the neurogenesis promoting agent according to the above (20) which is a compound represented by the formula or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • R 3 Aa represents a substituted or unsubstituted lower alkyl
  • R 5 Aa represents a halogen, or a pharmaceutically acceptable compound thereof.
  • Substances that inhibit the activity of GSK-3 are 3,4-bis (1-methylindole-1-yl) -1H-pyrroyl-2,5-dione, 3- (1-methylindone-1) 3- (yl)-4- (1-propyl-indole-l-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione, 3-(1- (3-cyanopropyl) -dyl--3--yl ] 1 4 1 (1-methylindole 1-3-yl) 1 1H-pyrrole-2,5-dione, 3-[1-(3-aminopropyl) indole-3-yl] -4- (1-methylin 1-Hyl-pyrroyl 2,5-dione, 3- [1- (3-carboxypropyl) indole-3-yl] -4-1- (1-methylindole 3-yl) 1) 1 H-pyrroyl 2,5—dione, 3— [1— (3—rubamoyl)
  • R 1 consists of hydrogen, aryl, lower aliphatic substituents, especially alkyl and lower alkyl esters is selected from the group
  • R "to R 14 are alkoxy, Amino, Ashiru, aliphatic substituents, particularly alkyl, alkenyl and alkynyl substituents, aliphatic alcohols - le, in particular alkyl alcohols, aliphatic nitriles, particularly alkyl nitriles , Cyano, nitro, carboxyl, halogen, hydrogen, hydroxyl, imino and ⁇ -unsaturated ketones, wherein R 15 -R 18 are aliphatic substituents, especially alkyl, alkenyl and alkynyl substituents.
  • R 19 is independently selected from the group consisting of ano, nitro, epoxy, haloalkyl, halogen, hydrogen and hydroxyl, and R 19 is an aliphatic group, especially a lower alkyl group, an aliphatic alcohol, especially an alkyl alcohol, and a carboxylic acid. Or a pharmacologically acceptable salt thereof, wherein the agent is selected from the group consisting of hydrogen and hydrogen.
  • Substances that inhibit GSK-3 are 7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [1] benzoazepin-6 (5H) -one, 2-bromo-7,12-dihydro-indolo [3, 2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 9_bromo-7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 9-black mouth-7,12-dihydro-indro [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 1 black mouth-7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [l] benzazepine-6 (5H) -one, 10-bromo-7,12-dihydro-indro [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 8-bromo-6,11- Dihydro-thieno
  • benzazepine-6 (5H) -one, 9-promo-7,12-dihydro-2,3-dimethoxy-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 ( 5H) -one, 9-promo-7,12-dihydro-2,3-dihydroxy-indolo [3,2-d] [1] benzazepin-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-2,3 -Dimethoxy-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-9-trifluoromethyl-indro [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-2,3-dimethoxy-9-trifluoromethyl-indro [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-2,3-dime
  • the substance that inhibits GSK-3 is 9_cyano-7,12-dihydro-indolo.
  • benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-7,12-dihydro-2,3-dimethoxy-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 ( 5H) -one, 2-bromo_7,12-dihydro-9-trifluoromethyl-ind, mouth [3,2-d] [1] benzazepin-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-2, 3-dimethoxy-9-trifluoromethyl-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) _one, 2,9-dibromo-7,12-dihydro-indolo [3,2-d ] [1] Benzezepine-6 (5H) -one, 7,12-dihid-9-Trifluoromethyl-indro [3,2-d] [1] Benzazepine-6 (5H) -one, 9- Black mouth-7,
  • benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-7,12-dihydro-2,3-dihydroxy-indolo [3,2-d] [1] benzazepine_6 ( 5H) -one, 2-bromo-7,12-dihydro-indro [3,2-d] [1] benzazepin-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-2,3-dimethoxy-indro [3,2-d] [1] benzazepin-6 (5H) -one, 9-bromo_7,12-dihydro-12-methyl Ruindro [3,2-d] [1] Benzazepine-6 (5H) -one, 9-promo-7, 12-dihydro-5-methyloxycarbonylmethyl-indro [3, 2-d] [ 1] A compound selected from the group consisting of benzazepine-6 (5H) -one and 7,12-dihydrido-ind
  • benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-7,12-dihydro-2,3-dimethoxy-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 ( 5H) -one, 2-bromo-7,12-dihydro_9-trifluoromethyl-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H): one, .7,12-dihydric mouth-2,3 -Dimethoxy-9-trifluoromethyl-indro [3,2-d] [1] benzapine_6 (5H) -one, 2,9-dibromo-7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [1] Benzezepine-6 (5 ⁇ -one, 7,12-dihydro-9-trifluoromethyl-indolo [3,2-d] [1] Benzezepine-6 (5H) -one,
  • R 2 o and R 25 may be the same or different are a hydrogen atom; a halogen; a hydroxy group; a methylenehydroxy group; a linear or branched chain; Or a methylenealkoxy group; a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, optionally containing one or more heteroatoms; substituted or unsubstituted, optionally having one or more heteroatoms
  • An aryl, aralkyl or aryloxy group a mono-, di- or trialkylsilyl group having from 1 to 6 carbon atoms in a linear or branched alkyl group independently of each other; Mono-, di- or triarylsilyl groups having a substituted or unsubstituted aryl group independently of each other; trifluoromethyl group; —C OM; —CO OM; ] ⁇ Group (where M is a hydrogen atom, a linear or branched C i -C 18 -alkyl
  • Substances that inhibit GSK-3 are indirubin, 5-phosphate-indirubin, 5-bromo-indirubin, 5-cloin-indirubin, 5-fluorindirubin, 5-methyl-indirubin, 5-nitro-one indirubin, 5- S0 3
  • the substance that inhibits GSK- 3 is selected from the group consisting of indirubin-1,3-monoxime, 5-iodine-indirubin-3, -monoxime and 5-S N3Na-indirubin-1,3-monoxime
  • the neuronal stem cell is cultured to generate neurons, and the neurons are collected from the culture. Method of manufacturing neurons.
  • a nerve regeneration method comprising administering a substance that inhibits GSK_3.
  • the substance that inhibits the activity of GSK-3 may be any compound that inhibits the activity of GSK-3.
  • Examples thereof include lithium, bisindolylmaleimide derivatives, 3-aryl-4-indolylmaleimide derivatives, and indolo.
  • Examples of the bis (indolylmaleimide) derivative, 3-aryl-4-indolylmaleimide derivative, and indolorubazole derivative include, for example, compounds of formulas (I) to (III) The compound represented by is mentioned. Among them, 3,4-bis (1-methylindole-3-yl) -1H-pyrrole-2,5-dione, 3- (1-methylindole-3-yl) 4- (1-propylindole) 3-yl) 1H-pyrroyl 2,5-dione, 3- [1- (3-cyanopropyl) indole-3-3-yl] -4-1- (1-methylindole-3-yl) -1H —Pyrrole—2,5-dione, 3— [1- (3-Aminopropyl) indole-3-yl] 1-4— (1—methylindole—l—3-yl) 1H—pyrrole—2,5-dion, 3— [1— (3
  • indolo [3,2-d] [1] benzazepin-6 (5H) -one derivative include a compound represented by the formula (IV).
  • benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-7,12-dihydro-5-methyloxy-propylonylmethyl-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 ( 5H) -one, 9-bromo-7,12-dihydro-12-methyloxyl-ponylmethyl-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-7,12- Dihydro-12- (2-hydroxyethyl) -indolo
  • Benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-7, 12-dihydro-5-methyl-ind [3, 2-d] [1] Benzazepine-6 ( 5H) -one, 5-benzyl-9-bromo-7,12-dihydro-5-methyl-indro [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-7,12 -Dihydro-12-methyl-indro [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-12-ethyl-7,12-dihydro-indolo [3,2-d ] [1] Benzazepine-6 (5H) -one.
  • benzazepine-6 (5H) -one, 9-bromo-7,12-dihydro-2- (carboxylic acid) -ind [3,2-d] [1] benzazepine- 6 (5H) -one, 9-bromo-7,12-dihydro-10-hydroxy-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 9-promo-7,12-dihydro -U-hydroxymethyl-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 7,12-dihydro-4-hydroxy-indolo [3, 2_d] [1] benzazepine-6 (5H ) -One, 7,12-dihydroxy-2,3-dihydroxy-indro [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 2,3-dimethoxy-9-nitro-7, 12-di
  • Zazepine-6 (5H) -one, 2,3-dimethoxy-9-cyano-7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [1] ben Zazepine-6 (5H) -one, 9-Nitro-7,12-dihydro-indro [3,2-d] [1] Benzazepine-6 (5H) -one, 3- (6-oxo-9-9 Trifluoromethyl-5,6,7,12-tetrahydrido-indro [3,2-d] [1] benzazepine-2-yl) propionitrile, 2-bromo-9-dito-7 , 12-Dihydro-indro [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one, 3- (6-oxo-9-trifluoromethyl-5,6,7,12-tetrahydro-indolo [3,2-d] [1] benzazepine-2-yl) acrylonitrile, 23-hydroxy-
  • indirubin derivative examples include, for example, a compound represented by the formula (V).
  • indirubin 5-® one Doinjirubin, 5-bromo-r down Jirubin, 5 black port one indirubin, 5-fluoro over indirubine, 5-methyl-one indirubin, 5-two Toro one indirubin, 5-S0 3 H- indirubin , 5'-bromo-indirubin, 5-5, -moindirubin, 5'-bromo-indirubin 5-sulfonic acid, indirubin-1,3-monoxime, 5-odo-indirubine-1,3-monoxime and 5- S0 3 Na—Indirubin—3′—Monoxy And the like.
  • Examples of the lower alkyl moiety of lower alkyl, lower alkoxy and lower alkoxyl-propyl include, for example, linear or branched alkyl having 1 to 10 carbon atoms, and specifically, methyl, ethyl ', propyl, Examples include isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, heptyl, octyl, 6-methylheptyl, isooctyl, nonyl, and decyl.
  • cycloalkyl examples include cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms, and specific examples thereof include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclohexyl and cyclooctyl.
  • Examples of lower alkenyl are-.
  • straight-chain, branched or cyclic alkenyl having 2 to 8 carbon atoms such as pinyl, aryl, 1-proenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl , Heptenyl, octenyl, cyclohexenyl, 2,6-octenyl and the like.
  • the lower alkyl portion of the mono- or di-lower alkylamino has the same meaning as the lower alkyl, and the two lower alkyl portions of the di-lower alkylamino may be the same or different.
  • (V) octogen represents each atom of fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • aryl examples include monocyclic, bicyclic or tricyclic aryl having 6 to 14 carbon atoms, specifically, phenyl, naphthyl, indenyl, anthranyl and the like. .
  • Substituents in substituted lower alkyl, substituted lower alkenyl, substituted lower alkoxy and substituted lower alkoxycarbonyl are the same or different, for example, having 1 to 3 substituents, halogen, cyano, nitro, hydroxy, propyloxy, Levalmoyl, amino, mono- or di-lower alkylamino, cycloalkyl, lower alkanoyl, lower Examples include alkoxy, aryl, substituted aryl, aryloxy, substituted aryloxy, lower alkoxycarbonyl, lower alkoxyyloxy, and the like.
  • halogen the mono- or di-lower alkylamino, cycloalkyl, the aryl moiety of aryl and aryloxy, and the lower alkyl moiety of lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl, lower alkyl and lower alkyloxy, respectively, are as described above. Synonymous with halogen (v), mono- or di-lower alkylamino (iv), cycloalkyl (ii), aryl (vi) and lower alkyl (i).
  • the substituents in the substituted aryl and substituted aryloxy shown here may be the same or different and include, for example, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkoxyl alkoxyl having 1 to 3 substituents, Halogen, cyano, nitro, hydroxy, propyloxy, amino and the like.
  • halogen and the lower alkyl portion of the lower alkyl, lower alkoxy and lower alkoxycarbonyl shown herein have the same meaning as the above-mentioned halogen (V) and lower alkyl (i), respectively.
  • Examples of the substituent in the substituted aryl and the substituted alkyl have the same groups as those described above for the substituent (vii) in the substituted lower alkyl, and include, for example, lower alkyl, substituted lower alkyl and the like. '
  • substituent in the substituted lower alkyl shown here are the same or different, and include, for example, lower alkoxy, lower alkoxyl propyl, halogen, cyano, nitro, hydroxy, propyloxy, amino and the like having 1 to 3 substituents. .
  • halogen and the lower alkyl moiety of the lower alkoxy and the lower alkoxycarbonyl shown herein have the same meaning as the halogen (V) and the lower alkyl ⁇ , respectively.
  • the lower alkyl shown here has the same meaning as the lower alkyl (i).
  • Bisindolylmaleimide derivatives 3-aryl-4_indolylmaleimide derivatives, indolo rubazole derivatives, indolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one derivatives, indirubin derivatives, compounds (I As the pharmacologically acceptable salts of) to (V) and compounds (la) to (Ilia), non-toxic, water-soluble salts are preferable.
  • hydrochloride, sulfate, nitrate, phosphate Inorganic acid salts such as acetate, maleate, fuma Organic salts such as-,, silicates, citrates and the like are listed.
  • 'Pharmacologically acceptable metal salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, magnesium salt, calcium salt and the like. Salts include alkaline earth metal salts, aluminum salts, zinc salts, etc., and pharmacologically acceptable ammonium salts include salts such as ammonium, tetramethylammonium, and the like. Examples of the organic amine addition salt include addition salts such as morpholine and piperidine.
  • siRNA short interference RNA
  • the siRNA against GSK-3 can suppress the expression of GSK-3 due to its RNAi activity, thereby inhibiting the activity of GSK-3.
  • siRNA can inhibit GSK-3 activity by introducing itself into cells, and also by introducing vectors that express siRNA into cells. .
  • the guanine or cytosine content is 3052% in any 19 of the messenger RNA sequences of human GSK-3. That at least 3 out of the 5 bases at the 3 'end are adenine or peridine, the melting temperature is 2 (less than T, the 3rd base is adenine, and the 10th base is The condition that the 13th base is other than glycine, the 19th base is adenine, and the 19th base is not glycine or cytosine.
  • a target sequence that is highly effective By selecting a sequence that satisfies the above criteria, a target sequence that is highly effective can be selected.
  • Sense strand oligoRNA with 2 nucleotides added to 3 'end of oligo RNA of the target sequence and antisense strand with 2 nucleotides added to 3' end of oligo RNA of sequence complementary to the target sequence By hybridizing both oligo RNAs, an effective siRNA against human GSK-3 can be produced. Synthesis, purification, and hybridization of siRNA can be performed by various methods (for example, it can be performed by using a 7 siRNA Construction Kit (manufactured by Ambion) and following the attached protocol).
  • Vectors to be expressed can be expressed by various viral vectors such as various plasmid vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, and adenovirus vectors.
  • the vector can be expressed in the iGENEhU6 Vector (iGENE) by the method described above. It can be prepared by incorporating oligo DNA of the selected target sequence according to the attached protocol.Introduction of siRNA or a vector expressing the siRNA into cells can be carried out by various methods, for example, Nucleofector Device (Manufactured by Amaxa) according to the attached protocol.
  • the method of searching for a substance that inhibits the activity of GSK-3 is based on [i] coexistence of GSK-3 3 ⁇ 4 GSK-3 phosphorylated peptide and ATP in the presence of the test substance, and [ii] test substance [Iii] Measured and compared the amount of phosphorylated peptide in the presence of GSK-3, GSK-3 phosphorylated peptide and ATP as described in [i] above in the absence of [Iv]
  • the test substance is not particularly limited.
  • peptides, proteins, cell extracts, purified products derived from the extracts, cell culture supernatants, purified products derived from the supernatants, biological samples such as serum, and biological samples derived from the biological samples Purified product, microbial cell extract, purified product derived from the extract, microbial culture supernatant, purified product derived from the supernatant, compound, compound synthesized using combinatorial chemistry, etc. it can.
  • GSK-3 is not particularly limited as long as it has GSK-3 activity. But preferably mammalian, more preferably rat, mouse, monkey or human-derived GSK-3 ⁇ or / 3, and more specifically, a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Can be given.
  • GSK-3 can be obtained by introducing an expression vector having a gene encoding GSK-3 into animal cells, and culturing the animal cells.
  • the gene encoding GSK-3 is not particularly limited as long as it encodes GSK-3, but is preferably GSK-3 ⁇ or / 3 derived from mammals, more preferably rat, mouse, monkey or human.
  • a gene to be encoded can be mentioned, and specifically, a gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be mentioned.
  • Examples of the peptide phosphorylated by GSK-3 include glycogen synthase.
  • Examples of glycogen synthase include a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. .
  • Daricogen synthase can be obtained by, for example, introducing an expression vector having a gene encoding Daricogen synthase into animal cells, and culturing the animal cells.
  • the gene encoding glycogen synthase is not particularly limited as long as it encodes glycogen synthase, but preferably encodes glycogen synthase derived from mammals, more preferably rat, mouse, monkey or human. And, specifically, a gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • a peptide having an amino acid sequence containing a site that is phosphorylated by GSK-3 is also phosphorylated by GSK-3. It can be used as a peptide, and specifically, a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 can be obtained.
  • GSK- 3 activity for example as AT P is a donor of phosphoric acid - with [ ⁇ 33 P] ATP, and have your test substance the presence or test substance in the absence, GSK- Phosphorylation reaction of dalycogen synthase or a peptide containing a phosphorylation site of the enzyme by step 3 and measuring the amount of 33 P. incorporated into the enzyme or peptide using a liquid scintillation counter or the like. Can be raised You.
  • the nerve regenerating agent refers to an agent having an effect of directly acting on neural stem cells in the brain of a human or animal to promote neuron formation and increase the number of neurons in the brain.
  • the nerve regenerating agent can be used as a therapeutic agent for a nerve disease accompanied by nerve degeneration or damage.
  • the neurological diseases include Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Down's syndrome, cerebrovascular disorder, stroke, spinal cord injury, Huntington's chorea, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, epilepsy, anxiety disorder, schizophrenia , Depression and manic depression.
  • a substance that inhibits the activity of GSK-3 or a pharmacologically acceptable salt thereof can be administered alone as it is as a nerve regenerating agent, but it is usually provided as various pharmaceutical preparations. desirable.
  • the pharmaceutical preparations are used for animals and humans.
  • the nerve regenerating agent of the present invention contains, as an active ingredient, a substance that inhibits the activity of GSK-3 or a pharmacologically acceptable salt thereof alone or as a mixture with any other active ingredient for treatment. can do.
  • these pharmaceutical preparations are prepared by mixing the active ingredient with one or more pharmaceutically acceptable carriers and by any method well known in the technical field of pharmaceuticals.
  • the route of administration may be oral, for which it is desirable to use the most effective one for treatment, or parenteral, for example, intravenously.
  • Dosage forms include tablets, powders, granules, syrups, and injections.
  • Liquid preparations suitable for oral administration include water, sugars such as sucrose, sorbit, fructose, glycols such as polyethylene glycol, propylene glycol, sesame oil, olive oil, soybean oil It can be produced by using oils such as E. coli, preservatives such as P-hydroxybenzoic acid esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint. Tablets, powders, granules, etc.
  • Formulations suitable for parenteral administration comprise sterile aqueous solutions containing the active compound, which is preferably isotonic with the blood of the recipient.
  • a solution for injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of saline and a glucose solution.
  • parenteral preparations one selected from the diluents, preservatives, flavors, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc. exemplified for the oral preparations Alternatively, more auxiliary components can be added. .
  • the dosage and frequency of administration of a substance that inhibits the activity of GSK-3 or a pharmacologically acceptable salt thereof will vary depending on the mode of administration, the age and weight of the patient, the nature or severity of the condition to be treated, Usually, in the case of oral administration, 0.01 mg to lg, preferably 0.05 to 50 mg per adult is administered once to several times a day. In the case of parenteral administration such as intravenous administration, 0.001 to 100 mg, preferably 0.01 to 10 mg, per adult is administered once to several times a day. 4. Agent for promoting neurogenesis of neural stem cells
  • the agent for promoting neuronal generation of neural stem cells refers to an agent that promotes neuronal generation of neural stem cells when brought into contact with neural stem cells in vivo or in vitro.
  • Neural stem cells are not particularly limited as long as they are neural stem cells, but adult neural stem cells of the brain are preferred.
  • the brain may be the brain of any animal, but is preferably a mammal, more preferably a brain of a rat, mouse, monkey, human or the like.
  • a substance that inhibits the activity of GSK-3 or a pharmacologically acceptable salt thereof can be used alone as it is as an agent for promoting neurogenesis of neural stem cells, but is usually provided as various pharmaceutical preparations Is desirable.
  • the pharmaceutical preparations are used for animals and humans.
  • the agent for promoting neurogenesis of neural stem cells of the present invention may be a substance which inhibits the activity of GSK-3 or a pharmacologically acceptable salt thereof alone or as an active ingredient for any other treatment. Can be contained as a mixture. These pharmaceutical preparations can be produced by the same method as the preparation of the above-mentioned nerve regeneration drug, and can be administered by the same administration method.
  • the neurogenesis-promoting agent for neural stem cells according to the present invention is characterized in that, in vitro, the neural stem cells are brought into contact with neural stem cells, and the neurons are cultured to generate new neurons, and the neurons are collected from the culture. It can be used for the manufacturing method of the neuron which performs.
  • a substance that inhibits the activity of GSK-3 or a pharmacologically acceptable salt thereof may be dissolved in the substance or the salt. It is preferable to use it by dissolving it in a solution that can be used. Examples of the solution include water and DMS0.
  • Neurons obtained by culturing neural stem cells in the presence of the neurogenesis promoter of the present invention are obtained by culturing neural stem cells in the presence of the neurogenesis promoter of the present invention.
  • the animal neural stem cells may be neural stem cells of any animal, and preferably include mammalian, more preferably rat, mouse, monkey and human-derived neural stem cells.
  • Examples of neural stem cells include: Examples include neural stem cells derived from the brain.
  • the neural stem cells may be cells derived from animals of any age or age, but preferably include adult neural stem cells.
  • Obtaining adult neural stem cells from an animal The method described in J. Neuroscinece, 19, 8487 (1999) and Genes S Development, 10, 3129 (1996) is performed by a surgical technique. A method of extracting a brain from an adult animal to prepare a crude extract of brain cells, and concentrating adult stem cells from the crude extract can be mentioned.
  • tissue is collected from the lateral ventricle wall of a neurological disease patient by biopsy. And a method of preparing a crude extract of brain cells and enriching adult stem cells from the extract.
  • the agent for promoting neurogenesis is applied to about 1.8 ⁇ 10 5 cells / cm 2 of adult neural stem cells. It is preferred to work at a concentration of mol / l. However, lithium or a pharmacologically acceptable salt thereof is preferably used at a concentration of 100 mol / l to 10 mmol / l.
  • 5% CO at 37 ° C Culture can be promoted by static culture in two atmospheres, with replacement of the whole or partial medium every 4 days for 4 to 14 days.
  • the medium used for culturing adult neural stem cells may be any medium as long as it does not prevent promotion of neurogenesis, such as DMEMZF12 medium (Invitrogeri) containing 1% N2 supplement (Invitrogen). It is preferable to use
  • the neurons obtained by the above culture can be recovered from the culture medium and transplanted to the affected site of a neurological disease patient by a surgical technique to be used for the treatment of the neurological disease.
  • the neurological diseases include Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Down's syndrome, cerebrovascular disorder, stroke, spinal cord injury, Huntington's chorea, multiple sclerosis', amyotrophic lateral sclerosis, epilepsy, anxiety disorder, schizophrenia, Depression and manic depression can be cited.
  • Evaluation method of nerve regenerating agent of the present invention The following method can be used to confirm that the nerve regenerating agent of the present invention can regenerate neurons in vivo and treat nerve diseases.
  • the above-described nerve regenerating agent of the present invention is administered to an experimental animal such as a rat or a monkey.
  • the experimental animal may be a healthy animal without injury, but it is possible to effectively observe neurogenesis by giving hippocampal ischemic injury [Cell, no, 429 (2002 )], Animals in which the brain has been injured by a method such as ischemia, 6-hydroxydopamine (6-0HDA) administration or kainate administration.
  • Administration routes include oral, buccal, subcutaneous, intramuscular, intravenous and intraventricular administration.
  • the dose and the administration method are, for example, lOO ⁇ glOing, preferably 500 g to 500 ng per kg of body weight, administered once or several times a day.
  • parenteral administration such as intravenous administration, 10 g to 1 mg, preferably 100 g to 100 ng per 1 kg of body weight is administered once or several times a day.
  • Newborn neurons can be detected by the following method.
  • a retroviral vector capable of expressing a cell-labelable gene such as bromodoxyperidine (BrdU), which can label proliferating cells, or Green Fluorescent Protein (GFP) or galactosidase, is used as the first substance.
  • a cell-labelable gene such as bromodoxyperidine (BrdU), which can label proliferating cells, or Green Fluorescent Protein (GFP) or galactosidase
  • the number of BrdU-positive cells per unit area and the ratio of the number of Tuj 1-positive cells, which is a neuronal marker, to the number of BrdU-positive cells are calculated as follows: Compare with negative control.
  • the neurogenesis promoting effect of the nerve regenerating agent of the present invention and the therapeutic effect on nerve disease can be evaluated.
  • ANSC-7 cells obtained by the method described in Reference Example 2 were collected from a culture medium containing DMEM / F12 medium containing 1 ml of N2 supplement (Invitrogen) and 20 ng / ml of FGF-2 (PeproTech). In a 12-well culture dish coated with two tins and laminin, spread 1.8 ⁇ 10 5 per well and incubate. The whole amount of the culture solution is replaced with a DMEM / F12 medium (manufactured by Invitrogen, hereinafter referred to as a differentiation induction medium) containing 0.5% fetal calf serum and 1% N2supplement without FGF2 to induce differentiation.
  • a differentiation induction medium manufactured by Invitrogen
  • PBS Invitrogen
  • a substance which inhibits the activity of GSK-3 which is serially diluted in a range of 0.01 mmol / l to 5 mol / l with DMS0, is added in a volume of 1 / 1,000. Add the same volume of PBS or DMS0 as a negative control.
  • the culture medium is exchanged every two days with a differentiation-inducing medium containing a substance that inhibits the activity of each GSK-3, and after a total of six days of differentiation induction, a 15% neutral buffered formalin solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) And fix for 20 minutes. Then, washing for 5 minutes using PBS containing 0.3% TritonX-100 (manufactured by Nacalai Tesque) is repeated three times. Next, after blocking the cells for 2 hours using 10% fetal fetal serum (manufactured by DAK0) diluted with PBS, mouse anti-Tujl (
  • H33342 Fluorochrome, Trihydrochloride (manufactured by Calbiochem, hereinafter referred to as H33342) is added to a final concentration of lg / ml to stain the nuclei. After immersion in PBS, the cells are observed with an inverted fluorescence microscope (manufactured by Nikon Corporation), and the number of Tujl-positive neurons per 2.44 square millimeters is counted.
  • an inverted fluorescence microscope manufactured by Nikon Corporation
  • ANSC-7 cells 4.5 x 10 5 per well in a 6-well culture dish coated with polyorditin and laminin in DMEM / F12 medium containing 2 ml of orchid N2 supplement and 20 ng / ml FGF-2 7 holes were soaked and incubated.
  • Total RNA was obtained from the cells in one well using an RNeasy mini kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached protocol.
  • the medium in the remaining 6 wells was completely replaced with a differentiation induction medium to induce differentiation.
  • 3 mol / l of lithium chloride was added to 1 / 1,000 volume of the culture medium in 2 wells, and 1 mol / l volume of 1 mol / l of lithium chloride was added to the other 2 wells.
  • the same volume of PBS was added to the remaining two wells to make a control.
  • 5XDNase buffer of IO I 5XDNase buffer of IO I
  • RNase inhibitor of 0.51 40U / 1
  • RNase-free DNaseldU / ⁇ 1 2.5 I (promega)
  • the total volume was adjusted to 501 with sterile water. After reacting at 37 ° C for 30 minutes, phenol was treated with chloroform and precipitated with ethanol.
  • cDNA was prepared from all RMs of rat brain as a positive control. 1 il l of the cDNA was added to a set of 2, "1 ⁇ , mo 1/1 primer, 11 DMS0 (manufactured by Nacalai Tesque), 21 lOXExTaq buffer, 1.6 ⁇ 1 dNTPmix, 0.1 l After adding ExTaq (above, manufactured by Yu-Kara Bio Inc.) and treating at 94 ° C for 1 minute using a thermal cycler, the cycle of 94 for 1 minute, 60 for 1 minute, and 74 for 1 minute is amplified by Be2. The cDNA fragment was amplified by repeating 27 cycles of PCR for PCR and 35 cycles of PCR for amplification of BDNF, respectively.
  • BDNF For amplification of BDNF, a synthetic DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 8 and 9 was used as a format.
  • the amplified DNA was electrophoresed on a 1.8% agarose (Nacalai Tesque) gel, stained with ethidium bromide (Nacalai Tesque), and detected with a transilluminator (Toyobo).
  • the Bcl-2 band intensity did not change due to the difference in the concentration of lithium chloride at 24 hours and 6 days after the start of differentiation.
  • BDNF was not expressed regardless of the difference in lithium chloride concentration.
  • lithium ANSC- The effect of inhibiting apoptosis on 7 cells was analyzed.
  • lithium chloride was added to a medium containing ANSC-7 cells to a final concentration of 3 ol / l, cultured for 6 days, and the ANSC-7 cells cultured with lithium chloride were added.
  • ANSC-7 cells cultured with PBS were reacted with the cells using Fluorescein (manufactured by Roche Diagnostics), an in situ cell death detection kit, according to the attached protocol. The cells were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Nikon Corporation), and the number of apoptotic cells per 2.44 square millimeters was counted.
  • the target molecule of lithium, GSK- 3 and inositol ⁇ Ichiru - 1-phosphate Fosufu ⁇ evening - Zeya inositol Bok - Lou poly phosphatase are known [Na t ur e, 417, 292-295 (2002 )], And insulin and forskolin are known to indirectly inhibit the activity of GSK-3 [Mol. Cell. Biol., 19, 4989-5000 (1999)].
  • Lithium promotes neurogenesis of neural stem cells by inhibiting the activity of GSK-3, as lithium, insulin and forskolin are thought to share a common target molecule for the promotion of neurogenesis. It was shown that.
  • a substance having an activity of selectively inhibiting GSK-3 can be used as an agent for promoting neuronal formation of neural stem cells and as a therapeutic agent for nerve regeneration.
  • Example 6 9-bromo-7,12-dihydro-indolo [3,2_d] [1] benzazepine-6 (5H) -one (Kenpaullone), a GSK-3 inhibitor, promotes neurogenesis GSK-3 and cyclin dependence in a manner similar to that shown Kenpaullone [Biochem.
  • CDK an inhibitor of kinase
  • the DMS0 solution was dissolved in DMS0, and the DMS0 solution in a volume of 1 / 1,000 of the culture solution was added to the medium containing ANSC-7 cells, and the number of Tujl-positive neurons on day 6 after induction of differentiation was analyzed.
  • the number of Tujl-positive neurons was 1.3 times higher than that of the negative control with Kenpaullone at a final concentration of 0.5 ⁇ mol / l, 2.7 times at 2 xmol / l, and 3.7 times at 5 ⁇ mol / l, depending on the concentration of Kenpaullone. Significantly increased.
  • Roscovitine at a final concentration of 2 xmol / 1 was 1.0-fold compared to the negative control, 1.2-fold at 5 mol / 1, and 1.1-fold at 10.mol / l. No increase in numbers was observed. Therefore, it was clarified that Kenpaullone has a neurogenesis-promoting action, and that the action is not due to the CDK inhibitory activity of Kenpau 11 one but to the GSK-3 inhibitory activity.
  • the cDNA encoding the wild-type rat GSK-3 gene was prepared as follows using the rat brain-derived cDNA described in Experimental Example 2 as type II. A primer set of 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 / 1 consisting of 31 SEQ ID NOS: 10 and 11 to 2.5 xl type II cDNA
  • a mutant rat GSK-3 ⁇ gene in which the lysine residue at position 85, which is a mutation that loses the kinase activity of GSK-3 ⁇ , is mutated to an arginine residue [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92, 8498-8502 (1995)] was similarly prepared as follows.
  • the amplification reaction solution of each of the wild type and the mutant type was treated with phenol / cloth form, precipitated by adding ethanol, and purified using a QIAquick PCR purification kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached protocol.
  • the reaction solution was treated with phenolic orifice, and ethanol was added to precipitate the DNA.
  • the DNA was dissolved in 431 of sterilized water.
  • 5 10 of 10X Alkaline Phosphatase buffer and 21 of Alkaline Phosphatase buffer were added. (Manufactured by La Bio Inc.) and reacted at 65 ° C for 30 minutes.
  • the reaction solution was treated with phenol / chloroform and ethanol was added to precipitate the DNA, which was dissolved in sterilized water.
  • 3 g of the cut pCLNCX plasmid vector is mixed with 3 g of the wild-type or mutant rat GSK-3] 3 gene cDNA prepared above, and sterile water is added thereto.
  • 4 l was added, and ligation high (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) of 41 was added to react at 16 ° C for 12 hours. This was transformed into an iDH5o! Competent cell (Dakara Bio Inc.).
  • the ampicillin-resistant colonies were cultured in a liquid LB medium by a standard method, and pCLNC-GSK3j3 plasmid DNA and pCLNC-GSK3 / 3 (K85R) plasmid DNA were prepared using Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) according to the attached protocol. .
  • a virus vector was prepared as follows, and the functions involved in neuronal differentiation of ANSC-7 cells were analyzed.
  • 2 ml of PCLNC-GSK3; 3, pCLNC-GSK3 ⁇ (K85R), or the pCLNCX plasmid vector, which is a negative control, and pMD.G plasmid vector DNA (distributed from US The cells were dissolved in D-MEM high glucose medium (Invitrogen) and transfected into 293gp cells prepared on the previous day (distributed from the US Solk Laboratories) using Transfast transfection reagent (Promega) according to the attached protocol. Fiction was performed.
  • the culture supernatant was filtered with a 0.4511 m filter (Mi 11 ipore) to recover a solution containing the virus vector.
  • the virus vector solution was transferred to a poly-aloma tube (manufactured by Hitachi, Ltd.) and centrifuged at 50,000 ⁇ g, 18 ° C. for 90 minutes using an ultracentrifuge (manufactured by Hitachi, Ltd.). Remove the supernatant and remove the precipitated virus from DMEM / F12 containing 2% 1 supplement, 20 ng / ml FGF-2 and 8, "g / uil hexadimethrine bromide (Sydama Aldrich).
  • GSK-3 ⁇ was highly expressed and differentiated by infecting a retrovirus made from CLNC-GSK3; 3 compared to ANSC-7 cells differentiated. In cells, the number of new neurons was significantly reduced by 33%.
  • Alzheimer's disease is shown to have the potential to develop by inhibiting the self-renewal ability of the brain by suppressing neurogenesis by promoting the phosphorylation of the target molecule by high expression of GSK-3) 3.
  • — 3 inhibitors have been shown to be potential therapeutics for neurological disorders such as Alzheimer's disease.
  • Beta-amyloid peptide (hereinafter referred to as A ⁇ ) is a major component of senile plaques and a substance thought to be the cause of Alzheimer's disease [Pro Nat. Acad. Sci., USA, 98, 11039. -11041 (2001)].
  • S [1-40] (BI0S0URCE) was dissolved in 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid (Nacalai Tesque) to make lOmg / ml .. Incubate at 25 for 1 hour, then PBS To 0.5 mg / ml. The cells were incubated at 25 ° C for 24 hours to form complexes (J. Biol.
  • Alzheimer's disease one of the neurological diseases, may have the potential to develop by inhibiting the self-renewal ability of the brain by suppressing the neuronal renewal by associative A / 3.
  • ANSC-7 cells of associated A3 Apoptosis-promoting effect on Analyzed.
  • ANSC-7 cells induced to differentiate for 6 days with a differentiation-inducing medium containing associative type A] 3 at a final concentration of 0.1 mg / ml in the same manner as in Experimental Example 8, and a differentiation-inducing medium containing PBS as a control MSC-7 cells induced to differentiate by the above method were transformed with the cells using an in situ cell death detection kit, Fluorescein (manufactured by Roche Diagnostics) according to the attached protocol.
  • the cells were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Nikon Corporation), and the number of apoptotic cells per 2.44 square millimeters was counted.
  • the number of apoptosis-positive cells increased by 14% with the addition of associative A jS, but there was no significant difference. It has been revealed that suppression is mainly caused by.
  • a compound having an activity of selectively inhibiting GSK-3 is a nerve regenerating agent for neurological diseases such as Alzheimer's disease, and that the compound is a neurogenesis promoting agent for neural stem cells.
  • Indirubin-3, -monoxime reported as an inhibitor of GSK-3 [J. Biol. Chem., 276, 251-260 (2001), Sigma-Aldrich, Inc.] Was dissolved in DMS0 to lmmol / 1, and the culture solution was Was added to the medium containing ANSC-7 cells, and the number of Tujl-positive neurons on day 6 after induction of differentiation was analyzed. The same volume of DMS0 was added as a negative control. As a result, when Indirubin-3'-monoxime was added at a final concentration of l ⁇ mol / 1, the number of Tujl-positive neurons significantly increased 1.4-fold compared to the negative control. Therefore, it was revealed that Indirubin-3'-monoxime has a neurogenic effect.
  • siRNA Short interference RNA
  • siRNA_Bl consisting of SEQ ID NOS: 14 and 15
  • double-stranded siRNA consisting of SEQ ID NOs: 16 and 17-B2
  • Dharmacon was introduced according to the attached protocol.
  • Non-specific Control Duplex IX (473 ⁇ 4GC Content) siRNA was introduced.
  • the cells were suspended in 5 ml of a differentiation induction medium and inoculated on a 6-cm culture dish coated with polyorutin and laminin. 48 hours after seeding, the cells were cultivated with 1% Noni de t P_40, 50 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 50 mM NaCl (all manufactured by Nacalai Tesque), and one tablet per 10 ml of Complete mini, EDTA free ( The product was dissolved and recovered in an aqueous solution containing Roche Diagnostics, and separated by SDS-PAGE according to a standard method, and then the amount of GSK-3 ⁇ was detected by Western blotting.
  • a compound having an activity of inhibiting GSK-3 and a nucleic acid containing siRNA serve as an agent for promoting neurogenesis of neural stem cells and as a medicament for regenerative treatment of neurological diseases.
  • Step 2 Synthesis of 2- (1-methylindole-1-yl) -12-oxoacetic acid methyl ester
  • Reference Example 2 Isolation and culture of adult neural stem cells from rat brain
  • a 7-week-old Sprague Dawley rat was put to sleep under ether anesthesia and then decapitated.
  • the skull was incised from the top of the head to remove the brain.
  • the tissue including the periventricular region was separated from the excised brain under a microscope using ophthalmic scissors and tweezers.
  • the tissue including the periventricular region is cut into fragments of about lmm 3 using ophthalmic scissors and a scalpel, and then 2.5 U / ml papain and 250 U / ml DNase (both manufactured by Worth'ington, Freehold, NJ) 5 ml HBSS buffer containing lu / ml neutral protease (Dispase: Boehringer Maneim)
  • the obtained crude cell extract was cultured on a 10-cm culture dish in a 37 ° C incubator using a DMEM / F12 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum. The next day, the medium was replaced with DMEM / F12 containing 1% N2 supplement (Invitrogen) and 2 Ong / ml FGF-2 (PeproTech), and culture was started. Once every three days, half of the medium was replaced with DMEM / F12 containing fresh 1% N2 supplement and 20 ng / ml FGF-2, and the culture was continued. When small colonies of small cells were formed, the cells were treated with 1% trypsin for about 30 seconds to 1 minute, and the detached cells were collected.
  • the cells were incubated at room temperature with lO zg / ml of polyorditin (manufactured by Shidama) and at 37 ° C. with Sg / ml of mouse EHS tumor-derived laminin (Becton Dickinson). It was spread on a multi-coated culture dish (manufactured by Fisher Scientific), which had been coated, and the culture was continued. By continuing the above culture, thick small cells having small projections were concentrated. The cells were used in the above experiments as the adult neural stem cell line ANSC-7. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a tablet having the following composition is prepared by a conventional method.
  • Lithium chloride was dissolved in PBS to a concentration of 3 ⁇ 1/1 by a conventional method to prepare an agent for promoting the formation of neural stem cells that contains lithium chloride.
  • Example 3 Agent for promoting neurogenesis of neural stem cells (2)
  • a neurogenesis promoter for neural stem cells containing Indirubin-3'-monoxime was prepared. . Industrial Applicability
  • a nerve regenerating agent comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the activity of Daricogen synthase kinase-3, an agent for promoting neuronal stem cell neurogenesis, comprising the substance as an active ingredient, It is possible to provide a neuron obtained by culturing a neural stem cell in the presence of the neurogenesis promoter, and a method for producing the neuron. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 6 Description of artificial sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 7 Description of artificial sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 10 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA ′
  • SEQ ID NO: 11 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA

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Abstract

本発明の課題は、神経再生薬、神経幹細胞のニューロン新生促進剤、該ニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロンおよび該ニューロンの製造方法を提供することにある。該課題を解決するために、本発明は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３の活性を阻害する物質を有効成分として含有する神経再生薬、該物質を有効成分として含有する神経幹細胞のニューロン新生促進剤、該ニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロンおよび該ニューロンの製造方法を提供する。本発明の医薬は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ダウン症、脳血管障害、脳卒中、脊髄損傷、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、不安障害、統合失調症、うつ病、躁鬱病などの神経疾患治療薬として有用である。

Description

' ■ 明細書
" 神経再生薬
技術分野
本発明はグリコーゲンシン夕一ゼキナ一ゼー 3 (以下、 G S K— 3と略す） の活 性を阻害する物貲を有効成分として含有してなる神経再生薬、 G S K— 3の活性を 阻害する物質を有効成分として含有してなるニューロン新生促進剤、該ニューロン 新生促進剤の存在下、 神経幹細胞を培養して得られるニューロン、 および該ニュー ロンの製造方法に関する。 背景技術 '
神経疾患とは、 脳や末梢のニューロンが遺伝的要因、 環境要因、 加齢要因など【こ より傷害を受ける疾患である神経変性疾患と、神経の変性を伴わないうつ病および 躁鬱病等とを総称する。 神経変性疾患として、 具体的には、 パーキンソン病、 アル ッハイマー病、 ポリグルタミン酸病、 筋萎縮性側索硬化症、 多発ニューロバチ一、 脊髄損傷、 脳血管障害などがあげられる。 これら神経変性疾患の一般的治療法は、 ニュ—ロンの傷害により失われた神経伝達物質を補充する療法であるが、該療法で 症状が改善するのはパーキンソン病、 アルツハイマー病などに限定される。 また神 経伝達物質補充療法では神経細胞死の進行を止めることはできない。
中枢神経系を再生する再生医療は、 パーキンソン病で失われたドーパミン作動性 ニューロンの機能を積極的に回復させる治療法として検討が進められてきたが、中 絶胎児脳を用いる方法であることから様々な問題があり一般的な利用としては応 用されていない。
また、 胎児脳から取得した神経幹細胞ゃヒト受精卵から取得した E S細胞を生体 外で大量培養した後、 目的のニューロンへ変換して移植に用いるという治療法も検 討されているが、 目的とするニュ一ロンへ正確に分化させる技術は確立されておら ず、また胎児由来の神経幹細胞ゃヒト E S細胞を用いる方法であることに起因する 問題もあり、 臨床応用は進んでいない。
一方、 成体脳から神経幹細胞が分離され、 ヒト成体脳でも生涯にわたりニューロ ンの新生が起こることが報告されたことから、患者の脳内に内在する神経幹細胞を 薬剤などで刺激して再生を誘導して神経変性疾患を治療する方法が検討されてい る。
インスリン様増殖因子一 1 [J. Neuroscience, 20； 2896-2903 (2000) ]、 線維芽 細胞増殖因子一 2 [Pro. Nat. Acad. Sc i. USA, 98, 5874-5879 (2001) ] , ステムセ ルファクター [J. Cl in. Invest. , 110, 311-319 (2002) ] , エリスロポエチン [J. Neurosc ience, 21, 9733-9743 (2001) ] , 全脳虚血 [ J. Neuroscience, 18, 7768 - 7778 (1998) ]、 てんかん刺激 [J. Neuroscience, 22, 3174-3188 (2002) ] など サイトカインの脳内投与や疾患モデルにより海馬や嗅球でのニューロン新生が促 進されることが報告されている。また、 腫瘍増殖因子一 αの脳内投与により線条体 でドーパミン作動性ニューロンが新生し、パーキンソン病の症状が改善することも 報告されている [Pro. Nat. Acad. Sci. USA, 97, 14686-14691 (2000) ]。 さらに、 海馬への虚血傷害により失われた C A 1錘体細胞が虚血後 2日目から 5日目にか けて脳内に線維芽細胞増殖因子一 2と上皮細胞増殖因子を投与することにより、そ の 4 0 %が完全に回復することも報告されている [Cel l , 110, 429-441 (2002) ] o しかし、上記の方法は、いずれも蛋白性の因子を脳内に投与することが必要であり 一般的な医療へと応用することは困難である。
末梢投与可能な低分子化合物.によりニューロン新生を惹起できるものとしては、 モノアミンォキシダ一ゼ阻害剤、 セロトニン特異的なトランスポーター阻害剤、フ ォスフオジェステラ一ゼ IV 阻害剤などの抗鬱薬が報告されている [Neuropsychopharmacology, 25, 836 - 844 (2001) ]。 これらの薬剤が脳内で神経再 生を誘導するメカニズムとしては、セロ卜ニン作動性ニューロンのセロトニン受容 体シグナルに直接的または間接的に作用して、 神経栄養因子を生産し、 セロトニン 作動性ニューロン周囲のニューロン新生を促進していることが考えられている。 し たがって、 これらの薬剤はセロトニン作動性ニューロンの変性とは関係しない大部 分の神経疾患においては、神経再生薬として利用することはできないと考えられる。 また、 気分安定化薬のリチウムが細胞死抑制遺伝子 bcl- 2の発現を誘導すること により海馬で恒常的に新生している新生ニュ一ロンをニューロン死から保護し、海 馬でのニューロン新生を見かけ上増加させることが報告されてい [ J. Neurochemis try, 75, 1729-1734 (2000) ]。 またリチウムは神経栄養因子 BDNFの発 現を誘導することも報告されている' [Neuropharmacology, 43, 1173-1179(2002)]。 しかしながら、 リチウムが直接、 神経幹細胞に働きかけ、 ニューロン分化を促進す ることによりニューロン新生を促進させることについては報告されておらず、また リチウムの海馬以外でのニューロン新生促進活性についても報告されていない。ま た、 リチウムが何故、 神経変性を伴わないうつ病および躁鬱病に対し治療効果があ るのかについても知られていない。
アルツハイマー病では、 ダリコーゲンシンタ一ゼキナーゼー 3 (以下、 GSK— 3と略す）が、 微小詧関連蛋白質であるタウ蛋白質を過剰にリン酸化することで神 経原繊維変化を形成し、 神経細胞死を誘導するという仮説が提唱されている [Trends in Molecular Medicine, 8, 126-132(2002)]。 また GSK— 3の活性を 阻害する物質は、 in vitroにおいて成熟した神経細胞を保護する活性があると報告 されている [J. Neurochemistry, 77, 94-102 (2001) ]0 該報告に基づき、 GSK— 3の活性を阻害する物質は、アルツハイマー病をはじめ様々な神経変性疾患の治療 薬として用いることができると考えられている（国際公開第 00/38675号パ ンフレット） が、 成熟したニューロンを保護することで実際に神経変性疾患を治療 することができるか否か、および GSK— 3の活性を阻害する物質にニュ一ロン新 生促進作用があることは知られていない。 発明の開示
本発明の目的は、 GSK— 3の活性を阻害する物質を有効成分として含有してな る神経再生薬、該物質を有効成分として含有してなる神経幹細胞のニューロン新生 促進剤、 該ニューロン新生促進剤の存在下、 神経幹細胞を培養して得られるニュ一 ロンおよび該ニュ一口ンの製造方法を提供することにある。 本発明は以下の （1) 〜 （41) に関する。
(1) グリコーゲンシン夕一ゼキナーゼ一 3 (以下、 GSK— 3と略す） の活 性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経再生薬。
(2) 神経再生薬が、 神経疾患の治療薬である上記 （1) の医薬。.
(3) 神経疾患が、 パーキンソン病、 アルツハイマー病、 ダウン症、 脳血管障 害、脳卒中、脊髄損傷、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、 てんかん、 不安障害、 統合失調症、 うつ病および躁鬱病からなる群より選ばれる神 経疾患である上記 （2 ) の医薬。
( 4 ) G S K— 3の活性を阻害する物質が、 リチウムまたはその薬理学的に許 容される塩である上記 （1 ) 〜 （3 ) のいずれか 1つの医薬。
( 5 ) G S K— 3の活性を阻害する物質が、 ビスインドリルマレイミド誘導体、 3—ァリール—4—インドリルマレイミド誘導体、ィンドロ力ルバゾール誘導体、ィ ンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン誘導体もしくはィンジルビン誘導体ま たはそれらの薬理学的に許容される塩である上記 （1 ) 〜 （3 )'のいずれか 1つの医 薬。
( 6 ) G S K - 3の活性を阻害する物質が、 式（I)
Figure imgf000005_0001
[式中、 nおよび mは同一または異なって、 1〜3の整数を表し、 R R3および R4は 同一または異なって、 水素原子 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換の低級アルケニル、 -C0R6 (式中、 R6は水素原子、 置換もしくは非置換の低 級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換のァリ一 ルまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す）、 -C00R7 (式中、 R7は水素原 子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァリールまたは置 換もしくは非置換のシクロアルキルを表す） または- OR8 (式中、 R8は水素原子、 置 換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もし くは非置換のシクロアルキルを表す） を表し、 R2および R5は同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケ ニル、 置換もしくは非置換の低級アルコキシ、 置換もしくは非置換の低級アルコキ シカルポニル、 置換もしくは非置換のァリール、 カルボキシ、 ハロゲン、 ヒドロキ シ、 ニトロ、 アミノまたはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、 nおよび m がそれぞれ 2または 3であるとき、 それぞれ.の および R5は同一でも異なってい てもよい] で表される化合物、 式（I I)
Figure imgf000006_0001
(式中、 na、 ma、 R1A、 R2A、 R3Aおよび R5Aは、 それぞれ前記 n、 m、 R R2、 R3および と同義である） で表される化合物もしくは式（I I I) '
Figure imgf000006_0002
[式中、 nb、 mb、 R1B、 R2Bおよび は、 それぞれ前記 n、 m、 R Rzおよび R5と同義 であり、 R3Bおよび R4Bは同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低 級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 -C0R6 (式中、 R6は前記と同義 である）、 -C00R7 (式中 R7は前記と同義である） または- OR8 (式中、 R8は前記と同 義である） を表すか、 または R3Bと R4Bが一緒になつて、
Figure imgf000006_0003
(式中、 kは 1または 2を表し、 Xは C¾、 NH、 酸素原子または硫黄原子を表し、 R9 はヒドロキシ、力ルポキシ、力ルバモイルまたは低級アルコキシカルボニルを表す) を形成する]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である上記
( 1 ) 〜 （3 ) のいずれか 1つの医薬。
( 7 ) G S K— 3の活性を阻害する物質が、 式（l a)
Figure imgf000007_0001
(式中、 R2aは水素原子、 低級アルコキシ、 低級アルユキシカルポニル、 ァリール またはニトロを表し、 R3aおよび R4aは同一または異なって、 置換もしくは非置換 の低級アルキルを表す）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であ る上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つの医薬。
(8) GSK— 3の活性を阻害する物質が、 式（Ila) '
Figure imgf000007_0002
(式中 ma は前記と同義であり、 R3Aaは置換もしくは非置換の低級アルキルを表 し、 R5Aaはハロゲンを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩 である上記 (1) 〜 (3) のいずれか 1つの医薬。
(9) GSK— 3の活性を阻害する物質が、 式（Ilia)
Figure imgf000007_0003
(式中、 R9は前記と同義である） で表される化合物またはその薬理学的に許容され る塩である上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つの医薬。
(10) GSK-3の活性を阻害する物質が、 3， 4一ビス （ 1—メチルイン ドール一 3—^ Γル） 一 1H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン、 3— (1—メチルインド ール— 3—ィル） 一 4一 （1—プロピルインドールー 3—ィル） — 1H—ピロ一ル 一 2， 5—ジオン、 3— [1— (3—シァノプロピル) インドール— 3—ィル] ―
4- (1一メチルインドールー 3—ィル） 一 1H—ピロール— 2， 5—ジオン、 3 ― [1— (3—ァミノプロピル） インドール— 3—ィル] 一 4— (1一メチルイン ドール— 3—ィル） 一 1H—ピロール— 2， 5—ジオン、 3— [1— (3—力ルポ キシプロピル）インドールー 3—ィル] 一 4一（1一メチルインドールー 3—ィル） 一 1H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン、 3— [1— (3—力ルバモイルプロピル） ィ ンドール— 3—ィル] —4一 （1一メチルインドールー 3—ィル） 一 1H—ピロ一 ル—2, 5—ジオン、 3— [1— (3—アミノプロピル） インド一ルー 3—ィル] —4— (1ーメチルー 5—プロピルォキシインドール— 3—ィル） ― 1H—ピロ一 ルー 2， 5—ジオン、 3 - [1— (3—ヒドロキシプロピル) インドールー 3—ィ ル] —4一 （1ーメチルー 5—フエニルインドールー 3—ィル） 一 1H—ピロ一ル - 2, 5—ジオン、 3 - [1 - (3—ァミノプロピル) インドール—3—ィル] -
4— (1ーメチルー 5—フエ二ルインドール一 3—ィル） - 1 H—ピロ一ル _ 2，
5—ジオン、 3 - [1 - (3—ヒドロキシプロピル) インドールー 3—ィル] -4 一 （1—メチル— 5—メトキシカルポニルインドール— 3—ィル） — 1H -ピロ一 ルー 2， 5—ジオン、 3 - [1— (3—ヒドロキシプロピル) インドールー 3—ィ ル] — 4— (1—メチル— 5—二トロインド一ル— 3—ィル) 一 1H—ピロール— 2, 5ージオン、 3— (1一メチルインドールー 3—ィル) —4— [1一 （3—ヒ ドロキシプロピル) 一 5—ニトロインドール— 3—ィル] - 1 H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン, 3一 (2—クロ口フエニル) -4- (1一メチルインドール— 3—ィ ル） 一 1 H—ピロール— 2， 5ージオン、 3 - (2, 4—ジクロロフエニル) —4 - (1一メチルインド一ルー 3—ィル) 一 1H—ピロ一ルー 2, 5—ジオン、 3一
(2 _クロ口フエニル) 一 4一 [1— (3—ヒドロキシプロピル) インドール— 3 一ィル] 一 1H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン、 4一 [1一 (3—ァミノプロピル) インドール— 3 _ィル] - 3 - (2—クロ口フエニル) - 1 H—ピロ一ルー 2， 5 ージオンおよび
Figure imgf000008_0001
からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記
(1) 〜 （3) のいずれか 1つの医薬。，
(11) GSK— 3を阻害する物質が、 式 （IV)
Figure imgf000009_0001
[式中、 Aは単結合または二重結合によっておに結合されている酸素または硫黄で あり、 R1()は水素原子、 ァリール、 低級脂肪族置換基、 特にアルキルおよび低級アル キルエステルからなる群より選択され、 R"〜R14はアルコキシ、 ァミノ、 ァシル、 脂肪族置換基、 特にアルキル、 アルケニルおよびアルキニル置換基、 脂肪族アルコ —ル、特にアルキルアルコール 脂肪族二トリル、特にアルキル二トリル、シァノ、 ニトロ、 カルボキシル、 ハロゲン、 水素原子、 ヒドロキシル、 ィミノならびにひ、β 不飽和ケトンからなる群より個別に選択され、 R15〜R18は脂肪族置換基、 特にァ ルキル アルケニルおよびアルキニル置換基、 特に低級脂肪族置換基 脂肪族アル コール、 特にアルキルアルコール、 アルコキシ、 ァシル、 シァノ、 ニトロ、 ェポキ シ、 八口アルキル基、 ハロゲン、 水素原子ならびにヒドロキシルからなる群より個 別に選択され、 R19は脂肪族の基、 特に低級アルキル基、 脂肪族アルコール、 特にァ ルキルアルコール、 カルボン酸、 および水素からなる群より選択される] で表され る化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記 (1) 〜 (3) のいずれか 1つの医薬。
(1 2) GSK— 3を阻害する物質が、 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベ ンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2-ブロモ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3,2-d] [1]ベンズァ ゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9 -クロロ- 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3,2-d] [1]ベンズァゼピン
-6 (5H) -オン、 H-クロ口- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 10-ブロモ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)_オン、 8 -ブロモ -6， 11-ジヒドロ-チエノ [3',2' :2,3ァゼピノ [4,5- b]インド —ル- 5 (4H) -ォン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 4-メトキシ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベン ズァゼピン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 4-ヒドロキシ-ィンドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7， 12-ジヒドロ- 4-メトキシ-ィンドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ -7， 12-ジヒドロ -2,3-ジメトキシ -インドロ [3，2_d] [1]ベンズァゼピン _6(5H)-オン、 9_ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 2， 3 - ジヒドロキシ -インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 7, 12-ジヒドロ -2， 3-ジメトキシ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H)-オン、 7， 12-ジヒドロ -9 -トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7, 12-ジ ' ヒドロ- 2， 3 -ジメトキシ -9-トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピ ン- 6(5H)-オン、 2-ブロモ -7， 12-ジヒドロ -9-トリフルォロメチル-ィンドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ -7,12-ジヒドロ-ィンドロ
[3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-チオン., 9-ブロモ -5， 12-ビス-（t-ブチルォキシ 力ルポニル) - 7， 12 -ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9- プロモ -12-(t-プチルォキシカルポニル） - 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベン ズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ -5， 7-ビス- (t-ブチルォキシ力ルポ二ル）- 7, 12- ジヒドロ—インドロ [3,2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン 9-ブロモ -5， 7, 12-トリ -（t-プチルォキシカルポニル） - 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピ ン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ _7， 12-ジヒドロ- 5-メチルォキシカルボニルメチル -イン ドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 12-メチル ォキシ力ルポ二ルメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -プロ モ- 7, 12-ジヒドロ- 12- (2-ヒド口キシェチル) -インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 2,9-ジブロモ- 7， 12-ジヒドロ-ィンド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 8，10-ジクロロ- 7,12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9-シァノ- 7, 12 -ジヒドロ-ィンド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H) -オン、 9 -ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 5-メチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼ ピン- 6(5H)-オン、 5-ベンジル- 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 5-メチル -ィンドロ Γ3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 12-メチル -イン ドロ. [3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -ブロモ -12-ェチル -7， 12-ジヒドロ- インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 12- (2 - プロぺニル) -インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7， 12-ジヒドロ- 9 - メチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7， 12- ヒドロ- 9-メトキ シ -インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-フルォロ -7, 12-ジヒドロ -12- (2 -プロべニル) -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 11 -ブロモ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2_d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12 - ジヒド口- 2- (メチルイミノアミン）-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -才 ン、 9_ブロモ - 7, 12-ジヒドロ -2- (カルボン酸) -ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 9-ブロモ - 7，12-ジヒドロ- 10-ヒドロキシ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズ ァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -ブロモ- 7, 12 -ジヒドロ- 11-ヒドロキシメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)_オン、 7， 12-ジヒドロ- 4-ヒドロキシ -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ- 2， 3-ジヒドロキシ-インド 口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2， 3-ジメトキシ- 9-ニトロ- 7， 12-ジヒド ロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、. 9-シァノ -7, 12-ジヒドロ-ィ ンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2, 3-ジメトキシ- 9-シァノ -7, 12-ジ ヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ニトロ- 7, 12-ジヒドロ -ィンドロ [33 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン 3 -（6-ォキソ -9-トリフルォロメ チル- 5， 6, 7, 12-テ卜ラヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -2-ィル）プロピ ォニトリル、 2 -ブロモ -9-ニトロ- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピ ン- 6 (5H) -オン、 3 -（6-ォキソ -9-トリフルォロメチル -5, 6, 7, 12-テトラヒドロ-ィン ドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2-ィル）ァクリロニトリル、 2- (3-ヒドロキシ -卜プ 口ピニル) -9-卜リフルォロメチル -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼ ピン- 6 (5H) -オン、 2-ョ一ド- 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [Πベンズ ァゼピン- 6 (5H) -オン、 2 -（3-ォキソ -1-ブテニル） -9-トリフルォロメチル- 7， 12 -テ トラヒド口 -ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン _6 (5H)-オン、 8-ク口口- 6， U-ジヒ ドローチエノ [3'，2' : 2, 3]ァゼピノ [4, 5-b]ィンドール- 5 (4H) -オン、 2 -ョード -9 -ト リフルォ口メチル- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォ ン、 7, 12-ジヒドロ-ピリド [3' , 2' : 4, 5]ピロ口 [3， 2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -才 ン、 U -メチル -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3,2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2 - [2- (卜ヒドロキシシクロへキシル）ェチニル] -9-トリフルォロメチル- 7， 12-ジヒ ドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2-シァノ -7, 12-ジヒドロ- ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H)-オン、 2 -ョード- 7, 12-ジヒドロ-ィンド 口 [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H)-オン、 1卜ェチル -7, 12-ジヒド σ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 8-メチル- 6,1卜ジヒドロ-チェノ [3',2' :2, 3]ァゼピノ [4， 5-b]ィンドール - 5 (4H) -オンおよび 3 -（6-ォキソ -9-トリフ ルォロメチル- 5， 6, 7， 12-テトラヒド口-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2 -ィ ル）アクリル酸メチルエステルからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的 に許容される塩である上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つの医薬。 ' (13) GSK- 3を阻害する物質が、 9-シァノ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ _7， 12-ジヒドロ- 2,3-ジメトキシ -インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2_ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 9 -ト リフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン.. 7, 12-ジヒド 口- 2， 3-ジメトキシ- 9-トリフルォロメチル-ィンドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン -6(5H) -オン、 2, 9-ジブロモ -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ- 9-トリフルォロメチル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァ ゼピン -6 (5H) -ォン、 9-ク口口- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 8_ブロモ -6， 11 -ジヒドロ-チェノ [3',2' :2，3]ァゼピノ [4, 5-b]インド ール -5(4H)-オン、 7， 12-ジヒドロ- 9-メトキシ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 10-プロモ- 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 11-ブロモ -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H) -オン、 11 -クロ口- 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 9 -フルォ口- 7， 12-ジヒドロ-ィンド口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9-メチル -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3，2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9-ブロモ - 7，12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-チオン、 8， 10-ジクロロ- 7， 12 -ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピ ン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ -7， 12 -ジヒドロ- 12- (2-ヒドロキシェチル） -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 2, 3-ジヒドロキ シ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2_ブロモ - 7, 12-ジヒドロ-ィ ンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7, 12-ジヒドロ- 2， 3 -ジメトキシ-ィ ンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン_6 (5H) -才ン、 9-ブ口モ- 7， 12-ジヒドロ- 12-メチ ル-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ - 7，12-ジヒドロ- 5 - メチルォキシカルポニルメチル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン および 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -ォンからなる群 より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つの医薬。
( 1 4) GSK— 3を阻害する物質が、 9-シァノ -7， 12」ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ _2， 3-ジメトキシ
-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2-ブロモ- 7, 12-ジヒドロ- 9 -ト リフルォロメチル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7， 12-ジヒド ロ- 2， 3-ジメトキシ -9-トリフルォロメチル-ィンド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 2, 9-ジブロモ- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H) -オン、 7， 12-ジヒドロ- 9-トリフルォロメチル-インドロ [3,2- d] [l]ベンズァ ゼピン- 6(5H)-オン、 9-クロ口- 7， 12—ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H) -オン、 8-ブロモ -6, 11 -ジヒドロ-チェノ [3',2' :2, 3]ァゼピノ [4, 5-b]インド ール- 5 (4H)-オンおよび' 7, 12-ジヒドロ- 9-メトキシ-ィンド口 [3, 2-d] [1]ベンズァ ゼピン- 6 (5H) -ォンからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容され る塩である上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つの医薬。
( 1 5) G S K - 3を阻害する物質が、 9_ブロモ -7,12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オンまたはその薬理学的に許容される塩である 上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つの医薬。 '
(1 6) GSK- 3を阻害する物質が、 式 (V)
Figure imgf000014_0001
[式中、同じか異なってよい R20および R25は水素原子；ハロゲン；ヒドロキシ基； メチレンヒドロキシ基；直鎖または分枝鎖の C ^ds—アルキルまたはアルコキシ またはメチレンアルコキシ基；必要に応じて 1個または複数のへテロ原子を含む、 3から 7個一炭素原子を有するシクロアルキル基；必要に応じて 1個または複数の ヘテロ原子を有する置換または非置換のァリール、ァラルキルまたはァリ一ルォキ シ基；それぞれ互いに独立に、 直鎖または分枝鎖のアルキル基中に 1から 6個の炭 素原子を有するモノー、 ジーまたはトリアルキルシリル基；それぞれ互いに独立に 置換または非置換ァリール基を有するモノー、 ジ—またはトリアリールシリル基； トリフルォロメチル基； -COM； -COOM；あるいは一 CH2C〇〇M基 (こ こで Mは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基 1個または複数 で置換された直鎖または分枝鎖の C C 18—アルキル基、または必要ならば 1個ま たは複数のへテロ原子を有し、 1個または複数のハロゲン、 アルキル基またはアル コキシ基で置換されていてよいァリール基を表す）； - R30R3i¾ (ここで同じか 異なってよい R30および R31は水素原子、 必要ならば付加的に 1個または複数のヒ ドロキシおよび Zまたはァミノ基で置換されている C i〜 C 18直鎖または分枝鎖ァ ルキル基、 置換または非置換で、 必要ならば 1個または複数のへテロ原子を含むァ リール基を表す) ；ァシル基； -CH2-NR30R31メチレンアミノ基 (ここで R30 および Rsiは前記の意味を有する）；ベンゼン環が必要ならば 1個または複数のへ テロ原子を有するベンジル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する、 炭素原子 3から 7個を有するメチレンシクロアルキル基；アミドとしての、 窒素原 子に結合した生理的アミノ酸基；グリコシドが単糖または二糖から選択される O— グリコシドまたは N—グリコシド；あるいはメチレンスルホネート基を表し；同じ か異なってよい R21、 R22、 R23、 R24、 R26、 R27、 R28および R29は水素原子； ハロゲン；ヒドロキシ基；ニトロソ基；ニトロ基；アルコキシ基 ;必要ならば 1個 または複数のヒドロキシおよびノまたはァミノ基で置換されている直鎖または分 枝鎖の C dsアルキル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換のァリール基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換ァラルキル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換ァリールォキシ基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有す る置換または非置換メチレンァリールォキシ基；必要ならば 1個または複数のへテ 口原子を含む、 3力、ら 7個の炭素原子を有するシク口アルキル基；必要ならば 1個 または複数のへテロ原子を含む、 3から 7個の炭素原子を有す'るメチレンシクロア ルキル基； トリフルォロメチル基；— C OM； _ C〇〇M；または C H2C O OM 基（ここで Mは水素原子、 必要ならばヒドロキシおよび Zまたはアミノ基 1個また は複数で付加的に置換された直鎖または分枝鎖の C C 18—アルキル基、または必 要ならば 1個または複数のへテロ原子を有し、 1個または複数のハロゲン原子、 ァ ルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよぃァリ一ル基を表す)； - N R30 R3i基 (ここで同じか異なってよい Rsoおよび Rsiは水素原子、 必要ならば付加的 に 1個または複数のヒドロキシおよび/またはァミノ基で置換されている直鎖ま たは分枝鎖 C ^ dsアルキル基、 置換または非置換で、 必要ならば 1個または複 数のへテロ原子を含むァリール基、 ァシル基を表すか 窒素原子が、 必要ならば 1 個または複数のへテロ原子を含む、炭素原子 3から 7個を有するシクロアルキルの 一部を形成する）；一 C O N RsoRsi基 （ここで Rsoおよび R3iは前記の意味を有す る）；ヒドロキシルァミノ基；ホスフェート基；ホスホネ一ト基；スルフェート基； スルホネート基；スルホンアミド基；— S〇2N R30 R31基 (ここで R 30および R 31 は前記の意味を有する) ； 一 N = N _ R 32ァゾ基 (ここで R32は必要ならば 1個ま たは複数のカルポキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された芳香族基 あるいはグリコシドが単糖または二糖から選択されている O—グリコシドまたは N—グリコシド基を表す） を表すか； R2oおよび R24ならびに R25および R29はそ れぞれ一緒になつて、 互いに独立に必要ならば置換された 1から 4個の C H2基を —有する環を形成し；同じか異なってよい Yおよび Zは酸素；ィォゥ；セレン；テル ルの原子； N R33基 （ここで R33は水素原子、 必要ならば 1個または複数の力ルポ キシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された直鎖または分枝鎖 (^〜じ]^ アルキル基、必要ならば 1個または複数のへテロ原子を含む置換または非置換のァ リール基、 ァラルキル基またはスルホネート基を表す）；あるいは一 NOR33 (ここ で R33基は前記の意味を有する） を表す] で表される化合物またはそれらの薬理学 的に許容される塩である上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つの医薬。
(17) GSK— 3を阻害する物質が、 インジルビン、 5—ョードーインジル ビン、 5—ブロモーインジルビン、 5—クロローインジルビン、 5—フルォロ Γ ンジルビン、 5—メチル—インジルビン、 5一二トローインジルビン、 5— S〇3 H—インジルビン、 5'—ブロモ一^ Γンジルビン、 5— 5 '—ジブロモ—インジルビ ンおよび 5 '—プロモーインジルビン 5—スルホン酸からなる群より選ばれる化合 物またはその薬理学的に許容される塩である上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つの
(18) GSK— 3を阻害する物質が、 インジルビン— 3'—モノォキシム、 5 ーョ一ド fンジルビン一 3 '—モノォキシムおよび 5一 S 03N a—ィンジルビン - 3，—モノォキシムからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容さ れる塩である上記 (1) 〜 (3) のいずれか 1つの医薬。
(19) GSK— 3を阻害する物質が、インジルビン— 3，—モノォキシムまた はその薬理学的に許容される塩である上記 （1) 〜 (3) のいずれか 1つの医薬。
(20) G S K— 3の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経 幹細胞のニューロン新生促進剤。
(21) GSK- 3の活性を阻害する物質が、 リチウムまたはその薬理学的に 許容される塩である上記 （20) のニューロン新生促進剤。
(22) GSK-3の活性を阻害する物質が、ビスィンドリルマレイミド誘導体、 3—ァリ一ルー 4一インドリルマレイミド誘導体、ィンドロ力ルバゾール誘導体、ィ ンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン誘導体もしくはィンジルビン誘導体ま たはそれらの薬理学的に許容される塩である上記 （20) のニューロン新生促進剤。
(23) GSK— 3の活性を阻害する物質が、 式（I)
Figure imgf000017_0001
[式中、 nおよび mは同一または異なって、 1〜3の整数を表し、 R R3および R4は 同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換の低級アルケニル、 - C0R6 (式中、 R6は水素原子、 置換もしくは非置換の低 級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換のァリー ルまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)、 -C00R7 (式中、 R7は水素原 子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァリールまたは置 換もしくは非置換のシクロアルキルを表す） または- OR8 (式中、 R8は水素原子、 置 換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もし くは非置換のシクロアルキルを表す） を表し R2および R5は同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケ エル、 置換もしくは非置換の低級アルコキシ、 置換もしくは非置換の低級アルコキ シカルポニル、 置換もしくは非置換のァリ一ル、 力ルポキシ、 ハロゲン、 ヒドロキ シ、 ニトロ、 ァミノまたはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、 nおよび m がそれぞれ 2または 3であるとき、 それぞれの R2および R5は同一でも異なってい てもよい] で表される化合物、 式（I I)
Figure imgf000017_0002
(式中、 na、 ma、 R1A、 R2A、 R3Aおよび R5Aは、 それぞれ前記 n、 m、 R R2、 R3および R5と同義である） で表される化合物もしくは式（I I I) Znb 人. ^^..入^
R FT。
[式中、 nb、 mb、 R1B、 R2Bおよび R5Bは、 それぞれ前記 n、 m、 R R2および R5と同義 であり、 R3Bおよび R4Bは同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは #置換の低 級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 - C0R6 (式中、 R6は前記と同義 である）、 -C00R7 (式中、 R7は前記と同義である） または- OR8 (式中、 R8は前記と同 義である） を表すか、 または R3Bと R4Bが一緒になつて、
Figure imgf000018_0001
(式中、 kは 1または 2を表し、 Xは CH2、 NH、 酸素原子または硫黄原子を表し、 R9 はヒドロキシ、.カルボキシ.,力ルバモイルまたは低級アルコキシカルボニルを表す) を形成する]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である上記 式（la)
Figure imgf000018_0002
(式中、 R2aは水素原子、 低級アルコキシ、 低級アルコキシ力ルポニル、 ァリールま たはニトロを表し、 R3aおよび R4aは同一または異なって、置換もしくは非置換の低 級アルキルを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である上 記 （2 0 ) のニューロン新生促進剤。
( 2 5 ) G S K— 3の活性を阻害する物質が、 式（I la)
Figure imgf000019_0001
(式中、 maは前記と同義であり、 ： R3Aaは置換もしくは非置換の低級アルキルを表 し、 R5Aaはハロゲンを表す）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩 である上記 （20) のニューロン新生促進剤。
(26) GSK— 3の活性を阻害する物質が、 式（Ilia)
Figure imgf000019_0002
(式中 R9は前記と同義である） で表される化合物またはその薬理学的に許容され る塩である上記 （20) のニューロン新生促進剤。
(27) GSK— 3の活性を阻害する物質が、 3, 4一ビス （1_メチルイン ドール一 3—ィル） 一 1H—ピロ一ルー 2, 5—ジオン、 3— (1—メチルインド 一ルー 3—ィル) -4- ( 1 _プロピルインド一ルー 3—ィル) — 1H—ピロール -2, 5—ジオン、 3 - [1— (3—シァノプロピル) インド一ル— 3—ィル] 一 4一 ( 1—メチルインドール一 3—ィル) 一 1H—ピロール— 2， 5—ジオン、 3 — [1— (3—ァミノプロピル) インドール— 3—ィル] -4- (1 _メチルイン ドール一 3—ィル） 一 1H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン、 3 - [1— (3—カルボ キシプロピル）インドール— 3—ィル]—4一 ( 1—メチルインド一ルー 3—ィル) 一 1 H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン、 3— [1— (3—力ルバモイルプロピル) ィ ンドール一 3—ィル] —4— (1—メチルインド一ルー 3一^ Tル） — 1H—ピロ一 ルー 2， 5—ジオン、 3 - [1 - (3—ァミノプロピル) インド一ルー 3—ィル] 一 4一 （1ーメチルー 5—プロピルォキシインド一ルー 3—ィル） 一 1H—ピロ一 ルー 2， 5—ジオン、 3— [1一 （3—ヒドロキシプロピル） インドールー 3—ィ ル] —4— (1一メチル— 5 _フエ二ルインド一ルー 3—ィル） — 1H—ピロール -2, 5—ジオン、 3— [1一 （3—ァミノプロピル） インド一ルー 3—ィル] 一
4- (1一メチル— 5—フエ二ルインドールー 3—ィル） 一 1H—ピロ一ル—2，
5—ジオン、 3— [1一 （3—ヒドロキシプロピル） インドールー 3—ィル] 一 4 一 （1—メチル— 5—メトキシカルボニルインドール— 3—ィル） 一 1H—ピロ一 ルー 2， 5—ジオン、 3 - [1一 (3—ヒドロキシプロピル) インド一ルー 3—ィ ル] —4一 （1一メチル— 5—二トロインドールー 3—ィル） — 1H—ピロ一ルー 2, 5—ジオン、 3— (1—メチルインド一ルー 3—ィル） 一4— [1— (3—ヒ ドロキシプロピル） 一 5—二トロインドール— 3—ィル] — 1H—ピロール— 2， 5—ジオン、 3 - (2—クロ口フエニル） -4- ( 1—メチルインド一ルー 3—ィ ル） 一 1H—ピロ一ル一 2， 5—ジオン、 3— （2， 4—ジクロ口フエニル) -4 一 （1一メチルインドールー 3—ィル） — 1H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン、 3—
(2—クロ口フエニル) 一 4一 [1— (3—ヒドロキシプロピル) インド一ルー 3 —ィル] — 1H—ピロ一ルー 2, 5—ジオン、 4一 [1 - (3—ァミノプロピル) インドール _ 3 _ィル] —3— (2 _クロ口フエニル) — 1H—ピロ一ル— 2, 5 ージオンおよび
Figure imgf000020_0001
からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記 (2 0) のニューロン新生促進剤。
(28) GSK— 3を阻害する物質が、 式 （IV)
Figure imgf000021_0001
[式中、 Aは単結合または二重結合によって右に結合されている酸素または硫黄で あり、 R1()は水素原子、 ァリール、 低級脂肪族置換基、 特にアルキルおよび低級アル キルエステルからなる群より選択され、 R"〜R14はアルコキシ、 ァミノ、 ァシル、 脂肪族置換基、 特にアルキル、 アルケニルおよびアルキニル置換基、 脂肪族アルコ —ル、特にアルキルアルコール、脂肪族二トリル、特にアルキル二トリル、シァノ、 ニトロ、 カルボキシル、 ハロゲン、 水素原子、 ヒドロキシル、 ィミノならびにひ、 β 不飽和ケトンからなる群より個別に選択され、 R15〜R18は脂肪族置換基、 特にァ ルキル、 アルケニルおよびアルキニル置換基、 特に低級脂肪族置換基、 脂肪族アル コール、 特にアルキルアルコール、 アルコキシ、 ァシル、 シァノ、 ニトロ、 ェポキ シ、 ハロアルキル基、 八ロゲン、 水素原子ならびにヒドロキシルからなる群より個 別に選択され、 R19は脂肪族の基 特に低級アルキル基、 脂肪族アルコール、 特にァ ルキルアルコール、 カルボン酸、 および水素からなる群より選択される] で表され る化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記 (20) のニューロン新生 促進剤。
(29) GSK- 3を阻害する物質が、 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベ ンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2 -ブロモ- 7， 12 -ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァ ゼピン- 6 (5H)-オン、 9_ブロモ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9-クロ口- 7,12-ジヒドロ-ィンドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 1卜クロ口- 7,12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [l]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 10-ブロモ -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H) -オン、 8 -ブロモ -6, 11-ジヒドロ -チエノ [3',2' :2， 3ァゼピノ [4， 5- b]インド ール _5 (4H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒド口- 4-メトキシ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベン ズァゼピン _6(5H)-オン、 9_ブロモ -7, 12 -ジヒドロ- 4-ヒドロキシ -ィンドロ
[3,2-d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 7,12-ジヒドロ- 4-メトキシ-ィンドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -プロモ- 7, 12-ジヒドロ- 2,3-ジメトキシ -インドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 9 -プロモ- 7,12-ジヒドロ- 2， 3 - ジヒドロキシ -インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 7,12-ジヒドロ -2， 3-ジメトキシ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 7, 12 -ジヒドロ - 9 -トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7, 12 -ジ ヒドロ- 2， 3 -ジメトキシ -9-トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピ ン -6(5H)-オン、 2-ブロモ -7， 12-ジヒドロ - トリフルォ ΰメチル -ィンドロ
[3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5Η)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -チオン、 9 -ブロモ -5， 12-ビス- (t-ブチルォキシ カルボ二ル)- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9- ブロモ -12- (t-ブチルォキシ力ルポ二ル）- 7， 12 -ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベン ズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -5,7 -ビス -（卜プチルォキシカルボ二ル）- 7, 12- ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -5， 7， 12-卜リ _(t-プチルォキシカルボ二ル)- 7， 12-ジヒドロ—インドロ [3,2 - d] [1]ベンズァゼピ ン- 6(5H)-オン、 9_ブロモ - 7， 12-ジヒドロ- 5-メチルォキシカルボニルメチル-イン ドロ [352 - d] [1]ペンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 12-メチル ォキシ力ルポ二ルメチル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-プロ モ -7, 12-ジヒドロ- 12- (2-ヒドロキシェチル） -インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H) -オン、 2,9-ジブロモ- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 8, 10-ジクロロ- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9-シァノ -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 5-メチル -インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼ ピン- 6(5H)-オン、 5-ベンジル- 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 5-メチル -インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 12-メチル -イン ドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ -12-ェチル -7, 12-ジヒドロ- インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ- 7， 12-ジヒドロ- 12- (2- プロべニル) -インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン _6(5H)-オン、 7， 12-ジヒドロ- 9 - メチル -インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ- 9-メトキ シ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-フルォロ- 7， 12-ジヒドロ -12- (2 -プロべニル) -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン、 11-ブロモ -7, 12 -ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -プロモ- 7, 12- ジヒドロ- 2,- (メチルイミノアミン）-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -才 ン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 2- (カルボン酸) -ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 10-ヒドロキシ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズ ァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ -11 -ヒドロキシメチル-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7，12-ジヒドロ- 4-ヒ'ドロキシ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ- 2, 3-ジヒドロキシ-ィンド Π [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2， 3 -ジメトキシ- 9-ニトロ- 7， 12 -ジヒド ロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-シァノ -7, 12-ジヒドロ-イ ンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 2, 3 -ジメトキシ- 9-シァノ -7， 12 -ジ ヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -二トロ- 7, 12-ジヒドロ -インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン、 3 (6-ォキソ -9-トリフルォロメ チル- 5, 6， 7, 12-テトラヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2-ィル）プロピ ォニトリル、 2-ブロモ _9_ニトロ- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2_d] [1]ベンズァゼピ ン- 6 (5H) -オン 3- (6-ォキソ - 9 -トリフルォロメチル- 5， 65 7, 12 -テトラヒド口-ィン ド口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2 -ィル）ァクリロニ卜リル、 2- (3-ヒドロキシ- 1 -プ 口ピエル） -9-トリフルォロメチル- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼ ピン- 6 (5H) -オン、 2-ョ一ド -9-ブロモ _7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズ ァゼピン- 6 (5H) -オン、 2- (3-ォキソ -1-ブテニル） -9-トリフルォロメチル -7, 12 -テ 卜ラヒドロ—インドロ [3, 2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 8 -クロ口- 6， 11 -ジヒ ドロ-チエノ [3' , 2' : 2， 3]ァゼピノ [4, 5- b]インドール- 5 (4H) -オン、 2-ョード -9-ト リフルォロメチル- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォ ン、 7， 12 -ジヒドロ-ピリド [3'，2' : 4, 5]ピロ口 [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -才 ン、 1卜メチル- 7, 12-ジヒドロ-インド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2- [2- (卜ヒドロキシシクロへキシル）ェチニル] -9-トリフルォロメチル _7， 12-ジヒ ドロ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2-シァノ -7， 12-ジヒドロ- ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2-ョ一ド- 7, 12 -ジヒドロ-ィンド 口 [3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 U-ェチル -7, 12-ジヒドロ-インドロ
[3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 8-メチル -6,1卜ジヒドロ-チェノ
[3',2' :2,3]ァゼピノ [4, 5 - b]インドール - 5 (4H)-オンおよび 3 -（6-ォキソ - 9 -トリフ ルォロメチル -5， 6， 7， 12-テトラヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 2 -ィ ル）アクリル酸メチルエステルからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的 に許容される塩である上記 （20) のニューロン新生促進剤。
(30) GSK— 3を阻害する物質が、 9_シァノ -7， 12-ジヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 2, 3-ジメトキシ -インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 2-ブロモ _7， 12-ジヒドロ- 9 -ト リフルォロメチル-ィンド,口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7, 12-ジヒド ロ- 2， 3-ジメトキシ- 9-トリフルォロメチル-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)_オン、 2,9-ジブロモ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒド口- 9 -トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァ ゼピン- 6 (5H)-オン、 9-クロ口- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 8 -プロモ- 6， 11-ジヒドロ-チェノ [3',2' :2， 3]ァゼピノ [4,5- b]インド —ル- 5(4H)-オン、 7, 12-ジヒドロ- 9-メトキシ -インドロ [3, 2_d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン 10-プロモ- 7,12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 1卜プロモ -7, 12-ジヒド口-ィンド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン _6(5H)-オン、 U-クロ口- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 9-フルォロ -7,12-ジヒドロ-ィンド口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9 -メチル -7， 12-ジヒドロ -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-チオン、 8, 10-ジクロロ- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピ ン- 6(5H)-オン、 9_ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 12- (2-ヒドロキシェチル） -インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 9 -ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 2， 3-ジヒドロキ シ -インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン _6(5H)-オン、 2-ブロモ -7, 12-ジヒドロ-ィ ンドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7, 12-ジヒドロ- 2， 3-ジメトキシ-ィ ンドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ _7， 12-ジヒドロ- 12-メチ ル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -プロモ- 7， 12 -ジヒドロ - 5 - メチルォキシカルポ二ルメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン および 7， 12 -ジヒド口 -インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オンからなる群 より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記（20) のニュ 一ロン新生促進剤。
(3 1) GSK— 3を阻害する物質が、 9-シァノ -7,12-ジヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12 -ジヒドロ- 2， 3-ジメトキシ -インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 2-ブロモ -7, 12-ジヒドロ _9 -ト リフルォロメチル-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H):オン、.7， 12 -ジヒド 口- 2， 3-ジメトキシ- 9-トリフルォロメチル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァ ピン _6(5H) -オン、 2, 9-ジブロモ- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン -6(5©-オン、 7， 12-ジヒドロ- 9-トリフルォロメチル-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァ ゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ク口口- 7， 12 -ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 8-プロモ- 6， 1卜ジヒドロ-チエノ [3' ,2' :2， 3]ァゼピノ [4, 5-b]ィンド —ル- 5 (4H)-オンおよび 7， 12-ジヒドロ- 9-メトキシ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァ ゼピン- 6 (5H)-オンからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容され る塩である上記 （20) のニューロン新生促進剤。
(32) GSK— 3を阻害する物質が、 9-プロモ -7512-ジヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オンまたはその薬理学的に許容される塩である 上記 （20) のニューロン新生促進剤。
(33) GSK-3を阻害する物質が、 式 (V)
Figure imgf000025_0001
[式中、同じか異なってよい R2oおよび R25は水素原子；ハロゲン；ヒドロキシ基； メチレンヒドロキシ基；直鎖または分枝鎖の 〜じ —アルキルまたはアルコキシ またはメチレンアルコキシ基；必要に応じて 1個または複数のへテロ原子を含む、 3から 7個一炭素原子を有するシクロアルキル基；必要に応じて 1個または複数の ヘテロ原子を有する置換または非置換のァリール、ァラルキルまたはァリ一ルォキ シ基；それぞれ互いに独立に、 直鎖または分枝鎖のアルキル基中に 1から 6個の炭 素原子を有するモノ—、 ジ—またはトリアルキルシリル基；それぞれ互いに独立に 置換または非置換ァリ一ル基を有するモノ一、 ジーまたはトリァリ一ルシリル基； トリフルォロメチル基；— C OM； - C O OM；ぁるぃはー( 1^(：〇〇]^基 （こ こで Mは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび Zまたはアミノ基 1個または複数 で置換された直鎖または分枝鎖の C i〜 C 18—アルキル基、または必要ならば 1個ま たは複数のへテロ原子を有し、 1個または複数のハロゲン、 アルキル基またはアル コキシ基で置換されていてよいァリール基を表す）；—N RSORSI基（ここで同じか 異なってよい Rsoおよび Rsiは水素原子、 必要ならば付加的に 1個または複数のヒ ドロキシおよび Zまたはァミノ基で置換されている C i〜 C 18直鎖または分枝鎖ァ ルキル基、 置換または非置換で、 必要ならば 1個または複数のへテロ原子を含むァ リール基を表す）；ァシル基；一 C H2_ N R30R3iメチレンアミノ基 (ここで および Rsiは前記の意味を有する）；ベンゼン環が必要ならば 1個または複数のへ テロ原子を有するベンジル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する、 炭素原子 3から 7個を有するメチレンシクロアルキル基；アミドとしての、 窒素原 子に結合した生理的アミノ酸基；グリコシドが単糖または二糖から選択される O— グリコシドまたは N—グリコシド；あるいはメチレンスルホネート基を表し；同じ か異なってよい R21、 R22、 R 23、 R 24、 R 26、 R 27、 R 28および R 29は水素原子； ハロゲン；ヒドロキシ基；ニトロソ基；ニトロ基；アルコキシ基；必要ならば 1個 または複数のヒドロキシおよび/またはァミノ基で置換されている直鎖または分 枝鎖のじ 〜 ^アルキル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換のァリール基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換ァラルキル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換ァリールォキシ基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有す る置換または非置換メチレンァリールォキシ基；必要ならば 1個または複数のへテ 口原子を含む、 3力 ^ら 7個の炭素原子を有するシクロアルキル基；必要ならば 1個 または複数の Λテロ原午を含む、 3から 7個の炭素原子を有するメチレンシクロア ルキル基； トリフルォロメチル基；ー COM；— COOM；または CH2COOM 基（ここで Mは水素原子、 必要ならばヒドロキシおよびノまたはアミノ基 1個また は複数で付加的に置換された直鎖または分枝鎖の C ^ds—アルキル基、または必 要ならば 1個または複数のへテロ原子を有し、 1個または複数のハロゲン原子、 ァ ルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいァリール基を表す） ； 一 NRso Rsi基 （ここで同じか異なってよい Rsoおよび Rsiは水素原子、 必要な :らば付加的 に 1個または複数のヒドロキシおよび/またはァミノ基で置換されている直鎖ま ' たは分枝鎖 Ci dsアルキル基、 置換または非置換で、 必要ならば 1個または複 数のへテロ原子を含むァリール基、 ァシル基を表すか、 窒素原子が、 必要ならば 1 個または複数のへテロ原子を含む、炭素原子 3から 7個を有するシクロアルキルの 一部を形成する）；一 CONR3oii3i基（ここで Rsoおよび Rsiは前記の意味を有す る）；ヒドロキシルァミノ基；ホスフエ一ト基；ホスホネ一ト基；スルフエ一ト基； スルホネート基；スルホンアミド基；— S〇2NR30R31基 (ここで R30および R31 は前記の意味を有する）；一 N = N— R32ァゾ基 （ここで R32は必要ならば 1個ま たは複数のカルポキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された芳香族基 あるいはグリコシドが単糖または二糖から選択されている O—グリコシドまたは N—グリコシド基を表す） を表すか； R2oおよび R24ならぴに R25および R29はそ れぞれ一緒になつて、 互いに独立に必要ならば置換された 1から 4個の CH2基を 有する環を形成し；同じか異なってよい Yおよび Zは酸素；ィォゥ；セレン；テル ルの原子； NR33-基 (ここで R33は水素原子、 必要ならば 1個または複数のカルボ キシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された直鎖または分枝鎖 C;L〜C18 アルキル基、必要ならば 1個または複数のへテロ原子を含む置換または非置換のァ リール基、 ァラルキル基またはスルホネ一ト基を表す)；あるいは—NOR33 (ここ で R33基は前記の意味を有する） を表す] で表される化合物またはそれらの薬理学 的に許容される塩である上記 （20) のニューロン新生促進剤。
(34) GSK— 3を阻害する物質が、 インジルビン、 5—ョ一ド—インジル ビン、 5—ブロモ—インジルビン、 5—クロ口—インジルビン、 5—フルォロ—ィ ンジルビン、 5—メチルーインジルビン、 5—ニトロ一インジルビン、 5— S03 H—インジルビン、 5'—ブロモ—インジルビン、 5— 5，一ジブ口モーインジルビ ンおよび 5，—プロモーインジルビン 5—スルホン酸からなる群より選ばれる化合 物またはその薬理学的に許容される塩である上記（20)のニューロン新生促進剤。
(35) GSK— 3を阻害する物質が、インジルビン一 3，—モノォキシム、 5 一ョード—インジルビン— 3，—モノォキシムおよび 5— S〇3N a—インジルビン 一 3，一モノォキシムからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容さ れる塩である上記 （20) のニュ一ロン新生促進剤。
(36) GSK-3を阻害する物質が、インジルビン一 3'_モノォキシムまた はその薬理学 ¾に許容される塩である上記 （20) のニューロ'ン新生促進剤。
(37) 上記 （20) 〜 （36) のいずれか 1つのニューロン新生促進剤の存 在下、 神経幹細胞を培養して得られるニューロン。
(38) 上記 （2 )) 〜 （36) のいずれか 1つのニューロン新生促進剤の存 在下、 神経幹細胞を培養してニューロンを新生させ、 培養物中よりニューロンを採 取することを特徴とするニューロンの製造方法。
(39) GSK_ 3を阻害する物質を投与することを特徴とする神経再生方法。
(40) 神経再生薬の製造のための G SK- 3を阻害する物質の使用。
(41) 神経幹細胞のニューロン新生促進剤の製造のための GSK— 3を阻害 する物質の使用。 以下、 本発明の詳細を説明する。
1.本発明の神経再生薬および神経幹細胞のニューロン新生促進剤に含有される G
SK-3の活性を阻害する物質
GSK-3の活性を阻害する物質としては、 GSK-3の活性を阻害する化合物 であればいずれでもよいが、 例えばリチウム、 ビスインドリルマレイミド誘導体、 3—ァリール— 4—インドリルマレイミド誘導体、 ィンドロ力ルバゾール誘導体、 インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン誘導体、 インジルビン誘導体等が あげられる。
ビスィンドリルマレイミド誘導体、 3—ァリール— 4—インドリルマレイミド誘 導体、 インドロ力ルバゾ一ル誘導体としては、 具体的には、 例えば式 (I) 〜 （III) で表される化合物があげられる。 中でも 3， 4—ビス （1—メチルインドールー 3 —ィル） 一 1H—ピロール— 2, 5—ジオン、 3— (1—メチルインドールー 3— ィル） —4— (1一プロピルインドール— 3—ィル） 一 1H—ピロ一ルー 2, 5 - ジオン、 3— [1— (3—シァノプロピル） インドール— 3—ィル] ー4一 （1— メチルインドール— 3—ィル）— 1H—ピロール— 2， 5—ジオン、 3— [1—（3 ーァミノプロピル） インドールー 3—ィル] 一 4— (1一メチルインド一ルー 3— ィル） 一 1H—ピロール— 2， 5—ジオン、 3— [1— (3—カルポキシプロピル） インド一ルー 3—ィル] —4一 （1—メチルインド一ル— 3—ィル） 一 1H—ピロ ール— 2， 5—ジオン、 3— [1— (3—力ルバモイルプロピル） インド一ル—3 一ィル] —4_ (1 _メチルインド一ルー 3 _ィル） — 1H—ピロ一ル— 2, 5― ジオン、 3- [1— (3—ァミノプロピル) インドール— 3—ィル] —4— (1 - メチルー 5—プロピルォキシィンドール一 3—ィル) 一 1H—ピロール— 2， 5 - ジオン、 3- [1 - (3—ヒドロキシプロピル)インド一ルー 3—ィル] -4- (1 ーメチルー 5—フエニルインドールー 3—ィル） - 1 H—ピロ一ルー 2， 5―ジォ ン、 3— [1— (3—ァミノプロピル） ィンドール— 3—ィル] —4一 （1ーメチ ル一 5—フエニルインド一ルー 3—ィル） 一 1 H—ピロ一ル一 2, 5—ジオン、 3 - [1— (3—ヒドロキシプロピル) インドール一 3—ィル] 一 4一 （1—メチル 一 5—メトキシカルボニルインド一ル— 3—ィル） 一 1H—ピロ一ル— 2, 5—ジ オン、 3 - [1— (3—ヒドロキシプロピル) インドール _ 3 _ィル] -4- (1 —メチルー 5—ニトロインド一ルー 3—ィル）一 1H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン、 3一 ( 1ーメチルインド一ルー 3—ィル) 一 4一 [1一 (3—ヒドロキシプロピル) 一 5—ニトロインド一ルー 3—ィル] - 1 H—ピロ一ルー 2, 5ージオン、 3— (2 一クロ口フエニル） -4- (1一メチルインド一ル— 3一^ rル) 一 1 H—ピロール -2, 5ージオン、 3 - (2, 4—ジクロ口フエニル) -4- (1 _メチルインド 一ルー 3—ィル） — 1 H—ピロ一ル— 2， 5—ジオン、 3 - (2—クロ口フエニル) -4- [1一 （3—ヒドロキシプロピル） インド一ルー 3—ィル] — 1H—ピロ一 ルー 2， 5—ジオン、 3 - [1— (3—ァミノプロピル) インド一ルー 3—ィル] 一 4— (2—クロ口フエニル） 一 1H—ピロ一ルー 2， 5—ジオンおよび
Figure imgf000030_0001
等が好ましい。
インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン誘導体としては、 具体的には、 例えば式 (IV) で表される化合物があげられる。 中でも 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3，2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2-ブロモ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-クロロ- 7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 1卜クロロ- 7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 10-ブロモ -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 8-ブロモ -6， 11-ジヒド口-チェノ [3' , 2' : 2, 3ァゼピノ [4, 5 - b]インドール- 5 (4H) オン、 9-プロモ- 7， 12-ジヒドロ- 4_ メトキシ -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒド 口- 4-ヒドロキシ -ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒド口 -4-メトキシ-インドロ [3, 2- d] [1]ペンズァゼピン _6 (5H) -オン、 9_ブロモ -7， 12 -ジ ヒドロ- 2， 3-ジメトキシ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロ モ- 7， 12-ジヒドロ- 2， 3-ジヒドロキシ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) - オン、 7, 12 -ジヒドロ- 2， 3-ジメトキシ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) - オン、 7, 12 -ジヒドロ- 9-トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 7， 12-ジヒドロ- 2， 3-ジメトキシ- 9-トリフルォロメチル-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 9-トリフルォロ メチル -ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12 -ジヒドロ 一インドロ [3, 2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -チオン、 9-ブロモ -5, 12-ビス -（卜ブチ ルォキシカルポニル) -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) - オン、 9-ブロモ -12- (t-プチルォキシカルボニル） - 7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン、 9 -ブロモ -5， 7-ビス -（t -ブチルォキシカル ポニル ) -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -プロ モ- 5， 7, 12-トリ -（卜ブチルォキシ力ルポニル） - 7, 12-ジヒ ドロ-ィン ドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 5-メチルォキシ 力ルポニルメチル-インドロ [3，2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 12-メチルォキシ力ルポニルメチル-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァ ゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 12- (2-ヒドロキシェチル) -インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2， 9-ジブロモ- 7, 12-ジヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン、 8， 10-ジクロロ- 7， 12-ジヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-シァノ -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 5-メチル -イン ド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 5-ベンジル- 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ - 5 -メチル -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 9-ブロモ- 7, 12 -ジヒ ドロ- 12-メチル -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -12 -ェ チル- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1 ]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン. 9_プロモ -7, 12-ジヒドロ- 12- (2 -プロべ二ル）-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) - オン、 7, 12-ジヒドロ- 9-メチル -ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7， 12-ジヒドロ- 9 -メトキシ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-フ ルォ口- 7， 12-ジヒドロ- 12- (2 -プロべニル） -ィンドロ [33 2- d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H)-オン、 11-ブロモ -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 9-ブロモ- 7， 12-ジヒドロ- 2- (メチルイミノアミン） -ィンドロ
[3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 2- (カルボン 酸）-ィンド口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -ブロモ -7， 12-ジヒドロ -10-ヒドロキシ -インドロ [3, 2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -プロモ- 7， 12- ジヒドロ- U-ヒドロキシメチル -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ- 4-ヒドロキシ-インドロ [3， 2_d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7， 12-ジヒド口- 2， 3-ジヒドロキシ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -ォ ン、 2, 3-ジメトキシ- 9-ニトロ- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 9 -シァノ -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2 - d] [1]ベンズァゼピン
.
- 6 (5H) -オン、 2， 3-ジメトキシ -9-シァノ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2 - d] [1]ベン ズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-二トロ- 7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼ ピン- 6 (5H)-オン、 3- (6-ォキソ - 9 -トリフルォロメチル -5， 6, 7, 12 -テトラヒド口-ィ ンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2-ィル）プロピオ二トリル、 2-ブロモ -9-二ト口 -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 3- (6-ォキソ -9 - トリフルォロメチル- 5， 6， 7， 12 -テトラヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 2 -ィル）アクリロニトリル、 2 3-ヒドロキシ-卜プロピニル） -9-トリフルォロメ ， チル- 7,12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [l]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 2 -ョード - 9 -ブロモ -7, 12-ジヒドロ—インドロ [3，2_d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2- (3- ォキソ -卜ブテニル） -9-トリフルォロメチル _7， 12 -テトラヒドロ-インドロ [3,2- d] [l]ベンズァゼピ - 6(5H)-オン、 8-クロ口- 6，1卜ジヒドロ-チエノ [3',2' :2，3]ァゼピノ [4, 5-b]インドール- 5(4H)-オン、 2 -ョ一ド- 9-トリフルォロメ チル -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7,12-ジヒ ドロ-ピリド [3' , 2' :4, 5]ピロ口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン、 11 -メチル - 7， 12-ジヒドロ -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン-.2 - [2_ (トヒドロ キシシクロへキシル）ェチニル] -9 -トリフルォロメチル- 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 2-シァノ - 7，12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 2 -ョード- 7,12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 1卜ェチル -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 8-メチル -6， 1卜ジヒドロ-チエノ [3' , 2' :2, 3]ァゼピノ [4, 5 - b]インド一ル- 5 (4H)-オンおよび 3- (6-ォキソ -9-トリフ ルォ口メチル- 5, 6, 7, 12-テトラヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2 -ィ ル）アクリル酸メチルエステル等が好ましい。
ィンジルビン誘導体としては、 具体的には、 例えば式 (V) で表される化合物が あげられる。 中でもインジルビン、 5—ョ一ドーインジルビン、 5—ブロモ rン ジルビン、 5—クロ口一インジルビン、 5—フルオローインジルビン、 5—メチル 一インジルビン、 5—二トロ一インジルビン、 5— S03H—インジルビン、 5'— ブロモ—インジルビン、 5— 5，—ジブ口モーインジルビン、 5'—ブロモ—インジ ルビン 5—スルホン酸、インジルビン一 3，—モノォキシム、 5—ョード—インジル ビン一 3，—モノォキシムおよび 5— S03N a—インジルビン— 3'—モノォキシ ム等が好ましい。
以下、 式 （I) 〜 （V) で表きれる化合物をそれぞれ化合物 （I) 〜 （V) という。 他の式番号の化合物についても同様である。
化合物 （I) 〜 （I I I) および化合物 （la) 〜 （I l ia) の各基の定義において、 以 下の例示があげられる。
(i)低級アルキル、 低級アルコキシおよび低級アルコキシ力ルポニルの低級アルキ ル部分としては、 例えば直鎖または分岐状の炭素数 1〜10のアルキルがあげられ、 具体的にはメチル、 ェチル'、 プロピル、 イソプロピル、 プチル、 イソプチル、 sec ーブチル、 tert—ブチル、 ペンチル、 イソペンチル、 ネオペンチル、 へキシル、 へ プチル、 ォクチル、 6—メチルヘプチル、 イソォクチル、 ノニル、 デシル等があげ られる。
(i i)シクロアルキルしては、 例えば炭素数 3〜8のシクロアルキルがあげられ、 具 体的にはシクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シク 口へプチル.. シクロォクチル等があげられる。
(i i i)低級アルケニルとしては-. 例えば直鎖、 分岐または環状の炭素数 2〜8のアル ケニルがあげられ、 具体的にはピニル、 ァリル、 1一プロべニル、 ブテニル、 ペン テニル、 へキセニル、 ヘプテニル、 ォクテニル、 シクロへキセニル、 2， 6—ォク 夕ジェニル等があげられる。
(iv)モノもしくはジ低級アルキルァミノの低級アルキル部分は、前記低級アルキル と同義であり、 ジ低級アルキルァミノの 2つの低級アルキル部分は、 同一でも異な つていてもよい。
(V)八ロゲンは、 フッ素、 塩素、 臭素およびヨウ素の各原子を表す。
(vi)ァリールとしては、 例えば炭素数 6〜14の単環式、 二環式または三環式のァリ ールがあげられ、 具体的にはフエニル、 ナフチル、 インデニル、 アントラニル等が . あげられる。
(vi i)置換低級アルキル、 置換低級アルケニル、 置換低級アルコキシおよび置換低級 アルコキシカルボニルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数 1〜3の、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒドロキシ、 力ルポキシ、 力ルバモイル、 アミ ノ、 モノまたはジ低級アルキルァミノ、 シクロアルキル、 低級アルカノィル、 低級ァ ルコキシ、 ァリール、 置換ァリール、 ァリールォキシ、 置換ァリールォキシ、 低級ァ ルコキシカルポニル、 低級アル力ノィルォキシ等があげられる。
ここで示したハロゲン、 モノもしくはジ低級アルキルァミノ、 シクロアルキル、 ァリールおよびァリールォキシのァリール部分、 ならびに低級アルコキシ、 低級ァ ルコキシカルポニル、低級アル力ノィルおよび低級アル力ノィルォキシの低級アル キル部分は、 それぞれ前記ハロゲン (v)、 モノまたはジ低級アルキルアミノ（iv)、 シクロアルキル（i i)、 ァリール (vi)および低級アルキル（i)と同義である。
また、 ここで示した置換ァリ一ルおよび置換ァリ一ルォキシにおける置換基とし ては、 同一または異なって、 例えば置換数 1〜3の、 低級アルキル、 低敏アルコキ シ、 低級アルコキシ力ルポニル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒドロキシ、 力ルポ キシ、 ァミノ等があげられる。
ここで示したハロゲンならびに低級アルキル、低級アルコキシおよび低級アルコ キシカルボニルの低級アルキル部分は、 それぞれ前記ハロゲン（V)および低級アル キル（i)と同義である。
(vi i i)置換ァリールおよび置換シク口アルキルにおける置換基としては、前記置換 低級アルキルにおける置換基 (vi i) の定義であげた基に加え、 例えば低級アルキ ル、 置換低級アルキル等があげられる。 '
ここで示した置換低級アルキルにおける置換基としては、 同一または異なって、 例えば置換数 1〜3の、 低級アルコキシ、 低級アルコキシ力ルポニル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒドロキシ、 力ルポキシ、 ァミノ等があげられる。
ここで示したハロゲンならびに低級アルコキシおよび低級アルコキシカルポ二 ルの低級アルキル部分は、それぞれ前記ハロゲン (V)および低級アルキル ωと同義 である。
また、 ここで示した低級アルキルは、 前記低級アルキル（i)と同義である。
ビスインドリルマレイミド誘導体、 3—ァリール _ 4 _インドリルマレイミド誘 導体、 インドロ力ルバゾール誘導体、 インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) - オン誘導体、インジルビン誘導体、化合物（I) 〜（V)および化合物（la)〜（I l ia) の薬理学的に許容される塩としては、 毒性のない水溶性のものが好ましく、 例えば 塩酸塩、 硫酸塩、 硝酸塩、 リン酸塩などの無機酸塩、 酢酸塩、 マレイン酸塩、 フマ -,,ル酸塩、 クェン酸塩などの有機酸塩があげられ、'薬理学的に許容される金属塩とし ては、 ナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩、 マグネシウム塩、 カルシ ゥム塩などのアルカリ土類金属塩、 アルミニウム塩、 亜鉛塩などがあげられ、 薬理 学的に許容されるアンモニゥム塩としては、 アンモニゥム、 テトラメチルアンモニ ゥムなどの塩があげられ、 薬理学的に許容される有機アミン付加塩とレては、 モル ホリン、 ピぺリジンなどの付加塩等があげられる。
ビスインドリルマレイミド誘導体、 3—ァリール— 4一インドリルマレイミド誘 導体、 ィンドロ力ルバゾール誘導体、 ィンドロ [3 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) - オン誘導体、インジルビン誘導体、化合物（I) （V)および化合物（la) （I l ia) は、 EP 470490 W0 93/18766 0 93/18765, EP 397060 W0 98/11105 TO 98/11103 W0 98/11102 WO 98/04552 WO 98/04551 DE 4243321 DE 4005970, DE 4217964 DE 4005970 DE 3914764 WO 96/04906 W0 95/07910 DE 42179464 US 5856517 US 5891901 0 99/42100 EP 328026 EP 384349 EP 540956 DE 4005969 EP 508792 W0 99/65910, W0 01/037819等に記載の方法またはそれらに準じた方法により製造 することができる。
また、 G S K - 3の活性を阻害する物質として、 shor t interference RNA (s iRNA) を使用することもできる。 G S K— 3に対する s iRNAは、 その RNAi活性により G S K - 3の発現を抑制し その結果、 G S K - 3の活性を阻害することができる。 s i RNAは、 そのもの自身を細胞内に導入することによって G S K— 3の活性を阻害 することができるほか、 s iRNAを発現するべクタ一を細胞内に導入することによつ ても可能である。
ヒト G S K— 3に対する効果的な s iRNAを作製するためには、効果の高い夕一ゲ ット配列を選択することが重要である。その配列を決定するアルゴリズムは様々な 方法が知られているが、 例えば、 ヒト G S K— 3のメッセンジャー R NA配列中の 任意の 1 9配列の中で、グァニンまたはシトシンの含量が 30 52%であること、 3 ' 末端の 5塩基のうち 3塩基以上がアデニンまたはゥリジンであること、融解温度が 2(T 未満であること、 3番目の塩基がアデニンであること、 10番目の塩基がゥリジ ンであること、 13番目の塩基がグリシン以外であること、 19番目の塩基がアデ二 ンであること、 19番目の塩基がグリシン及びシトシンでないことの各条件をより多 く満たす配列を選択することにより効果の高いターゲット配列を選択することが できる。 そのターゲット配列のオリゴ RNAの 3' 末端に 2塩基のヌクレオチドを 付加したセンス鎖オリゴ RNAおよびそのターゲット配列に相補的な配列のオリ ゴ RNAの 3' 末端に 2塩基のヌクレオチドを付加したアンチセンス鎖オリゴ RN Aの両者をハイブリダィズさせることにより、 ヒト GSK— 3に対する効果的な siRNAを作製することができる。 siRNAの合成、 精製、 ハイブリダィズは様々な方 法により可能であ (るが、 例えば、 7 siRNA Const ruction Kit (Ambion社製） を用い、 添付のプロトコールに従うことにより実施することができる。 また siRNA を発現するベクターは、 各種プラスミドベクターやレトロウイルスベクター、 レン チウィルスベクター、アデノウイルスベクターなどの各種ウィルスベクターによつ て可能であるが、 例えば、 iGENEhU6 Vector (i GENE社製) に上記の方法により選 択したターゲット配列のオリゴ D N Aを添付プロトコールに従つて組み込むこと により作製することができる。 siRNAや siRNAを発現するベクターの細胞内への導 入は様々な方法により可能であるが、 例えば Nucleofector Device (Amaxa社製） を用い添付のプロトコ一ルに従うことにより実施することができる。
2. GSK- 3の活性を阻害する物質の探索法
GSK-3の活性を阻害する物質の探索法は、 [i] 被験物質の存在下、 GSK- 3¾ GSK— 3によりリン酸化されるペプチドおよび AT Pを共存させた場合と [ii] 被験物質の非存在下、 上記 [i] の GSK - 3、 GSK - 3によりリン酸化さ れるペプチドおよび A T Pを共存させた場合での、 [iii] リン酸化されているぺプ チドの量を測定、 比較し、 [iv] 被験物質の非存在下に比べ、 被験物質の存在下に おけるリン酸化されているぺプチドの量が少ない物質を選択する方法をあげるこ とができる。
被験物質は、 特に限定されないが、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 細胞抽出液ゃ該 抽出液由来の精製物、 細胞培養上清や該上清由来の精製物、 血清などの生体試料や 該生体試料由来の精製物、微生物の菌体抽出液ゃ該抽出液由来の精製物、 微生物培 養上清や該上清由来の精製物、 化合物、 コンビナトリアルケミストリーを用いて合 成された化合物などをあげることができる。
、
GSK- 3としては、 GSK— 3の活性を有するものであれば特に限定されない が、 好ましくはほ乳類、 より好ましくはラット、 マウス、 サルまたはヒト由来の G SK- 3 αまたは /3をあげることができ、具体的には配列蕃号 1で表されるァミノ 酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
GSK— 3は、 GSK— 3をコードする遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞 に導入し、 該動物細胞を培養する方法などにより取得することができる。 GSK— 3をコードする遺伝子は、 GSK— 3をコードする遺伝子であれば特に限定されな いが、 好ましくはほ乳類、 より好ましくはラット、 マウス、 サルまたはヒト由来の GSK— 3 αまたは /3をコードする遺伝子をあげることができ、具体的には配列番 号 2で表される塩基配列を有する遺伝子をあげることができる。
GSK— 3によりリン酸化されるペプチドとしては、グリコーゲン合成酵素をあ げることができ、 グリコーゲン合成酵素としては、 例えば配列番号 3で表されるァ ミノ酸配列を有するぺプチドをあげることができる。
ダリコーゲン合成酵素は、ダリコ一ゲン合成酵素をコードする遺伝子を有する発 現ベクターを動物細胞に導入し、該動物細胞を培養する方法などにより取得するこ とができる。 グリコーゲン合成酵素をコードする遺伝子は、 グリコ一ゲン合成酵素 をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、 好ましくはほ乳類、 より好まし くはラット、 マウス、 サルまたはヒ卜由来のグリコーゲン合成酵素をコードする遺 伝子をあげることができ、具体的には配列番号 4で表される塩基配列を有する遺伝 子をあげることができる。
また、 蛋白質の翻訳に関与する eukaryotic initiation factor 2Β (eIF2B) 蛋白 質のアミノ酸配列中で、 G S K— 3によりリン酸化される部位を含むアミノ酸配列 を有するぺプチドも G SK- 3によりリン酸化されるペプチドとして用いること ができ、具体的には配列番号 5で表されるァミノ酸配列を有するぺプチドをぁげる ことができる。
GSK- 3の活性を測定する方法としては、例えばリン酸の供与体である AT P として [ァ— 33P] ATPを用い、 被験物質存在下、 または被験物質非存在下にお いて、 GSK- 3によるダリコーゲン合成酵素または該酵素のリン酸化部位を含む ぺプチドのリン酸化反応を行レゝ、該酵素またはペプチドに取り込まれた33 P .の量を 液体シンチレーシヨンカウンターなどを用いて測定する方法をあげることができ る。
3 . 神経再生薬 ·
神経再生薬とは、 ヒトまたは動物の脳内の神経幹細胞に直接作用することでニュ 一ロン新生を促進し、 脳内のニューロンを増加させる作用を有する薬剤をいう。 該神経再生薬は、神経の変性または損傷を伴う神経疾患の治療薬として用いるこ とができる。
該神経疾患としては、 パーキンソン病、 アルツハイマー病、 ダウン症、 脳血管障 害、脳卒中、脊髄損傷、八ンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、 てんかん、不安障害、統合失調症、うつ病および躁鬱病などをあげることができる。
G S K - 3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩は、神経再 生薬として、 そのまま単独で投与することも可能であるが、 通常各種の医薬製剤と して提供するのが望ましい。 また、 それら医薬製剤は、 動物および人に使用される ものである。
本発明の神経再生薬は、活性成分として G S K— 3の活性を阻害する物質または その薬理学的に許容される塩を単独で、または任意の他の治療のための有効成分と の混合物として含有することができる。 また、 それら医薬製剤は、 活性成分を薬理 学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野に おいてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路は 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口または、 例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、 錠剤、 散剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 注射剤などがある。 経口投与に適当な、 例えばシロップ剤のような液体調製物は、 水、 蔗糖、 ソルビ ット、 果糖などの糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコールなどのグ リコール類、 ごま油、 オリ一ブ油、 大豆油などの油類、 P—ヒドロキシ安息香酸ェ ステル類などの防腐剤、 ストロベリーフレ一バ一、 ペパーミントなどのフレ一バ一 類などを使用して製造できる。 また、 錠剤、 散剤および顆粒剤などは、 乳糖、 ブド ゥ糖、 蔗糖、 マンニットなどの賦形剤、 澱粉、 アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、 ス テアリン酸マグネシウム、 タルクなどの滑沢剤、 ポリビニールアルコール、 ヒドロ キシプロピルセルロース、 ゼラチンなどの結合剤、 脂肪酸エステルなどの界面活性 剤、 グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。 , 非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を 含む滅菌水性剤からなる。 例えば、 注射剤の場合は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液または 塩水とブドウ糖溶液の混合 からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。 また、 これら非経口剤においても、 経口剤で例示した希釈剤、 防腐剤、 フレーバ 一類、 賦形剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 結合剤、 界面活性剤、 可塑剤などから選択される 1種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。 .
G S K— 3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩の投与量 および投与回数は、 投与形態、 患者の年齢、 体重、 治療すべき症状の性質または重 篤度により異なるが、通常経口の場合、成人一人当り 0. 01mg〜lg、好ましくは 0. 05 〜50mgを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人 一人当り 0. 001 〜100mg、 好ましくは 0. 01〜10mgを一日一回ないし数回投与する。 4 . 神経幹細胞のニューロン新生促進剤
神経幹細胞のニューロン新生促進剤とは、 in vivoまたは in vi t roにおいて、 神 経幹細胞と接触させたとき、該神経幹細胞のニューロン新生を促進する薬剤のこと をいう。
神経幹細胞は、 神経幹細胞であれば特に限定されないが、 脳の成体神経幹細胞が 好ましい。
脳は、 いずれの動物の脳であってもよいが、 好ましくは哺乳動物、 より好ましく はラット、 マウス、 サル、 ヒトなどの脳をあげることができる。
G S K— 3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩は、神経幹 細胞のニューロン新生促進剤として、 そのまま単独で用いることも可能であるが、 通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。 また、 それら医薬製剤は、 動物 および人に使用されるものである。
本発明の神経幹細胞のニューロン新生促進剤は、活性成分として G S K— 3の活 性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩を単独で、または任意の他の 治療のための有効成分との混合物として含有することができる。それら医薬製剤は、 上記した神経再生薬の製剤と同様の方法により製造することができ、同様の投与方 法により投与することができる。 本発明の神経幹細胞のニューロン新生促進剤は、 in vi troにおいて、神経幹細胞 と接触させ、 該神経細胞を培養することにより、 ニューロンを新生させ、 培養物か ら該ニューロンを採取することを特徴とするニューロンの製造法に用いることが できる。 in vi troで本発明の神経幹細胞のニューロン新生促進剤を用いる場合、 G S K - 3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩を、該物質また は該塩を溶解することができる溶液に溶解して用いることが好ましい。該溶液とし ては、 水、 DMS0などをあげることができる。
5 . 本発明のニューロン新生促進剤の存在下、 神経幹細胞を培養して得られるニュ 一ロン '
本発明のニューロン新生促進剤の存在下、動物の神経幹細胞を培養することによ り、 該神経幹細胞のニューロン新生を積極的に促進させることができる。動物の神 経幹細胞は、 いずれの動物の神経幹細胞であってもよく、 好ましくは哺乳動物、 よ り好ましくはラット、 マウス、 サル、 ヒト由来の神経幹細胞をあげることができ、 神経幹細胞としては、 脳由来の神経幹細胞をあげることができる。 神経幹細胞は、 いずれの週齢、 または年齢の動物由来の細胞でもよいが、 好ましくは成体神経幹細 胞をあげることができる。
動物から成体神経幹細胞を取得する:^法としては、 J. Neurosc inece, 19, 8487 (1999)および Genes S Devel op. , 10, 3129 (1996)記載の方法に準じて、 外科的手 法によって成体動物から脳を摘出して、 脳細胞粗抽出液を調製し、 該粗抽出液から 成体幹細胞を濃縮する方法をあげることができる。
また、 ヒトから成体神経幹細胞を取得する方法としては、 Exper imental Cel l Research, 289, 378 (2003)記載の方法に準じて、 バイオプシ一によって神経疾患 患者の側脳室壁から組織を採取して、 脳細胞粗抽出液を調製し、 該抽出液から成体 幹細胞を濃縮する方法をあげることができる。
本発明のニューロン新生促進剤存在下、 成体神経幹細胞を培養する場合、 1. 8 X 105個/ cm2程度の成体神経幹細胞に対して、 該ニューロン新生促進剤を l OOnmo l/1 〜100 mol/lの濃度で作用させることが好ましい。ただし、 リチウムまたはその薬 理学的に許容される塩は 100 mol/l〜10mmol/l の濃度で作用させることが好まし い。 成体神経幹細胞と本発明のニューロン新生促進剤を接触させ、 37°Cで 5% C O 2雰囲気下、 4〜14 日間、 2 日お.きに全量または部分量培地交換しながら静置培養 することでニューロン新生を促進させることができる。
成体神経幹細胞の培養に用いる培地は、ニューロン新生の促進を妨げない培地で あればいずれの培地でもよいが、 1 %の N2 supplement (Invi trogen社製） を含む DMEMZF12培地 （Invi trogeri社製） などを用いるのが好ましい。
上記の培養により取得されるニューロンは、 培地から回収し、 神経疾患患者の障 害部位へ外科的手法で移植することにより該神経疾患の治療に用いることができ る。 該神経疾患としては、 パーキンソン病、 アルツハイマー病、 ダウン症、 脳血管 障害、 脳卒中、 脊髄損傷、 ハンチントン舞踏病、 多発性硬化症'、 筋萎縮性側索硬化 症、 てんかん、 不安障害、 統合失調症、 うつ病および躁鬱病などをあげることがで きる。
6 . 本発明の神経再生薬の評価法 - 本発明の神経再生薬が、 in vivoにおいてニューロンを再生させ、 神経疾患を治 療することができることは 以下の方法により確認することができる。
上記した本発明の神経再生薬を、 ラットまたはサルなどの実験動物に投与する。 実験動物は、 傷害を有していない健康な動物であってもよいが、 海馬虚血傷害を与 えることによりニューロン新生を効果的に観察することができるので [Cel l , no, 429 (2002) ] , 虚血、 6- hydroxydopamine (6- 0HDA)投与またはカイニン酸投与等の方 法により、 脳に傷害を与えた動物が好ましい。 投与経路としては、 経口、 口腔内、 皮下、 筋肉内、 静脈内または脳室内などへの投与をあげることができる。 投与量、 投与方法としては、 例えば体重 lkg当り lOO ^ g lOing 好ましくは 500 g〜500ng を一日一回ないし数回投与する。 静脈内投与などの非経口投与の場合、体重 lkg当 り 10 g 〜lmg、 好ましくは 100 g〜100ngを一日一回ないし数回投与する。 新生したニューロンは以下の方法により検出することができる。
増殖細胞を標識することができるブロモデォキシゥリジン（BrdU)、または Green Fluorescent Protein (GFP)やべ一夕ガラクトシダ一ゼ等の細胞標識可能な遺伝子を 発現できるレトロウイルスベクターを該物質の最初の投与と同時、投与前または投 与後に該実験動物に投与した後、 該物質を一日一回ないし数回投与して 10〜20 日 間飼育する。 その後、 該実験動物の脳を摘出し、 脳の凍結切片を調製して蛍光顕微 鏡を用いて観察し、 例えば増殖細胞を標識する薬剤として BrdUを用いた場合は、 単位面積当たりの BrdU陽性細胞数および BrdU陽性細胞数に対するニューロンマー カーである Tuj 1陽性細胞数の割合を、 陰性コントロールと比較する。
以上の方法により、本発明の神経再生薬のニューロン新生促進作用および神経疾 患治療効果を評価することができる。
7. 本発明のニューロン新生促進剤の評価法
参考例 2記載の方法で取得できる ANSC-7 細胞を、 1ml の の N2 supplement (Invi trogen社製）と 20 ng/mlの FGF-2 (PeproTech社製）を含む DMEM/F12 培地が入ったポリオル二チンおよびラミニンでコートした 12穴培養ディッシュに 1穴当たり 1.8X105個まき、 ー晚インキュベートする。 培養液を、 FGF2 を含まず 0.5%の胎仔牛血清及び 1%の N2supplementを含む DMEM/F12培地 （Invitrogen社 製。 以下、 分化誘導培地と称する) に全量交換して分化を誘導する。 その際、 PBS (Invi trogen社製）または DMS0で 0.01mmol/l〜5mol/lの範囲で段階的に希釈し た G S K— 3の活性を阻害する物質をそれぞれ 1000分の 1容量添加する。 陰性コ ントロールとして同容量の PBSまたは DMS0を添加する。
培養液を、それぞれの G SK-3の活性を阻害する物質が入った分化誘導培地で 2日おきに交換し、 計 6日間分化誘導後、 15%中性緩衝ホルマリン液（和光純薬ェ 業） に置換し 20分間固定する。その後、 0.3% TritonX-100 (ナカライテスク社製） を含む PBSを用いた 5分間の洗浄を 3回繰り返す。 次に、 PBSで希釈した 10%ャギ 胎児血清（DAK0社製） を用いて細胞を 2時間ブロッキングした後、 1次抗体として PBSで 1000倍希釈したマウス抗 Tujl (|Sチュープリンイソタイプ m) 抗体 （シグ マ アルドリツチ社製) を 4 で 16時間反応させる。 その後、 0.3% TritonX-100 を含む PBSを用いた 5分間の洗浄を 3回繰り返す。
次に、 2次抗体として 1000倍希釈した Alexa Fluor 488コンジユゲートャギ抗マ ウス IgG 抗体 （Molecular Probes 社製） を室温で 2 時間反応さる。 同時に Bisbenzimide H 33342 Fluorochrome, Tr ihydrochloride (Calbiochem社製、 以下 H33342と記す） を終濃度 l g/ml になるように添加し、核を染色する。 PBSに浸し たのち倒立型蛍光顕微鏡（ニコン社製） により観察し、 2.44平方ミリメ一トルあた りの Tujl陽性ニューロン数をカウントする。 以下、本発明のニューロン新生促進剤のニューロン新生促進作用に関する実験例 を示す。
実験例 1 ：塩化リチウムによるニューロン新生促進 （1)
上記 7の方法により、 ANSC-7細胞の分化誘導時に PBSで 0.01， 0.1， 1, 3mol/l になるように溶解した塩化リチウムまたは塩化ナトリウム（いずれもナカライテス ク社製） を培養液の 1000分の 1容量、 ANSC- 7細胞を含有する培地に添加し、 分化 誘導後 6日目のニュ一ロン数を解析した。その結果、 Tujl陽性のニュ一ロン数は終 濃度 0.01, 0.1， 1， 3腿 ol/lの塩ィ匕リチウムでそれぞれ 1.1， 1.3, 1.8, 2.1倍と なり （塩化リチウム 1醒 ol/l以上で有意差あり）、 塩化リチウム濃度に依存して増 加した。 また 3匪 ol/lの塩化リチウムによる H33342陽性の総細胞数は塩化リチウ ムなしのコント口一ルと比較して 1.1倍で有意差がなかった。 以上のことから、 塩 化リチウムは ANSC- 7細胞のニューロン新生促進作用を有することが明らかとなつ た。 また、 ネガティブコントロールである塩化ナトリウムでは Tu]'l陽性のニュー ロン数は終濃度 0.01， 0.1, 1, 3讓 ol/lでそれぞれ 1.0， 1.1， 1.2, 1.2倍で全て 有意差は無く、ニューロン新生数の増加は塩濃度や塩化物イオンによる効果ではな くリチウムの効果であると考えられる。
実験例 2 ：塩化リチウムによるニューロン新生促進 (2)
ANSC-7'細胞に対するニューロン新生促進作用が BDW?および Bd-2の発現誘導に よるものであるかどうかを明らかにするため、 リチウムにより BDNFおよび Bel - 2 の発現が促進されるか否かを半定量的 RT- PCRにより解析した。
ANSC- 7細胞を、 2mlの蘭 N2 supplementと 20 ng/mlの FGF-2を含む DMEM/F12 培地が入つたポリオル二チンとラミニンでコートした 6穴培養ディッシュに、 1穴 あたり 4.5X105個になるように計 7穴まき、 ー晚インキュベートした。 1穴の細胞 から RNeasy mini kit (キアゲン社製）を用いて添付プロトコ一ルに従って全 RNAを 取得した。残り 6穴の培地を分化誘導培地に全量交換して分化を誘導した。そのう ち 2穴には 3mol/lの塩化リチウムを培地の 1000分の 1容量、別の 2穴には lmol/1 の塩化リチウムを培地の 1000分の 1容量添加した。 残り 2穴には同容量の PBSを 添加しコント口一ルとした。
分化誘導開始から 24時間後、 各濃度の塩化リチウムを添加した 1穴ずつから細 胞を採取し、 該細胞から上記と同様の方法により全 RNAを取得し;'残りの細胞から は分化誘導開始から 6日後に全 RNAを取得した。 上記 取得した各 の全 RNA に、 IO I の 5XDNase buffer, 0·5 1 の RNase inhibi tor (40U/ 1), 2.5 Iの RNase-free DNaseldU/^ 1) (以上プロメガ社製） をそれぞれ加え、 滅菌水で総容 量を 50 1 とした。 37°Cで 30分間反応させた後、 フエノール クロロホルム処理 したのちェタノール沈殿した。
DNase処理した各 l gの全 RNA'に 0 g/ lオリゴ（dT) 12-18プライマ一を 1 H 1加え、滅菌水で総容量を とした。65 で 10分間加熱した後氷上で急冷し、 4 1の 5Xsynthesisbuffer (インピトロジェン社製）、 1/xlの' 10腿 oi/1 dNTPmix, 2 1の 0.1mol/lDTT、l lの 200U/ 1 Superscript HRT (インビトロジェン社製） を加え、 421で 50分間反応した。 90でで 5分間加熱した後氷上に 10分間置いた。 次に RNaseH(2U/ l) (インビトロジェン社製）を 1 1加え、 37でで 20分間反応 し、 滅菌水を加えて総容量を 200 1とすることにより cDNAを作製した。
同様に陽性コントロール用としてラッ卜脳の全 RMから cDNAを作成した。 1 il l の該 cDNAに、 2,"1 の ΙΟ, mo 1/1 プライマ一セット、 1 1の DMS0 (ナカライテス ク社製）、 2 1の lOXExTaq buffer、 1.6^1 の dNTPmix, 0. 1の ExTaq (以上、 夕カラバイオ社製）を加え、サ一マルサイクラ一を用いて 94°Cで 1分間処理後、 94 で 1分間 60 で 1分間、 74でで 1分間のサイクルを、 Be卜 2増幅用 PCRで 27サイ クル、 BDNF増幅用 PCRで 35サイクル繰り返し、それぞれの cDNA断片を増幅させた。 Bel- 2 の増幅には配列番号 6および 7で表される塩基配列からなる合成 DNA を、
BDNFの増幅には配列番号 8および 9で表される塩基配列からなる合成 DNAをブラ イマ— ッ卜に用いた。
増幅 DNAは、 1.8% ァガロース (ナカライテスク社製) ゲルで電気泳動し、 ェチ ジゥムブロマイド (ナカライテスク社製) で染色後、 トランスイルミネーター （東 洋紡社製）で検出した。 Bcl-2のバンド強度は分化開始後 24時間目および 6日目と もに塩化リチウムの濃度差により変化しなかった。 BDNFは塩化リチウムの濃度差に 関わらず発現は認められなかった。
. 以上の結果から、 塩化リチウムによるニューロン新生促進活性は、 Bel- 2および BDNFを介した細胞死抑制の結果ではなぐ塩化リチウムは積極的にニューロン新生 を促進することが示唆された。
実験例 3 ：塩化リチウムによるニューロン新生促進 ( 3 )
リチウムによるニューロン新生促進作用がアポト一シス抑制による新生細胞数 の増加によるものであるのか、または積極的にニューロン分化を誘導していること によるものであるのかを明らかにするため、 リチウムによる ANSC-7細胞に対する アポトーシス抑制効果を解析した。
上記 7の方法により、 塩化リチウムを終濃度 3匪 ol/lになるように ANSC- 7細胞 を含有する培地に添加して 6日間培養し、塩化リチウムを添加して培養した ANSC - 7 細胞とコントロールとして PBSを添加して培養した ANSC- 7細胞とを、 i n s i t u細胞 死検出キット、 フルォレセイン (ロシュ ·ダイァグノスティックス社製) を用いて 添付プロトコ一ルどおり該細胞と反応させた。倒立型蛍光顕微鏡 (ニコン社製) を 用いて該細胞を観察し、 2. 44平方ミリメ一トルあたりのアポト一シス細胞数をカウ ントした。
その結果、アポトーシス陽性細胞数は塩化リチウム添加により 1. 0倍となり変化 せず 塩化リチウムは ANSC-7細胞のアポトーシスを抑制しないことが明らかとな つた。 従って、 リチウムによるニュ一ロン新生促進作用は、 積極的なニューロン新 生の促進によるものであることが明らかとなった。
実験例 4：インスリンおよぴフォルスコリンとリチウムとのニューロン新生促進作 用に関する拮抗作用
ニューロン新生促進作用が知られるインスリンおよびフォルスコリンとリチウ ムとのニューロン新生促進作用に関する拮抗作用を解析した。
上記 7の方法により、 ANSC- 7細胞の分化誘導時に、 培地中の濃度が 5 g/m lま たは 25 g/ml になるようにィンスリンを培地に添加するとともに、 各濃度のイン スリンを含む培地に、 終濃度が 0、 1および 3mmol/lになるように塩ィ匕リチウムを 添加し、 6日間分化誘導を行った。
その結果、 3腿 o l/l の塩化リチウムによるニューロン増加率は、 のイン スリン共存時に比べ、 25 g/mlのインスリン共存時で 0. 70倍となり有意に低下し ていた。 よって、 インスリンとリチウムの作用が拮抗することが明らかとなった。 また、 上記と同様の方法にて、 インスリンの代わりに終濃度が 0、 1および 5 ■mo 1/1になるようにフォルスコリンを培地に添加し、 終濃度が 0または 3匪 ol/lの 塩ィ匕リチウム共存時におけるニューロン増加率を算出した。
その結果、塩ィ匕リチウムなしの条件ではフオルスコリンによるニューロン増加率 が 1， 5 D101/1のフオルスコリンでそれぞれ 1.9， 2.2倍であるのに対し、 3mmol/l の塩化リチウム共存時にはそれぞれ 1.2, 1.1倍と加算しなかった。 従って、 塩化 リチウムとフオルスコリンは、ニューロン新生促進作用において拮抗することが明 らかとなつた。
リチウムの標的分子としては、 GSK— 3やイノシ! ^一ル— 1ーリン酸フォスフ ァ夕—ゼゃイノシ卜—ルーポリフォスファターゼが知られており [Nature, 417, 292-295(2002)], また、 インスリンとフオルスコリンは間接的に G S K— 3の活性 を阻害することが知られている [Mol. Cell. Biol., 19, 4989-5000(1999)] 。 リチ ゥム、ィンスリンおよびフオルスコリンのニュ一ロン新生促進作用に関する標的分 子は共通であると考えられることから、 リチウムは G SK- 3の活性を阻害するこ とにより神経幹細胞のニューロン新生を促進していることが示された。
実験例 5： GSK— 3の選択的阻害剤である SB- 216763によるニューロン新生促進 参考例 1記載の方法により合成した G S K— 3の選択的阻害剤として知られる SB - 216763 [Chem. Biol., 7, 793-803(2000)] を、 0.1および 0.33腿 ol/lになるよ うに DMS0に溶解し、 上記 7の方法により、 その 1000分の 3容量を ANSC- 7を含有 する培地に、 ANSC-7細胞分化誘導時に添加し、分化誘導後 6日目のニューロン数を 測定した。
その結果、 Tujl陽性のニューロン数は終濃度 0.3, 1.0 mol/lの SB-216763によ つてそれぞれ 1.2倍、 1.8倍となり濃度依存的に有意に増加した。 ようて、 GSK 一 3を選択的に阻害する活性を持つ化合物によりニューロン新生を促進できるこ とが明らかとなった。
以上より、 GSK— 3を選択的に阻害する活性を持つ物質は、 神経幹細胞のニュ 一ロン新生促進剤になるとともに、 神経の再生治療薬になることが示された。 実験例 6 ： G S K— 3の阻害剤である 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3，2_d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン (Kenpaullone) によるニューロン新生促進 実験例 1に示した方法と同様の方法により、 G S K— 3およびサイクリン依存性 キナーゼ（以下、 CDKと称す）の阻害剤として知られる Kenpaullone[Biochem. J., 371, 199-204(2003)、 CALBI0CHEM社製] を、 0.5、 2および 5mmol/lになるように DMS0に溶解し、 培養液の 1000分の 1容量の該 DMS0溶液を、 ANSC- 7細胞を含有す る培地に添加し、 分化誘導後 6日目の Tujl陽性ニューロン数を解析した。 陰性コ ントロールとして同容量の DMS0を添加した。 また同様に、 CDK阻害剤として知 られ、 G S K— 3はほとんど阻害しない Roscovitine [Biochem. J., 371-, 199-204(2003), シグマアルドリッチ社製]を、 2、 5および 10mmol/lになるように DMS0に溶解し、 培養液の 1000分の 1容量の該 DMS0溶液を、 ANSC- 7細胞を含有す る培地に添加し、 分化誘導後 6日目の Tujl陽性ニューロン数を解析した。
その結果、 Tujl陽性ニューロン数は終濃度 0.5^mol/lの Kenpaulloneで陰性コ ントロールと比較して 1.3倍、 2 xmol/lで 2.7倍、 5^mol/lで 3.7倍となり、 Kenpaulloneの濃度依存的に有意に増加した。一方、終濃度 2 xmol/1の Roscovi t ine で陰性コントロールと比較して 1.0倍、 5 mol/1で 1.2倍、 10. mol/lで 1.1倍で ありそれぞれ有意差は無く、 Roscovitineによる Tujlニューロン数の増加は認め られなかった。 従って、 Kenpaulloneはニューロン新生促進作用を持ち、 その作用 は Kenpau 11 one の CDK阻害活性ではなく GSK— 3阻害活性によるものである ことが明らかとなった。
以上より、 リチウム、 SB- 216763に限らず、 G S K— 3を阻害する活性を持つ化 合物は、神経幹細胞のニューロン新生促進剤になるとともに、神経疾患の再生治療 用医薬になることが示された。
実験例 7 ： GSK— 3 ]3遺伝子高発現によるニューロン新生の抑制
ァルツハイマー病患者の脳内で G SK- 3 βの高発現が認められることから [J. Neuropathol. Exp. Neurol., 56, 70-78 (1997)] 、 アルツハイマー病発症の原因と GSK- 3 ;8の関係を明らかにするため、成体神経幹細胞のニュ一ロン分化に対す る GSK—3 /3高発現の影響を、 レトロウイルスベクタ一を用いて検討した。 まず、 実験例 2に記載したラット脳由来 cDNAを鍀型として、 野生型ラット G SK— 3 遺伝子をコードする cDNAを以下のように調製した。 2.5 xl の铸型 cDNAに、 3 1 の配列番号 10および 1 1からなる 1θ ΐηο1/1 のプライマーセット
(プロリゴ社製）、 5 1の 10XPCR uffer for議 - plus-、 5 1 の 2腿 ol/l dNTPs、 2 1の 25mmol/l MgS04、 1 ^ 1の KOD -plus- DNA polymerase, (以上、 東洋紡績社製） および 31.5 1の滅菌水を加え、サーマルサイクラ—を用いて 94°Cで 2分間保温後、 94°Cで 15秒間、 60Cで 30秒間、 68°Cで 1分 20秒間のサイクルを 25サイクル繰り 返し、 cDNA断片を増幅させた。
一方、 GSK- 3 βのキナーゼ活性を失う変異である 8 5番目のリジン残基がァ ルギニン残基に変異した変異型ラット GSK— 3 β遺伝子 [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92, 8498- 8502(1995)]をコードする c DNAを同様に以下のように調製した。
.5^1の野生型ラット GSK— 3 /3遺伝子をコードする cDNAを铸型として、 配列番号 1 0および 1 2からなるプライマ一セットを用いて '変異型ラット GSK 一 3 ]3の 5 ' 末端側部分長 cDN Aを増幅させ、 配列番号 1 1および 1 3からなる プライマーセットを用いて変異型ラット GSK— 3 i3の 3 '末端側部分長 c D N A を増幅させた。それぞれの部分長 cDN Aの混合物を铸型として、 配列番号 1 0お よび 1 1からなるブライマ一セットを用いて変異型ラット GSK 3 iSの完全長 c DN Aを増幅させた。
野生型および変異型それぞれの増幅反応液をフエノール/クロ口ホルム処理し たのちエタノールを加えて沈殿させ、 QIAquick PCR purification kit (キアゲン 社製) で添付プロトコ一ルに従って精製した。
続いて lO gの pCLNCXプラスミドベクター （IMGENEX社製） に 10 1 の 10XM バッファ一、 5 ιの lidm (夕カラバイオ社製) を加え、 滅菌水を加えて ιοο〃 1 とし、 37 で 12時間反応させた。 反応液をフエノール/クロ口ホルム処理した後 エタノールを加えて DN Aを沈殿させ、 32 lの滅菌水に溶解した。 該 DNA溶液 に 4 1の lOXBlunting buffer, 4 1の K0D DNA polymeraseを加え、 ΊΤ で ϊ分 間反応させ平滑末端化した。反応液をフエノール Ζク口口ホルム処理した後エタノ ールを加えて DNAを沈殿させ、 43 1 の滅菌水に溶解した後、 5 Π の 10X Alkaline Phosphatase bufferおよび 2 1 の Alkaline Phosphatase (以上、 夕力 ラバイオ社製） を加え 65°Cで 30分間反応させた。 反応液をフエノール/クロロホ ルム処理したのちエタノールを加えて DNAを沈殿さ 滅菌水に溶解した。
この切断した pCLNCXプラスミドベクター 3 gに上記で調製した 3 gめ野生型ま たは変異型のラット GSK— 3 ]3遺伝子をコードする c DN Aを混合し滅菌水を 加えて 4 zlとし、 4 1の ligation high (東洋紡績社製） を加え 16°Cで 12時間反 応させた。 これを i DH5o! コンピテントセル （ダカラバイオ社製） にトラン スフォーメ一ションした。定法によりアンピシリン耐性コロニ一を液体 LB培地で 培養し、 Endofree Plasmid Maxi Kit (キアゲン社製） を用いて添付プロトコ一ル に従って pCLNC-GSK3j3プラスミド DNAおよび pCLNC- GSK3 /3 (K85R) プラスミド DNA を調製した。
次に、 以下のとおりウィルスベクタ一を作製し、 ANSC- 7細胞のニューロン分化 に関わる機能を解析した。 まず、 PCLNC-GSK3 ;3、 pCLNC-GSK3 β (K85R) , または陰性 コントロールである pCLNCXプラスミドベクタ一 と、それぞれ pMD.Gプラ スミドベクター DNA (米国ソ一ク研究所より分与） 5 を 2mlの D- MEM high glucose 培地 （インビトロジェン社製） に溶解し、 Transfast transfection reagent (プロ メガ社製）を用いて添付プロトコールに従って、 前日に用意した 293gp細胞 （米国 ソ一ク研究所より分与) にトランスフエクションを行った。
トランスフエクションの 3日後に、培養上清を 0.4511 mのフィルター（Mi 11 ipore 社製）でろ過し-. ウィルスベクターを含む溶液を回収した。該ウィルスベクター溶 液をポリ.ァロマチューブ （日立ェ機製） に移し、 超遠心機 （日立ェ機製） を用いて 50，000Xg、 18°Cで 90分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿しているウィルスを 1%の 2 supplementと 20 ng/mlの FGF-2と 8,"g/uilの臭化へキサジメトリン （シ ダマアルドリッチ社製） を含む DMEM/F12培地に懸濁した。 実験例 1に示した方法 と同様の方法により、 ポリオル二チンおよびラミニンでコ一卜した 12穴培養ディ ッシュに 1穴当たり 1.8 X 105個まいてー晚静置した ANSC- 7細胞から培養上清を除 いて該ウィルス懸濁液を添加し、 37°C、 5¾C02濃度のインキュベータ一中で 2時間 培養して感染させた。続いて培養液を分化誘導培地に全量交換して分化誘導を開始 し、 実験例 1と同様に分化誘導 6日後の Tujl陽性ニ ーロン数を解析した。
その結果、 陰性コントロールである pCLNCXより作製したレトロウイルスを感染 させ分化させた ANSC- 7細胞と比べ、 CLNC-GSK3 ;3 より作製したレトロウイルスを 感染させ GSK— 3 β を高発現させ分化させた細胞では新生ニューロン数が 3 3%有意に減少した。一方、 pCLNC-GSK3]3 (K85R)より作製したレトロウイルスを感 染させキナーゼ活性を持たない GSK— 3 β (K85R)を高発現させ分化させた細胞 では新生ニューロン数が野生型 GSK— 3 β を高発現させた細胞より有意に 3 4%多く、 陰性: άン'トロールである pCLNCXより作製したレトロウイルスを感染さ せ分化させた場合と同程度であった。 ょって03 ー3 ]3 のキナーゼ活性により ニューロン新生が抑制されることが明らかとなった。
従って、 アルツハイマー病は、 GSK— 3 )3 の高発現による標的分子のリン酸 化の促進によってニューロン新生が抑制されることにより脳の自己再生能が抑制 され、発症する可能性が示され、 GSK— 3阻害剤が神経疾患、例えばァルツハイ マ一病の治療薬となり得ることが示された。
実験例 8：会合型ベータアミロイドペプチドによるニューロン新生の抑制と GSK — 3阻害剤による抑制の解除 （ 1 )
ベータアミロイドぺプチド（以下、 A βと称す）は老人斑の主要構成成分であり、 アルツハイマー病の原因であると考えられている物質である [Pro Nat. Acad. Sci.， USA, 98, 11039-11041 (2001)]。 A |S [ 1 - 40] (BI0S0URCE社製） を 0.1% (v/v)トリフルォロ酢酸 (ナカライテスク社製) で lOmg/mlになるように溶解し.. 25 で 1時間保温した後、 PBSで 0.5mg/mlに希釈した。 25°Cで 24時間保温して会 合体を形成させ [J.Biol.Chem., 276, 42027-42034(2001)], 実験例 1に示した方法 と同様の方法により ANSC- 7細胞の分化誘導時に終濃度 0. ling/mlになるように培地 に添加し、 陰性コントロールには同容量の PBSを添加した。 分化誘導 2日後 4日 後にはそれぞれ分化誘導培地のみで全量培地交換し、分化誘導 6日後のニューロン 数を測定した。
その結果、 Tujl陽性ニューロン数は会合型 A /3 の添加により 78%有意に減少 した。 従って、 神経疾患の 1つであるアルツハイマー病は、 会合型 A/3 により二 ュ一ロン新生が抑制されることにより、脳の自己再生能が抑制され、発症する可能 性が示された。
実験例 9：会合型べ一夕アミロイドペプチドによるニューロン新生の抑制と GSK 一 3阻害剤による抑制の解除 （2)
会合型 A ]3 によるニューロン新生の抑制がアポトーシス促進による新生細胞数 の減少によるものであるのか、またはニューロン分化の抑制によるものであるのか を明らかにするため、会合型 A 3の ANSC-7細胞に対するアポトーシス促進効果を 解析した。
実験例 8と同様の方法により、終濃度 O. lmg/mlの会合型 A ]3 を含有する分化誘 導培地により 6日間分化誘導した ANSC- 7細胞とコントロールとして PBSを含有す る分化誘導培地により分化誘導した MSC- 7細胞とを、 in s i tu細胞死検出キット、 フルォレセイン （ロシュ ·ダイァグノスティックス社製） を用いて添付プロトコ一 ルどおり該細胞と皮応させた。倒立型蛍光顕微鏡（ニコン社製） を用いて該細胞を 観察し、 2. 44平方ミリメートルあたりのアポト一シス細胞数をカウントした。 その結果、 アポトーシス陽性細胞数は会合型 A jS 添加により 14%増加したが有 意差は無かったことから、 会合型 A /3 による新生ニューロン数の減少は、 アポト 一シス促進よりもニューロン分化の抑制により主に引き起こされることが明らが となった。
実験例 1 0 :会合型ベータアミロイドペプチドによるニューロン新生の抑制と G S
K一 3阻害剤による抑制の解除 （ 3 )
実験例 8と同様の方法により、終濃度 O. lmg/mlの会合型 A /3 を含有する分化誘 導培地で ANSC- 7細胞を分化誘導する際に、 塩化リチウムを終濃度 3mmol/l、 また は Kenpaul loneを終濃度 2 xmol/lになるように加え、分化誘導 6日後の Tuj l陽性 ニューロン数を解析した。
その結果、 塩化リチウムまたは Kenpaul loneを加えることにより Tuj l陽性二 ユーロン数が、 会合型 A iSのみと比較してそれぞれ 73%、 400%有意に増加した。 従って、 G S K— 3阻害剤は会合型 A 0 によるニューロン新生の抑制を解除する 作用を持つことが明らかとなつた。
以上より、 G S K - 3を選択的に阻害する活性を持つ化合物は、 アルツハイマー 病等の神経疾患の神経再生薬になること、および該化合物は神経幹細胞のニューロ ン新生促進剤になることが示された。
実験例 1 1 ： G S K—3の阻害剤である Indirubin- 3， -monoximeによるニューロ ン新生促進
実験例 1に示した方法と同様の方法により、 G S K— 3の阻害剤として報告され ている Indirubin - 3， -monoxime [J. Biol . Chem. , 276, 251-260 (2001) 、 シグ マアルドリツチ社製] を、 lmmol/1になるように DMS0に溶解し、 培養液の 1000分 の 1容量の該 DMSO溶液を、 ANSC-7細胞を含有する培地に添加し、 分化誘導後 6 日目の Tujl陽性ニューロン数を解析した。陰性コントロールとして同容量の DMS0 を添加した。その結果、 終濃度 l^mol/1の Indirubin- 3' - monoximeの添加条件に おいて、 Tujl陽性ニューロン数は陰性コントロールと比較して 1.4倍に有意に増 加した。 従って、 Indirubin- 3' -monoxime はニューロン新生促進作用を持つこと が明らかとなった。
以上より、 リチウム、 SB - 216763、 Kenpaullone に限らず、 GSK— 3を阻害す る活性を持つ化合物は、神経幹細胞のニューロン新生促進剤になるとともに、神経 疾患の再生治療用医薬になることが示された。 '
実験例 1 2 ： GSK— 3に対する特異的な siRNAによるニューロン新生促進
short interference RNA (siRNA)は遺伝子を特異的にノックダウンする [Nature, 4Π, 494-498 (2001)]。 成体神経幹細胞に発現する G S K— 3を特異的に阻害する ことによりニューロン新生が促進できることをさらに明らかにするため、 GSK- 3 β に対する特異的な化学合成 siRNAを MSC-7細胞に導入し ニューロン新生に 対する効果を検討した。
まず、以下のとおり GSK— 3 β に対する 2種の化学合成 siRNAの ANSC-7細胞 でのノックダウン効果を検討した。 ANSC- 7細胞に対する siRNAの導入は Rat NSC Nucleofector™ Kit (Amaxa社製）を用いて行なった。 1 X 106個の A SC- 7細胞に対 して 1 0pmolの配列番号 14および 1 5からなる 2重鎖 siRNA_Blまたは配列番号 1 6および 1 7からなる 2重鎖 siRNA - B 2 (Dharmacon社製）を添付プロトコ一ルに 従って導入した。 陰性コントロールとして Non-specific Control Duplex IX (47¾ GC Content) siRNA (Dharmacon社製） を導入した。 導入後直ちに 5mlの分化誘導 培地に懸濁し、ポリオル二チンおよびラミニンでコートした 6センチ培養ディッシ ュに播種した。播種 48時間後に細胞を 1 %の Noni de t P_40、 50mMの Tr i s- HC1 (pH7.4)、 50mMの NaCl (以上、ナカライテスク社製）、 10mlあたり一錠の Complete mini, EDTA free (ロシュ ·ダイァグノスティックス社製） を含む水溶液に溶解して回収し、 定 法により SDS- PAGE法で分離したのちウェスタンブロッテイング法で GSK— 3 β 量を検出した。検出には GSK— 3 αおよび /3 を認識する抗 GSK— 3抗体 （シ. ダマ社製） を用いた。 その結果、 2種の GSK— 3 iS に対する siRNAを導入した 細胞は両者とも陰性コントロールと比較して GSK— 3 |8 量が 9割以上減少し、 GSK- 3 α量は変化しなかったため、 それぞれの siRNAは G'SK— 3 j8特異的 にノックダウンできることが明らかになった。
続いてそれら 2種の siRNAを ANSC- 7に導入後、 直ちに 1mlの分化誘導培地が入 つたポリオル二チンおよびラミニンでコートした 12穴培養ディッシュに 1穴当た り 1.8X105個まき、分化を誘導した。実験例 1に示した方法と同様の方法により、 分化誘導後 6日目の Tujl陽性ニュ一ロン数を解析した。 その結果、 Tujl陽性ニュ 一ロン数は siRNA- B1を導入した細胞では'陰性コントロールと比較して 2.5倍に増 加し、 siRNA_B2を導入した細胞では 1.9倍に増加した。 従つ 、 GSK- 3 β に 対する siRNAはニューロン新生促進作用を持つことが明らかとなった。
以上より、 G S K— 3を阻害する活性を持つ化合物および siRNAを含む核酸は、 神経幹細胞のニューロン新生促進剤になるとともに、神経疾患の再生治療用医薬に なることが示された。
参考例 1 ： 3— (2, 4—ジクロロフエニル） —4一 （1一メチルインド一ル—3 一ィル) - 1 H—ピロ一ルー 2, 5—ジオン （SB- 216763) の合成工程 1： 3—イン ドールダリオキシル酸メチルエステルの合成
市販の 3—インドールダリオキシル酸 （9.55 g) を塩化メチレン （300 mL) に 懸濁し、 氷冷下 ォキサリルクロリド (8.8 mL) を加え 20°Cで 20時間攪拌した。 反応液を氷冷し、 メタノール (190 mL) を加えた後、 反応液を 25でで 1時間攪拌 した。 反応液に水および塩化メチレンを加え、 析出した結晶を濾取し、 結晶を塩化 メチレンで洗浄した。 結晶を減圧乾燥し、 3—インド一ルグリオキシル酸メチルェ ステル (7.07 g、 69%) を得た。
工程 2 ： 2— ( 1—メチルインドール一 3—ィル) 一 2—ォキソ酢酸メチルエステ ルの合成
工程 1で得られた 3—インドールダリォキシル酸メチルエステル（5.88 g)を N， N—ジメチルホルムアミド （180 mL) に溶解し、 0°Cで攪拌しながら、 水素化ナト リウム （60%オイル分散、 1.4g) を少量ずつ加えた。 反応混合物を 1時間攪拌した 後、 ヨウ化メチル （1.2 mL) を加え、 20でで 20時間攪拌した。 氷冷水を反応液に 添加した後、 1 mol/L塩酸で pH値を 5に調整した。 析出した結晶を濾取し、 水で 洗浄した。 結晶を減圧乾燥し、 2— （1一メチルインドール— 3—ィル） 一 2—才 キソ酢酸メチルエステル （1.96 g、 33%) を得た。
工程 3 ： 2, 4ージクロロフェニル酢酸アミト'、
市販の 2， 4ージクロロフェニル酢酸 （12.4 g) を塩化メチレン （350 mL) に 溶解し、氷冷下、ォキサリルクロリド（10.6mL) を加え、 20°Cで 20時間攪拌した。 反応液を減圧濃縮し、 得られた残渣を塩ィ匕メチレン （100 mL) に溶解した。 この 溶液を氷冷した 28%アンモニア水溶液（250mL) に滴下し、 塩化メチレンを減圧留 去した。 析出した結晶を濾取し、 水で洗^ :した。 結晶を減圧乾燥し、 2, 4—ジク ロロフェニル酢酸アミド （11.14 g、 90%) を得た。 '
工程 4： SB- 216763の合成
ter卜ブトキシカリウム （0.5 g) をテトラヒドロフラン （35 mL) に溶解し、 氷 冷下、 工程 2で得られた 2— (1—メチルインドール— 3—ィル） 一 2—ォキソ酢 酸メチルエステル （0.4g)、 次いで工程 3で得られた 2, 4ージクロ口フエニル酢 酸アミド （0.3 g) を加え、 同温度で 3時間攪拌した。 水を反応液に添加した後、 酢酸ェチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液、 飽和食塩水で順 次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、 結晶をエタノールで洗浄した。 結 晶を減圧乾燥し、 SB-216763 (390 mg、 70%) を得た。
'H-NMR (CDC13) δ (ppm)： 3.89(s, 3H), 6.41(d, J = 8· 1 Hz, 1H)5 6.80(t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.15ひ， J = 7.1 Hz, 1H), 7.32-7.38 (m, 3H), 7.49(s, 1H), 8.01(s, 1H), 10.94 (s, 1H)元素分析：理論値 (C： 61.5, H: 3.3 N : 7.6)、 測定値 (C： 61.3, H： 3.5、 N： 7.4)
参考例 2 ：ラット脳からの成体神経幹細胞の単離と培養
7週齢の Sprague Daw ley rat をェテール麻酔によって眠らせた後に断頭し、 頭 頂部より頭蓋骨を切開して脳を摘出した。摘出した脳から脳室周囲部位を含む組織 を顕微鏡下で眼科用のはさみとピンセットを用いて分離した。脳室周囲部位を含む 組織は眼科用はさみとメスを用いて lmm3程度の断片にした後、 2.5U/mlのパパイン、 250U/mlの DNase (いずれも Worth'ington, Freehold, NJ社製）、 lu/mlの中性プロ テアーゼ （Dispase： Boehringer Man eim 社製） を含む 5ml の HBSS 緩衝液
(Invitrogen社製） 中で 37°C、 30分間消化反応を行なった。 該反応により得られ た細胞と組織の混合物を 10%の胎仔牛血清（Hyclone社製）を含む DMEM (Invitrogen 社製） で 3回洗浄後、 10%の胎仔牛血清を含む DMEMに溶解し、 107 mのナイロンメ ッシュを用いて未消化物を除去した。
得られた細胞粗抽出液を、 10cmの培養皿上で 10%の胎仔牛血清を含む DMEM/F12 培地 （Invitrogen社製） を用いて 37°Cのインキュベータ一中で 1晚培養した。 翌 日、 培地を 1¾の N2 supplement (Invitrogen社製）と 2 Ong/mlの FGF - 2 (PeproTech 社製） を含む DMEM/F12に置換して培養を開始した。 3日に一度、培地の半分を新し い 1%の N2 supplementと 20 ng/mlの FGF-2を含む DMEM/F12に置換し、 培養を継続 した。 小型細胞の小さなコロニーが形成されたら 1%のトリプジンで 30秒から 1分 間程度処理し、剥がれた細胞を回収した。該細胞は、 lO zg/mlのポリオル二チン（シ ダマ社製） を用いて室温でー晚、および S g/mlのマウス EH S腫瘍由来ラミニン (Becton Dickinson社製） を用いて 37°Cでー晚コートしたマルチ ·ゥエルの培養 皿 (Fisher Scientific社製） 上に撒き、 培養を継続した。 上記培養を続けること で、 小型の突起を有し、 厚みのある小型細胞が濃縮された。 本細胞を成体神経幹細 胞株 ANSC-7として上記の実験に使用した。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1 ：錠剤
常法により、 次の組成からなる錠剤を調製する。
(1) 処方 SB-216763 5mg
乳糖 62mg
馬鈴薯デンプン 30mg
ポリビニルアルコール 2mg
ステアリン酸マグネシウム lmg
lOOmg
(2) Kenpaullone 5mg
乳糖 62mg
馬鈴薯デンプン 30mg ポリビニルアルコール 2mg
ステアリン酸マグネシウム lmg
lOOmg ( 3 ) Indirubin-3 -monoxime 5mg
乳糖 62mg
馬鈴薯デンプン 30mg
ポリビニルアルコール 2mg
ステアリン酸マグネシウム lmg
lOOmg 実施例 2 ：神経幹細胞のニューロン新生促進剤 （ 1 )
常法により、 塩化リチウムを 3ηιο 1/1になるように PBSに溶解し、 塩化リチウム を含む神経幹細胞の二ユーロン新生促進剤を調製した。 実施例 3 ：神経幹細胞のニューロン新生促進剤 ( 2 )
常法により、 SB-216763, Kenpaul loneまたは Indirubin- 3， - monoximeを
0. 1腿 ol/lになるように DMS0に溶解し SB-216763, Kenpaul loneまたは
Indirubin-3' -monoximeを含む神経幹細胞のニューロン新生促進剤を調製した。 . 産業上の利用可能性
本発明によれば、ダリコーゲンシンタ一ゼキナーゼー 3の活性を阻害する物質を有 効成分として含有してなる神経再生薬、該物質を有効成分として含有してなる神経幹 細胞のニューロン新生促進剤、該ニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養 して得られるニューロンおよび該ニューロンの製造方法を提供することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 5—人工配列の説明：合成蛋白質
配列番号 6—人工配列の説明：合成 D NA 配列番号 7—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 8—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 9一人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 10—人工配列の説明：合成 DNA ' 配列番号 11一人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 12—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 13—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 14一人工配列の説明：合成 RN A , 配列番号 15—人工配列の説明：合成 RNA '
配列番号 16—人工配列の説明：合成 RNA
配列番号 17—人工配列の説明：合成 RNA

Claims

請求の範囲
1. グリコーゲンシン夕ーゼキナーゼ— 3 (以下、 G S K— 3と略す） の活性 を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経再生薬。
2. 神経再生薬が、 神経疾患の治療薬である請求項 1記載の医薬。 '
3. 神経疾患が、 パーキンソン病、 アルツハイマー病、 ダウン症、脳血管障害、 脳卒中、 脊髄損傷、 ハンチントン舞踏病、 多発性硬化症、 筋萎縮性側索硬化症、 て んかん、 不安障害、 統合失調症、 うつ病および躁鬱病からなる群より選ばれる神経 疾患である請求項 2記載の医薬。 '
4. G S K— 3の活性を阻害する物質が、 リチウムまたはその薬理学的に許容 される塩である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
5. G S K - 3の活性を阻害する物質が、 ビスィンドリルマレイミド誘導体、 3 —ァリ一ルー 4 _インドリルマレイミド誘導体、ィンドロ力ルバゾ一ル誘導体、ィン ドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン誘導体もしくはィンジルビン誘導体また はそれらの薬理学的に許容される塩である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医 薬。
6. G S K— 3の活性を阻害する物質が、 式（I)
Figure imgf000058_0001
[式中、 nおよび mは同一または異なって、 1〜3の整数を表し、 I 1、 R3および R4は 同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換の低級アルケニル、 - C0R5 (式中、 R6は水素原子、 置換もしくは非置換の低 級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換のァリ一 ルまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す）、 -C00R7 (式中、 R7は水素原 子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァリールまたは置 換もしくは非置換のシクロアルキルを表す） または- OR8 (式中、 R8は水素原子、 置 換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換,もし くは非置換のシクロアルキルを表す） を表し、 R2および R5は同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケ ニル、 置換もしくは非置換の低級アルコキシ、 置換もしくは非置換の低級アルコキ シカルポニル、 置換もしくは非置換のァリール、 カルボキシ、 ハロゲン、 ヒドロキ シ、 ニトロ、 ァミノまたはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、 nおよび m がそれぞれ 2または 3であるとき、 それぞれの R2および R5は同一でも異なってい てもよい] で表される化合物、 式（I I)
Figure imgf000059_0001
(式中、 na、 ma、 R1A、 R2\ R3Aおよび R5Aは、 それぞれ前記 n、 m、 R R2、 R3および R5と同義である） で表される化合物もしくは式 απ)
Figure imgf000059_0002
[式中、 nb、 mb、 RlB、 R2Bおよび R5Bは、 それぞれ前記 n、 m、 R R2および R5と同義 であり、 R3Bおよび R4Bは同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低 級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 -C0R6 (式中、 R6は前記と同義 である）、 -C00R7 (式中、 R7は前記と同義である） または- OR8 (式中、 Rsは前記と同 義である） を表すか、 または R3Bと R4Bがー緒になって、
Figure imgf000059_0003
(式中、 kは 1または 2を表し、 Xは CH2、 冊、 酸素原子または硫黄原子を表し、 はヒドロキシ、力ルポキシ、力ルバモイルまたは低級アルコキシ力ルポニルを表す） を形成する]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である請求 3のいずれか 1項に記載の医薬。
GSK— 3の活性を阻害する物質が、 式（la)
Figure imgf000060_0001
(式中、 R2aは水素原子、 低級 7ルコキシ、 低級アルコキシ力ルポニル、 ァリール またはニトロを表し、 R3aおよび は同一または異なって、 置換もしくは非置換 の低級アルキルを表す）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であ る請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
8. GSK— 3の活性を阻害する物質が、 式（Ila)
Figure imgf000060_0002
(式中、 ma は前記と同義であり、 は置換もしくは非置換の低級アルキルを表 し、 5Aaはハロゲンを表す）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩 である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
9. GSK— 3の活性を阻害する物質が、 式（II la)
Figure imgf000060_0003
(式中、 R9は前記と同義である） で表される化合物またはその薬理学的に許容され る塩である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
10. GSK— 3の活性を阻害する物質が、 3， 4_ビス （1—メチルインドー ルー 3—ィル） — 1H—ピロール— 2, 5—ジオン、 3― (1一メチルインドール 一 3—ィル）— 4— ( 1—プロピルインドール— 3—ィル）一 1 H—ピロール— 2 , 5—ジオン、 3— [1— （3—シァノプロピル）インド一ルー 3—ィル] —4一 （1 一メチルインドール— 3 _ィル） 一 1H—ピロ一ルー 2, 5—ジオン、 3— [1— (3—ァミノプロピル） インドール— 3—ィル] —4一 (1一メチルインド一ルー 3—ィル） 一 1H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン、 3— [1— (3—力ルポキシプロ ピル） インドール— 3—ィル] —4— (1一メチルインドール— 3—ィル） — 1H —ピロ一ル—2， 5—ジオン、 3— [1一 （3—力ルバモイルプロピル） インド一 ル— 3—ィル ]—4一（1—メチルインドールー 3—ィル)— 1H—ピロール— 2， 5—ジオン、 3— [1一 （3—ァミノプロピル）インドール一 3—ィル] 一 4— (1 —メチルー 5 _プロピルォキシインドールー 3—ィル） — 1H—ピロ.一ル— 2, 5 ージオン、 3- [1 - (3—ヒドロキシプロピル) インド一ルー 3—ィル] -4- (1ーメチル— 5 _フエニルインド一ルー 3—ィル) — 1H—ピロ一ルー 2, 5― ジオン、 3 - [1— (3—ァミノプロピル) インドール— 3—ィル] 一 4— (1— メチルー 5—フエニルインドールー 3 Γル) - 1H—ピロ一ル— 2， 5—ジオン、 3— [1一 (3—ヒドロキシプロピル） インドール—3—ィル] -4- (1ーメチ ル— 5—メトキシカルボニルインド一ルー 3—ィル） 一 1H—ピロ一ルー 2， 5一 ジオン、 3 - [1 - (3—ヒドロキシプロピル)インドール一 3—ィル] -4- (1 ーメチルー 5—ニトロインドール— 3一^ Γル）― 1H—ピロ一ル— 2, 5—ジオン、 3— ( 1—メチルインドール— 3—ィル) —4一 [1— (3—ヒドロキシプロピル) - 5一二トロインド一ル— 3—ィル]― 1H—ピロール— 2， 5—ジオン、 3 - (2 一クロ口フエ二ル) 一 4— (1一メチルインド一ルー 3—ィル) - 1H -ピロール -2, 5—ジオン、 3― (2, 4ージクロ口フエニル) -4- (1一メチルインド —ルー 3—ィル） 一 1H—ピロール一 2, 5 _ジオン、 3 - (2—クロ口フエニル) —4一 [ 1一 (3—ヒドロキシプロピル) インドール一 3—^ ίル] - 1 Η—ピロ一 ルー 2, 5ージオン、 4一 [1 - (3—ァミノプロピル) インドール— 3—ィル] - 3 - (2—クロ口フエニル) 一 1H—ピロ一ル一 2， 5—ジオンおよび
Figure imgf000062_0001
からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項
1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
11. G S K— 3を阻害する物質が、 式 （IV)
Figure imgf000062_0002
[式中、 Aは単結合または二重結合によって右に結合されている酸素または硫黄で あり、 R1()は水素原子、 ァリール、 低級脂肪族置換基、 特にアルキルおよび低級アル キルエステルからなる群より選択され、 R"〜R14はアルコキシ ァミノ.， ァシル 脂肪族置換基、 特にアルキル、 アルケニルおよびアルキニル置換基、 脂肪族アルコ ール、特にアルキルアルコール、脂肪族二トリル、特にアルキル二トリル、シァノ、 ニトロ、 カルポキシル、 ハロゲン、 水素原子、 ヒドロキシル、 ィミノならびにひ、 β 不飽和ケトンからなる群より個別に選択され、 R15〜R18は脂肪族置換基、 特にァ ルキル、 アルケニルおよびアルキニル置換基、 特に低級脂肪族置換基、 脂肪族アル コール、 特にアルキルアルコール、 アルコキシ、 ァシル、 シァノ、 ニトロ、 ェポキ シ、 ハロアルキル基、 ハロゲン、 水素原子ならびにヒドロキシルからなる群より個 別に選択され、 R19は脂肪族の基、 特に低級アルキル基、 脂肪族アルコール、 特にァ ルキルアルコール、 カルボン酸、 および水素からなる群より選択される] で表され る化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項 1〜 3のいずれか 1項 に記載の医薬。
12. GSK-3を阻害する物質が、 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズ ァゼピン -6 (5H)-オン、 2-ブロモ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3,2_d] [1]ベンズァゼピ ン- 6(5H)-オン、 .9 -プロ - 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 9-クロロ- 7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 11-クロ口- 7,12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 10-ブロモ -7,12-ジヒドロ-ィンドロ [3，2_d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 8 -ブロモ -6, U-ジヒドロ-チェノ [3',2' :2， 3ァゼピノ [4,5-b]イシド ール- 5(4H)-オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 4-メトキシ-インドロ [3， 2-d] [1]ベン ズァゼピン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 4-ヒドロキシ -ィンドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 7, 12-ジヒドロ- 4-メトキシ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -プロモ- 7, 12-ジヒドロ- 2,3-ジメトキシ -インドロ [3,2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 2,3- ジヒドロキシ -ィンド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ -2， 3-ジメトキシ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン..7, 12-ジヒドロ - 9 -トリフルォロメチル-ィンド口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7, 12-ジ ヒドロ- 2， 3 -ジメトキシ _9_トリフルォロメチル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピ ン- 6 (511)-オン、 2 -プロモ -7, 12-ジヒド口 -9 -トリフルォロメチル-ィンドロ [3,2-d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン， 9-プロモ -7，12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-チオン、 9 -プロモ -5， 12 -ビス- (t-ブチルォキシ 力ルポニル） -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)_オン、 9- プロモ- 12 - (t-ブチルォキシ力ルポニル) -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベン ズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ -5， 7-ビス- (t -プチルォキシカルボ二ル）- 7， 12 - ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロ ΐ - 5， 7, 12- リ -（t-ブチルォキシ力ルポニル) - 7, 12 -ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピ ン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 5-メチルォキシカルボニルメチル-イン ドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 9 -ブロモ -7, 12 -ジヒドロ -12-メチル ォキシ力ルポ二ルメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-プロ モ- 7, 12-ジヒドロ - 12_(2-ヒドロキシェチル） -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 2,9-ジブロモ- 7,12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 8, 10-ジクロロ- 7, 12 -ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 9-シァノ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒド口- 5-メチル -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼ ピン- 6 (5H) -オン、 5-ベンジル- 9-プロモ- 7， 12-ジヒドロ- 5-メチル -ィンドロ
[3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 12-メチル -イン ドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -12-ェチル -7， 12-ジヒドロ- インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン_6 (5H) -才ン、 9 -ブロモ _7， 12-ジヒドロ- 12- (2- プロぺニル) -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン、 7， 12 -ジヒド口 _9 - メチル -インドロ [3，2_d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12ニジヒドロ- 9-メトキ シ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5©-オン、 9-フルォロ -7, 12-ジヒドロ -12- (2-プロぺニル) -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 11 -ブロモ -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -プロモ- 7, 12- ジヒドロ- 2 - (メチルイミノアミン）—インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -ォ ン、 9-プロモ -7, 12-ジヒドロ- 2- (カルボン酸) -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12 -ジヒドロ- 10-ヒドロキシ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズ ァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 11 -ヒドロキシメチル -インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ- 4 -ヒドロキシ-インドロ
[3, 2-d] [1]ペンズァゼピン- 6 (5H) -オン 7, 12-ジヒドロ- 2， 3 -ジヒドロキシ -ィンド 口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 2, 3-ジメトキシ -9-二ト口- 7, 12 -ジヒド 口-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9_シァノ -7, 12-ジヒドロ-イ ンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2， 3 -ジメトキシ -9-シァノ -7, 12-ジ ヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ニトロ 7, 12-ジヒドロ -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 3- (6-ォキソ - 9-トリフルォロメ チル- 5， 6, 7, 12-テトラヒド口-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2-ィル）プロピ ォニトリル、 2 -プロモ- 9-ニトロ- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [l]ベンズァゼピ ン -6 (5H) -オン、 3- (6-ォキソ -9-トリフルォロメチル- 5， 6， 7, 12-テトラヒドロ-ィン ド口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2-ィル）ァクリロ二トリル、 2- (3-ヒドロキシ- 1-プ 口ピエル) -9-トリフルォロメチル -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼ r、
ピン- 6 (5H) -オン、 2-ョード -9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズ ァゼピン- 6 (5H)-オン、 2 -（3-ォキソ -1 -ブテニル) -9-トリフルォロメチル- 7, 12 -テ トラヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 8-クロ口- 6， 1トジヒ ドロ-チエノ [3',2' :2, 3]ァせピノ [4, 5-b]インドール- 5 (4H)-オン、 2_ョード -9 -ト リフルォロメチル- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-ォ ン、 7， 12 -ジヒドロ-ピリド [3',2' :4,5]ピロ口 [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-ォ ン、 1卜メチル -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2- [2- (卜ヒドロキシシクロへキシル）ェチニル] -9-トリフルォロメチル- 7, 12-ジヒ ドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2-シァノ -7， 12-ジヒドロ- ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2-ョード -7， 12-ジヒドロ-ィンド 口 [3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 11-ェチル -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 8-メチル -6， 11 -ジヒドロ-チェノ [3',2' :2， 3]ァゼピノ [4, 5-b]ィンドール - 5 (4H) -オンおよび 3- (6 -ォキソ - 9-トリフ ルォロメチル- 5， 6， 7， 12-テトラヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2 -ィ ル）アクリル酸メチルエステルからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的 に許容される塩である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
13. G S K— 3を阻害する物質が、 9-シァノ- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 2,3-ジメトキシ -インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- (K5H)-オン、 2-プロモ -7， 12-ジヒドロ- 9 -ト リフルォ口メチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒド ロ- 2, 3-ジメトキシ- 9_トリフルォロメチル-ィンドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 2， 9-ジブロモ- 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 7, 12 -ジヒドロ- 9 -トリフルォロメテル-ィンド口 [3, 2-d] [1]ベンズァ ゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -クロ口- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H) -オン、 8_ブロモ -6,11-ジヒドロ-チェノ [3',2' :2, 3]ァゼピノ [4, 5-b]インド —ル- 5(4H)-オン、 7， 12-ジヒドロ- 9-メトキシ-インドロ [3， 2_d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 10-ブロモ -7,12-ジヒドロ-ィンドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H) -オン、 1卜ブロモ -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 1卜クロ口- 7,12-ジヒドロ-ィンドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 9-フルォロ- 7， 12 -ジヒドロ-ィンドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 9-メチル -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9-ブロモ - 7， .12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1Jベンズァゼピン - 6(5H)-チオン、 8, 10-ジクロロ- 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピ ン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ - 12_(2-ヒドロキシェチル） -ィンドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン _6(5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 2,3-ジヒドロキ シ -インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2-ブロモ -7, 12-ジヒドロ-イ ンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ- 2, 3 -ジメトキシ-ィ ンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ _7， 12-ジヒドロ- 12-メチ ル-インドロ [3， 2_d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロ ΐ- 7, 12-ジヒドロ- 5 - メチルォキシカルボ二ルメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン および 7, 12-ジヒド口-ィンド口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オンからなる：群 より選択される、 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の医薬。
14. 9 -シァノ- 7， 12 -ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -プロモ- 7, 12-ジヒド口- 2, 3-ジメトキシ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 2-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 9-トリフルォロメチル -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ-' 2, 3-ジメトキシ -9-トリフ ルォロメチル -ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2,9-ジブロモ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン 7,12-ジヒドロ -9 -トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H)-オン、 9-クロ 口- 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 8_プロモ - 6, 11-ジヒドロ-チェノ [3',2' :2,3]ァゼピノ [4, 5- b]インドール- 5 (4H)-オン、 7， 12-ジヒドロ- 9-メトキシ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オンから なる群より選択される、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
15. 9 -ブロモ -7, 12 -ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン からなる群より選択される、 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の医薬。
16. GSK— 3を阻害する物質が、 式 （V)
Figure imgf000067_0001
[式中、同じか異なってよい R2oおよび R 25は水素原子；ハロゲン,；ヒドロキシ基； メチレンヒドロキシ基；直鎖または分枝鎖の C ^ ds—アルキルまたはアルコキシ またはメチレンアルコキシ基；必要に応じて 1個または複数めヘテロ原子を含む、 3から 7個一炭素原子を有するシク口アルキル基；必要に応じて 1個または複数の ヘテロ原子を有する置換または非置換のァリール、ァラルキルまたはァリ一ルォキ シ基；それぞれ互いに独立に、 直鎖または分枝鎖のアルキル基中に 1から 6個の炭 素原子を有するモノ―、 ジ—またはトリアルキルシリル基；それぞれ互いに独立に 置換または非置換ァリール基を有するモノー、 ジーまたはトリアリールシリル基； トリフルォロメチル基； - C OM； - C O OM；あるいは一 C H2C O〇M基 （こ こで Mは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび Zまたはアミノ基 1個または複数 で置換された直鎖または分枝鎖の C C 18—アルキル基、または必要ならば 1個ま たは複数のへテロ原子を有し、 1個または複数のハロゲン、アルキル基またはアル コキシ基で置換されていてよいァリール基を表す）；— N RSORSI基（ここで同じか 異なって,よい R および Rsiは水素原子、 必要ならば付加的に 1個または複数のヒ ドロキシぉよび/またはァミノ基で置換されている C 〜 C 18直鎖または分枝鎖 7 ルキル基、 置換または非置換で、 必要ならば 1個または複数のへテロ原子を含むァ リール基を表す)；ァシル基；—C H2— N R30R31メチレンアミノ基 （ここで および Rsiは前記の意味を有する）；ベンゼン環が必要ならば 1個または複数のへ テロ原子を有するベンジル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する、 炭素原子 3から 7個を有するメチレンシクロアルキル基；アミドとしての、 窒素原 子に結合した生理的アミノ酸基；グリコシドが単糖または二糖から選択される〇一 グリコシドまたは N—グリコシド；あるいはメチレンスルホネート基を表し；同じ か異なってよい R21、 R22、 R23、 R 24、 R 26、 R27、 R 28および R 29は水素原子； ハロゲン；ヒドロキシ基；ニトロソ基；ニトロ基；アルコキシ基；必要ならば 1個 または複数のヒドロキシおよび Zまたはァミノ基で置換されている直鎖または分 枝鎖の C i dsアルキル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換のァリ一ル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換ァラルキル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換ァリールォキシ基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有す る置換または非置換メチレンァリ一ルォキシ基；必要ならば 1個または複数のへテ 口原子を含む、 3力、ら 7個の炭素原子を有するシク口アルキル基；必要ならば 1個 または複数のへテロ原子を含む、 3から 7個の炭素原子を有す ¾メチレンシクロア ルキル基； トリフルォロメチル基；— C OM；— C O OM；または C H2C O〇M 基 (ここで Mは水素原子、 必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基 1個また は複数で付加的に置換きれた直鎖または分枝鎖の C ^ ds—アルキル基、または必 要ならば 1個または複数のへテロ原子を有し、 1個または複数のハロゲン原子、 ァ ルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいァリール基を表す） ； - N R30 RSi基 （ここで同じか異なってよい R∞および RS1は水素原子、 必要ならば付加的 に 1個または複数のヒドロキシおよび Zまたはァミノ基で置換されている直鎖ま たは分枝鎖 C ^ dsアルキル基、 置換または非置換で、 必要ならば 1個または複 数のへテロ原子を含むァリール基 ァシル基を表すか、 窒素原子が、 必要ならば 1 個または複数のへテロ原子を含む、炭素原子 3から 7個を有するシクロアルキルの 一部を形成する）；一 C O N RSORSI基（ここで RMおよび Rsiは前記の意味を有す る）；ヒドロキシルァミノ基；ホスフェート基；ホスホネート基；スルフェート基； スルホネ一ト基；スルホンアミド基；— S O2N R30R31基 (ここで R 30および R 31 は前記の意味を有する）； _ N = N— R32ァゾ基 （ここで R32は必要ならば 1個ま たは複数のカルポキシル、ホスホリルまたはスルホネ一ト基で置換された芳香族基 あるいはグリコシドが単糖または二糖から選択されている O—グリコシドまたは N—グリコシド基を表す） を表すか； R20および R24ならびに R25および R29はそ れぞれ一緒になつて、 互いに独立に必要ならば置換された 1から 4個の C H2基を 有する環を形成し；同じか異なってよい Yおよび Zは酸素；ィォゥ；セレン；テル ルの原子； N R33基 （ここで R33は水素原子、 必要ならば 1偭または複数の力ルポ キシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された直鎖または分 鎖 C;L〜C18 アルキル基、必要ならば 1個または複数のへテ口原子を含む置換または非置換のァ リール基、 ァラルキル基またはスルホネート基を表す）；あるいは— N〇R33 (ここ で R33基は前記の意味を有する） を表す] で表される化合物またはそれらの薬理学 '的に許容される塩である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
17. GSK- 3を阻害する物質が、ィンジルビン、 5—ョ一ドーインジルビン、 5—ブロモーインジルビン、 5—クロローインジルビン、 5—フルォロ一^ fンジル ビン、 5—メチル—インジルビン、 5—ニトロ一^ f ンジルビン、 5— S03H—ィ ンジルビン、 5'—ブロモーインジルビン、 5— 5，—ジブロモ—インジルビンおよ び 5 '—ブロモ—インジルビン 5—スルホン酸からなる群より選ばれる化合物また はその薬理学的に許容される塩である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の [S薬。
18. GSK— 3を阻害する物質が、 インジルビン— 3，—モノォキシム、 5-3 ード一インジルビン— 3，一モノォキシムおよび 5— S〇3N a—インジルビン一 3，一モノォキシムからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容され る塩である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
19. GSK— 3を阻害する物質が、インジルビン— 3'—モノォキシムまたはそ の薬理学的に許容される塩である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
20. GSK-3の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経幹細 胞のニューロン新生促進剤。
21. GSK-3の活性を阻害する物質が、 リチウムまたはその薬理学的に許容 される塩である請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
22. GSK— 3の活性を阻害する物質が、 ビスインドリルマレイミド誘導体、 3 ーァリール一 4—インドリルマレイミド誘導体、ィンドロ力ルバゾ一ル誘導体もしく はインドロ [3， 2d- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)一オン誘導体またはそれらの薬理学的 に許容される塩である請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
23. 'GSK— 3の活性を阻害する物質が、 式（I)
Figure imgf000070_0001
[式中、 nおよび mは同一または異なって、 1〜3の整数を表し、 R R3および R4は 同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換の低級アルケニル、 -C0R6 (式中、 R6は水素原子、 置換もしくは非置換の低 級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換のァリ一 ルまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)、 -C00R7 (式中、 R7は水素原 子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非 S換のァリールまたは置 換もしくは非置換のシクロアルキルを表す） または- OR8 (式中、 R8は水素原子、 置 換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もし くは非置換のシクロアルキルを表す） を表し、 R2および R5は同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケ ニル、 置換もしくは非置換の低級アルコキシ、 置換もしくは非置換の低級アルコキ シカルボニル、 置換もしくは非置換のァリール、 力ルポキシ、 ハロゲン、 ヒドロキ シ、 ニトロ ァミノまたはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し nおよび m がそれぞれ 1または 3であるとき、 それぞれの R2および R5は同一でも異なってい てもよい] で表される化合物、 式（I I)
Figure imgf000070_0002
(式中、 na、 ma、 R1A、 R2A、 R3Aおよび R5Aは、 それぞれ前記 n、 m、 R R2、 R3および R5と同義である） で表される化合物もしくは式（I I I)
Figure imgf000071_0001
[式中、 nb、 mb、 R1B、 R2Bおよび R5Bは、 それぞれ前記 n、 m、 R R2および R5と同義 であり、 R3Bおよび R4Bは同一または異なって、 水素原子、 置換もしくは非置換の低 級アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 -C0R6 (式中、 R6は前記と同義 である）、 -C00R7 (式中、 R7は前記と同義である） または- OR8 (式中、 R8は前記と同 義である） を表すか、 または R3Bと R4Bが一緒になつて、
Figure imgf000071_0002
(式中、 kは 1または 2を表し、 Xは CH2、 冊、 酸素原子または硫黄原子を表し、 R9 はヒドロキシ、力ルポキシ 力ルバモイルまたは低級アルコキシカルボニルを表す) を形成する]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である請求 項 2 0記載のニューロン新生促進剤。
24. G S K— 3の活性を阻害する物質が、 式（la)
Figure imgf000071_0003
(式中、 R2aは水素原子、 低級アルコキシ、 低級アルコキシ力ルポニル、 ァリール またはニトロを表し、 RSaおよび 11 は同一または異なって、 置換もしくは非置換 の低級アルキルを表す）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であ る請求項 2 0記載のニューロン新生促進剤。
25. G S K— 3の活性を阻害する物質が、 式（I la)
Figure imgf000072_0001
(式中、 ma 'は前記と同義であり、 R3Aaは置換もしくは非置換の低級アルキルを表 し、 RSAaはハロゲンを表す）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩 である請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
26. GSK— 3の活性を阻害する物質が、 式（Ilia)
Figure imgf000072_0002
(式中、 R9は前記と同義である） で表される化合物またはその薬理学的に許容され る塩である請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
27. GSK- 3の活性を阻害する物質が、 3, 4一ビス (1 _メチルインドー ル _ 3 _ィル） _ 1H—ピロ一ルー 2， 5—ジオン、 3 - (1 _メチルインドール 一 3—ィル）— 4一（1—プロピルインドール— 3—ィル）― 1 H—ピロ一ルー 2 , 5 _ジオン、 3- [1 - (3—シァノプロピル)インドール— 3—ィル] — 4一 （1 ーメチルインドール一 3—ィル) 一 1H—ピロール— 2， 5ージオン、 3 - [1 - (3—ァミノプロピル) インドール— 3—ィル] 一 4— (1—メチルインド一ルー 3一ィル) 一 1 H—ピロール— 2， 5ージオン、 3 - [ 1 - (3 _カルポキシプロ ピル） インドール _ 3 _ィル] 一 4一 （1一メチルインドール— 3—ィル） —1H ーピロール— 2， 5—ジオン、 3 - [1— (3 _力ルバモイルプロピル) インド一 ルー 3—ィル]— 4一（ 1ーメチルインド一ルー 3—ィル) - 1H—ピロ一ルー 2 , 5—ジオン、 3— [1— (3—ァミノプロピル）インドール— 3—ィル] 一 4— (1 —メチル—5—プロピルォキシインドールー 3—ィル） 一 1H—ピロール— 2, 5 ージオン、 3— [1— (3—ヒドロキシプロピル） インド一ルー 3—ィル] 一 4— (1—メチル— 5—フエニルインドール— 3—ィル） 一 1H—ピロール— 2， 5 - ジオン、 3 [1一 （3—ァミノプロピル） インドールー 3—ィル] 一 4— (1— メチルー 5—フエニルインドール— 3—ィル）一 1H—ピロ一ルー 2 5—ジオン、 3— [1— (3—ヒドロキシプロピル） インドールー 3—ィル] —4一 （1—メチ ルー 5—メトキシカルポニルインドール— 3—ィル） — 1H—ピロ一ルー 2, 5- ジオン、 3 - [ 1— (3—ヒドロキシプロピル)インドールー 3—ィル] 一 4一 （1 —メチルー 5—二トロインドール— 3—ィル)一 1H—ピロ一ル— 2 5ージオン、 3一 (1一メチルインドール— 3—ィル) —4— [1— (3—ヒドロキシプロピル) —5—二トロインド一ルー 3—ィル]一 1H—ピロール— 2, 5—ジオン、 3—（2 —クロ口フエニル） -4- (1一メチルインドールー 3—ィル) ― 1H—ピロ一ル -2, 5—ジオン、 3― (2, 4ージクロ口フエニル) -4- (1—メチルインド ール _ 3—ィル） 一 1 H—ピロ一ルー 2, 5—ジオン、 3 - (2—クロ口フエニル) —4一 [1— (3—ヒドロキシプロピル) インド一ルー 3—ィル] — 1H -ピロ一 ルー 2, 5 _ジオン、 4— [1— (3—ァミノプロピル) インドール— 3—ィル] - 3 - (2—クロ口フエニル） 一 1H—ピロ一ル— 2 5—ジオンおよび
Figure imgf000073_0001
からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
28. GSK- 3を阻害する物質が、 式 (IV)
Figure imgf000073_0002
(IV) [式中、 Aは単結合または二重結合によって右に結合されている酸素または硫黄で あり、 R1Qは水素原子、 ァリール、 低級脂肪族置換基、 特にアルキルおよび低級アル キルエステルからなる群より選択され、 R11〜！"はアルコキシ、 ァミノ、 ァシル、 脂肪族置換基、 特にアルキル、 アルケニルおよびアルキニル置換基、 脂肪族アルコ ール、特にアルキルアルコール、脂肪族二トリル、特にアルキル二トリル、シァノ、 ニトロ、 カルボキシル、 ハロゲン、 本素原子、 ヒドロキシル、 ィミノならびにひ、 β 不飽和ケトンからなる群より個別に選択され、 R15〜R18は脂肪族置換基、 特にァ ルキル、 アルケニルおよびアルキニル置換基、 特に低級脂肪族置換基、 脂肪族アル コール、 特にアルキルアルコール、 アルコキシ、 ァシル、 シアン、 ニトロ、 ェポキ シ、 ハロアルキル基、 ハロゲン、 水素原子ならびにヒドロキシルからなる群より個 別に選択され、 R19は脂肪族の基、 特に低級アルキル基、 脂肪族アルコール、 特にァ ルキルアルコール、 カルボン酸、 および水素からなる群より選択される] で表され る化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項 2 0記載のニューロン 新生促進剤。
29. 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3J- d] [l]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2 -プロ モ- 7, 12-ジヒドロ -ィンドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-クロ口- 7, 12- ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン 1卜クロ口- 7, 12-ジヒ ドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 10-プロモ- 7, 12-ジヒドロ- インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 8 -プロモ- 6, 1 ジヒドロ -チエノ [3' , 2' : 2， 3ァゼピノ [4， 5- b]インド一ル- 5 (4H) -オン、 9-ブロモ -7, 12 -ジヒドロ- 4_ メトキシ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒド ロ- 4-ヒドロキシ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7， 12-ジヒドロ - 4 -メトキシ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジ ヒドロ- 2, 3-ジメトキシ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9 -プロ モ- 7, 12-ジヒドロ- 2, 3-ジヒドロキシ -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) - オン、 7, 12-ジヒドロ- 2， 3-ジメトキシ-インドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン _6 (5H) - オン、 7, 12 -ジヒドロ- 9-トリフルォロメチル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン
,
- 6 (5H) -オン、 7， 12-ジヒドロ- 2， 3-ジメトキシ- 9-トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 2-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 9-トリフルォロ メチル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒド:口 -ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -チオン、 9 -ブロモ- 5， 12-ビス-（卜プチ ルォキシカルボ二ル) - 7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) _ オン、 9-ブロモ -12- (t-ブチルォキシ力ルポ二ル）- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -5, 7-ビス-（t -プチルォキシカル ボニル ) -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 9 -プロ モ- 5，7，12-トリ -（t_ブチルォキシカルボ二ル）- 7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒ ロ- 5-メチルォキシ 力ルポ二ルメチル-ィンドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12 -ジヒドロ- 12-メチルォキシ力ルポ二ルメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァ ゼピン， 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12 -ジヒドロ- 12- (2-ヒド口キシェチル） -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 2, 9 -ジブ口モ- 7, 12 -ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 8, 10 -ジクロ口- 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H) -オン、 9-シァノ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -プロモ- 7， 12-ジヒドロ- 5-メチル -イン ド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 5-ベンジル -9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ - 5 -メチル -ィンドロ [3, 2-d] [1]ペンズァゼピン- 6 (5H) -オン 9_ブロモ -7, 12-ジヒ ド口- 12 -メチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-プロモ- 12-X チル -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 9_プロモ -7, 12-ジヒドロ- 12- (2 -プロべニル） -ィンドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) - オン、 7, 12-ジヒド口- 9-メチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 7, 12-ジヒドロ- 9-メトキシ-インドロ [3, 2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-フ ルォロ _7， 12 -ジヒドロ -12- (2-プロぺニル）-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6 (5H) -オン、 1卜ブロモ -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H)-オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 2- (メチルイミノアミン）-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7, 12-ジヒドロ- 2- (カルボン 酸）-ィンドロ [3, 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ -10-ヒドロキシ -インドロ [3, 2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 9-ブロモ _7， 12- ジヒドロ- U-ヒドロキシメチル -インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7, 12-ジヒドロ- 4-ヒドロキシ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 7， 12-ジヒドロ- 2, 3 -ジヒドロキシ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-ォ ン、 2,3-ジメトキシ- 9-ニトロ- 7,12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 9-シァノ - 7,12-ジヒドロ-インドロ [3，2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 2, 3-ジメトキシ- 9-シァノ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベン ズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-二ト口- 7, 12-ジヒド口-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼ ピン- 6 (5H) -オン、 3- (6 -ォキソ- 9-トリフルォ口メチル- 5， 6, 7, 12-テトラヒドロ-イ ンドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 2-ィル）プロピオ二トリル、 '2-ブロモ -9-ニトロ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン _6(5H)-オン、 3- (6-ォキソ _9 - トリフルォロメチル- 5， 6, 7, 12-テ卜ラヒド口-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 2 -ィル）アクリロニトリル、 2- (3-ヒドロキシ-卜プロピニル) -9-トリフルォロメ チル- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3,2 - d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2 -ョード -9 -プロモ- 7， 12 -ジヒドロ-インド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2- (3 - ォキソ -1-ブテニル） -9-トリフルォロメチル- 7， 12-テトラヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 8 -ク口口- 6,1 ジヒド口-チェノ
[3' , 2' :2， 3]ァゼピノ [4， 5- b]インドール- 5 (4H)-オン、 2 -ョード -9-トリフルォロメ チル -7312-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ペンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7, 12-ジヒ ドロ-ピリド [3',2' :4, 5]ピロ口 [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン 11 -メチル -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 2 - [2_ (トヒドロ キシシクロへキシル）ェチニル] -9-トリフルォロメチル -7, 12 -ジヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2 -シァノ -7， 12 -ジヒドロ-ィンドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2-3-ド- 7， 12-ジヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 11-ェチル -7, 12-ジヒドロ-ィンドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 8-メチル -6, 11-ジヒドロ-チェノ
[3',2' :2, 3]ァゼピノ [4, 5-b]ィンドール - 5 (4H)-オンおよび 3- (6-ォキソ - 9-トリフ ルォ口メチル- 5， 6, 7， 12-テトラヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 2 -ィ ル）アクリル酸メチルエステルからなる群より選択される、 請求項 20記載のニュ 一ロン新生促進剤。
30. 9-シァノ -7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ- 7, 12-ジヒドロ- 2, 3-ジメトキシ -インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 2-ブロモ- 7,12-ジヒドロ- 9-トリフルォロメチル-ィンドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7,12-ジヒドロ- 2， 3-ジメトキシ- 9-トリフ ルォロメチル-インドロ [3，2_d][l]ベンズァゼピン - 6(5H)-オン、 2, 9-ジブロモ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -ォン、 7， 12-ジヒドロ -9 -トリフルォロメチル-ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-ク口 ロ- 7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1 ]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 8 -プロモ - 6， 11 -ジヒドロ-チエノ [3',2' :2, 3]ァゼピノ [4, 5-b]インドール-.5 (4H)-オン、 7, 12-ジヒドロ- 9-メトキシ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 10- ブ口モ- 7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オン、 1卜プロ モ- 7， 12-ジヒド口-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン -6 (5H)-オン、 1卜クロ口 - 7, 12-ジヒドロ-ィンド口 [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-フルォロ -7, 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン..9-メチル -7， 12- ジヒドロ-インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ- 7， 12-ジヒド ロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-チオン、 8， 10 -ジク口口- 7， 12 -ジヒ ドロ—インドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ - 12 -（2 -ヒドロキシェチル) -インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 9 -ブ ロモ- 7, 12-ジヒドロ- 2, 3-ジヒドロキシ -ィンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 2-ブロモ -7,12-ジヒドロ-インドロ [3，2_d][l]ベンズァゼピン - 6(5H) -オン、 7， 12-ジヒドロ- 2， 3-ジメ卜キシ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン - 6(5H) -オン、 9 -プロモ -7, 12-ジヒドロ -12-メチル -インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼ ピン _6(5H)-オン、 9-ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 5-メチルォキシ力ルポ二ルメチル-ィ ンドロ [3， 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H) -オンおよび 7, 12-ジヒドロ-インドロ
[3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オンからなる群より選択される、 請求項 20記 載のニューロン新生促進剤。
31. 9-シァノ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9 -ブロモ -7， 12-ジヒドロ- 2,3-ジメトキシ-ィンドロ [3，2_d] [1]ベンズァゼピン -6(5H)-オン、 2-ブロモ - 7，12-ジヒドロ- 9-トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 7,12-ジヒドロ- 2， 3 -ジメトキシ- 9-トリフ ルォロメチル -ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 2, 9-ジブロモ -7,12-ジヒドロ-インドロ [3， 2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 7,12-ジヒドロ - 9_トリフルォロメチル-ィンドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン、 9-クロ ロ- 7， 12-ジヒドロ-ィンドロ [3，2- d] [1]ベンズァゼピン- 6(5H)-オン、 8-ブロモ -6,1卜ジヒドロ-チェノ [3',2' :2, 3]ァゼピノ [4， 5-b]インドール- 5(4H)-オン、 7,12-ジヒドロ- 9-メトキシ-インドロ [3,2- d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オンから なる群より選択される、 請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
32. 9_ブロモ -7， 12-ジヒドロ-インドロ [3, 2-d] [1]ベンズァゼピン- 6 (5H)-オン からなる群より選択される、 請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
33. G S K— 3を阻害する物質が、 式 (V)
Figure imgf000078_0001
[式中 同じか異なってよい R2oおよび R25は水素原子；ハロゲン；ヒドロキシ基； メチレンヒドロキシ基；直鎖または分枝鎖の C〜 'C 18—アルキルまたはアルコキシ またはメチレンアルコキシ基；必要に応じて 1個または複数のへテロ原子を含む、 3から 7個一炭素原子を有するシク口アルキル基；必要に応じて 1個または複数の ヘテロ原子を有する置換または非置換のァリ一ル、ァラルキルまたはァリ一ルォキ シ基；それぞれ互いに独立に、 直鎖または分枝鎖のアルキル基中に 1から 6個の炭 素原子を有するモノー、 ジ—またはトリアルキルシリル基；それぞれ互いに独立に 置換または非置換ァリ一ル基を有するモノ一、 ジーまたはトリァリールシリル基； トリフルォロメチル基；— COM；— COOM；あるいは一 CH2COOM基 （こ こで Mは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび Zまたはアミノ基 1個または複数 で置換された直鎖または分枝鎖の (^〜( —アルキル基、または必要ならば 1個ま たは複数のへテロ原子を有し、 1個または複数のハロゲン、 アルキル基またはアル コキシ基で置換されていてよいァリール基を表す）；— N RsoRai基（ここで同じか 異なってよい Rsoおよび Rsiは水素原子、 必要ならば付加的に 1個または複数のヒ ドロキシおよび Zまたはァミノ基で置換されている。 〜じ 直鎖または分枝鎖ァ ルキル基、 置換または非置換で、 必要ならば 1個または複数のへテロ原子を含むァ リール基を表す） ；ァシル基；一 C H2— N R30R31メチレンアミノ基 （ここで R 30 および Raiは前記の意味を有する） ；ベンゼン環が必要ならば 1個または複数のへ テロ原子を有するベンジル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する、 炭素原子 3から 7個を有するメチレンシクロアルキル基；アミドとしての、 窒素原 子に結合した生理的アミノ酸基；グリコシドが単糖または二糖から選択される〇一 グリコシドまたは N—グリコシド；あるいはメチレンスルホネ一ト基を表し；同じ か異なってよい R21、 R22、 R23、 R24、 R26、 R27、 R 28および R 29は水素原子； ハロゲン；ヒドロキシ基；ニトロソ基；ニトロ基；アルコキシ基；必要ならば 1個 または複数のヒドロキシおよび Zまたはァミノ基で置換されている直鎖または分 枝鎖の (^〜（ 18アルキル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換のァリ一ル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換ァラルキル基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有する置 換または非置換ァリールォキシ基；必要ならば 1個または複数のへテロ原子を有す る置換または非置換メチレンァリ一ルォキシ基；必要ならば 1個または複数のへテ 口原子を含む、 3から 7個の炭素原子を有するシク口アルキル基；必要ならば 1個 または複数のへテロ原子を含む、 3から 7個の炭素原子を有するメチレンシクロア ルキル基； トリフルォロメチル基； - C OM； - C O OM；または C H2C O OM 基 (ここで Mは水素原子、 必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基 1個また は複数で付加的に置換された直鎖または分枝鎖の C ^ ds—アルキル基、または必 要ならば 1個または複数のへテロ原子を有し、 1個または複数のハロゲン原子、 ァ ルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいァリール基を表す）； 一 N Rso Rsi基 （ここで同じか異なってよい Rsoおよび Rsiは水素原子、 必要ならば付加的 に 1個または複数のヒドロキシおよび Zまたはァミノ基で置換されている直鎖ま たは分枝鎖 (^〜(：^アルキル基、 置換または非置換で、 必要ならば 1個または複 数のへテロ原子を含むァリール基、 ァシル基を表すか、 窒素原子が、 必要ならば 1 個または複数のへテロ原子を含む、炭素原子 3から 7個を有するシクロアルキルの 一部を形成する）；一 CONRSORSI基（ここで Rsoおよび Rsiは前記の意味を有す る）；ヒドロキシルァミノ基；ホスフエ一ト基；ホスホネート基；スルフエ一ト基； スルホネート基；スルホンアミド基；— SO2NR30R31基 （ここで R30および R31 は前記の意味を有する）； -N = N-R32ァゾ基 （ここで R32は必要ならば 1個ま たは複数のカルポキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された芳香族基, あるいはグリコシドが単糖または二糖から選択されている O—グリコシドまたは
N—グリコシド基を表す） を表すか； R20および R24ならびに R25および R29はそ れぞれ一緒になって、 互いに独立に必要ならば置換された 1がら 4個の CH2基を 有する環を形成し；同じか異なってよい Yおよび Zは酸素；ィォゥ；セレン；テル ルの原子； NR33基 (ここで R33は水素原子、 必要ならば 1個または複数のカルボ キシル、ホスホリルまたはスルホネ一ト基で置換された直鎖または分枝鎖 (^〜(： アルキル基、必要ならば 1個または複数のへテロ原子を含む置換または非置換のァ リール基 ァラルキル基またはスルホネート基を表す）；あるいは一 NOR33 (ここ で R33基は前記の意味を有する） を表す] で表される化合物またはそれらの薬理学 的に許容される塩である請求項 20記載のニュ一ロン新生促進剤。
34. GSK- 3を阻害する物質が、インジルビン、 5—ョ一ドーインジルビン、 5—プロモーインジルビン、 5—クロローインジルビン、 5—フルォロ ίンジル ビン、 5—メチルーィンジルビン、 5—ニトロ—インジルビン、 5 - S〇3H—ィ ンジルビン、 5'—ブロモ—ィンジルビン、 5一 5'—ジブ口モーィンジルビンおよ び 5'—プロモーインジルビン 5—スルホン酸からなる群より選ばれる化合物また はその薬理学的に午容される塩である請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
35. GSK— 3を阻害する物質が、 インジルビン— 3，—モノォキシム、 5-3 一ドーィンジルビン一 3，_モノォキシムおよび 5— S03N a—ィンジルビン一 3 '—モノォキシムからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容され る塩である請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
36. GSK— 3を阻害する物質が、インジルビン— 3'—モノォキシムまたはそ の薬理学的に許容される塩である請求項 20記載のニューロン新生促進剤。
37. 請求項 20〜36のいずれか 1項に記載のニューロン新生促進剤の存在下、 神経幹細胞を培養して得られるニューロン。
38. 請求項 20〜36のいずれか 1項に記載のニュ一ロン新生促進剤の存在下、 神経幹細胞を培養してニューロンを新生させ、培養物中よりニューロンを採取する ことを特徴とするニューロンの製造方法。
39. GSK— 3を阻害する物質を投与することを特徴とする神経再生方法。
40. 神経再生薬の製造のための GSK— 3を阻害する物質の使用。
41. 神経幹細胞のニューロン新生促進剤の製造のための GSK— 3を阻害する 物質の使用。
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