WO2004058984A1 - 糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖ならびにそれらの製造法 - Google Patents

糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖ならびにそれらの製造法 Download PDF

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WO2004058984A1
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asparagine
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sugar chain
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4glcnac
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PCT/JP2003/016523
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Yasuhiro Kajihara
Kazuaki Kakehi
Kazuhiro Fukae
Original Assignee
Otsuka Chemical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof

Definitions

  • Asparagine sugar chain derivative asparagine sugar chain and sugar chain, and methods for producing them
  • the present invention relates to a sugar chain asparagine derivative, sugar chain asparagine and sugar chain, and a method for producing them.
  • the present invention also relates to a sugar chain asparagine derivative containing fucose and a method for producing the same.
  • Sugar chains are monosaccharide sequences, bonding styles, sites, chain lengths, branching styles, and overall higher-order structure. Due to its diversity, it is a very complex structure compared to the structure of nucleic acids and proteins. Therefore, the biological information derived from its structure is more diverse than nucleic acids and proteins. Despite the recognition of the importance of research on sugar chains, the progress of research is slower than that of nucleic acids and proteins due to the complexity and diversity of their structures. As described above, most of the proteins existing on the cell membrane surface, serum, and the like have sugar chains attached thereto. Molecules in which sugar chains are covalently linked to proteins are called glycoproteins, and can be divided into two groups based on the difference in the binding between sugar and protein.
  • One is an asparagine-linked sugar chain (N-glycoside-linked type) in which a sugar chain is linked to an amino group in the side chain of asparagine (A sn).
  • the other is a mucin-linked sugar chain in which a sugar chain is linked to the alcohol of serine (Ser) and threonine (T hr) ( ⁇ -glycoside-linked).
  • All asparagine-linked sugar chains have a basic skeleton consisting of five sugar residues and are classified into high-mannose, complex, and hybrid subgroups depending on the type of sugar residue at the non-reducing end of the sugar chain to be linked. Is done.
  • mucin-linked sugar chains are classified into four groups based on differences in the basic skeleton (core).
  • sugar chains are important compounds, but there is a shortage of absolute sugar chains.
  • As a means for obtaining a sugar chain there is a method of releasing only a sugar chain from a glycoprotein existing in a living body.
  • it is difficult to cut out a large amount of sugar chains from glycoproteins and there are many sugar chains with very similar structures in living organisms, and it is difficult to obtain only a single sugar chain in large quantities.
  • An object of the present invention is to provide a novel asparagine sugar chain derivative containing at least one or more sialic acids or sialic acid derivatives at the non-reducing end, and a method for producing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a novel asparagine sugar chain containing at least one or more sialic acid or a sialic acid derivative at a non-reducing end, and a method for producing the same.
  • Another object of the present invention is to provide at least one or more sialic acids or the induction of sialic acids. It is an object of the present invention to provide a novel sugar chain containing a compound at the non-reducing end and a method for producing the same.
  • the present invention relates to the following inventions.
  • R 2 is a group represented by the formula (2)
  • R x is a group represented by the following formula (7). :].
  • the present inventor has previously disclosed in Japanese Patent Application No. 2001-185685 (hereinafter referred to as the prior application) various kinds of isolated asparagine-linked oligosaccharide derivatives which can be obtained much more easily and in large amounts than in the past.
  • Asparagine-linked oligosaccharides, asparagine-linked oligosaccharides, a method for producing sugar chains, and novel asparagine-linked asparagine derivatives, asparagine-linked oligosaccharides, and sugar chains having sugar chains with arbitrarily deleted sugar residues have been developed.
  • a method for producing a sugar chain asparagine derivative derived from sugar chain asparagine A method for producing a sugar chain asparagine derivative derived from sugar chain asparagine,
  • step (a) Introduces an Fmoc group into a asparagine containing one or more asparagine having a sialic acid residue at a non-reducing end, and introduces a benzyl group into the sialic acid residue.
  • the method of producing a sugar chain asparagine derivative according to any one of the above (1) to (3) which comprises introducing the sugar chain asparagine derivative mixture.
  • step (b ′) a step of hydrolyzing the asparagine derivative isolated in step (b) using a sugar hydrolase, and / or
  • the mixture containing one or more kinds of asparagine sugar chains contains a compound of the following formula (A) and / or a compound in which one or more sugar residues are deleted from the compound.
  • A the formula for producing the glycan asparagine according to (7) Law
  • step (10) In the step (a), an Fmoc group is introduced into the sugar chain asparagine contained in a mixture containing one or more kinds of sugar chain asparagine having a sialic acid residue at a non-reducing terminal; and
  • the method for producing the asparagine derivative of the glycan of the prior application is, for example, asparagine glycan derived from a natural glycoprotein, preferably asparagine obtained from an asparagine-linked glycan.
  • Asparagine sugar chain refers to a sugar chain to which asparagine is bound.
  • Asparagine-linked sugar chain refers to a group of sugar chains in which N-acetyldarcosamine present at the reducing end is linked to an N-glycosidic acid amino group of asparagine (As n) in a protein polypeptide.
  • G1cNac refers to a group of sugar chains having a mother nucleus.
  • the “sugar chain asparagine derivative” refers to a sugar chain asparagine in which a fat-soluble protecting group is bonded to an asparagine residue.
  • a c HN represents an acetoamide group.
  • a sugar chain derived from a natural glycoprotein is a mixture of sugar chains in which sugar residues at non-reducing terminals are randomly deleted.
  • the present inventors surprisingly introduced a fat-soluble protecting group into a sugar chain derived from a natural glycoprotein, specifically, the sugar chain asparagine contained in a mixture of sugar chains asparagine, whereby It has been found that a mixture of asparagine derivatives having a protective group introduced therein can be easily separated into individual asparagine derivatives using a known chromatography technique. As a result, it has become possible to prepare large amounts of asparagine-linked sugar chains having various structures.
  • sugar chain asparagine derivatives having similar structures, which were conventionally difficult to separate, and each of these compounds can be prepared easily and in large quantities.
  • various sugar chain asparagine derivatives can be synthesized based on the obtained sugar chain asparagine derivative, for example, by successively acting a sugar hydrolase to remove sugar residues.
  • sugar chain asparagine derivative sugar chain asparagine and All the sugar chains were of the a 2, 6 conjugate.
  • any of the novel ⁇ 2,3 conjugated sugar chain asparagine derivative, sugar chain asparagine and sugar chain, and ⁇ ; 2,6 conjugated product which further contain fluorine, which are not described in the prior application, are novel.
  • a sugar chain asparagine derivative, a sugar chain asparagine and a sugar chain are obtained.
  • influenza virus recognizes a sugar chain having sialic acid as a terminal as a receptor.
  • human and avian influenza viruses have different receptor specificities. The former specifically recognizes a sugar chain in which sialic acid is a2,6 linked to galactose, and the latter specifically recognizes a sugar chain in which sialic acid is a2,3 linked to galactose. It is known that the difference in the binding mode between sialic acid and galactose and also the difference in sialic acid play a significant role in limiting the host range of influenza virus. '
  • the present invention thus relates to a novel asparagine sugar chain derivative, asparagine and sugar chain, and a method for producing the same, which are not described in the prior application.
  • the obtained 9 to 7 sugar chain asparagine derivative having sialic acid or a sialic acid derivative is obtained by subjecting the obtained disia mouth sugar chain asparagine derivative and two kinds of monosial sugar chain asparagine derivative to sugar hydrolysis.
  • the above-mentioned 11 to 7 asparagine glycan derivative and asparagine disia mouth sugar chain (2,6-11 saccharide-1 Asn-Fmoc) are used as starting materials to carry out sugar hydrolysis.
  • fucose By transferring fucose to the obtained 10-6 sugar chain asparagine derivative by glycosyltransferase, a 13-7 sugar chain asparagine derivative containing fucose can be obtained.
  • the protective group is not particularly limited, and may be, for example, a carbonate group such as an Fmoc group, a t-butyloxycarbonyl (Boc) group, a benzyl group, an aryl group, an aryloxy group, an acetyl group, or the like.
  • Amide-based protecting groups and the like can be used.
  • the protecting group is preferably an Fmoc group or a Boc group, and more preferably an Fmoc group, from the viewpoint that the obtained asparagine-linked oligosaccharide derivative can be used immediately for synthesis of a desired glycopeptide.
  • the Fmoc group is particularly effective when a sugar that is unstable to relatively acidic conditions such as sialic acid is present in the sugar chain.
  • the introduction of the protecting group may be carried out according to a known method (for example, see Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6).
  • an appropriate amount of acetone is added to asparagine sugar chain, and furthermore, 9-fluorenylmethyl-N-succinimidelka 1-ponate and sodium hydrogen carbonate are added and dissolved, and asparagine is added at 25 ° C.
  • the asparagine residue of the glycan mo c groups can be introduced.
  • a sugar chain asparagine derivative into which a lipophilic protecting group is introduced can be obtained.
  • sialic acid commercially available sialic acid or chemically synthesized sialic acid can be used.
  • sialic acid derivative a commercially available sialic acid derivative or a chemically synthesized one can be used. Specifically, there can be mentioned sialic acid in which the hydroxyl group bonded to the 7-, 8- or 9-position carbon is replaced by a hydrogen atom or a halogen atom. Examples of the halogen atom include fluorine, chlorine, and bromine, but fluorine is preferred.
  • sialyltransferase commercially available ones, naturally-occurring ones, and ones produced by gene recombination can be used, and are appropriately determined depending on the type of sialic acid or sialic acid derivative to be transferred. You can choose. Specific examples include those derived from RatRecombinant, which is a 2,3 transferase, and those derived from RatLiver, which is an o, 2,6 transferase. Alternatively, sialic acid or a derivative of sialic acid may be transferred by shifting the equilibrium by adjusting the pH using sialidase.
  • the reaction solution obtained after the reaction may be subjected to chromatography to obtain each sugar chain asparagine derivative.
  • Removal of the N-acetyldarcosamine residue is accomplished by dissolving the compound to be hydrolyzed in a buffer solution (for example, a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a good buffer solution, etc.) and subjecting the compound to a known method under known conditions.
  • a buffer solution for example, a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a good buffer solution, etc.
  • the reaction solution obtained after the reaction may be subjected to chromatography to obtain each sugar chain asparagine derivative.
  • separation is performed by HPLC (ODS column, developing solvent is a buffer solution such as ammonium acetate of about 10 to 20 OmM and acetonitrile, or ethanol, or methanol, or butanol, or propanol.
  • a fat-soluble water-soluble organic solvent such as the above can be appropriately mixed and used.
  • fucose is transferred to the non-reducing terminal side of the asparagine in which the amino group nitrogen of asparagine is protected by the lipophilic protecting group of the present invention. It is possible to produce a novel asparagine sugar chain derivative containing at least one or more fucose in N-acetyldarcosamine.
  • fucose transferase commercially available ones, naturally occurring ones, and ones produced by gene recombination can be used, and can be appropriately selected depending on the type of fucose to be transferred. Specifically, it is an enzyme that transfers fucose to N-acetyldarcosamine on the non-reducing terminal side of asparagine glycan
  • Fucosyl transferase V Human, Recominant, from plasma, from serum, from milk, from liver
  • fucose may be transferred by shifting the equilibrium by pH adjustment or the like using fucose hydrolase.
  • the above-mentioned asparagine-linked oligosaccharide derivative can be separated by chromatography, if necessary, by using known chromatography alone or in combination.
  • the derivative is further hydrolyzed using various sugar hydrolases and the like to remove saccharide residues at the non-reducing terminal of the glycan, thereby obtaining, for example, saccharides.
  • various asparagine-derived sugar chain derivatives having heterogeneous branched structures at the chain ends can be obtained as single compounds. Further, by using various sugar hydrolyzing enzymes and changing the order of hydrolysis and the type of hydrolysis, it is possible to produce more types of asparagine-linked sugar chain derivatives.
  • the protecting group is an Fmoc group
  • the asparagine derivatives of the sugar chains of formulas (14) to (16) and (19) to (21) are obtained alone or in the form of a mixture. be able to.
  • the present invention also provides a method for producing sugar chain asparagine from which various isolated sugar chain asparagine can be obtained in large quantities.
  • the method includes a step of producing a sugar chain asparagine derivative according to the method for producing a sugar chain asparagine derivative, and further a step of removing a protecting group from the obtained sugar chain asparagine derivative.
  • the removal of the protecting group from the asparagine derivative of a sugar chain can be carried out according to a known method (for example, Protecting groups in Organic chemistries, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301- 6).
  • the protecting group is an F moc group
  • the sugar chain in N, N-dimethylformamide (DMF)
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • the Boc group can be removed by reacting with a weak acid.
  • asparagine sugar chains of formulas (8) and (9) can be obtained alone or in the form of a mixture.
  • the present invention provides a method for producing a sugar chain from which various isolated sugar chains can be obtained in a large amount.
  • the method includes a step of producing asparagine-linked oligosaccharides according to the method of producing asparagine-linked oligosaccharides, and further includes a step of removing asparagine residues from the obtained asparagine-linked oligosaccharides.
  • Asparagine residues can be removed from the asparagine sugar chain by a known method.
  • a sugar chain can be obtained by reacting asparagine sugar chain with anhydrous hydrazine and then acetylating to remove the asparagine residue.
  • the asparagine residue can be removed by heating the asparagine sugar chain to reflux with a basic aqueous solution and then acetylating the sugar chain to obtain the saccharide chain.
  • the product may be purified by a known method, for example, various chromatography using a gel filtration column, an ion exchange column, or the like, or a method of separation by HPLC.
  • a sugar chain asparagine derivative having a desired sugar chain structure, a sugar chain asparagine and a sugar chain (hereinafter, three may be collectively referred to as sugar chains) can be produced inexpensively and efficiently. Can be manufactured in large quantities. ⁇
  • sugar chains are very useful in fields such as drug development.
  • applications in drug development include, for example, cancer vaccine synthesis. It is known that when cells become cancerous, sugar chains not found in the body are expressed. It is also known that when the sugar chain is chemically synthesized and administered to an individual as a vaccine, cancer growth is suppressed. Therefore, if a desired sugar chain can be produced by the present invention, it is possible to synthesize a vaccine effective for treating cancer.
  • the sugar chains obtained according to the present invention are further derivatized by combining a new sugar residue with a combination of a chemical reaction and a reaction with a glycosyltransferase to synthesize a new peptide. It is also possible to do.
  • the physical data of the obtained sugar chain mixture is as follows.
  • Ne uAc Sialic acid Gal: D—galact 1 ⁇ GlcNAc: N— cetyldarcosamine Man: D— mannose As n: Asparagine Show
  • Table 2 shows a simplified structure of Compound 11.
  • Table 2 shows a simplified structure of Compound 12.
  • Table 2 shows a simplified structure of Compound 16.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • This aqueous solution was purified by gel column chromatography (developing solvent: 2 OmM ammonia water, flow rate: 0.3 ml Zmin) using Sepadex G-15 (1.8 ⁇ 90 ⁇ ), and CMP-sialic acid was purified. Obtained.
  • CMP-sialic acid was transferred to asparagine-linked asparagine in which the amino group nitrogen of asparagine was protected with the Fmoc group obtained in Reference Example 3 using sialyltransferase.
  • sialyltransferase those derived from commercially available Rat and Recombinant which are 2,3 transferases were used.
  • the compound (C 1-2) (2 mg, 0.88 ⁇ , ⁇ 1) obtained in Example 1 and lmg of serum albumin were dissolved in 100 ⁇ 1 of HEPES buffer solution (5 OmM, pH 5.0) 100 ⁇ 1 Then, / 3-galactosidase (Seikagaku Kogyo Co., Ltd., from Jack Beans, 5 L, lO OmU) was added. The solution was allowed to stand at 37 ° C for 15 hours, and then filtered with a membrane filter.
  • the filtrate was HPLC (ODS column, 2.0 ci) x 25 cm, and the developing solvent was 50 mM ammonium acetate aqueous solution: acetone
  • the solvent was concentrated and then lyophilized.
  • the residue was dissolved in water 200 1 ODS force Ramukuro Mato chromatography (Cosmosil 7 5 C 18 - opn, performs first washed with water, eluted with following Ide 25% Asetonitoriru solution) desalted using As a result, 0.5 / X g of the desired compound (C2) was obtained.
  • the NMR data is as follows.
  • Example 2 Compound (C 2) (1.8 mg, 0.86 no 1) obtained in Example 2 was dissolved in HEPES buffer solution (50 mM, pH 5.0) 90 H 1 together with 1 mg of serum albumin, and further dissolved. 4 zl (250 mU) of N-acetyl-l-dalcosaminidase (Fram Jack Beans, manufactured by Sigma-Aldrich) was added. The solution was allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours, and then filtered with a membrane filter.
  • HEPES buffer solution 50 mM, pH 5.0
  • 4 zl (250 mU) of N-acetyl-l-dalcosaminidase Fr Jack Beans, manufactured by Sigma-Aldrich
  • the compound (C1-3) (lmg, 0.44 xmol) obtained in Example 1 and lmg of serum serum albumin were added to HEPE S buffer solution (50 mM, pH 5.0) 50 / il. After dissolving, jS-galactosidase (Seomikagaku Kogyo Co., Ltd., frrom JackBeans, 5 ⁇ L, lO OmU) was added. The solution was allowed to stand at 37 ° C. for 15 hours, and then filtered with a membrane filter.
  • Example 6 Compound (C 5) (1.Omg, 0.48 ⁇ mo 1) obtained in Example 5 was dissolved in HEPE S buffer solution (5 OmM, pH 5.0) 501 together with lmg of serum albumin, and Further, 4 / zl (250 mU) of ⁇ -acetyl- / 3-darcosaminidase (produced by Sigma-Aldrich, from Jack Beans) was added. The solution was allowed to stand at 37 ° C. for 22 hours, and then filtered with a membrane filter.
  • HEPE S buffer solution 5 OmM, pH 5.0
  • 4 / zl (250 mU) of ⁇ -acetyl- / 3-darcosaminidase produced by Sigma-Aldrich, from Jack Beans
  • the compound (C 6) (1. Omg ', 0.53 ⁇ mo 1) obtained in Example 6 and lmg of serum albumin dissolved in HEPE S buffer solution (5 OmM, pH 5.0) 501
  • HEPE S buffer solution 5 OmM, pH 5.0
  • One mannosidase Sigma Aldrich, from Jack Bean s 101 (0.9 U) was added.
  • the solution was allowed to stand at 37 ° C for 20 hours, and then filtered with a membrane filter.
  • CMP-sialic acid was transferred to asparagine asparagine (compound 2) obtained by protecting the amino group nitrogen of asparagine with the Fmoc group obtained in Reference Example 3 using sialyltransferase.
  • sialyltransferase those derived from commercially available Rat and Recombinant which are a few transferases were used.
  • CMP-sialic acid was transferred to asparagine asparagine (compound 3) obtained by protecting the amino group nitrogen of asparagine with the Fmoc group obtained in Reference Example 3 using a sialyltransferase.
  • sialyltransferases those derived from commercially available Rat and Recombinant, which are 2,3 transferases, were used.
  • Example 8 In the same manner as in Example 1 except that the CMP-7 "-deoxy-7" -fluoro-sialic acid obtained in Reference Example 8 was used, the amino group nitrogen of asparagine was protected with the Fmoc group shown below. "—Doxy-7” —Fluorosialo ⁇ 2,3 sugar chain Asparagine and two mono 7-protected amino nitrogens of Asparagine with Fmoc group Obtained.
  • the desired compound (C9) was obtained in the same manner as in Example 2 except that the compound (C8-2) obtained in Example 8 was used instead of the compound (C12) of Example 2. Was done.
  • the desired compound (C12) was obtained in the same manner as in Example 5 except that the compound (C8-3) obtained in Example 8 was used instead of the compound (CI-13) of Example 5. Was.
  • the desired compound (C13) was obtained in the same manner as in Example 6, except that the compound (C12) obtained in Example 12 was used instead of the compound (C5) in Example 6.
  • Example 18 (mannose hydrolase of Example 17)
  • Example 21 (mannose hydrolase of Example 20)
  • Example 22 Di9 "-deprotected amino group nitrogen of asparagine with Fmoc group Xi 9 "monofluorosialo c3 ⁇ 42,3 sugar chain Asparagine (C22-1) and two mono 9” —deoxy-9 "monofluoroscialo ⁇ 2,3 sugar chains with the amino nitrogen of asparagine protected by Fmo c group Synthesis of Asparagine (C 22-2 and C 22-3)
  • the desired compound (C24) was obtained in the same manner as in Example 3 except that the compound (C23) obtained in Example 23 was used instead of the compound (C2) in Example 3.
  • Example 25 (mannose hydrolase of Example 24)
  • the desired compound (C26) was obtained in the same manner as in Example 5, except that the compound (C22-13) obtained in Example 22 was used instead of the compound (C13) of Example 5. Was done.
  • Example 27 The desired compound (C 27) was obtained in the same manner as in Example 6, except that the compound (C 26) obtained in Example 26 was used instead of the compound (C 5) in Example 6.
  • Example 28 (mannose hydrolase of Example 27)
  • Example 27 The compound (C 27) obtained in Example 27 was replaced with the compound (C 27) obtained in Example 27 in place of the compound (C 6) in Example 7.
  • the desired compound (C28) was obtained in the same manner as in Example 7 except for using the compound.
  • Example 29 Di7 "-deoxy-7" -fluoro-scaro (2-6) sugar chain of asparagine (C29-1) and asparagine protected by Fmoc group protecting amino group nitrogen of asparagine with Fmoc group Synthesis of two kinds of mono 7 "-doxy 1 7" -fluoro-scaro (2-6) sugar chains of asparagine (C29-2 and C29-3) with amino group nitrogen protected
  • Example 30 galactose hydrolase of Example 29
  • the desired compound (C30) was obtained in the same manner as in Example 2 except that the compound (C29-2) obtained in Example 29 was used in place of the compound (C1-2) in Example 2. Was done.
  • the chemical formula of (C30) is shown below.
  • a target compound (C31) was obtained in the same manner as in Example 3, except that the compound (C30) obtained in Example 30 was used instead of the compound (C2) in Example 3.
  • Example 32 (mannose hydrolase of Example 31) The desired compound (C32) was obtained in the same manner as in Example 4, except that the compound (C31) obtained in Example 31 was used instead of the compound (C3) in Example 4.
  • Example 33 galactose hydrolase of Example 29
  • the desired compound (C33) was obtained in the same manner as in Example 5 except that the compound (C29-3) obtained in Example 29 was used instead of the compound (C1-3) of Example 5. Was done.
  • the chemical formula of (C33) is shown below.
  • a target compound (C34) was obtained in the same manner as in Example 6, except that the compound (C33) obtained in Example 33 was used instead of the compound (C5) in Example 6.
  • Example 34 The compound (C34) obtained in Example 34 was replaced with the compound (C34) obtained in Example 34.
  • the desired compound (C35) was obtained in the same manner as in Example 7, except that the compound was used.
  • the chemical formula of (C 35) is shown below.
  • NMR data of 8Fa2,6-11 sugar-Asn-Fmoc (C36-1) are shown below.
  • the Fmoc group was deprotected by the following procedure for all the asparagine derivatives of the sugar chains.
  • glycan asparagine Fmo c body 240 liters per 1 mo Of N, N-dimethylformamide and 160 ⁇ L of morpholine were added and reacted at room temperature under an argon atmosphere.
  • the mixture was cooled with ice water.
  • getyl ether 10 times the volume of the reaction solution and stirring for 15 minutes the deposited precipitate was separated by filtration. The obtained residue was dissolved in water and evaporated at 35 ° C.
  • Example 50 After reacting the asparagine sugar chain obtained in Example 50 with anhydrous hydrazine, the asparagine residue was removed by acetylation to obtain a corresponding sugar chain.
  • Example 5 2 The raw materials and intended products in each example are shown below.
  • Example 5 2 The raw materials and intended products in each example are shown below.

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Abstract

　１１～７糖を有するα２,３糖鎖アスパラギン誘導体、フッ素を含む１１～７糖を有するα２,６糖鎖アスパラギン誘導体、及び脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体、並びにこれらの製造方法。

Description

明 細 書
糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギンおよび糖鎖ならびにそれらの製造法
技術分野
本発明は糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギンおよび糖鎖ならびにそれ らの製造法に関する。
また本発明はフコースを含む糖鎖ァスパラギン誘導体およびその製造方法に関 する。
背景技術
近年、 核酸 （D NA) 、 タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、 糖鎖分 子が注目されてきている。 ヒトの体は、 約 6 0兆個の細胞から成っている一大細 胞社会であり、 全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。 例えば、 A B O式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、 細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、 細胞社会を成り立たせ る要となっている。 細胞社会の乱れは、 癌、 慢性疾患、 感染症、 老化などにつな がる。
例えば、 細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。 また、 コレラ菌ゃインフルエンザウイルスなどは、 ある特定の糖鎖を認識し結合するこ とにより、 細胞に侵入し感染することが知られている。
糖鎖機能の解明は、 新しい原理に基づく医薬品や食品の開発などをもたらし、 病気の予防、 治療に貢献するなど、 幅広い応用が期待されている。
糖鎖は単糖の配列、 結合様式 ·部位、 鎖の長さ ·分岐様式、 全体の高次構造な どの多様性から、 核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。 従って、 その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多 様である。 糖鎖は、 研究の重要性を認識されながらも、 その構造の複雑さや多様 性により、 核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。 上記のように細胞膜表面や血清などに存在するタンパク質の多くは糖鎖が結合 している。 糖鎖がタンパク質に共有結合した分子は糖タンパク質とよばれ、 糖と タンパク質との結合様式の違いから 2つのグループに分けることができる。 一つ はァスパラギン （A s n ) の側鎖のァミノ基と糖鎖が結合したァスパラギン結合 型糖鎖 （N—グリコシド結合型） である。 もう一方はセリン （S e r ) ゃトレオ ニン （T h r ) のアルコールに糖鎖が結合したムチン結合型糖鎖 （〇ーグリコシ ド結合型） である。 すべてのァスパラギン結合型糖鎖は 5つの糖残基からなる基 本骨格をもち、 結合する糖鎖の非還元末端の糖残基の種類によって高マンノース 型、 複合型、 混成型のサブグループに分類される。 一方ムチン結合型糖鎖は基本 骨格 （コア） の違いから 4グループに分類される。
このように糖鎖は重要な化合物ではあるが、 糖鎖の絶対量の不足がある。 糖鎖 を得る手段として、 生体内に存在する糖タンパク質から糖鎖だけを遊離させる方 法がある。 しかし糖タンパク質から糖鎖を大量に切り出すのは、 困難であり、 生 体内には構造が酷似した糖鎖が多く存在し、 単一の糖鎖のみを大量に得るのは難 しい。 また、 生体内に存在しない糖鎖は、 大量に入手するのは困難である。 本発明の課題は、 少なくとも 1種以上のシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を 非還元末端に含む新規な糖鎖ァスパラギン誘導体とその製造方法を提供すること にある。
また本発明の課題は、 少なくとも 1種以上のシアル酸あるいはシアル酸の誘導 体を非還元末端に含む新規な糖鎖ァスパラギンとその製造方法を提供することに ある。
また本発明の課題は、 少なくとも 1種以上のシアル酸あるいはシアル酸の誘導 体を非還元末端に含む新規な糖鎖とその製造方法を提供することにある。
本発明の課題は、 脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護された 糖鎖ァスパラギンの非還元末端側の N—ァセチルダルコサミンに少なくとも 1個 以上のフコースを含む新規な糖鎖ァスパラギン誘導体とその製造方法を提供する ことにある。
発明の開示
本発明は、 下記の発明に係る。
1. 式 （1) で表される 11〜 7糖を有する 2, 3糖鎖ァスパラギン誘導体及 びその製造法。
Figure imgf000004_0001
〔式中、 1^ぉょび1 2は、 水素原子、 式 （2) 〜 （5) で示される基であり、 同一でも異なっていてもよい。 ただし、 R1および R2の一方は必ず式 （2) で 示される基である。 〕
Figure imgf000004_0002
R, R' ， R" は下記の組合せを示す。 (a) R = F、 ' =OH、 R" =OH
(b) R = OH、 R' =F、 R" =OH
(c) R =〇H、 R， =OH、 R" =F
(d) R = OH、 R' =OH、 R" =OH
Figure imgf000005_0001
2. 式 （6) で表されるフッ素を含む 1 1〜7糖を有する α 2， 6糖鎖ァスパラ ギン誘導体及びその製造法。
Figure imgf000006_0001
〔式中、 Rxおよび RYは、 水素原子、 式 （7) で示される基、 または式 （3) 〜 （5) で示される基である。 ただし、 Rxおよび RYの一方は必ず式 （7) で 示される基である。 〕
Figure imgf000006_0002
' ， R" は下記の組合せを示す。
R = F R' =OH、 R" =OH
R = OH、 R' =F、 R" =OH
R = OH、 ' =OH、 R" =F
3. 式 （8) で表される 11〜7糖を有する a; 2, 3糖鎖ァスパラギン及びその 製造法。
Figure imgf000006_0003
〔式中、 R1および R2は上記に同じ。 〕
4. 式 （9) で表されるフッ素を含む 11〜7糖を有する 2, 6糖鎖ァスパラ ギン及びその製造法。
Figure imgf000007_0001
〔式中、 Rxおよび RYは上記に同じ。 〕
5. 式 （10) で表される 1 1〜7糖を有する《 2, 3糖鎖及びその製造法。
Figure imgf000007_0002
〔式中、 R1および R2は上記に同じ。 〕
6. 式 （11) で表されるフッ素を含む 11〜 7糖を有する α 2, 6糖鎖及びそ の製造法。
Figure imgf000007_0003
〔式中、 Rxおよび RYは上記に同じ。 〕
7. 式 （22) で表される 1 1糖を有する （a 2， 3) ( 2, 6) 糖鎖ァスパラ ギン誘導体。
Figure imgf000007_0004
〔式中、 R1は式 （2) で示される基であり、 RYは下記式 （7) で示される基 である。 〕
Figure imgf000008_0001
R， R' ， R" は下記の組合せを示す。
(a) R = F、 R， =OH、 R" =OH
(b) R = OH、 R， =F、 R" =〇H
(c) R =〇H、 R， =OH、 R" =F
(d) R =〇H、 R， =OH、 R" =OH
8. 式 （23) で表される 1 1糖を有する （cu 2, 3) ( α 2 , 6) 糖鎖ァスパラ ギン誘導体。
Figure imgf000008_0002
〔式中、 R2は式 （2) で示される基であり、 Rxは下記式 （7) で示される基 である。 ：] .
Figure imgf000008_0003
R， R' , R" は下記の組合せを示す。 (a) R = F、 R， =OH、 R" =OH
(b) R = OH、 R， =F、 R" =OH
(c) R = OH、 R， =OH、 R" =F
(d) R = OH、 R， =OH、 R" =OH
本発明は、 脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖ァ スパラギンの非還元末端側の N—ァセチルダルコサミンに少なくとも 1個以上の フコースを含む糖鎖ァスパラギン誘導体、 およびその製造方法に係る。
本発明者は、 先に特願 2001— 185685号 （以下、 先願という） におい て、 種々の単離された糖鎖ァスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大 量に得ることができる、 糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギン、 糖鎖の製 造方法、 更には糖残基が任意に欠失した糖鎖が結合した新規な糖鎖ァスパラギン 誘導体、 糖鎖ァスパラギン、 糖鎖を開発した。
この先願の方法は例えば
(1) (a) 1種もしくは 2種以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物に含まれ る該糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖ァスパラギン誘導体混合 物を得る工程、
ならびに
(b) 該糖鎖ァスパラギン誘導体混合物または該糖鎖ァスパラギン誘導体混合物 に含まれる糖鎖ァスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグ ラフィ一に供して各糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する工程、
を含む、 糖鎖ァスパラギン由来の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法、
(2) (b' ) 工程 （b) で分離された糖鎖ァスパラギン誘導体を糖加水分解 酵素を用いて加水分解する工程をさらに含む前記 （1) 記載の糖鎖ァスパラギン 誘導体の製造方法、
(3) 1種もしくは 2種以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物が、 下記式
(A) の化合物および/または該化合物において 1以上の糖残基が欠失した化合 物を含むものである、 前記 （1) または （2) 記載の糖鎖ァスパラギン誘導体の 製造方法、 .
(4) 脂溶性の保護基がフルォレニルメトキシカルボニル （Fmo c) 基であ る前記 （1) 〜 （3) いずれか記載の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法、 (5) 工程 （a) が、 非還元末端にシアル酸残基を有する 1種もしくは 2種以 上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖ァスパラギンに Fmo c基 を導入し、 かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖ァスパラギン誘導体混 合物を得る工程である、 前記 （1) 〜 （3) いずれか記載の糖鎖ァスパラギン誘 導体の製造方法、
(6) (a) 1種もしくは 2種以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物に含まれ る該糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖ァスパラギン誘導体混合 物を得る工程、
( b ) 該糖鎖ァスパラギン誘導体混合物または該糖鎖ァスパラギン誘導体混合物 に含まれる糖鎖ァスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマ卜グ ラフィ一に供して各糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する工程、 ならびに
(c) 工程 （b) で分離された糖鎖ァスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖 ァスパラギンを得る工程、
を含む、 糖鎖ァスパラギンの製造方法、
(7) (b' ) 工程 （b) で分離された糖鎖ァスパラギン誘導体を糖加水分解 酵素を用いて加水分解する工程、 および/または
(c ' ) 工程 （c) で得られた糖鎖ァスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水 分解する工程、
をさらに含む、 前記 （6) 記載の糖鎖ァスパラギンの製造方法、
(8) 1種もしくは 2種以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物が、 下記式 (A) の化合物および/または該化合物において 1以上の糖残基が欠失した化合 物を含むものである、 前記 （6) または （7) 記載の糖鎖ァスパラギンの製造方 法、
(9) 脂溶性の保護基が Fmo c基である前記 （6) 〜 （8) いずれか記載の 糖鎖ァスパラギンの製造方法、
(10) 工程 （a) が、 非還元末端にシアル酸残基を有する 1種もしくは 2種 以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖ァスパラギンに Fmo c 基を導入し、 かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖ァスパラギン誘導体 混合物を得る工程である、 前記 （6) 〜 （8) いずれか記載の糖鎖ァスパラギン の製造方法などである。
Figure imgf000011_0001
これら糖鎖ァスパラギン誘導体及び糖鎖ァスパラギンの製造についての詳細は、 上記先願に述べられているので、 これを引用する。 しかし若干先願の内容につい て述べると、 先願の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法は、 たとえば、 天然の糖 タンパク質に由来する糖鎖ァスパラギン、 好ましくはァスパラギン結合型糖鎖か ら得られる糖鎖ァスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖ァスパラギンに脂溶性 の保護基を導入 （結合） して糖鎖ァスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混 合物を各糖鎖ァスパラギン誘導体に分離することを 1つの大きな特徵とする。 な お、 本明細書において、 「糖鎖ァスパラギン」 とはァスパラギンが結合した状態 の糖鎖をいう。 また、 「ァスパラギン結合型糖鎖」 とはタンパク質のポリべプチ ド中のァスパラギン （As n) の酸ァミノ基に、 還元末端に存在する N—ァセチ ルダルコサミンが N—グリコシド結合した糖鎖群であって、 Man (/31 -4) G l c N a c ( β 1 - 4 ) G 1 c N a cを母核とする糖鎖群をいう。 「糖鎖ァス パラギン誘導体」 とはァスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖 ァスパラギンをいう。 また、 化合物の構造式中、 「A c H N」 はァセトアミド基 を示す。
前記するように、 天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基が ランダムに欠失した糖鎖の混合物である。 本発明者らは、 意外にも天然の糖タン パク質に由来する糖鎖、 具体的には糖鎖ァスパラギンの混合物に含まれる当該糖 鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入することで、 当該保護基が導入された糖 鎖ァスパラギン誘導体の混合物を公知のクロマトグラフィーの手法を用いて容易 に個々の糖鎖ァスパラギン誘導体に分離することができることを見出した。 それ により、 種々の構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体をそれぞれ大量に調製する ことが可能となった。 たとえば、 従来分離が困難であった類似構造の糖鎖ァスパ ラギン誘導体同士の分離が可能となり、 それらの化合物を各々、 容易かつ大量に 調製することができる。 また、 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体を元に、 たとえ ば、 糖加水分解酵素を順次作用させて糖残基を除去することにより、 さらに様々 な糖鎖ァスパラギン誘導体を合成することもできる。
このように、 糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入して誘導体化すること により個々の糖鎖ァスパラギン誘導体の分離が可能となったが、 これは、 脂溶性 の保護基を導入したことにより糖鎖ァスパラギン誘導体の全体の脂溶性が高まり、 たとえば、 好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、 その結 果、 より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して個々の糖鎖ァスパラギン誘導体が分離さ れるようになったことによると考えられる。
さらに、 先願によれば、 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体の保護基を除去する ことにより種々の糖鎖ァスパラギンを、 人工的に容易かつ大量に得ることができ る。
しかし、 上記先願で得られる糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギン及び 糖鎖はいずれも a 2 , 6結合体のものであった。
また、 上記先願で得られる糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギン及び糖 鎖はいずれもフコースが結合していない糖鎖ァスパラギン誘導体であった。
本発明では、 上記先願に記載のない α 2 , 3結合体の糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギン及び糖鎖、 並びに α; 2 , 6結合体のもので更にフッ素を含む、 いずれも新規な糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギン及び糖鎖を得るもの である。
また本発明では、 上記先願に記載のないフコース結合体の糖鎖ァスパラギン誘 導体を得るものである。
ここで、 a 2 , 3結合体と α 2， 6結合体の相異について以下に説明する。
ひ 2 , 3結合体、 ひ 2 , 6結合体とは、 シアル酸とガラクトースとの結合様式を 表わすものである。 前者は、 シアル酸の 2位の炭素と、 ガラクトースの 3位の炭 素が a結合しているものをいい、 後者は、 シアル酸の 2位の炭素と、 ガラクトー スの 6位の炭素が a結合しているものをいう。 これらは、 ガラク！ ^一スとの結合 炭素の違いではある。
しかしながらこの違いは、 例えば、 インフルエンザウイルスは、 シアル酸を末 端に持つ糖鎖をレセプターとして認識している。 しかし、 ヒトとトリのインフル ェンザウィルスではレセプ夕一特異性が異なっている。 前者は、 シアル酸がガラ クトースに a 2， 6結合した糖鎖を、 後者はシアル酸がガラクト一スに a 2 , 3結 合した糖鎖を特異的に認識する。 シアル酸一ガラクトース間の結合様式の違い、 さらにはシアル酸の相違が、 ィンフルェンザウィルスの宿主域の制限に大きな役 割を果たしていることが知られている。 '
本発明では、 このように先願には記載のない新規な糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギン及び糖鎖、 並びにそれらの製造法に係るものである。
本発明の方法においては先ず、 出発化合物である脂溶性の保護基で保護された 糖鎖ァスパラギン （9糖— A s n— F m o c ) をシアル酸転移酵素を用いてシァ ル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、 得られた脂溶性の保護基で保護され た糖鎖ァスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離し、 脂溶性の 保護基で保護されたジシァ口糖鎖ァスパラギン誘導体および 2種のモノシァロ糖 鎖ァスパラギン誘導体が得られる。
次いで、 得られたジシァ口糖鎖ァスパラギン誘導体および 2種のモノシァロ糖 鎖ァスパラギン誘導体を糖加水分解することにより、 シアル酸あるいはシアル酸 誘導体を有する 9〜 7糖鎖ァスパラギン誘導体が得られる。
また、 上記で得られた 11〜 7糖鎖ァスパラギン誘導体やジシァ口糖鎖ァスパ ラギン （ 2, 6— 1 1糖一 A s n-Fmo c) を出発原料としそれを糖加水分 解することにより得られる 10〜6糖鎖ァスパラギン誘導体に、 糖転移酵素によ りフコースを転移することによりフコースを含む 13〜 7糖鎖ァスパラギン誘導 体が得られる。
当該保護基としては特に限定されるものではなく、 例えば、 Fmo c基や t— ブチルォキシカルポニル （Bo c) 基、 ベンジル基、 ァリル基、 ァリルォキシ力 ルポニル基、 ァセチル基等の、 カーボネート系またはアミド系の保護基等を使用 することができる。 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体を直ちに所望の糖ペプチド の合成に使用できるという観点から、 当該保護基としては、 Fmo c基または B o c基などが好ましく、 Fmo c基がより好ましい。 Fmo c基はシアル酸等比 較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効である。 また、 保護 基の導入は公知の方法 （たとえば、 Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0 - 471- 62301- 6を参照) に従つ て行えばよい。
たとえば、 Fmo c基を用いる場合、 糖鎖ァスパラギンに対しアセトンを適量 加えた後、 さらに 9一フルォレニルメチルー N—スクシニミデルカ一ポネートと 炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、 25°Cにてァスパラギン残基への Fmo c 基の結合反応を行うことにより、 当該糖鎖ァスパラギンのァスパラギン残基に F mo c基を導入することができる。 . 以上の操作により、 脂溶性の保護基が導入された糖鎖ァスパラギン誘導体が得 られる。
シアル酸としては、 一般に市販されているシアル酸あるいは化学合成したもの を用いることができる。
シアル酸の誘導体としては、 一般に市販されているシアル酸の誘導体あるいは 化学合成したものを用いることができる。 具体的には、 シアル酸の 7位、 8位あ るいは 9位の炭素に結合している水酸基を水素原子あるいはハロゲン原子で置換 したものを挙げることができる。 ハロゲン原子としては、 フッ素、 塩素、 臭素等 を挙げることができるが、 好ましくはフッ素がよい。
シアル酸転移酵素としては、 一般に市販されているもの、 天然由来のもの、 遺 伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、 転移させるシアル酸ある いはシアル酸の誘導体の種類により適宜選択することができる。 具体的には、 ひ 2, 3転移酵素である R a t R e c omb i n a n t由来のもの、 o; 2， 6転移 酵素である Ra t L i v e r由来のものを挙げることができる。 また、 シァリ タ一ゼをもちいて pH調整等により平衡をずらすことにより、 シアル酸あるいは シアル酸の誘導体を転移させてもよい。
上記糖鎖ァスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、 適宜、 公知 のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うこ とができる。
たとえば、 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体混合物をゲル濾過力ラムクロマト グラフィ一で精製後、 HPLCを用いて精製する。 HPLCにおいて用い得る力 ラムとしては逆相系のカラムが好適であり、 たとえば、 ODS、 Ph e ny l系、 二トリル系や、 陰イオン交換系のカラム、 具体的には、 たとえば、 フアルマシア 社製モノ Qカラム、 ィャトロン社製ィアト口ビーズカラムなどが利用可能である。 分離条件等は適宜、 公知の条件を参照して調整すればよい。 以上の操作により、 糖鎖ァスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖ァスパラギン誘導体を得ること ができる。
以上の操作により、 たとえば、 保護基が Fm o c基である場合、 式 （1 2 ) 、 ( 1 3 ) 、 （1 7 ) 、 （1 8 ) 、 （2 2 ) 、 （2 3 ) の糖鎖ァスパラギン誘導体 を単独又は混合物の形で得ることができる。
次に、 上記で分離された糖鎖ァスパラギン誘導体を加水分解することにより、 所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。 たとえば、 糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する段階においては混合物に含まれる 糖鎖ァスパラギン誘導体の種類を制限して糖鎖ァスパラギン誘導体を大まかに分 離し、 次いで加水分解、 たとえば、 糖加水分解酵素を用いて加水分解することに より所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を効率的に得ることができ る。 なお、 加水分解は前記と同様にして行うことができる。 特に、 所望の糖鎖構 造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体をより効率的に得る観点から、 糖残基の切断 様式が明確な糖加水分解酵素を用いて加水分解するのが好ましい。
たとえば、 ガラクトース残基の除去は、 加水分解される化合物を緩衝液 （たと えば、 リン酸緩衝溶液、 酢酸緩衝溶液、 グッド緩衝溶液など） に溶かし、 公知の 条件に従ってガラクトース加水分解酵素を用いてガラク 1 ^一ス残基の切断反応を 行うことにより成し得る。 なお、 加水分解される化合物は各々単離されたもので あっても混合物であってもよい。 この反応で用いるガラク 1 ^一ス加水分解酵素は 市販されている公知のェキソ型の酵素を利用するのが好ましい。 また、 同様の活 性を有するものであれば、 新たに単離された酵素、 遺伝子工学的に創製された酵 素であってもよい。 次いで、 前記と同様にして、 反応後に得られる反応液 （糖残 基が切断された糖鎖ァスパラギン誘導体の混合物） をクロマトグラフィーに供し、 各糖鎖ァスパラギン誘導体を得ればよい。 たとえば、 分離は H P L C (O D S力 ラム、 展開溶媒は 5 O mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリル = 8 2 ： 1 8 ) で行うのが好ましい。 N—ァセチルダルコサミン残基の除去は、 加水分解される化合物を緩衝液 （た とえば、 リン酸緩衝溶液、 酢酸緩衝溶液、 グッド緩衝溶液など） に溶かし、 公知 の条件に従つて N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素を用いて N—ァセチルダ ルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。 また、 N—ァセチルへキ ソサミニダーゼ加水分解酵素を用いてもよい。 なお、 加水分解される化合物は 各々単離されたものであっても混合物であつてもよい。 この反応で用いる各酵素 は市販されているェキソ型の酵素を利用するのが好ましい。 また、 同様の活性を 有するものであれば、 新たに単離された酵素、 遺伝子工学的に創製された酵素で あってもよい。 次いで、 前記と同様にして、 反応後に得られる反応液 （糖残基が 切断された糖鎖ァスパラギン誘導体の混合物） をクロマトグラフィーに供し、 各 糖鎖ァスパラギン誘導体を得ればよい。 たとえば、 分離は H P L C (O D Sカラ ム、 展開溶媒は 5 O mM酢酸アンモニゥム水溶液：メタノール = 6 5 ： 3 5また は 5 O mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリル = 8 2 ： 1 8 ) で行うのが 好ましい。
マンノース残基の除去は、 加水分解される化合物を緩衝液 （たとえば、 リン酸 緩衝溶液、 酢酸緩衝溶液、 グッド緩衝溶液など） に溶かし、 公知の条件に従って マンノース加水分解酵素を用いてマンノース残基の切断反応を行うことにより成 し得る。 なお、 加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物で あってもよい。 この反応で用いるマンノース加水分解酵素は市販されているェキ ソ型の酵素を利用するのが好ましい。 また、 同様の活性を有するものであれば、 新たに単離された酵素、 遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。 次いで、 前記と同様にして、 反応後に得られる反応液 （糖残基が切断された糖鎖ァスパラ ギン誘導体の混合物） をクロマトグラフィーに供し、 各糖鎖ァスパラギン誘導体 を得ればよい。 たとえば、 分離は H P L C (O D Sカラム、 展開溶媒は、 1 0〜 2 0 O mM程度の酢酸アンモニゥムなどの緩衝溶液とァセトニトリル、 あるいは エタノール、 あるいはメタノール、 あるいはブ夕ノール、 あるいはプロパノール などの脂溶性のある水溶性有機溶剤を適宜混ぜて用いることができる。 ここに例 示する場合、 展開溶媒としては 5 O mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリ ル = 8 2 ： 1 8が好適である） で行うのが好ましい。
このようにして得られた各糖鎖ァスパラギン誘導体を得た後、 フコースを転移 させることにより本発明の脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護 された糖鎖ァスパラギンの非還元末端側の N—ァセチルダルコサミンに少なくと も 1個以上のフコースを含む新規な糖鎖ァスパラギン誘導体を製造することがで さる。
フコースとしては、 一般に市販されているフコースあるいは化学合成したもの を用いることができる。
フコース転移酵素としては、 一般に市販されているもの、 天然由来のもの、 遺 伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、 転移させるフコースの種 類により適宜選択することができる。 具体的には、 糖鎖ァスパラギンの非還元末 端側の N—ァセチルダルコサミンにフコースを転移させる酵素である
Fucosyl transferase V (Human, Recom inant, 血漿由来、 血清由来、 乳汁由来、 肝臓由来） などを挙げることができる。 また、 フコース加水分解酵素を用いて p H調整等により平衡ずらすことにより、 フコースを転移させてもよい。
上記糖鎖ァスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、 適宜、 公知 のクロマトグラフィ一を単独でまたは複数組合せて用いることにより行うことが できる。
たとえば、 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体混合物をゲル濾過力ラムクロマト グラフィ一で精製後、 H P L Cを用いて精製する。 H P L Cにおいて用い得る力 ラムとしては逆相系のカラムが好適であり、 たとえば、 〇D S、 P h e n y l系、 二トリル系や、 陰イオン交換系のカラム、 具体的には、 たとえば、 フアルマシア 社製モノ Qカラム、 ィャトロン社製ィアト口ビーズカラムなどが利用可能である。 分離条件等は適宜、 公知の条件を参照して調整すればよい。 以上の操作により、 糖鎖ァスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖ァスパラギン誘導体を得ること ができる。
このように、 各糖鎖ァスパラギン誘導体を得た後、 さらに各種糖加水分解酵素 等を用いて当該誘導体を加水分解し、 糖鎖の非還元末端の糖残基を除去すること により、 たとえば、 糖鎖の末端の分岐構造が不均一な様々な糖鎖ァスパラギン誘 導体をそれぞれ単一化合物として得ることができる。 また、 種々の糖加水分解酵 素を用い、 加水分解する順番やその種類を変えることで、 より多くの種類の糖鎖 ァスパラギン誘導体を製造することができる。
従来の方法によれば、 極限られた糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を 分析スケールで得るのにさえ膨大な時間とコス卜が必要であつたが、 本発明によ れば、 特別の装置や試薬を必要とすることなく、 慣用のゲルろ過カラム、 H P L Cカラムや、 少なくとも 3種類の糖加水分解酵素 （たとえば、 ガラクトース加水 分解酵素、 マンノース加水分解酵素、 N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素） 等を使って、 2週間程度で所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を 1 グラム程度調製することが可能である。
以上の操作により、 たとえば、 保護基が Fm o c基である場合、 式 （1 4 ) 〜 ( 1 6 ) 、 （1 9 ) 〜 （2 1 ) の糖鎖ァスパラギン誘導体を単独又は混合物の形 で得ることができる。
また本発明は、 種々の単離された糖鎖ァスパラギンを大量に得ることができる 糖鎖ァスパラギンの製造方法を提供する。 当該方法は、 前記糖鎖ァスパラギン誘 導体の製造方法に従う糖鎖ァスパラギン誘導体の製造工程に続き、 さらに、 得ら れた糖鎖ァスパラギン誘導体から保護基を除去する工程を含むものである。
糖鎖ァスパラギン誘導体からの保護基の除去は、 公知の方法に従って行うこと ができる （たとえば、 Protect ing groups in Organic chemis try, John Wi ley & Sons INC. , New York 1991, ISBN 0-471- 62301-6を参照) 。 たとえば、 保護基が F m o c基である場合、 N, N—ジメチルホルムアミド （D M F) 中、 糖鎖ァス パラギン誘導体にモルホリンを加えて反応を行うことにより F m o c基を除去す ることができる。 また、 B o c基は弱酸を反応させることで除去することができ る。 保護基除去後、 所望により適宜、 公知の方法、 たとえば、 ゲル濾過カラム、 イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、 H P L Cによる分 離という方法によって精製することにより、 糖鎖ァスパラギンを得てもよい。 以上の操作により、 たとえば、 式 （8 ) 、 ( 9 ) の糖鎖ァスパラギンを単独又 は混合物の形で得ることができる。
さらに本発明は、 種々の単離された糖鎖を大量に得ることができる糖鎖の製造 方法を提供する。 当該方法は、 前記糖鎖ァスパラギンの製造方法に従う糖鎖ァス パラギンの製造工程に続き、 さらに、 得られた糖鎖ァスパラギンからァスパラギ ン残基を除去する工程を含むものである。
糖鎖ァスパラギンからのァスパラギン残基の除去は、 公知の方法に従って行う ことができる。 たとえば、 糖鎖ァスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、 ァセチル化することによりァスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。 また、 糖鎖ァスパラギンを塩基性水溶液で加熱還流後、 ァセチル化することによ つてもァスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。 ァスパラギン残基 除去後、 所望により適宜、 公知の方法、 たとえば、 ゲル濾過カラム、 イオン交換 カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、 H P L Cによる分離という方 法によって精製してもよい。
以上の操作により、 たとえば、 式 （1 0 ) 、 （1 1 ) の糖鎖を単独又は混合物 の形で得ることができる。
このように、 本発明によれば、 所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導 体、 糖鎖ァスパラギンおよび糖鎖 （以下、 3つ併せて糖鎖類という場合がある） を安価かつ効率的に大量に製造することができる。 ·
かかる糖鎖類は医薬品開発等の分野において非常に有用である。 たとえば、 医 薬品開発における応用例としては、 たとえば、 ガンのワクチン合成があげられる。 細胞がガン化すると体内にはなかった糖鎖が発現することが知られている。 また、 当該糖鎖を化学的に合成し、 ワクチンとして個体に投与すると、 ガンの増殖が抑 制されることも知られている。 そこで、 本発明により所望の糖鎖類を製造するこ とができれば、 ガンの治療に有効なワクチンの合成を行うことが可能である。 ま ' た、 本発明により得られる糖鎖類を、 さらに化学的な反応および糖転移酵素によ る反応などを組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、 新規なヮクチ ンの合成を行うことも可能である。 発明を実施するための最良の形態 .
以下に参考例、 実施例を挙げて説明するが、 本発明は何らこれら実施例に限定 されるものではない。
参考例 1 a 2， 6—ジシァ口糖鎖ァスパラギンの合成
卵由来粗精製 S GP (シァリルグリコペプチド) 2. 6 gをトリス一塩酸 ·塩 化カルシウム緩衝溶液 （TR I ZMA BAS E 0. 0 5mo l /し 塩化力 ルシゥム 0. 0 lmo 1 Z 1、 pH7. 5) 1 0 0m lに溶解させた。 これにアジ 化ナトリウム 5 8mg (7 7 2 mo 1 ) とァクチナーゼー E (科研製薬社製）
5 2 6mgを加え、 3 7°Cで静置した。 6 5時間後、 再びァクチナ一ゼー Eを 2
6 3mg加え、 更に 3 7°Cで 24時間静置した。 この溶液を凍結乾燥した後、 残 留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー （S e p h a d e X G— 2 5、 2. 5 φΧ lm、 展開溶媒は水、 流速は 1. 0m 1 _ m i n) で 2回精製し、
2， 6—ジシァ口糖鎖ァスパラギンを 1. 3 g (5 5 5 mo 1 ) 得た。
得られたジシァ口糖鎖ァスパラギンの物理的データは以下の通りである。
^-NMR (D20, 3 0。C)
δ 5. 1 3 (s , 1 Η, Ma n 4 - Η— 1)， 5. 0 7 (d， 1 Η, J = 9. 5Η ζ , G 1 c NAc 1— Η— 1)， 4. 9 5 (s , 1 Η, Ma n 4— Η— 1)， ·
4. 7 7 (s， 1 Η， Ma η 3 -Η- 1), 4. 6 1 (d, 1 Η， 1 = 7. 6Ηζ , G 1 c NAc 2 - H— 1)， 4. 60 (d， 2 H, J = 7. 6Hz， G l cNAc 5, 5— H— 1)， 4.44 (d， 2 H, J = 8. 0Hz, G a 1 6, 6— H— 1)， 4. 25 (bd， 1 H, Ma n 3 -H- 2), 4. 20 (bdd, 1 H， Man4 - H— 2), 4. 12 (bd， 1 H, Ma n 4-H- 2), 2. 94 (d d 1 H, J =4. 5Hz , 17. 2Hz, As n-j3 CH), 2. 85 (d d, 1 H, J = 7.0Hz, 17. 2Hz, As n— /3CH), 2. 67, 2. 66 ( d d , 2 H, J = 4. 6Hz, 12.4Hz, Ne uAc 7, 7— H— 3eq), 2.07 (s， 3H， Ac), 2. 06 (s , 6 H， Ac X 2), 2.02 (s , 6 H， Ac X 2), 2. 01 (s， 3 H, Ac), 1.71 (d d, 2 H, J = 12.4 H z , 12.4Hz, Ne uAc 7, 7— H— 3。J
Figure imgf000022_0001
参考例 2 ' 化合物 1、 2、 3および 4の合成
参考例 1で得られた a 2, 6—ジシァ口糖鎖ァスパラギン （609mg， 26 1 /xmo l) を水 20. 7mlに溶解させ、 さらに 0. 1規定塩酸 13. 8 m 1を 加えた。 この溶液を 70°Cで 35分間加熱した後速やかに氷冷し、 飽和炭酸水素 ナトリウム水溶液を加え PH7とした。 これを凍結乾燥した後、 残留物をゲル濾 過カラムクロマトグラフィー （S e p h a d e X G— 25、 2. 5 φΧ 1πι、 展開溶媒は水、 流速は 1. Om 1 /m i η) で精製したところ、 ο; 2, 6—ジシァ 口糖鎖ァスパラギン、 2種の α 2, 6—モノシァロ糖鎖： ァロ糖鎖ァスパラギンの混合物 534mgを得た。 この 4成分はそれぞれを単離 することなく次の工程に進めた。
なお、 得られた糖鎖混合物の物理的データは以下の通りである。
— NMR (D20, 30。C)
5. 13 (s , Man4-Hl), 5. 12 (s , Man4 - Hl)，. 5.01 (d, G l cNAc l— HI), 4. 94 (s , Ma n 4 ' -HI), 4. 93 ( s , Ma n 4 ' -HI), 4. 82 (s , Ma n 3 -H 1), 4.60 (d, G 1 c NA c 2 -H 1), 4. 58 (d, G 1 c NAc 5, 5 ' -HI), 4.47 (d d, Ga l 6, 6， -HI), 4.44 (d， Ga l 6, 6， -HI), 4. 24 (d, Man 3-H2), 4. 19 (d， Ma n 4 ' — H2), 4. 11 (d, Man 4- H2), 2. 97 (bdd， A s N- ]3 CH), 2. 72 (dd, Ne uAc 7 -H 3 e q, Ne uAc 7 -H3 e q), 2.64 (bdd, As N- j3 CH), 2. 1 5 (s X 5, -Ac), 1. 79 (dd, N e u A c 7 -H 3 a x, Ne uAc 7 ' — H 3 a x)
得られた糖鎖の混合物 429mgをアセトン 16.3 m 1と水 1 1. 2 m 1に溶 解させた。 ここに 9 _フルォレニルメチル一N—スクシ二ミジル力一ポネート (155. 7mg, 461. 7 ^mo 1 ) と炭酸水素ナトリウム （80.4mg， 957 mo 1) を加え、 室温で 2時間攪拌した。 この溶液をエバポレー夕一に 供してアセトンを除き、 残りの溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフィー （S e p h a d e X G— 25、 2 · 5 φ X 1 m、 展開溶媒は水、 流速は 1.0 m 1 Zm i n) で精製したところ、 化合物 1、 化合物 2および 3、 化合物 4の混合物 30 9mgが得られた。 この混合物を HPLC (ODSカラム、 展開溶媒は 50 mM 酢酸アンモニゥム水溶液：メタノール = 65 : 35、 2. 0 φΧ 25 οπι, 流速 3mlZm i n) を用いて精製したところ、 51分後に化合物 1が、 67分後に 化合物 2および 3の混合物が、 93分後に化合物 4が溶出した。 それぞれを取り 分け凍結乾燥を行った後、 ゲル濾過カラムクロマトグラフィー （S e ph a d e x G—25、 2. 5 φ X 30 cm、 展開溶媒は水、 流速は 1.0m 1 /m i n) で脱塩することで目的の化合物 2および 3の混合物 15 Omgを得た。
なお、 得られた化合物 1の物理的データは以下の通りである。
XH-NMR (D20, 30°C)
7.99 (2 H, d, Fmo c), 7. 79 (2 H, d， Fmo c), 7. 55 (4
H, m， Fmo c), 5. 15 (1H， s , Ma n 4-H 1), 5.06 ( 1 H, d G l cNAc l— Hl)， 4.95 (1 H, s , Ma n 4 ' -HI), 4. 82 ( 1 H， s , Man 3-H1), 4.69 ( 1 H, d, G 1 c NAc 2 -H 1 ), 4. 6 7 (2H， d, G 1 c NAc 5, 5 ' -HI), 4. 53 (2H, d, G a 1 6, 6， -H 1 ), 4. 34 (1H， d， Man 3-H2), 4.27 ( 1 H, d, Ma n 4 ' — H2)， 4. 19 (1H， d, Ma n 4-H2), 3. 03 (1 H, b dd A s N- |S CH), 3.00 (1H， bdd, AsN— j8CH)， 2. 76 (2 H, d d, Ne uAc 7, 7 ' -H 3 e q), 2. 15 (18H, s X 6, -Ac),
I.79 (2 H, dd， N e u Ac 7 , 7 ' -H 3 a x) ; HRMS C a 1 c d f o r C103H154N8N a066 [M + N a +] 2581. 8838, f o u n d， 2581. 8821
Figure imgf000024_0001
上記の糖鎖,の構造を記号化すると次のようになる。 ここで
Ne uAc :シアル酸 Ga l : D—ガラク 1 ^一ス G l cNAc : N—ァ セチルダルコサミン Man ： D—マンノース As n :ァスパラギン を示す
NeuAc α 2— 6Gal j31— 4GlcNAc β 1— 2Man
1— 4G1 cNAc β 1— 4G1 cNAc— Asii-Fmoc
NeuAc a 2— 6Gal β 1— 4GlcNAc β 1— 2Man
Figure imgf000025_0001
(1一 a)
また、 得られた化合物 2および 3の混合物の物理的データは以下の通りである, ^-NMR (D20, 30。C)
7. 99 (d， Fmo c), 7. 79 (d， Fmo c ), 7. 55 (m， Fmo c), 5. 14 (s, Man4— Hl)， 5. 1 2 (s , Man4— H)， 5. 00 (d, G l cNAc l— HI), 4. 94 (s, Ma n 4 ' -HI), 4. 93 (s , Ma n 4' -HI), 4. 82 (s， Man 3-H1), 4. 60 (d， G 1 c NAc 2 -HI), 4. 58 (d, G 1 c NAc 5, 5 ' -H I), 4. 46 (d d, Ga l 6, 6， -HI), 4.44 (d, G a 1 6, 6 ' 一 HI), 4. 24 (d, Ma n 3 -H2), 4. 1 9 (d, Ma n 4' 一 H2)， 4. 1 1 (d, Man4-H2), 2. 97 (b d d， As N— jS CH), 2. 72 (dd， Ne uAc 7 -H3 e Q, Ne uAc 7 -H3 e q), 2. 64 (b d d, A s N- β ΟΗ), 2. 1 5 ( s X 5, -Ac), 1. 79 (dd， Ne uAc 7-H3 ax, Ne uAc 7 ' — H3 a x)
また、 得られた化合物 4の物理的データは以下の通りである。
XH-NMR (D2〇， 30。C)
7. 99 (2H， d， Fmo c), 7. 79 (2H, d, Fmo c), 7. 55 (4 H, m, Fmo c), 5. 1 2 (1 H, s , Ma n 4-H1), 5. 06 ( 1 H, d, G l cNAc l— HI), 4. 93 ( 1 H, s， Ma n 4 ' -HI), 4. 82 (1 H, s， Ma n 3 -H 1), 4. 69 (1H， d， G 1 c NAc 2 -H 1), 4. 6 7 (2H, d, G 1 cNAc 5, 5 ' -HI), 4. 53 (2H, d， G a 1 6, 6， -HI), 4. 34 (1H， d， Man 3-H2), 4. 27 (1H, d， Ma n 4 ' -H2), 4. 19 (1H， d， Ma n 4 -H2), 3. 03 (1H， b dd, AsN— j8 CH), 3. 00 ( 1 H, b d d, As N— /3 CH), 2. 1 5 (1 2H s X 4, -Ac)； HRMS C a l c d f o r C81H120N6N a O50 [M + N a+] 1999. 6 9 30, f o un d, 1 999. 69 39
Figure imgf000026_0001
上記の化合物 4の構造の簡略化したものを表 2に示す。
参考例 3 化合物 2、 3の合成および単離
参考例 2で得られた化合物 2、 3の混合物 （5. 0mg， 2. 2 nmo 1 ) を 2 20 Lの水に溶解させ、 22 mMの炭酸セシウム水溶液を 1 00 加え、 p H7. 0とした。 この溶液を凍結乾燥した。 乾燥後の固形物に N， N—ジメチルホ ルムアミドを 430 L加え、 更に 6. 6 iTio 1のベンジルブ口マイド ZN, N ージメチルホルムアミド溶液を 20 L加えた。 この溶液をアルゴン雰囲気下で 攪拌した。 48時間後、 TLC (展開溶媒は 1M NH40AC ：イソプロパノ —ル =1 ： 2を用いた） にて原料の消失を確認した後、 4. 4mLのジェチルェ —テルを加えて化合物を沈殿させた。 沈殿した糖鎖を濾過し、 残った糖鎖を水に 溶解させ凍結乾燥した。 凍結乾燥後の残留物を分取 HP L C (YMC P a c k e d Co l umn D— ODS— 5 S- 5 1 20 A 〇DS No. 20 20 178、 20 X 250 mm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液： ァセトニトリル =7 8 ： 22、 流速 4. OmL/m i n) で精製したところ、 8 8分後に化合物 3が、 9 1分後に化合物 2が溶出した。 それぞれを取り分け、 更 に OD Sカラム （コスモシール 75 C 18—〇PN、 15X 100mm、 最初に H20を 50mL流し、 次に 25%ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩 したところ、 目的とする化合物 2のべンジル体が 1. 6mg、 化合物 3のべンジ ル体が 1. 8mg得られた。
化合物 2のベンジル体 （10糖、 13. 6mg、 5. 8mmo 1) を、 氷冷下に N aOH a q. (pH= 12) 1.4 m 1に溶解させた。 反応を H P L Cでモニタ 一しながら約 8時間撹拌した。 反応の進行が終了した時点で、 反応液を 40mM HC 1にて pH= 7. 0に調整した。 中和後の液を、 メンブランフィルターで濾 過した後、 濃縮、 次いで HPLC (YMC- P a c k OD S -AM, SH— 343 - 5 AM, 20 X 250 mm, AN/25 mM A c〇NH4 bu f f e r = 20/80, 7. 0m l /m i n. , wa v e l e n g t h ; 274 n m) にて分取 ·精製を行った。 分取した液を濃縮後、 ODSカラム （コスモシー ル 75 C18— OPN, ナカライテスク社製) にて脱塩処理を行い、 濃縮、 凍 結乾燥を行うと、 目的とする化合物 2 (6.2mg, 47.4%) が得られた。 得 られた化合物の物理的データは以下の通りである。 化合物 2の構造の簡略化した ものを表 1に示す。
;H NMR (400MHz , D20， 30°C, HOD = 4. 81 )
δ 8. 00 (d， 2 H, J = 7. 2, Fmo c), 7. 79 (d, 2H, J = 7. 2， Fmo c), 7.59 (d d, 2H, J = 7. 2, Fmo c), 7. 53 (d d, 2H, J = 7. 2, Fmo c), 5. 22 (s， 1 H， Man4-Hl),
5. 09 (d, 1 H, J = 9. 8, G l cNAc l - Hl)， 5. 01 ( s , 1 H, Ma n 4 ' — H— 1), 4. 85 (s , 1 H), 4. 58— 4. 75 (m, 5H)， 4. 57 (d d， 2 H, J = 8. 0), 4. 38 - 4. 48 (m， 2 H), 4. 33 (s , 1H)， 4.28 (b s， 1H,- Man4-H2), 4. 19 (b s , 1 H), 2. 64 - 2. 85 (m, 3 H, As n-/3 CHx 2, N e u A c 7 -H 3 e q), 2. 16, 2. 1 3， 2. 12 (e a c h s , 12 H, Ac x 4), 1. 98 (s， 3H， Ac) 1. 8 0 (d d， 1 H, J a= 1 2. 0, J b = 1 2. 0, N e u A c 7 -H3 a x) .
化合物 3のベンジル体 （1 0糖、 5. 0mg、 2. lmmo 1 ) を、 氷冷下に N aOHa q. (pH= 1 2) 2. 0 m 1に溶解させた。 反応を H P L Cでモニター しながら約 5時間撹拌した。 反応の進行が終了した時点で、 反応液を 40mM HC 1にて pH= 7. 0に調整した。 中和後の液を、 メンブランフィルターで濾 過した後、 濃縮、 次いで HPLC (YMC- P a c k ODS -AM, SH- 343 - 5 AM, 2 0 X 2 5 0 mm, AN/2 5 mM Ac ONH4 b u f f e r = 2 0/8 0, 7. 0m l /m i n. , wa v e l e n g t h ; 2 74 n m) にて分取 ·精製を行った。 分取した液を濃縮後、 ODSカラム （コスモシー ル 7 5 C18— OPN, ナカライテスク社製） にて脱塩処理を行い、 濃縮、 凍 結乾燥を行うと、 目的とする化合物 3 (2. 5mg, 5 2. 0 %) が得られた。 得 られた化合物の物理的データは以下の通りである。 化合物 3の構造の簡略化した ものを表 1に示す。
:H NMR (40 0MHz , D2〇， 3 0°C, HOD = 4. 8 1)
δ 8. 0 1 (d, 2H， J = 7. 6, Fmo c), 7. 8 0 (d, 2H， J = 7. 6， Fmo c), 7. 5 9 (d d, 2 H, J = 7. 6, Fmo c), 7. 5 2 (d d， 2 H, 1 = 7. 6, Fmo c)， 5. 2 1 ( s， 1 H, Ma n 4-H 1), 5. 0 9 (d， 1 H, J = 9. 5, G l c NAc l - H I), 5. 0 3 (s， 1 H, Ma n 4 ' — H— l)， 4. 5 8— 4. 7 1 (m， 5H)， 4. 54 ( t , 2 H, J = 7. 5), 4. 40— 4. 5 0 (b， 2 H), 4. 34 (s , 1 H), 4. 2 8 (b s : 1 H, Ma n 4-H2), 4. 1 9 (b s , 1 H)， 2. 7 0 - 2. 8 5 (m， 2 H, As n-i3 CH, Ne uAc 7 -H3 e q), 2. 5 5 - 2. 7 0 (m, 1 H, A s n - i3 CH)， 2. 1 6, 2. 1 5， 2. 1 3， 2. 1 1 (e a c h s , 1 2 H， Ac x 4), 1. 9 8 (s , 3H, Ac) 1. 8 0 (d d， 1 H, J a= 1 2. 4, J b = 1 2. 4, Ne uAc 7 -H3 a x) . 参考例 4 化合物 5および 6の合成
参考例 2で得られた化合物 2および 3の混合物 （224mg， 97 nmo 1 ) とゥシ血清アルブミン 24mgを HEPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH6.0) 22mlに溶解させ、 さらに D i p 1 o c o c c u s pn e umon i a e由 来 i3—ガラクトシダーゼ （1. 35U) を加えた。 この溶液を 37°Cで 15時間 静置した後、 凍結乾燥を行った。 残留物を HPLC (ODSカラム、 2.0 φΧ 25 cm, 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリル= 8 5 ： 15、 流速 3m l /mi n) で精製したところ、 129分後に化合物 5が、 134分後に化合物 6が溶出した。 それぞれを取り分け、 凍結乾燥を行った。 続 いて HPLC 〔ODSカラム、 2.0 φ X 25 cm、 展開溶媒は最初の 15分間 が水、 16分後から 30分後までは水：ァセトニトリル （容量比） = 10 ： 0か ら 85 ： 15、 31分後から 45分後までは水：ァセトニトリル =85 ： 15か ら 80 ： 20になるようにグラジェントを掛けた。 流速は 3. 0m 1 Zm i n〕 を用いて脱塩処理を行ったところ、 目的とする化合物 5が 8 lmg、 化合物 6が 75mg得られた。
なお、 得られた化合物 5の物理的デ一夕は以下の通りである。
^-NMR (D2〇， 30°C)
7. 99 (2H, d, Fmo c), 7. 79 (2H, d， Fmo c), 7. 55 (4 H, m, Fmo c), 5. 15 (1H， S, Ma n 4-H 1), 5. 06 (1H， d: G l cNAc l - Hl)， 4. 95 ( 1 H， s, Ma n 4 ' -HI), 4. 82 ( 1 H， s, Ma n 3 -H 1), 4. 69 (1 H, d， G 1 c NAc 2 -H 1), 4. 6 7 (2H, d， G 1 c NAc 5, 5 ' -HI), 4. 53 ( 1 H, d， G a 1 6 ' 一 HI), 4. 34 (1 H, d， Ma n 3 -H2), 4. 27 ( 1 H, d, Man ' -H2), 4. 19 (1H， d, Man 4-H2), 2. 97 (1 H, bdd， As N-jS CH), 2. 76 (1 H, dd， Ne uAc 7 ' -H3 e q), 2. 61 (1 H, bdd， AsN— /3CH), 2. 1 5 (15H， s X 5, 一 Ac), . 1. 7 9 (1 H, dd, Ne uAc 7 ' -H3 ax) ； HRMS C a l c d f o r C86H127N7Na 053 [M + N a+] 2128.7356, f ound, 21 28. 7363
また、 得られた化合物 6の物理的デ一夕は以下の通りである。
XH-NMR (D2〇， 30°C)
7. 99 (2 H, d, Fmo c), 7. 79 (2 H, d, Fmo c), 7. 55 (4 H, m， Fmo c), 5. 15 ( 1 H, S, Man4 - Hl)， 5. 06 (1H， d, G l cNAc l - HI), 4. 95 ( 1 H, s， Ma n 4 ' —HI), 4. 82 (1 H, s, Man 3-H1), 4.69 (1H， d， G 1 cNAc 2-H1), 4. 6
7 (2 H, d, G 1 cNAc 5, 5 ' -HI), 4. 53 ( 1 H, d, G a 1 6 - HI), 4. 34 (1H， d, Ma n 3 -H2), 4. 27 (1H， d, Ma n 4 ' -H2), 4. 19 (1H, d, Ma n 4-H2), 2.97 ( 1 H， b dd, As N- β CH), 2. 76 (1H， dd, N e u A c 7 -H 3 e q), 2.60 ( 1 H， bdd, A s N-i3 CH), 2. 15 (1 5H， s X 5, -Ac), 1. 79 ( 1 H, dd, Ne uAc 7-H3 ax) ; HRMS C a l c d f o r C86H125 N7N a 3053 [M + N a +]' 2172.6995, f ound, 2172. 70
84
参考例 5 化合物 7および 8の合成
参考例 4で得られた化合物 5および 6の混合物 （90mg， 47. 3 πιο 1 ) をそれぞれ分離することなく、 ゥシ血清アルブミン 8mgと共に HEPES 緩衝溶液 （ 50 mM, p H 6.0 ) 8. 1m lに溶解させ、 さらに Bov i n e k i d n e y由来 jS—ダルコサミニダ一ゼ （シグマアルドリッチ社製、 f r om Bov i ne k i dn ey) を 2.88 U加えた。 この溶液を 37 °Cで 18時 間静置した後凍結乾燥し、 残留物を HPLC (〇DSカラム、 2. 0 φ Χ 2 5 c m、 展開溶媒は 5 OmM酢酸アンモニゥム水溶液：メタノール =65 : 35、 流 速 3m l/mi n) で精製したところ、 1 17分後に化合物 7が、 127分後に 化合物 8が溶出した。 それぞれを取り分け、 凍結乾燥を行った。 続いて HPLC (ODSカラム、 2. Ο φΧ 25 cm、 展開溶媒は最初の 15分間が水、 16分 後から 30分後までは水：ァセトニトリル =10 ： 0から 85 : 15、 31分後 から 45分後までは水：ァセトニトリル = 85 ： 15から 80 ： 20になるよう にグラジェントを掛けた。 流速は 3.0m 1 /m i n) を用いて脱塩処理を行つ たところ、 目的とする化合物 7が 4 Omg、 化合物 8が 37mg得られた。
なお、 得られた化合物 7の物理的データは以下の通りである。
XH-NMR (D20, 30。C)
8. 01 (2 H, d， Fmo c), 7. 80 (2 H, d, Fmo c), 7. 56 (4 H， m, Fmo c), 5.22 (1H， s， Ma n 4 -H 1), 5. 08 ( 1 H, d， G l cNAc l— Hl)， 4. 94 ( 1 H, s, Man4， -HI), 4. 84 (1 H, s, Ma n 3 -H 1), 4.69 (1H， d, G 1 cNAc 2-H1), 4.6 ' 7 (1H， d, G 1 c NAc 5 -H 1), 4. 55 ( 1 H， d， G a 1 6 -H 1), 4. 33 (1 H, dd， Ma n 3 -H2), 4.20 ( 1 H, dd， Ma n 4-H 2), 4. 15 (1H， d d, Ma n 4 ' -H2), 2.97 ( 1 H, b dd, As N- j3 CH), 2. 76 (2H， dd， Ne uAc 7, 7， -H 3 e q), 2. 62 (1H， bdd, AsN-j3CH), 2. 15 ( 12 H, s X 4, -Ac), 1.7 9 (2H， dd, Ne uAc 7, 7 ' -H 3 a x) ; HRMS Ca l c d f o r C78H114N6Na048 [M + Na+] 1925.6562, f o und, 1925. 6539
また、 得られた化合物 8の物理的データは以下の通りである。
XH-NMR (D20, 30°C)
7. 99 (2H， d, Fmo c), 7. 79 (2 H, d, Fmo c), 7. 55 (4 H, m, Fmo c)， 5. 15 (1 H, S, Man4— Hl)， 5. 06 ( 1 H, d, G l cNAc l - HI), 4. 95 ( 1 H， s, Ma n 4 ' 一 Hl)， 4. 82 ( 1 H, s , Ma n 3 -H 1), 4. 69 ( 1 H, d, G 1 cNAc 2 -H 1), 4.6 7 (2H, d, G 1 cNAc 5, 5 ' -HI), 4. 53 (2H, d， G a 1 6 , 6， -HI), 4. 34 (1 H, d, Ma n 3 -H 2), 4. 27 ( 1 H， d， Ma n 4 ' -H2), 2. 97 (1H， bdd， As N-j8 CH2), 2.76 ( 1 H, dd， Ne uAc 7 ' -H 3 e q), 2. 61 (1 H, bdd， A s N- β CH 2), 2. 15 ( 12 H, s X 4, -Ac), 1. 79 ( 1 H, dd， Ne uAc 7 ' -H3 ax) ; HRMS Ca l c d f o r C 78H x ! 4N 6N a 048 [M + N a +] 1925.6562, f ound, 1925.6533
参考例 6 化合物 9の合成
参考例 5で得られた化合物 7 (3 Omg, 473 xmo 1 ) とゥシ血清アルブ ミン3mgをHEPES緩衝溶液 （50mM, ρΗ6.0) 6mlに溶解させ、 さらに J a c k B e an s由来 α—マンノシダ一ゼを 10U加えた。 この溶液 を 37 で 21時間静置した後凍結乾燥し、 続いて HPLC (ODSカラム、 2. 0 φ Χ 25 cm, 展開溶媒は最初の 15分間が水、 16分後から 30分後ま では水：ァセトニトリル = 10 ： 0から 85 ： 15、 31分後から 45分後まで は水：ァセトニトリル =85 ： 15から 80 ： 20になるようにグラジェントを 掛けた。 流速は 3.0m 1 /m i n) を用いて精製したところ、 目的とする化合 物 9が 2 Omg得られた。
なお、 得られた化合物 9の物理的デ一夕は以下の通りである。
XH-NMR (D20, 30。C)
8. 01 (2 H, d, Fmo c), 7. 80 (2 H, d, Fmo c), 7. 56 (4 H， m， Fmo c), 5.00 (1H， d, G l cNAc l— Hl)， 4. 95 ( 1 H， s , Ma n 4 ' -HI), 4. 84 (1H， s , Ma n 3 -H 1), 4. 67 (1 H, d, G 1 cNAc 2-H1), 4. 56 (1 H, d, G l cNAc 5 - H 1)， 4.44 (1H， d， G a 1 6 -H 1), 4. 11 ( 1 H, dd, Man4' -H2), 4. 07 (1H, dd, Man 3-H2), 2. 97 ( 1 H, b dd， A s N- j3 CH), 2. 76 ( 1 H， dd， Ne uAc 7 ' -H3 e q), 2. 62 (1 H, b dd, As N-j3 CH), 2. 1 5 (12H, s X 4, -Ac), 1. 7 9 (2H, dd, Ne uAc 7 ' -H 3 a x) ; HRMS C a l c d f o r C72H104N6NaO43 [M + N a+] 1 763. 60 34, f oun d, 1 7
63. 6074
参考例 7 化合物 10の合成
参考例 5で得られた化合物 8 (4 Omg, 630 mo l ) とゥシ血清アルブ ミン 5 gを HEPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH6. 0) 7. 8m lに溶解させ、 J a c k B e an s由来 α—マンノシダーゼを 38U加えた。 この溶液を 3
7 °Cで 63時間静置した後凍結乾燥し、 続いて HPLC (ODSカラム、 2. 0 Χ 25 cm, 展開溶媒は最初の 1 5分間が水、 1 6分後から 30分後までは 水：ァセトニトリル = 1 0 ： 0から 8 5 ： 1 5、 31分後から 45分後までは 8 5 : 1 5から 80 : 20になるようにグラジェントを掛けた。 流速は 3. 0ml /m i n) を用いて精製したところ、 目的とする化合物 10が 3 Omg得られた t なお、 得られた化合物 10の物理的データは以下の通りである。
— NMR (D20, 30。C)
8. 01 (2 H, d, Fmo c), 7. 80 (2 H, d， Fmo c), 7. 56 (4 H， m, Fmo c), 5. 23 ( 1 H, s, Ma n 4 -H 1), 5. 08 (1 H, d, G l cNAc l - Hl)， 4. 53 ( 1 H, d, Ga 1 6 -H 1), 4. 32 (1H, d d, Man 3 -H2), 4. 2 8 (1 H, dd， Ma n 4-H2), 2. 8 1 ( 1 H, bdd, A s N-/3 CH), 2. 76 (1 H, d d, Ne uAc 7 -H3 e q), 2. 59 (1H， b d d, AsN— /3CH), 2. 13 ( 1 2 H, s X 4, 一 Ac), 1. 80 (1H, dd， Ne uAc 7H3 ax) ; HRMS C a l c d f o r C72H104N6N a 043 [M + N a+] 1 763. 6034, f o u n d, 1763. 6041
参考例 8 化合物 1 1の合成
化合物 5 (28mg, 21. 3 πιο 1 ) とゥシ血清アルブミン 1. Omgを Η EPES緩衝溶液 （5 OmM, pH5. 0, 454 ^L) に溶解させ、 ノイラミ ニダーゼ （シグマアルドリッチ社製、 f r om V i b 1 i o Cho l e r a e, 198mU) を加えた。 この溶液を 37 °Cで 20時間静置した後、 HPLC 分析により反応終了を確認した。 反応溶液を HP LC (YMC P a c k e d Co l umn D-OD S- 5 S- 5 120 A ODS No. 202017 8、 20 X 250mm、 展開溶媒は 5 O mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニ トリル =80 ： 20、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に ODSカラム （コ スモシール 75C18— OPN、 1 5X 1 00 mm, 最初に H2〇を 5 OmL流 し、 次に 25%ァセ卜二トリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的と する化合物 11 (17mg, 収率 70%) が得られた。 得られた化合物の物理的 デ一夕は以下の通りである。
化合物 11の構造の簡略化したものを表 2に示す。
一 NMR (30°C)
57. 91 (d， 2H, J = 7. 5Hz， Fmo c), 7. 71 (d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 51 (dd, 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c), 7.43 (dd， 2H, J -7. 5Hz, Fmo c), 5. 12 (s , 1 H, Man 4-H- 1), 4. 99 (d, 1H， J = 9. 5Hz， G 1 c NA c 1— H— 1 ), 4. 92 (s， 1 H, Ma n 4 ' 一 H— 1)， 4.76 (s , 1 H, Ma n 3 -H — 1), 4. 58 (d, 1 H, J = 8. 0 H z , G 1 c NA c 2— H— 1 )， 4. 5 5 (d， 1H， J = 8.4Hz， G 1 c NAc 5 ' — H_l), 4.47 (d， 1 H, J = 7. 8Hz, G a 1 6 ' — H— 1), 4. 34 ( t , 1 H, Fmo c), 4.24 (b d, 1H, J = 1. 9Hz, Ma n 3 -H- 2), 4. 18 (b dd, 1 H, J = 1.4Hz, 3. 3Hz , Ma n 4-H- 2), 4. 11 (b dd, 1 H, J = 1. Hz , 3. 5Hz, Ma n 4 ' —H_2)， 2. 72 (b dd， 1 H， J =3. 0Hz, 15. 7Hz, As N-/3 CH), 2. 52 (b dd， 1 H， J - 8. 7Hz， 15.7Hz, As N— j3CH)， 2.06， 2. 05, 2. 04, 1. 89 (e a c s , e a c h 3H, Ac)； HRMS C a 1 c d f o r C75H110N6NaO45 [M + Na+] 1837. 6402, f ound 1837. 6471
参考例 9 化合物 12の合成
化合物 6 (2 Omg, 9.4 ^mo 1 ) とゥシ血清アルブミン 1.6mgを HE PE S緩衝溶液 （50mM， pH 5.0, 323 zL) に溶解させ、 ノィラミニ ダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om V i b l i o C h o 1 e r a e 14 lmU) を加えた。 この溶液を 37°Cで 18時間静置した後、 HPLC分析 により反応終了を確認した。 続いて HPLC (YMC P a c k e d Co l u mn D— ODS— 5 S— 5 120 A ODS No. 2020178、 2 0 X 250mm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリル =80 ： 20、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に ODSカラム （コスモシ —ル 75 C 18— OPN、 1 5 X 100 mm, 最初に H2〇を 5 OmL流し、 次 に 25%ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的とする化 合物 12 (13mg, 収率 76%) を得た。 得られた化合物の構造は1 H— NM Rが標品と一致したことから確認した。
化合物 12の構造の簡略化したものを表 2に示す。
参考例 10 化合物 13の合成
化合物 7 (45mg, 24 xmo 1 ) とゥシ血清アルブミン 1.7mgを H EPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH5. 0， 820 L) に溶解させ、 ノイラミ ニダ一ゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om V i b l i o Ch o l e r a e, 134mU) を加えた。 この溶液を 37 °Cで 14時間静置した後、 HPLC 分析により反応終了を確認した。 続いて、 反応溶液を HPLC (YMC P a c k e d Co l umn D-OD S - 5 S— 5 120 A ODS No. 2 020178、 20 X 250 mm, 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶 液：ァセトニトリル =80 : 20、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に OD Sカラム （コスモシール 7 5 C 1 8— OPN、 1 5 X 1 0 0mm、 最初に H20 を 5 0mL流し、 次に 2 5 %ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したと ころ、 目的とする化合物 1 3 ( 2 8 m g , 収率 7 4%) が得られた。 得られた化 合物の物理的データは以下の通りである。
化合物 1 3の構造の簡略化したものを表 2に示す。
iH— NMR (3 0。C)
5 7. 9 2 (d, 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c), 7. 7 1 (d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 5 1 (d d, 2H, J = 7. 5Hz , Fmo c), 7. 44 (d d, 2H， J = 7. 5Hz, Fmo c), 5. 1 0 (s , 1 H, Ma n 4— H— 1), 4. 9 9 (d, 1 H, J = 9. 5H z , G 1 c NA c 1— H— 1 )， 4. 9 2 (s , 1 H, Ma n 4 ' — H - 1)， 4. 7 6 (s , 1 H, Ma n 3 -H 一 1), 4. 5 8 (d, 2H， G 1 c NAc 2, 5 ' _H— 1)， 4. 47 (d, 1 H, J = 8. 0 H z , G a 1 6 ' 一 H - 1), 4. 3 5 ( t , 1 H, Fmo c), 4. 24 (b d, 1 H， J = 1. 9Hz , Ma n 3 -H- 2), 4. 1 1 (b s , 1 H, Ma n 4 ' — H— 2), 4. 0 7 (b s , 1 H, Ma n 4 -H- 2), 2. 7 2
(b d, 1 H， J = l 5. 5Hz , As N— i3 CH)， 2. 5 2 (b d d， 1 H, J = 8. 7Hz， 1 5. 5Hz， As N - i3 CH)， 2. 0 6, 2. 04， 1. 8 9
(e a c h s , e a c h 3H, Ac) ; HRMS C a l c d f o r C 67H97N5NaO40 [M + Na + 1 6 34. 56 0 8, f o u n d, 1 6 34. 5 5 64
参考例 1 1 化合物 1 4の合成
化合物 8 (47mg, 2 5 βπιο 1 ) とゥシ血清アルブミン 1. 9mgを HE PE S緩衝溶液 （5 0mM， ρΗ5. 0， 84 0 L) に溶解させ、 ノィラミニ ダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om V i b l i o C h o 1 e r a e , 3 6 9mU) を加えた。 この溶液を 3 7 °Cで 3 7時間静置した後、 HPLC分析 により反応終了を確認した。 反応溶液を凍結乾燥し、 続いて HPLC (YMC P a c k e d Co l umn D— ODS— 5 S— 5 120 A ODS N 0. 2020178、 20 X 250mm、 展開溶媒は 5 OmM酢酸アンモニゥム 水溶液：ァセトニトリル =80 : 20、 流速 4mLZm i n) で精製した。 更に ODSカラム （コスモシール 75 C 18一 OPN、 15X 100mm, 最初に H 20を 50mL流し、 次に 25%ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩し たところ、 目的とする化合物 14 (26mg, 収率 65%) を得た。 得られた化 合物の物理的データは以下の通りである。
化合物 14の構造の簡略化したものを表 2に示す。
一 NMR (30°C)
57. 92 (d, 2H, J = 7. 5Hz , Fmo c), 7. 71 (d, 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c), 7. 51 (dd， 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c),
7.43 (dd, 2H, J = 7. 5Hz， Fmo c), 5. 12 (s， 1 H, Man 4一 H— 1)， 4. 99 (d, 1 H, J = 9.4Hz, G 1 cNAc 1 -H- 1), 4. 91 (s, 1 H, Ma n 4 ' 一 H - 1), 4.77 (s， 1 H, Man 3— H - 1), 4. 57 (b d, 2 H, G 1 c NAc 2, 5 ' — H— l)， 4.46 (d， 1H， J = 7. 5Hz, G a 1 6 ' —H— 1)， . 34 (t， 3 H， Fmo c), 4. 24 (b s， 1H, Ma n 4 ' — H— 2)， 4. 19 (b s , 1 H， Man 4 — H— 2)， 2. 72 (b d， 1 H, J = 15. 5Hz， As N_jSCH)，
2. 52 (bdd, 1 H, J = 9. 2Hz, 15. 5Hz, As N - j3 CH)， 2. 06, 2.05, 1. 89 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac) ; HRMS
Ca l c d f o r C 67H97N5N a O40 [M + Na+] 1634. 5608, f ound, 1634. 5644
参考例 12 化合物 15の合成
化合物 9 (32mg, 18.4 /zmo 1 ) とゥシ血清アルブミン 2. 5mgを H EPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH5. 0, 713 L) に溶解させ、 ノイラミ ニダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om V i b l i o Ch o l e r a e, 1 34mU) を加えた。 この溶液を 3 7 °Cで 1 7時間静置した後、 HPL C 分析により反応終了を確認した。 続いて、 反応溶液を HPLC (YMC P a c k e d C o l umn D— OD S— 5 S— 5 1 2 0 A ODS No. 2 0 2 0 1 7 8、 2 0 X 2 5 0 mm, 展開溶媒は 5 0 mM酢酸アンモニゥム水溶 液：ァセトニトリル =8 0 : 2 0、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に OD Sカラム (コスモシール 7 5 C 1 8 -Ο ΡΝ 1 5 X 1 0 0 mm, 最初に H2〇 を 5 0mL流し、 次に 2 5 %ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したと ころ、 目的とする化合物 1 5 (1 3mg, 収率 5 2 %) が得られた。 得られた化 合物の物理的データは以下の通りである。
化合物 1 5の構造の簡略化したものを表 2に示す。
^-NMR (3 0°C)
6 7. 9 2 (d, 2H, J = 7. 5Hz , Fmo c), 7. 7 1 (d, 2 H， J = 7. 5 Hz , Fmo c), 7. 5 1 (d d, 2H, 1 = 7. 5Hz , Fmo c), 7. 44 (d d， 2H, J = 7. 5Hz , Fmo c), 5. 0 0 (d, 1 H, J = 9. 9 Hz, G 1 cNAc 1— H— 1), 4. 9 2 (s， 1 H, M a n 4 ' — H_ 1), 4. 7 5 (s , 1 H, Ma n 3 -H- 1), 4. 5 8 (d， 2 H, J = 7. 5 Hz , G 1 c NAc 2, 5 ' — H— 1), 4. 47 (d, 1 H， J = 7. 8Hz , G a 1 6 ' -H- 1), 4. 34 ( t , 1 H, Fmo c), 4. 1 0 (b d, 1 H, Ma n 3 -H- 2), 4. 0 7 (b s , 1 H, Ma n 4 ' — H— 2)， 2. 7 2 (b d d， 1 H， J = 1 5. 5Hz, A s N— i3 CH), 2. 5 2 (b d d, 1 H， J = 9. 2Hz , 1 5. 5Hz , A s N— i3 CH)， 2. 0 7, 2. 0 5, 1. 8 9 (e a c h s， e a c h 3 H, Ac) ； MS (F a b), C a l c d f o r C61H88N5035 [M + H+] 1 4 5 0. 5， f o u n d, 1 4 5 0. 3 参考例 1 3 化合物 1 6の合成
化合物 1 0 (2 8mg, 1 6 βπιο 1 ) とゥシ血清アルブミン 1. 7 mgを Η E PE S緩衝溶液 （5 0mM， pH5. 0, 6 24 xL) に溶解させ、 ノイラミ ニダーゼ （シグマアルドリッチ社製、 f r om V i b l i o Ch o l e r a e, 1 17mU) を加えた。 この溶液を 37 ^で 1 7時間静置した後、 HPLC 分析により反応終了を確認した。 続いて、 反応溶液を HPLC (YMC P a c k e d Co l umn D— ODS— 5 S - 5 1 20 A ODS No. 2 0201 78、 20 X 250 mm, 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶 液：ァセトニトリル =80 : 20、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に〇D Sカラム （コスモシール 75 C 1 8— OPN、 1 5 X 1 00mm。 最初に H20 を 50mL流し、 次に 25 %ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したと ころ、 目的とする化合物 16 (14. 6mg, 収率 68%) が得られた。 得られ た化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物 16の構造の簡略化したものを表 2に示す。
^-NMR (30。C)
δ 7. 92 (d, 2H， J = 7. 5 H z , Fmo c)， 7. 71 (d, 2H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 50 (dd， 2 H, J = 7. 5H z , Fmo c), 7.43 (d d, 2H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 5. 12 (s , 1 H, Man 4-H- 1), 4. 99 (d， 1 H, J = 9. 5H z , G 1 c NA c 1— H— 1 ), 4. 77 (s , 1H, Ma n 3 -H- 1), 4. 57 (d, 2H, J = 7. 2Hz , G 1 c NAc 2 - H— 1), 4.46 (d, 1 H， 1 = 7. 8Hz, G a 1 6 -H — 1)， 4. 34 ( t , 1 H, Fmo c), 4. 22 (b d, 1 H, J = 2. 7Hz , Ma n 3 -H- 2), 4. 1 9 (b， 1 H, Ma n 4-H- 2), 2. 72 (b dd, 1H， J 1 5. 5Hz , As N— j8 CH), 2. 52 (b dd, 1 H, J = 9. 8 Hz, 1 5. 5Hz, As N-i3 CH), 2. 05 (s， 6 H， Ac X 2), 1. 8 9 (s, 3H， Ac) ； MS (F a b), C a l c d f o r C61H88N503 5 [M + H + ] 1450. 5， f o und, 1450. 3
参考例 14 (5—ァセタミドー 3, 5， 7—トリデォキシー 7—フルオロー D_ グリセロー /3— D—ラクト一 2—ノヌロビラノシドニック アシッド （7—フ ルォロシアル酸）
5— Ac e t am i d e— 3, 5, 7— t r i d e o xy— 7— f 1 u o r o— D— g 1 y c e r o— jS— D— g a 1 a c t o— 2— nonu 1 o p y r a n o s i don i c a c i d 25の合成）
Figure imgf000040_0001
G 17 18
(1) 化合物 17の合成
無水酢酸 （60m l) に酢酸ナトリウム （5 g, 69mmo 1 ) を溶かし、 カロ 熱した後に D—ガラクトース （G) (10 g, 55mmo 1 ) を少しずつ加える。 2時間加熱還流した後 TLC (トルエン：酢酸ェチル =5 ： 1) にて反応が終了 したことを確認した。 反応溶液を室温に戻した後に、 氷水 300 c cに注ぐ。 ろ 過して沈殿物を集める。 沈殿物をエタノール （14ml) の溶かし再結晶を行い、 化合物 17を 9. 0 g (収率 41 %) 得た。
(2) 化合物 18の合成
化合物 17 (4. 3 g, 1 lmmo 1 ) を塩化メチレン （120ml) の溶か した後、 アルゴン気流下— 20°Cまで冷却した。 続いて、 反応溶液に四塩化スズ
(3. 1 g, 12 mm o 1 ) を加え 20分撹拌した後、 ベンジルアルコール （2. 3 g, 22mmo 1 ) を加え反応温度を室温に戻した。 TL C (へキサン：酢酸 ェチル =1 ： 1) で反応終了を確認後、 反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶 液に注ぎ、 塩化メチレンで抽出した。 塩化メチレン層を無水硫酸マグネシウムで 乾燥後、 ろ過、 減圧濃縮した。 残渣をデシケ一夕で乾燥後、 蒸留したメタノール
(80m l) に溶かしナトリウムメトキシド （431mg， 5. 5mmo 1 ) を 加えアルゴン気流下撹拌した。 TLC (酢酸ェチル：メタノール：水 = 10 ： 5 ： 1) で反応終了を確認した後、 陽イオン交換樹脂 I R— 120 ( + ) で中和 し反応を終了させた。 樹脂をろ過して取り除いた後、 濾液を減圧濃縮した。 残渣 をデシケ一夕で乾燥後、 ピリジン （44ml) に溶かし、 反応溶液を 0°Cに冷却 した。 反応溶液にトリメチルァセチルクロリド （4. 6 g, 38. 5 mm o 1 ) を 加えた後、 室温に戻しアルゴン気流下 1時間撹拌した。 反応終了を TLC (へキ サン：酢酸ェチル =2 ： 1) で確認し 0°Cに冷却後メタノールを加え反応を終了 させた。 反応溶液をそのまま減圧濃縮した後、 残渣を酢酸ェチルに溶かし飽和食 塩水溶液、 水で洗浄し無水硫酸マグネシウムで酢酸ェチルを乾燥させた。 硫酸マ グネシゥムをろ過して取り除いた後、 濾液を減圧濃縮した。 残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー （展開溶媒へキサン：酢酸ェチル =2 ： 1) で精製し化 合物 18 (2. 8 g, 収率 58%) を得た。
化合物 18 ―
Figure imgf000041_0001
19 20
(3) 化合物 19の合成
化合物 18 (20 Omg, 0.455mmo 1) をジクロロメタン （7. 8m 1 ) とピリジン （1. 3m 1 ) に溶かし、 無水クロ口酢酸 （155mg, 0. 91 mmo 1 ) を加えて、 アルゴン気流下一 15°Cで攪拌しながら 15分間反応させ た。 反応終了を確認後、 メタノール （5ml) で無水クロ口酢酸をクェンチし、 トルエンで 3回共沸しながら減圧濃縮した。 残渣を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食 塩水で洗浄した。 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、 濾過後濃縮した。 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （酢酸エヂル：へキサン = 1 ： 4) で精製し、 化合物 19 (収量 172mg， 収率 73. 5%) を得た。
XH-NMR (400MHz, CDC 13)
δ 7. 37 - 7. 29 (m, 5H, Ph)， 5. 39 (dd， 1 H， J 1( 2 = 8. 0Hz , J 2> 3 = 10.4Hz , H一 2)， 4. 89 (dd， 1 H, J 3， 4 = 3. 4Hz, H— 3), 4. 89， 4. 62 (2 d, 2 H, J = 12. 5Hz， OC H2P h) , 4. 53 (d， 1 H， H— 1), 4. 37 (dd， 1 H, J 6a, 6b = 1 1. 5Hz, J 6a, 5=6. 0Hz, H- 6 a), 4. 32 (d d, 1 H， J 6b 5 = 6. 6Hz， H- 6 b) , 4. 00 (m， 1 H, H-4) , 3. 92 (s， 2 H, COCH2C 1 ) , 3. 75 (d d, 1 H， H— 5)， 1. 23, 1. 1 9 〔2 s, 18H， COC (CH J 3〕
13C— NMR (400MHz, CDC ")
6 1 78. 33, 177. 57, 1 65. 92, (C =〇）， 1 36. 66,
128. 48, 128. 07, 127. 89 (Ph), 99. 16 (C— 1),
72. 82 (C— 3), 72. 35 (C一 5)， 70. 92 (C— 2), 70. 49 (O^H2P h) , 67. 29 (C一 4)， 62. 30 (C一 6)， 40. 40 (CO _C H 2 C 1 ) , 38. 95, 38. 80 [COC. (CH3) 3], 27. 14,
26. 98 〔COC (C.H3) 3〕
^-NMR, 13C - NMRは B r u k e rの AVANCE 400 (400M Hzと表記） で測定した。 溶媒が重クロ口ホルムの時は内部標準としてトリメチ ルシランを用いた。 その他の重溶媒を用いたときは溶媒ピークを基準とした。 化 学シフトは、 δ (p pm) で、 結合定数は J (Hz) 示した。 シリカゲルカラム クロマトグラフィ一には、 Me r c k S i l i c a g e l 60, 7 0 - 230 me s h又は 230— 400me s hを、 球状シリカゲルは関東化学社製の S i 1 i c a Ge l 60 (S ph e r i c a l ) を、 反応検出用 （以下 TL C) としては E. Me r k社製 DC— P 1 a t t e n K i e s e 1 g e 1 60 F 254 (A r t 1 , 057 1 5) を使用した。 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) のカラムはナカライテスク社製 COSMOS I L 5 C18-A R P a c k e d Co l umn ( 4. 6 X 1 50 mm) , を使用し、 分光蛍光 光度計は、 J AS CO社製の FP— 2 1 0 S p e c t r o f l uo r ome t e rを用いた。
(4) 化合物 20の合成
化合物 19 (30 Omg, 0. 583 mm o 1) をジクロロメタン （5. 8m 1)に溶かし、 アルゴン気流下一 15 °Cで攪拌しながらジェチルアミノスルファ 一トリフルオリド （DAST) を加えた。 DASTを加え 10分後室温に戻し 1 時間反応させた。 TLCで原料消失を確認し、 メタノール （3ml) で DAST をクェンチ後減圧濃縮した。 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （酢酸 ェチル：へキサン = 1 ： 6) で精製し化合物 20 (収量 21 lmg、 収率 7 0%) を得た。
一 NMR (400MHz, CDC 13)
δ 7. 37 - 7.27 (m, 5H, P h) , 5. 31 (ddd， 1 H, J 3, F= 1 4. 3Hz, J 3i 4=9. 69Hz, J 2, 3=9.63Hz, H— 3), 5.04
(dd， 1 H, J x, 2=7. 93Hz, H— 2), 4. 86 (d, 1H, J = 12. 2Hz, OCH2Ph)， 4. 60 (d， 1 H, H- 1), 4. 59 (d， 1 H, OCH2Ph), 4.44 (ddd, 1 H， J4, 5=9. 04Hz, J 4, F = 50. 6Hz, H— 4)， 4.43 (ddd, 1 H, J 6a, 6b= 12. 1Hz , j 6a 5=2.41Hz, J 6a, F=2. 23Hz， H- 6 a), 4.24 (ddd, 1H， J 6b,
Figure imgf000043_0001
1.28Hz, H— 6 b)， 3.93 (s, 2H, OCOCH2C 1), 3.75 (m, 1 H, H— 5), 1.25, 1. 18
〔2 s , 18H, OCOC (CH3) 3〕
13C— NMR (400MHz, CDC 13)
δ 177. 94, 117.43, 165. 88 (C = 0), 136. 34，
128. 55, 138. 23, 127. 92 (P h) , 98. 68 (C_ l),
87. 35 (d, J 4, F= 188. 62 H z , C— 4)， 72. 65 (d, J 2, F =
7. 96Hz, C一 2), 72. 05 (d， J 3, F= 20. 02 H z， C— 3)，
71.49 (d, J 5, F= 23. 09 Hz， C— 5), 70. 80 (OCH2Ph), 62. 12 (C— 6), 40. 30 (OCO H2C 1)， 3 8. 87 [OCOC. (CH3) 3 ], 27. 17, 26. 92 (OCOC ( H3) 3 〕
化合物 20一
Figure imgf000044_0001
21 22
(5) 化合物 21の合成
化合物 20 (625mg, 1. 2 lmmo 1 ) をメタノール (24. 2ml ) に 溶かし、 アルゴン気流下— 15°Cで攪拌しながら、 ナトリウムメトキシド （13. lmg, 0. 6 mm o 1 ) を加えた。 30分後 T L Cで原料消失を確認後陽ィォ ン交換樹脂 I R— 120 ( + ) で中和 （pH6— 7) し、 樹脂を濾過後減圧濃縮 した。 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （酢酸ェチル：へキサン = 1 : 4) で精製し化合物 21 (収量 395mg, 収率 74%) を得た。
XH-NMR (400MHz, CDC 13)
δ 7.38 - 7. 29 (m， 5H, Ph)， 5. 18 (ddd， 1 H, J 3> F = 14. 8Hz, J 3j 4= 9. 51 Hz , J 2 3= 8. 99 Hz， H— 3)， 4. 90 (d， 1H, J = 11.7 , OCH2P h) , 4.63 (d, 1 H， OCH2P h) , 4.47 (ddd， 1 H, J 5> 6 a= 2.43 H z , J 6a> F=2. 2Hz , H— 6 a) , 4.47 (d, 1 H, J 1> 2=7. 7Hz， H— 1), 4. 38 (ddd, 1 H, J 4i 5=8. 96Hz, J 3; 4=9. 67Hz, J 4, F= 50.8Hz , H- 4), 4. 23 (ddd, 1 H， J 6a, 6b- 12. 0Hz , J 6 b, 5 = 6.05 H z , J 6b> F=l. 26Hz, H— 6 b)， 3. 75 (m, 1 H, H— 5)， 3. 54 (m, 1H， J 2i
Figure imgf000044_0002
70Hz, H- 2), 1. 27, 1. 26 〔2 s， 18 H, O COC (CH3) 3〕
13C-NMR. (400MHz, CDC ")
6 178. 17, 177. 94 (C = 0) , 1 36. 54, 128. 54, 128. 17, 128. 12 (P h) , 101. 31 (C- 1) , 87.45 (d, J 4, F=l 87. 39 Hz， C-4), 74. 17 (d, J 3, F= 18. 88 H z， C— 3)， 72.45 (d， J 2， F=7. 56Hz， C— 2), 71.45 (d, J 5, F= 23. 26 Hz, C— 5)， 71. 09 (O H2Ph), 62.44 (C— 6), 38. 90, 38. 85 〔0 C O （CH3) 3 〕， 27. 14, 26. 99
COCOC (_ H3) 3 〕
( 6 ) 化合物 22の合成
ピリジン （22. 2 1 , 0. 274mmo 1 ) を溶かしたジクロロメタン （3 70 ^ 1) 溶液に 0°Cで無水トリフルォロメタンスルフォン酸 （46 1 , 0. 274mmo 1 ) を滴下し、 15分後、 化合物 21をジクロロメタン （ 1 m 1) に溶かしたものを 0°Cで滴下した。 TLCで原料消失を確認し、 反応混合物 をジクロロメタンで希釈した。 有機層を飽和重曹水、 飽和食塩水、 水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮した。 残渣を真空ポンプでさらに乾燥後ベン ゼン （1ml) に溶かし、 アルゴン気流下室温でアジ化ナトリウム （13mg， 0. 206mmo l)、 テトラアンモニゥムクロライド （57mg， 0. 206m mo 1 ) を加え 40°Cで反応させた。 2時間後 TLCで原料消失を確認後減圧濃 縮した。 残渣を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水、 水で洗浄し無水硫酸マグネシ ゥムで乾燥後濃縮した。 残渣をシリ力ゲルカラムク口マトグラフィー (酢酸エヂ ル：へキサン = 1 ： 4) で精製して化合物 22 (収量 30.4mg, 収率 9 5 %) を得た。
— NMR (400MHz , CDC 13)
δ 7. 39 - 7. 32 (m, 5 H, P h) , 4. 99 (ddd, 1 H, J 3, F = 13. 18Hz, J 3 4= 9. 27 Hz， J 2, 3= 3. 87 H z， H— 3) ,
4. 93 (d, 1 H, J = 12. 07Hz， OCH2P h) , 4. 67 (d, 1 H， J !, 2= 1. 18 H z , H— 1), 4. 63 (d， 1 H, OCH2P h) , 4. 51
(ddd, 1H， J 6a, 6b=l 1. 95Hz, J 6 a， 5 = 2. 54 H z， J 6a, F = 2. 08Hz, H - 6 a), 4. 23 (dd d， 1 H, J 6b， 5= 6. 14 H z , J 6b, F= 1. 14Hz, H— 6 b), 4. 08 (m, 1 H, H— 2), 3. 64 (m， 1 H, H— 5)， 1. 26 [2 s , 1 8 H， OCOC (CH3) 3 〕
13C— NMR (400MHz, CDC ")
6 1 78. 01, 177. 68 (C = 0)， 1 36. 06， 1 2 8. 63,
1 28. 3 1, 128. 14 (P h), 97. 25 (C— 1)， 8 5. 51 (d, J 4, F= 1 83. 97, C一 4)， 72. 0 1 (d, J 5； F= 23. 89, C— 5), 7 1. 7 3 (d, J 3, F= 18. 98， C一 3)
70. 57 (0_CH2P h) , 62.42 (C- 2 , C一 6), 39. 08, 38. 9 0 [OCOC. (CH3) 3 〕， 27. 1 8, 26. 95 [OCOC (C.H3) 3 〕
化合物 22 — -
Figure imgf000046_0001
23 24 .
(7) 化合物 23の合成
化合物 22 ( 1 8 Omg, 0. 3 87 mm o 1 ) をメタノ一ル （8m l ) に溶 かしナトリウムメトキシド （922mg， 9. 67mmo 1 ) を加え攪拌し 4 0°Cで反応させた。 4. 5時間後 TLCで 1スポットにまとまつたことを確認し 陽イオン交換樹脂 I R_ l 20 ( + ) で中和後、 濾過し濃縮した。 残渣をシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー （酢酸ェチル：へキサン = 1 ： 1) で精製し化合 物 23 (収量 105. 3mg， 収率 9 1. 6%) を得た。
XH-NMR (400MHz, CDC 13)，
δ 7. 40- 7. 31 (m, 5 Η, Ρ h) , 4. 96 (d， 1 Η, J = 1 2. 13 Hz, OCH P h) , 4. 7 1 (d, 1 H, J !, 2= 1. 33Hz, H— l), 4. 6 9 (d， 1 H, OCH2P h) , 4. 49 (dd d, 1 H， J4 F=51. 0 6Hz , J 4_ 5=9. 1 9Hz, J 3, 4=9. 20Hz, H— 4), 4. 02 (m， 1 H, H- 2) , 3. 9 3 (d d d d， 1 H, J 6 a, 6 b= 1 2. 1 9Hz , J 6 a 5 = 2. 3 1 H z , J 6 a, F=2. 3 2Hz , J 6 a， OH= 6. 2 0 H z , H一 6 a) , 3. 8 9 - 3. 7 7 (m, 2H, H - 3, H - 6 b)， 3. 3 9 (m， 1 H, H— 5) ,
13C - NMR (40 0MHz, CDC 1 3) ,
6 1 3 6. 3 9， 1 2 8. 6 2, 1 2 8. 24, 1 2 7. 8 3 (P h)， 9 8. 6 3 (C一 1)， 8 8. 1 9 (d, J 4; F= 1 7 8. 9 1 Hz , C— 4)， 7 3. 9 5 (d, J 5> F=2 5. 48Hz , C— 5) , 7 1. 1 8 (〇_^H2Ph)， 7 1. 1 6 (d, J 3> F= 1 9. 6 9Hz , C一 3) , 64. 48 (d, J 2； F= 8. 42H z ,
C一 2), 6 1. 3 9 (C- 6)
(8) 化合物 24の合成
化合物 2 3 (1 0 5mg, 0. 3 5 3mmo 1 ) をメタノール （7m l ) に溶 かし無水酢酸 （3 3 3 /^ 1， 3. 5 3mo 1 ) を加えた後、 アルゴン気流下で触 媒量の 1 0 % P d/Cを加え水素置換してから室温で攪拌した。 2時間後 TL Cで原料消失を確認し、 活性炭濾過後濃縮した。 残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフィ一 （酢酸ェチル：メタノール = 5 ： 1) で精製し化合物 24 (収量 5' 7mg, 収率 7 2 %) を得た。
^-NMR (40 0MHz , D2〇），
6 5. 2 3 (d d, 1 Η, J 1； 2= 2. 6 9Hz , J χ, F= 1. 44Η ζ , Η一 1 - ) , 4. 6 5 (d d d， 1 Η， J 4, F= 5 0. 94 Η ζ， J 3, 4= 9. 0 6H ζ, J 4, 5= 9. 5 8Ηζ , Η- 4 - ) , 4. 47 (m, 1 Η， Η— 2— α)， 4. 43 (d d d, 1 Η, J 3, F= 1 4. 2 8 Η ζ， J 2, 3 = 4. 9Hz， Η- 3 - ) , 4. 1 6 (m, 1Η， U- 5 - a) , 3. 9 5 (m， 2 Η, Η- 6 a- α, Η— 6 b—ひ）， 2. 1 4 (s， 3 Η, NHCOCH^- )
13C - NMR (40 0MHz, D20)，
δ 1 7 5. 2 7 (C =〇一 a)， 9 3. 46 (C一 1— a)， 8 8. 3 0 (d， J 4, F= 1 7 7. 0 0Hz， C-4- a) , 6 9. 9 1 (d, J 5， F= 24. 41 H z , C- 5 - α) , 6 7. 6 0 (d， J 3i F= 1 8. 74H z , C- 3 - a) ,
6 0. 3 6 (C一 6) , 54. 1 2 (d, J 2_ F= 8. 6 8 H z , C- 2 - a) , 2 2. 3 1 (NHCOC.H3- )
Figure imgf000048_0001
(9) 化合物 2 5の合成
化合物 24 (5 Omg, 0. 2 24mmo 1 ) ピルビン酸ナトリウム （1 2 3 mg, 1. 1 2mmo 1 ) と牛血清アルブミン （5mg) をリン酸ナトリウム緩 衝溶液 （l O OmM, pH7. 5, 3. 4 m 1 ) に溶かし、 その後シアル酸アルド ラーゼ （5 0 U) を加え室温で反応を開始した。 24時間後反応溶液を凍結乾燥 させ、 少量の水に溶かし陰イオン交換樹脂カラム （AG 1— X 8, 2 0 0 -4 0 Ome s h, f o rma t e f o r m) にのせた。 水 3 0 0 m 1流した後、 1Mギ酸で目的物を溶出させ減圧濃縮し、 ゲル濾過カラム （S e p h a d e x G_ 1 5， 水） で精製し化合物 2 5 (収量 4 Omg, 収率 5 8. 9 %) を得た。 !H-NMR (40 0MHz , D20),
δ 4. 6 1 (d d， 1 Η， J 7ι 8= 8. 9 7Hz , J 7, F= 4 5. 5 6 Η ζ , Η 一 7) , 4. 1 8 (d d， 1 Η， J 5, 6= 1 0. 6 3 Η ζ , J 6, F= 2 9. 8 6 Η ζ， Η- 6) , 4. 1 5 (m, 1 Η， Η— 4)， 4. 0 7 (m, 1 Η， Η— 8)， 4. 0 2 (d d， 1 Η, J 4; 5= 1 0. 1 ΟΗζ , Η— 5), 3. 9 0 (d d d， 1 Η, J 9 a 9 b= l 2. 1 8Hz , J 9 a, 8= 2. 7 7Hz , J 9 a_ F- 2. 8 6 H z , H- 9 a) , 3. 7 6 (d d d, 1 H， J 9 b, 8= 5. 3 3 H z , J 9 b, F= 2. 0 6 H z , H- 9 b) , 2. 40 (d d, 1 H, J 3 e q, 3 ax= 1 3. 0 0, J 3 etli 4 = 4. 8 8Hz， H- 3 e q) , 2. 1 5 (s， 3 H， OCOCH。）， 2. 0 0 (d d， 1 H, J 3aX; 4=11.70Hz, H- 3 a x) ,
13C - NMR (400MHz, D20) ,
δ 175. 17, 173. 68 (C = 0) , 96.01 (C- 1) , 89. 12 (d J 7, F= 179. 23Hz， C- 7) , 69.67 (d， J 6> F= 17.41 H z , C- 6) , 68. 31 (d， J 8i F= 26. 50 Hz , C一 8), 67. 26 (C_ 4)， 62. 70 (C- 6), 52. 17 (C- 5), 39. 19 (C一 3),
22. 61 (NHCO_CH3)，
参考例 15 (5—ァセタミドー 3， 5， 8—トリデォキシー 8—フルオロー D—グ リセロー) 3— D—ラクト一 2—ノヌロピラノシドニック アシッド (8—フルォ ロシアル酸）
5— Ac e t ami d e— 3， 5, 8— t r i d e oxy— 8— f 1 u o r o— D — l yc e r o— j3— D— a 1 a c t o— 2— n onu 1 opy r an o s i don i c a c i d 27の合成）
下記のスキームに従ってシアル酸 （26) から 5—ァセタミドー 3, 5, 8—ト リデォキシー 8—フルオロー D—グリセ口一 /3—D—ラクトー 2—ノヌロピラノ シドニック アシッド （27) を合成した。
Figure imgf000049_0001
8—フルォロシアル酸の NMRデータを以下に示す。 ^-NMR (400MHz, D20),
δ 4. 69 (dddd, 1 H, J 8, F=48.7Hz , J 8, 9a=5.0Hz , J 8i 9b=3. 5Hz, H- 8), 4. 03 (ddd， 1 H, J 4, 5= 10.0Hz , J 3ax，
Figure imgf000050_0001
7Hz, H-4), 3.95 (dd， 1 H， J 4, 5=10. 0Hz, J 5, 6=9. 9Hz, H- 5), 3. 94 (ddd, 1 H， J 6, 7二〜 0Hz， J 7i 8=6. 8Hz, J 7, F =14. 0Hz , H- 7), 3. 8 8 (ddd, 1 H, J 9a9b= 13. 3 H z， J 9a， 8=3. 5Hz， J 9b, F=2 8. OHz, H— 9 b), 3. 86 (d d, 1 H, J 5, 6 = 9. 9 H z， J 6, 7=〜 OHz, H一 6), 3. 72 (ddd, 1 H, J 9a, 9b= 5. 33 H z , J 9a, 8 = 5. OHz, J 9a， F=30. 6Hz， H一 9 a), 2. 28 (d d, 1H， J 3eq> 3ax= 13.00, J 3eQ， 4=4. 6Hz , H— 3 e q), 2. 05 (s , 3 H， A c)， 1. 87 (dd, 1H, J 3ax, 4=1 1. 1Hz, J 3 e Q, 3 ax= 13 · 00， H- 3 a x)
参考例 16 (5—ァセタミド— 3， 5, 9 -トリデォキシ— 9一フルオロー D—グ リセロー /3—D—ラクト一2—ノヌロビラノシドニック アシッド （9一フルォ ロシアル酸）
5— Ac e t am i de— 3, 5 , 9— t r i d e oxy— 9— f 1 u o r o— D — g l y c e r o— jS— D— g a 1 a c t o— 2— nonu l o py r an o s i d on i c a c i d 28の合成）
下記のスキームに従ってシアル酸 （26) から 5—ァセタミドー 3， 5， 9—ト リデォキシー 9一フルォロ一D—グリセ口一 i3—D—ラク卜 _ 2—ノヌロピラノ シドニック アシッド （28) を合成した。
Figure imgf000051_0001
参考例 1 7 CMP—シアル酸の 成
Figure imgf000051_0002
(a) (1) D owe x 5 0 -X8, Me OH, (2) Ac 20, 6 0 %HC 1 04；
(b) (1) 1 H-T e t r a z o 1 e, CH3CN， (2) t一 BuOOH, CH3CN， (3) DBU, CH3CN, (4) N aOMe, Me OH, H20 シアル酸 （0. 0 74mmo 1 ) を蒸留メタノール （ 3 m 1 ) に溶かし、 アル ゴン気流下室温で撹拌しながら D owe X— 5 0W— X 8 (6 5mg) を加え、 3時間反応させた。 反応終了を確認し、 濾過後減圧濃縮した。 残渣を無水酢酸 (2 0 0 /i 1 ) に溶かし、 一 2 0°Cで撹拌しながら無水酢酸： 6 0 %過塩素酸二 1 5 ： 1溶液 （ 2 2 1 ) を加え、 1 0°Cにて 40分反応させた。 反応終了を確 認後、 反応溶液を酢酸ェチルで希釈して、 .飽和重曹水で洗浄した。 有機層を無水 硫酸マグネシウムで乾燥し、 濾過後減圧濃縮して、 力ルポキシル基が保護された シアル酸 （2 9) を含む残渣を得た。 残渣と CMP— 5 ' —ホスホロアミダイト 誘導体 （3 0) (0. 2 3mmo 1 ) をベンゼンで別々の 3回共沸し、 蒸留したァ セトニトリル （1 0 0 z l ) にそれぞれ溶かし混ぜた。 アルゴン気流下氷水中で 撹拌しながら 1 H—テトラゾール （1.7mg, 0. 2 3mmo 1 ) を加えた。 5 分後に室温に戻し、 さらに 10分間反応させた。 反応終了を確認後、 溶液を酢酸 ェチルで希釈し、 飽和重曹水、 飽和食塩水で洗浄した。 有機層を無水硫酸マグネ シゥムで乾燥させ、 濾過後 30°C以下で濃縮した後さらにトルエンで 2回共沸し 水を取り除いた。 残渣に蒸留したァセトニトリル （400 l) を加え、 ァルゴ ン気流下氷冷しながら 2. 5Mの t— B uOOHトルエン溶液 （290 1 ) を 滴下した。 5分後に室温に戻し、 さらに 20分間撹拌した。 反応終了を確認後、 ジメチルスルフイド （53 /x l) を滴下し 10分間撹拌して t— BuOOHをク ェンチした。 その後、 DBU (18 x l) を滴下して 20分間室温で撹拌した。 反応終了を確認後、 メタノール （0. 67ml)、 水 （1. 35m l)、 ナトリウム メトキシド （36 Omg) を加え室温で 16時間反応させた。 反応終了を確認後 水で抽出し、 ジクロロメタンで洗浄した。 水層を 25 °C以下で 8m 1程度まで減 圧濃縮した。 この水溶液を S e ph ad e x G— 15 (1.8 φΧ 90 οπι) を用いるゲルカラムクロマトグラフィー （展開溶媒： 2 OmMアンモニア水、 流 速： 0. 3ml Zm i n) で精製し、 CMP—シアル酸を得た。
参考例 18 CMP— 7" —デォキシ— 7" —フルォロ—シアル酸の合成 シアル酸の代わりに化合物 （25) を用いた以外は参考例 7と同様にして CM P - 7" ーデォキシ— 7" —フルオローシアル酸を合成した。 NMRデータを以 下に示す。
XH-NMR (400MH ζ , 5 OmM ND4DCOs i n D20), δ 8.04 (d, 1 H, J 5, 6=7. 6Hz, H— 6), 6. 20 (d, 1 H, J 6_ 5=7. 6Hz, H- 5), 6.06 (d， 1 H， J , 2, = 4. 5 H z， H— 1，）， 4. 54 (dd， 1 H, J 7", 8" = 9. 5 H z， J 7", F= 45. 9 H z， H _7"), 4.42-4. 20 (m， 7H, H— 2，， H_3，， H— 4，， H - 5， a, H - 5， b， H - 6", H— 8"), 4. 16 (ddd， 1 H, J4", 3" eQ = 4. 7 Hz, J 4-, 3- ax= 1 1· 3 Hz , J4, 5二 10. 3Hz， H— 4"),
4. 03 (dd, 1H， J 5", 4" = J 5", 6" = 10. 3H z， H— 5")， 3. 91 (ddd, 1H， J 9" a, 9" b =12. 2 Hz, J 9" a, 8" = 2. 8 H z，
J 9" a, F=2. 8Hz， H一 9" a), 3. 75 (ddd, 1 H， J 9" a, 9" b = 12. 2Hz, J 9- b, 8" = 5.4Hz , J 9" b, F= 2. 1 H z , H一 9 " b), 2. 61 (dd， 1H， J 3- e q, 4" =4. 7 Hz, J gem= 13. 3Hz , H_ 3" e q), 2. 14 (s , 3H, Ac), 1. 76 (ddd, 1 H, J 3" ax, 4" = 1 1. 5Hz , J gem= 13. 3Hz, J 3" ax, P= 5 · 6 H z， H- 3" a x), 参考例 19 CMP- 8" —デォキシー 8" —フルオローシアル酸の合成
シアル酸の代わりに化合物 （27) を用いた以外は参考例 7と同様にして CM P - 8" —デォキシー 8" —フルオローシアル酸を合成した。 NMRデータを以 下に示す。
XH-NMR (400MHz, 50 mM ND4DCOs i n D2〇）， δ 8. 08 (d, 1H， J 5i 6=7.6Hz, H— 6), 6. 20 (d, 1 H， J 6； 5=7. 6 Hz , H— 5), 6. 09 (d, 1 H, J , 2， = 4. 1 H z ,
H— 1，）， 4. 90 (m， 1H， H - 8，，）， 4.42 (dd, 1 H, J 3，， 2， = J 3,, 4， =4. 9Hz, H- 3 '), 4.39 (dd， 1 H， J 2._ =4. 1 Hz , J, 2,, 3, =4. 9Hz, H- 2 '), 4.31 -4. 28 (m， 3 H， H— 4，， H —5， a, H— 5， b), 4. 15 (ddd, 1 H， J 4", 3" e q= 4.4 H z， J 4", s"
Figure imgf000053_0001
10. 5Hz , H- 4"), 4. 10- 3. 90 (m， 5H， H— 5"， H— 6"， H- 7", H— 9" a, H— 9" b), 2. 60 (dd, 1H, J 3" eq, 4" = 4.4Hz， J gem=13. 1Hz, H— 3" e q), 2. 13 (s， 3H, Ac), 1. 77 (ddd， 1 H, J 3" ax, 4" = 11. 5 H z, J
Figure imgf000053_0002
5Hz, H-3" ax),
参考例 20 CMP - 9" —デォキシー 9" 一フルオローシアル酸の合成
シアル酸の代わりに化合物 （28) を用いた以外は参考例 7と同様にして CM P - 9" ーデォキシ— 9" 一フルオローシアル酸を合成した。
実施例 1 Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシァ口 2, , 3糖鎖ァスパラギン （C 1— 1) および Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒 素を保護した 2種のモノシァロ 2， 3糖鎖ァスパラギン （(： 1ー2及び。 1ー 3) の合成
参考例 3で得られた Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したァシ ァロ糖鎖ァスパラギンにシアル酸転移酵素を用いて CMP—シアル酸を転移させ た。
シアル酸転移酵素としてひ 2, 3転移酵素である市販の R a t , R e c omb i n a n t由来のものを用いた。
参考例 3で得られたァシァ口 9糖 （2 Omg, 1 0. 1 βτηο 1 ) を 5 OmM 力コジル酸緩衝液 （pH=6. 0; 5m l ) に溶解させた後、 牛血清アルブミン (BSA, 5mg) を加える。 これに、 CMP—シアル酸 （26mg, 40.4 mo l)、 A 1 k a 1 i n e ph o s ph a t a s e (5 l， 1 25 u n i t ) を加え均一化する。 最後に、 α 2, 3— S i a l y l t r an s f e r a s e (CALB I OCHEM社製、 1 00 i l ) を加え 37 °Cで 48時間静置さ せる。 HP LCで反応をモニターしながら原料が目的量まで減少した時点で反応 を終了させ、 反応液をメンブランフィルタ一にて濾過する。 濾液を濃縮し液量を 減じた後、 HPLC分取カラムにて精製した （YMC— P a c k R&D OD S， D-OD S - 5 -A, 20 X 250mm, AN/25mM Ac ONH4 bu f f e r = 18/ 82, 7. 5m l / i n. , wav e l e n t h ; 2 74 nm) ところ、 25分後にジシァ口 ; I 1糖 化合物 （C 1— 1) が、 それぞ れ 30分後、 34分後に各モノシァロ 1 0糖 化合物 （C 1— 2) 及び （C 1— 3) が溶出してきた。 それぞれを分取した後、 脱塩処理、 次いで凍結乾燥を行う と、 各化合物 1、 2、 3がそれぞれ 0. 7mg (2. 7%)、 1. 9mg (8. 3%)、 3. 5mg (1 5. 3%) 得られた。 各化合物の NMRデータは以下のと おりである。
化合物 （C 1— 1) ^ NMR (40 OMHz , D20, 30。C， HOD = 4. 81) δ 7. 90 (d, 2H， Fmo c), 7. 69 ( d , 2 H, Fmo c), 7.49 (dd， 2H, Fmo c), 7.42 (d d, 2H， Fmo c)， 5. 10 (s, 1 H, Man4-Hl), 4.97 (d, 1 H, G l cNAc l— HI), 4. 91 (s , 1H， M a n 4 ' 一 H - 1), 4. 50 -4. 60 (m, 4H), 4. 34 (1H， Fmo c), 4. 24 (b s， 1 H， Ma n 3 -H2), 4. 18 (b s , 1 H, Man 4-H2), 4. 10 (m， 2H)， 2. 74 (m， 3 H, A s n— /3 CH, Ne uAc 7, 7 ' -H 3 e q), 2.40 - 2. 60 (m, 1 H, A s n 一 j3CH)， 2. 05, 2.03, 2. 02 (e a c h s, Ac), 1. 77 (d d, 2 H, Ne uAc 7, 7 ' -H 3 a x) .
化合物 （C I一 2)
αΗ NMR (400MHz , D20, 30°C, HOD = 4. 81 )
δ 7. 90 (d, 2 H, Fmo c), 7. 69 (d, 2H, Fmo c), 7.49
(dd， 2 H, Fmo c), 7.42 (dd， 2 H， Fmo c), 5. 10 ( s , 1 ，H， Ma n 4-H 1), 4.97 (d, 1 H, G l cNAc l— HI), 4. 90
(s, 1H， Man4' — H— 1), 4.47 -4. 60 (m), 4.43 (d, 1 H), 4. 32 ( 1 H, Fmo c), 4. 22 (b s， 2 H), 4. 17 (b s, 1 H， Man 4-H2), 4. 06-4. 13 (m, 2 H), 2. 72 (m, 2 H, A s n - β CH, Ne uAc 7 -H 3 e q), 2. 50 - 2. 60 (m， 1 H, A s n- β CH), 2. 05, 2. 03， 2.01 (e a c h s, Ac), 1.77 (dd， 1 H, N e uA c 7 -H 3 a x) .
化合物 （C I一 3)
1H NMR (400MHz , D2〇， 30。C， HOD = 4. 81)
δ 7. 90 (d, 2H, Fmo c), 7. 69 (d， 2H, Fmo c), 7.49 (dd, 2H, Fmo c), 7.42 (dd， 2 H, Fmo c), 5. 10 (s， 1 H， Man4-Hl), 4. 97 (d， 1 H, G l cNAc l— HI), 4. 90 (s， 1H， Ma n 4 ' — H - 1), 4. 50— 4. 60 (m)， 4. 45 (d, ] H)， 4. 33 (1H， Fmo c), 4. 22 (m， 2H), 4. 17 (b s， 1 H Man 4-H2), 4. 09 (m， 2H), 2. 74 (m， 2 H, As n— /3 CH Ne uAc 7 -H3 e q), 2. 45- 2. 60 (m, 1 H, As n- β CH), 2. 05, 2. 03, 2. 02, 2. 00 (e a c h s , Ac), 1. 77 (d d 1 H， Ne uAc 7 -H 3 a x)
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β MMan a
、6
Man)3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→^Asn-Fmoc
NeuAc a 2→-3Gal /3 l-*-4GlcNAc β l→-2Man a Γ
(C I一 1)
l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
NeuAc a 2→-3G
Figure imgf000056_0001
al j31→-4G1 cNAc β l→-2Man a
(C I— 2)
NeuAc 2→-3Gal /3 l→-4GlcNAc β l→-2Man
l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man
Figure imgf000056_0002
(C 1一 3)
実施例 2
実施例 1で得られた化合物 （C 1— 2) (2mg, 0. 88 μ,πιο 1 ) とゥシ血 清アルブミン lmgを HEPES緩衝溶液 （5 OmM, pH5. 0) 1 00 ^ 1 に溶解させ、 さらに /3—ガラクトシダーゼ （生化学工業社製、 f r om J a c k B e an s, 5 L, l O OmU) を加えた。 この溶液を 37 °Cで 1 5時間 静置した後、 メンプランフィルターでろ過を行った。 ろ液を HPLC (ODS力 ラム、 2. 0 ci)X 25 cm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセ トニトリル =82 : 1 8、 流速 7. 5m l Zm i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次いで凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 1に溶解させ ODS—力ラムクロ マトグラフィー （コスモシール 7 5 C18— o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次 いで 25 %ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用いて脱塩処理を行ったとこ ろ、 目的とする化合物 （C 2) が 0. 5 /X g得られた。 NMRデータは以下のと おりである。
NMR (400MHz, D20， 30。C， HOD = 4. 81 )
δ 7. 90 (d, 2H, Fmo c), 7. 69 (d, 2 H, Fmo c), 7.49
(d d, 2H, Fmo c), 7.42 (d d, 2 H, Fmo c), 5. 10 (s , 1 H, Ma n 4-H1), 4. 98 (d, 1 H, G l cNAc l— Hl)， 4. 90
(s , 1H， Man4' — H— 1), 4. 50— 4. 60 (m), 4. 33 ( 1 H, Fmo c), 4. 22 (m, 2 H), 4. 1 7 (b s， 1 H, M a n 4 - H 2 ) , 4. 10 (m， 2H), 2. 74 (m, 2 H, As n- β CH, Ne uAc 7 -H 3 e q), 2. 45 - 2. 60 (m, 1 H， A s n - |S CH), 2. 05， 2. 03, 2. 0 1 (e a c h s, Ac), 1. 78 (dd， 1 H， Ne u Ac 7 -H3 a x)
GlcNAcj31→-2Mano!lv
、6
3Mani3 l→-4GlcNAc 3 l→^4GlcNAc→^Asn-Fmoc
NeuAc 2→-3Gal j3 l→-4GlcNAc β l-*-2Man
(C 2)
実施例 3
実施例 2で得られた化合物 （C 2) (1. 8mg, 0. 86 n o 1 ) を、 ゥシ 血清アルブミン lmgと共に HEPES緩衝溶液 （50mM， pH5. 0) 9 0 H 1に溶解させ、 さらに N—ァセチル- 一ダルコサミニダーゼ （シグマアルド リッチ社製、 f r om J a c k B e an s) を 4 z l (250mU) 加えた。 この溶液を 37 °Cで 24時間静置した後、 メンブランフィルターでろ過を行つた。 ろ液を HPLC (ODSカラム、 2. 0 φΧ 25 οπι、 展開溶媒は 50mM酢酸 アンモニゥム水溶液：ァセトニトリル =82 : 18、 流速 7. 5ml /m i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次いで凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 /21に 溶解させ OD S—力ラムクロマトグラフィー （コスモシール 75 C18— o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次いで 25%ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用 いて脱塩処理を行ったところ、 目的とする化合物 （C 3) が 0. 9 /xg得られた。 XH NMR (400MHz, D20, 30°C, HOD = 4. 81)
δ 8. 01 (d, 2H, J = 7. 6 , Fmo c), 7. 80 (d， 2H, J = 7. 6, Fmo c), 7.60 (dd, 2 H, 1 = 7.6, Fmo c), 7. 53 (d d, 2H, J = 7. 6 , Fmo c), 5. 21 (s, 1 H, Man 4-H1), 5. 09 (d， 1H， J = 8. 8, G 1 cNAc 1 -HI), 5.00 (s， 1 H, Man 4， 一 H_ l), 4. 87 (s， 1 H), 4. 60 -4. 78 (m, 5H), 4.40 — 4. 50 (bm， 2H), 4. 34 (s， 1H)， 4. 28 (b s， 1 H， Man 4-H 2), 4. 20 (d d, 1 H, J a = 3.0, J b = 9.9), 2. 80- 2. 95 (m， 2H, As n— /3 CH， N e u A c 7 - H 3 e q ) , 2. 65- 2. 75 (m, 1 H, As n-/3 CH), 2. 16, 2. 14, 2. 12 (e a c h s , Ac x 3), 1. 98 (s , 3H, Ac), 1.89 (dd, 1 H, J a = 12. 1, J b=1 1. 9, Ne uAc 7-H3 ax) .
Man
、6
Manj31→-4GlcNAc j3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
(C 3)
実施例 4
実施例 3で得られた化合物 （C 3) (0. 8mg, 0.42 //mo 1 ) とゥシ血 清ァルブミン1111 を11£?£3緩衝溶液 （501]1：^， pH 5. 0) 50 lに 溶解させ、 ひ一マンノシダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om J a c k Be an s) 30 1 (2. 9 U) 加えた。 この溶液を 37 °Cで 63時間静置し た後、 メンブランフィル夕一でろ過を行った。 ろ液を HPLC (ODSカラム、 2.0 d)X 25 cm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニト リル =80 ： 20、 流速 7. 5m lZm i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次い で凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 1に溶解させ〇DS—力ラムクロマト グラフィー （コスモシール 75 C18—o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次いで 25 %ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用いて脱塩処理を行ったところ、 目的とする化合物 （C4) が 0.6 g得られた。
'Η NMR (400MHz, D2〇， 30 o C, HOD = 4. 81)
δ 8. 00 (d, 2 H, J = 7. 2, Fmo c), 7. 79 (d， 2H, J = 7.2， Fmo c), 7. 59 (d d, 2H, J = 7. 2, Fmo c), 7. 52 (d d， 2H, J = 7. 2, Fmo c), 5. 21 (s， 1 H, Man4-Hl), 5.09 (d, 1 H, J = 10.0, G l cNAc l— Hl)， 4.60-4. 75 (m，）， 4.40— 4. 50 (m， 2H), 4. 32 (bd, 1 H, J = 2. 3), 4.28 (b s , 1 H), 4. 22 (bdd, 1 H, J a = 9. 7， J b = 2. 8, Ma n 4-H2), 2. 80 - 2.95 (m, 2H, A s n - |S CH, Ne uAc
7 -H 3 e q), 2. 60 - 2.75 (m， 1 H, As n - j3CH), 2. 14, 2. 14， 2. 12 (e a c h s , Ac x 3), 1. 98 (s , 3 H, Ac), 1. 8
8 (dd， 1 H, J a= 12. 1 , J b= 12. 0, Ne uAc 7 -H3 a x) .
3Mani3 l→-4GlcNAc /3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
NeuAc a 2-^3Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man
(C4)
実施例 5
実施例 1で得られた化合物 （C 1— 3) (lmg, 0.44 xmo l) とゥシ血 清アルブミン lmgを HEPE S緩衝溶液 （50mM， pH 5. 0) 50 /i lに 溶解させ、 さらに jS—ガラクトシダーゼ （生化学工業社製、 f r om J a c k B e an s, 5 ^L, l O OmU) を加えた。 この溶液を 37 °Cで 15時間静置 した後、 メンブランフィルターでろ過を行った。 ろ液を HPLC (OD.Sカラム、 2. 0 (i)X25 cm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニト リル =82 ： 18、 流速 7. 5ml Zm i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次い で凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 X 1に溶解させ ODS—力ラムクロマト グラフィー （コスモシール 75 C18— o p n、 最初に'水で洗浄を行い、 次いで 25 %ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用いて脱塩処理を行ったところ、 目的とする化合物 （C 5) が 0. 3 xg得られた。
XH NMR (400MHz , D20, 30°C, HOD = 4. 81 )
δ 8. 01 (d, 2H, J = 7. 2 , Fmo c), 7. 81 (d, 2H， J = 7. 2, Fmo c), 7. 60 (dd, 2 H, J = 7. 2, Fmo c), 7. 53 (d d, 2 H, J = 7. 2 , Fmo c), 5. 21 ( s , 1 H, M a n 4-H 1 ), 5. 09 (d, 1 H, J = 9. 6, G l cNAc l— Hl)， 5. 02 (s , 1 H, Ma n 4 ' — H— 1), 4. 55-4. 70 (m), 4.44 ( 1 H, Fmo c), 4. 30—4. 38 (bm， 2H), 4. 28 (b d, 1 H， Man4-H2), 4. 17-4. 25 (m, 2 H), 2.78 - 2. 95 (m， 2 H, A s n - β ΟΗ, Ne uAc 7 -H3 e q), 2. 55 - 2. 70 (m, 1 H, A s n - j3 CH), 2. 16, 2. 15, 2. 14, 2. 12 (e a c h s , 12 H, Ac x 4),
1. 98 (s， 3H, Ac), 1. 89 (dd, 1 H， J a= 12. 2, J b = 12. 0, Ne uAc 7 -H 3 a x) .
NeuAc 2→-3Gal β
Figure imgf000060_0001
(C 5) 実施例 6 ' 実施例 5で得られた化合物 （C 5) (1. Omg, 0. 48 xmo 1 ) を、 ゥシ 血清アルブミン lmgと共に HEPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH5. 0) 5 0 1に溶解させ、 さらに Ν—ァセチルー /3—ダルコサミニダーゼ （シグマアルド リッチ社製、 f r om J a c k B e a n s) を 4 /z l (2 5 0mU) 加えた。 この溶液を 3 7°Cで 2 2時間静置した後、 メンブランフィルターでろ過を行った。 ろ液を HPLC (OD Sカラム、 2. 0 X 2 5 cm, 展開溶媒は 5 0 mM酢酸 アンモニゥム水溶液：ァセトニトリル = 8 2 ： 1 8、 流速 7. 5m l Zm i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次いで凍結乾燥を行った。 残留物を水 20 0 1に 溶解させ OD S—力ラムクロマトグラフィー （コスモシール 7 5 C18—o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次いで 2 5 %ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用 いて脱塩処理を行ったところ、 目的とする化合物 （C 6) が 0. 6 /z g得られた。 JH NMR (40 0MHz , D20, 3 0。C， HOD = 4. 8 1)
δ 8. 0 1 (d, 2H， J = 7. 6 , Fmo c), 7. 8 0 (d, 2H, J = 7. 6 , Fmo c), 7. 6 0 (d d, 2 H, J - 7. 6, Fmo c), 7. 5 3 (d d, 2H， J = 7. 6, Fmo c), 5. 1 9 (s , 1 H， Ma n 4-H 1), 5. 0 9 (d, 1 H, J = 9. 2, G l c NAc l - H I), 5. 02 (s , 1 H, Ma n 4 ' — H - 1), .4. 8 5 (s , 1 H) 4. 5 8 -4. 7 5 (m， 5H)， 4. 3 8 -4. 48 (m， 2 H, Fmo c), 4. 40 (b d, J =2. 4， 1 H), 4. 1 8 -4. 25 (m, 2 H), 4. 1 5 (m， 1 H), 2. 8 0 - 2. 9 5 (m， 2H, As n— j8 CH, N e u A c 7 -H 3 e q), 2. 6 5 - 2. 7 5 (m， 1 H, As n- β ΟΗ), 2. 1 6, 2. 1 3， 2. 1 2 (e a c h s , 9 H， Ac x 3), 1. 9 8 (s， 3H， Ac), 1. 8 9 (d d, 1 H， J a=- 1 2. 2, J b = 1 2. 0, Ne u Ac 7 -H 3 a x) . NeuAc o; 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l+
i31→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Figure imgf000062_0001
(C 6)
実施例 7
実施例 6で得られた化合物 （C 6) (1. Omg', 0. 53 ^mo 1 ) とゥシ血 清アルブミン lmgを HEPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH 5. 0) 50 1に 溶解させ、 一マンノシダーゼ （シグマアルドリッチ社製、 f r om J a c k B e an s) 10 1 (0. 9U) 加えた。 この溶液を 37 °Cで 20時間静置し た後、 メンブランフィルターでろ過を行った。 ろ液を HPLC (ODSカラム、 2. 0 φ X 25 c mゝ 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニト リル =80 ： 20、 流速 7. 5m l Zm i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次い で凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 /2 1に溶解させ ODS—カラムクロマト グラフィー （コスモ.シール 75 C18— o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次いで 2 5%ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用いて脱塩処理を行ったところ、 目的とする化合物 （C 7) が 0. 5 g得られた。
αΗ NMR (40 OMH z , D20， 30°C, HOD = 4. 8 1)
δ 8. 01 (d， 2H, J = 7. 6, Fmo c), 7. 81 (d, 2 H, J = 7. 6, Fmo c), 7. 60 (d d, 2 H， J = 7. 2, Fmo c), 7. 53 (d d, 2H, J = 7. 6, Fmo c), 5. 09 (d, 1 H, J = 9. 2, G 1 c NA c 1 -H 1), 5. 0 1 (s , 1 H, Man4' 一 H— 1)， 4. 84 (s， 1 H), 4. 55-4. 70 (m， 5 H), 4. 44 ( t , 1 H, J = 6. 0, Fmo c), 4. 30— 4. 38 (b s, 1 H), 4. 1 5— 4. 25 (m, 2H), 4. 17 (s， 1 H), 2. 80 - 2. 95 (m, 2 H， A s n - jS CH, Ne uAc 7 -H3 e q), 2. 55 - 2. 70 (m， 1 H, A s n - j3 CH), 2. 16, 2. 13, 2. 1 2 (e a c h s, Ac x 3), 1. 98 (s， 3 H, Ac) 1. 89 (d d， 1 H, J a= 12. 2, J b= 1 2. 3, Ne uAc 7 -H3 a x) . NeuAca;2→-3Gal β l→-4GlcNAc j3 l→-2Man k
、6
Mani31→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
(C 7)
実施例 7 A
Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシァ口 （a 2， 6) ( 2, 3) 糖鎖ァスパラギンの合成
参考例 3で得られた Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したァシ ァロ糖鎖ァスパラギン （化合物 2) にシアル酸転移酵素を用いて CMP—シアル 酸を転移させた。
シアル酸転移酵素として 2, 3転移酵素である市販の R a t , R e c omb i n a n t由来のものを用いた。
参考例 3で得られた化合物 2 (1. 7mg, 0. 7 5 ^mo 1 ) を 5 0mMカコ ジル酸緩衝液 （pH=5. 0, 8 5 1 ) に溶解させた後、 牛血清アルブミン
(B SA, lmg) を加える。 これに、 CMP—シアル酸 （4. 8mg, 7. 5 mo l )、 A l k a l i n e p h o s p h a t a s e 丄 l , 7 5 u n i t ) を加え均一化する。 最後に、 α 2, 3 -S i a l y l t r a n s f e r a s e (CALB I OCHEM社製、 7 5 1 , 3 4mU) を加ぇ3 7でで3. 5時 間静置させる。 HP LCで反応をモニターしながら原料が消失した時点で反応を 終了させ、 反応液をメンブランフィル夕一にて濾過する。 濾液を濃縮し液量を減 じた後、 HPL C分取カラムにて精製した （YMC— P a c k R&D OD S， D-OD S - 5 - A, 2 0 X 2 5 0mm, AN/2 5mM Ac ONH4 b u f f e r = 1 8/8 2, 7. 5m l Zm i n. , wa v e l e n g t h ; 2 74 nm) ところ、 2 5分後に化合物 （C 7A) が溶出してきた。 分取した後、 脱塩 処理、 次いで凍結乾燥を行うと、 化合物 （C 7A) が 1. 3mg (6 7. 8 %) 得 られた。 化合物の NMRデータは以下のとおりである。 ^ NMR (40 0MHz , D20， 3 0°C, HOD = 4. 8 1)
δ 8. 0 0 (d, 2H, J = 7. 2, Fmo c), 7. 7 9 (d, 2H, J二 7. 2， Fmo c), 7. 6 0 (d d, 2 H, J = 7. 2, Fmo c), 7. 5 2 (d d, 2H， J = 7. 2, Fmo c), 5. 2 1 (s , 1 H, Ma n 4 -H 1 ), 5. 0 9 (d， 1 H, J = 8. 8, G l c NAc l - H l)， 5. 0 3 ( s , 1 H, Ma n 4， 一 H— 1), 4. 8 6 (s， 1 H), 4. 5 8— 4. 7 2 (m， 5H), 4. 54 (d， 1 H, J = 8. 0), 4. 3 8—4. 48 (m, 2 H) 4. 34 (b s 1H), 4. 2 8 (b s , 1 H), 4. 1 5— 4. 2 5 (m， 2H), 2. 8 0 - 2. 8 6 (d d, 1 H， J a = 4. 4, J b= 1 2. 4, Ne uAc 7 -H3 e q), 2. 7 3 - 2. 8 3 (m， d d, 3H, J a = 4. 4, J b= 1 2. 4, A s n - j3 CH， N e uAc 7 -H 3 e q), 2. 6 0 - 2. 7 2 (m, 1 H, A s n - j8 C H), 2. 1 6, 2. 1 5, 2. 1 4， 2. 1 2 (e a c h s , Ac x 5), 1. 9 8 (s， 3H, Ac), 1. 8 9 (d d, 1 H, J a= 1 2. 4, J b = 1 2. 0, Ne uAc 7 -H3 a x), 1. 8 1 (d d， 1 H, J a= 1 2. 4, J b= 1 2. 0 , Ne uAc 7 -H3 a x) .
NeuAc 2-^6Gal j3 l→-4GlcNAc j3 l→-2Man a
ManiS 1→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc j3 l-*-2Man Γ 実施例 7 B
Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシァ口 （《 2， 3) ( 2, 6) 糖鎖ァスパラギンの合成
参考例 3で得られた Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したァシ ァロ糖鎖ァスパラギン （化合物 3) にシアル酸転移酵素を用いて CMP—シアル 酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてひ 2， 3転移酵素である市販の R a t , R e c omb i n a n t由来のものを用いた。 参考例 3で得られた化合物 3 (1. 2mg, 0. 5 3 nmo 1 ) を 5 0mMカコ ジル酸緩衝液 （pH= 5. 0， 6 0 il l ) に溶解させた後、 牛血清アルブミン
(B SA, lmg) を加える。 これに、 CMP—シアル酸 （3. 4mg， 5. 3 mo l)、 A l k a l i n e p h o s p h a t a s e (1 ^ 1 , 7 5 u n i t ) を加え均一化する。 最後に、 α 2， 3— S i a l y l t r a n s f e r a s e (CALB I OCHEM社製、 5 2. 9 1 , 24mU) を加え 3 7°Cで 3時 間静置させる。 HPLCで反応をモニターしながら原料が全て消費された時点で 反応を終了させ、 反応液をメンブランフィルタ一にて濾過する。 濾液を濃縮し液 量を減じた後、 HP LC分取カラムにて精製した （YMC— P a c k R&D OD S， D-ODS - 5 -A, 2 0 X 2 5 0mm, AN/2 5 mM A c ONH 4 b u f f e r = 1 8/8 2, 7. 5m l /m i n. , wa v e 1 e n g t h ； 2 74 nm) ところ、 2 3分後に化合物 （C 7 B) が溶出してきた。 分取し た後、 脱塩処理、 次いで凍結乾燥を行うと、 各化合物 （C 7 B) が 1. lmg
(8 1. 2 %) 得られた。 各化合物の NMRデータは以下のとおりである。
aH NMR (40 0MHz , D20, 3 0°C, HOD = 4. 8 1 )
δ 8. 0 0 (d， 2H, J = 7. 6, Fmo c), 7. 7 9 (d, 2H, J = 7. 6, Fmo c), 7. 5 9 (d d, 2H， J = 7. 6, Fmo c), 7. 5 1 (d d， 2 H, J = 7. 6, Fmo c), 5. 2 1 (s， 1 H， M a n 4 -H 1 ), 5. 0 8 (d, 1 H， J = 1 0. 0， G l c NAc l— H I), 5. 00 (s， 1 H: Ma n 4 ' _H— 1), 4. 84 (s , 1 H), 4. 6 0— 4. 7 2 (m, 5H), 4. 5 2 (d, 1 H, J = 7. 6), 4. 3 5 -4. 45 (m, 2 H), 4. 3 3 (b s , 1 H), 4. 2 7 (b s， 1 H), 4. 1 5 - 4. 2 5 (m, 2H)， 2. 8 0 - 2. 8 6 (d d, 1 H， J a-4. 8, J b = 1 2. 4, Ne uAc 7 -H3 e q)， 2. 7 3 - 2. 8 3 (b s , d d, 3 H， J a = 4. 8, J b= 1 2. 4, As n-/3 CH, Ne uAc 7 -H 3 e q), 2. 6 0 - 2. 7 2 (m， 1 H， As n-j3 CH), 2. 1 5, 2. 1 2, 2. 1 0 (e a c h s， Ac x 5), 1. 97 (s , 3H， Ac), 1. 88 (dd， 1 H, J a= 12.4, J b = 12.4, Ne uAc 7 -H3 a x), 1. 80 (d d, 1H， J a= 12.4, J b= 12.4, NeuAc 7-H3 ax) .
NeuAc 2→-3Gal β l-^4GlcNAc β l→-2Man a lv
6
3Mani3 l→-4GlcNAc /3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
NeuAc 2-*- 6Gal β 1+4G1 cNAc j3 l→-2Man a 実施例 8 Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を葆護したジ 7" —デォキ シー 7" —フルオローシァロ α 2， 3糖鎖ァスパラギン （C 8— 1) および Fm o c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護した 2種のモノ 7" —デォキシー 7" 一フルオローシァロ α 2, 3糖鎖ァスパラギン （C 8— 2及び C 8-3) の 合成
参考例 8で得られた CMP— 7" —デォキシ— 7" —フルォロ—シアル酸を用 いた以外は実施例 1と同様にして下記に示す Fmo c基でァスパラギンのァミノ 基窒素を保護したジ 7" —デォキシ— 7" —フルオローシァロ α 2, 3糖鎖ァス パラギンおよび Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護した 2種のモノ 7" ーデォキシ—7" —フルオローシァロ α 2, 3糖鎖ァスパラギンを得た。
7FNeuAc a2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a l
6
Man/3 l→-4GlcNAci3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
7FNeuAc a2→-3Gal/3 l→-4GlcNAc β l→-2Man a Γ
(C 8— 1)
Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man
、6
Man β l+4GIcNAc l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
7FNeuAc a2→-3Galj3 l→-4GlcNAc β l→-2Man
(C 8 - 2) 7FNeuAc a2→-3Gal j3 l+4GlcNAc β l→-2Man a
、6
3Manj3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal j3 l→-4GlcNAc β MMan a
(C 8— 3)
実施例 9
実施例 2の化合物 （C 1一 2) の代りに実施例 8で得られた化合物 （C 8— 2) を使用した以外は実施例 2と同様にして目的とする化合物 （C 9) が得られ た。
GlcNAcj81→-2Mano;lv 、
Man β l→-4GlcNAc j3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
7FNeuAc o;2-*-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a
(C 9)
実施例 10
実施例 3の化合物 （C 2) の代りに実施例 9で得られた化合物 （C 9) を使用 した以外は実施例 3と同様にして目的とする化合物 （C 1 0) が得られた。
Man a
6
Mani3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
7FNeuAc a2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man
(C 1 0)
実施例 11
実施例 4の化合物 （C 3) の代りに実施例 1 0で得られた化合物 （C 1 0) を 使用した以外は実施例 4と同様にして目的とする化合物 （C 1 1) が得られた。 3Mani3 l→-4GlcNAc 3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fioc 7FNeuAc o;2→-3Gal/S】+4GlcNAc β MMan a '
(C 1 1)
実施例 12
実施例 5の化合物 （C I一 3) の代りに実施例 8で得られた化合物 （C 8— 3) を使用した以外は実施例 5と同様にして目的とする化合物 （C 12) が得ら れた。
7FNeuAca2→-3Gal β
l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Figure imgf000068_0001
(C 12)
実施例 13
実施例 6の化合物 （C 5) の代りに実施例 12で得られた化合物 （C 12) を 使用した以外は実施例 6と同様にして目的とする化合物 （C 13) が得られた。 FNeuAc a2→-3Gal/3 l→-4GlcNAc β MMan α
、 6
Man β l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Man r
(C 13)
実施例 14
実施例 7の化合物 (C 6) の代りに実施例 13で得られた化合物 (C 13) を 使用した以外は実施例 7と同様にして目的とする化合物 （C 14) が得られた。
7FNeuAc a2→-3Galj3 l→-4GlcNAc β MUan W
、6
• Man j3 l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
(C 14) 実施例 15 Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ 8" —デォ キシ— 8"'—フルオローシァロ α 2， 3糖鎖ァスパラギン （C 1 5— 1) および Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護した 2種のモノ 8" —デォキシ 一 8" —フルオローシァロ α 2, 3糖鎖ァスパラギン （C 15— 2及び C 15- 3) の合成
参考例 9で得られた CMP— 8" —デォキシ— 8" —フルオローシアル酸を用 いた以外は実施例 1と同様にして下記に示す Fmo c基でァスパラギンのァミノ 基窒素を保護したジ 8" —デォキシー 8" —フルオローシァロ α 2, 3糖鎖ァス パラギンおよび Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護した 2種のモノ 8" ーデォキシ— 8" —フルオローシァロ α 2, 3糖鎖ァスパラギンを得た。
8FNeuAc a2→-3Gal)3 l→-4GlcNAc β MMa α lv
、6
Man/31+4G1CNACJ3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc 3
8FNeuAc a2→-3Gal)3 l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
(C 15 - 1)
この糖鎖ァスパラギンは式 （1) の R1 = R2=式 （2)、 R = OH、 R' =F、 R" =OHに相当する。
Gal β l+4GlcNAc β MMan
3Man)3 l+4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-FmocFNeuAc a2→-3Gal/3 l+4GlcNAc β l+2Man
(C 15— 2)
この糖鎖ァスパラギンは式 （1) の R1==式 （3)、 R2=式 （2)、 R = OH、 R' =F、 R" =OHに相当する。
8FNeuAc a2→-3Gal/3 l→-4GlcNAc β MMau a K
Man/3 l→-4GlcNAci3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
Gal l+4GlcNAc β l→-2Man a Γ
(C 15 - 3)
この糖鎖ァスパラギンは式 （1) の R1=式 （2)、 R =〇H、 R' =F、 R" =OH、 R2=式 （3) に相当する。 実施例 16 (実施例 15のガラクトース加水分解酵素）
実施例 2の化合物 （C 1一 2) の代りに実施例 15で得られた化合物 （C 15 -2) を使用した以外は実施例 2と同様にして目的とする化合物 （C 16) が得 られた。
GlcNAc(3MMaiiQ!l
ヽ6
Mani 1→-4G1CNACJ3 l→^4GlcNAc→-Asn-Fffloc 3
8FNeuAc a2→-3Gal j3 l+4GlcNAc j3 l+2Man Γ
(C 16)
この糖鎖ァスパラギンは式 （1) の R1^式 （4)、 ： 2 =式 （2)、 R = OH、
R， =F、 R" =OHに相当する。
実施例 17 (実施例 16の N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素）
実施例 3の化合物 （C 2) の代りに実施例 16で得られた化合物 （C 16) を 使用した以外は実施例 3と同様にして目的とする化合物 （C 17) が得られた。
l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
8FNeuAc a2→-3Gal β l+4GlcNAc jS l→-
Figure imgf000070_0001
(C 17)
この糖鎖ァスパラギンは式 （1) の R1=式 （5): R2=式 （2)、 R = OH、 R， =F、 R" =OHに相当する。
実施例 18 (実施例 17のマンノース加水分解酵素）
実施例 4の化合物 （C 3) の代りに実施例 17で得られた化合物 （C 17) を 使用した以外は実施例 4と同様にして目的とする化合物 （C 18) が得られた。
Man/3 l+4GlcNAc 3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc 3
8FNeuAc a2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ ·
(C 18)
この糖鎖ァスパラギンは式 （1) の Ι^=Η、 R2=式 （2)、 R =〇H、 R' =F、 R" =〇Hに相当する。
実施例 19 (実施例 15のガラクトース加水分解酵素） 実施例 5の化合物 （C 1一 3) の代りに実施例 15で得られた化合物 （C 15 -3) を使用した以外は実施例 5と同様にして目的とする化合物 （C 19) が得 られた。
8FNeuAca;2→-3Gal β l→-4GlcNAc j3 l→-2Man a; k
、6
Manj31-»-4GlcNAc j3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
GlcNAci31→-2ManQ!r .
(C 19)
この糖鎖ァスパラギンは式 （1) の R1:式 （2)、 R = OH、 R' =F、 R" =〇H、 R2=式 （4) に相当する。
実施例 20 (実施例 19の N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素）
実施例 6の化合物 （C 5) の代りに実施例 19で得られた化合物 （C 19) を 使用した以外は実施例 6と同様にして目的とする化合物 （C 20) が得られた。
8FNeuAc G;2→-3Galj3 l→-4GlcNAc β l+2Man a
、6
Mani3 l→-4GlcNAc)3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
Man a r
(C 20)
この糖鎖ァスパラギンは式 （1) の R1=式 （2)、 R =〇H、 R' =F、 R" =OH、 R2=式 （5) に相当する。
実施例 21 (実施例 20のマンノース加水分解酵素）
実施例 7の化合物 （ C 6 ) の代りに実施例 20で得られた化合物 （ C 20 ) を 使用した以外は実施例 7と同様にして目的とする化合物 （C 21) が得られた。
8FNeuAc a2→-3Gal β l+4GlcNAc β MMan α 1
、6
Man /3 l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
(C 21)
この糖鎖ァスパラギンは式 （1) の R1-式 （2)、 R =〇H、 R' =F、 R" =〇H、 R2 = Hに相当する。
実施例 22 Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ 9" ーデォ キシ一 9" 一フルオローシァロ c¾ 2, 3糖鎖ァスパラギン （C22— 1) および Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護した 2種のモノ 9" —デォキシ -9" 一フルオローシァロ α 2, 3糖鎖ァスパラギン （C 22— 2及び C 22- 3) の合成
参考例 10で得られた CMP— 9" —デォキシー 9" —フルオローシアル酸を 用いた以外は実施例 1と同様にして上記 Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒 素を保護したジ 9" ーデォキシ— 9" 一フルオローシァロ α 2， 3糖鎖ァスパラ ギンおよび Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護した 2種のモノ 9" —デォキシ一 9" —フルオローシァロ a 2, 3糖鎖ァスパラギンを得た。
9FNeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc)3 l→-2Man l
、6
Man β l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
9FNeuAc a2→-3Galj3 l+4GlcNAc β l→-2Man T
(C 22 - 1)
Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man lv
、6
Man^ l→-4GlcNAc 3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
9FNeuAc cK2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
(C 22 - 2)
9FNeuAc a2→-3Gal)3 l→-4GlcNAc β MMan a l
、
Manj3 l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn— Fmoc 3
Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man Γ
(C 22 - 3)
(C 22 ~ 1) は式 （1) の R1:!^2 式 （2)、 R = OH、 R， =〇H、 R" =Fの糖鎖ァスパラギンに相当する。
(C 22 - 2) は式 （1) の （3)、 R2=式 （2)、 R =〇H、 R' =〇H、 R" =Fの糖鎖ァスパラギンに相当する。
(C 22— 3) は式 （1) の R1 式 （2)、 R =〇H、 R' =〇H、 R" = F、 R2=式 （3) の糖鎖ァスパラギンに相当する。
実施例 23 (実施例 22のガラクトース加水分解酵素）
実施例 2の化合物 （C 1一 2) の代りに実施例 22で得られた化合物 （C 22 一 2) を使用した以外は実施例 2と同様にして目的とする化合物 （C 23) が得 られた。 ' ■
(C 23) は式 （1) の 式 （4)、 R2=式 （2)、 R = OH、 R' =0 H、 R" =Fの糖鎖ァスパラギンに相当する。
GlcNAc/3 l→-2Mano!lv
6
1→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
9FNeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc)3 l→-2Manai
(C 23)
実施例 24 (実施例 23の N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素）
実施例 3の化合物 （C 2) の代りに実施例 23で得られた化合物 （C 23) を 使用した以外は実施例 3と同様にして目的とする化合物 （C 24) が得られた。
(C 24) は式 （1) の 式 （5)、 R2=式 （2)、 R =〇H、 R' =〇 H、 R" 二 Fの糖鎖ァスパラギンに相当する。
l→-4GlcNAc j3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
9FNeuAc a2— 3Gal l→-4GlcNAc β l-*-
Figure imgf000073_0001
(C 24)
実施例 25 (実施例 24のマンノース加水分解酵素）
実施例 4の化合物 (C 3) の代りに実施例 24で得られた化合物 (C 24) を 使用した以外は実施例 4と同様にして目的とする化合物 （C25) が得られた。
(C 25) は式 （1) の Ι^ = Η、 R2=式 （2)、 R = OH、 R' =〇H、 R" =Fの糖鎖ァスパラギンに相当する。 Man/3 l→-4GlcNAci3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 9FNeuAca2→-3Gal β l-*-4GlcNAc β l→-2Man a Γ .
(C 25)
実施例 26 (実施例 22のガラクトース加水分解酵素）
実施例 5の化合物 （C 1一 3) の代りに実施例 22で得られた化合物 （C 22 一 3) を使用した以外は実施例 5と同様にして目的とする化合物 （C 26) が得 られた。
(C- 26) は式 （1) の; 1^式 （2)、 R = OH、 R， =OH、 R" =F、 R2 =式 （4) の糖鎖ァスパラギンに相当する。
9FNeuAc Qi2→-3Gal/3 l→-4GlcNAc β MMm a
6
Man^ 1→-4G1CNACJ8 l-*-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
GlcNAcj3 l-^2Manar
(C 26)
実施例 27 (実施例 26の N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素）
実施例 6の化合物 (C 5) の代りに実施例 26で得られた化合物 (C 26) を 使用した以外は実施例 6と同様にして目的とする化合物 （C 27) が得られた。
(C 27) は式 （1) の R1^式 （2)、 R = OH、 R' =OH、 R" =F、 R2=式 （5) の糖鎖ァスパラギンに相当する。
9FNeuAc a2→-3Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man
Mani3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
Man
(C 27)
実施例 28 (実施例 27のマンノース加水分解酵素）
実施例 7の化合物 （C 6) の代りに実施例 27で得られた化合物 （C 27) を 使用した以外は実施例 7と同様にして目的とする化合物 （C28) が得られた。
(C 28) は式 （1) の R1-式 （2)、 R = QH、 R' =OH、 R" =F、 R 2 = Hの糖鎖ァスパラギンに相当する。
9FNeuAc a2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
β
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
(C 28)
実施例 29 Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ 7" —デォ キシ— 7" —フルオローシァロ （2— 6) 糖鎖ァスパラギン （C 29— 1) およ び Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護した 2種のモノ 7" —デォキ シ一 7" —フルオローシァロ （2— 6) 糖鎖ァスパラギン （C 29— 2及び C 2 9-3) の合成
参考例 7で得られた CMP— 7" —デォキシ— 7" —フルオローシアル酸を、 シアル酸転移酵素として α 2, 6転移酵素である市販の R a t L i v e r由来 のものを用い、 力コジル酸緩衝溶液の pHを 6.0とした以外は実施例 1と同様 にして下記に示す Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ 7" ― デォキシー 7" —フルオローシァロ （2— 6) 糖鎖ァスパラギンおよび Fmo c 基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護した 2種のモノ 7" —デォキシ— 7" - フルオローシァロ （2— 6) 糖鎖ァスパラギンを得た。 （C 29— 1) 〜 （C 2 9-3) の化学式を以下に示す。
7FNeuAc a 2 + 6Gal i3 l→-4GlcNAc β l+2Man a
、6
Man/31→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
7FNeuAc l+4GlcNAc β l+2Man Γ
(C 29 - 1) Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a
、6
' Man β l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 7FNeuAc a2→-6Gal β l—4GlcNAc β MMan α Γ
(C 29 - 2)
7FNeuAc a2→-6Gal β l→-4GlcNAc β MMan α
l→-4GlcNAc/3 l→^4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal l+4GlcNAc β l→-2Man a
(C 29 - 3)
実施例 30 (実施例 29のガラクトース加水分解酵素）
実施例 2の化合物 (C 1 - 2) の代りに実施例 29で得られた化合物 (C 29 -2) を使用した以外は実施例 2と同様にして目的とする化合物 （C 30) が得 られた。 （C 30) の化学式を以下に示す。
GlcNAcj31→-2Manal
、6
Man β l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
7FNeuAco;2→-6Gal β l→-4GlcNAc β MMan a
(C 30)
実施例 31 (実施例 30の N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素）
実施例 3の化合物 （ C 2 ) の代りに実施例 30で得られた化合物 （ C 30 ) を 使用した以外は実施例 3と同様にして目的とする化合物 （C 31) が得られた。
(C 31) の化学式を以下に示す。
β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
7FNeuAc a 2+6Gal j3 l→-4GlcNAc β l-»-
Figure imgf000076_0001
(C 31)
実施例 32 (実施例 31のマンノース加水分解酵素) 実施例 4の化合物 （C 3) の代りに実施例 31で得られた化合物 （C 31) を 使用した以外は実施例 4と同様にして目的とする化合物 （C 32) が得られた。
(C 32) の化学式を以下に示す。
Man /3 l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
7FNeuAc a2→-6Gal β l+4GlcMc β l→-2Man a
(C 32)
実施例 33 (実施例 29のガラクトース加水分解酵素）
実施例 5の化合物 （ C 1— 3 ) の代りに実施例 29で得られた化合物 （ C 29 -3) を使用した以外は実施例 5と同様にして目的とする化合物 （C 33) が得 られた。 （C33) の化学式を以下に示す。
7FNeuAc a2→-6Galj3 l→-4GlcNAc β l→-2Man
、6
Manj3 l→-4GlcNAc^ l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
GlcNAc/31→-2Manar
(C 33)
実施例 34 (実施例 33の N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素）
実施例 6の化合物 （C 5) の代りに実施例 33で得られた化合物 （C 33) を 使用した以外は実施例 6と同様にして目的とする化合物 （C 34) が得られた。
(C 34) の化学式を以下に示す。
7FNeuAc a2→-6Gali3 l→-4GlcNAc β l→-2Man a lv
、6
Manj3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
^3
Man a r
(C 34)
実施例 35 (実施例 34のマンノース加水分解酵素）
実施例 7の化合物 （C 6) の代りに実施例 34で得られた化合物 （C 34) を 使用した以外は実施例 7と同様にして目的とする化合物 （C 3 5 ) が得られた。 (C 3 5 ) の化学式を以下に示す。
7FNeuAca2→-6Gal j3 l→-4GlcNAc j3 l-^2Man
g
Manj31→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
(C 3 5 )
実施例 3 6〜 4 9
以下、 同様にして以下に示す糖鎖ァスパラギン誘導体を合成した。
8FNeuAc a2→-6Gal β l→-4GlcNAc β MMan α
l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
8FNeuAc a2→-6Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man α
Figure imgf000078_0001
(C 3 6 - 1 )
Gal β l→-4GlcNAc j3 l-^2Man l
、6
Man/3 l→-4GlcNAci3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
8FNeuAca2→-6Gal)31→-4G1CNACJ3 l-^ Manal-^
(C 3 6 - 2)
8FNeuAc a2→-6Galj3 l→-4GlcNAc β l→-2Man a 1χ
、6
Man/3 l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal β l→-4GlcNAc β l-^2Man
(C 3 6 — 3 )
GlcNAc^ l→-2Manoilv
6
Man/3 l→-4GlcNAc)3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
8FNeuAc
Figure imgf000078_0002
a 1,
(C 3 7 ) Man K
、6
Mani3 l→-4GlcNAci3 l→-4GlcNAc→-Asn-FmocFNeuAc a2→-6Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man a Γ
(C 38)
^Man^ l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn - FmocFNeuAc a2→-6Gal^ l→-4GlcNAc β l→-2Man
(C 39) FNeuAc a2→-6Galj3 l→-4GlcNAc β MMan l 、6
Manj3 l→-4GlcNAci3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
GlcNAci31→-2Mano;r
(C 40) FNeuAc n2→-6Gal β l→-4GlcNAc j3 l→-2Man
、6
Manj31→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
Man a 1
(C41 ) FNeuAco!2→-6Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
、6
ManiS l+4GlcNAc j3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
(C 42) FNeuAco;2→-6Gal β l-^4GlcNAc β MUan 1
、6
Man/31→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc→-Asn-FmocFNeuAc a2→-6Gal/3 l+4GlcNAc β MMan α Γ
(C43- 1 ) Gal β l+4GlcNAc β MMan a
、6
Man/3 l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
FNeuAc a2→-6Gal β l→-4GlcNAc j3 l→-2Man
(C 43 - 2) FNeuAca2→-6Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man lv
、6
Man/3 l→-4GlcNAc)3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
(C 43 - 3)
GlcNAc/31→-2Mano!
l+4GlcNAc l→-4GlcNAc→-Asn-FmocFNeuAca2→-6Gal β l→-4GlcNAci3 l→-2Mana
Figure imgf000080_0001
(C 44)
Man l
、6
3Manj3 l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-FmocFNeuAca2→-6Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man
(C 45)
^Man β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- FmocFNeuAca2→-6Gal β l→-4GlcNAci3 l→-2Mano!l/
(C 46) FNeuAca2→-6Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
、 6
Man β l→-4GlcNAc β 1→-4 1
GlcNAc 31-^2Manar
(C47) FNeuAca2→-6Gal β l→-4GlcNAc β l→- /31→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc-»-Asn-Finoc
Figure imgf000081_0001
(C 48)
9FNeuAc a2-^6Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
6
Man/3 l+4GlcNAc β l-*^4GlcNAc→-Asii-Fmoc
(C 49)
尚、 代表例として 8 F a 2, 6— 1 1糖— As n— Fmo c (C 36 - 1) の N MRデータを以下に示す。
NMR (400MHz, D2〇， 30°C, HOD = 4. 81 )
δ 8. 01 (d， 2H, J = 7.4, Fmo c), 7. 80 (d， 2H， J = 7. 4， Fmo c), 7. 59 (d d, 2H, J = 7. 4, Fmo c), 7. 52 (b dd， 2H， J = 7. 4, Fmo c)， 5. 22 (s, 1 H, Man4— Hl)， 5. 08 (d， 1H， J = 9.4, G l cNAc l— HI), 5. 05 (s， 1 H, Ma n ' _H— 1), 4. 85—4. 9 5 (m, 1H)， 4. 55 -4. 75 (m)， 4. 53 (d， 1H， 1 = 7. 9), 4.43 (m, 1 H), 4. 35 (b s， 2 H, Ma n 3 -H2), 4. 28 (b s， 1 H, Man 4-H2), 4. 10 -4. 25 (m, 2 H), 2. 7 5 - 2. 85 (m， 1 H, As n- β CH), 2. 63- 2. 7 0 (d d, 2 H, J a= 3. 9, J b = 1 2. 0 , N e u A c 7 , 7 ' -H 3 e q), 2. 55 - 2. 65 (m, 1 H， As n— jS CH), 2. 16, 2. 1 1, 2. 08 (e a c h s , 1 5H, Ac x 5), 1. 84 (s , 3 H, Ac), 1. 7 4 (dd， 1 H, J a= 12. 3, J b = 12. 2, Ne uAc 7 -H3 ax) . 実施例 50 (糖鎖ァスパラギン誘導体の Fmo c基の脱保護）
全ての糖鎖ァスパラギン誘導体において、 以下の手順で Fmo c基の脱保護を 行った。 まず、 糖鎖ァスパラギン Fmo c体 1 mo 1あたりに 240 リット ルの N, N—ジメチルホルムアミド、 160 ^リットルのモルホリンを加え、 室 温 'アルゴン雰囲気下で反応させた。 TLC (展開溶媒として 1M 酢酸アンモ 二ゥム：イソプロパノール =8 ： 5を用いた） にて反応終了を確認した後、 氷水 で冷却した。 ここにジェチルエーテルを反応溶液の 10倍量加えて 15分間攪拌 した後、 析出した沈殿物をろ別した。 得られた残渣を水に溶解させ、 35°Cでェ バポレートした。 更にトルエンを 3m 1加えエバポレー卜するという操作を 3回 繰り返した。 残留物を逆相カラムクロマトグラフィー (コスモシール 75 C18 一 OPN、 15X 10 Omm、 展開溶媒は水） により精製して、 対応する糖鎖ァ スパラギンを得た。
実施例 51 (糖鎖ァスパラギンのァスパラギン残基の除去）
実施例 50で得られた糖鎖ァスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、 ァ セチル化することによりァスパラギン残基を除去して対応する糖鎖を得た。
実施例 52〜 69
参考例 2、 3、 8〜13、 実施例 1〜7で製造した各 Fmo c—糖鎖ァスパラ ギン 2 nmo lを、 トリス塩酸緩衝液 約 10m lに溶解させた。 このものに、 GDP—フコース 200 nmo l、 Fucosyl transferase V (Human,
Recombinant) 0. 5mUを加え、 37°Cで約 2時間静置、 反応させた。 反応液を 超純水 20m 1で希釈したのち、 キヤピラリー電気泳動 （fused silica capillary, 50mm i . d.， 60 cm, buffer； 100 mM Tris-borate, pH=8. 3, 10 OmM Heptane sulfonate， 印加電圧 27 kV， 温度 25 °C, 214mm) で分離を行い各目的物を得た。
各実施例における原料及び目的物を以下に示す。 実施例 5 2
原料
NeuAc a 2→-6Gal β l+4GlcNAc l+2Man K
、6
Mani31→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man Γ
(化合物 2)
目的物
NeuAc a 2→-6Gal
l→-4GlcNAcj3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal
Figure imgf000083_0001
Fuc 1、 3
NeuAc a 2→-6Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man l
、6
Man/3 l→-4GlcNAc^ l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
Gal β l+4GlcNAc β l-^2Man a Γ
NeuAc a 2→-6Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a
、6
Manj3 l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc 3
Gal j3 l→-4GlcNAc j3 l→-2Man a Γ
Fuc K 1 実施例 5 3
原料
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
NeuAca2→-6Gal β l→-4GlcNAc)3 l→-2Mano!
Figure imgf000084_0001
(化合物 3 )
目的物
Fuc lv
3
Gal β l→-4GlcNAc β MMan lv
6
Manj3 l+4GlcNAc j8 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
NeuAc 2— 6Gal β 1+4G1 cNAc β l→-2Man
3
Fuc
Fuc lv
3
Gal β l→-4GlcNAc j3 l→-2Man l
6
Man β l+4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
NeuAc 2+ 6Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
Gal j3 l→-4GlcNAc β MMan l
6
Man )3 H GlcNAc l+4GlcNAc+Asn-Fmoc 3
NeuAc 2+6Gal j3 l+4GlcNAc β l→-2Man Γ
3
Fuc a I,
実施例 5 4
原料
Gal j3 l→-4GlcNAe β l→-2Man lv
g
Man ^ l→^4GlcNAc j3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fnioc
Gal j3 l→-4GlcNAc β l+2Man a
(化合物 4 )
目的物
Fuc a 1
3
Gal β l+4Gl cNAc β l+2Man a k
6
Man β 1- -4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
Fuc Γ
Fuc
3
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a
6
Man j3 1- -4GlcNAc ^ l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man a
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
1- -4GlcNAc j8 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a
Figure imgf000085_0001
Fuc a r 実施例 55
原料
Gal j3
Figure imgf000086_0001
(化合物 11 )
目的物
Fuc \
3
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man lv
、6
3Man/31→-4GlcNAc /3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
GlcNAc/31→-2Mano!l^
実施例 56
原料
GlcNAcj3 l→-2Manalv
、
Manj3 l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fnioc
Gal β l→-4GlcNAc β l-^2Man a Γ
(化合物 12 )
目的物
GlcNAcj31→-2Manalv g
Man /3 l+4GlcNAc /3 l+4GlcNAc+Asn-Fmoc 3
Gal β l~ GlcNAc β l+2Man
Fuc Γ 実施例 57
原料
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a
、6
Man^ 1→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Man
(化合物 13)
目的物
Figure imgf000087_0001
6
Man j3 l→-4GlcNAc j3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Man 1
実施例 58
原料 β l+4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-
Figure imgf000087_0002
(化合物 14)
目的物
Man
、6
3Manj31→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal β l→-4GlcNAc β l-^2Man a
Fuc 実施例 5 9
原料
Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man 1
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc (化合物 1 5)
目的物
Fuc a 1、
Gal j3 l→-4GlcNAc l→-2Man a 1
Manj3 H GlcNAciS l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
実施例 6 0
原料
Man (3 l→^4GlcNAc /3 l→^4GlcNAc-^Asn-Fmoc
Gal β l-^4GlcNAc l—2Man Γ
(化合物 1 6 )
目的物
1→^4G1CNACJ3 l-*-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man 1ズ
Fuc a r 実施例 6 1
原料
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
Man j3 l→-4Gl cNAc i3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
NeuAc a 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a Γ
(化合物 1 Ί )
目的物
Fuc 1、
3
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→ ^-2Man - 、
Figure imgf000089_0001
3
NeuAc 2+3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
Fuc a Γ
Fuc a lv
3
NeuAc 2+3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a
1ヽ
Man j3 l+4GlcNAc /3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l-^2Man Γ
NeuAc ffl 2+3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
Man )3 l→-4GlcNAc )3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
NeuAc 2→- 3Gal β l→-4GlcNAc j3 l→-2Man α Γ
3
Fuc a r 実施例 6 2
原料
NeuAc 2-»-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
1→-4GlcNAc l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
Figure imgf000090_0001
(化合物 1 8)
目的物
Fuc l
3
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a
6
3Man/3 l+4GlcNAc)3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man
Fuc
Fuc a l
NeuAc o;2→-3Gal jS l→-4Gl
l→-4GlcNAcj3 l→-4GlcNAc→-Asn-FfflOc
Gal β l→-4Gl
Figure imgf000090_0002
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man
Figure imgf000090_0003
Fuc 1
実施例 6 3
原料
Gal β l→-4GlcNAci l→-2Mana lv ·
、6
Man β l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
NeuAc a 2→-3Gal β l+4GlcNAc β l-»-2Man
(化合物 1 9 )
目的物
Fuc 1、
Gal j3 l→-4Gl
l+4GlcNAc i3 l+4GlcNAc+Asn - Fmoc
NeuAc 2→-3Gal β l→-4Gl
Figure imgf000091_0001
FUG a r
Gal 31→-4GlcNAci31→-2Mana 1\
、6
Man/3 l→-4GlcNAc )3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
3
NeuAc 2→-3Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man I
Fuc Γ
Fuc a 1、
3
Gal j3 l+4GlcNAc β l+2Man
、6
Man/3 l→-4GlcNAc )3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
NeuAc 2-*- 3Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a Γ 実施例 64
原料
GlcNAo31→-2Mano!
l→-4GlcNAc]3 l-*-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
Figure imgf000092_0001
(化合物 20)
目的物
GlcNAc/31→-2Mano!
l→-4GlcNAc /3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
NeuAc l→- 3Gal l-*-4GlcNAc β l→-2Man
Figure imgf000092_0002
Fuc o; 1
実施例 65
原料
Man 1、
Manj3 l→^4GlcNAc)3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fnioc
NeuAca2→-3Gal β l-»-4GlcNAc β l→-2Man a ΐ
(化合物 21 )
目的物 ;3 l→-4GlcNAc i3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
NeuAc 2→-3Gal β l-*-4GlcNAc 0 l→-2
Figure imgf000092_0003
3
Fuc a 実施例 66
原料
Man β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc 3
NeuAc 2→-3Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man iai Γ
(化合物 2 2)
目的物
Man /3 l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
NeuAc 2+3Gal β 1→-4G1 cNAc β l+2Man a Γ
Flic a r
実施例 67
原料
NeuAc a2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a l
Manj3 l→^4GlcNAc j3 l→-4GlcNAc-*-Asn-Fmoc
GlcNAc/3MManar
(化合物 2 3)
目的物
Fuc l
3
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc j3 l+2Man 1
Mani31→-4G1CNACJ8 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
GlcNAcj31→-2Manar 実施例 6 8
原料
NeuAc 2+3Gal β 1+4G1 cNAc β MMan α
Man β l→-4GlcNAc β l→-4Gl cNAc-*-Asn-Fmoc
Man
(化合物 2 4 )
目的物
Fuc K
3
NeuAc a 2→-3Gal j3 l-^4GlcNAc β l→-2Man 、6
Maii iS l→-4GlcNAc 3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
Man 1
実施例 6 9
原料
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
Man β l→-4GlcNAc j3 l→-4GlcNAc-*-Asn-Fmoc
(化合物 2 5 )
目的物 '
Fuc a lv
3
NeuAc a 2→-3Gal β l→-4Gl cNAc β MMan α 、6
Man β l-*^4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc

Claims

請求の範囲
1. 下記式（1)で表される 11〜7糖を有する a 2， 3糖鎖ァスパラギン
Figure imgf000095_0001
〔式中、 1^ぉょび1^2は、 水素原子、 式 （2) 〜 （5) で示される基であり、 同 一でも異なっていてもよい。 ただし、 R1および R2の一方は必ず式 （2) で示さ れる基である。 〕
Figure imgf000095_0002
R, R' ， R" は下記の組合せを示す。
(a) R = F、 R， =OH、 R" =OH
(b) R = OH、 R， =F、 R" =OH
(c) R =〇H、 R， =OH、 R" =F
(d) R = OH、 R， =〇H、 R" =〇H
Figure imgf000096_0001
Figure imgf000096_0002
Figure imgf000096_0003
2. 下記式（6)で表されるフッ素を含む 1 1〜7糖を有する ο; 2, 6糖鎖ァス パラギン誘導体。
( 6ノ
Figure imgf000096_0004
〔式中、 Rxおよび RYは、 水素原子、 式 （7) で示される基、 または式 （3) 〜 (5) で示される基である。 ただし、 Rxおよび RYの一方は必ず式 （7) で示さ れる基である。 〕
Figure imgf000097_0001
R, R' , R" は下記の組合せを示す。
(a) R = F、 R， =OH、 R" =OH
(b) R = OH、 R， =F、 R" =OH
(c) R = OH、 R， =OH、 R" =F
3. 下記式 （8) で表される 1 1〜7糖を有する ο; 2, 3糖鎖
Figure imgf000097_0002
〔式中、 R1および R2は上記に同じ。 〕
4. 下記式（9)で表されるフッ素を含む 1 1〜7糖を有する 2, 6糖鎖ァス
Figure imgf000097_0003
〔式中、 Rxおよび RYは上記に同じ。 〕
5. 下記式 （10) で表される 11〜7糖を有する ο; 2， 3糖鎖
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000098_0002
〔式中、 Rxおよび RYは上記に同じ。 〕
7. 脂溶性の保護基で保護された糖鎖ァスパラギンをシアル酸転移酵素を用い てシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、 得られた脂溶性の保護基で保 護された糖鎖ァスパラギンをクロマ卜グラフィ一に供することにより分離するこ とを特徴とする下記式（12)で表される 11糖を有する α 2, 3ジシァ口糖鎖ァ スパラギン誘導体の製造法。
Figure imgf000098_0003
〔式中、 R1および R2は、 共に式 （2) で示される基である。 〕
8. 脂溶性の保護基で保護された糖鎖ァスパラギンをシアル酸転移酵素を用い てシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、 得られた脂溶性の保護基で保 護された糖鎖ァスパラギンをクロマトグラフィ一に供することにより分離するこ とを特徴とする下記式（13)で表される 10糖を有する 2， 3モノシァロ糖鎖 ァスパラギン誘導体の製造法。
Figure imgf000099_0001
〔式中、 R1, R 2の一方は式 （2) で示される基、 他方は式 （3) で示される基 である。 〕
9. 式 （13) で表されるモノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体をガラクトース 力 11水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式 （14) で表される 9糖を有する α 2, 3モノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体の製造法。
Figure imgf000099_0002
〔式中、 R1 R2の一方は式 （2) で示される基、 他方は式 (4) で示される基 である。 〕
,10. 式 （14) で表されるモノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体を N—ァセチ ルダルコサミン加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式 （ 1 5)で表される 8糖を有する α 2, 3モノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体の製造法。
5 )
Figure imgf000099_0003
〔式中、 R1 R 2の一方は式 （2) で示される基、 他方は式 （5) で示される基 である。 〕
11. 式 （15) で表されるモノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体をマンノース 加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式 （16) で表される 7糖を有するひ 2, 3モノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体の製造法。
、丄 6 )
Figure imgf000100_0001
〔式中、 R1 R 2の一方は式 （2) で示される基、 他方は水素原子である。 〕 12. 脂溶性の保護基で保護された糖鎖ァスパラギンをシアル酸転移酵素を用 いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、 得られた脂溶性の保護基で 保護された糖鎖ァスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離する ことを特徴とする下記式（17)で表される 1 1糖を有する α 2, 6ジシァ口糖鎖 ァスパラギン誘導体の製造法。
Figure imgf000100_0002
〔式中、 Rxおよび RYは、 共に式 （7) で示される基である。 〕
13. 脂溶性の保護基で保護された糖鎖ァスパラギンをシアル酸転移酵素を用 いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、 得られた脂溶性の保護基で 保護された糖鎖ァスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離する ことを特徴とする下記式（18)で表される 10糖を有する 0； 2, 6モノシァロ糖 鎖ァスパラギン誘導体の製造法。
(18)
Figure imgf000100_0003
〔式中、 RXおよび RYの一方は式 （7) で示される基、 他方は式 （3) で示され る基である。 〕
14. 式 （18) で表されるモノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体をガラクトー ス加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式 （19) で表され る 9糖を有するひ 2， 6モノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体の製造法。
Figure imgf000101_0001
〔式中、 Rxおよび RYの一方は式 （7) で示される基、 他方は式 （4) で示され る基である。 〕
15. 式 （19) で表されるモノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体を N—ァセチ ルダルコサミン加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式 （2 0)で表される 8糖を有する a 2, 6モノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体の製造法。
Figure imgf000101_0002
〔式中、 Rxおよび RYの一方は式 （7) で示される基、 他方は式 （5) で示され る基である。 〕
16. 式 （20) で表されるモノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体をマンノース 加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式 （21) で表される 7糖を有する a 2， 6モノシァロ糖鎖ァスパラギン誘導体の製造法。
Figure imgf000102_0001
〔式中、 Rxおよび RYの一方は式（7) で示される基、 他方は水素原子である。〕
17. 式（1)で表される 1 1〜 7糖を有する 2, 3糖鎖ァスパラギン誘導体 の保護基を除去することを特徴とする式 （8) で表される 1 1〜7糖を有する α 2， 3糖鎖ァスパラギンの製造法。
1 8. 式（6)で表される 1 1〜 7糖を有する 2, 6糖鎖ァスパラギン誘導体 の保護基を除去することを特徴とする式 （9) で表される 1 1〜7糖を有する a; 2, 6糖鎖ァスパラギンの製造法。
19. 式（8)で表される 1 1〜7糖を有する a 2， 3糖鎖ァスパラギンのァス パラギン残基を除去することを特徴とする式 （1 0) で表される 1 1〜7糖を有 するひ 2, 3糖鎖の製造法。
20. 式（9)で表される 1 1〜 7糖を有するひ 2， 6糖鎖ァスパラギンのァス パラギン残基を除去することを特徴とする式 （1 1) で表される 1 1〜7糖を有 する a 2, 6糖鎖の製造法。
21. 下記式 （22) で表される 1 1糖を有する （a 2, 3) (a 2, 6) 糖鎖 誘導体。
Figure imgf000102_0002
〔式中、 R1は式 （2) で示される基であり、 RYは下記式 （7) で示される基で ある。 〕
Figure imgf000103_0001
R， R， ， R" は下記の組合せを示す。
(a) R = F、 R， =OH、 R" =〇H
(b) R = OH、 R， =F、 R" =OH
(c) R =〇H、 R， =OH、 R" =F
(d) R = OH、 R， =OH、 R" =〇H
22. 下記式 （23) で表される 1 1糖を有する （a 2, 3) (a 2， 6) 糖鎖 ァスパラギン誘導体。
Figure imgf000103_0002
R, R' , R" は下記の組合せを示す。
(a) R = F、 R， =OH、 R" =OH
(b) R = OH、 R， =F、 R" =OH (c) R = OH、 R， =OH、 R" =F
(d) R = OH、 R， =OH、 R" =OH
23. 脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖ァスパ ラギンの非還元末端側の N—ァセチルダルコサミンに少なくとも 1個以上のフコ ースを含む糖鎖ァスパラギン誘導体。
24. 脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖ァスパ ラギンが、 式（1) で表される 1 1〜7糖を有する α 2, 3糖鎖ァスパラギン誘導 体である請求の範囲第 23項に記載のフコ一スを含む糖鎖ァスパラギン誘導体。
25. 脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖ァスパ ラギンが、 式（6) で表されるフッ素を含む 1 1〜 7糖を有するひ 2, 6糖鎖ァス パラギン誘導体である請求の範囲第 23項に記載のフコースを含む糖鎖ァスパラ ギン誘導体。
26. 脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖ァスパ ラギンが、下記式（6) で表される 1 1〜 6糖を有するひ 2， 6糖鎖ァスパラギン 誘導体である請求の範囲第 23項に記載のフコースを含む糖鎖ァスパラギン誘導 体。
Figure imgf000104_0001
〔式中、 Rxおよび RYは、 水素原子、 下記式 （7) で示される基、 または上記式 (3) 〜 （5) で示される基である。 ただし、 Rxおよび RYの一方は必ず式 （7) あるいは式 （3) で示される基である。 〕
Figure imgf000105_0001
ただし、 R = OH、 R' =OH、 R" =OHである。
27. 脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖ァスパ ラギンをフコース転移酵素を用いてフコースを転移させ、 得られた脂溶性の保護 基で保護された糖鎖ァスパラギンをグロマトグラフィ一に供することにより分離 することを特徴とする脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護され た糖鎖ァスパラギンの非還元末端側の N—ァセチルダルコサミンに少なくとも 1 個以上のフコースを含む糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。
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