WO2004058966A1

WO2004058966A1 - 肝臓疾患診断用マーカー蛋白質およびそれを利用した肝臓疾患診断方法

Info

Publication number: WO2004058966A1
Application number: PCT/JP2003/016600
Authority: WO
Inventors: Fumio Nomura; Kazuyuki Sogawa; Takeshi Tomonaga; Takenori Ochiai; Hideaki Shimada; Tatsuya Ohashi; Katsuhiro Katayama
Original assignee: Nitto Boseki Co., Ltd.
Priority date: 2002-12-24
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2004-07-15
Also published as: EP1577385A1; JP4196948B2; NO336459B1; US20090275059A1; ATE462001T1; AU2003296085A1; CN1732261A; US7517951B2; NO20052992L; NO20052992D0; CN100384996C; DE60331857D1; US7781180B2; US20060116504A1; EP1577385B1; JPWO2004058966A1; EP1577385A4

Abstract

　プロテインチップテクノロジーを利用して血清等生体試料のプロテオーム解析を行い、習慣飲酒に伴って増減するヒトフィブリノーゲンα-E 鎖（Fibrinogen α-E Chain）の分解産物であって分子量 5,900 の蛋白質、アポリポプロテイン AII（Apolipoprotein AII）の分解産物であって分子量 7,800 の蛋白質およびアポリポプロテイン AI（Apolipoprotein AI）であって分子量 28,000 の蛋白質を新たに見出し、これらの蛋白質の検出あるいは定量により問題飲酒者等の肝臓疾患を早期に診断することができる。

Description

明細書肝臓疾患診断用マーカー蛋白質およびそれを利用した肝臓疾患診新方法技術分野

本発明は、プロテインチップテクノロジーを利用した血清試料のプロテオーム解析の結果、習慣飲酒に伴って増減し従って肝臓疾患診断用マーカー蛋白質として利用できることが見出された複数の血清蛋白質およびそれらの蛋白質の存否の検出あるいは定量により問題飲酒者等の肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患、肝臓疾患の予後等を診断する方法に関するものである。背景技術

アルコールによる臓器障害の診断の第一歩は正確な飲酒歴の把握であるが、了ルコール依存は否認の病気といわれ、常習飲酒家が、その飲酒量を正確に申告しないのは古今東西変わりがない。従って、その裏づけとなる客観的なマーカーが必要である。習慣飲酒のマーカーとして最も広く測定されているのは T/ - GTP (GGT) であるが、飲酒家が GGT高値を示す場合でも、その値は肝障害の重症度や積算飲酒量とは必ずしも相関せず、またアルコール飲用後の GGT の変化には個体差があり、大量飲酒後にも増加しないいわゆるノンリスポンダーが相当数存在する。

一方、飲酒習慣がない場合でも肥満に伴う脂肪肝、ある種の薬剤の常用者など飲酒以外の要因で GGT が上昇する場合も多く、人間ドック等などにおいて GGT 高値、即ち飲酒家といった短絡的指導が行われる場合も少なくない。従って、 GGT に相補的な検査として糖鎖欠損トンランスフェリン（CDT) が北欧の研究者達により開発され、欧米の文献ではその有用性が強調されているが、日本人を対象とした成績では飲酒マーカーとしての CDT は GGT のノンレスポンダーの 10% 程度を拾いあげるにとどまっている。

エタノールの第一代鶴す産物であるァセトアルデヒドは反応性に富み、種々の蛋白との間で各種のァセトアルデヒド付加体を形成する。例えばァセトアルデヒド —ヘモグロビン付加体を HPLC などにより検出する試みがなされている。糖尿病における HbAlc のように飲酒量を過去にさかのぼって推測しうる興味深いマーカーと期待されるものもあるが、感度に難があり実用化していない。

習慣飲酒は慢性 f障害の 2大要因のひとつである。わが国の月干硬変症例において、純粋にアルコールのみに起因する症例の割合は 10〜 15 % に過ぎないとされている。し力し、これは主として大学病院などを対象にして得られたデ^"タであり、 200 万人を超えると予想されるアルコール依存症の存在を考えると、医療機関を受診する機会がないアルコール性肝障害患者が多数潜在していると予想される。また、習慣飲酒は脳出血、高血圧、痛風などの増悪因子でもあり、問題飲酒者を早期にかつ的確にスクリーニングすることは極めて重要である。し力し、上記のように、現在存在するいわゆる飲酒マーカーにおいて感度 ·特異度において決定的なものはなく、新たなマーカーを検索することが求められている。

網羅的発現タンパク解析の手法として一般的なのは二次元タンパク電気泳動であるが、低分子量蛋白またはペプチドの検出に難がある。近年、 surface enhanced laser desorption ionization (SELDI) と飛行型質量分析計を糸且み合わせたプロテインチップテクノロジーが米国 Ciphergen社により開発され、新規月重瘍マーカーの検出など臨床応用が始まっている。従ってこれらのプロテオミクス技術などを活用して網羅的に新たなマーカ一を検索することが求められている。発明の開示

本発明は、問題飲酒者などの肝臓疾患を早期にしかも的確にスクリーニングしうる新規マーカーを見出し、その測定系を確立し、医療に役立てることを課題としている。

本発明者らは上記の課題に関して鋭意検討した結果、本発明を完成した。即ち、本発明者らはプロテインチップテクノロジーを応用し、断酒目的に入院したアルコール依存症患者において経時的に採取された血清検体を用レ、、習慣飲酒に伴つて増減する新規の血清蛋白を同定することに成功した。そしてこれらの血清蛋白は肝臓疾患診断マーカー蛋白質として利用できることを見出し本発明を完成させた。

従って、本発明は、ヒトフイブリノ一ゲン - E鎖（Fibrinogen ひ - E Chain) の分解産物であって分子量 5, 900 の蛋白質（5. 9 kDa蛋白質）、アポリポプロティン All (Apolipoprotein All) の分解産物であって分子量 7， 800 の蛋白質 (7. 8 kDa蛋白質）、アポリポプロテイン AI (Apolipoprotein AI) であって分子量 28, 000の蛋白質おょぴこれらの蛋白質の変異体であってこれらと同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する変異体から選ばれる肝臓疾患診断用マーカー蛋白質に関するものである。

更に本発明は、肝臓疾患が疑われる患者から得た検体中の、上記肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否を検出しあるいはその量を測定して、肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患あるいは肝臓疾患の予後を診断する方法に関するものである。更に本発明は、配列表の配列番号 1のァミノ酸配列を有する新規蛋白質またはその変異体であって該蛋白質と同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有し且つ該アミノ酸配列と 90 %以上の相同性を有する蛋白質もしくは配列番号 1 のアミノ酸配列において 1 個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である変異体に関するものである。更に本発明は、配列表の配列番号 2 のアミノ酸配列を有する新規蛋白質またはその変異体であって該蛋白質と同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有し且つ該アミノ酸配列と 90 %以上の相同性を有する蛋白質もしくは配列番号 2 のアミノ酸配列において 1個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付カ卩したアミノ酸配列を有する蛋白質である変異体に関するものである。更に本発明は、上記の蛋白質またはそれらの変異体の測定方法であって、それらの蛋白質または変異体に対する抗体を用いて免疫測定法により測定する測定方法に関するものである。図面の簡単な説明

図 1は、 Ciphergen社のプロテインチップシステムを利用し、 SAXII チップを使用して測定されたアルコール性肝障害患者血清の測定結果である。ピークの高さの減少から入院時、 1週間後、 3ヶ月後と経時的に 28 kDa 蛋白質 (Apolipoprotein AI) が血清中から徐々に低下していることがわかる。

図 2は、図 1と同様に WCXII チップを使用して測定したアルコール性肝障害患者血清の測定結果である。入院時から治療に伴い経時的に、（1) 5. 9 kDa蛋白質、（2) 7. 8 kDa蛋白質の血中濃度が上昇している様子がわかる。

図 3は、図 1と同様に WCXII チップを使用して測定した健常人血清の測定結果である。（1) 5. 9 kDa蛋白質、（2) 7. 8 kDa蛋白質は一定の高値を示しており、図 2と比較することにより、同蛋白質が疾患によって低下したことがわかる。図 4は、 SDS- PAGE による 7. 8 kDa蛋白質及び 28 kDa蛋白質の電気泳動結果である。サンフレ中に目的蛋白質を含むことがわかる。

図 5は、合成された 5. 9 kDa蛋白質の質量分析値と HPLC のデータを示す。質量分析値は、理論値に一致していることがわかる。

図 6は、 Ciphergen社のプロテインチップシステムを利用し、 WCXII プロティンチップアレイを用いて、合成された 5. 9 kDa蛋白質と飲酒しない患者血清検体のデータを比較したものである。両者とも、 5. 9 kDa にピークを有し、同一した挙動を示した。

図 7は、種々の飲酒量の健常人や患者で、血清検体を、 Ciphergen社のプロテのピークの大小を測定したものである。飲酒量依存的に、ピークが小さくなることが半 IJ明した。

図 8は、検体として種々の濃度の 5. 9 kDa蛋白質を含むものを用い、 EIA法 (サンドイッチ ELISA 法）により吸光度を測定したものである。横軸は 5. 9 kDa蛋白質の濃度を示し、縦軸は測定された吸光度を示す。 5. 9 kDa蛋白質の濃度依存的に、吸光度の上昇がみられる。すなわち、検体中の 5. 9 kDa蛋白質の濃度を EIA法により測定できることを示している。発明を実施するための形態

以下に本発明を更に詳細に説明する。

本発明により肝臓疾患診断用マーカー蛋白質として利用できることが見出された蛋白質は、ヒトフイブリノ一ゲン - E鎖（Fibrinogen α -Ε Chain) の分解産物であって分子量 · 5， 900 の蛋白質（以下 5. 9 kDa蛋白質という）、ァポリポプ口ティン All (Apolipoprotein All) の分解産物であって分子量 7, 800 の蛋白質（以下 7. 8 kDa蛋白質という）およびアポリポプロテイン AI

(Apolipoprotein AI) であって分子量 28, 000 の蛋白質（以下 28 kDa 蛋白質という）である。これらの 5. 9 kDa蛋白質、 7. 8 kDa蛋白質および 28 kDa蛋白質は、それぞれ配列表の配列番号 1、 2および 3に示すアミノ酸配列を持つ蛋白質である。

次にそれぞれの蛋白質を説明する。 5. 9 kDa 蛋白質はヒト Fibrinogen a ~E Chain の分解産物であり、 54個のアミノ酸よりなる蛋白質であって、その理論分子量は 5904. 2 である。 7. 8 kDa蛋白質はヒトの Apolipoprotein All分解産物であり、 68個のアミノ酸よりなる蛋白質であって、その理論分子量は 7753. 8 である。また 28 kDa蛋白質は Apolipoprotein AI であり、 243個のアミノ酸よりなる蛋白質であって、理論分子量 28078. 8 である。これら蛋白質の中、 5. 9 kDa蛋白質おょぴ 7. 8 kDa蛋白質については、その血中の存在、肝障害等における臨床的意義が明らかになつたのは本発明が初めてであって、新規蛋白質並びに新規マーカー物質である。また 28 kDa蛋白質である Apolipoprotein AI は既知の蛋白質であり、脂質代謝における臨床的意義が確立して臨床的に測定されてきたものである。

本発明により肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能が見出された 5. 9 kDa蛋白質、 7. 8 kDa蛋白質おょぴ 28 kDa蛋白質は、配列表に示したアミノ酸配列を有するもののみに限定されるものではなく、同様に肝臓疾患診断用マーカ一蛋白質としての機能を有するそれらの蛋白質の変異体であってもよい。即ち、特に血液、組織中では多種類のエンド及びェキソプロテアーゼによって分解を受ける可能性が大きく、ァミノ酸の全長や配列の長さに変化があることは十分考慮されるべきである。また組換え蛋白質作製においては発現効率を下げないために抗原性を極力変化させないようなアミノ酸変異を持たせることは定法である。よつて本発明の 5. 9 kDa蛋白質、 7. 8 kDa蛋白質おょぴ 28 kDa蛋白質のそれぞれのアミノ酸配列と 90 %以上の相同性（ここで相同性とはアミノ酸の同一性を意味する）を有する蛋白質であるそれらの変異体であってもよい。それらのアミノ酸配列の長さが 15 %以内で変化していても問題はなく、肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する場合は本発明に包含される。そして好ましくは 95 %以上の相同性を持つ蛋白質、より好ましくは 98 % 以上の相同性を持つ蛋白質がよレ、。アミノ酸配列の相同性は既に公知のソフトウェア、例えば Wilber, W. J. and Lipman, D. J らの方法 (Proc. Natl. Sci. USA, 80, 726 - 730, 1983) に記載の検索方法を原理とするソフトウェアを利用して検索できる。また GENETYX (ソフトウエア開発株式会社）などは市販される汎用ソフトであって簡単に利用できる。本発明の月刊蔵疾患診断用マーカー蛋白質である 5. 9 kDa蛋白質、 7. 8 kDa蛋白質おょぴ 28 kDa蛋白質の変異体としては、配列番号 1、 2および 3のそれぞれのアミノ酸配列において 1 個から数個のアミノ酸残墓が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であって同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する変異体でもよい。このような変異体としては、例えば

10 %未満のアミノ酸残基が修飾を受けた蛋白質、好ましくは 5 %未満、更に好ましくは 2 %未満のアミノ酸残基が修飾を受けた蛋白質などが挙げられる。ァミノ酸残基の修飾は、当業者に周知の遺伝子技術によりァミノ酸変異として導入することができる。また翻訳後修飾、リン酸化、ァセチル化、糠鎖付加などの周知の修飾を受けた変異体も本発明の範囲に含まれる。

以上に説明した本発明により見出された肝臓疾患診断用マーカー蛋白質に基づいて肝臓疾患の診断が可能になる。即ち、肝臓疾患が疑われる患者から得た検体中の、上記月刊蔵疾患診断用マーカー蛋白質の存否を検出しあるいはその量を測定して、肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患あるいは肝臓疾患の予後を診断することができる。

本努明で用いることのできる検体としては、肝臓疾患が疑われる患者から採取した血清、血漿、血液、尿などが挙げられる。

本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否の検出あるいはその量の測定は、現在既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、質量分析法、免疫測定法、電気泳動法、液体ク口マトグラフィー（LC) 法、ガスクロマトグラフィー (GC) 法などが挙げられる。

質量分析法としては、レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（LDI - TOF MS) により行う方法が挙げられる。レーザーイオンィ匕飛行時間型質量分析計としては、表面増強レーザー脱離イオン化（Surface Enhanced Laser Desorption/

Ionization) 飛行時間型質量分析計（SELDI- TOF MS 法）、マトリックス支援レ一サーィ才ンィ匕 (Matrix— Assisted Laser Desorption/Ionization) 飛 Ττ時間型質量分析計（MALDI TOF MS 法）などを例示できる。

例えば、 SELDI- TOF MS法を用いる場合、 Ciphergen社により開発されたプロティン 'バイオロジー · システム II ·マス 'スぺクトロメーター（Ciphergen Biosystems, Inc) を使用することができる。この機械は SELDI (surface enhanced laser desorption ionization; と飛行型 ¾量分析を組み合わせたプ口ティンチップテクノロジーである。その詳細は W0 01/25791 A2号公報、特開 2001-28122号公報等に詳しい。 SELDI- TOF MS法の場合、通常、検体を、前処理した後、チップに吸着させて、 SELDI-T0F MS質量計に付す。検体が血清の場合、アルプミンの吸着剤を用いる力、ィオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでパッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。これらの方法に用いられるプロテインチップとしては、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質を吸着できるチップであれば特に限定しなレ、。例えば、疎水性やイオン交換などの蛋白質に親和性を持つ官能基が修飾されているチップ（ケミカルチップともいう）、目的の蛋白質に対する抗体を固定ィヒしたチップ（バイオケミカルチップ）等を例示できる。

その他の質量分析法としては、例えば ESI 法 (Electrospray Ionization) による質量分析法が挙げられる。 ESI 法の場合は、プロテアーゼ処理等の前処理した検体を、高速液体ク口マトグラフィ一等の分離手段と直結した質量分析計に付するのが好ましいことが多い。

免疫測定法としては、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作成し、従来知られている蛋白質を測定する方法を挙げることができる。そのような免疫測定法として、酵素免疫測定法 (EIA法）、免疫比濁測定法（TIA法）、ラテックス免疫凝集法（LATEX法）、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またィムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法は、いずれも当業者に周知の方 .

8

法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。

上記免疫測定法に使用できる抗体としては既に汎用されている方法により作製されるポリクローナルゃモノクローナル抗体が挙げられる。これらの抗体はヒト血液由来精製蛋白質、具体的には、 28 kDa蛋白質、 7. 8 kDa蛋白質、 5. 9 kDa蛋白質を免疫原（抗原）として使用することにより得ることができる。抗体を作成するためのこれらの蛋白質は、ヒト血液から精製して入手してもよレ、が、公知のペプチド合成技術を用い、化学合成して入手してもよい。これに限らず培養細胞などの産生蛋白質も抗原として用いることができる。更には、遺伝子工学的に作製された完全長の組換え蛋白質、それらの変異体、それらの一部分を用いることも常套手段であり、利用され得るものである。

モノクローナル抗体は、上記したさまざまな抗原、例えば、 28 kDa蛋白質、 7. 8 kDa蛋白質、 5. 9 kDa蛋白質、即ち、マーカー蛋白質などを免疫原として動物を免疫し、その脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることにより得られるハイプリドーマによって産生される。

ハイプリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち上述のようにして得た抗原、例えば、マーカー蛋白質をフロイントの完全、不完全アジュパント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に 1〜3週間おきに腹腔内皮下または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は通常 l ^ g〜100 mg の間とされているが、一般的には 50 μ _§ 程度が好ましい。免疫回数は 2〜7 回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄 B瘍細胞（ミエローマ細胞）等を試験管内で融合する。融合法としては既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Nature. 256， 495. 1975) によってポリエチレングリコール（PEG) を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。

融合した細胞からマーカー蛋白質を認識する抗体を産生するハイプリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、融合した細胞から限界希釈法によって HAT培地及ぴ HT培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイプリドーマを選択する。 96穴ゥエルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にマーカー蛋白質に対する抗体が含まれている場合には、マーカー蛋白質をプレート上に固定ィ匕したアツセィプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスィムノグロブリン- HRP標識抗体等、 2 次標識抗体を反応させる ELISA法により、マーカー蛋白質に対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質には HRP の他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤である BSA のみを結合したアツセィプレートによる ELISA を同時に行うことでマーカー蛋白質それぞれに対する特異的抗体のスクリーニングができることになる。つまりマーカー蛋白質プレートのいずれかで陽性であり、 BSA による ELISA法で陰性のクローンを選択する。

例えば、本発明者が樹立したハイプリドーマ CN- 1 および CN - 2 はヒト 5. 9 kDa蛋白質を特異的に認識するクローンであり、好ましい例として挙げることができる。ハイプリドーマ CN- 1 および CN - 2 は、〒305_8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IP0D) にそれぞれ、平成 15 年 12 月 12 日に受託番号 IP0D FERM BP-0856 として、また平成 15年 12 月 12 日に受託番号 IPOD FERM BP- 08565 として寄託されている。

ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えば α -ΜΕΜ、 RPMI1640、 ASF, S - clone などで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。ハイプリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによつて腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニゥム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法ゃクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテイン A などによるァフィ二ティークロマトグラフィーなどが挙げられる。

上記方法によつて精製された本発明によるモノクローナル抗体によつて検体中の 28 kDa蛋白質、 7. 8 kDa蛋白質または 5. 9 kDa蛋白質を精密測定することができる。 EIA法で検体中の 28 kDa蛋白質、 ⁷. 8 kDa蛋白質または 5. 9 kDa蛋白質を測定する方法としては、方法それ自体は公知であり、抗体としてマーカー蛋白質に対する 1種または複数のモノクローナル抗体を用いることにより行うことができる。以下にその例を記述する。初めにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタタリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合やィ匕学結合、ァフィ二ティーを利用してマーカー蛋白質に対するモノクローナル抗体を結合させる。感作抗体量は通常 1 ng〜100 mg/mlの範囲である。物理結合や化学結合、ァフィ二ティーなどによって固相に結合したモノクローナル抗体に検体を加えて反応させる。一定時間反応させた後、固相を洗浄し対応する二次標識抗体（例えば、抗 28 kDa蛋白質 2 次標識抗体、抗 7. 8 kDa蛋白質 2次標識抗体、抗 5. 9 kDa蛋白質 2次標識抗体）を加えて更に 2次反応させる。固相を再度洗浄し、 DAB発色基質などを加え反応させる。標識物質に HRPを用いた場合、基質には既知の DAB、 TMBなどを用いることができ、標識物質はこれに限定されるものではない。例えば酵素だけではなく金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属や FITC、ローダミン、 Texas Red、

Alexa、 GFPなどの化学的、生物的各種蛍光物質、 ³² P、 ⁵¹ Crなどの放射性物質など識別可能なあらゆる物質が挙げられる。

上記した免役測定法以外にも、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（LC) 法、ガスクロマトグラフィー（GC) 法などによりマーカー蛋白質を測定することができる。これらの方法も既に当業者に周知であり、それらの周知の方法をそのまま採用することができる。

以上に説明した方法により、肝臓疾患が疑われる患者から得た検体中の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否を検出しあるいはその量を測定することにより、肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患あるいは肝臓疾患の予後を診断することができる。本発明の診断方法は、上記した質量分析により行う場合には、質量分析計によつて得られるスぺクトルのパターン分析によって診断することもできる。本発明の診断方法は、例えば、習慣飲酒者や問題飲酒者が肝臓疾患を発症する可能性を診断することもでき、飲酒が要因の肝臓疾患、例えば、肝炎、肝硬変などを診断することもでき、また通常の肝臓疾患を診断することもできる。更には、肝臓疾患の治療経過などを診断することもできる。本発明の診断方法は、特にアルコール性肝障害、アルコール依存症などの診断に適している。以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

実施例 1

SAXII プロテインチップアレイを用いる肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の同定インフォームド ' コンセントを行なった患者血清を使用し、 SAXII プロテインチップアレイ（Ciphergen Biosystems, Inc) を用いて血清中の新規肝傷害マーカ一を検索した。 SAXII チップとは Strong Anion Exchange Chip のことであり、検体中の負電荷物質を結合させるという特徴を持っている。検体としてアルコール性肝障害患者入院直後及び禁酒後 1週間、 3 ヶ月そして正常者の血清を用いた。

( 1 ) 方法

以下にプロテインチップアレイ実験操作法を簡単に述べる。血清サンプルは 8M尿素（SIGMA) /1 % CHAPS (SIGMA) 溶液で 10倍に希釈した。 10分間氷上処理を行なった後、 50 mM トリス（SIGMA) 緩衝液（pH 9. 0) にて更に 10倍希釈し、 4, 000 rpm、 5 分間の遠心分離操作を行なってその上清を希釈サンプルとして用いた。 SAXII チップは Bioprocessor に取り付けて実験した。 Bioprocessor とは金属チップ上に立体的ゥエルを簡易作製する穴付ブラスチック製アダプタ一であり、この方法によって希釈サンプルを大量にアプライできる。

初めに 150 ΐ の 50 mM トリス緩衝液（pH 9. 0) をゥエル状になったチップに加え、振とう機上で 5分間洗浄を行なった。これを 2 回行なった後に先の希釈サンプル 100 μ ΐ を添カ卩し、室温で 20分間振とうしてチップと反応させた。続いて希釈サンプルを除き、 150 /z L の 50 mM トリス緩衝液 (pH 9. 0) を加えて振とう機上で 5分間洗浄を行なった。この操作を 3 回繰り返した。その後 400 μ ΐ の蒸留水で 2 回洗浄し、チップを Bioprocessor から取り外した。チップが乾いた後、 PAPen (Zymed) で蛋白質の接着しているスポットを囲み、 0. 5 μ ΐ の飽和シナピン酸 (Ciphergen Biosystems, Inc) /50 % ァセトニトリノレ (Wako) /0. 5 % TFA (Wako) 溶液を 2 回添加した。作製したプロテインチップアレイは、プロテイン ·バイオロジー · システム II *マス ·スぺクトロメータ一 (し iphergen Biosystems, Inc) ίこよって "取った。

( 2 ) 結果

図 1に、代表的なアルコール肝障害入院時患者血清の測定データを示す。このデータフォーマットでは、 SAXII プロテインチップから脱着されたサンプルのタンパク質の分子量を横軸に、その分子量で検出器に到達した分析物の量を反映するピークを縦軸で表すことができる。よって図 1から明らかなように、ァノレコール性肝障害患者の入院時のデータでは、分子量 28 kDa の蛋白質のピークが観察されたが、入院後はほとんど観察されないことが判明した。従って、この 28 kDa蛋白質を指標として、肝臓疾患を診断できることが判った。

実施例 2

WCXII プロテインチップアレイを用いる肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の同定次に実施例 1 と全く同一検体を使用し、 WCXII プロテインチップアレイ (Ciphergen Biosystems, Inc) を用いて血清中の新規肝傷害マーカーを検索した。 WCXII チップとは Weak Cation Exchange Chip のことであり、検体中の正電荷物質を結合させるという特徴を持っている。

( 1 ) 方法

以下にプロティンチップアレイ実験操作法を簡単に述べるが殆ど実施例 1と同様である。血清サンプルを 8M尿素（SIGMA) /1 % CHAPS (SIGMA) 溶液で 10倍に希釈した。 10分間氷上処理を行なった後、 50 mM酢酸ナトリゥム（SIGMA) 緩衝液 (pH 6. 5) にて更に 10倍希釈し、 4, 000 rpm、 5分間の遠心分離操作を行なってその上清を希釈サンプルとして用いた。 WCX I Iチップは Bioprocessor に取り付けて実験し、初めに 150 μしの 50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH6. 5) をゥエル状になったチップに加え、振とう機上で 5分間洗浄を行なつた。これを 2 回行なった後に先の希釈サンプル 100 μ ΐ を添加し、室温で 20 分間振とう反応させた。続いて希釈サンプルを除き、 150 μ ΐ の 50 m リン酸ナトリゥム緩衝液（pH 6. 5) を加えて振とう機上で 5 分間洗浄を行なった。この操作を 3 回繰り返した。その後 400 β ΐ の蒸留水で 2 回洗浄し、チップを Bioprocessor 力ら取り外した。チップが乾いた後、 PAPen (Zymed) で蛋白質の接着しているスポットを囲み、 0. 5 μ ΐ の飽和シナピン酸（Ciphergen

Biosystems, Inc) /50 % ァセトニトリル（Wako) /0. 5 % TFA (Wako) 溶液を 2 回添カ卩した。プロテインチップアレイは、プロテイン 'バイオロジー 'システム II ·マス ·スぺクトロメーター (Ciphergen Biosystems, Inc) によって読み取つた。

( 2 ) 結果

図 2に代表的なアルコール性肝障害入院時患者血清の測定データ、図 3に正常者の測定データを示す。図 3から明らかなように、図 3の正常者のデータでは、分子量 5, 900 Da (5. 9 kDa 蛋白質）及ぴ分子量 7, 800 (7. 8 kDa 蛋白質）のピークが大きいにもかかわらず、図 2のアルコ一ル性肝障害患者の入院直後のデータでは、ピークがほとんど認められないことが判明した。この 5. 9 kDa 蛋白質と 7. 8 kDa蛋白質のピークは治療に従ってピークが高くなり治療効果をよく示している。これらの蛋白質は肝臓疾患診断用マーカー蛋白質となりうることが判つた。

実施例 3

28 kDa 蛋白質の同定

( 1 ) SAXII プロテインチップ実験によって見出された 28 kDa蛋白質について FPLC Pharmacia LKB (Amersham Pharmacia Biotech AB) により、 HiTrap Q力ラムを用いて 50 mM トリス緩衝液 (pH 9. 0) 、流速 2 ml/min 条件下で血清サンプルを用いた精製を行なうと目的とする 28 kDa蛋白質をほぼ単一に精製できた。このフラクションを電気泳動法により次のように確認した。フラクションは SDS を含む 2 Xサンプルバッファー（0. 25 M Tris-HCl (pH 6. 8)， 4 % SDS, 20 % グリセロール， 0. 01 % BPB, 10 % -メルカプトエタノール）と 1 : 1の割合で混合し、 90 °C で 2 分間処理した後使用した。電気泳動は 15-25 %

Polyacrylamid Gradient Gel (Perfect NT bel System Products) を用レヽて 10 mA で行った。

( 2 ) 図 4のレーン 4および 5に示すように、 Comassie. Tablet R-350 (Phast Gl Blue R) (Amersham Pharmacia Biotech AB) によるクマシーブリリアントブルー染色によって 28 k Da の位置にバンドが確認された。

( 3 ) 次にこのゲルのパンドを切り出して I n - Gel Digestion 法によりぺプチドを分離した。簡単には Gel 片を 2 回洗浄した後、 35 °Cで一晩トリプシン処理した。次にこのトリプシン処理サンプルを逆相 HPLC法により精製した。精製条件は TSK gel 0DS-80Ts QA (T0S0H) カラムを用いた 0 1 % TFA と 0. 09 % TFA 90 %ァセトニトリルによるグラジェント溶出である。

この結果得られた 28 kDa蛋白質フラグメントの内部アミノ酸配列を決定した。 28 kDa蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号 3に示した。 28 kDa蛋白質フラグメントのァミノ酸配列分析を行なうとその内部配列からヒト

Apolipoprotein AIであること力 ^sわ力つ 7こ。

( 4 ) そこでチップ実験に用いた同一血清検体を後の実施例 6に述べる既知の自動分析機による免疫測定法を用いて測定し、 Apolipoprotein AI値を調べると表 1のような結果が得られた。この免疫測定法結果より治療効果の認められた患者検体では治療後明らかに Apolipoprotein AI 値が低下していた。一方、プロテインチップ実験結果の 28 kDa蛋白質（Apolipoprotein AI) ピークも治療によつて低くなり、治療効果を反映していた。このように免疫測定法による結果とプ口ティンチップ実験結果が非常によく相関し、ピークの大きさは病態解析に利用できることを示していることがわかつた。

実施例 4

7. 8 kDa蛋白質の同定

( 1 ) WCXII プロテインチップ実験によって見出された 7. 8 kDa蛋白質についても 28 kDa蛋白質と同様に FPLC Pharmacia LKB (Amersham Pharmacia

Biotech AB) にて HiTrap CM Sepharose FFカラムを用い、 50 mM Ammonium Acetate バッファー、流速 2 ral/min条件下で血清サンプルの精製を行なうと目的とする 7. 8 kDa蛋白質を精製できた。プロテインチップ実験によって 7. 8' kDa 蛋白質の確認出来たフラクションを電気泳動法により確認した。検体血清は SDS を含む 2 Xサンプルバッファーと 1： 1 の割合で混合し、 90 °C で 2 分間処理した後使用した。電気泳動は 15-25 % Polyacrylamide Gradient Gel を用いて 10 mAで行った。 (2) 図 4のレーン 2および 3に示すように、クマシ一ブリリアントプル一染色によって 7.8 kDa の位置にバンドが確認された。この 7.8 kDa の蛋白質をほぼ単一に含むフラクションを濃縮し、先の 28 kDa 蛋白質の実施例 3と同様に SDS - PAGE を行なってゲルから目的とする 7.8 kDaバンドを切り出して In- Gel Digestion法によりぺプチドを分離した。この方法は実施例 3と同様であるが簡単には Gel 片を 2 回洗浄した後、 35 °C でー晚トリプシン処理する。次にこのトリプシン処理サンプルを逆相 HPLC 法により精製した。精製条件は TSK gel 0DS-80Ts QA (T0S0H) カラムを用いた 0.1 % TFA と 0.09 % TFA 90 % ァセトニトリルによるグラジェント溶出である。

(3) 7.8 kDa蛋白質フラグメントのァミノ酸配列分析を行なうとその内部配列からヒト Apolipoprotein All であることがわかった。しかし完全長ヒト Apolipoprotein All の理論分子量は 11432.4 であり、 7.8 kDa蛋白質はつまりヒト Apolipoprotein All 分解産物であることがわかった。 7.8 kDa蛋白質のァミノ酸配列を配列番号 2に示す。

実施例 5

5.9 kDa蛋白質の同定

(1 ) WCXII プロテインチップ実験によって見出された 5.9 kDa 蛋白質について FPLC Pharmacia LKB (Amersham Pharmacia Biotech AB) にて HiTrap CM Sepharose FF カラムを用レヽ、 50 mM Ammonium Acetate ノッファー、流速 2 ml/rain 条件下で血清サンプルの精製を行なうと目的とする 5.9 kDa蛋白質を精製できた。再びプロテインチップ法により 5.9 kDa 蛋白質を多く含むフラクシヨンをチェックした後、濃縮して HPLC (T0S0H) によって更に精製を行なった。精製条件は Sephasil protein C4 カラム (Amersham Pharmacia Biotech AB) 、ァセトニトリルグラジェント、 1 mL/min である。

(2) 再ぴプロティンチップ法によりフラクションをチェックした後、凍結乾燥により濃縮してアミノ酸配列決定を行なった。精製 5.9 kDa 蛋白質のアミノ酸配列を決定するとヒト Fibrinogen ひ- E Chain分解産物であることがわかった。完全長ヒト Fibrinogen α-Ε Chain は分子量が 72488.3 であることから、 5.9 kDa 蛋白質はヒト Fibrinogen a-E Chain 分解産物であることがわかったのである。 5. 9 kDa蛋白質のァミノ酸配列を配列番号 1に示す。

更に 5. 9 kDa蛋白質のアミノ酸配列が正確なものである力確認するためにその配列の蛋白質を全化学合成した。ィ匕学合成された 54アミノ酸を有する蛋白質の分子量は 5904. 1であり理論値と一致した（図 5 ) 。またこの合成蛋白質を用いて実際の検体と比較検討を行った。実験は実施例 2と全く同様の WCXII プロティンチップアレイ（Ciphergen Biosystems, Inc) を用いて行い、サンプノレとして 100 ng/mLの濃度の合成蛋白質を反応させて、実際の血清と比較した。結果を図 6に示す。結果として合成蛋白質のピークは血清検体の 5. 9 kDa蛋白質と一致した挙動を示し、これらの結果より、血清中の 5. 9 kDa蛋白質は、アミノ酸配列力配列番号 1に示したものであることが確認された。

実施例 6

本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質と従来の肝炎

マーカーとに基くアルコール性肝障害患者の診断比較

( 1 ) 方法

これまでに使用したのと同じアルコール性肝障害入院患者 16人の入院直後、入院治療 1 週間経過後、入院治療後 3 力月経過後の血清を用いて、従来の肝炎マーカーの測定値を求めた。自動分析機による測定は AST 、 GGT 、 TG 、 Apo AI 及び Apo All については Hitachi 7150型分析機 (HITACHI) を使用して行レ、、試薬はそれぞれ N-アツセィ L GOT (AST) (Nittobo) 、 N-アツセィ L γ - GTP-H (GGT) (Nittobo) 、 N-アツセィ TG L (TG) (Nittobo) 、 N-アツセィ TIA Apo AII-H (Apo AI ) (Nittobo) 、 N-アツセィ TIA Apo All (Apo All (Nittobo) 、を使用した。 FDP及び FDP- E は LPIA - S500 (ダイアヤトロン）を用いて所定のパラメータ一にて測定し、試薬はエルピア FDP ラテックス、エルピア FDP-E ラテックス（帝国臓器）であった。尚、プロテインチップの測定結- 果をピークより数値ィヒして比較するが単位は AU (Arbitrary Units) である。

( 2 ) 結果

表 1はアルコール性肝障害によって入院した患者の一般的な血清中の臨床検査生化学系測定マーカー（AST、 GGT、 TG) 値、免疫系測定マーカー（Apo AI、 Apo ΑΠ、 FDP、 FDP-E) 値、そしてプロテインチップ法による本発明の肝臓疾患マーカー蛋白質の測定結果を示す。表 1の右から 2番目までの欄に（FDP-E 5, 900Da および Apo All 7, 800Da) 、実施例 2と同様のプロテインチップを用いた方法で本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質である 5. 9 kDa蛋白質と 7. 8 kDa蛋白質を測定した時の測定値が示されている。表 1の右から 6番目の欄（Apo AI) に、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質である 28 kDa蛋白質を従来法で測定した時の測定値が示されている。

表 2には健常人の血清検体における、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質である 5. 9 kDa 蛋白質（FDP - E 5, 900Da) と 7. 8 kDa 蛋白質（Apo All 7, 800Da) をプロティンチップ法により測定した時の測定値が示されている。

表 3は、プロテインチップ法により測定したアルコ一ル性肝障害入院患者の 5. 9 kDa蛋白質および 7. 8 kDa蛋白質測定平均値を示す。

表 1

アルコ一ル性肝障害患者における断酒後の臨床検査値変化

AST GGT TG Apo A I Αρο ΑΠ FDP FDP - E FDP - E Apo A ll

5，900Da 7,800Da

U/L U/L mg/dし mg/dL mg/dL μ g/mL ng/mL AU AU

No.1 入院時 34 542 672 144 37.3 2.99 1 10.32 11 J 9.9

1週間後 39 559 246 121 27.8 2.76 135.69 24.2 10.9

3力月後 25 121 142 79 17.4 1.63 80.20 20.8 6.1

No.2 入院時 13 9 103 88 15.0 3.57 77.28 0 3.1

1週間後 30 16 98 94 15.1 3.69 136.11 1.0 1 1.7

3力月後 15 3 173 95 20.8 2.65 126.56 t.8 20.0

No.3 入院時 42 68 100 155 38.2 1.37 70.† 8 0 0

1週間後 22 45 91 105 26.0 7.05 592.26 0 1.7

3力月後 18 19 1 17 104 21.5 1257.50 0.7 5.0

No.4 入院時 86 1452 150 234 45.0 3.39 93.30 0.5 7.9

1週間後 21 701 73 1 12 26.1 5.24 347.94 3.5 12.6

3力月後 15 24 68 95 17.7 7 27 516.60 17.7 21.1

No.5 入院時 24 74 93 95 21.8 0.31 35.1 1 0.8 2.4

1週間後 23 64 139 86 21.0 1.36 47.86 4.8 16.1

3力月後 35 †60 154 80 ^ 97 71.87 6.2 18.1

No.6 入院時 44 108 141 149 37.7 1.56 42.53 9.2 12.1

1週間後 25 64 1 17 98 26.0 3.56 248.95 48.0 21.4

3力月後 17 24 109 83 19.3 8.88 743.54 58.0 20.0

No.7 入院時 37 272 1 19 218 46.5 2.54 90.77 0 0

1週間後 27 174 77 157 33 7 2.05 91.00 23.0 18.4

3力月後 19 26 81 95 23.3 1.58 50.95 21.7 10.4

No.8 入院時 40 61 170 183 33.3 3.87 127.00 1 J 3.3

1週間後 24 57 65 1 13 22.7 3.17 189.23 0 5

3力月後 22 36 113 101 20.6 2.35 105.10 1.8 6.9

No.9 入院時 20 77 244 1 14 28.4 4.33 118.19 0 0.4

1週間後 25 65 121 109 24.9 5.03 330.58 0 7.1

3力月後 24 36 260 109 24.0 5.33 270.77 1.7 14.0

No.10 入院時 2.0 5.6

1週間後 55 232 67 69 18.5 13.52 915.69 8.7 16.1

3力月後 17 41 54 107 20.6 0.87 35.35 1.7 21.4

No.1 1 入院時 38 81 187 151 34.5 2.82 58.02 15.8 19.3

1週間後 20 67 98 1 16 28.1 6.33 554.17 56.0 26.4

3力月後 22 18 74 104 18.1 15.51 1310.60 52.0 18.6

No.12 入院時 18 37 103 135 24.8 1.91 43.10 0 1 1 J

1週間後 17 31 1 10 126 19.6 1.78 68.85 0.8 6.4

3力月後 21 32 1 18 136 22.6 1.03 33.59 1.2 15.0

No.13 入院時 18 31 84 198 30.6 1.99 38.14 12.2 9.4

1週間後 100 23 72 154 22.7 6.74 342.92 32.8 13.9

3力月後 17 18 80 180 22.6 14.37 1 1 18.50 45.0 15.0

No.14 入院時 63 44 333 154 39.5 3.07 96.96 0 3.1

1週間後 43 39 72 1 1 1 27.0 2.50 146.95 0.3 1 1.0

3力月後 37 26 159 92 23.2 4.73 382.86 0.3 12.1

No.15 入院時 49 86 91 146 28.9 1.35 58.93 13.0 7.0

1週間後 19 79 82 83 23.0 2.29 59.44 28.5 17.7

3力月後 22 60 1 12 86 22.5 2.99 177.59 51.0 18.0

No.16 入院時 29 84 90 1 62 31.3 3.24 88.54 2.5 1.3

1週間後 12 70 1 18 102 26.6 1.86 84.94 1.7 10.3

3力月後 1 6 15 96 72 17.0 5.84 213.87 2.0 13.3 表 2

健常人における 5. 9 kD a、 7. 8 kD a値

患者数 (n=16) 表 1から 3に示されるように、汎用されてきた AST、 GGT値の低下、正常値範囲への回復は肝治療効果を反映していた。しかし GGT ノンレスポンダーと思われる検体 No.5 にみられるように、これまで汎用されてきた GGT値が治療効果の指標になりえないケースでも、 5.9 kDa蛋白質おょぴ 7.8 kDa蛋白質は血中値が上昇し、治療効果をよく示していた。 GGTは肝障害の重症度や積算飲酒量とは必ずしも相関せず、またアルコール飲用後の GGT の変化には個体差があり、大量飲酒後にも増加しないいわゆるノンレスポンダーが相当数存在するので新規蛋白質はこれら GGT ノンレスポンダーの治療判定に有効であると考えられた。実施例 7 飲酒量と本発明マーカー蛋白質との相関

以上の実施例により、本発明によって見つかった新規肝臓疾患診断用マーカーの特異性について有用性が確認された。更に飲酒量との相関を解明するために、以下の実験を行った。

方法

健常人及び飲酒量の確実なアルコール摂取患者の検体だけを集めて実験を行つた。実験では飲酒なしの健常人、飲酒量日本酒 1 合相当、飲酒量日本酒 3合相当の 3つの実験区にわけてプロテインチップ法を用いた測定を行い、それぞれの新規マーカーについて比較をした。また、プロテインチップを用いた測定方法は実施例 1による SAXII プロテインチップアレイ、実施例 2における WCXIIプ口ティンチップアレイで述べたものと全く同様である。

ロ

結果を図 7に示す。結果として全ての新規肝臓疾患診断用マーカー蛋白質で飲酒量依存的にピークが増減することがわかった。ここでは特に 5. 9 kDa蛋白質の結果について示す。飲酒量 5. 9 kDa蛋白質は飲酒量依存的に減少し、 3合を飲酒していた実験区ではほぼ検出できないレベルに低下していた。つまり 5. 9 kDa蛋白質は飲酒量依存的に変化し、アルコール飲酒量を推定するのに十分利用できるマーカーであることが判明した。また、アルコール依存症のマーカーとなり得ることが判明した。

実施例 8

モノクローナル抗体の作製

実施例 5で得られた完全合成 5. 9 kDa蛋白質を抗原として用いて、抗 5. 9 kDa蛋白質モノクローナル抗体を作成するため以下の実験を行った。

( 1 ) 免疫

完全合成 5. 9 kDa蛋白質を 1 mg/mlとなるようにリン酸緩衝液 (pH 7. 0) で希釈し、 50 μ _§ (50 μ ΐ) をとつてフロインド完全アジュバンド（WAK0) 50 〃 1と乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液を Balbん 6週齢雌マウス（日本クレアー）にジェチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。 2週間後には同量の完全合成 5. 9 kDa蛋白質（50 μ g/ml) をフロインド不完全アジュパンド（WAK0) と混和してフロインド完全ァジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降 2 週間後に同様の操作を行い、 4 回目には最終免疫として完全合成 5. 9 kDa蛋白質 50 // g/mlをリン酸緩衝液（pH 7. 0) で調製しマウス尾静脈注射により投与した。

( 2 ) ハイプリドーマの確立

最終免疫より 3 日後に合成 5. 9 kDa蛋白質により感作済みのマウスよりジェチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Nature. 256， 495. 1975) に従って行われ、ポリエチレングリコール（PEG4000) (MERK) を用いて脾細胞と骨髄腫細胞 P3 - X63- Ag8- Ul (P3U1) を融合した。その融合比率は脾臓細胞数 10 X 10⁷個に対して骨髄腫細胞 P3 - X63 - Ag8- Ul (P3U1) 2 X 10⁷個で、 5： 1であった。融合細胞は 10 % FCS (INVITR0GEN) ひ- MEM (IRVINE) HAT (コスモバイオ）培地に分散し 96 穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト）に分注して 37 °C、 5 % CO ₂条件にて培養した。

( 3 ) スクリーニング

約 2週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。スクリーニング用プレートを作製するために上記実施例にて精製した合成 5. 9 kDa蛋白質をリン酸緩衝液中に溶解し、 1 z g/ 100 μ ΐ/wellとなるように 96穴ゥエル（Nunc) に分注した。プレートを 4 。Cで 2 晚静置した後に 0. 05 % Tween 20を含むリン酸緩衝液で 3回洗浄し、非特異的反応を抑えるために 1. 5 % BSA溶液を 200 μ ΐ分注して、更に 4 °Cで 1晚静置した。完成したプレートを 0. 05 % Tween 20を含むリン酸緩衝液で 3回洗浄した後に培養上清 100 μ ΐを反応させ、更に洗浄を行った後に 2 次抗体である HRP標識抗マウスィムノグロブリン抗体（Zymed) を加えて反応させた。洗浄後に HRPの発色基質である 3 mg/ml o -フエ二レンジァミン（OPD) (Nacalai tesque) クェン酸発色溶液を 100 1加えて一定時間の発色後、 1N硫酸を停止液として更に 100 i l添加し、測定波長 492 nmにて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チェックした。

( 4 ) 抗体の確認、 ELISAによって合成 5. 9 kDa 蛋白質との反応性を確認し、クローン CN - 1 およぴ CN - 2 の 2種類が合成 5. 9 kDa蛋白質を認識したものとして選択した。得られた f几体をモノクローナノレ抗体タピンクキット（Amersham Pharmacia Biotech) にて検定した結果を表 4に示す。表 4 ：モノクローナル抗体の特性

ハイプリドーマクラス軽鎖クローン CN - 1 IgM κ クローン CN - 2 IgM κ

( 5 ) モノクローナル抗体の作製及ぴ精製

得られたハイプリドーマ CN- 1 および CN- 2細胞 1 X 10 '細胞個をプリスタン（ァルドリッチ） 0. 5 ml投与後 2週間の Balbんマウス（日本クレア一）、 10週齢、雌性に腹腔内投与し、約 2 週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジェチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。スクリーニングで行った ELISA法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安 40 % で処理し、 PBSに透析した後、 CN- 1、 CN-2は S- 300 を用いて精製した。その結果 CN- 1、 CN-2は非還元では分子量約 900， 000に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約 70， 000のバンドと 25， 000の 2本のパンドが確認された。精製された抗体は CN-1、 CN-2ともにマウス 1匹あたりそれぞれ約 10mg以上であって工業的利用を行うには十分量であつた。

実施例 9

EIA 法による 5. 9 kDa蛋白質の測定

5. 9 kDa 蛋白質の 2種のモノクローナル抗体 CN- 2、 CN - 1を、それぞれ、一次抗体、標識された二次抗体として使用し、 ELISA 法（EIA法）により検体中の 5. 9 kDa蛋白質を測定できるかどう力検討した。

( 1 ) 方法

ELISA用プレートを作製するため、一次抗体 CN- 2をリン酸緩衝液 (pH 7. 0) に溶解し、 .1 μ g/100 ^u l/wellとなるように 96穴ゥエル（Nunc) に分注した。プレートを 4 °Cで 2晚静置した後に 0. 05 % Tween 20を含むリン酸緩衝液で 3回洗浄し、非特異的反応を抑えるために 1. 5 % BSA溶液を 200 μ ΐ分注して、更に 4 °Cで 1晚静置した。完成したプレートを 0. 05 % Tween 20を含むリン酸緩衝液で 3回洗浄した後に各種濃度の合成 5. 9 kDa蛋白質を標準品として 100 1を添カ卩し、室温で 1時間反応させた。反応終了後、 0. 05 % Tween 20を含むリン酸緩衝液で 3回洗浄し、二次抗体である HRP標識 CN- 1抗体を加えて反応させた。洗浄後に HRPの発色基質である 3 mg/ml o -フエ二レンジァミン（OPD) (Nacalai tesque) クェン酸発色溶液を 100 μ ΐ加えて一定時間の発色後、 1N硫酸を停止液として更に 100 ju l添加し、測定波長 492 画にて吸光度を測定した。

( 3 ) 結果

上記のようにして測定した各種濃度の合成 5. 9 kDa蛋白質における発色値から、合成 5. 9 kDa蛋白質測定標準曲線を作成すると図 8のような結果であった。図 8より、合成 5. 9 kDa蛋白質の濃度依存的に、吸光度の上昇がみられた。つまり、 5. 9 kDa蛋白質を認識するモノクローナル抗体 CN-1と CN-2は認識部位を異にするため、これら抗体をサンドイッチ ELISA法に使用することにより、 5. 9 kDa 蛋白質を測定できることが判明した。産業上の利用可能十生

以上に具体的に示したように、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質は、 GGT等の従来の肝炎マーカーが反応性の低いノンレスポンダー、または肥満にともなう脂肪肝、ある種の薬剤常用者など飲酒以外の要因で GGT が高値を示す場合でも、正確に飲酒からくる肝臓疾患患者の治療判定効果を調べ状態把握を行なう指標となり得る。つまり GGT は飲酒以外にウィルス性の慢性肝障害 ·肥満 ' ある種の薬剤の連用など他の要因で上昇するために特異性が低いのに対して、この点、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質はウィルス性肝硬変でも変動しないので特異性に期待がもてるという長所がある。また測定対象が生ィ匕学的酵素機能に依存しないべプチドであることから検体の取り扱いがよく、測定再現性が良いという特徴があることも判明した。本発明の診断方法は、例えば、習 1貫飲酒者や問題飲酒者が肝臓疾患を発症する可能性を診断することもでき、飲酒が要因の肝臓疾患、例えば、肝炎、肝硬変などの肝臓疾患を診断することもできる。更には、そのような肝臓疾患の治療経過などを診断することもできる。本発明の診断方法は、特にアルコール性肝障害、アルコール依存症などの診断に適している。本発明の診断方法においては、マーカー蛋白質を汎用的 EIA法、ィムノクロマト、さらには紙験紙などにより測定して実施することができる。これらの汎用されてレヽる方法により簡便に診断可能であることは、現在の肝疾患人口から考えても今後の予防医学的見地から意義が大きいものと考えられる。

Claims

請求の範囲

1. ヒトフイブリノ一ゲンひ- E鎖（Fibrinogen a ~E Chain) の分解産物であつて分子量 5, 900 の蛋白質（5. 9 kDa 蛋白質）、アポリポプロテイン ΑΠ (Apolipoprotein All) の分解産物であって分子量 7， 800の蛋白質（7. 8 kDa蛋白質）、アポリポプロテイン AI (Apolipoprotein AI) であって分子量 28, 000 の蛋白質おょぴこれらの蛋白質の変異体であってこれらと同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する変異体から選ばれる肝臓疾患診断用マーカ一蛋白質。

2. 5. 9 kDa蛋白質が配列表の配列番号 1のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、その変異体が該アミノ酸配列と 90 %以上の相同性を有する蛋白質あるいは配列番号 1のアミノ酸配列において 1 個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付カ卩したアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項 1の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。

3. 7. 8 kDa蛋白質が配列表の配列番号 2のァミノ酸配列を有する蛋白質であり、その変異体が該アミノ酸配列と 90 %以上の相同性を有する蛋白質あるいは配列番号 2のアミノ酸配列において 1 個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項 1の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。

4. アポリポプロテイン AI であって分子量 28， 000 の蛋白質が配列表の配列番号 3のァミノ酸配列を有する蛋白質であり、その変異体が該ァミノ酸配列と 90 %以上の相同性を有する蛋白質あるいは配列番号 3のアミノ酸配列において 1 個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項 1の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。

5. 飲酒が要因の肝臓疾患診断用の請求項 1から 4のいずれかの肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。

6. アルコール性肝障害診断用またはアルコール依存症診断用の請求項 5の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。

7. 肝臓疾患が疑われる患者から得た検体中の、請求項 1カゝら 6のいずれかの肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否を検出しあるいはその量を測定して、肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患あるいは肝臓疾患の予後を診断する方法。

8. 肝臓疾患が飲酒が要因の肝臓疾患である請求項 Ίの診断方法。

9. 肝臓疾患がアルコール性肝障害またはアルコール依存症である請求項 8の診断方法。

10. 検体中の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否の検出あるいはその量の測定を質量分析法により行なう請求項 7力ら 9のいずれかの診断方法。

11. 質量分析計で得られるスぺクトルのパターン分析により診断する請求項 1 0の診断方法。

12. 質量分析をレーザーイオン化飛行時間型質量分析計（LDI- TOF MS) により行う請求項 1 0または 1 1の診断方法。

13. レーザーィオン化飛行時間型質量分析計が表面増強レーザーィオン化飛行時間型質量分析計（SELDI- TOF MS) である請求項 1 2の診断方法。

14. 検体中の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否の検出あるいはその量の測定を、該蛋白質に対する抗体を用いた免疫測定法により行う請求項 7から 9のいずれかの診断方法。

15. 免疫測定法が、酵素免疫測定法（EIA法）、免疫比濁測定法（TIA法）、ラテックス免疫凝集法（LATEX法）、電気化学発光法または蛍光法である請求項 1 4の診断方法。

16. 免疫測定法が、酵素免疫測定法（EIA法）である請求項 1 5の診断方法。

17. 配列表の配列番号 1のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその変異体であつて該蛋白質と同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有し且つ該ァミノ酸配列と 90 %以上の相同性を有する蛋白質もしくは配列番号 1のァミノ酸配列において 1個から数個のァミノ酸残基が欠失、置換もしくは付カ卩したァミノ酸配列を有する蛋白質である変異体。

18. 配列表の配列番号 2のァミノ酸配列を有する蛋白質またはその変異体であつて該蛋白質と同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有し且つ該アミノ酸配列と 90 %以上の相同性を有する蛋白質もしくは配列番号 2のァミノ酸配列において 1個から数個のァミノ酸残基が欠失、置換もしくは付カ卩したァミノ酸配列を有する蛋白質である変異体。

19. 請求項 1 7または 1 8の蛋白質またはその変異体、あるいはアポリポプロティン AI (Apolipoprotein AI) であって分子量 28， 000 の蛋白質またはその変異体であってそれと同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する変異体の測定方法であって、それらの蛋白質または変異体に対する抗体を用いて免疫測定法により測定する測定方法。

20. 免疫測定法が、酵素免疫測定法（EIA法）、免疫比濁測定法（TIA法）、ラテックス免疫凝集法（LATEX法）、電気化学発光法または蛍光法である請求項 1 9の診断方法。

21. 免疫測定法が、酵素免疫測定法（EIA法）である請求項 2 0の診断方法。