NO336459B1

NO336459B1 - Markørproteiner og in vitro metoder for diagnostisering av leversykdom og metoder for måling av protein.

Info

Publication number: NO336459B1
Application number: NO20052992A
Authority: NO
Inventors: Takeshi Tomonaga; Tatsuya Ohashi; Katsuhiro Katayama; Fumio Nomura; Kazuyuki Sogawa; Takenori Ochiai; Hideaki Shimada
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 2002-12-24
Filing date: 2005-06-17
Publication date: 2015-08-31
Also published as: US7781180B2; EP1577385A1; CN1732261A; NO20052992L; JPWO2004058966A1; CN100384996C; EP1577385A4; US7517951B2; US20060116504A1; WO2004058966A1; DE60331857D1; JP4196948B2; EP1577385B1; ATE462001T1; AU2003296085A1; US20090275059A1; NO20052992D0

Abstract

Ved anvendelse av protein-chip teknologi, kan biologiske prøver slik som sera underlegges proteomanalyse. Følgelig er det nylig funnet et protein som er et humant fibrinogen (-E kjede nedbrytningsprodukt og har en molekylvekt på 5,900, et protein som er et apolipoprotein All nedbrytningsprodukt og har en molekylvekt på 7,800 og et protein som er et apolipoprotein Al nedbrytningsprodukt og har en molekylvekt på 28,000, som hver viser en økning eller en reduksjon med drikkevanene. Ved å detektere eller kvantifisere disse proteinene, kan en leversykdom i et subjekt slik som et som har et problem med hensyn til drikking diagnostiseres på et tidlig stadium.

Description

TEKNISK OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår en rekke serumproteiner som er funnet å øke eller minske med drikkevaner og følgelig å være anvendbare som markørproteiner for diagnostisering av leversykdom, som et resultat av proteomanalyse av serumprøver ved anvendelse av protein-chip teknologien; og in vitro metoder for diagnostisering av leversykdom og metoder for måling av protein.

KJENT TEKNIKK

Det første trinnet ved diagnostisering av et organproblem forårsaket av alkohol er å kjenne til en nøyaktig drikkehistorie, men alkoholavhengighet anses som en sykdom som fornektes, dvs. at en kronisk alkoholmisbruker ikke nøyaktig innberetter sitt alkoholinntak i alle aldre og land. Derfor er det nødvendig med en objektiv markør for å dokumentere alkoholinntak. En markør som vanligvis måles for drikkevaner er y-GTP (GGT). Imidlertid, selv om en person som drikker har et høyt GGT-nivå, samsvarer ikke alltid GGT-nivået med alvorlighetsgraden av leverproblemer eller det kumulative alkoholinntaket hos personen som drikker. I tillegg er forandringen av GGT-nivå etter drikking av alkohol individavhengig og det er et betraktelig antall av såkalte ikke-respondere som ikke fremviser noen GGT-økning selv etter drikking av en stor mengde alkohol.

På den annen side er GGT ofte, av en annen årsak enn drikking, økt også hos en person som ikke har noen tilbøyelighet til drikking, slik som en person som har fettlever på grunn av fedme eller en person som jevnlig tar en bestemt medisin. Det gis ofte veiledning, for eksempel, på et sykehus for fullstendig fysisk undersøkelse slik at en person som har et høyt GGT-nivå forhastet kan anses for å være en person som drikker. Derfor er chain-deficient transferrin (CDT) utviklet av forskere i Nordeuropa for undersøkelse komplementær til undersøkelsen med GGT og dens anvendelighet er fremhevet i europeiske og amerikanske referanser. Men i tilfellet av resultatet oppnådd for Japan, tillater CDT som en markør for

drikkfeldighet deteksjon av bare ca. 10% av GGT ikke-responderne.

Acetaldehyd, den første metabolitten av etanol, er så reaktiv at den danner forskjellige acetaldehyd "addicts" av forskjellige proteiner. For eksempel har det blitt gjort forsøk på å detektere et acetaldehyd-hemoglobin addict ved HPLC eller lignende. Det finnes også et addict som er forventet å være en interessant markør i stand til å tillate vurdering av alkoholinntak i fortiden, slik som HbAlc i tilfellet av diabetes. Men, et slikt addict har ikke blitt satt til praktisk anvendelse på grunn av dets lave sensitivitet.

Tilbøyeligheten til drikkfeldighet er én av to hovedårsaker til kroniske leverproblemer. Med hensyn til tilfeller av levercirrhose i Japan, er

prosentandelen av tilfeller bare på grunn av alkohol i seg selv ansett å være kun 10 til 15%. Dette er imidlertid data oppnådd hovedsakelig ved universitetssykehus og lignende. I betraktning av tilstedeværelsen av alkoholikere i en mengde beregnet til mer enn 2,000,000, er det spekulert i at det er mange latente pasienter med alkoholisk leverproblem som ikke har noen sjanse til å få en medisinsk undersøkelse i en medisinsk institusjon. Siden tilbøyeligheten til drikkfeldighet er en faktor for eksaserbasjon av hjerneblødning, hypertensjon, gikt og lignende, er i tillegg tidlig og nøyaktig screening av alkoholmisbrukere svært viktig. Imidlertid finnes det, som beskrevet ovenfor, blant eksisterende såkalte markører for drikkfeldighet ingen markør som har avgjørende sensitivitet og spesifisitet og således er det ønsket å lete etter en ny markør.

En generell metode for omfattende ekspresjons protein-analyse er todimensjonal protein-elektroforese, men denne metoden er ufordelaktig for deteksjon av proteiner eller peptider med lav molekylvekt. I de senere år er en protein-chip teknologi omfattende en kombinasjon av surface enhanced laser desorpsjon ionisasjon (SELDI) og et time-of-flight massespektrometer utviklet av Ciphergen Biosystems Inc., USA og har begynt å bli anvendt klinisk for, for eksempel, detektering av en ny tumormarkør. Derfor er omfattende leting etter en

ny markør ved utnyttelse av en slik proteomikk-teknikk og lignende ønsket.

WO 9416085 A2 beskriver fibrinogensekvensen som SEQ ID NO:l heri er den del av, men beskriver ikke diagnostisering av leversykdom.

POYNARD T ET AL; A simple biological index for detection of alcoholic liver disease in drinkers, Gastroenterology vol. 100, no. 5, 1991, pages 1397-1402, ISSN 0016-5085 beskriver markører for diagnostisering av leversykdom knyttet til alkoholinntak.

WO 0186304 A2 omhandler biologiske markører og algoritmer for å diagnostisere fibrose i lever.

FREMLEGGING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse skal finne en ny markør som er i stand til å tillate tidlig og nøyaktig screening av leversykdommene hos alkoholmisbrukere eller lignende, etablere et system for å måle markøren og dra fordel av markøren i medisinsk behandling.

Foreliggende oppfinnere har arbeidet intensivt med forskning angående problemet ovenfor og har som følge av dette oppnådd foreliggende oppfinnelse. Det vil si at foreliggende oppfinnere har lykkes i å identifisere nye serumproteiner som hver viser en økning eller en reduksjon med tilbøyeligheten til å drikke, ved anvendelse av serumprøver periodisk oppsamlet fra alkoholikere som er lagt inn på sykehus for å slutte å drikke. Foreliggende oppfinnere har funnet at disse serumproteinene er anvendbare som markørproteiner for diagnostisering av leversykdom, hvorved foreliggende oppfinnelse har blitt fullført.

Følgelig angår foreliggende oppfinnelse etmarkørprotein for diagnostisering av leversykdom valgt fra et protein som er et humant fibrinogen a-E kjede nedbrytningsprodukt og har en molekylvekt på 5,900 (5,9 kDa protein), og variant av proteinet som har den samme funksjonen som den til proteinet som en markørprotein for diagnostisering av leversykdom, hvor 5,9 kDa proteinet er et protein som har aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO:l sekvenslisten, og varianten derav er et protein som har 90% eller mer homologi med nevnte aminosyresekvens eller er et protein som har en aminosyresekvens dannet ved delesjon, substitusjon eller addisjon av en eller flere aminosyreresidier i aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO:l, som resulterer i en modifikasjon som er mindre enn 10% av nevnte SEQ ID NO.

I tillegg angår foreliggende oppfinnelse en in vitro metode for diagnostisering av sannsynligheten for start av en leversykdom, leversykdommen eller prognose for leversykdom ved detektering eller kvantifisering av markørproteinet for diagnostisering av leversykdom ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 i en prøve oppnådd fra en pasient som antas å ha leversykdommen.

Følgelig angår foreliggende oppfinnelse et nytt protein som har aminosyresekvensen vist som SEKV ID NR: 1 i sekvenslisten, eller dets variant som har samme funksjon som nevnte protein som et markørprotein for diagnostisering av leversykdom, hvilken variant er et protein som har 90% eller mer homologi med nevnte aminosyresekvens eller et protein som har en aminosyresekvens dannet ved delesjon, substitusjon eller tilføyelse av én eller flere aminosyrerester i aminosyresekvensen vist som SEKV ID NR: 1.

Enda videre angår foreliggende oppfinnelse en in vitro diagnosemetode ifølge krav 4, hvor leversykdommen er en leversykdom forårsaket av drikking.

Enda videre angår foreliggende oppfinnelse et protein bestående av aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO:l i sekvenslisten eller varianten derav som har samme funksjon som den til nevnte protein som en markørprotein for diagnostisering av leversykdom, idet nevnte variant er et protein som har 90% eller mer homologi med nevnte aminosyresekvens eller er et protein bestående av en aminosyresekvens dannet ved delesjon, substitusjon eller addisjon av en eller flere aminosyreresidier i aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO:l, som resulterer i en modifikasjon på mindre enn 10% av nevnte SEQ ID NO.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en metode for måling av et protein eller variant derav ifølge krav 14, ved en immunoanalysemetode ved anvendelse av et antistoff mot proteinet eller varianten.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGER

Fig. 1 viser målingsresultater oppnådd fra serumet til en pasient med alkoholisk leverproblem ved anvendelse av SAXU-chips ved anvendelse av Protein Chip System tilgjengelig fra Ciphergen Biosystems Inc. Fra reduksjonen i høyde av toppen, kan det ses at nivået av 28 kDa-proteinet (apolipoprotein AI) minsker

gradvis i serum med tidens gang i henhold til nivået på tidspunktet for innleggelse, nivået etter sykehusopphold i 1 uke og nivået etter sykehusopphold i 3 måneder.

Fig. 2 viser målingsresultater oppnådd fra serumet til en pasient med alkoholisk leverproblem ved anvendelse av WCXG-chips på samme måte som i Fig. 1. Det kan ses at blodnivåene av (1) 5,9 kDa-proteinet og (2) 7,8 kDa-proteinet øker med behandling med tidens gang fra blodnivåene på tidspunktet for innleggelse. Fig. 3 viser målingsresultater oppnådd fra serumet til en frisk person ved anvendelse av WCXII-chips på samme måte som i Fig. 1. Blodnivåene av (1) proteinet på 5,9 kDa og (2) proteinet på 7,8 kDa er avgjort høye nivåer og sammenligning mellom Fig. 2 og Fig. 3 indikerer at disse proteinene er redusert ved sykdommen. Fig. 4 viser resultatet av elektroforese av proteinet på 7,8 kDa og proteinet på 28 kDa ved SDS-PAGE. Det kan ses at prøvene inneholder proteinene av interesse, henholdsvis. Fig. 5 viser massespektrometri-verdien og HPLC-data for syntetisk 5,9 kDa protein. Det kan ses at massespektrometri-verdien stemmer overens med den teoretiske verdien. Fig. 6 viser resultatet av sammenligning av data for det syntetiske 5,9 kDa proteinet med data for serumet fra en pasient som ikke drikker, ved anvendelse av WCXJJ protein-chip arrays ved anvendelse av Protein Chip System tilgjengelig fra Ciphergen Biosystems Inc. Begge viser en topp ved 5,9 kDa og de oppviser samme oppførsel. Fig. 7 viser resultatet av måling av høyden av en topp ved 5,9 kDa i tilfellet av en serumprøve fra hver av friske personer og pasienter, som er forskjellige i alkoholinntak, ved anvendelse av WCXII protein-chip arrays ved anvendelse av Protein Chip System tilgjengelig fra Ciphergen Biosystems Inc. Det ble funnet at høyden av toppen reduseres avhengig av alkoholinntaket. Fig. 8 viser resultatet av måling av absorbans ved anvendelse av en EIA-metode (en sandwich ELISA-metode) ved anvendelse av prøver inneholdende forskjellige konsentrasjoner av proteinet på 5,9 kDa. X-aksen angir konsentrasjonen av 5,9 kDa proteinet og ordinataksen absorbansen målt. Absorbansen øker avhengig av konsentrasjonen av 5,9 kDa proteinet. Altså indikerer dette resultatet at konsentrasjonen av 5,9 kDa proteinet i prøvene kan måles ved en EIA-metode.

METODE FOR UTFØRELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse er forklart mer detaljert nedenfor.

Proteinene som er funnet å være anvendbare som markørproteiner for diagnostisering av leversykdom ved foreliggende oppfinnelse er et protein som er et nedbrytningsprodukt av human fibrinogen a-E kjede og har en molekylvekt på 5,900 (nedenfor referert til som 5,9 kDa-proteinet), et protein som er et nedbrytningsprodukt av apolipoprotein All og har en molekylvekt på 7,800 (nedenfor referert til som 7,8 kDa-proteinet) og et protein som er apolipoprotein AI og har en molekylvekt på 28,000 (nedenfor referert til som 28 kDa-proteinet). Proteinet på 5,9 kDa, proteinet på 7,8 kDa og proteinet på 28 kDa er proteiner som har aminosyresekvensene vist som SEKV ID NR: 1, 2 og 3, henholdsvis, i sekvenslisten.

De individuelle proteinene er forklart nedenfor. 5,9 kDa-proteinet er et nedbrytningsprodukt av human fibrinogen a-E kjede, omfatter 54 aminosyrer og har en teoretisk molekylvekt på 5904,2. Proteinet på 7,8 kDa er et nedbrytningsprodukt av human apolipoprotein AU, omfatter 68 aminosyrer og har en teoretisk molekylvekt på 7753,8. Proteinet på 28 kDa er apolipoprotein AI, omfatter 243 aminosyrer og har en teoretisk molekylvekt på 28078,8. Med hensyn til 5,9 kDa-proteinet og 7,8 kDa-proteinet blant de ovennevnte proteinene, har foreliggende oppfinnelse klarlagt deres tilstedeværelse i blod og deres kliniske betydning når det gjelder leverproblemer og lignende for første gang. Proteinet på 5,9 kDa og proteinet på 7,8 kDa er nye proteiner og nye markørsubstanser. Apolipoprotein AI, 28 kDa-proteinet er et kjent protein, dets klinisk betydning når det gjelder lipidmetabolisme er fastslått og klinisk måling av det har tidligere blitt utført.

Proteinet på 5,9 kDa som er funnet å fungere som markørproteiner for diagnostisering av leversykdom ved foreliggende oppfinnelse, er ikke begrenset til proteiner som har aminosyresekvensene som vist i sekvenslisten men kan være varianter av disse proteinene som likeledes fungerer som markørproteiner for diagnostisering av leversykdom. Altså skulle det tas tilstrekkelig hensyn til at 5,9 kDa-proteinet, 7,8 kDa-proteinet og 28 kDa-proteinet er svært tilbøyelig til å bli brutt ned av forskjellige endo- og exoproteaser spesielt i blod og vev, hvilket resulterer i endringer av den totale lengden av aminosyrer og lengden av sekvensen. Ved fremstilling av et rekombinant protein, skulle det bli gitt en aminosyrevariasjon som selvfølgelig så lite som mulig er i stand til å endre antigenisiteten, for ikke å redusere effektiviteten av ekspresjon. Derfor kan det også anvendes varianter av proteinet på 5,9 kDa ifølge foreliggende oppfinnelse som er proteiner som har 90% eller mer homologi med aminosyresekvensen av hvert av proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse (her betyr betegnelsen "homologi" likhet av aminosyrer). Aminosyresekvensen av hvilke som helst av variantene kan ha en lengde endret med 15% eller mindre og foreliggende oppfinnelse omfatter også en slik variant når den fungerer som et markørprotein for diagnostisering av leversykdom. Variantene er fortrinnsvis proteiner som har 95% eller mer homologi, mer foretrukket 98% eller mer homologi. Homologien av aminosyresekvensen kan finnes i velkjent programvare, for eksempel programvare oppnådd ved å ta i bruk som et prinsipp referansemetoden beskrevet ved metoden ifølge Wilber, W.J., Lipman, D.J., et al. (Proe. Nati. Sei. USA, 80, 726-730, 1983). I tillegg er GENETYX (Software Development Co., Ltd.) eller lignende kommersielt generelt virkende programvare og er lett å anvende.

Variantene av 5,9 kDa-proteinet, som er markørproteinene for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse, kan også være varianter som er proteiner som har en aminosyresekvens dannet ved delesjon, substitusjon eller tilføyelse av én eller flere aminosyrerester i hver av aminosyresekvensene vist som SEKV ID NR: 1 og har samme funksjon som de ovennevnte tre proteinene som markørproteiner for diagnostisering av leversykdom. Som slike varianter er det eksemplifisert proteiner oppnådd ved modifikasjonen av mindre enn 10%, fortrinnsvis mindre enn 5%, mer foretrukket mindre enn 2%, av aminosyrerestene i den opprinnelige aminosyresekvensen. Modifikasjonen av aminosyrerestene kan innføres som aminosyrevariasjon ved en genetisk teknikk generelt kjent for fagfolk på området. Foreliggende oppfinnelse omfatter også varianter oppnådd ved velkjent modifikasjon slik som posttranslasjonell modifikasjon, fosforylering, acetylering, tilføyelse av sukkerkjede eller lignende.

Diagnose av leversykdommer blir mulig på grunnlag av markørproteinene for diagnostisering av leversykdom funnet ifølge foreliggende oppfinnelse og forklart ovenfor. Det vil si at sannsynligheten for start av en leversykdom, leversykdommen eller prognosen for leversykdommen kan diagnostiseres ved å detektere eller kvantifisere ovennevnte markørproteiner for å diagnostisere leversykdom i en prøve tatt fra en pasient som er antatt å ha leversykdommen.

Som prøven anvendelig i foreliggende oppfinnelse kan det nevnes som eksempler serum, plasma, blod og urin oppsamlet fra pasienten som er antatt å ha leversykdommen.

Alle metoder som er kjent hittil kan tas i bruk for å detektere eller kvantifisere markørproteinene for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse. Metodene omfatter for eksempel massespektrometri-metode, immunanalysemetode, elektroforesemetode, væskekromatografi (LC)-metode og gasskromatografi (GC)-metode.

Som massespektrometri-metoden, kan en metode ved anvendelse av en laser desorpsjon/ionisering-time of flight-massespektrometer (LDI-TOF MS) være et eksempel. Som laser desorpsjon/ionisering-time of flight-massespektrometer, kan det eksemplifiseres surface enhanced laser desorpsjon/ionisasjon-time of flight-massespektrometere (SELDI-TOF MS metode) og matriks assistert laser desorpsjon/ionisasjon-time of flight-massespektrometere (MALDI-TOF MS metode).

Når for eksempel SELDI-TOF MS-metoden tas i bruk kan Protein»Biology»System II»Mass»Spectrometer (Ciphergen Biosystems, Inc.) utviklet av Ciphergen Biosystems, Inc. anvendes. Denne maskinen er basert på en protein-chip teknologi omfattende en kombinasjon av SELDI (surface enhanced laser desorpsjon ionisasjon) og et time-of-flight massespektrometer. Detaljene ved maskinen er beskrevet i internasjonal publikasjon nr. WO 01/25791 A2, JP-A-2001-28122 og lignende. Ved SELDI-TOF MS-metode blir en prøve vanligvis forbehandlet, adsorbert til en chip og deretter fylt på et SELDI-TOF MS-massespektrometer. Når prøven er serum er det foretrukket å fjerne albumin fra systemet ved anvendelse av en adsorbent for albumin eller vaske systemet med en bufferløsning helt til besittelsen av elektrisk ladning ved albumin på grunn av

ionebytter-chip'en er opphørt.

Protein-chip'en anvendt i en slik metode er ikke spesielt begrenset så lenge den kan adsorbere markørproteinene for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse. Som eksempel på protein-chip er chips (også referert til som kjemiske chips) hvor funksjonelle grupper som har hydrofobisitet eller affinitet for proteiner (f. eks. ionebytteregenskaper) har blitt modifisert og chips (biokjemiske chips) som har et antistoff mot proteinet av interesse er immobilisert dertil.

Et eksempel på en annen massespektrometri-metode, er en massespektrometri-metode som anvender en ESI-metode (elektrospray ionisasjon). I tilfellet av ESI-metoden, er det ofte foretrukket å fylle i en prøve underlagt forbehandling slik som proteasebehandling, på et massespektrometer forbundet direkte til et separerings-middel slik som høytrykks-væskekromatografi.

En immunanalysemetode hvor et tidligere kjent protein måles ved fremstilling av et polyklonalt eller monoklonalt antistoff mot hvilke som helst av markørproteinene for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være et eksempel på en immunanalysemetode. En slik immunanalysemetode omfatter en enzym immunoassay-metode (EIA-metode), immunoturbidimetry metode (TIA-metode), lateks immuno-agglutinering metode (LATEKS-metode), elektrokjemiluminescens-metode, fluorescensmetode og lignende. En immunkromatografi-metode og en metode ved anvendelse av testpapir er også effektive. Alle disse metodene er generelt kjent for fagfolk på området og disse generelt kjente metodene kan tas i bruk som de er.

Som antistoffet anvendelig i ovennevnte immunanalysemetode, kan polyklonale eller monoklonale antistoffer fremstilt ved generelt anvendte metoder nevnes som eksempler. Disse antistoffene kan oppnås ved anvendelse av et renset protein avledet fra humant blod, spesielt proteinet på 28 kDa, proteinet på 7,8 kDa eller proteinet på 5,9 kDa som et immunogen (et antigen). Selv om disse proteinene for fremstilling av antistoffene kan oppnås fra humant blod ved rensning, kan de også oppnås ved kjemisk syntese ved å ta i bruk en velkjent peptidsyntese-teknikk. I tillegg til disse antigenene kan proteiner fremstilt av dyrkede celler også anvendes som et antigen. I tillegg er anvendelse av et full-lengde rekombinant protein fremstilt ved genetisk konstruksjon, dets variant eller en del av det rekombinante proteinet eller varianten også et velbrukt mål og dette målet kan anvendes.

De monoklonale antistoffene produseres av hybridomer oppnådd ved å immunisere et dyr med et immunogen slik som hvilke som helst av de ovenfor eksemplifiserte forskjellige antigenene, for eksempel proteinet på 28 kDa, proteinet på 7,8 kDa og proteinet på 5,9 kDa, dvs., markørproteinene, og deretter fusjonere antistoffproduserende celler avledet fra milten eller lignende med myelomceller.

Hybridomene kan oppnås ved følgende metode. Det vil si at antigenet (f. eks. markørproteinet) oppnådd som beskrevet ovenfor blandes med en velkjent adjuvans slik som Freunds complete eller uncomplete adjuvans, aluminiumhydroksyd-adjuvans, pertussis-adjuvans eller lignende for å fremstille en adjuvansvæske for sensibilisering, og denne væsken administreres til et dyr (f.eks. en mus eller en rotte) subkutant i bukhulen eller intravenøst i halen, i mange porsjoner i intervaller på 1 til 3 uker for å immunisere dyret. Selv om mengden av antigenet for sensibiliseringen vanligvis velges i området 1 ug til 100 mg, er den generelt foretrukket ca. 50 ug. Selv om antallet immuniserende operasjoner er generelt 2 til 7, er forskjellige metoder kjent. Deretter fusjoneres antistoffproduserende celler avledet fra milten eller lignende med myelomceller eller lignende i et prøverør. Med hensyn til en metode for fusjonen, kan fusjonen utføres ved anvendelse av en poly(etylen glykol) (PEG) ved metoden ifølge KOhller og Milstein (Nature, 256, 495, 1975) som allerede i og for seg er velkjent. Fusjonen kan også utføres ved anvendelse av Sendai-virus eller ved en metode for elektrofusjon.

Med hensyn til en metode for seleksjon av hybridom som er i stand til å produsere et antistoff som er i stand til å gjenkjenne markørproteinet, fra de fusjonerte cellene, kan seleksjonen utføres som følger. Det vil si at hybridomet selekteres fra kolonier dannet av celler som overlever i HAT-medium og HT-medium i begrensende fortynning av de ovennevnte fusjonerte cellene. Når et antistoff mot markørptoteinet er inneholdt i supernatanten av dyrkningsmediet for hvilke som helst av koloniene dannet av de fusjonerte cellene utsådd på en 96-brønners plate eller lignende, kan en klon som er i stand til å produsere et monoklonalt antistoff mot markørproteinet velges ut ved en ELIS A-metode i hvilken supernatanten anbringes på en analyseplate som har markørproteinet immobilisert derpå, og etter reaksjonen, reageres et sekundært merket antistoff slik som et anti-mus immunoglobulin-HRP merket antistoff med ovennevnte antistoff. Som den merkende ("labeling") substansen av det merkede antistoffet, kan det anvendes enzymer (f. eks. alkalisk fosfatase), fluorescerende substanser, radioaktive substanser og lignende i tillegg til HRP. Screening av spesifikke antistoffer mot markørproteinene kan utføres ved å utføre ELISA, som en kontroll, ved anvendelse av en analyseplate som kun har BSA bundet dertil som et blokkerende agens, samtidig med ovennevnte ELISA. Det vil si at det selekteres en klon som er positiv på hvilke som helst av platene som har markørproteinene, henholdsvis, immobilisert derpå og er negativ i ELISA der det anvendes BSA.

For eksempel er hybridomene CN-1 og CN-2 etablert av foreliggende oppfinner kloner som er i stand til å gjenkjenne humant 5,9 kDa protein spesifikt og er foretrukne eksempler. Hybridomene CN-1 og CN-2 ble deponert som følger i Patented Organism Deposition Center (IPOD), Industrial Technology General Research Institute (Independent Administrative Corporation), Chuo-dairoku, Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 305-8566: hybridom CN-1 ble deponert som en mottagelse ("receipt") nummer IPOD FERM BP-08564 den 10. desember, 2003 og hybridom CN-2 ble deponert som en mottagelse nummer IPOD FERM BP-08565 den 10. desember, 2003.

Hybridomene dyrkes på et medium som vanligvis anvendes for cellekultur, slik som a-MEM, RPMI1640, ASF, S-klon eller lignende og det monoklonale antistoffet kan utvinnes fra supernatanten av mediet. Følgende er også mulig: etter at en naken mus, et dyr fra hvilket hybridomet er avledet, er tidligere behandlet med pristan, injiseres celler intraperitonealt inn i dyret for å forårsake akkumulering av ascites, og det monoklonale antistoffet utvinnes fra ascites. Som en metode for å utvinne det monoklonale antistoffet fra supernatanten eller ascites, kan det velges en konvensjonell metode. Eksempler på dette er utsalting med ammoniumsulfat, natriumsulfat eller lignende, kromatografi, ionebytterkromatografi og affinitetskromatografi ved anvendelse av protein A.

Proteinet på 28 kDa, proteinet på 7,8 kDa eller proteinet på 5,9 kDa i en prøve kan måles nøyaktig ved anvendelse av det monoklonale antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse renset ved ovennevnte metode. Som en metode for å måle proteinet på 28 kDa, proteinet på 7,8 kDa eller proteinet på 5,9 kDa i en prøve ved en EIA-metode, kan det tas i bruk en i og for seg velkjent metode ved anvendelse av én eller flere monoklonale antistoffer mot markørproteinet. Et eksempel på metoden er beskrevet nedenfor. Først bindes det monoklonale antistoffet (antistoffene) mot markørproteinet direkte eller indirekte til en i og for seg velkjent fast fase (f. eks. et polystyren, polypropylen, polykarbonat, polyetylen, nylon eller polymetakrylat) ved anvendelse av fysisk binding, kjemisk binding eller affinitet. Mengden av det sensibiliserende antistoffet varierer vanligvis fra 1 ng til 100 mg/ml. En prøve tilsettes til det monoklonale antistoffet (antistoffene) bundet til den faste fasen ved fysisk binding, kjemisk binding eller affinitet for å utføre reaksjonen. Etter et bestemt tidsrom av reaksjonen, vaskes den faste fasen og et korresponderende sekundært merket antistoff (f.eks. et anti-28 kDa protein sekundært merket antistoff, et anti-7,8 kDa protein sekundært merket antistoff eller et anti-5,9 kDa protein sekundært merket antistoff) tilsettes for å utføre den sekundære reaksjonen. Den faste fasen vaskes igjen og DAB fargeproduserende substrat eller lignende tilsettes for å utføre reaksjonen. Når HRP anvendes som den merkende substansen kan et kjent substrat slik som DAB, TMB eller lignende anvendes. Den merkende substansen er ikke begrenset til HRP. Som eksempler på den merkende substansen er alle gjenkjennelige substanser omfattende ikke kun enzymer men også merkende metaller (f. eks. gull kolloid og europium), forskjellige kjemiske eller biologiske fluorescerende substanser (f.eks. FITC, Rhodamin, Texas Red, Alexa og GFP) og radioaktive substanser (f. eks.<32>P og<51>Cr).

Markørproteinene kan også måles ved en metode forskjellig fra ovennevnte immunanalysemetode, slik som en elektroforesemetode, væskekromatografi (LC)-metode, gasskromatografi (GC)-metode eller lignende. Disse metodene er også generelt kjent for fagfolk på området og disse generelt kjente metodene kan tas i bruk som de er.

Ved metoden forklart ovenfor kan sannsynligheten for start av en leversykdom, leversykdommen eller prognosen for leversykdommen diagnostiseres ved å detektere eller kvantifisere markørproteinene for diagnostisering av leversykdom i en prøve tatt fra en pasient som en mistenker for å ha leversykdommen. Når diagnosemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse utføres ved ovennevnte massespektrometri, kan diagnosen også utføres ved å analysere mønsteret for et spekter oppnådd med et massespektrometer. Diagnosemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse tillater diagnose av sannsynligheten for start av en leversykdom hos en som drikker vanemessig eller en alkoholmisbruker, diagnose av en leversykdom forårsaket av drikking, slik som hepatitt, levercirrhose eller lignende og diagnose av en vanlig leversykdom. Videre tillater den også diagnose av, for eksempel utviklingen av behandling av leversykdom. Diagnosemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt egnet for diagnose av alkoholiske leverproblemer, alkoholavhengighet og lignende.

Foreliggende oppfinnelse illustreres mer detaljert med henvisning til de følgende eksemplene.

Eksempel 1

Identifikasjon av et markørprotein for diagnostisering av leversykdom ved anvendelse av SAXIJ protein- chip arrays

Ved anvendelse av serum fra pasienter fra hvilke det var oppnådd informert samtykke, ble det lett etter en ny markør for leverproblem i serum ved anvendelse av SAXIJ protein-chip arrays (Ciphergen Biosystems, Inc.). SAXIJ chip refererer til en sterk anionbytter-chip og erkarakterisert vedat det binder til en negativt ladet substans i en prøve. Serum fra pasientene med alkoholisk leverproblem umiddelbart etter innleggelse, den første uken etter avholdenhet og 3 måneder etter avholdenhet og serum fra normale personer ble anvendt som prøver.

(1) Metode

En metode for eksperimentell operasjon av protein-chip array er kort beskrevet nedenfor. Hver serumprøve ble fortynnet 10 ganger med en 8M urea (SIGMA)/1% CHAPS (SIGMA)-løsning. Etter behandling på is i 10 minutter, ble serumprøven ytterligere fortynnet 10 ganger med 50 mM Tris (SIGMA)-buffer (pH 9,0) og sentrifugert ved 4,000 rpm i 5 minutter og supernatanten ble anvendt som en fortynnet prøve. Et eksperiment ble utført ved å feste S AXU-chipen til en bioprosessor. Bioprosessoren er en perforert plast-adaptor for ganske enkelt å forme tredimensjonale brønner på en metallchip. Ved en slik metode, kan et stort volum av den fortynnede prøven anvendes.

Først ble 150 ul 50 mM Tris-buffer (pH 9,0) tilsatt til chip'en som har brønner dannet derpå og chip'en ble vasket på en shaker i 5 minutter. Etter at denne fremgangsmåten hadde blitt utført to ganger, ble 100 ul av den fortynnede prøven tidligere oppnådd tilsatt til chip'en og ristet ved romtemperatur i 20 minutter for å reageres med chip'en. Deretter ble den fortynnede prøven fjernet og 150 ul 50 mM Trisbuffer (pH 9,0) ble tilsatt til chip'en, fulgt av vasking på en shaker i 5 minutter. Denne prosedyren ble gjentatt tre ganger. Deretter ble chip'en vasket to ganger med 400 ul destillert vann og deretter fjernet fra bioprosessoren. Etter at chip'en hadde tørket, ble hver spot som har et protein festet dertil omgitt med PAPen (Zymed) og 0,5 ul av en mettet løsning av sinapinsyre (Ciphergen Biosystems, Inc.) i 50% acetonitril (Wako) og 0,5% TFA (Wako) ble tilsatt to ganger til spot'en. Proteinet chip-arrayen fremstilt på denne måten ble avlest med Protein»Biology»System II»Mass»Spectrometer (Ciphergen Biosystems, Inc.).

(2) Resultater

Fig. 1 viser typiske målingsdata oppnådd fra serumet fra en pasient med alkoholisk leverproblem på tidspunktet for innleggelse. I dette dataformatet kan X-aksen referere til molekylvekten av et protein i hver prøve løsnet fra SAXIJ protein-chip'en og ordinataksen kan referere til en topp som reflekterer mengden av en analytt som kom til detektoren ved den ovennevnte molekylvekten. Derfor ble det funnet at, noe som er tydelig ut fra Fig. 1, en topp beroende på et protein som har en molekylvekt på 28 kDa ble observert i dataene for pasienten med alkoholisk leverproblem på tidspunktet for innleggelse men ble nesten ikke observert etter innleggelse. Følgelig ble det funnet at en leversykdom kan diagnostiseres ved anvendelse av dette 28 kDa proteinet som en indikasjon.

Eksempel 2

Identifikasjon av markørproteiner for diagnostisering av leversykdom ved anvendelse av WCXIJ protein- chip arrays

Deretter ble det, ved anvendelse av nøyaktig de samme prøvene som i Eksempel 1, lett etter nye markører for leverproblem i serum ved anvendelse av WCXIJ protein-chip arrays (Ciphergen Biosystems, Inc.). WCXII-chip'en refererer til en svak kationbytter-chip og erkarakterisert vedat den binder til en positivt ladet substans i en prøve.

(1) Metode

En metode for eksperimentell operasjon av protein-chip array'en er kort beskrevet nedenfor og er hovedsakelig den samme som i eksempel 1. Hver serumprøve ble fortynnet 10 ganger med en 8M urea (SIGMA)/1% CHAPS (SIGMA)-løsning. Etter behandling på is i 10 minutter, ble serumprøven ytterligere fortynnet 10 ganger med 50 mM natriumacetat (SIGMA)-buffer (pH 6,5) og sentrifugert ved 4,000 rpm i 5 minutter, og supernatanten ble anvendt som en fortynnet prøve. Et eksperiment ble utført ved å feste WCXU-chip'en til en bioprosessor. Først ble 150 ul 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,5) tilsatt til chip'en som har brønner dannet derpå, og chip'en ble vasket på en shaker i 5 minutter. Etter at denne fremgangsmåten var utført to ganger, ble 100 pl av den fortynnede prøven oppnådd tidligere tilsatt til chip'en og ristet ved romtemperatur i 20 minutter for å reageres med chip'en. Deretter ble den fortynnede prøven fjernet og 150 pl 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,5) ble tilsatt til chip'en, fulgt av vasking på en shaker i 5 minutter. Denne fremgangsmåten ble gjentatt tre ganger. Deretter ble chip'en vasket to ganger med 400 pl destillert vann og deretter fjernet fra bioprosessoren. Etter at chip'en var tørket, ble hver spot som har et protein festet dertil omgitt med PAPen (Zymed) og 0,5 pl av en mettet løsning av sinapinsyre (Ciphergen Biosystems, Inc.) i 50% acetonitril (Wako) og 0,5% TF A (Wako) ble tilsatt to ganger til spot'en. Protein-chip arrays således fremstilt ble avlest med Protein»Biology»System U»Mass»Spectrometer (Ciphergen Biosystems, Inc.).

(2) Resultater

Fig. 2 viser typiske målingsdata oppnådd fra serumet fra en pasient med alkoholisk leverproblem på tidspunktet for innleggelse. Fig. 3 viser målingsdata for normale personer. Følgende ble funnet: hvilket er tydelig ut fra Fig. 3, er toppene ved en molekylvekt på 5,900 Da (proteinet på 5,9 kDa) og en molekylvekt på 7,800 Da (proteinet på 7,8 kDa) høye i dataene for de normale personene, men disse toppene er nesten ikke observert i dataene vist i Fig. 2, dvs. dataene for pasienten med alkoholisk leverproblem umiddelbart etter innleggelse. Høydene av toppene beroende på 5,9 kDa proteinet og 7,8 kDa proteinet øker med behandling og indikerer tydelig effekten av behandlingen. Det ble funnet at disse proteinene kan anvendes som markørproteiner for diagnostisering av leversykdom.

Eksempel 3

Identifikasjon av proteinet på 28 kDa

(1) Proteinet på 28 kDa funnet ved SAXG protein-chip eksperimentet ble renset fra en serumprøve med FPLC Pharmacia LKB (Amersham Pharmacia Biotech AB) ved anvendelse av en HiTrap Q kolonne under de følgende betingelsene: 50 mM Tris-buffer (pH 9,0) og en strømningshastighet på 2 ml/min. Følgelig kunne 28 kDa proteinet av interesse renses som en hovedsakelig enkelt fraksjon. Denne fraksjonen ble bekreftet som følger ved elektroforese. Fraksjonen ble blandet med 2 x prøvebuffer (0,25 M Tris-HCl (pH 6,8), 4% SDS, 20% glyserol, 0,01% BPB og 10% p-merkaptoetanol) i forholdet 1: 1 og behandlet ved 90°C i 2 minutter. Fraksjonen behandlet på denne måten ble anvendt i elektroforesen. Elektroforesen ble utført ved 10 mA ved anvendelse av 15 til 25% polyakrylamid gradient-gel (Perfect NT Gel System Products). (2) Som vist i hver av brønnene 4 og 5 i Fig. 4, ble et band bekreftet ved en posisjon svarende til 28 kDa, ved Coomassie Brilliant Blue-merking ved anvendelse av Coomasie Tablet R-350 (Phast GI Blue R). (3) Deretter ble bandet fra gelen skjært ut og peptider ble separert ved en In-Gel kløyvingsmetode. I korthet ble stykket av gelen oppnådd ved utskjæring vasket to ganger og deretter behandlet over natten med trypsin ved 35°C. Deretter ble prøven behandlet med trypsin renset ved revers fase HPLC. Med hensyn til rensingsbetingelsene ble gradient-eluering med 0,1% TFA og 0,09% TF A 90% acetonitril utført ved anvendelse av en TSK gel ODS-80Ts QA

(TOSOH)-kolonne.

De indre aminosyresekvensene av de resulterende 28 kDa proteinfragmentene ble bestemt. Aminosyresekvensen av proteinet på 28 kDa er vist som SEKV ID NR: 3 i sekvenslisten. Som resultatet av aminosyresekvensering av 28 kDa proteinfragmentene, ble proteinet på 28 kDa funnet å være humant apolipoprotein AI på grunnlag av de indre aminosyresekvensene av 28 kDa proteinfragmentene. (4) Deretter ble apolipoprotein AI-nivåer målt for de samme serumprøvene som ble anvendt i chip-eksperimentene ved en immunanalysemetode ved anvendelse av den kjente autoanalysatoren beskrevet i eksempel 6, for å oppnå resultatene vist i Tabell 1. Fra immunanalyseresultatene ble det funnet at apolipoprotein AI-nivåer ble tydelig redusert etter behandling i prøvene oppnådd fra pasientene som hadde oppnådd effekt fra behandlingen. På den annen side ble høyden av toppen beroende på 28 kDa-proteinet (apolipoprotein AI) observert som et resultat av protein-chip eksperimentet også redusert ved behandlingen, dvs., den reflekterte effekten av behandlingen. Således ble det funnet at det er en svært høy korrelasjon mellom resultatet oppnådd ved immunanalysemetoden og resultatet av protein-chip eksperimentet, noe som indikerer at høyden av toppen er anvendbar for analysering av sykdom.

Eksempel 4

Identifikasjon av 7, 8 kDa- proteinet

(1)1 likhet med 28 kDa proteinet, ble også 7,8 kDa proteinet funnet ved WCXIJ protein-chip eksperimentet renset fra en serumprøve med FPLC Pharmacia LKB (Amersham Pharmacia Biotech AB) ved anvendelse av en HiTrap CM Sepharose FF-kolonne under de følgende betingelsene: 50 mM ammoniumacetatbuffer og en strømningshastighet på 2 ml/min. Således kunne det 7,8 kDa proteinet av interesse renses. En fraksjon i hvilken det 7,8 kDa proteinet hadde blitt bekreftet ved protein-chip eksperimentet ble bekreftet ved elektroforese som følger. Fraksjonen ble blandet med 2 x prøvebuffer inneholdende SDS, i forholdet 1 : 1 og behandlet ved 90°C i 2 minutter. Fraksjonen behandlet på denne måten ble anvendt i elektroforesen. Elektroforesen ble utført ved 10 mA ved anvendelse av 15 til 25% polyakrylamid gradient-gel. (2) Som vist i hver av brønnene 2 og 3 i Fig. 4, ble et band bekreftet ved en posisjon svarende til 7,8 kDa, ved Coomassie Brilliant Blue-merking. Som i Eksempel 3 for ovennevnte 28 kDa protein, ble en fraksjon inneholdende hovedsakelig kun dette proteinet på 7,8 kDa konsentrert og deretter underlagt SDS-PAGE og bandet av interesse på 7,8 kDa ble skjært ut av gelen og peptider ble separert ved en In-Gel-kløyvingsmetode. Denne metoden er lik den i eksempel 3.1 korthet ble stykket av gelen oppnådd ved utskjæring vasket to ganger og deretter behandlet over natten med trypsin ved 35°C. Deretter ble prøven behandlet med trypsin renset ved revers fase HPLC. Med hensyn til rensingsbetingelser, ble gradient-eluering med 0,1% TF A og 0,09% TF A 90% acetonitril utført ved anvendelse av en TSK gel ODS-80Ts QA (TOSOH)-kolonne. (3) De resulterende 7,8 kDa proteinfragmentene ble underlagt aminosyresekvensering og funnet å være avledet fra humant apolipoprotein AI, på grunnlag av de indre aminosyresekvensene av 7,8 kDa proteinfragmentene. Imidlertid er den teoretiske molekylvekten av full-lengde humant apolipoprotein AI 11432,4. Altså ble 7,8 kDa proteinet funnet å være et humant apolipoprotein AI nedbrytningsprodukt. Aminosyresekvensen av proteinet på 7,8 kDa er vist som

SEKV ID NR: 2.

Eksempel 5

Identifikasjon av 5, 9 kDa- proteinet

(1) Proteinet på 5,9 kDa funnet ved WCXII protein-chip eksperimentet ble renset fra en serumprøve med FPLC Pharmacia LKB (Amersham Pharmacia Biotech AB) ved anvendelse av en HiTrap CM Sepharose FF-kolonne under de følgende betingelsene: 50 mM ammoniumacetatbuffer og en strømningshastighet på 2 ml/min. På denne måten kunne 5,9 kDa proteinet av interesse renses. En fraksjon som har et høyt innhold av 5,9 kDa proteinet ble kontrollert igjen ved en protein-chip metode, konsentrert og deretter ytterligere renset ved HPLC (TOSOH). Rensingsbetingelsene var som følger: en Sephasil protein C4-kolonne (Amersham Pharmacia Biotech AB), en acetonitrilgradient og 1 ml/min.

(2) Fraksjonen ble kontrollert igjen ved en protein-chip metode, konsentrert ved frysetørking og deretter underkastet aminosyresekvensering. Som et resultat av aminosyresekvenseringen av det rensede 5,9 kDa proteinet, ble dette proteinet funnet å være et humant fibrinogen a-E kjede nedbrytningsprodukt. Det vil si at, siden molekylvekten av full-lengde human fibrinogen a-E kjede er 72488,3, ble 5,9 kDa proteinet funnet å være et humant fibrinogen a-E kjede nedbrytningsprodukt. Aminosyresekvensen av proteinet på 5,9 kDa er vist som

SEKV ID NR: 1.

I tillegg ble, for å bekrefte nøyaktigheten av aminosyresekvensen av 5,9 kDa proteinet, et protein som har denne aminosyresekvensen fullstendig og kjemisk syntetisert. Molekylvekten av det kjemisk syntetiserte proteinet som har 54 aminosyrer var 5904,1 som stemte overens med den teoretiske verdien (Fig. 5). Videre ble dette syntetiske proteinet sammenlignet med en reell prøve. Et eksperiment ble utført ved anvendelse av nøyaktig samme WCXIJ protein-chip arrays (Ciphergen Biosystems, Inc.) som i eksempel 2.1 eksperimentet ble det syntetiske proteinet reagert i en konsentrasjon på 100 ng/ml som en prøve og sammenlignet med den reelle prøven. Resultatene er vist i Fig. 6. Som et resultat viste en topp beroende på det syntetiske proteinet en oppførsel som samsvarer med en topp beroende på 5,9 kDa proteinet i serumprøven. Gjennom disse resultatene ble det bekreftet at 5,9 kDa proteinet i serum hadde aminosyresekvensen vist som

SEKV ID NR: 1.

Eksempel 6

Sammenligning mellom diagnose hos pasienter med alkoholisk leverproblem basert på markørproteinene for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse og den basert på konvensjonelle markører for hepatitt(1) Metode

Målte verdier for konvensjonelle markører for hepatitt ble oppnådd ved anvendelse av samme sera som anvendt ovenfor, dvs. sera fra 16 sykehuspasienter med alkoholisk leverproblem umiddelbart etter innleggelse, etter 1 ukes sykehusopphold og etter 3 måneders sykehusopphold. Måling med en

autoanalysator ble utført som følger. AST, GGT, TG, Apo AI og Apo AU ble målt med Hitachi 7150 analyzer (HITACHI). Som reagenser ble N-assay L GOT (AST)

(Nittobo), N-assay L y-GTP-H (GGT) (Nittobo), N-assay TG L (TG) (Nittobo), N-assay HA Apo AII-H (Apo AI) (Nittobo) og N-assay TIA Apo All (Apo All)

(Nittobo) anvendt individuelt. FDP og FDP-E ble målt med LPIA-S500 (Diayatron) ved anvendelse av forutbestemt parametere. I denne målingen ble LPIA FDP lateks og LPIA FDP-E lateks (Teikoku Hormone MFG. Co., Ltd.) anvendt som reagenser. For sammenligningsformål er resultatene av måling ved anvendelse av protein-chips uttrykt ved tallverdier på grunnlag av topper. Enhetene for de tallverdiene er vilkårlige enheter.

(2) Resultater

Tabell 1 viser de følgende elementene i de vanlige sera fra pasienter innlagt på sykehus med alkoholisk leverproblem: nivåene av biokjemiske målingsmarkører for klinisk undersøkelse (AST, GGT og TG), nivåene av markører for immunologisk måling (Apo AI, Apo AU, FDP og FDP-E) og resultatene av måling av markørproteinene for leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse ved en protein-chip metode. I første og andre kolonne ("FDP-E 5,900 Da"-kolonnen og "Apo AU 7,800 Da"-kolonnen) fra høyre i Tabell 1, er det vist målte verdier oppnådd ved å måle 5,9 kDa proteinet og 7,8 kDa proteinet, dvs. markørproteinene for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse, ved en metode ved anvendelse av samme protein-chips som i Eksempel 2.1 den sjette kolonnen ("Apo AI"-kolonnen) fra høyre i Tabell 1, er det vist målte verdier oppnådd ved å måle 28 kDa proteinet, dvs. markørproteinet for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse, ved en konvensjonell metode.

Tabell 2 viser målte verdier oppnådd ved å måle 5,9 kDa proteinet (FDP-E 5,900 Da) og 7,8 kDa proteinet (Apo AU 7,800 Da), dvs. markørproteinene for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse, i serumprøver fra friske personer.

Tabell 3 viser gjennomsnittlig målte verdier oppnådd ved å måle 5,9 kDa proteinet og 7,8 kDa proteinet hos sykehuspasienter med alkoholisk leversykdom ved en protein-chip metode.

Som vist i Tabellene 1 til 3, gjenspeilet reduksjonen av generelt anvendte AST og GGT-nivåer og gjenopprettingen av disse nivåene til normale nivåområder effekten av behandling på lever. Imidlertid økte blodnivåene av 5,9 kDa-proteinet og 7,8 kDa-proteinet og indikerer tydelig effekten av behandling selv når det generelt anvendte GGT-nivået ikke var anvendelig som en indikasjon på effekten av behandling som i tilfellet av prøve nr. 5 fra en pasient som ble betraktet som en ikke-responder. GGT-nivået samsvarer ikke alltid med alvorlighetsgraden av et leverproblem eller det kumulative alkoholinntaket. I tillegg varierer endringen av GGT-nivået etter drikking av alkohol avhengig av individet og det er et anselig antall av såkalte ikke-respondere som ikke viser noen økning i GGT-nivået selv etter drikking av et stort volum alkohol. Derfor ble de nye proteinene betraktet å være effektive med hensyn til å vurdere behandling av disse GGT ikke-responderene.

Eksempel 7

Korrelasjon mellom alkoholinntak og markørproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse

Ved de praktiske eksemplene beskrevet ovenfor, ble anvendeligheten av de nye markørene for diagnostisering av leversykdom funnet ved foreliggende oppfinnelse bekreftet med hensyn til deres spesifisitet. Det følgende eksperimentet ble utført for ytterligere tydeliggjøring av korrelasjonen mellom alkoholinntak og markørene.

Metode

Et forsøk ble utført ved oppsamling av prøver kun fra friske personer og alkoholdrikkende pasienter hvis alkoholinntak var bestemt. I forsøket ble disse subjektene delt i tre eksperimentelle grupper, dvs. en gruppe friske personer som ikke drikker, en gruppe pasienter som har et alkoholinntak svarende til 1 glass sake og en gruppe pasienter som har et alkoholinntak svarende til 3 glass sake. For disse gruppene ble det utført målinger ved anvendelse av protein-chip metoder, henholdsvis, og gruppene ble sammenlignet med hensyn til hver av de nye markørene. Målingsmetodene ved anvendelse av protein-chips var nøyaktig de samme som beskrevet i tilfellet av SAXIJ protein-chip arrays i eksempel 1 og WCXU protein-chip arrays i eksempel 2.

Resultater

Resultatene er vist i Fig. 7. Som et resultat ble det funnet at høydene av toppene beroende på alle de nye markørproteinene, henholdsvis, for diagnostisering av leversykdom varierer avhengig av alkoholinntak. Her er resultatene for, spesielt, 5,9 kDa-proteinet vist. Proteinet på 5,9 kDa minsket avhengig av alkoholinntak og det minsket til å bli hovedsakelig udetekterbart i den eksperimentelle gruppen som har et alkoholinntak på 3 glass. Altså ble det funnet at 5,9 kDa-proteinet varierer i mengde, avhengig av alkoholinntak og derfor er en markør tilfredsstillende anvendbar for vurdering av alkoholinntak. Det ble også funnet at proteinet på 5,9 kDa er anvendbar som en markør for alkoholavhengighet.

Eksempel 8

Fremstilling av et monoklonalt antistoff

De følgende forsøket ble utført for å fremstille et anti-5,9 kDa protein monoklonalt antistoff ved anvendelse av det fullstendige syntetiske 5,9 kDa proteinet oppnådd i eksempel 5, som et antigen.

(1) hnmunisering

Det fullstendige syntetiske 5,9 kDa proteinet ble fortynnet til en konsentrasjon på 1 mg/ml med fosfatbuffer (pH 7,0) og 50 ug (50 ul) av fortynningen ble grundig blandet med 50 ul Freunds complete adjuvans (WAKO) til emulgering ble bevirket. Suspensjonen fremstilt på denne måten ble intraperitonealt administrert til en Balb/c hunnmus med en alder på 6 uker (Nippon Clear Co., Ltd.) under anestesi med dietyleter. Etter 2 uker ble samme mengde som ovenfor av det fullstendige syntetiske 5,9 kDa proteinet (50 ug/ml) blandet med Freunds uncomplete adjuvans (WAKO). Ved nøyaktig samme fremgangsmåte som i tilfellet av Freunds complete adjuvans, ble emulgering bevirket for å oppnå en suspensjon og musen ble sensibilisert med suspensjonen. To uker etter sensibiliseringen, ble samme prosedyre som ovenfor utført. Til den fjerde immuniseringen, dvs. endelig immunisering, ble en fortynning av det fullstendige syntetiske 5,9 kDa proteinet (50 ug/ml) med fosfatbuffer (pH 7,0) fremstilt og

deretter administrert til musen ved injeksjon i halevenen.

(2) Etablering av hybridom

Tre dager etter den endelige immuniseringen ble milten kirurgisk fjernet fra musen sensibilisert med det syntetiske 5,9 kDa proteinet, under anestesi med dietyleter og ble aseptisk dispergert for å fremstille splenocytter. Fusjon ble utført i henhold til metoden ifølge KOhller og Milstein (Nature, 256, 495, 1975). Splenocyttene ble fusjonert med myelomceller P3-X63-Ag8-Ul (P3U1) ved anvendelse av en poly(etylen glykol) (PEG4000) (MERK). Med hensyn til fusjonsratioen, var antallet splenocytter 10x10 , mens antallet av myelomceller P3-X63-Ag8-Ul (P3U1) var 2 x IO<7>. Altså er fusjonsratioen av splenocytter til myelomceller 5 : 1. De fusjonerte cellene ble dispergert i 10% FCS (INVITROGEN) a-MEM (IRVINE) HAT (Cosmo Bio Co., Ltd.), sådd ut på en 96-brønners mikrotiter kulturplate (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) og deretter dyrket under betingelser på 37°C og 5% CO2.

(3) Screening

Etter ca. 2 uker ble vekst av kolonier bekreftet og screening ble utført. En metode for utførelse av screeningen er beskrevet nedenfor. For å fremstille en plate for screening, ble det syntetiske 5,9 kDa proteinet renset i det praktiske eksempelet ovenfor oppløst i fosfatbuffer og fylt inn i en 96-brønners plate (Nunc) i en mengde på 1 ug/100 ul/brønn. Platen fikk stå ved 4°C i to netter og ble deretter vasket tre ganger med fosfatbuffer inneholdende 0,05% Tween 20. Hver brønn ble fylt med 200 pl 1,5% BSA-løsning for å hemme en uspesifikk reaksjon og platen fikk stå natten over ved 4°C. Etter at den således fullførte platen var vasket tre ganger med fosfatbuffer inneholdende 0,05% Tween 20, ble 100 pl av kultursupernatanten reagert i hver brønn og platen ble ytterligere vasket. Deretter ble HRP-merket anti-mus immunoglobulin antistoff (Zymed), et sekundært antistoff tilsatt for å utføre reaksjonen. Etter vasking ble 100 pl av en 3 mg/ml fargeproduserende løsning av o-fenylendiamin (OPD) (Nacalai tesque), et fargeproduserende substrat for HRP, i sitronsyre tilsatt til hver brønn for å forårsake farging i et avgrenset tidsrom. Deretter ble 100 ul IN svovelsyre tilsatt til hver brønn som en avsluttende løsning og absorbans ble målt ved en målingsbølgelengde på 492 nm. Kloner som ble funnet å være positive ved ovennevnte fremgangsmåte ble underlagt ny kloning ved en metode for begrensende fortynning og de resulterende supernatantene ble kontrollert igjen.

(4) Bekreftelse av antistoffer

To kloner, dvs. klonene CN-1 og CN-2 ble valgt som kloner som hadde gjenkjent det syntetiske 5,9 kDa proteinet, ved å bekrefte deres reaktivitet med det syntetiske 5,9 kDa proteinet ved ELISA. Tabell 4 viser resultatene av analysering av antistoffer produsert av disse klonene, ved anvendelse av et sett for typebestemmelse av monoklonalt antistoff (Amersham Pharmacia Biotech).

(5) Fremstilling og rensning av de monoklonale antistoffene

Til en Balb/c hunnmus med en alder på 10 uker (Nippon Clear Co., Ltd.) ble det to uker etter administrering av 0,5 ml pristan (Aldrich) til musen administrert intraperitonealt 1 x IO<7>celler av hver av de oppnådde hybridomene CN-1 og CN-2. Etter ca. 2 uker ble ascites akkumulert i musens bukhule kirurgisk oppsamlet under anestesi med dietyleter. Som et resultat av bekreftelse ved ELISA-metoden tatt i bruk i screeningen, ved anvendelse av ascites trinnvis fortynnet som en prøve, ble det funnet at ascites inneholdt en høy konsentrasjon av det monoklonale antistoffet. Ascites ble behandlet med 40% ammoniumsulfat og dialysert mot PBS, og deretter ble de monoklonale antistoffene CN-1 og CN-2 renset ved anvendelse av S-300. Som et resultat ble et enkelt band bekreftet ved en molekylvekt på ca. 900,000 når hver av de monoklonale antistoffene CN-1 og CN-2 ikke hadde blitt redusert og to bånd ble bekreftet ved molekylvekter på ca. 70,000 og 25,000 når hver av dem hadde blitt redusert med merkaptoetanol. Mengden av hvert av de rensede antistoffene CN-1 og CN-2 var ca. 10 mg eller mer pr. mus, dvs., den var tilstrekkelig for industriell anvendelse.

Eksempel 9

Måling av 5, 9 kDa proteinet ved EIA- metode

Muligheten for måling av 5,9 kDa proteinet i en prøve ved ELISA-metode (EIA metode) ble undersøkt ved anvendelse av de to monoklonale antistoffene CN-2 og CN-1 mot 5,9 kDa proteinet som et primært antistoff og et sekundært antistoff, henholdsvis.

(1) Metode

For fremstilling av en plate for ELISA, ble det primære antistoffet CN-2 oppløst i fosfatbuffer (pH 6,7) og fylt inn i en 96-brønners plate (Nunc) i en mengde på 1 ug/100 ul/brønn. Platen fikk stå ved 4°C i to netter og ble deretter vasket tre ganger med fosfatbuffer inneholdende 0,05% Tween 20. Hver brønn ble fylt med 200 ul 1,5% BSA-løsning for å hemme en uspesifikk reaksjon og platen fikk stå over natten ved 4°C. Etter at den således fullførte platen hadde blitt vasket tre ganger med fosfatbuffer inneholdende 0,05% Tween 20, ble 100 ul av forskjellige konsentrasjoner av det syntetiske 5,9 kDa proteinet tilsatt til hver brønn som en referansestandard og reaksjonen ble utført ved romtemperatur i 1 time. Etter fullføring av reaksjonen, ble platen vasket tre ganger med fosfatbuffer inneholdende 0,05% Tween 20, og HRP-merket CN-1 antistoff som sekundært antistoff ble tilsatt for å utføre reaksjonen. Etter vasking ble 100 pl av en 3 mg/ml fargeproduserende løsning av o-fenylendiamin (OPD) (Nacalai tesque), et fargeproduserende substrat for HRP, i sitronsyre tilsatt til hver brønn for å bevirke farging i et avgrenset tidsrom. Deretter ble 100 ul IN svovelsyre tilsatt til hver brønn som en avsluttende løsning og absorbans ble målt ved en målingsbølgelengde på 492 nm.

(2) Resultater

På grunnlag av fargingsverdier målt for de forskjellige konsentrasjonene av det syntetiske 5,9 kDa proteinet som beskrevet ovenfor, ble det fremstilt en standardkurve for å måle det syntetiske 5,9 kDa proteinet for å oppnå resultatet vist i Fig. 8. Som det kan ses fra Fig. 8, økte absorbans avhengig av konsentrasjonen av det syntetiske 5,9 kDa proteinet. Altså ble det funnet at siden de monoklonale antistoffene CN-1 og CN-2 som er i stand til å gjenkjenne 5,9 kDa proteinet var forskjellige med hensyn til epitop, kunne 5,9 kDa proteinet måles ved anvendelse av disse antistoffene i sandwich ELIS A-metode.

INDUSTRIELL ANVENDBARHET

Som beskrevet konkret ovenfor, kan markørproteinene for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes som en

indikasjon for nøyaktig undersøkelse av effekten av vurdering for behandling av en pasient med leversykdom beroende på drikking for å forstå pasientens tilstand, selv når pasientens GGT-nivå er høyt på grunn av en årsak forskjellig fra drikking som i tilfellet av, for eksempel en ikke-responder som har en lav reaktivitet med

konvensjonelle markører for hepatitt (f.eks. GGT), fettlever som følger med fedme eller en person som vanligvis anvender en bestemt medisin. Det vil si at GGT har en lav spesifisitet fordi den er øket av en årsak forskjellig fra drikking, slik som et viralt kronisk leverproblem, fedme eller kontinuerlig anvendelse av en bestemt medisin. På den annen side er markørproteinene for diagnostisering av leversykdom ifølge foreliggende oppfinnelse fordelaktige i at deres spesifisitet er lovende fordi deres nivåer ikke varierer selv i tilfellet av viral levercirrhose. Det er også funnet at disse markørproteinene erkarakterisert vedat de tillater lett

handtering av prøver og gir en høy reproduserbarhet av måling fordi substanser som skal måles i dette tilfellet er peptider som ikke er avhengig av biokjemisk enzymatisk funksjon. Diagnosemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse tillater også diagnose av sannsynligheten for start av en leversykdom hos en som drikker vanemessig eller en alkoholmisbruker og diagnose av en leversykdom forårsaket av drikking, slik som hepatitt, levercirrhose eller lignende. Videre tillater den også diagnose av, for eksempel, utviklingen av behandling av en slik leversykdom. Diagnosemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for diagnose av, spesielt, et alkoholisk leverproblem, alkoholavhengighet eller lignende. I diagnosemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse, kan diagnose utføres ved å måle markørproteinene ved en generelt anvendt EIA-metode, immunkromatografi, testpapir eller lignende. Det faktum at diagnosen lett kan utføres ved en slik generelt anvendt metode anses å være av stor betydning med henblikk på fremtidig forebyggende medisin med hensyn til nåværende populasjon av personer som lider av leversykdom.

Claims

1. Et markørprotein for diagnostisering av leversykdom valgt fra et protein som er et humant fibrinogen a-E kjede nedbrytningsprodukt og har en molekylvekt på 5,900 (5,9 kDa protein), og variant av proteinet som har den samme funksjonen som den til proteinet som en markørprotein for diagnostisering av leversykdom, hvor 5,9 kDa proteinet er et protein som har aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO:l sekvenslisten, og varianten derav er et protein som har 90% eller mer homologi med nevnte aminosyresekvens eller er et protein som har en aminosyresekvens dannet ved delesjon, substitusjon eller addisjon av en eller flere aminosyreresidier i aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO:l, som resulterer i en modifikasjon som er mindre enn 10% av nevnte SEQ ID NO.

2. Et markørprotein for diagnostisering av leversykdom ifølge krav 1, som er for diagnostisering av en leversykdom forårsaket av drikking.

3. Et markørprotein for diagnostisering av leversykdom ifølge krav 2, som er for diagnostisering av et alkoholisk leverproblem eller alkoholavhengighet.

4. En in vitro metode for diagnostisering av sannsynligheten for start av en leversykdom, leversykdommen eller prognose for leversykdom ved detektering eller kvantifisering av markørproteinet for diagnostisering av leversykdom ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 i en prøve oppnådd fra en pasient som antas å ha leversykdommen.

5. En in vitro diagnosemetode ifølge krav 4, hvor leversykdommen er en leversykdom forårsaket av drikking.

6. En in vitro diagnosemetode ifølge krav 5, hvor leversykdommen er et alkoholisk leverproblem eller alkoholavhengighet.

7. En in vitro diagnosemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 4 til 6, hvor deteksjonen eller kvantifiseringen av markørproteinet for diagnostisering av leversykdom i prøven blir utført ved massespektrometri.

8. En in vitro diagnosemetode ifølge krav 7, hvor diagnosen blir utført ved analysering av mønsteret av et spekter oppnådd med et massespektrometer.

9. En in vitro diagnosemetode ifølge krav 7 eller 8, hvor massespektrometri blir utført med et laser desorpsjon/ionisasjon-time of flight massespektrometer (LDI-TOF MS).

10. En in vitro diagnosemetode ifølge krav 9, hvor laser desorpsjon/ionisasjon-time of flight massespektrometer er et overflateforsterket laser desorpsjon/ionisasjon-time of flight-massespektrometer (SELDI-TOF MS).

11. En in vitro diagnosemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 4 til 6, hvor deteksjonen eller kvantifiseringen av markørproteinet for diagnostisering av leversykdom i prøven blir utført ved en immunoanalysemetode ved anvendelse av et antistoff mot nevnte protein.

12. En in vitro diagnosemetode ifølge krav 11, hvor immunoanalysemetoden er en enzym immunoanalysemetode (EIA metode), en immunoturbidinmetrimetode (HA metode), en lateks immuno-agglutinasjonsmetode (LATEX metode), en elektrokjemiluminiscens-metode eller en fluorescensmetode.

13. En in vitro diagnosemetode ifølge krav 12, hvor immunoanalysemetoden er en enzym immunoanalysemetode (EIA metode).

14. Et protein bestående av aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO: 1 i sekvenslisten eller varianten derav som har samme funksjon som den til nevnte protein som en markørprotein for diagnostisering av leversykdom, idet nevnte variant er et protein som har 90% eller mer homologi med nevnte aminosyresekvens eller er et protein bestående av en aminosyresekvens dannet ved delesjon, substitusjon eller addisjon av en eller flere aminosyreresidier i aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO:l, som resulterer i en modifikasjon på mindre enn 10% av nevnte SEQ ID NO.

15. En metode for måling av et protein eller variant derav ifølge krav 14, ved en immunoanalysemetode ved anvendelse av et antistoff mot proteinet eller varianten.

16. En metode ifølge krav 15, hvor immunoanalysemetoden er en enzym immunoanalysemetode (ETA metode), en immunoturbidimetrimetode (TIA metode), en latex immuno-agglutinasjonsmetode (LATEX metode), en elektrokjemiluminiscensmetode eller en fluorescensmetode.

17. En metode ifølge krav 16, hvor immunoanalysemetoden er en enzym immunoanalysemetode (ETA metode).