WO2004039403A1 - 角膜障害治療剤 - Google Patents

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WO2004039403A1
WO2004039403A1 PCT/JP2003/013503 JP0313503W WO2004039403A1 WO 2004039403 A1 WO2004039403 A1 WO 2004039403A1 JP 0313503 W JP0313503 W JP 0313503W WO 2004039403 A1 WO2004039403 A1 WO 2004039403A1
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corneal
somatostatin receptor
receptor agonist
somatostatin
cells
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PCT/JP2003/013503
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English (en)
French (fr)
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Yoshiko Takayama
Yoshikuni Nakamura
Jun Inoue
Mitsuyoshi Azuma
Original Assignee
Senju Pharmaceutical Co., Ltd.
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Publication date
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Priority to JP2005501843A priority patent/JP4603976B2/ja
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Definitions

  • the present invention relates to a corneal nerve axon extension promoter containing a somatostatin receptor agonist, a recovery and improvement of corneal sensation by corneal nerve axon extension, and a therapeutic agent for dry eye and corneal epithelial defect.
  • corneal surgery such as laser refractive keratotomy (PRK), laser keratoplasty (LAS IK), and corneal transplantation
  • PRK laser refractive keratotomy
  • LAS IK laser keratoplasty
  • corneal transplantation the corneal nerve is severed, so the corneal sensory function is usually about 3 weeks to 1 year. It is said that the symptom of the decline of the disease occurs. Due to this decrease in corneal perception, it has become a problem that the number of blinks decreases in patients after corneal surgery and symptoms of dry eye are observed. In dry eye patients, a decrease in tear function leads to a decrease in corneal perception, and this decrease in corneal sensitivity further circulates with a decrease in tear function, which further worsens corneal surface symptoms. Has become. However, at present, the recovery of corneal sensation after corneal surgery is left to spontaneous recovery, and no active treatment for restoring corneal sensation has been performed in dry eye treatment.
  • PRK laser refractive keratotomy
  • LAS IK laser
  • somatostatin is a peptide isolated from the hypothalamus in 1973 as a somatotropin release inhibitory factor (SRIF). Somatostatin receptors have been found and are named SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 and SSTR5, respectively. Somatostatin is widely distributed in nerve tissue as a growth hormone release inhibitor, and it has been confirmed that somatostatin receptors are present in the iris, ciliary body, and retina also in eye tissue (Mori, M., et al., Neuroscience Letters, 1999, Vol. 223, No. 3, p. 185—188).
  • somatostatin has a variety of functions in the body, including the endocrine system, exocrine system, and nervous system, and is involved in, for example, neurotransmission and regulation of nerve cell growth. It is reported that S has an action to promote cord extension (Ferriero, MD et., Developmental Brain Research, 1994, 80, 80, p. 13-18).
  • Known ophthalmic diseases involving somatostatin include glaucoma, corneal inflammation, ulceris, retinitis, cataract, conjunctivitis, etc. (Table 2002—515992, corresponding: WO 98/58646) , EP 101 9050).
  • octreotide known as a somatostatin receptor agonist
  • somatostatin receptor agonist is a gastrointestinal hormone-producing tumor and acromegaly. It is marketed as a treatment for pituitary gigantism.
  • lanreotide Japanese Patent Laid-Open No.
  • R 11 is a group selected from a halogen atom, a cyano group, a carboxy group, a (C r C 6 ) alkyl group, and a (C Factory C 6 ) alkoxy group;
  • X is a _CH 2 _ group , - S0 2 - group, one CO- group, or a direct bond; and
  • Y is Soma CH group or represented a is] like nitrogen atom Tosutachinago - be sampled (JP 200 1 - 1 1476 1 , Correspondence: EP 1086947A1),
  • Somatostatin agonist represented by, for example, (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-33498, corresponding: US201 / 047030),
  • SSTR 2 such as 5-guanidino-1 2 ((2- (toluene-1-4-sulfonyl) -11,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline_3-carboe) -amino] -pentanoic acid methyl ester Somatostatin agonists (US 2000/9 1 1 2 5 A 1),
  • a somatostatin analog (WO 2002/10 1992), an imidazolyl derivative that induces an agonist effect from one or more subtypes of somatostatin receptor (WO 99b4401), a somatostatin receptor affinity A hydantoin derivative (WO 200 1/85 7 18), a 4-aminobiperidine derivative (WO 200 1 Z44 191) useful as a ligand for somatostatin receptor,
  • Somatostatin ⁇ Gore varnish preparative represented by like (US 6387932), for example, P he Shiku port (C ys- D_T rp - L ys - C ys) - Th r SS TR 1
  • Agonisu preparative represented by NH 2 (WO 2000 / 75 1 86), It has a selective SSTR 4 binding effect and is expected to have a glaucoma treatment effect.
  • Soma DOO statin analog represented wherein the Ci one C 4 alkyl, indicating, for example Adamanchiru] in (WO 2 00 0/1 0 5 8 9),
  • Somatostatin agonists such as those shown in Table 2 (Tables 2001-525793 (corresponding to WO 97/43278, EP 912551)), for example, cyclo [Tyr-D-Trp-Lys-Val-P He (4— (3-Methoxyphenyl) imidazole) —Cyclic somatostatin analog represented by G 1 y] etc. (Table 2002- 5 1 8409 (corresponding: WO 99/65942, EP 1 086 1 3 1) Ergoline derivative, a selective agonist of SSTR1 useful in the treatment of anxiety, depression, etc.
  • Amine derivative having a unique chemical structure characterized by the substitution of a nitrogen atom at position 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-348287) and has an affinity and selectivity for one somatostatin receptor Pyridothienozazepine (Table 200) 2-54 1 260, corresponding: WO 2000/6 1 587).
  • the presence of somatostatin receptors in the cornea has not yet been reported.
  • most of the nerves derived from the first branch (ophthalmic branch) that branches in the trigeminal ganglion are distributed in the cornea, and are deeply involved in the recovery of postoperative corneal perception and repair of the corneal epithelium. (Ke-PingXu et al. Cornea, 1995, Vol. 15, p. 235—239).
  • the present invention relates to keratoplasty in patients with reduced corneal perception after corneal surgery such as laser refractive keratotomy (PRK), laser keratoplasty (LASIK; LAS IK), and corneal transplantation, and in dry eye patients. It is intended to provide a medicament for restoring a sensory function and for treating a disorder of the corneal epithelium caused by a decrease in the corneal sensory function.
  • PRK laser refractive keratotomy
  • LASIK laser keratoplasty
  • LASIK laser keratoplasty
  • corneal transplantation corneal transplantation
  • the present inventors have studied for the purpose of providing a new type of medicament for improving corneal sensitivity after corneal surgery and improving symptoms of dry eye, and found that somatostatin was replaced by trigeminal nerve (hereinafter referred to as corneal nerve). For the first time, we found that it had an axonal outgrowth-promoting effect and that somatostatin receptor was present in the trigeminal nerve. Based on these findings, we conducted further research and decided to use a somatostatin receptor agonist as a cornea. The present invention has been completed for use as a medicament for recovery of perception.
  • a corneal nerve axon extension promoter containing a somatostatin receptor agonist (2) a corneal sensory recovery agent containing a somatostatin receptor agonist
  • a pharmaceutical composition for treating dry eye comprising a somatostatin receptor agonist
  • a pharmaceutical composition for treating corneal epithelial defect comprising a somatostatin receptor agonist
  • corneal sensation recovery method by administering an effective amount of a somatostatin receptor agonist to a disease subject in need of corneal sensation recovery
  • somatostatin receptor agonists include those that act on somatostatin receptor and exert the same action as somatostatin in addition to somatostatin itself, and are called somatostatin agonists, somatostatin analogs, and somatostatin analogs. Include what is.
  • somatostatin receptor agonist in addition to somatostatin itself, if it acts on the somatostatin receptor and exhibits the same action as somatostatin, Any of the compounds can be advantageously used.
  • Such compounds include, for example, otatreotide, which is known as a somatostatin receptor agonist
  • somatostatin-like cyclic peptide for example, a somatostatin-like cyclic peptide such as AN-238, and Table 2002—5 1 8339 (corresponding: US 605 1 554, US 63)
  • the medicament containing the somatostatin receptor agonist of the present invention may be a corneal nerve of a mammal (for example, a human, a rat, a mouse, a heron, a penis, a stab, a dog, a cat, etc.) that is damaged, cut, or corneal epithelium is damaged. It is useful for restoring reduced corneal sensory function in defective corneas. For example, as a therapeutic agent for the recovery of decreased corneal sensitivity after surgery such as PRK, LAS IK, or corneal transplantation, or as a therapeutic agent for patients with dry eye with reduced corneal sensitivity, and with decreased corneal sensory function It is useful as a therapeutic agent for corneal epithelial disorders. Further, as the somatostatin receptor agonist, agonists (agonists) that specifically act on the somatostatin receptor subtype SSTR2 and / or SSTR4 are more preferable.
  • the medicament of the present invention is administered systemically or locally.
  • parenteral administration such as intravenous injection, subcutaneous injection, and intramuscular injection is also used. Topically, it is administered to the eye.
  • Examples of the pharmaceutical form of the present invention include solid preparations such as powders, granules, tablets, capsules and suppositories, and liquid preparations such as syrups, injections and eye drops.
  • solid preparations such as powders, granules, tablets, capsules and suppositories
  • liquid preparations such as syrups, injections and eye drops.
  • excipients lactose, sucrose, pudose, starch, microcrystalline cellulose, etc.
  • lubricants magnesium stearate, talc, stearic acid, calcium stearate, etc.
  • disintegrants Starch, carmellose sodium, calcium carbonate, etc.
  • binders starch paste solution, hydroxypropyl cellulose solution, carmellose solution, gum arabic solution, gelatin solution, sodium alginate solution, etc.
  • Manufacture can do.
  • suitable coating agents eg, gelatin, saccharose, gum arabic, carnapalow
  • enteric coating agents eg, cellulose acetate phthalate, methacrylic acid copolymer, hydroxypropylcellulose phthalate
  • Carboxymethylethylcellulose etc.
  • excipients such as magnesium stearate, calcium stearate, talc, and light caffeic anhydride to improve fluidity and lubricity, and pressurized fluidity.
  • disintegrants such as magnesium stearate, calcium stearate, talc, and light caffeic anhydride
  • they are evenly mixed or granulated or granulated and coated with an appropriate coating agent.
  • glycerin or sorbitol to a capsule base (such as gelatin) to form an encapsulated base with increased plasticity.
  • the capsule may be an ordinary coated capsule, an enteric coated capsule, a gastric resistant capsule, or a controlled release capsule.
  • an enteric capsule a compound coated with an enteric coating agent or a compound obtained by adding the above-mentioned appropriate excipient to a compound is filled in a usual capsule, or the capsule itself is coated with an enteric coating agent, or It can be molded using a soluble polymer as a base.
  • a suppository base eg, cacao butter, McGall
  • cacao butter e.g. cacao butter, McGall
  • a stabilizer eg, sodium edetate
  • a suspending agent eg, gum arabic, carmellose
  • a flavoring agent eg, simple syrup, glucose
  • a pharmaceutically acceptable additive such as an isotonic agent (sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, boric acid, borax, glucose) , Propylene glycol ), Buffers (phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, tris buffer, glutamate buffer, epsilon aminocaproate buffer, etc.) ), Preservatives (paraoxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalco-chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, borax, etc.), thickeners (hydroxche Tylcellulose, hydroxypropinoresenololose, polyvinylinoleanolone, polyethylene glycol, etc., stabilizers (sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium e
  • isotonic agent sodium chloride, potassium chloride,
  • the amount of the additives in the above syrups, injections and eye drops varies depending on the type and use of the additives to be added, but it is sufficient to add a concentration that can achieve the purpose of the additives. Usually, about 0.5 to about 5. OwZv% is added so that the osmotic pressure is about 229 to about 343 mO sm.
  • the buffer is about 0.01 to about 2.0 /%, the viscosity is about 0.01 to about 1.Ow / v%, the stabilizer is about 0.001 to about 1. Add so as to be about 0 w / v%.
  • the pH adjuster is appropriately added, and is usually added so that the pH may be about 3 to about 9, preferably about 4 to about 8.
  • the concentration of the somatostatin receptor agonist is usually lower than about 0.0005 wZv%, about 0.001 w / v%, about 0.005 w / v%, The upper limit is adjusted to about 1.0%, about 0.5w / v%, about 0.1wZv%, about 0.05w / v%, about 0.01w / v%.
  • the dose of the somatostatin receptor agonist in the present invention varies depending on the target disease, condition, administration subject, administration method, and the like.For example, when topically used in an adult eye as an agent for restoring corneal sensation after PRK surgery for example, the eye drops containing about 0.01 w / v% somatostatin are preferably applied about 20 to about 50 once and instilled several times a day.
  • bases and amino acids are indicated by abbreviations,
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase NGF: nerve growth factor
  • RNA ribonucleic acid
  • mRNA Messenger RNA
  • a 1 a Aranine
  • FIG. 1 shows the expression of somatostatin receptor subtypes (SSTR2 and SSTR4) in the egret trigeminal nerve and retina.
  • Figure 2 is a phase contrast microscopy image showing cultured porch egret trigeminal cells and axonal outgrowth from the cells.
  • A indicates the cells in the non-added group
  • B indicates the cells in the 10 ⁇ somatostatin added group
  • C indicates the cells in the 10 ⁇ somatostatin added group
  • D indicates the cells in the NGF added group
  • ⁇ indicates the cells in the somatostatin + NGF added group.
  • FIG. 3 is a graph showing the transition of corneal perception after cutting the corneal nerve of the egret.
  • FIG. 4 is a fluorescence microscopic image showing the cultured trident trigeminal nerve cells and axon extension from the cells.
  • ⁇ indicates cells in the control group
  • B indicates cells in the group to which 10 ⁇ otatretide was added.
  • Figure 5 shows the ratio of neurite-forming cells to the total number of cells in the same test as in Figure 4.
  • FIG. 6 is a fluorescence microscopy image showing cultured porcupine trigeminal nerve cells and axonal outgrowth from the cells.
  • ⁇ indicates the cells in the group without addition
  • B indicates the cells in the group with 1 ⁇ compound 1 added
  • C indicates the cells in the group with 0.1 ⁇ compound 2 added.
  • Test Example 1 Expression of somatostatin receptor in the egret trigeminal nerve
  • the primers used were the somatostatin receptor SSTR2 gene-specific primer (sequence table: SEQ ID NO: 1) and the SSTR4 gene-specific primer (sequence table: SEQ ID NO: 2) described in Table 1 . Retina and GAPDH were used as positive controls for expression.
  • Test Example 2 Promoting neural axon outgrowth in cultured heron trigeminal nerve cells (In vitro experiment) ''
  • Japanese white ⁇ heron (2-3 days after birth) purchased from Fukusaki Rabbit Union was used.
  • test substances As test substances, somatostatin (CALBI0CHEM, Lot B33795) and NGF (NGF-7S, Sigma) were used. The test substance was dissolved in phosphate buffer (PBS) so that ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ somatostatin and 20 / z g / mL NGF-7S were obtained. The prepared reagents were stored at 80 ° C and dissolved before use.
  • PBS phosphate buffer
  • Trigeminal nerve cells were isolated with reference to the report of Chan et al. (Kuan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41: 687-699, 1985). That is, under ether anesthesia, the perforated egret was perfused with physiological saline, the trigeminal ganglion was cut out, and the trigeminal ganglion was dispersed using a nerve dispersion (Sumitomo Bei-Cryt) and coated with polylysine / laminin. The cells were seeded on a 24-well plate (Sumitomo Bei-Client). The number of cells was about 3000 cells / well, and the culture conditions were 37 in 5% CO 2 and 95% air.
  • FIG. 2 shows a phase-contrast microscope image of the cultured egret trigeminal nerve cells.
  • A cells of group I
  • B cells of group ⁇
  • C cells of group ⁇
  • D cells of group IV
  • E cells of group V. Each cell in the group is shown.
  • Test example 3 ⁇ ⁇ Changes in corneal sensory function after transection of the corneal nerve (In vivo test)
  • test substance Somatostatin (CALBI0CHEM, Lot B33795) and NGF (NGF-7S, Sigma) were used as test substances.
  • the test substance was dissolved in the following vehicle and used for the test.
  • the cornea was labeled with a 6 mm diameter trepan, and the upper 180 degree cornea was sutured with a 8.0 nylon suture while making a circular incision.
  • test substance was instilled four times a day, and at the same time, Tarivid ophthamic solution (Santen) was instilled.
  • Animals were housed in a breeding room set at room temperature of 23 ⁇ 3 ° C, humidity of 55 ⁇ 10%, and illuminated for 12 hours (8:00 on, 22:00 off), and housed in a cage per cage.
  • Corneal perception was measured using a Cochet-Bonnet corneal perimeter (manufactured by LUNEAU) on the third day of surgery and at 1, 2, 3, 4, and 6 weeks. The corneal perception (%) was calculated assuming that the perception before surgery of each individual was 100%.
  • Figure 3 shows the transition of corneal perception over time after cutting the corneal nerve. Corneal perception decreased sharply in all groups from 3 days to 1 week after keratotomy, but a gradual recovery of corneal perception was observed after the second cycle. Three and four weeks later, a significant corneal sensation recovery effect was observed in the somatostatin-administered group compared to the vehicle-administered group ( ⁇ ⁇ 0.05, Dunnett test).
  • Test Example 4 Effect of octreotide on axonal outgrowth of cultured heron trigeminal nerve cells (In vitro test)
  • Trigeminal nerve cells were isolated by referring to the report of Chan et al. (Kuan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41: 687-699, 1985). That is, under cardiac anesthesia under ether anesthesia, the trigeminal ganglion is cut out after perfusion with physiological saline, the trigeminal ganglion is dispersed using a nerve dispersion (Sumitomo Bakelite), and the number of cells is counted. Cells were seeded on 8 ⁇ L culture slides (BECT0N DICKINSON) coated with ricin. The number of cells was about 3 ⁇ 10 3 cells / well, and the culture conditions were 37% in 5% CO 2 and 95% air.
  • the axon extension length and cell body diameter of cells are measured using image analysis software, and cells with axons longer than twice the cell body diameter are regarded as neurite-forming cells and expressed as a percentage of the total cell number. The ratio (%) was calculated.
  • Figure 4 shows the effects of otatreotide on neurite and axonal outgrowth in cultured egret trigeminal neurons.
  • A shows control perforated trigeminal neurons cultured in a culture medium without octreotide for 24 hours
  • (B) shows cells cultured for 24 hours in a culture medium supplemented with a final concentration of 10 ⁇ ⁇ of otatreotide. Show. Compared with the control cell group, it was confirmed that neurite-forming cells increased in the group supplemented with otatreotide.
  • FIG. 5 shows the ratio (%) of the neurite-forming cells to the total cell number.
  • otatreotide an analog of somatostatin, promotes axonal outgrowth of trigeminal neurons.
  • Test Example 5 Effect of somatostatin receptor agonist on axonal outgrowth of cultured heron trigeminal nerve cells (In Vitro experiment)
  • somatostatin receptor agonist As a test substance, somatostatin receptor agonist, SSTR2-specific agonist, 6-amino-2- (3- (1H-indole-3-yl) -2-((4-(2- Oxo-1,2,3-dihydrobenzoimidazole-11-inole) piperidine-11-carbonyl) amino () propionylamino) hexanoic acid t_butyl ester (hereinafter referred to as compound 1), and , SSTR4 specific agonist, 1- (3- (N- (5-bromopyridine-12-yl) -N- (3,4-dichloromethylbenzyl) amino) propyl) 13_ (3 — (1H-midazol-4-yl) propyl) thiopurea (hereinafter referred to as compound 2) was used.
  • Compound 1 is a compound of Example 4 in WO 2001/49192 (WO 98/444922) and was synthesized according to the method of Example 2.
  • Compound 2 was synthesized according to the description in Example 15 of WO 2001 / 52,793 (WO97 / 432,788).
  • the heron trigeminal nerve cells were isolated by referring to the report of Chan et al. (Kuan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41: 687-699, 1985). That is, under ether anesthesia, after performing cardiac perfusion with physiological saline, the trigeminal ganglion is taken out, and the trigeminal ganglion is dispersed using a nerve dispersion (Sumitomo Bei-Client). Trigeminal nerve cells were prepared.
  • GIBC0 B27 Supplement
  • GIBCO L-Glutamin
  • % C02 95% air, 100% humidity, 37 ° C, 48 hours.
  • Cells are seeded on poly-lysine-coated 8-well culture slides (BECT0N DICKINSON) at approximately 3 x 10 3 cells / well, or poly-lysine-coated 96-well plates at 3 x 10 3 cells / well and tested.
  • Compound 1 final concentration 1 ⁇
  • Compound 2 final concentration 0.1 ⁇
  • Cell staining After completion of culture for 48 hours, cells seeded on a 96-well plate are fixed with 4 ° / 0 paraformaldehyde, and anti-specifically recognize neuronal filaments constituting neuronal cell bodies and neurites. Neurofilament of cells was labeled using Neurofilament 200 antibody (Sigma) and HRP-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). 0.02% of 50 labeled on the cell H 2 0 2 (Nacalai Tesque) and 0. 2 ° /.
  • FIG. 6 shows a fluorescence microscopic image of the cultured egret trigeminal nerve cells.
  • A shows cells of a control group cultured in a culture solution without somatostatin receptor agonist
  • B shows cells of a group to which compound 1 was added at a final concentration of 1 ⁇
  • C shows cells of compound 2 at a final concentration of 0 ⁇ m.
  • the cells in the group to which 1 ⁇ was added are shown.
  • Neurite-forming cells are increased in cells in the group to which compound 1 or compound 2 is added, compared to cells in the control group It was confirmed that.
  • FIG. 7 is a graph showing the absorbance indicating the amount of neurofilament of the cells in each addition group.
  • the absorbance of the control group was 0.798, and the absorbance of the compound 1 added group and the compound 2 added group was 0.876 and 0.850, respectively. That is, the amount of neurofilament was increased by the addition of the somatostatin receptor agonist, which was considered to reflect the addition of neurite-forming cells. From the above, it was found that the somatostatin receptor agonists Compound 1 and Compound 2 have an effect of promoting axonal outgrowth of trigeminal nerve cells.
  • tablets are formed in a conventional manner. Tablets may be coated with commonly used enteric coating agents (such as hydroxypropyl phthalate or pillmethylcellulose) and sugar-coated films (such as ethyl cellulose), if necessary.
  • enteric coating agents such as hydroxypropyl phthalate or pillmethylcellulose
  • sugar-coated films such as ethyl cellulose
  • Example 3 Injection Compound 1 750 mg
  • a total of 100 mL or more of the components is aseptically mixed by an ordinary method to prepare an injection.
  • the medicament containing the somatostatin receptor agonist of the present invention has a trigeminal nerve cell axon extension promoting action and a corneal sensory function restoring action, it improves corneal sensory function deterioration and corneal sensory function associated with damage to corneal nerves and the like. It is useful for improving the dry eye symptoms associated with the decrease.
  • the application of somatostatin receptor agonists is associated with decreased corneal perception after cataract surgery and LASIK surgery, corneal neuropathy such as neuropathic keratopathy, corneal ulcer, and diabetic keratopathy. It can be expected to reduce corneal perception and improve dry eye symptoms.

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Abstract

本発明は、角膜の術後の角膜知覚回復やドライアイの症状を改善する新しいタイプの医薬を提供する。ソマトスタチン受容体作動薬の適用は、白内障手術後、ＬＡＳＩＫ手術後、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下、ドライアイ症状の改善に有用である。

Description

明細書
角膜障害治療剤 技術分野
本発明はソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進剤、 および角膜神経軸索伸展による角膜知覚の回復、 改善、 並びにドライアイ及 ぴ角膜上皮欠損の治療剤に関する。 背景技術
レーザー屈折矯正角膜切除術 （PRK) 、 レーザー角膜切削形成術 （レー シック ； LAS I K) 、 角膜移植などの角膜手術後には、 角膜神経が切断さ れるため、 通常約 3週間から 1年間角膜知覚機能の低下症状が起きるといわ れている。 そしてこの角膜知覚機能の低下から角膜手術後の患者では瞬目回 数が減少しドライアイの症状が認められることが問題となっている。 また、 ドライアイ患者では、 涙液機能の低下から角膜知覚の低下をもたらし、 さら にこの角膜知覚の低下がさらなる涙液機能の低下と循環し、 角膜表面の症状 がさらに悪化することが問題となっている。 しかし、 現在角膜手術後の角膜 知覚の回復は自然回復に委ねられ、 またドライアイの治療においても角膜知 覚を回復させるための積極的治療は施されていないのが現状である。
一方、 ソマ トスタチン（somatostatin)は、 成長ホルモン放出抑制因子 (somatotropin release inhibiting factor； SRIF) として、 1 9 7 3年に 視床下部から単離されたペプチドで、 現在までに、 5個のサブタイプのソマ トスタチン受容体が見出されており、 それぞれ S STR 1、 S STR 2、 S STR 3、 S S TR4および S S TR 5と命名されている。 ソマ トスタチン は成長ホルモン放出抑制因子として神経組織に広く分布し、 眼組織において も虹彩、 毛様体、 網膜にソマトスタチン受容体が存在することが確認されて いる（Mori, M.、 et al. , Neuroscience Letters, 1 99 7年， 223卷， 3 号， p. 1 85— 1 88)。 また、 ソマトスタチンは生体内において、 内分泌系、 外分泌系、 神経系な どにおいて多彩な機能を有し、 例えば、 神経伝達や神経細胞成長調節などに 関与すること、 また、 PC 1 2細胞において神経軸索伸展を促進させる作用 力 Sあると報告されてレヽる (Ferriero, M. D. et. , Developmental Brain Research, 1 9 94年， 80卷， p. 1 3— 1 8)。
ソマ トスタチンが関与する眼疾患としては、 緑内障、 角膜実質の炎症、 虹 彩炎、 網膜炎、 白内障、 結膜炎などが知られている （特表 2002— 5 1 5 91 2、 対応： WO 98/58646、 EP 1 0 1 9050) 。
ソマトスタチンそのもの、 またはその類縁体を医薬品として開発する試み もなされており、 例えば， ソマトスタチン受容体作動薬として知られている ォク トレオチド（octreotide)は消化管ホルモン産生腫瘍おょぴ末端肥大症 · 下垂体性巨人症の治療薬として市販されている。 その他、 例えば； ランレオ タイ ド （lanreotide) (特開平 2— 28 9 5 9 9、 対応： EP 389 1 80) 、 AN- 238 (特表 2000— 50205 5、 対応： WO 97/1 9 954、 US 5843903) 、 PTR— 3 1 7 3 (特表 200 2— 5 1 8 3 39、 対応： US 60 5 1 5 54、 US 6 3 5 56 1 3) 、 S STR 2, S STR 3に親和性を有するァミン誘導体 （特開 2000— 226 3 73、 対応： U S 6 32 9 38 9) 、 ソマトスタチン受容体機能調節作用を有し、 糖尿病、 肥満糖尿病合併症などの予防または治療に有用な芳香族ァミン誘導体 （特開 2000— 1 9 1 6 1 5、 対応： EP 1 1 23 9 1 8) 、 ソマトスタチン受 容体作動作用を有し、糖尿病などの予防または治療に有用な縮合環化合物（特 開平 1 1— 209356、 対応： US 6 3 52982)、
例えば、 式 I
X^X^Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-X^Ser-X4
1は Asp - Arg_Met - Pro - Cys, Arg- Met- Pro - Cys， Met- Pro- Cys, Pro- Cysま たは Cysを、 X2は Argまたは Lysを、 X 3は Serまたは Thrを、 X 4力 SCys— Lysまた は Cysを示す。 〕 で示されるソマ トスタチン様活性を有するペプチド （特開平 1 0- 1 74587) 、 例えば、 式 Π
Figure imgf000004_0001
などで表されるソマトスタチン作動薬 （特表 200 1— 5 1 8895、 対応 WO 98/45285、 EP 97775 1) 、
例えば、 式 Π
Figure imgf000004_0002
などで表されるソマトスタチン作動薬 （特表 200 1— 5 1 98 1 1、 対応 WO 98/4492 1、 US 606 3796) 、
例えば、 式 IV
Figure imgf000005_0001
などで表されるソマトスタチン作動薬（特表 200 1 - 5 1 98 1 2、対応 WO 98/44922、 US 606 3796) 、
式 V
Figure imgf000005_0002
〔式中、 R11は、 ハロゲン原子、 シァノ基、 カルボキシ基、 (CrC6) アル キル基、 及び （C厂 C6) アルコキシ基から選択した基であり； Xは、 _CH2_ 基、 — S02—基、 一 CO—基、 又は直接結合であり ；そして Yは、 CH基又 は窒素原子である〕 などで表されるソマ トスタチンァゴ-ス ト （特開 200 1 — 1 1476 1、 対応： EP 1086947A1) 、
例えば、 式 VI
Figure imgf000006_0001
などで表されるソマトスタチンァゴニスト （特開 2 00 2— 3 4 9 8、 対応： U S 2 0 0 1 /04 7 0 3 0) 、
例えば、 5ーグァニジノ一 2 ( (2 - (トルエン一 4—スルフォニル） 一 1， 2, 3， 4—テトラヒ ドロ一イソキノ リン _ 3—カルボエル) —アミノ〕 —ぺ ンタン酸メチルエステルなどの S S TR 2に作用するソマトスタチンァゴニス ト (US 2 0 0 2/9 1 1 2 5 A 1 ) 、
例えば、 式 \¾
な
Figure imgf000006_0002
0 2/9 1 0 9 0 A 1 ) 式
Figure imgf000007_0001
で示されるソマトスタチンアナログ (WO 2002/10 1 9 2) 、 ソマトスタチンの 1以上のサブタイプの受容体からァゴニス ト効果を引き起こ すィミダゾリル誘導体 （WO 99 b 440 1) 、 ソマトスタチン受容体と親 和性を持つヒダントイン誘導体 （WO 200 1/85 7 1 8) 、 ソマトスタチ ン受容体のリガンドとして有用な 4 _アミノビペリジン誘導体 （WO 200 1 Z44 1 9 1) 、
例えば、 式 IX
Figure imgf000007_0002
などで表されるソマトスタチンァゴニス ト （US 6387932) 、 例えば、 P h eーシク口 (C y s— D_T r p - L y s - C y s ) — Th r NH2で示される S S TR 1ァゴニス ト (WO 2000/75 1 86) 、 選択的 S S TR 4結合作用を有し、緑内障治療作用が期待されるとして、式 X
Figure imgf000008_0001
などで表される化合物 （US 6 2 7 34 3)
式 X I
0 OH
H2C ~ 1 ~ CH2-NH— Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-D-Tyr一 H2
〔式中、 は Ci一 C4アルキル、 ァダマンチルなどを示す〕 で示されるソマ トスタチンアナログ (WO 2 00 0/1 0 5 8 9) 、
例えば、 式 ΧΠ
Figure imgf000008_0002
などで示されるソマトスタチンァゴニスト (WO 9 9 2 2 7 3 5、 対応： U S 6 1 1 7 8 8 0) 、
例えば、 式 ΧΠ
Figure imgf000008_0003
などで示されるソマトスタチンァゴニスト （特表 2 0 0 1 5 0 2 7 1 2、 対 応： U S 6 0 2 0 34 9、 U S 6 0 8 3 9 6 0) 、 例えば、 式 XIV
Figure imgf000009_0001
などで示されるソマトスタチンの作動因子 （特表 200 1— 525793 (対 応： WO 97/43278, EP 9 1 255 1) 、 例えば、 シクロ 〔T y r— D— T r p— Ly s— Va l— P h e (4— (3—メ トキシフエニル） イミダ ゾール) — G 1 y〕 などで示されるサイクリックソマトスタチン類似体 (特表 2002- 5 1 8409 (対応： WO 99/65942、 EP 1 086 1 3 1) 、 不安、 欝などの処置に有用な S S TR 1選択的ァゴエストであるエルゴリン誘 導体 （特表 2001— 527 580 (対応： WO 98/54 1 83、 US 6 22 1 8 70) 、 ソマ トスタチン受容体機能調節剤としてのビフエ二ル化合物 （特 開 2002— 80439、 対応： WO 2002/000606) 、 ソマトスタ チン受容体に結合して、 N aチャンネルを遮断する ) 3—カルボリン誘導体 （特 表 2002— 5 1 7500、 対応： WO 99/64420、 EP 1086 1 0 1) 、 ノヽプレオテド ^vapreotide, Sharon Gazal et al. , journal of Medicinal Chemistry, 2002年， 45卷， p. 1 665— 1 6 71) 、 ソマ トスタチン 受容体結合阻害作用を有する化合物で、 基：
Figure imgf000009_0002
の 2位に窒素原子が置換していることに特徴がある特異な化学構造を有するァ ミン誘導体 （特開 2002 _ 34828 7) 、 およびソマ トスタチンレセプタ 一に対して親和性および選択性を有するピリ ドチエノジァゼピン （特表 200 2— 54 1 260、 対応： WO 2000/6 1 587) などが知られている。 その一方、 角膜においては、 ソマトスタチン受容体が存在することは未だ報 告されていない。 また、 角膜の神経に関して、 三叉神経節で分岐する第一枝 (ophthalmic branch)由来の神経のほとんどが角膜に分布し、角膜の術後知覚回 復、角膜上皮の修復などに深く関わっていることが報告されている（Ke- PingXu et al. Cornea, 1 996年， 1 5卷， p. 23 5— 239) 。
しかし、 三叉神経 （角膜神経） にソマトスタチン受容体が存在することや、 三叉神経 （角膜神経） の神経軸索伸展をソマトスタチンが促進させるという報 告は認められない。 発明の開示
本発明は、 レーザー屈折矯正角膜切除術 （PRK) 、 レーザー角膜切削形成 術 （レーシック ； LAS I K) 、 および、 角膜移植などの角膜手術後やドライ アイ患者などで角膜知覚機能の低下した患者の角膜知覚機能を回復させ、 さら に、 これら角膜知覚機能の低下に伴う角膜上皮の障害を治療する医薬を提供す る。
本発明者らは、 角膜の術後の角膜知覚回復やドライアイの症状を改善する新 しいタイプの医薬を提供することを目的に検討を行ったところ、 ソマトスタチ ンが三叉神経 （以後、 角膜神経ということもある。 ） の軸索伸展促進効果があ ること、また三叉神経にソマトスタチン受容体が存在することを初めて見出し、 これらの知見に基づいてさらに研究をすすめ、 ソマトスタチン受容体作動薬を 角膜知覚回復などの医薬として利用する本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、
(1) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進剤、 (2) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜知覚回復剤、
(3) ソマトスタチン受容体作動薬を含有するドライアイ治療剤、
(4) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜上皮欠損治療剤、
(5) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進用医薬組 、
成物、
( 6 ) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜知覚回復用医薬組成物、
( 7 ) ソマトスタチン受容体作動薬を含有するドライアイ治療用医薬組成物、
( 8 ) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜上皮欠損治療用医薬組成 物、
( 9 ) 角膜神経軸索伸展促進用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン 受容体作動薬の使用、
(10)角膜知覚回復用医薬組成物を製造するためのソマ トスタチン受容体作動 薬の使用、
(11) ドライアイ治療用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容体 作動薬の使用、
(12) 角膜上皮欠損治療用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容 体作動薬の使用、
(13) 角膜神経の軸索伸展促進が必要とされる疾患対象にソマ トスタチン受 容体作動薬の有効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展促進方法、
(14) 角膜知覚の回復が必要される疾患対象にソマトスタチン受容体作動 薬の有効量を投与することによる角膜知覚回復方法、
(15) ドライアイに罹患した疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効 量を投与することによるドライアイの治療方法、
(16) 角膜上皮が欠損した疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効量 を投与することによる角膜上皮欠損の治療方法、
に関するものである。
ここで、 ソマトスタチン受容体作動薬とは、 ソマトスタチンそのものの他、 ソマトスタチン受容体に作用し、 ソマトスタチンと同様の作用を示すものをい い、 ソマトスタチンァゴニスト、 ソマトスタチン類似体、 ソマトスタチンアナ ログなどといわれているものを包含する。
ソマトスタチン受容体作動薬としては、 ソマトスタチンそのものの他、 ソマ トスタチン受容体に作用しソマトスタチンと同様の作用を示すものであれば、 いずれの化合物であっても有利に使用できる。 そのような化合物としては、 例 えば， ソマトスタチン受容体作動薬として知られているオタ トレオチド
(octreotide)、 特開平 2— 289599 (対応： EP 3891 80) に記載の ランレオタイ ド （lanreotide) 、 パプレオチド (vapreotide) などのォクタべ プチド、 特表 2000— 502055 (対応： WO 9 7/1 9954, US 5
843903) に記載の例えば AN— 238などのソマトスタチン類似環状べ プチド、 特表 2002— 5 1 8339 (対応： US 605 1 554、 US 6 3
556 1 3) に記載の例えば PTR— 3 1 73などの主鎖環化ソマトスタチン 類似体、 特開 226 3 73 (対応： US 6 329389)ゃ特開 2002— 34 8287に開示のァミン誘導体、 特開 2000— 1 9 1 6 1 5 (対応： E P 1 1 239 1 8)に記載の芳香族ァミン誘導体、 特開平 1 1— 209356 (対 応： US 6 3 52982)に記載の縮合環化合物、 特開平 1 0— 1 7458 7 に記載のぺプチド類、 特表 200 1— 5 1 88 95 (対応： WO 98/45 2 85、 E P 97775 1) 、 特表 200 1— 5 1 98 1 1 (対応： WO 98/ 4492 1、 US 6063 796) およぴ特表 2001— 5 1 98 1 2 (対 応： WO 98ノ44922、 US 606 3 796) に記載のソマトスタチン作 動薬、 特開 200 1— 1 1476 1 (対応： EP 1 086 947A1) 、 特開 2002- 3498 (対応： US 200 1/047030)、 U S 2002/ 9 1 1 25 A 1、 US 2002/9 10 90A 1 , US 6 38 7932、 WO 99/22735 (対応： US 6 1 1 7880), 特表 200 1— 5027 1 2 (対応： U S 6020349、 US 6083 960) に記載のソマトスタチン ァゴエス ト、 WO 2002/10 1 92および WO 2000/1 058 9に記 載のソマトスタチンアナログ、 WO 99/6440 1に記載のィミダゾリル誘 導体、 WO 200 1/85 7 1 8に記載のヒダントイン誘導体、 WO 200 1 /441 9 1に記載の 4—アミノピペリジン誘導体、 WO 2000/75 1 8 6に記載の S STR 1ァゴュス ト、 US 6 1 2 7343に記載の選択的 S ST R 4結合作用を有し、 緑内障治療作用を示す化合物、 特表 200 1— 525 7
93 (対応： WO 9 7/432 78、 E P 9 1 255 1 )に記載のソマトスタチ i ンの作動因子、 特表 2002— 5 18409 (対応： WO 99/6 5942、 EP 1 086 1 3 1)に記載のサイクリックソマトスタチン類似体、 特表 20 0 1 - 527580 (対応： WO 98/54 1 83、 US 6221 870)記載 のエルゴリン誘導体、 特開 2002— 80439 (対応： WO 2002/00 0606)に記載のビフヱ-ル化合物、 特表 2002- 5 1 7500 (対応： W 099/64420、 EP 1 08 6 1 O 1 )に記載の ]3—カルボリル餺導体、 およぴ特表 2002— 54 1 260 (対応： WO 2000/6 1 587)に記載 のピリ ドチエノジァゼピンなどが挙げられる。
本発明のソマトスタチン受容体作動薬を含有する医薬は、 哺乳動物 （例えば ヒ ト、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ゥシ、 プタ、 ィヌ、 ネコなど） の角膜神経が 障害、 切断または角膜上皮が欠損した角膜において、 低下した角膜知覚機能の 回復に有用である。 例えば、 PRKや LAS I K、 角膜移植などの手術後の低 下した角膜知覚回復のための治療薬として、 あるいは角膜知覚の低下したドラ ィアイ患者の治療薬として、 さらに、 角膜知覚機能の低下に伴う角膜上皮障害 の治療薬として有用である。 また、 ソマトスタチン受容体作動薬としては、 ソ マトスタチン受容体サブタイプである S S TR 2または/およぴ S S TR 4 に特異的に作用するァゴニス ト（作動薬）がより好ましい。
本発明の医薬は全身的または局所的に投与される。 全身的には経口投与の他、 静脈内注射、 皮下注射、 筋肉内注射など非経口的にも投与される。 局所的には、 眼に投与される。
本発明の医薬の製剤形態としては、 粉末、 顆粒、 錠剤、 カプセル剤、 坐剤な どの固形剤、 およびシロップ剤、 注射剤、 点眼剤などの液剤などが挙げられる。 顆粒および錠剤として製造する場合には、 例えば賦形剤 （乳糖、 白糖、 プドウ 糖、 デンプン、 結晶セルロースなど） 、 滑沢剤 （ステアリン酸マグネシウム、 タルク、 ステアリン酸、 ステアリン酸カルシウムなど） 、 崩壌剤 （デンプン、 カルメロースナトリウム、 炭酸カルシウムなど） 、 結合剤 （デンプン糊液、 ヒ ドロキシプロピルセルロース液、 カルメロース液、 アラビアゴム液、 ゼラチン 液、 アルギン酸ナトリウム液など） などを用いることにより任意の剤形を製造 することができる。 また、 顆粒剤おょぴ錠剤には、 適当なコーティング剤 （ゼ ラチン、 白糖、 アラビアゴム、 カルナパロウなど） 、腸溶性コーティング剤 （例 えば酢酸フタル酸セルロース、 メタアクリル酸コポリマー、 ヒ ドロキシプロピ ルセルロースフタレート、 カルボキシメチルェチルセルロースなど） などで剤 皮を施してもよい。
カプセル剤として製造する場合には、 適当な賦形剤、 例えば流動性と滑沢性 を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、 ステアリン酸カルシウム、 タ ルク、 軽質無水ケィ酸など、 また加圧流動性のための結晶セルロースや乳糖な どの他、 上記崩壌剤などを適宜添加したものを均等に混和または粒状もしくは 粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものを充填するか、 適 当なカプセル基剤 （ゼラチンなど） にグリセリンまたはソルビトールなどを加 えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形することもできる。 これらカプセル 剤には必要に応じて、 着色剤、 保存剤 [二酸化イオウ、 パラベン類 （パラォキ シ安息香酸メチル、 ェチル、 プロピルエステル） ] などを加えることができる。 カプセル剤は通常のカプセルの他、 腸溶性コーティングカプセル、 胃内抵抗性 カプセル、 放出制御カプセルとすることもできる。 腸溶性カプセルとする場合、 腸溶性コーティング剤でコーティングした化合物または化合物に上記の適当 な賦形剤を添加したものを通常のカプセルに充填または、 カプセル自身を腸溶 性コーティング剤でコーティング、 もしくは腸溶性高分子を基剤として成形す ることができる。
坐剤として製造する場合には坐剤基剤（例えばカカオ脂、マク口ゴールなど） を適宜選択して使用することができる。
シロップ剤として製造する場合、 例えば安定剤 （ェデト酸ナトリウムなど） 、 懸濁化剤 （アラビアゴム、 カルメロースなど） 、 矯味剤 （単シロップ、 ブドウ 糖など） 、 芳香剤などを適宜選択して使用することができる。
本発明の医薬を注射剤または点眼剤として製造する場合、 医薬上許容される 添加物、 例えば等張化剤 （塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 グリセリン、 マン 二トール、 ソルビトール、 ホウ酸、 ホウ砂、 ブドウ糖、 プロピレングリ コール など） 、 緩衝剤 （リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 炭酸緩衝液、 ク ェン酸緩衝液、 トリス緩衝液、 グルタミン酸緩衝液、 ィプシロンアミノカプロ ン酸緩衝液など） 、 保存剤 （パラォキシ安息香酸エステル類、 クロロブタノ一 ル、 ベンジルアルコール、 塩化ベンザルコ-ゥム、 デヒ ドロ酢酸ナトリ ウム、 ェデト酸ナトリウム、 ホウ酸、 ホウ砂など） 、 増粘剤 (ヒ ドロキシェチルセル ロース、 ヒ ドロキシプロピノレセノレロース、 ポリ ビニノレアノレコーノレ、 ポリエチレ ングリコールなど） 、 安定化剤 （亜硫酸水素ナトリウム、 チォ硫酸ナトリウム、 ェデト酸ナトリウム、 クェン酸ナトリ ウム、 ァスコルビン酸、 ジブチルヒ ドロ キシトルエンなど） 、 pH調整剤 （塩酸、 水酸化ナトリウム、 リン酸、 酢酸な ど） などを適宜添加した溶液に溶解または分散することによって製造すること ができる。
上記シロップ剤、 注射剤および点眼剤における添加剤の添加量は、 添加する 添加剤の種類、 用途などによって異なるが、 添加剤の目的を達成し得る濃度を 添加すればよく、 等張化剤は、 通常、 浸透圧が約 229〜約 343 mO s mと なるよう、 約 0. 5〜約 5. OwZv%を添加する。 また、 緩衝剤は約 0. 0 1〜約 2. 0 / %程度、 增粘剤は約0. 0 1〜約1. Ow/v%程度、 安 定化剤は約 0. 001〜約1. 0 w/v%程度になるように添加する。 pH調 整剤は、 適宜添加し、 通常 pH約 3〜約 9、 好ましくは約 4〜約 8になるよう に添加する。
特に点眼剤として使用する場合、 ソマトスタチン受容体作動薬の濃度は、 通 常下限は約 0. 000 5 wZv%、 約 0. 00 1 w/v%、 約 0. 005 w/ v%であり、 上限は約 1. 0 %、 約0. 5w/v%、 約 0. l wZv%、 約 0. 05w/v%、 約 0. 0 1 w/v%に調製される。
本発明におけるソマトスタチン受容体作動薬の投与量は対象となる疾患、 症 状、 投与対象、 投与方法などにより異なるが、 例えば PRK手術後の角膜知覚 回復剤として成人の眼に局所的に使用する場合には、 例えばソマ トスタチン約 0. 0 1 w/v%含有する点眼液を、 1回約 20〜約 50 し、 1 日数回点眼 するのがよい。 本明細書おょぴ図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、
I UPAC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あ るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 ま たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。
DNA ：デォキシリボ核酸
c DNA ：相捕的デォキシリボ核酸
DN a s e ：デォキシリボヌクレアーゼ
S S TR ： ソマトスタチン受容体
GAPDH： グリセルアルデヒ ド- 3-ホスフェート -デヒ ドロゲナーゼ NGF ：神経成長因子
A ：アデニン
T ：チミン
G ： グァニン
C ： シトシン
RNA ： リボ核酸
mRNA ： メッセンジャー RNA
G 1 y ： グリシン
A 1 a ： ァラニン
V a 1 ： バリン
S e r ： セリン
T h r ： スレ才ニン
C y s
M e t ：メチォニン
A s P ： ァスパラギン酸
Ly s . リジン
A r g ： アルギニン
P h e ： フエ二ルァラニン T y r ： チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ： プロリン
A s n ： ァスパラギン
M e ：メチル基 図面の簡単な説明
図 1はゥサギ三叉神経と網膜でのソマトスタチン受容体サブタイプ（S S TR 2及び S S TR 4)の発現を示す図である。
図 2は培養ゥサギ三叉神経細胞とその細胞からの軸索伸展を示す位相差顕微鏡 像である。 Aは無添加群、 Bは 1 ΑίΜソマトスタチン添加群、 Cは 1 0 Μソマトスタチン添加群、 Dは NGF添加群、 Εはソマトスタチン +NG F添加群の各細胞を示す。
図 3はゥサギの角膜神経を切断した後の角膜知覚の推移を示すグラフである。
*は基剤投与群に対する有意差を示す（η = 6〜1 2、平均値土標準誤差、 ρ < 0. 05) 。
図 4は培養ゥサギ三叉神経細胞とその細胞からの軸索伸展を示す蛍光顕微鏡像 である。 Αはコントロール群、 Bは 1 0 μΜオタトレォチド添加群の各細 胞を示す。
図 5は図 4と同じ試験において、 全細胞数に対する神経突起形成細胞の比率
(%) 示すグラフである。 *はコントロールに対する有意差 (η= 3、 平 均値士標準誤差、 ρ < 0. 05) を示す。
図 6は培養ゥサギ三叉神経細胞とその細胞からの軸索伸展を示す蛍光顕微鏡像 である。 Αは無添加群、 Bは 1 μΜ化合物 1添加群、 Cは 0. Ι μΜ化合物 2添加群の各細胞を示す。
図 7は図 6と同じ試験において、 培養細胞のニューロフィランメント量を表す 吸光度を示すグラフである（η = 3、 平均値土標準誤差）。 発明の実施のするための最良の形態
本発明を以下の試験例及び実施例に従いさらに詳細に説明するが、 本発明は これらにより何ら限定されるものではない。
試験例 1. ゥサギ三叉神経におけるソマトスタチン受容体の発現
1) 使用動物
福崎養兎組合より購入した日本白色種ゥサギ （体重 2. 0 kg) を使用した。 2) 試験方法
日本白色種ゥサギにセラクタール（xylazine) ：ケタラール（塩酸ケタミン） = 0. 5 ： 1の混合液を筋肉内注射 （0. 9mLZk g) し、 全身麻酔を実施し た。 生理食塩水で心臓灌流後、 網膜と三叉神経節をそれぞれ採取した。 TRIzol Reagent (GIBCO BRL社製） を用いた AGPC法により、 組織から R N Aを抽 出し、 DNa s e処理によりゲノム DNAを除去した後、 SuperScripit II (GIBCO BRL社製）を用いて逆転写反応を行なった。 c D N Aを、 Platinum Taq DNA polymerase (GIBCO BRL社）を用いて表 1に記す反応条件で增幅させた。 なお、 プライマーは表 1記載のゥサギのソマトスタチン受容体 S STR 2遺伝子特異 的プライマー （後記配列表：配列番号 1) と S STR 4遺伝子特異的プライマ 一 （後記配列表：配列番号 2) を使用した。 網膜および GAPDHは発現の陽 性コントロールとして用いた。
(表 1)
Figure imgf000018_0001
3) 試験結果
結果を図 1に示した。ゥサギ網膜（R)と三叉神経 （T)におけるソマトスタチ 1$ ン受容体、 S STR 2および S S TR 4サブタイプを RT— P CR法により解 祈した結果、 両組織において S STR 2および S STR4とも発現が認められ た。
試験例 2.培養ゥサギ三叉神経細胞における神経軸索伸展促進作用（In vitro 実験） '
1) 使用動物
福崎養兎組合より購入した日本白色種ゥサギ（ 生後 2〜3日目）を使用した。
2 ) 被験物質
被験物質として、 ソマトスタチン（CALBI0CHEM社製， Lot B33795)および NG F (NGF- 7 S, Sigma社製） を使用した。 被験物質はリン酸緩衝液 （ P B S ) に Ι Ο Ο μΜ ソマ トスタチン、 20 /z g/mL NGF— 7 Sになるよう溶 解した。 調製した試薬は一 80°Cに保存し、 使用前に溶解して使用した。
3) 試験方法
三叉神経細胞の単離は Chanらの報告 (Kuan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41： 687 - 699， 1985) を参考にして行った。 すなわち、 エーテル 麻酔下、 ゥサギを生理食塩水で心臓灌流後、 三叉神経節を切り出し、 神経分散 液 (住友べ一クライ ト) を用いて、 三叉神経節を分散させ、 ポリリジン/ラミ ニンでコートした 24ゥエルプレート （住友べ一クライ ト）に細胞を播種した。 細胞数は 1ゥエルあたり約 3000細胞とし、 培養条件は 5 % C O 2、 95 % 空気環境下、 3 7でとした。 細胞は 5%牛血清 （Fetal calf serum； F C S) 添加 ダブノレべッコの修正ィーグノレ培地 ZF— 1 2 (Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium/Nutrient Mixture F-12： DMEM/F - 1 2 ) 培養液中に 播種して 24時間培養後、 培養液を F C S無添加の DMEM/F— 1 2培養液 に交換した。
その後、 以下の 5群：
I 無添加群
Π 最終濃度 1 Mとなるようソマ トスタチンを添加した群
ΙΠ 最終濃度 10 となるようソマトスタチンを添加した群 W 最終濃度 1μ g/mLとなるよう NGF添加した群
V ソマトスタチンおょぴ NGFをそれぞれ最終濃度 ΙμΜおよび 1μ g/m Lとなるよう同時に添加した群
に分け、 さらに 48時間培養した。
ソマトスタチンおょぴ NGFによる三叉神経細胞の突起形成と軸索伸展に対 する効果は位相差顕微鏡を用いた観察によって形態的に評価した。
4) 試験結果
図 2は培養ゥサギ三叉神経細胞の位相差顕微鏡像を示す。 （A) は第 I群の 細胞を、 （B) は第 Π群の細胞を、 （C) は第 ΠΙ群の細胞を、 （D) は第 IV群 の細胞を、 （E) は第 V群の細胞をそれぞれ示している。
無添加群の細胞ではわずかな神経突起の形成が認められた （A) 。 l Mソマ トスタチン添加群の細胞（B)は (A)に比較して明らかに軸索伸展が促進され、 10 /iMソマトスタチン添加群の細胞（C)でも長い軸索伸展を示す細胞が多く 観察された。 NGF添加群の細胞 （D) および NGFとソマトスタチンを同時 に添加した群の細胞 （E) においても、 無添加群 （A) に比較して明らかに神 経細胞の神経軸索伸展促進作用が認められた。
試験例 3. ゥサギ角膜神経切断後の角膜知覚機能変化 （In vivo試験）
1) 使用動物
福崎養兎組合より購入した体重 1. 5 k g〜2. O k gの雄性日本白色種ゥ サギを使用した。
2) 被験物質
被験物質としてソマトスタチン （CALBI0CHEM社製， Lot B33795) と NGF (N GF- 7 S, Sigma社製）を使用した。 被験物質は、 以下に示す基剤に溶解し、 試験に用いた。
基剤処方：
塩化ナトリウム 0. 9 g
リン酸 2水素ナトリウム · 2水和物 0. 1 g
水酸化ナトリウム 適量 （ p H 7. 0 ) 注射用蒸留水 適量
全量 100 m L
3 ) 試験方法
ゥサギにセラクタール（xylazine) ： ケタラール（塩酸ケタミン） = 0. 5 ： 1 混合液を筋肉内注射 （0. 9mL/k g) し、 全身麻酔を実施した。 角膜を直 径 6 mmのトレパンで標識し、その上位 1 80度の角膜を円形切開しながら 8. 0ナイロン縫合糸で縫合した。縫合の直後から、基剤（基剤投与群、 n = 1 0)、 ソマトスタチン溶液 （ 1 00 μΜ、 ソマトスタチン投与群、 η = 1 2) あるい は NGF溶液 （20 Ai g/mL、 NGF投与群、 n = 6) を 50 μ Ι^ずつ、 4 回 /1日、 4週間連続点眼投与した。 手術後一週間は 1日 4回の被験物質点眼 の際に、 同時にタリビット点眼液 (Tarivid ophthamic solution, Santen) を 点眼投与した。動物は室温 23 ± 3 °C、湿度 55 ± 10 %、 1 2時間照明（ 8 ： 00点灯、 20 ： 00消灯） に設定された飼育室内で 1ケージあたり 1匹収容 し、 飼育した。 角膜知覚は Cochet- Bonnet角膜知覚計 （LUNEAU社製） を用いて、 手術 3日目と 1、 2、 3、 4、 6週目に測定した。 角膜知覚（％)は、 各個体の 手術前の知覚を 1 00 %とし算出した。
4) 試験結果
図 3は角膜神経を切断後の角膜知覚の推移を経時的に示している。 角膜知覚 は角膜切開手術 3日後から 1週後にかけて、 すべての群で急激に低下したが、 2遍目以降、 緩やかな角膜知覚の回復が認められた。 3週、 4週間後にソマト スタチン投与群において、 基剤投与群と比較して有意な角膜知覚回復効果が認 められた（ρ < 0. 05、 Du n n e t t検定）。
試験例 4. 培養ゥサギ三叉神経細胞の軸索伸展に対するォクトレォチドの効 果 （In vitro試験）
1) 使用動物
福崎養兎組合より購入した日本白色種ゥサギ（ 生後 2〜3日目） を使用した。 2) 被験物質
ォク 卜レオチド（Octreotide； SMS 201 - 995， American Peptide ComDanv, Inc. 2l| を使用した。
3 ) 試験方法
細胞培養：三叉神経細胞の単離は Chanらの報告 （Kuan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41： 687-699， 1985) を参考にして行った。 すなわ ち、 エーテル麻酔下、 生理食塩水で心臓灌流後、 三叉神経節を切り出し、 神経 分散液 （住友ベークライト） を用いて、 三叉神経節を分散させた後、 細胞数を 計測して、 ポリ リシンでコートした 8ゥエルカルチャースライ ド （BECT0N DICKINSON) に細胞を播種した。 細胞数は 1ゥエルあたり約 3 X 1 0 3細胞とし、 培養条件は 5 % C 0 2、 9 5 %空気下、 3 7 とした。 細胞培養には-ユー 口べーサル培養液 （GIBG0) に B 2 7サプリメント （GIBG0； 0 . 0 2 m L /m L培養液） を添加した培養液を用い、細胞播種直後にオタトレォチド （1 0 μ Μ最終濃度） を培養液中に添加して 2 4時間培養した。
免疫染色：培養 2 4時間後に、 細胞を 4 %パラホルムアルデヒ トで室温で 2 時^固定し、 神経細胞体おょぴ神経突起を構成するニューロフィラメントを特 異的に認識する抗ニューロフィラメント 2 0 0抗体 （NF, Anti- Neurofi lament 200, Sigma) を用いて神経細胞、 軸索および突起を蛍光染色した。 染色細胞は 蛍光顕微鏡からコンピュータに画像として取り込み、画像解析ソフト（MacSCOP, MITANI CO. ) を用いてオタトレォチドによる突起形成と軸索伸展に対する効果 を評価した。 すなわち、 細胞の軸索伸展長および細胞体直径を画像解析ソフ ト を用いて測定し、 細胞体の直径の 2倍以上長さの軸索を持つ細胞を神経突起形 成細胞として全細胞数に対する比率 （％) を計算した。
4 ) 試験結果
図 4は培養ゥサギ三叉神経細胞におけるオタトレォチドの神経突起、 軸索伸 展効果を示している。 ( A )はォク トレォチド無添加培養液で 2 4時間培養した コントロールのゥサギ三叉神経細胞を、（B )は オタ トレォチドを最終濃度 1 0 μ Μ 添加した培養液で 2 4時間培養した細胞を示す。コント口ールの細胞群に 比較し、 オタトレォチド添加群では神経突起形成細胞が増加することが確認さ れた。 図 5は神経突起形成細胞の全細胞数に対する比率 （％) を示している。 神経 突起形成細胞の比率はコントロール群では全細胞の約 2 1 %、 オタトレオチド 添加群では全細胞の約 4 3 %であり、 ォクトレオチド添加による神経突起形成 細胞の有意な増加が認められた（n = 3、平均値土標準誤差、 t検定、 p < 0. 0 5 %)o
以上のことから、 ソマトスタチンのアナ口グであるオタ トレオチドは三叉神 経細胞の軸索伸展を促進することが分った。
試験例 5. 培養ゥサギ三叉神経細胞の軸索伸展に及ぼすソマトスタチン受容 体ァゴニス トの効果 （In Vitro実験）
1 ) 使用動物
北山ラベスより購入した日本白色種ゥサギ （生後 2〜3日） を使用した。 2) 被験物質
被験物質であるソマトスタチン受容体ァゴエス トとして、 S S TR 2特異的 ァゴニス トである、 6—アミノー 2— ( 3 - ( 1 H—インドール一 3—ィル） - 2 - ( (4 - ( 2—ォキソ一 2、 3—ジヒ ドロべンゾイミダゾール一 1—ィ ノレ） ピぺリジン一 1一カルボニル） ァミノ） プロピオニルァミノ） へキサン酸 t _プチルエステル（以下、 化合物 1と称する。 ）、 および、 S S TR 4特異的 ァゴニストである、 1― ( 3 - (N— ( 5—プロモピリジン一 2—ィル) — N 一 （3 , 4—ジクロ口ベンジル） ァミノ） プロピル） 一 3 _ ( 3— ( 1 H—ィ ミダゾルー 4 _ィル) プロピル) チォゥレア（以下、 化合物 2と称する。 )を使 用した。 化合物 1は特表 2 0 0 1 - 5 1 9 8 1 2 (WO 9 8 /4 4 9 2 2)、 実 施例 4の化合物で、 実施例 2の方法に従って合成した。 化合物 2は特表 2 0 0 1 - 5 2 5 7 9 3 (WO 9 7/4 3 2 7 8)実施例 1 5の記載に従い合成した。
3) 試験方法
細胞培養： ゥサギ三叉神経細胞の単離は Chanらの報告 （Kuan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41： 687 - 699， 1985) を参考にして行った。 すなわち、 エーテル麻酔下、 生理食塩水で心臓灌流を施した後、 三叉神経節を 取り出し、 神経分散液 （住友べ一クライ ト） を用いて三叉神経節を分散させ、 三叉神経細胞を調製した。 細胞培養には Neurobasal medium (GIBC0) に B27 Supplement (GIBC0 ;最終濃度. 2 % v/v) および L- Glutamin (GIBCO ;最終濃度. I mM) を添加した培養液を用い、培養条件は、 5 % C02, 95 % air, 100 % humidity, 37 °C, 4 8時間とした。 細胞はポリリジンでコートした 8ゥヱルカルチャース ライド （BECT0N DICKINSON) に約 3 X 103細胞 Zゥエル、 あるいはポリリジンで コートした 96ゥエルプレートに 3 X 103細胞/ゥエルとなるよう播種し、 被験物 質群の培養液中には化合物 1 (最終濃度 1 μ Μ)または化合物 2 (最終濃度 0. 1 μ Μ) を添加した。
細胞染色： 4 8時間培養終了後、 9 6ゥエルプレートに播種した細胞を 4 °/0 パラホルムアルデヒドにて固定し、 神経細胞体および神経突起を構成するニュ 一口フィラメントを特異的に認識する抗ニューロフィラメント 200抗体（Sigma) および H R P結合ャギ抗マウス IgG抗体（和光純薬） を用いて細胞のニューロフ イラメントを標識した。標識した細胞上に 50 の 0. 02% H202 (Nacalai Tesque) および 0. 2°/。 o-phenylenediamine (Sigma) を含むクェン酸緩衝液を添加して 30 分間発色させた後、 50 の 4. 5 M H2S04 (Nacalai Tesque) を添加して反応を 停止した。 発色終了後、 これの 492 nmの吸光度を測定し、 この測定値を染色さ れた-ユーロフイラメント量として、神経突起形成の指標とした（Taniwaki T. , et al. Dev. Brain Res. (1995) 88, 109 - 166)。 8ゥエルカルチャースライ ドに 播種した細胞は、 4 %パラホルムアルデヒドを用いて固定し、杭-ユーロフイラ メント 200抗体 （Sigma) を用いて固定した標本を染色し、 Alexa Fluor 568結合 二次抗体 （Molecular probes) を用いて蛍光標識した。 蛍光標識された細胞を 蛍光顕微鏡下で観察し、 細胞像をコンピュータに画像として取り込んだ。
4 ) 実験結果
図 6は培養ゥサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示している。 （A)はソマト スタチン受容体ァゴニスト無添加培養液で培養したコントロール群の細胞を、 ( B )は化合物 1を最終濃度 1 μΜ添加した群の細胞を、 （C )は化合物 2を最終 濃度 0. 1 μΜ添加した群の細胞を示している。 コントロール群の細胞に比較し、 化合物 1または化合物 2を添加した群の細胞では神経突起形成細胞が增加する ことが確認された。 図 7は各添加群の細胞のニューロフイラメント量を表す吸 光度を示すグラフである。 コントロール群の吸光度は 0 . 7 9 8、 化合物 1添 加群おょぴ化合物 2添加群ではそれぞれ 0 . 8 7 6および 0 . 8 5 0であった。 すなわち、 ソマトスタチン受容体ァゴニス ト添加によってニューロフィラメン ト量が増加しており、 神経突起形成細胞の增加を反映していると考えられた。 以上のことから、 ソマトスタチン受容体ァゴニストである化合物 1と化合物 2は三叉神経細胞の軸索伸展を促進する作用のあることがわかった。
以下に製剤実施例を示す。
実施例 1 錠剤
ソマトスクチン 5 0 m g
乳糖 8 0 m g
デンプン 1 7 m g
ステアリン酸マグネシウム 3 m g
結晶セルロース 1 0 m g
以上の成分を 1錠分の材料として、 常法により錠剤を成形する。 錠剤は必要 に応じて通常用いられる腸溶性コーティング剤 （例えばフタル酸ヒ ドロキシプ 口ピルメチルセルロースなど） 、 糖衣おょぴフィルム （例えばェチルセルロー ス） を適用してもよレ、。
実施例 2 カプセル剤 '
ソマトスタチン 7 5 m g
マンニ トール 7 5 m g
デンプン 1 7 m g
ステアリン酸カルシウム 3 m g
以上の成分を 1カプセル剤の材料として均一に混合し、常法により顆粒状と し、 硬カプセルに充填する。 この充填する前に必要に応じて顆粒は通常用いら れる腸溶性コーティング剤 （例えばフタル酸ヒ ドロキシプロピルメチルセル口 ース） 、 糖衣またはフィルム （例えばェチルセルロース） を適用してもよい 。 実施例 3 注射剤 化合物 1 750 m g
カノレボキシメチノレセノレロースナトリ ウム 500 m g
注射用水
全量 1 00 mL 以上の成分を常法により無菌的に混和して注射剤を調製する。
実施例 4 点眼剤
化合物 2 50 m g
ホウ酸 700 m g
ホウ砂 適量 （pH7. 0) 塩化ナトリウム 500 m g
ヒ ドロキシメチノレセノレロース 0. 5 g
ェデト酸ナトリゥム 0. 05 m g 塩化ベンザルコニゥム 0. 005 m g 滅菌精製水
100 mL 滅菌精製水 8 OmLを約 80°Cまで加温し、 ヒ ドロキシメチルセルロース を加えて攪拌し、 液温を室温まで戻す。 この液に化合物 2、 塩化ナトリウム、 ホウ酸、ェデト酸ナトリゥムおよび塩化ベンザルコニゥムを加えて溶解する。 ホウ砂を適量加えて p Hを 7に調整する。 滅菌精製水を加えて 1 0 OmLま でメスアップする。
実施例 5 点眼剤
酢酸ォクトレオチド 1 1 2 m g
D—マンニトール 4. 5 g
リン酸ニ水素ナトリウム 0. 1 g
水酸化ナトリウム 適量 （pH 7. 0) 滅菌精製水
1 00 mL
滅菌精製水 8 OmLに酢酸ォク トレオチド、 D—マンニトール、 リン酸二 水素ナトリゥムを加えて溶解する。水酸化ナトリゥムを適量加えて p Hを 5 .
0に調整する。 滅菌精製水を加えて 1 0 O m Lまでメスアップする。 調製し た点眼剤をメンブランフィルターで滅菌ろ過後、 デイスポーザブル （ュュッ トドース） 容器に充填、 密封する。 産業上の利用可能性
本発明のソマトスタチン受容体作動薬を含有する医薬は、 三叉神経細胞軸索 伸展促進作用および角膜知覚機能回復作用を有することから、 角膜神経の損傷 などに伴う角膜知覚機能低下の改善および角膜知覚機能低下に伴う ドライアイ 症状の改善に有用である。 具体的には、 ソマトスタチン受容体作動薬を適用す ることにより、 白内障手術後や L A S I K手術後の角膜知覚の低下、 神経麻痺 性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下、 ドライアイ症状の改善効果が期待できる。 以上、 本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、 当業者であれ ば示された特定の態様には、 本発明の新規な教示と利点から実質的に逸脱しな い範囲でいろいろな修正と変更をなすことは可能であるので、 そのような修正 および変更も、 すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲 内に含まれるものである。
本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 2— 3 1 8 8 8 1および特願 2 0 0 3 - 0 4 0 2 5 0を基礎としており、 それらの内容は本出願にすべて包含され るものである。

Claims

請求の範囲
1 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進剤。
2 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜知覚回復剤。
3 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有するドライアイ治療剤。
4 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜上皮欠損治療剤。
5 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進用医薬組 成物。
6 . ソマ トスタチン受容体作動薬を含有する角膜知覚回復用医薬組成物。
7 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する ドライアイ治療用医薬組成物。
8 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜上皮欠損治療用医薬組成物。
9 . 角膜神経軸索伸展促進用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受 容体作動薬の使用。
10. 角膜知覚回復用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容体作 働薬の使用。
11、 ドライアイ治療用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容
体作動薬の使用。
12. 角膜上皮欠損治療用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容 体作動薬の使用。
13. 角膜神経の軸索伸展促進が必要とされる疾患対象にソマトスタチン受 容体作動薬の有効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展促進方 法。
14. 角膜知覚の回復が必要される疾患対象にソマトスタチン受容体作動
薬の有効量を投与することによる角膜知覚回復方法。
15. ドライアイに罹患した疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効 量を投与することによるドライアイの治療方法。
16. 角膜上皮が欠損した疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効量 を投与することによる角膜上皮欠損の治療方法。
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